U.urealyticum - Молекулярная диагностика

Оценка лабораторных
показателей наличия
генитальных микоплазм
Иванова Т. А., Гущин А. Е., Рыжих П. Г.,Шипулина О. Ю.,
Белова А. В., Асцатурова О. Р., Никонов А. П.
Классификация микоплазм человека
Респираторный
тракт
Урогенитальный
тракт
Другие органы
M.hominis
M.genitalium
M.pneumoniae
M.spermatophilum
M.salivarium
M.primatum
M.orale
M.fermentans
U.parvum*
M.buccale
U.urealyticum**
* до 1999г –вид U.urealyticum, биовар PARVO
** до 1999г - вид U.urealyticum, биовар T960
M.penetrans
M.artritidis
M.spermatophilum
M.lipophilium
M.faucium
M.genitalium – облигатный патоген, обнаружение
которого является показанием к назначению
антибактериальной терапии.
M.hominis, U.parvum, U.urealyticum – условные
патогены, реализация патогенных свойств
которых происходит при определенных (до
конца не изученных) условиях
Значение генитальных микоплазм в патологии
урогенитального тракта у мужчин
• Уретрит - Ureaplasma urealyticum
(Hanno P. M.,2001).
20%
18%
16%
14%
12%
U.parvum
10%
8%
U.urealyticum
6%
4%
2%
0%
Мужчины с НГУ
Мужчины без НГУ
Povlsen K., 2001;
Deguchi T., 2004
Значение генитальных микоплазм в патологии
урогенитального тракта у мужчин
• Простатит? Mycoplasma hominis,
Ureaplasma spp
(Shimada M, 1999;
Okhawa M.,1993)
• Мужское бесплодие? –
Ureaplasma spp.
(Malka Reichart, 2000)
Частота обнаружения генитальных микоплазм
у клинически здоровых женщин
Микроорганизмы
Частота обнаружения
Ureaplasma spp.
40-80%
Mycoplasma hominis
21-53%
Ken B. Wates,2005
Распространенность генитальны х микоплазм среди клинически
здоровы х женщин
U.spp
45%
40%
35%
30%
25%
20%
M.hominis
15%
10%
5%
0%
1
M.hominis
U.spp 2
3
N=100
Значение генитальных микоплазм в патологии
урогенитального тракта у женщин
• ВЗОМТ - Mycoplasma hominis, Ureaplasma
urealyticum
(Stroky M.B.,1999)
• БВ - Mycoplasma hominis , Ureaplasma spp. ( )
(Борисенко К. К., 1999)
Ассоциация видов Ureaplasma с патологией
беременности, родов, послеродового и
раннего неонатального периода.
• U.parvum доминирует среди инфицированных
беременных инфицированных уреаплазмами
– до 70%
• У женщин с ВЗОМТ доминировал вид
U.urealyticum – до 57%
• Преждевременные роды (до 30нед.), амнионит,
хориоамнионит встречались в 2 раза чаще при
U.urealyticum, чем при U.parvum
• Средний вес новорожденные 2500г.(U.parvum) и 1720 г. (U.urealyticum)
Marianne Abele-Horn 1997
Ureaplasma parvum ≠ Ureaplasma urealyticum
Необходимо определение вида генитальных
микоплазм для оценки их вклада в развитие
той или иной патологии как у женщин, так и у
мужчин
Показания к лечению микоплазменной
инфекции
Терапия назначается при наличии:
 клинических признаков воспаления
( уретрит, простатит; цистит, цервицит,
ВЗОМТ, пиелонефрит, вагинит)
 лабораторных признаков воспаления ( мазки
из уретры – ПМЯЛ≥5, ППМ - ПМЯЛ≥10;
ПМЯЛ≥10, ПМЯЛ:ЭК ≥1:1)
 отягощенного анамнеза
 осложненного течения беременности
- облигатные возбудители ИППП
+ U.spp/M.hominis ≥ 104КОЕ/мл
Прилепская В. Н.,2007
Рахматулина М. Р.,2009
Значение количественной оценки генитальных
микоплазм
 При повышении концентрации U.spp.
повышается вероятность развития
осложнений послеродового периода
Chaim W.S. Ureaplasma
urealyticum in the development of
postpartum endometritis,2003
Прямые методы обнаружения
M.hominis, U.parvum, U.urealyticum
Микроскопия
Бактериология
• Не позволяет
дифференцировать
виды Ureaplasma
• Не позволяет
стандартизировать
процедуру получения
клинического
материала, качество
0.1-0.8мкм в диаметре сред, количественный
анализ
МАНК
• Высокая
чувствительность и
специфичность
• Стандартизация всех
этапов
• Количественный
анализ
• Видовая
дифференциация
Ureaplasma
Прилепская В. Н., 2007
Тест-системы для выявления и
количественного определения
U.parvum,U.urealyticum,M.hominis
АмплиСенс M.hominis
-скрин-титр-FL
M.hominis – 16S rRNA
ß-Globin
АмплиСенс Ureaplasma spp.
-скрин-титр-FL
U.spp - UreC
ß-Globin
АмплиСенс Флороценоз/
Микоплазмы-FL
U.parvum - UreC
U.urealyticum - UreC
M.hominis – 16S rRNA
ß-Globin
АЧ=103 ГЭ/мл
Разработка тест-системы на основе ПЦР в реальном
времени для идентификации и количественного
определения генитальных микоплазм
Стандартизация всех этапов анализа!
I Стандартизация процедуры получения
клинического материала
II Стандартизация процедуры экстракции ДНК
из клинического материала
III Стандартизация процедуры анализа и
обсчета данных
I Стандартизация процедуры получения
клинического материала
 использование
универсальных
зондов/тампонов
 инструкции по
забору клинического
материала
II Стандартизация процедуры экстракции
ДНК из клинического материала
Сорбентная
методика
Экспрессметоды
Эффективность экстракции ДНК
Сорбентная методика
45-69%
Экспресс-методы
<1-9%
III Стандартизация процедуры анализа и
обсчета данных
Калибраторы
Использование эндогенного внутреннего
контроля
ДНК человека
Контроль качества
получения клинического
материала
Возможность оценки
плотности обсемененности
возбудителем
Контроль качества получения
клинического материала
Распределение концентрации ДНК человека в
женских и мужских образцах (ГЭ/реакц)
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
0
1 Женщ ины
2
Мужчины
3
Пороговые значения концентрации эндогенного
ВКО в образцах
Женские образцы
Мужские образцы
1000 копий в ПЦР
100 копий в ПЦР
Возможность оценки плотности
обсемененности
Абсолютные значения
концентрации
Нормированные значения
концентрации
 Общее содержание
микроорганизмов в
клиническом
материале, взятом в
транспортную среду
(ГЭ/мл)
 Количество клеток
возбудителя относительно
клеток слизистой человека
(ГЭ на 105 клеток человека)
104ГЭ/мл≈500копий на 105
клеток человека
Корреляция между концентрацией
генитальных микоплазм и концентрацией
глобинового гена в образцах
зависимость кол-ва Ureaplasma от кол-ва клеток
7.0
кол-во клеток в мл
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
2.0
3.0
4.0
5.0
кол-во Ureaplasma в мл
6.0
7.0
Наборы для мультиплексной ПЦР
(U.parvum/U.urealyticum/M.hominis) в
количественном формате
• Видовая дифференциация генитальных
микоплазм
• Количественное определение;
• Высокая воспроизводимость теста;
• Широкий линейный диапазон измерений;
• Возможность нормировки полученных
значений.
Оценка роли генитальных микоплазм у
беременных женщин
 718 беременных женщин (III триместр), клиника акушерства и
гинекологии им.В.Ф.Снегирева
 После исключения (наличие облигатных патогенов, неполные
данные) – 662 женщины
 ПЦР-исследование (облигатные патогены, условно-патогенные
микроорганизмы)
 Микроскопия с окраской по Граму
 Бактериологическое исследование
Роль генитальных микоплазм в развитии
патологии беременности в отсутствие другой
условно-патогенной флоры
Микоплазмы
монокультура
N=9
Lacto
N=29
Myc neg
N=383
p
Выр. дисбиоз
0
1
9
0,834
Умер. дисбиоз
0
1
6
0,691
Легкий дисбиоз
0
0
9
0,634
БВ
0
0
3
0,861
МЦ
0
0
19
0,373
Д н/я
Патол.
выделения
0
1
6
0,691
0
1
50
0,471
Гиперемия
0
0
33
0,169
Запах
0
0
18
0,393
Зуд
0
0
20
0,353
Прежд. роды
0
1
13
0,854
ПИОВ
Маловесные
дети
0
2
41
0,479
0
3
15
0,230
Инф. осл. у детей
1
0
11
0,240
Эндометрит
0
0
9
0,634
Показатель
Ассоциация генитальных микоплазм с
признаками воспаления во влагалище
Показатель
Патол. вы деления
Гиперемия
Запах
Зуд
Мик<500 Мик>500 Контроль
p
18,5
22,7
13,1
0.003
9,3
8,4
8,6
0.982
13,0
12,9
4,7
<0.001
9,3
8,0
5,2
0.281
104ГЭ/мл≈500копий на 105 клеток человека
Частота обнаружения другой условнопатогенной флоры во влагалище
одновременно с генитальными микоплазмами
Показатель
Gv pos
Av pos
Ca pos
Cg pos
Ck pos
Ec pos
Sta pos
Str pos
Uspp<500 Uspp>500
52,0
54,9
38,0
30,1
36,0
32,5
0,0
1,9
2,0
2,9
16,0
10,7
54,0
73,3
100,0
100,0
Mh<500
60,0
60,0
30,0
0,0
0,0
10,0
60,0
100,0
Mh>500 Контроль
p
100,0
29,5
<0.001
100,0
18,8
<0.001
30,8
26,4
0.445
0,0
1,3
0.820
0,0
3,1
0.932
15,4
15,1
0.622
69,2
68,4
0.115
100,0
100,0
Оценка влияния генитальных микоплазм на
патологию родов, послеродового периода
Показатель
Прежд. роды
ПИОВ
Эндометрит
Мик<500 Мик>500 Контроль
3,7
5,8
3,4
14,8
11,1
10,7
3,7
3,1
2,3
p
0.363
0.668
0.769
Оценка влияния генитальных микоплазм на
патологию раннего неонатального периода
Показатель
Маловесны е дети
Инф. осл.
Мик<500 Мик>500 Контроль
3,7
6.7
3,9
1,9
5,8
2,9
p
0.287
0.134
Mycoplasma hominis+ Ureaplasma parvum+
Ureaplasma urealyticum –
маркеры возможного нарушения биоценоза
влагалища
При определении тактики лечения необходимо
не только исключение облигатных патогенов,
но и комплексная оценка биоценоза
влагалища
Заключение
• Необходима дифференциация генитальных
микоплазм до вида
• Концентрация генитальных микоплазм имеет
значение при интерпретации лабораторных
данных и определении тактики лечения
• ПЦР в реальном времени с количественной
оценкой возбудителя в формате
мультипрайм – удобный инструмент в
диагностике инфекций, ассоциированных с
генитальными микоплазмами
Заключение
• Не обнаружено ассоциации генитальных
микоплазм с патологией родов, послеродового и
раннего неонатального периода
• Обнаружена связь между наличием генитальных
микоплазм во влагалищном отделяемом
беременных женщин и наличием клинической
картины воспаления во влагалище
• Такая взаимосвязь объясняется наличием
полимикробных ассоциаций, в формировании
которых принимают участие генитальные
микоплазмы
Спасибо за внимание!