Роль пероксида водорода в регуляции поляризации и миграции
advertisement
На правах рукописи Тюрин-Кузьмин Пётр Алексеевич Роль пероксида водорода в регуляции поляризации и миграции фибробластов 03.03.04 "Клеточная биология, цитология, гистология" Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена на кафедре биохимии и молекулярной медицины факультета Фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент ВОРОТНИКОВ Александр Вячеславович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор НАДЕЖДИНА Елена Сергеевна, МГУ имени М.В. Ломоносова, Институт Физико-химической биологии им. Белозерского кандидат биологических наук МИНИН Андрей Александрович, Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ, лаборатория клеточной подвижности. Защита диссертации состоится «30» ноября 2011 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Автореферат разослан «___»______________2011 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ele0806@yandex.ru Абрамова Е.Б 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Работа посвящена изучению участия пероксида водорода (Н2О2) в регуляции поляризации и скорости движения клеток, необходимых для миграции. Способность к миграции характерна практически для всех клеток организма. Она лежит в основе эмбрионального развития, ангиогенеза, заживления ран и репарации тканей. В то же время миграция является важным фактором ряда патологических процессов, например, метастазирования раковых клеток. Миграция клетки может направляться внешними факторами, например, хемоаттрактантами (хемотаксис), а также внутриклеточными факторами (англ. intrinsic, врожденные). Хемотаксис происходит при ангиогенезе, росте аксонов, во время привлечения лейкоцитов в область воспаления, а фибробластов – в зону повреждения ткани, а также при многих других процессах. Однако в отсутствие направляющих стимулов фибробласты также способны к миграции. Такой тип движения мы назвали произвольной миграцией, в процессе которой клетки руководствуются внутриклеточными факторами при выборе направления перемещения. Например, фибробласты могут не направляться извне при движении в толще соединительной ткани, поддерживая её гомеостаз и осуществляя ремоделирование. Для успешной миграции необходимо одновременное осуществление двух процессов. Первый процесс – повышение двигательной активности клетки за счет ускорения актиновой динамики. Второй – морфологическая поляризация (формирование ламеллы, определяющей передний край клетки, и образование заднего края клетки). Градиент липидной сигнальной молекулы фосфатидилинозитол-3,4,5-трисфосфата (PIP3) в плазматической мембране считается одним из основных механизмов, определяющих направление поляризации клеток. В области повышенной концентрации PIP3 активируется малая ГТФаза Rac1, которая запускает построение сети актинового цитоскелета и выдвижение ламеллоподии с последующим формированием ламеллы. Таким образом на переднем крае образуется псевдоподия – вырост плазматической мембраны. В условиях хемотаксиса градиент PIP3 задается неравномерной активацией рецепторов хемоаттрактанта, и этот процесс достаточно хорошо изучен, однако о механизмах поляризации фибробластов при произвольной миграции практически ничего не известно. 3 Пероксид водорода (Н2О2) в последнее время рассматривается как потенциально важный регулятор миграции и пролиферации клеток, функционирующий в качестве вторичного посредника (Niethammer et al., 2009, San Martin & Griendling, 2010). В то же время, хорошо известно его токсичное действие при развитии окислительного стресса, а также его роль в реализации защитных функций лейкоцитов. В настоящей работе пероксид водорода рассматривался как внутриклеточный фактор, обеспечивающий поляризацию и произвольную миграцию фибробластов в отсутствие хемотактических градиентов. Цель и задачи работы. Целью работы было определение участия пероксида водорода в регуляции произвольной миграции фибробластов. Для этого было необходимо решить следующие задачи: 1. Установить сигнальные каскады, активация которых необходима для стимуляции миграции фибробластов тромбоцитарным фактором роста. 2. Определить, участвует ли НАДФН-оксидазный комплекс в стимуляции миграции фибробластов тромбоцитарным фактором роста. 3. Разработать методику долговременного прижизненного наблюдения за уровнем пероксида водорода в единичных мигрирующих фибробластах. 4. Определить внутриклеточное распределение и динамику образования пероксида водорода в цитоплазме произвольно мигрирующих фибробластов в условиях равномерной стимуляции. 5. Установить, формируется ли градиент пероксида водорода в отсутствие внешних стимулов. Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе изучены механизмы морфологической поляризации фибробластов в процессе их произвольного движения. Впервые прямо показана динамика образования и распределения Н2О2 в цитоплазме мигрирующих клеток. На основании полученных результатов предложен новый механизм, объясняющий роль Н2О2 в определении направления движения клеток. Впервые обнаружен градиент Н2О2 в цитоплазме поляризованных фибробластов и изучена временная динамика его распределения в процессе движения клеток. Разработаны и оптимизированы методики долговременной (в течение суток) прижизненной цейтраферной конфокальной и флуоресцентной микроскопии 4 мигрирующих клеток, а также методики детекции внутриклеточных сигнальных молекул в режиме реального времени при помощи биосенсоров. Применение методов одновременной детекции Н2О2 и PIP3 позволило сравнить динамику этих молекул в цитоплазме движущихся фибробластов. Несомненна фундаментальная важность исследуемой проблемы, а также её научно-практическая значимость. Результаты изучения Н2О2-зависимого механизма внутренней регуляции поляризации клеток открывают новое направление в исследованиях миграции клеток. Система образования Н2О2 в клетке может быть важной мишенью при разработке лекарственных препаратов, препятствующих метастазированию раковых опухолей, развитию стеноза и рестеноза сосудов, остеопороза, и ряда других заболеваний, связанных с нарушениями регуляции подвижности и направленного движения клеток. Оптимизированные в ходе данной работы методики могут применяться в фундаментальных клеточно-биологических и биомедицинских исследованиях, например, при изучении механизмов регуляции миграции стволовых или опухолевых клеток. Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором на Факультете фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова. Все поставленные задачи решены с применением современных методов клеточной биологии. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных. Апробация работы. Работа прошла апробацию на 35-ом научном конгрессе FEBS “Molecules of Life” (Гётеборг, Швеция, 2010); на международном симпозиуме “Biological motility. From fundamental achievements to nanotechnologies” (Пущино, 2010); на международном нанотехнологическом форуме Руснанотех (Москва, 2010); на Всероссийской научной школеконференции для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009). Публикации. По материалам работы опубликовано 14 научных работ, в том числе 1 статья в российском журнале, соответствующем перечню ВАК и 1 статья в зарубежном рецензируемом журнале. Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 129 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 135 ссылок. Диссертация содержит 26 рисунков. 5 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работу проводили на линейных мышиных фибробластах NIH-3T3 (Банк клеточных культур Института цитологии РАН). В процессе культивирования клетки выращивали в среде DMEM Low Glucose (1 г/л глюкозы), не содержащей антибиотиков и антимикотиков, с добавлением 10% бычьей фетальной сыворотки при 37°С, 5% СO2. Трансфекцию необходимыми плазмидами проводили с помощью реагента FuGene6 (Roche Applied Science, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Для определения скорости движения фибробластов методом прижизненной цейтраферной съемки клетки высаживали на 12 луночный планшет с покрытием CellBind® (Costar, США) и выращивали до конфлюентного монослоя в среде DMEM, содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки, в инкубаторе при 37°С, 5% СO2. Клетки депривировали в течение шести часов перед съёмкой. За 1,5-2 часа до съемки наконечником пипетки проводили царапину в монослое клеток и промывали средой для депривации для удаления открепившихся клеток. За 40 минут до съемки добавляли ингибиторы: апоцинин 2 мМ, ингибиторы MEK1/2 (U0126) и PI3-киназы (LY294002) до конечной концентрации 10 мкМ. За 10 минут до съёмки добавляли тромбоцитарный фактор роста (PDGF) до конечной концентрации 10 нг/мл. Во время съемки клетки находились в камере с подачей СО2 и температурой воздуха 37оС. Съемку проводили в режиме светлого поля с использованием 5х объектива (Leica HCX PL FLUOTAR 5x) в инвертированном микроскопе Leica DMI6000 (Leica Microsystems GmbH, Germany). Использовали многопозиционный режим параллельной съёмки в нескольких положениях планшета (multiposition). Съемку проводили в течение 10–12 часов с частотой 1 кадр в 20 мин. Частоту съёмки выбирали эмпирически так, чтобы промежуток между кадрами был сопоставим со временем перемещения тела клетки. Результаты съемки обрабатывали в программе ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Для определения подвижности фибробластов в культуре подсчитывали средние скорости миграции отдельных клеток, расположенных на краю экспериментальной раны монослоя. Координатой клетки считали положение геометрического центра ядра (центроид). Скорость движения клеток рассчитывали как отношение длины отрезков, пройденных клетками между кадрами, на затраченное время (20 мин). Результаты усредняли и статистически обрабатывали с использованием программы Microsoft Office 6 Excel 2007 (Microsoft Corporation, США). Полученные значения средних скоростей сравнивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента с оценкой нормальности распределения значений. Статистическая достоверность была установлена при p<0.05. Результаты представлены как среднее +/стандартная ошибка среднего. Измерение внутриклеточного уровня Н2О2. Для определения концентрации Н2О2 в цитоплазме клеток использовали внутриклеточный генетически-кодируемый биосенсор HyPer. Кодирующая его плазмида (Belousov et al., 2006), как и все ее модификации были любезно предоставлены к.б.н. В.В. Белоусовым (ИБХ РАН, Москва). HyPer сконструирован на основе циркулярно-пермутированного желтого флуоресцентного белка (cpYFP) с прикрепленными к нему доменами бактериального фактора транскрипции OxyR. Домены OxyR специфически окисляются Н2О2, при этом они смещаются и между ними замыкается дисульфидная связь, что ведет к изменению конформации cpYFP. При окислении HyPer Н2О2 изменяется его спектр возбуждения флуоресценции таким образом, что один из пиков (420 нм) уменьшается, а другой (500 нм) – возрастает. Измеряя соотношение пиков возбуждения флуоресценции 420 нм и 500 нм, определяли относительный уровень Н2О2. Для наглядности полученные изображения клеток переводили в псевдоцвета. Цвет каждой точки изображения обозначает определенное соотношение А500/А420 в этой точке: А500 – интенсивность флуоресценции биосенсора при возбуждающей длине волны 500 нм (или 488 нм в случае конфокального микроскопа), А420 – интенсивность флуоресценции при возбуждающем свете 420 нм (или 405 нм). Соотношение А500/А420 отражает относительный уровень Н2О2. Получаемые данные не зависят от концентрации биосенсора и его абсолютного количества. Биосенсор окисляется обратимо, поэтому регистрирует временную динамику образования Н2О2. В работе использовали следующие варианты биосенсора: HyPer-NES, биосенсор слит с сигналом экспорта белков из ядра; HyPer-BtkPH, биосенсор слит с РН-доменом киназы Btk. Прижизненная съёмка фибробластов с использованием флуоресцентного оптического и конфокального микроскопов. Флуоресцентную микроскопию проводили в среде для съёмки: МЕМ, содержащей 20 mM HEPES и 1% BSA, без антибиотиков (среда роста без сыворотки). В том случае, если клетки мигрировали в окружении факторов роста, в среду для съёмки добавляли 10% FBS (полная среда роста фибробластов). При проведении опытов со 7 стимуляцией фибробластов PDGF клетки предварительно депривировали в течение 2-4 часов в среде для съёмки. Съёмку проводили при 37Со. Наблюдение за миграцией клеток с использованием флуоресцентного и конфокального микроскопов производили в течение 10-40 часов. Интервал между кадрами составлял 5-20 минут в зависимости от жизнеспособности клеток и яркости возбуждающего света. Полученные фильмы обрабатывали при помощи программы ImageJ (NIH, USA). Изображения пропускали через гауссиановский фильтр, убирали фон при помощи команды Threshold и делили значения интенсивностей соответствующих точек фотографий в канале 500 нм и в канале 420 нм для регистрации уровня Н2О2 в плоскости клетки. Съёмку клеток проводили при помощи инвертированного флуоресцентного оптического микроскопа Leica DMI6000 или конфокального сканирующего флуоресцентного микроскопа Leica SP5 (Leica Microsystems GmbH, Germany). В первом случае флуоресценцию биосенсора возбуждали при помощи ртутно-галогеновой лампы (mercury metal halide bulb) Leica EL6000 (Leica Microsystems GmbH, Germany) поочередно в двух каналах с использованием фильтров 427/10 нм и 504/12 нм. Флуоресценцию биосенсора в обоих каналах регистрировали при помощи фильтра 542/27 нм. Для быстрого переключения фильтров использовали приставку к микроскопу для детекции FRET. Для снижения фототоксического эффекта использовали биннинг 4х4 (объединение сенсоров камеры, образующих квадрат 4х4, в один). Это значительно повышает чувствительность камеры, благодаря чему позволяет снизить интенсивность облучения клеток. При использовании конфокального микроскопа флуоресценцию биосенсора возбуждали поочерёдно при помощи лазеров 405 нм и 488 нм. Регистрировали флуоресценцию в обоих случаях в интервале 500–580 нм. Интенсивность лазеров составляла 3-10% (при этом лазер 488 нм работал на 20% от максимальной мощности). Частоту сканирования устанавливали либо на 700 Hz, либо на 1000 Hz, сканер проходил сканируемое поле в двух направлениях (режим bidirectional), pinhole устанавливали в максимально возможно открытом положении (2-3,5 относительных единиц или 180-300 мкм). Формат полученных изображений составлял не более 512x512. 8 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ PI3-киназный, но не Erk/МАР-киназный каскад регулирует скорость и направленность миграции фибробластов Миграция клеток, пролиферация, дифференцировка и некоторые другие важные клеточные ответы регулируются факторами роста. При стимуляции фибробластов PDGF запускаются, в основном, два сигнальных каскада: ERK1/2- и PI3-киназные каскады. В большинстве типов клеток активация МАРкиназ ведет к пролиферации клеток, а PIP3, синтезируемая PI3-киназой сигнальная молекула – важный медиатор поляризации и миграции клеток. Первоначальная задача состояла в выявлении сигнальных каскадов, важных для миграции используемых нами фибробластов. Для определения средней скорости и направленности движения клеток использовали модель экспериментальной раны в монослое клеток. Роль различных сигнальных каскадов проверяли при помощи ингибиторного анализа. Регистрировали следующие параметры миграции клеток: среднюю скорость движения и направленность. Направленность миграции фибробластов определяли по форме траекторий движения. Извитые траектории движения означают, что клетка часто изменяет направление поляризации. Близкие к прямым траектории свидетельствуют о том, что клетка поддерживает направление поляризации в течение долгого времени. Рис. 1. PI3-киназный сигнальный каскад регулирует скорость и направленность движения фибробластов. А. Влияние PDGF и ингибиторов сигнальных каскадов на среднюю скорость миграции фибробластов в экспериментальную рану клеточного монослоя (А) и траектории движения фибробластов (Б). 1 – Контроль; 2 – PDGF; 3 - PDGF и U0126, ингибитор ERK1/2 киназ; 4 - PDGF и LY294002, ингибитор PI3-киназы. Результаты на графике представлены в виде среднее ± доверительный интервал (95%). Для каждой серии n=180. 9 Влияние PDGF на результирующие средние скорости миграции фибробластов демонстрирует Рис. 1А. При стимуляции фибробластов PDGF скорость движения увеличивается почти в два раза. На Рис. 1Б представлены характерные траектории движения фибробластов. Видно, что равномерно добавленный PDGF заметно не влияет на направленность движения клеток. Таким образом, при стимуляции фибробластов PDGF повышалась подвижность клеток, а направленность их движения изменялась незначительно. При помощи ингибиторного анализа исследовали, какой из сигнальных каскадов, ERK1/2- или PI3-киназный, регулирует скорость и направленность миграции фибробластов. Для проверки роли ERK1/2-киназного каскада использовали вещество U0126, ингибитор участников данного сигнального каскада, киназ МЕК1/2 (Favata et al., 1998). Ингибирование ERK1/2-киназного каскада не изменяет средние скорости движения фибробластов в присутствии PDGF (Рис. 1А), также как и кривизну траекторий их движения (Рис. 1Б). Таким образом, ERK1/2-киназный каскад не влияет на подвижность клеток в данных условиях и на способность поддерживать выбранное направление движения. Для ингибирования PI3-киназного сигнального каскада мы использовали LY294002 (Vlahos et al., 1994) – селективный ингибитор PI3-киназы. В его присутствии PDGF не способен стимулировать фосфорилирование субстрата PI3-киназы, протеинкиназы В/Akt (PKB/Akt). Ингибирование PI3-киназного каскада приводило к снижению средней скорости движения фибробластов в экспериментальную рану монослоя почти в два раза (Рис. 1А). При этом траектории движения клеток становились заметно более извитыми (Рис. 1Б). Это свидетельствует о том, что PI3-киназный сигнальный каскад регулирует и скорость, и направленность движения фибробластов. Роль системы NOX/Н2О2 в стимуляции миграции фибробластов К настоящему времени появилось большое количество данных, свидетельствующих о значительной роли эндогенного Н2О2 в жизненно важных клеточных процессах. Н2О2 принимает участие в регуляции апоптоза (Cerella et al., 2009), пролиферации (Rhee, 2006), выживаемости (Groeger et al., 2009), а также миграции разных клеток, в том числе эндотелия и гладкомышечных клеток (Ushio-Fukai, 2006). Таким образом, Н2О2 может претендовать на роль фундаментального регулятора клеточных функций. 10 Визуализация Н2О2 в живых клетках Прежде чем изучать, принимает ли Н2О2 участие в регуляции миграции фибробластов, мы убедились, что в фибробластах Н2О2 образуется при стимуляции, и проверили действие используемого нами ингибитора. Для определения изменения уровня Н2О2 в цитоплазме клеток мы использовали биосенсор HyPer (Belousov et al., 2006). Прежде всего, мы убедились, что в стимулированных фибробластах Н2О2 образуется внутри клетки. Как показано на рис. 2, стимуляция 3Т3 фибробластов PDGF вызывала повышение внутриклеточной концентрации Н2О2. Увеличенный уровень Н2О2 поддерживается в течение 30 минут и более. На Рис. 2А представлены конфокальные фотографии фибробласта, трансфицированного плазмидой, кодирующей кДНК биосенсора HyPer, а также изображения клетки в псевдоцветах, соответствующих различному отношению А500/А420. На графике зависимости относительной концентрации Н2О2 в этой клетке от времени (Рис. 2В) видно, что концентрация Н2О2 в цитоплазме повышается. Источниками эндогенного Н2О2 могут служить митохондрии и мембранные комплексы НАДФН-оксидаз. Наиболее широко использующимся ингибитором сборки мембранных комплексов NOX1 и NOX2 является апоцинин. Мы показали, что апоцинин ингибирует рост уровня Н2О2 в фибробластах. На Рис. 2Б представлены изображения фибробласта, экспрессирующего биосенсор HyPer. Клетка была простимулирована PDGF в присутствии апоцинина. Отчетливо видно, что соотношение А500/А420 практически не изменяется. Это означает, что уровень Н2О2 в этой клетке не изменяется даже при стимуляции PDGF. Количественно эти изменения представлены на Рис. 2В. Таким образом, стимуляция фибробластов PDGF вызывает повышение уровня Н2О2 в цитоплазме, а ингибирование сборки комплексов NOX1/2 апоцинином препятствует образованию Н2О2. Поэтому на следующем этапе мы проанализировали внутриклеточное распределение Н2О2 при движении стимулированных фибробластов. Ингибиторный анализ Мы попытались определить, какое участие в миграции фибробластов принимает система NOX/Н2О2. Для этого использовали модель экспериментальной раны в монослое клеток и ингибиторный анализ. В присутствиии апоцинина форма фибробластов не изменяется (данные не представлены) и они сохраняют способность к миграции. Однако скорость их 11 Рис. 2. При стимуляции фибробластов PDGF происходит образование эндогенного Н2О2, которое ингибируется апоцинином. Представлены конфокальные микрофотографии фибробластов, экспрессирующих биосенсор HyPer. PDGF был добавлен в нулевой момент времени в отсутствие (А) и в присутствии апоцинина (Б). Масштаб 10 мкм. На панели B приведена зависимость изменения соотношения А488 нм/А405 нм в этих клетках от времени. 12 движения в присутствии PDGF уменьшается в два раза (Рис. 3А). При этом движение не ингибируется полностью, а замедляется до уровня нестимулированных клеток. Кроме того, несколько снижается и способность фибробластов поддерживать направление движения, поскольку траектории движения клеток становятся более извитыми и суммарное пройденное ими расстояние уменьшается больше, чем просто за счет замедления движения (Рис. 3Б). Таким образом, PDGF ускоряет движение фибробластов за счет активации системы NOX1/2-Н2О2. Рис. 3. Система NOX1/2-Н2О2 принимает участие в ускорении миграции фибробластов под действием PDGF. А. Влияние ингибирования образования Н2О2 на скорость миграции фибробластов в рану в монослое (А) и характерные траектории движения фибробластов (Б). 1 – Контроль; 2 – PDGF; 3 - PDGF и апоцинин, ингибитор НАДФН-оксидаз 1 и 2. Данные на графике представлены в виде среднее ± доверительный интервал (95%). n=180 для всех графиков. Распределение Н2О2 в цитоплазме стимулированных фибробластов Эффективность перемещения клетки в пространстве зависит от скорости движения и способности поддерживать направление. Выше мы показали, что система NOX1/2-Н2О2 регулирует скорость миграции фибробластов. Однако остается неясным, имеет ли Н2О2 отношение к направленности движения клетки. Известно, что направленность движения определяется поддержанием вектора поляризации клетки. Градиент PIP3, продукта действия PI3-киназы, 13 Рис. 4. В ламелле поляризованных фибробластов концентрация Н2О2 повышена. А. Репрезентативная конфокальная фотография нескольких экспрессирующих биосенсор HyPer-PH фибробластов и увеличенные фазово-контрастные изображения некоторых клеток. 1, 2, 3 – соответствующие участки, выделенные белыми квадратами. Масштаб 10 мкм. Б. Средние значения отношения концентрации Н2О2 в заднем крае и в ламеллоподии мигрирующих клеток к району ядра. n =51, значения представлены в виде среднее +/стандартное отклонение. Клетки находятся в полной среде роста фибробластов. 14 Рис. 5. Н2О2, так же как и PIP3, формирует градиент концентрации на переднем крае мигрирующих фибробластов. А. Конфокальные микрофотографии и рациометрические изображения фибробласта, трансфицированного плазмидой, кодирующей кДНК биосенсора HyPer-PH в разные моменты времени. Масштаб 10 мкм. Приведены данные репрезентативного эксперимента по наблюдению: 1) миграции клеток (для 85 наблюдений в 7 независимых экспериментах) и 2) изменения направления движения клетки (для 8 наблюдений в 7 независимых экспериментах). Клетки находятся в полной среде роста фибробластов. Б. Кимограмма, демонстрирующая зависимость распределения Н2О2 вдоль линии измерения от времени. Линия измерения показана справа. 15 является маркером поляризации фибробластов; он формируется на переднем крае движущейся клетки как при хемотаксисе, так и при произвольном движении (Weiger et al. 2009). В экспериментах использовали биосенсор HyPer-PHBtk. В этой конструкции к биосенсору HyPer присоединен РН-домен киназы Btk (Bruton's tyrosine kinase) (Manna et al., 2007), который специфично связывается с PIP3. Такой белок объединяет в себе транслокационный и спектральный биосенсоры. О концентрации Н2О2 в цитоплазме делали выводы по изменению спектральных характеристик биосенсора. О пространственно-временной динамике PIP3 судили по изменению плотности распределения биосенсора, о которой свидетельствует его флуоресценция при возбуждении в канале 405 нм. Таким образом, использование HyPer-PHBtk позволяет параллельно детектировать распределение Н2О2 и PIP3 в одной клетке. Сначала проанализировали распределение Н2О2 в поляризованных клетках и далее одновременно регистрировали сигналы Н2О2 и PIP3 в движущихся клетках. Распределение Н2О2 и PIP3 в поляризованных клетках Мы обнаружили, что в большинстве случаев Н2О2 неравномерно распределен в цитоплазме клеток. Для получения достоверных результатов мы получили изображения около двухсот клеток, экспрессирующих HyPer-PHBtk. Клетки находились в полной среде роста фибробластов при постоянной концентрации факторов роста, то есть в условиях равномерной стимуляции. На Рис. 4А видно, что в большинстве фибробластов концентрация Н2О2 неоднородна. Уровень Н2О2 повышен в клетках, которые имеют свободный край с ярко выраженной ламеллой. В ламеллоподиях концентрация Н2О2 наиболее высока (Рис. 4А, 1). В тех фибробластах, которые расположены в монослое и не имеют четкой ламеллы, Н2О2 в цитоплазме распределен практически равномерно (Рис. 4А, 2). На Рис. 4Б приведены результаты количественной обработки распределения Н2О2 в цитоплазме поляризованных фибробластов в условиях равномерной стимуляции. Соотношение величин флуоресценции биосенсора при 500 и 420 нм было рассчитано для различных участков клетки вдоль оси поляризации. На диаграмме за единицу принята величина отношения А500/А420 флуоресценции биосенсора, находящегося в центральной области цитоплазмы вблизи от ядра. Столбцы показывают, во сколько раз соотношение А500/А420 в 16 ламеллоподии (справа) или в отстающем крае выбранной клетки (слева) превышают значение А500/А420 в центре этой же клетки. Для анализа выбирались только клетки, содержащие ламеллу на свободном крае. Видно, что в ламелле концентрация Н2О2 в два раза выше, чем в центральной части. Таким образом, Н2О2 неравномерно распределен в цитоплазме поляризованных фибробластов, при этом концентрация Н2О2 наиболее высока в области ламеллы. В неполяризованных клетках Н2О2 распределяется относительно равномерно. Внутриклеточная динамика Н2О2 и PIP3 в движущихся клетках В процессе миграции фибробласты постоянно поддерживают поляризацию и за счет этого сохраняют направление движения. При этом новые ламеллоподии образуются преимущественно на переднем крае клетки поблизости от предыдущих. Если Н2О2 участвует в поляризации и поддержании направления движения фибробластов, то можно ожидать, что в мигрирующих клетках уровень Н2О2 должен быть постоянно повышен на переднем крае, так же как и уровень PIP3. Поэтому мы исследовали пространственно-временную динамику образования Н2О2 и PIP3 в цитоплазме мигрирующих фибробластов. За миграцией клеток наблюдали c помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии в режиме реального времени в течение 4-20 часов с частотой съемки от 3 до 20 минут между кадрами. Наблюдение клеток в этих условиях вызывает значительные затруднения, связанные с рядом факторов. Во-первых, фибробласты мигрируют крайне медленно. Продолжительность фильмов должна составлять от нескольких часов до суток. Необходимо создать условия для поддержания жизнедеятельности клеток под микроскопом в течение столь длительного времени. Во-вторых, от продолжительного воздействия интенсивного света фибробласты быстро погибают. Для выполнения данного раздела работы были подобраны условия съёмки, при которых повреждающее действие света на клетки минимально (см. раздел Материалы и методы). Клетки были трансфицированы плазмидой, кодирующей HyPer-PHBtk. На Рис. 5 (верхние ряды, "λвозб = 405 nm") представлены изъятые из видеоряда конфокальные микрофотографии репрезентативного фибробласта, мигрирующего при постоянной концентрации внеклеточных факторов (в условиях равномерной стимуляции). По ним можно судить о распределении биосенсора в цитоплазме, а, значит, и о распределении PIP3. Яркие области по 17 периферии клетки отражают места накопления PIP3. В течение первого часа наблюдения клетка практически не двигалась. На 44 минуте клетка начинает образовывать ламеллоподию в участке, отмеченном стрелкой. К 54 минуте она полностью приобретает поляризованную форму с выраженной ламеллой в этой части клетки. Далее фибробласт в течение часа совершает перемещение в этом направлении. В течение этого времени вплоть до полной остановки (95 минута наблюдения) на переднем крае фибробласта поддерживается градиент PIP3. Далее клетка в течение получаса остается на месте, при этом на разных краях клетки появляются кратковременные всплески PIP3, но ни в одну из сторон клетка не движется. К 139 минуте наблюдения фибробласт формирует ламеллу в новой части клетки (отмечена звездочкой) и начинает движение в эту сторону. При этом на вновь образованном переднем крае стабильно поддерживается градиент PIP3. На Рис. 5 (вторые ряды, "соотношение А420 nm/А500 nm") приведены изображения той же клетки в псевдоцветах, демонстрирующие распределение Н2О2 в цитоплазме. Видно, что во время движения клетки концентрация Н2О2 стабильно повышена на переднем крае. Примерно за 15 минут до полной остановки движения градиент Н2О2 в передней ламелле стал более пологим. Аналогично, градиент Н2О2 был выражен значительно слабее, когда клетка не двигалась, но образовывала короткоживущие ламеллоподии (80 – 120 минуты съемки). Таким образом, область цитоплазмы с повышенной концентрацией Н2О2 совпадает со стабильной ламеллой движущейся клетки и градиентом PIP3 в ней. В тех случаях, когда клетка не движется, но образует короткоживущие повышения концентрации PIP3 и вызванные ими ламеллоподии, уровень Н2О2 практически не повышается. На Рис. 5, Б показана кимограмма, показывающая временную развертку изменения концентрации Н2О2 вдоль линии измерения с 100-й по 230-ю минуту съемки. Видно, что концентрация Н2О2 на переднем крае клетки достигала наибольших значений во время быстрого выдвижения псевдоподии. Во время остановок движения уровень Н2О2 на переднем крае клетки снижался. Аналогичная кимограмма, отражающая изменение уровня PIP3 вдоль той же линии, показывает что он равномерно повышен на протяжении всего движения клетки и не снижается во время остановок. Таким образом, область повышенной концентрации Н2О2 формируется в цитоплазме мигрирующей клетки, в передней ламелле. При изменении 18 направления миграции клетки градиент Н2О2 появляется в новой ламелле одновременно с началом ее роста. Градиент PIP3 выявляется во всех псевдоподиях, тогда как Н2О2 – только в стабильных протрузиях во время движения клетки. Контрольные эксперименты Биосенсор HyPer сконструирован на основе YFP, поэтому так же, как многие флуоресцентные белки, он изменяет спектр возбуждения флуоресценции в зависимости от рН (Belousov et al., 2006). Повышенное отношение А500/А420 на переднем крае клетки может быть следствием локального защелачивания микроокружения биосенсора. В качестве контроля на вклад рН в получаемые результаты использовали инактивированный биосенсор HyPer-C199S-PH. Отношение А500/А420 во всех частях клеток, трансфицированных плазмидой, кодирующей кДНК этого варианта биосенсора, практически одинаково. Это означает, что изменение рН и прочие воздействия цитоплазматического микроокружения биосенсора не вносят существенного вклада в изменение отношения А500/А420. Таким образом, повышение отношения интенсивностей флуоресценции биосенсора А500/А420, наблюдаемое на Рис. 4 и 5, действительно отражает повышение концентрации Н2О2 на переднем крае клетки. В условиях равномерной стимуляции, добавление к мигрирующим фибробластам ингибитора сборки NOX1/2 апоцинина не приводило к подавлению синтеза Н2О2 на переднем крае мигрирующих клеток (изображения клеток не приведены). Эти результаты свидетельствуют о том, что NOX1 и 2 не принимают участия в формировании градиента Н2О2. Поскольку NOX3 и NOX5 не экспрессируются в фибробластах, возможными источниками Н2О2 в ламелле мигрирующих фибробластов могут быть NOX4, DUOX или митохондрии. Это т результат также свидетельствует о том, что источник Н2О2, отвечающий за PDGF-зависимое ускорение миграции фибробластов, может иметь другое происхождение, чем тот, который образует градиент Н2О2 в цитоплазме. Таким образом, градиент H2O2 совпадает с осью поляризации в мигрирующих клетках, но остается неясным, связано ли это с их стимуляцией. Распределение Н2О2 и PIP3 в цитоплазме нестимулированных клеток Повышенный уровень H2O2 на переднем крае фибробластов может быть следствием стимулирующего действия факторов роста, содержащихся в полной среде роста фибробластов. Альтернативно, градиент H2O2 формируется 19 Рис. 6. В условиях отсутствия внеклеточных стимуляторов миграции может формироваться градиент Н2О2 на переднем крае движущегося фибробласта. Фотографии экспрессирующего биосенсор HyPer фибробласта, в разные моменты времени после начала съёмки фильма. Фотографии сделаны на флуоресцентном микроскопе. Клетк находятся в среде роста фибробластов без сыворотки. Репрезентативный результат для 18 клеток из 4 независимых экспериментов. Масштаб 10 мкм. Рис. 7. Предполагаемый механизм участия Н2О2 в регуляции поляризации клетки. Эндогенный градиент концентрации Н2О2 формируется вне зависимости от стимуляции клетки. Он определяет ось поляризации и направление движения. Рецептор- и NOX1/2зависимое равномерное образование Н2О2 (на схеме показано розовым) повышает скорость миграции. Штрихпунктирная линия обозначает равномерный ингибирующий сигнал на уровне мишеней Н2О2. 20 независимо от внешней стимуляции. Для того чтобы понять, какой из этих вариантов реализуется в мигрирующих клетках, мы исследовали распределение Н2О2 и PIP3 в депривированных фибробластах. Для детекции Н2О2 в данных условиях использовали биосенсор HyPer-NES. Этот вариант биосенсора генетически слит с короткой последовательностью экспорта белка из ядра (Nuclear Exclusion Signal). Такой биосенсор равномерно распределен по всей цитоплазме, и не обнаруживается в ядре. Аналогичные эксперименты были проведены с биосенсором HyPer-РBtk и были получены принципиально такие же результаты (данные не представлены). В условиях отсутствия хемотактических факторов, на клетку не действовали ни направляющие миграцию факторы, ни стимулы, повышающие скорость миграции. В этом случае движение клетки полностью контролируется внутриклеточными процессами. В депривационных условиях большинство фибробластов сохраняют поляризацию, но не движутся. В цитоплазме таких клеток выявляется градиент Н2О2 (данные не приведены). Однако некоторые клетки совершали перемешение в депривационных условиях. На Рис. 6 представлены микрофотографии, изъятые из видеоряда такой мигрирующей клетки. Видно, что концентрация Н2О2 значительно выше в передней ламелле, чем в остальной цитоплазме, и такое распределение Н2О2 поддерживается на протяжении всего времени миграции клетки. Таким образом, в отсутствие внеклеточных стимулов на переднем крае мигрирующей клетки формируется область повышенной концентрации Н2О2. Градиент Н2О2 в цитоплазме фибробластов определяется, в основном, внутриклеточными причинами, а не внешним стимулирующим действием факторов роста. Возможный механизм функционирования Н2О2 как регулятора морфологической поляризации и скорости движения клеток Мы предложили механизм функционирования Н2О2 в качестве регулятора морфологической поляризации и скорости движения фибробластов. Согласно нашей гипотезе, эндогенный градиент концентрации Н2О2 формируется вне зависимости от стимуляции клетки. При этом его направление определяет ось поляризации и вектор движения фибробласта. Рецептор-зависимая стимуляция клеток активирует систему NOX1/2, что приводит к равномерному повышению уровня Н2О2 в цитоплазме, ускорению актиновой динамики и увеличению средней скорости движения, которая выражает общую подвижность клеток. 21 Стимуляция рецептора оказывает некоторое воздействие и на направленность движения клеток, так как градиент концентрации Н2О2 становится более выраженным. Однако остается непонятным, каким образом различаются сигналы Н2О2, ответственные за скорость и поляризацию. Можно предположить, что мишени Н2О2, ответственные за поляризацию и подвижность клеток имеют разное сродство к пероксиду водорода. Н2О2 в низкой концентрации образует цитоплазматический градиент, но способен действовать только на мишени, регулирующие поляризацию (например, ингибируя фосфатазу PIP3 PTEN). Для повышения скорости миграции данного уровня Н2О2 не хватает. Равномерное стимулируемое образование Н2О2 в цитоплазме при активации системы NOX1/2 приводит к общему росту уровня Н2О2 при сохранении градиента. В таком случае клетка и поляризована, и движется. Мишенью ответственной за подвижность клеток, и регулируемой Н2О2, может быть сам актин. Существуют данные, свидетельствующие об Н2О2зависимой регуляции динамики сборки/разборки актиновых микрофиламентов (Lassing I, et al., 2007). Обсуждая механизм регуляции пероксидом водорода поляризации, закономерно предположить наличие некоего ингибиторного сигнала на уровне мишеней Н2О2, равномерно распределенного в цитоплазме и не изменяющегося при стимуляции клетки. На роль такого сигнала могут претендовать системы Trx и GSH, которые восстанавливают окисленные SH-группы белков-мишеней. В отсутствие стимуляции либо при ингибировании NOX1/2-зависимого образования Н2О2 апоцинином, уровень Н2О2 незначительно превышает порог активации мишеней и только на переднем крае клетки. Как следствие, скорость миграции фибробластов низка, хотя они и сохраняют морфологическую поляризацию. При повышении уровня Н2О2 и значительном превышении градиентом Н2О2 игнибиторного сигнала, происходит не только поляризация цитоплазмы, но и ускорение движения клетки. На Рис. 7 основные положения данной гипотезы представлены в виде схемы. Таким образом, мы выдвинули гипотезу о том, что направление внутриклеточного градиента Н2О2 определяет ось поляризации и направление движения клетки вне зависимости от внешней стимуляции, тогда как рецептори NOX1/2-зависимое образование Н2О2 повышает скорость миграции. 22 ВЫВОДЫ: 1. Миграцию NIH-3Т3 фибробластов, стимулированную тромбоцитарным фактором роста, блокирует ингибирование PI3-киназного, но не Erk1/2МАР-киназного каскада. 2. Тромбоцитарный фактор роста вызывает образование и длительное (не менее 30 мин) накопление пероксида водорода в цитоплазме. Ингибирование 1 и 2 изоформ НАДФН-оксидазного комплекса апоцинином блокирует повышение уровня пероксида водорода и ускорение миграции фибробластов, вызванное тромбоцитарным фактором роста. 3. Разработан и оптимизирован метод длительной и одновременной регистрации движения фибробластов и внутриклеточной динамики пероксида водорода. 4. В условиях равномерной стимуляции пероксид водорода формирует внутриклеточный градиент, который совпадает с направлением движения клетки и сохраняется в присутствии апоцинина. Наиболее высокий уровень пероксида водорода поддерживается в стабильных псевдоподиях. 5. Пероксид водорода формирует внутриклеточный градиент, совпадающий с направлением движения клетки, даже в отсутствие внешних стимулов. 6. Выдвинута гипотеза о том, что направление внутриклеточного градиента пероксида водорода определяет ось поляризации и направление движения клетки вне зависимости от внешней стимуляции, тогда как рецептор- и NOX1/2-зависимое образование пероксида водорода повышает скорость миграции. 23 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК, и зарубежных рецензируемых журналах: 1. Mishina, N.M., P.A. Tyurin-Kuzmin, K.N. Markvicheva, A.V. Vorotnikov, V.A. Tkachuk, V. Laketa, C. Schultz, S. Lukyanov, and V.V. Belousov. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally? // Antioxidants and Redox Signalling. 2011. Vol. 14. P. 1-7. 2. Тюрин-Кузьмин П.А., K.M. Агаронян, Я.И. Морозов, Н.М. Мишина, В.В. Белоусов, А.В. Воротников. НАД(Ф)Н оксидаза регулирует EGF-зависимую пролиферацию клеток по механизму, отличному от активации ERK1/2 МАР-киназ // Биофизика. 2010. Т. 55 С. 1048-1056. Тезисы российских и международных конференций: 1. Tyurin-Kuzmin P., N. Mishina, V. Belousov, C. Schultz and A. Vorotnikov. Hydrogen peroxide generated during the RTKs signaling produces and acts locally confined. 2010. The FEBS Journal. June, Vol 277, Suppl 1, 35th FEBS Congress “Molecules of Life”. 2. P.A. Tyurin-Kuzmin, N.M. Mishina, V. Laketa, C. Schultz, V.A. Tkachuk, S. Lukyanov, A.V. Vorotnikov, V.V. Belousov. Direct visualization of local hydrogen peroxide generation upon RTK stimulation in cells. Symposium “Biological motility. From fundamental achievements to nanotechnologies”, Pushchino 2010 3. P.A. Tyurin-Kuzmin, A.V. Vorotnikov, N.M. Mishina, V.V. Belousov. Spatiotemporal dynamics of H2O2 generation in progenitor cells. Nanotechnology international forum Rusnanotech. Moscow 2010. 4. Тюрин-Кузьмин П.А., Сафронова Н.М. Воротников А.В., Белоусов В.В. Локализация пероксида водорода в клетке при активации тирозинкиназных рецепторов. Всероссийская научная школа-конференция для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования», Москва, 2009. 5. Тюрин-Кузьмин П.А., Агаронян К.М., Белоусов В.В., Ткачук В.А., Воротников А.В. Роль пероксида водорода в регуляции поляризации и миграции фибробластов. IV Всероссийская научная конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина» Москва, 2011. 6. Тюрин-Кузьмин П.А., Агаронян К.М., Белоусов В.В., Воротников А.В. Локализация пероксида водорода в мигрирующей клетке. I Всероссийская конференция «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет», Санкт-Петербург, 2011. 24
