Диссертациионная работа Крылдакова Р

Казахский Национальный аграрный университет
УДК
На правах рукописи
578.4; 578.852; 575.116.1
КРЫЛДАКОВ РУСЛАН ВЛАДИМИРОВИЧ
Экология вируса картофеля М в семействе Solanaceae
6D060800-Экология
Диссертация на соискание ученой степени
доктора философии (PhD)
Научные консультанты
доктор биологических наук,
профессор Искаков Б.К.
PhD, Шамекова М.Х.
PhD, Rajeswaran Rajendran
Республика Казахстан
Алматы, 2014
1
СОДЕРЖАНИЕ
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ…………………….
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………...
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………….
1
1.1
Семейство пасленовых……………………………………….
1.1.1
Ботаническая и морфологическая характеристика
картофеля……………………………………………………...
1.1.2
Болезни картофеля……………………………………………
1.1.2.1 Неинфекционные болезни……………………………………
1.1.2.2 Инфекционные болезни………………………………………
1.1.3
Номенклатура и классификация фитопатогенных вирусов..
1.1.4
Симптомы вирусных болезней растений……………………
1.1.5
Распространение вирусов внутри растения…………………
1.1.6
Способы распространения фитопатогенных вирусов……...
1.1.7
Сохранение вирусов………………………………………….
1.1.8
Влияние окружающей среды на развитие вирусов и
вирусных болезней……………………………………………
1.1.9
Экология вирусов растений………………………………….
1.1.9.1 Биологические факторы………………………………………
1.1.9.2 Физические факторы…………………………………………
1.1.9.3 Сохранение вируса на протяжении годового цикла………..
1.1.9.4 Сельскохозяйственные мероприятия и эволюция вирусов...
1.1.10 Распространенные типы заболеваний картофеля и
симптомы………………………………………………………
1.1.11 Типы устойчивости растений картофеля к вирусам
1.1.12 Генетический контроль устойчивости растений к
вирусным заболеваниям. Картирование генов
устойчивости………………………………………………….
1.1.13 Механизмы устойчивости……………………………………
1.1.14 Защита растений от вирусных болезней…………………….
1.1.14.1 Терапевтические мероприятия………………………………
1.1.14.2 Профилактические мероприятия…………………………….
1.2
М вирус картофеля …………………………………………...
1.3
РНК-интерференция………………………………………….
1.3.1
Механизм действия RNAi……………………………………
1.3.2
Пост-транскрипционное замолкание генов…………………
1.3.2.1 Короткие интерферирующие РНК…………………………..
1.3.2.2 МикроРНК…………………………………………………….
1.3.2.3 RISC-комплекс………………………………………………..
1.3.3
Замолкание эндогенных мРНК, вызванное микроРНК…….
1.3.4
Транскрипционное замолкание генов……………………….
1.3.5
Распространение замолкания генов по растению…………..
1.3.6
Замолкание генов и антивирусная защита растений……….
2
4
6
11
11
11
12
12
13
15
16
18
20
22
23
23
23
28
28
29
30
33
35
36
37
37
39
41
46
49
50
50
51
52
52
53
53
54
1.3.7
1.3.7.1
1.3.7.2
1.3.7.3
1.4
2
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
2.13
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
Вирусные белки-супрессоры замолкания генов……………
Белок HC-Pro вирусов рода Potyvirus………………………….
Белок P19 вирусов рода Tombusvirus…………………………..
Белки-супрессоры RNAi М вируса картофеля……………..
Генетически модифицированные (ГМ) организмы………..
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………………………….
Материалы исследования…………………………………….
Компьютерный анализ ………………………………………
Выделение М вируса картофеля……………………………..
Выделение РНК М вируса картофеля……………………….
Реакция обратной транскрипции ……………………………
Полимеразная цепная реакция……………………………….
Трансляция in vitro в бесклеточной системе из зародышей
пшеницы………………………………………………………
BP реакция с использованием Gateway технологии………..
Трансформация компетентных клеток………………………
LR реакция с использованием Gateway технологии………..
Трансформация клеток Agrobacterium tumefaciens………….
Коинфильтрация Nicotiana benthamiana линии 16C……….
Общие методы ……………………………………………….
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ………………………..
Анализ РНК растений с помощью нозерн-блот
гибридизации………………………………………………….
Получение очищенного препарата М-вируса картофеля ….
Кодирующие районы гРНК PVM и возможные способы
экспрессии генов ……………………………………………..
Выделение геномной РНК PVM……………………………..
Получение бесклеточной системы из зародышей пшеницы
и трансляция РНК PVM ……………………………………...
Амплификация целевых кДНК-фрагментов гРНК PVM…..
Клонирование амплифицированных кДНК-фрагментов
гРНК PVM в бактериальном векторе с использованием
Gateway-технологии …………………………………………
Клонирование амплифицированных кДНК-фрагментов с
ОРС гРНК PVM в растительном векторе с использованием
Gateway-технологии ………………………………………….
Идентификация супрессоров РНК-интерференции
методом коинфильтрации растений Nicotiana benthamiana.
Получение трансгенных растений картофеля, содержащих
в геноме кодирующие последовательности генов белка
12К и белка оболочки PVM………………………………….
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………...
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ…….
3
54
55
56
57
58
60
60
60
60
60
61
61
61
62
62
62
62
63
63
64
64
65
66
69
70
71
73
74
76
78
84
86
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
АТФ
БСА
ВТМ
ГТФ
ДНК
кДНК
д.п.и.
ДС-Na
ДТТ
МВК
мг
мкл
-МЭТ
нг
нм
НТП
об/мин
ОРС
ПАА-гель
ПЦР
РОТ
РНК
РНКи
асРНК
гРНК
дцРНК
киРНК
мРНК
миРНК
оцРНК
сРНК
сгРНК
ТБ
Ac
BP реакция
CaMV
ELISA
Gateway
аденозинтрифосфат
бычий сывороточный альбумин
вирус табачной мозаики
гуанозинтрифосфат
дезоксирибонуклеиновая кислота
копия-ДНК
дни после инфильтрации
додецилсульфат натрия
дитиотрейтол
М-вирус картофеля (см. PVM)
микрограмм
микролитр
-меркаптоэтанол
нанограмм
нанометр
нетранслируемая последовательность
обороты в минуту
открытая рамка считывания
полиакриламидный гель
полимеразная цепная реакция
реакция обратной транскрипции
рибонуклеиновая кислота
РНК-интерференция (или RNAi от RNA-interference)
антисмысловая РНК (или asRNA от antisense RNA)
геномная РНК
двухцепочечная РНК (или dsRNA от double stranded RNA)
короткая интерферирующая РНК (или siRNA от short interfering
RNA)
матричная РНК
микроРНК (или miRNA от microRNA)
одноцепочечная РНК (или ssRNA от single stranded RNA)
смысловая РНК (или sRNA от sense RNA)
субгеномная РНК
транспортные белки
ацетат
см. Gateway
от Cauliflower mosaic virus, вирус мозаики цветной капусты
enzyme-linked immunosorbent assay
технология, позволяющая клонировать фрагменты ДНК, с
использованием ферментов рекомбинации BP-Clonase, LRClonase
4
IHF
Int
LR реакция
LRR
MMuLV-RT
Pfu
PLRV
PTGS
PVL
PVM
PVS
PVX
PVY
RdRp
RFLP
RNAi
TBSV
TGB
TGS
TMV
ToMV
VIGS
Xis
integration host factor; фермент, необходимый в Gatewayтехнологии
integrase; фермент, необходимый в Gateway-технологии
см. Gateway
leucine-rich repeat (богатая лейцином повторность)
обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей
термофильная ДНК-полимераза
potato leaf-roll virus (или ВСЛК от вирус скручивания листьев
картофеля)
post-transcriptional gene silencing (пост-транскрипционное
молчание генов)
potato virus L (см. PLRV или ВСЛК)
potato virus M (см. МВК)
potato virus S (S вирус картофеля)
potato virus X (X вирус картофеля)
potato virus Y (Y вирус картофеля)
RNA-dependent RNA-polymerase
Restriction Fragment Length Polymorphism
РНК-интерференция
tomato bushy stunt virus (вирус кустистости и задержки роста
томата)
triple gene block (группа из трех генов, кодирующих белки,
ответственные за распространение вируса в соседние клетки, а
также системно по всему растению)
transcriptional gene silencing (транскрипционное молчание генов)
tobacco mosaic virus (см. ВТМ)
tomato mosaic virus (вирус мозаики томата)
virus-induced gene silencing (вирус-индуцируемое молчание
генов)
excisionase; фермент, необходимый в Gateway-технологии
5
ВВЕДЕНИЕ
Общая характеристика работы. Диссертационная работа посвящена
идентификации белков М вируса картофеля (PVM), которые вызывают
супрессию процесса РНК-интерференции в клетках зараженного растенияхозяина.
Для достижения этой цели были последовательно выполнены следующие
этапы работы: выделение очищенного препарата PVM и его геномной (г)РНК;
проведение компьютерного анализа гРНК PVM для выявления открытых рамок
считывания (ОРС), а также расчет и синтез олигонуклеотидных праймеров;
амплификация кДНК-фрагментов гРНК PVM, содержащих ОРС (№2 - №6) с
помощью реакции обратной транскрипции (РОТ) и полимеразной цепной
реакции (ПЦР); клонирование всех амплифицированных кДНК-фрагментов в
бактериальных и растительных векторах; идентификация вирусных белков –
супрессоров клеточного процесса РНК-интерференции (RNAi) путем
транзитной экспрессии клонированных ОРС гРНК PVM в индикаторных
растениях табака Nicotiana benthamiana линии 16C; создание ДНКконструкций, несущих в прямой и обратной ориентациях ОРС гРНК PVM,
кодирующих установленные белки – супрессоры RNAi, для получения
трансгенных растений с генетически закрепленной устойчивостью к PVM.
Актуальность темы. Одним из важнейших клеточных механизмов,
участвующих в метаболизме РНК, в настоящее время признана РНКинтерференция (RNAi). RNAi играет важную роль не только в процессах
модуляции стабильности и деградации мРНК, но также в регуляции процессов
трансляции мРНК, транскрипции генов, поддержании структуры хроматина и
целостности генома [1]. У растений этот механизм первоначально получил
название посттранскрипционного замолкания генов или PTGS (от PostTranscriptional Gene Silencing) и рассматривался как основной клеточный
механизм защиты от вирусов [2]. Было также установлено, что многие
вирусные белки способны подавлять (супрессировать) клеточный процесс
RNAi (RSS-белки – от RNA silencing suppressor proteins) и тем самым
обеспечивать вирусам условия для размножения в клетках растений [2, 3]. К
настоящему времени для ряда некоторых растительных вирусов (в том числе
семейств поти- , томбус- и кукумовирусов) RSS-белки установлены и показаны
молекулярные механизмы их функционирования [3, 4, 5]. Однако для
большинства вирусов и в частности для М-вируса картофеля (PVM)
существование RSS-белков и механизмы их действия остаются не
исследованными.
Картофелеводство является одной из важнейших отраслей сельского
хозяйства Казахстана. Картофель в Казахстане является одним из основных
продуктов питания и по своей значимости занимает второе место после хлеба.
Однако существует более 20 вирусных заболеваний картофеля. Только из-за
поражения вирусами Y, M, X, S, L, наиболее распространенными в
картофелеводческих районах Республики Казахстан урожайность картофеля
ежегодно снижается до 80%.
6
Общеизвестно, что вирусы, попадая в клетки растения-хозяина,
постепенно переключают белок-синтезирующий аппарат клетки на трансляцию
вирус-специфических мРНК. Это достигается за счет того, что вирусные мРНК
являются весьма конкурентно-способными, и экспрессируются намного
эффективнее, чем клеточные мРНК. Кроме того, вирусы в процессе эволюции
выработали защиту против РНК-интерференции растений, заключающуюся в
синтезе белков, которые блокируют внутриклеточный процесс РНКинтерференции на одной из его стадий.
Поэтому изучение экологических аспектов выживания вируса в организме
растения на молекулярном уровне позволит найти такие консервативные
мишени для создания устойчивых к фитопатогенным вирусам трансгенных
растений, которые не будут зависеть от быстрого мутирования штаммов, а
возможно будут эффективны против нескольких родственных вирусов.
М вирус картофеля (PVM) - один из вредоносных для сельского хозяйства,
потеря урожая из-за которого составляет около 30%, а в сочетании с другими
вирусами - до 60%. Разработка новых технологий, эффективно снижающих
заболеваемость вирусными инфекциями для картофеля, являются актуальной
задачей сельскохозяйственной биотехнологии. В этой связи исследования
молекулярных механизмов супрессии РНК-интерференции, используемой
данным вирусом в растениях картофеля, представляются весьма актуальными.
Также весьма перспективными представляются поиски возможных механизмов
защиты от РНК-интерференции, которые могут быть использованы в
биоинженерии растений для повышения экспрессии трансгенов, кодирующих
ценные белки. Познание этих механизмов послужит созданию эффективных
биотехнологий защиты растений методами генетической инженерии.
Как показывает практика, использование технологии оздоровления
семенного картофеля методом культивирования апикальной меристемы не
устраняет возможности повторного заболевания растений в почве. В связи с
этим особую важность приобретают сорта картофеля с генетически
закрепленной устойчивостью к вирусным заболеваниям. На создание таких
сортов традиционными методами требуются десятилетия, причем необходимо
учитывать, что донорами генов устойчивости к вирусным заболеваниям
являются в основном дикие виды растений, которые не всегда можно скрестить
с культурными сортами, используя классические методы селекции. Более того,
для заболеваний, вызываемых М-вирусом картофеля (PVM), доноры генов
устойчивости не найдены. В этом случае особенно актуальным становится
применение методов генной инженерии.
Успехи молекулярной биологии, генетической и клеточной инженерии
высших растений, достигнутые в последние годы, способствовали созданию
новых сортов ряда культурных растений с заданными свойствами, в том числе
увеличение урожайности, усиление устойчивости к неблагоприятным
экологическим факторам окружающей среды, ряду вирусных заболеваний.
В данной работе мы рассматриваем экологию вируса с точки зрения
стратегии его выживания и защитных механизмов, выработанных вирусом в
процессе эволюции.
7
Цель и задачи исследования. Целью исследования является изучение на
молекулярно-генетическом и организменном уровне экологии М вируса
картофеля (PVM) в растениях семейства паслёновых (Solanaceae), обладающих
различной чувствительностью к инфекции, путём определения специфических
белков PVM, которые вызывают супрессию процесса РНК-интерференции
(RNAi) в зараженных клетках растения-хозяина.
Для ее достижения решались следующие задачи
1. Анализ геномной РНК PVM для выявления открытых рамок считывания
(ОРС), а также консервативных нуклеотидных последовательностей, наиболее
подходящих в качестве мишеней при индукции РНК-интерференции в
генетически модифицированных растениях.
2. Дизайн и синтез олигонуклеотидных праймеров, а также амплификация
кДНК-фрагментов, которые содержат ОРС2 - ОРС6, кодирующие белки PVM.
3. Клонирование каждого из амплифицированных кДНК-фрагментов в
бактериальных и растительных экспрессионных векторах.
4. Экспрессия каждой из клонированных ОРС в модельных индикаторных
растениях (N. benthamiana линии 16С) из семейства Solanaceae и
идентификация белков PVM – супрессоров РНК-интерференции.
5. Создание рекомбинантных ДНК-конструкций, которые несут в прямой и
обратной ориентациях нуклеотидные последовательности ОРС гРНК,
кодирующие белки PVM с установленной RNAi-супрессорной активностью,
для получения трансгенных растений с генетически закрепленной
устойчивостью против PVM.
Объекты исследования: М вирус картофеля (PVM), его геномная (г)РНК;
растения семейства Solanaceae - табак (N. benthamiana линии 16С) и картофель
(Solanum tuberosum).
Предмет исследования: Белки PVM, супрессирующие процесс RNAi в
клетках инфицированных растений, а также рекомбинантные ДНКконструкции, способные индуцировать RNAi, которые позволяют получить
трансгенные растения с генетически закрепленной устойчивостью против PVM
и других родственных вирусов.
Методы исследования. В работе использованы как классические методы
микробиологии и вирусологии, так и современные методы молекулярной
биологии, генной и клеточной инженерии растений.
Научная новизна исследования: Новизна работы заключается в том, что
впервые выявлены белки PVM - TGB2 (12К-протеин) и белок оболочки (СР или
34К-протеин), обладающие наиболее выраженной активностью в подавлении
РНК-интерференции у растений семейства пасленовых.
Теоретическое и практическое значении работы. Сам процесс РНКинтерференции был обнаружен и активно изучается лишь в последние годы [3,
4, 5]. Открытие RNAi вошло в десять наиболее важных научных достижений
первой декады 21 века, а за изучение молекулярного механизма RNAi
американским ученым Э. Файру (A. Fire) и К. Мелло (C. Mello) была
присуждена Нобелевская премия 2006 года [6].
8
Исследование процесса RNAi на растительных объектах является
перспективным для познания молекулярных механизмов защиты от вирусных и
вироидных заболеваний. Для выбранного нами объекта – М вирус картофеля –
такие исследования являются приоритетными. До настоящего времени RSSбелкам PVM уделялось сравнительно немного внимания и в данной работе
многие из них исследованы впервые.
Нами впервые проведен поиск и идентификация белков PVM,
подавляющих защитный механизм RNAi клеток картофеля – естественного
хозяина этого вируса. Знание этих белков и механизмов их действия позволит с
помощью методов генной и клеточной инженерии создавать перспективные
исходные линии картофеля с повышенной и генетически закрепленной
устойчивостью против PVM, а также против близких ему по строению вирусов
(PVS, PVX).
Культивирование растений картофеля с генетически закрепленной
устойчивостью к патогенным вирусам, позволит значительно (в 2-3 раза)
повысить его урожайность и снизить необходимость применения пестицидов и
инсектицидов, что должно сэкономить сотни миллионов тенге, а также
благоприятно сказаться на оздоровлении экологической обстановки в
республике Казахстан.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Впервые проведено клонирование многих кДНК-генов М вируса
картофеля (ОРС25К, ОРС12К, ОРС7К, ОРС34К и ОРС11К) в экспрессионном
векторе pMDC32 под контролем конститутивного 35S промотора CaMV и nosтерминатора. С использованием коинфильтрации индикаторных растений N.
benthamiana 16C клетками агробактерий, несущих эти конструкции, впервые
проведено тестирование многих белков М вируса картофеля как потенциальных
супрессоров РНК-интерференции.
2. Впервые идентифицированы белки PVM, наиболее интенсивно
супрессирующие РНК-интерференцию: 12К-протеин (TGB2, кодируемый
ОРС3) и 34К-протеин (СР, кодируемый ОРС5). Значительно меньшую
супрессорную активность проявили 25К-протеин (TGB1, кодируемый ОРС2) и
11К-протеин (CYS-белок, кодируемый ОРС6), а белок, кодируемый ОРС4 (7Кпротеин или TGB3) супрессорной активности не имел.
3. Впервые созданы экспрессируемые в растениях конструкции, в которых
кДНК-гены PVM, кодирующие установленные белки-супрессоры RNAi (12К и
34К), клонированы в прямой и обратной ориентации для индукции у
трансгенных растений картофеля процесса RNAi против гРНК PVM и других
родственных вирусов.
Связь работы с научно-исследовательскими программами
Диссертационная работа выполнялась в рамках проекта «Разработка
биотехнологии получения трансгенных растений картофеля, устойчивых к
фитопатогенным вирусам, с помощью РНК-интерференции» (№ Гос.
Регистрации: 0106РК00195, в составе научно-технической программы НТПЦ
0382 в период 2006-2008 гг.); грантового проекта 0226/ГФ «Исследование
молекулярных механизмов взаимодействия вируса и растения: выявление
9
белков М вируса картофеля, подавляющих процесс РНК-интерференции клеток
хозяина» (№ Гос.Регистрации: 0112РК00463 в период 2012-2014 гг.); а также
проекта “Plant RNA-based Immunization”, финансируемого международной
ассоциацией INTAS (№06-1000014-6200, 2007-2008 гг.), который был частично
выполнен в лаборатории профессора Томаса Хона (Prof. Thomas Hohn, Botanical
Institute, Basel, Switzerland).
Апробация работы. Результаты исследований и основные положения
диссертации были доложены и представлены на международных и
республиканских
конференциях:
International
Symposium
“Molecular
Mechanisms of Genetic Processes and Biotechnology” (Москва, Россия, 2001);
International Congress on Protein Expression and Protein Function (Berlin, Germany,
2003); II Московский международный Конгресс “Биотехнология: состояние и
перспективы развития” (Москва, Россия, 2003); VII International Congress of
Plant Molecular Biology (Barcelona, Spain, 2003); Материалы I Международной
конференции «Астана Биотех 2008» (Астана, Казахстан, 2008); Международная
научная конференция по биологии и биотехнологии растений (Алматы,
Казахстан, 2014).
Публикации. Основные положения, результаты, выводы и заключение
диссертации изложены в 20 печатных работах, из них: 3 статьи в зарубежных
научных журналах, входящих в базы данных Thomson Reuters и Scopus; 7
статей в журналах РК, рекомендованных Комитетом науки МОН РК; 6 тезисов
в материалах конференций зарубежья, 3 тезиса в материалах международных
конференций РК; принята 1 заявка на инновационный патент (регистрационный
№2014/0167.1, дата поступления 12.02.2014).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на
103 страницах и включает Введение, Обзор литературы, Материалы и методы
исследования, Результаты исследования и обсуждение, Заключение, Список
использованных источников (270 наименований). Работа содержит 23 рисунка
и 7 таблиц.
10
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Семейство пасленовых
В семействе около 90 родов и не менее 2500 видов, широко
распространенных в тропических, субтропических и умеренных областях,
главным образом в Центральной и Южной Америке [7].
Представители семейства — травы, кустарники или небольшие деревья с
очередными (иногда в области соцветия супротивными), простыми листьями.
Цветки обычно в пазушных верхоцветных соцветиях, обоеполые,
актиноморфные или реже слегка зигоморфные. Чашечка обычно 5-лопастная
или 5-раздельная, остающаяся, часто при плодах увеличенная. Венчик от
колесовидного до трубчатого, 5-лопастный, редко двугубый. Тычинок обычно 5
или в зигоморфных цветках меньше (4-2); пыльники вскрываются продольно
или верхушечными порами. Нектарный диск обычно развит. Гинецей обычно
из 2 плодолистиков, редко из 5 плодолистиков, обычно с верхушечным
простым столбиком с двулопастным рыльцем; завязь обычно двугнездная
(иногда ложно-3 или 5-гнездная) или редко 5-гнездная, обычно с
многочисленными семязачатками. Плод — ягода или септицидная коробочка,
редко плод распадающийся. Семена с эндоспермом. Цветки пасленовых
опыляются различными насекомыми, а в тропических странах также птицами, а
иногда даже млекопитающими [7].
Пасленовые (Solanaceae) – широко распространенное семейство
двудольных растений, содержащее:
съедобные и культивируемые виды, такие как томат (Solanum
lycopersicum), баклажан (Solanum melongena), табак (Nicotiana tabacum) и
стручковый перец (Capsicum annum);
декоративные виды, такие как никандра (Nicandra physalodes), дереза
(Lycium chinense), физалис обыкновенный (Physalis alkekengi);
лекарственные, такие как красавка обыкновенная, или белладонна (Atropa
belladonna), скополия (Scopolia carniolica), белена черная (Hyoscyamus niger),
дурман обыкновенный (Datura stramonium).
Одним из типичных представителей этого семейства, насчитывающего
около 90 родов и не менее 2500 видов, является картофель клубненосный
(Solanum tuberosum) [7].
1.1.1 Ботаническая и морфологическая характеристика картофеля
Картофель клубненосный - травянистое растение, достигающее в высоту
более 1 метра. Стебель голый, ребристый. Часть стебля, погружённая в почву,
выпускает длинные побеги (длиной 15—20, у некоторых сортов 40—50 см).
Лист картофеля тёмно-зелёный, прерывисто-непарноперисторассечённый,
состоит из конечной доли, нескольких пар (3—7) боковых долей, размещённых
одна против другой, и промежуточных долек между ними. Непарная доля
называется конечной, парные доли имеют порядковые названия — первая пара,
вторая пара и т. д. (счёт ведётся от конечной доли). Доли и дольки сидят на
11
стерженьках, прикреплённых к стержню, нижняя часть которого переходит в
черешок. Около долей пар размещаются ещё более мелкие дольки.
Цветки белые, розовые и фиолетовые, собраны щитком на верхушке
стебля, чашечка и венчик пятираздельные.
Из пазух зачаточных листьев в подземной части стебля отрастают
подземные побеги — столоны, которые, утолщаясь на вершинах, дают начало
новым клубням (видоизменённым побегам). На концах столонов развиваются
клубни, которые, в сущности, не что иное, как вздувшиеся почки, вся масса
которых состоит из тонкостенных гранёных клеток, наполненных крахмалом, а
наружная часть состоит из тонкослойной пробковой ткани. Клубни созревают в
августе — сентябре.
Плод — многосемянная, тёмно-зелёная, ядовитая ягода диаметром 2 см. В
зелёных вегетативных частях растения содержится алкалоид соланин, который
служит для защиты растения от поражения бактериями и некоторыми видами
насекомых. В связи с этим позеленевшие клубни картофеля несъедобны [8].
1.1.2 Болезни картофеля
Картофель - одна из важнейших сельскохозяйственных культур,
возделываемых в Казахстане на площади около 180-190 тысяч га [9, 10].
Однако, по данным Хасанова и др., урожайность картофеля очень низка,
примерно 8-12 т/га [11], за последние несколько лет средняя урожайность не
превышает 15,5-16 т/га [12, 13], а на юго-востоке Казахстана не более 13 т/га
(по данным Красавина [14]). Одной из причин такой низкой урожайности
является широкое распространение болезней, вредителей и сорняков.
Болезни картофеля обычно разделяют на инфекционные (паразитарные) и
неинфекционные.
1.1.2.1 Неинфекционные болезни
Неинфекционные болезни растений представляют собой своеобразную
группу, принципиально отличающуюся от болезней инфекционных [15]:
Первая особенность неинфекционных болезней заключается в том, что
отсутствует возбудитель патологического процесса, а причинами развития
болезни служат абиотические факторы окружающей среды. Неблагоприятное
воздействие среды может в значительной степени нарушать те или иные
функции растений, влиять на морфологические признаки, существенно
изменять процессы жизнедеятельности, т.е. вызывать патологический процесс.
Вторая особенность неинфекционных болезней – одновременное массовое
появление их признаков на растениях, что объясняется, как правило,
воздействием неблагоприятных факторов внешней среды на растения в
пределах всего поля, сада, теплицы и т.д. Только когда речь идет о
неблагоприятных почвенных условиях (микроклимат, неравномерное внесение
удобрений и т.д.), проявление болезни может носить очаговый характер. В этих
случаях четко видна ограниченность действия неблагоприятного фактора, и
болезнь не распространяется за пределы его влияния.
12
Третья особенность заключается в том, что неинфекционные болезни не
передаются от растения к растению и развитие их можно приостановить,
исключив действие неблагоприятного фактора внешней среды.
Неинфекционные болезни наблюдаются в тех случаях, когда происходят
нарушения условий, необходимых для роста и развития растений. Такие
заболевания не способны передаваться от одного растения другому.
Проявляются они при недостатке или избытке макро- и микроэлементов, влаги,
при механических повреждениях, воздействии высоких или низких температур,
солнца, озона и др. примесей воздуха, при неправильной обработке
ядохимикатами. Внешние признаки неинфекционных болезней специфичны и
проявляются в изменении общего вида растений (карликовость, недоразвитость
и др.), окраски определенных органов, появлении некрозов на листьях. Иногда
они сходны с симптомами некоторых вирусных болезней. Неинфекционные
болезни угнетают растения, приводят к снижению урожая, потере товарных
качеств клубней и увеличению поражения их грибами, бактериями, вирусами и
вредителями. При нормализации условий окружающей среды симптомы
неинфекционных болезней обычно исчезают [17].
Нарушения в растительных организмах, вызванные неинфекционными
патологическими процессами, ослабляют растения, а это предрасполагает к
развитию фитопатогенов. Связь между неинфекционной и следующей за ней
инфекционной болезнью называют сопряженным заболеванием. Сопряженные
болезни увеличивают вредоносность возбудителей инфекционных болезней.
Так, недостаток калия в почве резко снижает устойчивость картофеля к
фитофторозу [18].
В зависимости от вызывающих их причин неинфекционные болезни
можно разделить на следующие группы [15, 18]:
- болезни,
обусловливаемые
неблагоприятными
климатическими
условиями;
- болезни, определяемые неблагоприятными почвенными условиями;
- болезни, определяемые неблагоприятными условиями питания;
- болезни, вызываемые механическими и химическими повреждениями.
1.1.2.2 Инфекционные болезни
К инфекционным относят болезни, способные передаваться от растения к
растению. Инфекционные болезни вызываются различными организмами:
грибами, оомицетами, актиномицетами, бактериями, вирусами, вироидами,
фитоплазмами, нематодами, цветковыми растениями-паразитами. Каждый
организм-возбудитель вызывает заболевание, специфичное по своим
симптомам. Наиболее распространены из них следующие: увядания, гнили,
некрозы (отмирание тканей), пятнистости, налёты, мумификация, деформация,
наросты, изменения окраски (мозаики) [17].
Способность организма вызывать болезнь у растений называют
патогенностью, а сам организм – фитопатогеном. Растение, обеспечивающее
паразиту пропитание, называют растением-хозяином.
13
Пути воздействия на растение-хозяин можно разделить на следующие
шесть групп [15]:
1) разрушение запасающих органов – семян, плодов, древесины и других,
сопровождающееся развитием гнилей. Паразиты этой группы – грибы и
бактерии – обладают большой вредоносностью. Разрушение тканей может быть
очень быстрым, как при мокрых гнилях клубней, плодов, корнеплодов, или
медленным, как при разрушении древесины. В каждом отдельном случае
скорость разрушения определяется природой разрушаемой ткани;
2) разрушение проростков или сдерживание их развития. При
заболеваниях этого типа погибают только молодые ткани, поэтому их называют
болезнями всходов. Возбудители – главным образом грибы, реже – бактерии.
Проростки поражаются до появления их над поверхностью почвы или сразу
после этого;
3) снижение водопоглощающей способности растений наблюдается при
болезнях типа корневых гнилей. Основные возбудители – грибы, но в
патологическом процессе могут принимать участие и бактерии. Возбудители
проникают как в молодые, так и в полностью развитые корни, поэтому болезнь
развивается на протяжении всего периода вегетации. В результате поражения
ограничивается поступление воды в растение, оно увядает, а нередко и гибнет;
4) нарушение восходящего тока воды и растворенных в ней веществ из-за
поражения сосудистой системы растения. Эти болезни вызывают грибы и
бактерии. Возбудители заселяют проводящие ткани (ксилему). Вредное
действие на растение обусловлено уменьшением восходящего тока воды и
выделением в него токсичных веществ паразита;
5) снижение фотосинтетической активности в результате разрушения
возбудителями фотосинтезирующей паренхимы приводит к недобору урожая.
Болезни вызывают все группы возбудителей – грибы, бактерии, вирусы,
фитоплазмы. Основные признаки заболевания – пятнистости, налеты, пустулы,
некрозы на листьях;
6) нарушение обмена веществ в результате деятельности паразитов,
изменяющих его таким образом, чтобы обеспечить синтез необходимых им
соединений. Возбудители болезней этого типа – грибы, бактерии, вирусы. В
некоторых случаях паразит стимулирует процесс роста или деления клеток, изза чего возникают различного рода пролиферации тканей.
Вирусы и вироиды – это мельчайшие (субмикроскопические) возбудители
болезней человека, животных, растений. Они не имеют клеточного строения, не
растут на искусственных питательных средах. Размножаются только в живых
клетках организма-хозяина. В отличие от других болезней растений
инфекционный процесс при вирусных болезнях имеет своеобразное течение.
При заражении фитопатогенными вирусами гораздо чаще, чем при заражении
другими возбудителями, возникает явление латентности, когда, несмотря на
системную инфекцию, на растениях-хозяевах не проявляются симптомы
поражения, и они часто представляют собой латентный очаг инфекции. За
последние десятилетия число идентифицированных фитопатогенных вирусов
14
резко возросло. Сейчас нет ни одного вида культурного растения, у которого не
было бы обнаружено вирусных заболеваний. Увеличились пораженные
площади посевов, возросли недоборы урожаев. Рост выявленных вирусных
болезней объясняется разработкой современных методов диагностики и
многочисленными научными исследованиями [15, 16].
Точные данные о размерах убытков, причиняемых вирусными болезнями
культурных растений, получить трудно, так как не всегда эти болезни четко
диагностируются. Нередко ущерб, причиняемый вирусами, приписывают
неблагоприятным погодным и почвенным условиям. В среднем размеры
убытков от развития вирусных болезней составляют примерно 20% от общего
экономического ущерба, обусловленного паразитической деятельностью
возбудителей болезней и вредителей растений. В большинстве случаев
вирусные заболевания не вызывают гибели больных растений. Их действие
проявляется главным образом в снижении урожая [15, 18].
1.1.3 Номенклатура и классификация фитопатогенных вирусов
Преобладающее большинство вирусов получило название в соответствии с
растением-хозяином или по симптомам того растения-хозяина, из которого их
удалось выделить впервые. Принято англоязычное обозначение для
наименования вирусов. Вирусы делят на группы; за основу деления взяты вид
нуклеиновой кислоты, характер генома и морфология частиц. С.Н. Еланским
выделено 22-25 групп вирусов с указанием типичных и возможных
представителей группы [18]. Вирусы, имеющие сходные свойства, объединены
в группы без попыток установления каких-либо иерархических связей между
группами (за редкими исключениями). Для характеристики группы используют
криптограммы, описывающие молекулярные и биологические признаки в виде
четырех дробей [15, 16]:
1) в числителе – тип нуклеиновой кислоты (R – РНК, D – ДНК); в
знаменателе – число цепей нуклеиновой кислоты;
2) в числителе – молекулярная масса нуклеиновой кислоты (megaD); в
знаменателе – процентное содержание нуклеиновой кислоты в частице;
3) в числителе – форма вирусных частиц (S – сферические, Е –
удлиненные); в знаменателе – форма нуклеокапсида;
4) в числителе – хозяин (S – семенные растения, I – беспозвоночные, V –
позвоночные, Fu – грибы); в знаменателе – переносчик (Ap – тли, Au – цикадки,
Cl - жуки, Di – мухи, комары, Ne – нематоды, Fu – грибы).
О – отсутствие признака; * - признак не исследован.
По перечисленным признакам вирусы растений объединяют в группы,
которым присваивается название типового представителя каждой группы.
Некоторые группы перечислены ниже.
Тобамовирусы (R/1; 2/5; E/E; S/O) – вирусы группы мозаики табака
(Tobacco mosaic virus).
15
Потексвирусы (R/1; 2,2/6; E/E; S/O) – группа X вируса картофеля (Potato X
virus). Вызывает мозаичные симптомы.
Потивирусы (R/1; 3,5/5; E/E; S/Ap) – группа Y вируса картофеля (Potato Y
virus). Включает также вирусы мозаики фасоли, оспу слив (шарка).
Каулимовирусы (D/2; 4,5/16; S/S; S/Ap) – группа вируса мозаики цветной
капусты (Cauliflower mosaic virus), содержащего двухцепочечную ДНК.
Карлавирусы (R/1; */6; E/E; S/Ap) – группа вируса латентной мозаики
гвоздики (Carnation latent virus), а также S и M вирусов картофеля.
1.1.4 Симптомы вирусных болезней растений
По мнению К.В. Попковой, В.А. Шкаликова, Р. Мэтьюза [15, 18, 19],
симптомы вирусных болезней можно разделить на 5 основных типов по
характеру проявления: угнетение роста, изменение окраски, деформация
органов, некрозы, нарушение репродуктивных функций. При одном и том же
вирусном заболевании на растении обычно появляется несколько типов
симптомов.
Угнетение роста может выражаться в общей задержке роста всего растения
(например, при желтой карликовости картофеля); в укорачивании междоузлий
(при метельчатости верхушки картофеля); в угнетении роста главных побегов,
при этом происходит усиленное образование боковых побегов (при аспермии
томата). Угнетение роста - сопутствующий симптом при большинстве
вирусных заболеваний.
Наиболее распространенный тип проявления вирусных болезней изменение окраски. Листья приобретают мозаичную расцветку, что вызвано
чередованием желтых, светло- и темно-зеленых участков различной формы.
Хлоротичные кольца, извитые, ленточные узоры обычно являются
достоверными симптомами вирусных болезней («шарка» сливы, кольцевая
мозаика малины). Реже при вирусных болезнях желтеют жилки или
прижилковые участки ткани листа (окаймление жилок крыжовника); может
происходить общее пожелтение, или хлороз, листовой пластинки (желтуха
свеклы). У цветочных культур может меняться окраска цветков
(пестролепестность тюльпана). В зависимости от расположения участков
мозаики на листьях ее разделяют на жилковую, прижилковую и
междужилковую. При светло-желтой или белой окраске мозаику обозначают
как аукуба-мозаика, при хлоротичном окрашивании всей поверхности листа –
как желтуха. В зависимости от характера рисунка выделяют кольцевую
мозаику, полосатую мозаику и т.д.
Деформация органов происходит из-за неравномерного роста отдельных
участков тканей листьев, плодов, цветков. Это приводит к морщинистости и
деформации листьев (морщинистая мозаика картофеля, папоротниковидность
листьев томата), деформация плодов (обыкновенная мозаика огурца).
Основной тип проявления некоторых вирусных заболеваний - локальные
некрозы, обычно серого, бурого, черно-коричневого цвета, округлой и
вытянутой формы, иногда с окаймлением. Они возникают на листовых
пластинках, черешках, стеблях, плодах, семенах, клубнях и т.п. Некрозы 16
типичный симптом при стрике томата, полосчатой мозаике картофеля, «шарке»
сливы. Некрозы могут возникать в результате гибели растительных клеток из-за
непосредственного воздействия вирусов, а также из-за реакции
сверхчувствительности, когда растение само убивает свои клетки, чтобы
локализовать в них вирусного патогена и препятствовать его системному
распространению.
Некроз особого типа развивается в тканях клубня картофеля. На разрезе
клубня видны темно-бурые дуги, полосы и кольца. Иногда вдавленные дуги и
кольца видны с поверхности клубня. Некроз этого типа вызывают вирус
погремковости табака и вирус метельчатости верхушки картофеля. При
сетчатом или сосудистом некрозе наблюдается побурение сосудов клубня,
особенно в пуповинной его части. Такие симптомы характерны для
заболеваний, вызванных вирусом скручивания листьев картофеля и вирусом
желтой карликовости картофеля.
Нарушение репродуктивных функций растений при вирусных болезнях
может проявляться в виде стерильности цветков, бессемянности плодов,
опадения цветков и завязей (аспермия томата, бессемянность хризантемы).
Изредка симптомами вирусных болезней бывают опухоли и наросты
(раневой рак клевера), уплощенность и ямчатость ветвей и стволов
(бороздчатость древесины яблони).
Симптомы вирусных заболеваний могут изменяться по мере развития
патологического процесса. Для некоторых случаев характерно появление
нескольких симптомов: мозаики и задержки роста, мозаики и деформации
плодов и листьев и т.д.
В некоторых случаях на растениях, зараженных вирусами, симптомы не
проявляются вообще, т. е. имеет место латентная (бессимптомная) инфекция. В
качестве примера можно привести бессимптомное развитие Х-вируса
картофеля на многих сортах этой культуры. Внешне болезнь не проявляется до
тех пор, пока растение не попадает в неблагоприятные условия. Такие растения
представляют собой латентный очаг вирусной инфекции.
На характер проявления вирусных болезней большое влияние оказывают
условия внешней среды – температура, влажность, освещенность и т.д. Вирусы
как внутриклеточные паразиты, находятся в сильной зависимости от состояния
клеток растения-хозяина. Под влиянием внешних условий изменяется
состояние растения, а вместе с ним и условия развития вирусной инфекции.
При заражении одним и тем же вирусом в зависимости от условий среды или
могут проявиться четкие симптомы болезни на растении, или инфекция
перейдет в латентную форму.
Повышение температуры окружающей среды может приводить к
изменению симптомов вирусных болезней. Так, при температуре ниже 160С не
развиваются симптомы желтой карликовости картофеля, при более высоком
температурном уровне интенсивность их проявления быстро возрастает. С
другой стороны, повышение температуры воздуха может приводить и к
ослаблению симптомов вирусных болезней. Так, у растений картофеля,
17
зараженных вирусами складчатости и мозаики (X и А вирусы), симптомы
исчезают при температуре выше 20°С.
Влияние интенсивности и продолжительности освещения на проявление
симптомов неодинаково для разных вирусов, однако обычно высокая
освещенность и длинный световой день способствуют развитию вирусного
заболевания. Проявление симптомов многих вирусных болезней ослабляется
при затенении.
Существенное влияние на развитие вирусных болезней оказывают резкие
перепады температуры и освещенности. Так, при выращивании томата в
теплицах при оптимальных условиях температуры и влажности заражение
вирусом табачной мозаики приводит к развитию мозаичности. В то же время
более опасный тип поражения – системный некроз (стрик) в таких условиях
отсутствует. Нарушение же температурного и светового режима, а также
несбалансированный режим питания приводят к появлению стрика.
Воздействие неблагоприятных абиотических факторов на растение также
может вызвать появление симптомов, сходных с теми, которые вызывают
вирусы. Например, недостаток калия и магния вызывает у картофеля появление
краевых и междужилковых некрозов, сходных по виду с симптомами
некоторых вирусных болезней картофеля.
Выращивание растений при температурах, значительно превышающих
нормальные, может также приводить к появлению симптомов, сходных с
симптомами вирусных болезней. Так, если растение табака выдержать 4-8 дней
при температуре 37,80С, а затем перенести в помещение с температурой 220С,
то на вновь образующихся листьях появляется мозаичный рисунок,
наблюдаются посветление жилок, хлороз и другие признаки, напоминающие
симптомы вирусной инфекции. Описанные симптомы постепенно исчезают, но
могут возникнуть на растении снова при повторном воздействии высокой
температурой.
Гербициды также способны вызвать у некоторых растений симптомы,
подобные симптомам вирусных инфекций. Так, томат, табак, картофель и
другие культуры очень чувствительны к действию соединений 2,4дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д). Нарушения роста растений при
обработке ими напоминают симптомы вирусных инфекций (деформация
листьев, угнетение роста, курчавость листьев и др.).
Перечисленные примеры сходства симптомов заболеваний, вызываемых
разными причинами (инфекционными и неинфекционными), свидетельствуют
о том, что нельзя делать заключение о вирусной природе заболевания лишь по
внешним признакам без специальных анализов.
1.1.5 Распространение вирусов внутри растения
По данным К.В. Попковой, В.А. Шкаликова, Р. Мэтьюза [15, 18, 19],
вирусные частицы перемещаются из клетки в клетку по плазмодесмам, этим же
путем транспортируются вирусные нуклеиновые кислоты. При поражении
флоэмы вирусные частицы разносятся по всему растению с током питательных
веществ (в основном сверху вниз), при этом происходит системное заражение
18
растения. При цветении и плодоношении наблюдается интенсивный приток
питательных веществ к генеративным органам, одновременно вирусы
распространяются по растению снизу вверх. В меньшей степени возможно
распространение вирусов по тканям ксилемы.
Движение вирусных частиц по флоэме происходит пассивно – с током
питательных веществ. Как правило, они перемещаются сверху вниз
значительно быстрее, чем снизу вверх. Скорость транспортирования вирусов
зависит от интенсивности флоэмного тока. Так, в период формирования
клубней картофеля, когда идет отток продуктов фотосинтеза от листьев к
клубням, вместе с этим током в клубни очень быстро попадают вирусы. По
сосудистой системе вирусы проникают во все органы растения: цветки, корни,
клубни и т.д.
Вирусы обычно концентрируются в листьях, во флоэме, могут быть в
цветках; в семенах большинство их отсутствует. В корнях многие вирусы
сохраняются длительное время. В клубнях их концентрация возрастает к
моменту прорастания. Меристему корней и побегов вирусы заражают не
всегда.
Внедряясь в клетки растения-хозяина, они вызывают в них изменения
физиологических и биохимических процессов. Это проявляется в снижении
интенсивности фотосинтеза, в усилении активности дыхания и некоторых
ферментов, снижении активности регуляторов роста растений и т.д.
По характеру воздействия на пораженный организм вирусы делят на две
большие группы – вирусы мозаичного типа и вирусы желтушного типа.
При заражении вирусами желтушного типа наблюдаются более сильные
повреждения, чем при заражении вирусами мозаичного типа. Характерная
особенность проявления заболеваний желтушных вирусов – деформация всего
растения или отдельных его частей (скручивание листьев, карликовость,
чрезмерная кустистость, израстание). Желтушные вирусы влияют на
сосудистую систему растений, вызывают отмирание и разрушение клеток
флоэмы, приводят к появлению в сосудах ксилемы барьеров и т.д.
В результате заражения мозаичными вирусами изменяется окраска
пораженных органов растений из-за торможения образования хлоропластов, а в
ряде случаев – и их разрушения. Нарушение формы наблюдается обычно
только в пределах отдельных листьев и проявляется в их морщинистости
вследствие неравномерного роста мезофилла и жилок.
Мозаичные вирусы обитают в основном в клетках паренхимы, а вирусы
желтушного типа – во флоэме. Характер заселения тканей растения-хозяина
определяет не только различие в проявлении симптомов заболеваний,
вызываемых вирусами этих групп, но и способ распространения патогенов от
растения к растению. Мозаичные вирусы передаются насекомыми
неперсистентно (основной переносчик – тля), но могут распространяться и
контактным способом. Вирусы желтушного типа передаются персистентно
главным образом цикадками.
19
1.1.6 Способы распространения фитопатогенных вирусов
Вирусы, вызывающие болезни растений, могут распространяться
различными путями [15, 18, 19].
Вирусы могут передаваться контактно-механическим путем, т. е. при
взаимоповреждающем контакте частей здорового и больного растений. Это
происходит при соприкосновении надземных или подземных частей растений
при загущенной посадке, а также в процессе ухода за растениями (обламывание
пасынков, срезка цветов, сбор плодов и т. п.). Контактным способом
распространяются вирусы, которые развиваются и накапливаются в клетках
эпидермиса, т.е. возбудители мозаики. У некоторых из них, например, у ВТМ,
X вируса картофеля, этот способ преобладает. Контагиозность, т.е.
инфекционность их очень велика. Достаточно небольших ранок на поверхности
растений (например, повреждения волосков на листьях), чтобы появилась
возможность контактной передачи. На большие расстояния контактные вирусы
передаются в процессе ухода за посевами (рыхление, окучивание, прополка и
т.д.). Так, ВТМ и X вирус картофеля могут сохраняться на одежде
работающего, его руках, орудиях производства и т.д. Часть вирусов (около 20
%) способна передаваться через семена, причем различают поверхностную и
внутреннюю семенную инфекцию. Таким способом передаются практически
все вирусы бобовых культур, вирус табачной мозаики, вирус зеленой крапчатой
мозаики огурца. Некоторые вирусы плодовых и ягодных культур (вирус
некротической кольцевой пятнистости косточковых) могут передаваться через
пыльцу.
У вегетативно размножаемых культур (картофеля, земляники, тюльпана и
др.) вирусы распространяются в основном с посадочным материалом. При
различного рода прививках (трансплантации) происходит распространение
вирусных болезней. Этим методом передаются все известные фитопатогенные
вирусы.
Многие вирусы распространяются переносчиками (векторами), которые
питаются или паразитируют на растении. Это самый распространенный способ
передачи вирусов в природе. Известно уже около 400 видов членистоногих –
тлей, клопов, цикад, трипсов, клещей, переносящих свыше 200 различных
вирусов. Среди переносчиков наиболее важная роль принадлежит персиковой
тле: она способна передавать более 60 вирусов. Часть вирусов передается
клещами, питающимися листьями и почками. Распространять вирусы могут
также нематоды и грибы. Единичные вирусы (вирус мозаики табака, вирус
некроза табака) могут передаваться с растительными остатками, с почвой, с
гидропонным раствором. Лишь сравнительно небольшое количество
фитопатогенных вирусов (вирус обыкновенной мозаики фасоли) передается
насекомыми с грызущим ротовым аппаратом: жуками, прямокрылыми,
уховертками. Такая передача малоспецифична и имеет значение только для
вирусов, способных сохраняться в соке больного растения.
Большинство фитопатогенных вирусов распространяется насекомыми с
колюще-сосущим ротовым аппаратом. Это различные виды тлей, цикадки,
белокрылки, трипсы, клопы. Клещи также могут быть переносчиками вирусов.
20
Существуют вирусы, которые могут передаваться различными
переносчиками, а для некоторых установлен только один переносчик. Среди
переносчиков, в свою очередь, есть виды, передающие определенные вирусы, и
виды, передающие многие вирусы.
Вирус сохраняется в организме переносчика в инфекционной форме
определенное время. Состояние, при котором переносчик сохраняет
инфекционность после того, как покинет зараженное растение, называется
персистентностью. Различают три основных вида персистентности:
неперсистентность,
полуперсистентность
и
персистентность.
Неперсистентность означает, что переносчик сохраняет инфекционность в
течение нескольких часов (обычно менее 4 часов). Полуперсистентность
наблюдается в том случае, когда переносчик сохраняет инфекционность в
течение 10-100 часов. Персистентность – когда его инфекционность
сохраняется свыше 100 часов, а иногда – и в течение всей жизни.
При неперсистентном способе передачи насекомому для приобретения
вируса достаточно короткого периода питания на больном растении – 0,5-2
минуты. Неперсистентные вирусы могут быть переданы переносчиками в
течение ограниченного промежутка времени, часто не более часа; в
дальнейшем его вирофорность снижается. Причем переносчик, питающийся на
больном растении, получает такой вирус, т. е. становится вирофорным, очень
быстро - с первых же секунд, реже минут. После линьки переносчика
инфекционность утрачивается. Такого рода передачу часто считают
механической, хотя, возможно, имеется и кратковременная биологическая связь
вируса и переносчика. Неперсистентные вирусы концентрируются в паренхиме
и, как правило, вызывают мозаики. Основные их переносчики – тли. К
неперсистентным вирусам относятся Y вирус картофеля, вирус мозаики гороха,
вирус мозаики свеклы, вирус огуречной мозаики и др.
При персистентном способе передачи, чтобы получить вирус от растения,
переносчику необходимо длительное питание – не менее 30 минут, после чего
он становится вирофорным. Однако распространять вирусную инфекцию
переносчик может не сразу после питания на больном растении, а по истечении
определенного периода времени – латентного, или инкубационного, периода.
Латентный период может продолжаться от нескольких дней до нескольких
недель. В течение этого времени происходит размножение вирусов в теле
переносчика и перемещение их из пищеварительного тракта в слюнные железы,
т.е. циркуляция в организме насекомого. Персистентные вирусы иначе еще
называют циркулятивными. По окончании периода циркуляции насекомоепереносчик способно передавать инфекцию другим растениям. Персистентные
вирусы сохраняют свою инфекционность в организме переносчика в течение
нескольких дней, а иногда и в течение всей жизни вектора. Такие вирусы тесно
связаны со своими переносчиками (цикадками, реже тлями, трипсами, клопами
и клещами). Попадая с соком растения в желудок насекомого-переносчика, они
поступают в гемолимфу, а оттуда в слюнные железы, где могут даже
размножаться (пропагативные вирусы). С этого момента переносчик становится
вирофорным, т. е. способным заразить. После линьки переносчика
21
инфекционность
сохраняется.
Большинство
персистентных
вирусов
локализованы во флоэме, редко передаются с соком больного растения и
вызывают болезни, подобные желтухе. К персистентным относятся вирусы
бронзовости томата, скручивания листьев картофеля, курчавости верхушки
свеклы, желтой карликовости картофеля.
Некоторые персистентные вирусы, передаваемые цикадками, не только
размножаются в теле насекомого, но и передаются от одного поколения к
другому через яйцо – трансовариальная передача. Так передаются возбудители
карликовости риса, желтой карликовости картофеля и другие.
Кроме того, существуют полуперсистентные вирусы, способные
сохраняться в теле переносчика в течение 10-100 ч без потери инфекционности.
Таким вирусам не свойственен латентный период в теле переносчика. В
отличие от неперсистентных эти вирусы проникают в организм переносчика
после его длительного питания на зараженном растении и сохраняются там 1-3
дня. Полуперсистентные вирусы концентрируются во флоэме. К ним относятся
вирус желтухи свеклы, вирус тристеца цитрусовых.
Вирусы двух групп – неповирусы и тобравирусы – передаются
почвенными нематодами, паразитирующими на корнях растений, например, из
родов Longidorus, Xiphinema. Нематоды распространяют около 20
представителей этих групп. Среди них – возбудители кольцевой пятнистости
томата, кольцевой пятнистости малины и другие.
Имеются данные о распространении вирусов почвенными грибами: вирус
некроза табака передается зооспорами Olpidium brassicae, вирус картофеля
может передаваться зооспорами Synchytrium endobioticum. Вирус локализуется
на поверхности зооспор гриба, которые инцистируются (покрываются
оболочкой) на корневых волосках. В результате вирусные частицы
оказываются под оболочкой. Когда содержимое зооспоры проникает в клетку
корня, вирусные частицы попадают туда вместе с ним.
1.1.7 Сохранение вирусов
Биология фитопатогенных вирусов неразрывно связана с живыми
клетками
растений-хозяев
или
организмов-переносчиков.
При
неблагоприятных условиях вирусы сохраняются в основном в живых растениях
(первичная инфекция). Вирусы плодовых, ягодных культур сохраняются в
тканях растений-хозяев. Корневища многолетних сорняков (осот, бодяк)
являются резерваторами многих вирусных патогенов. Местом перезимовки
могут быть органы вегетативного размножения и зимующие живые части
культурных растений - корнеплоды, клубни, луковицы, клубнелуковицы.
Семена могут быть источниками первичной инфекции многих вирусов
бобовых культур, томата, огурца. В переносчиках (насекомые, нематоды,
покоящиеся споры грибов) вирусы также могут сохраняться в неблагоприятный
период, с растительными остатками и в почве - только некоторые стойкие
вирусы, такие, как вирус мозаики табачной и вирус зеленой крапчатости огурца
[15, 18].
22
1.1.8 Влияние окружающей среды на развитие вирусов и вирусных
болезней
По отношению к факторам внешней среды фитопатогенные вирусы
подразделяются на две группы: стойкие и нестойкие.
Стойкие вирусы не теряют своей инфекционности и сохраняют
целостность частиц при нагревании, подкислении, длительное время
сохраняются в соке, даже при большом разведении. Например, вирус табачной
мозаики выдерживает 10-минутное нагревание до 80-90°С.
Нестойкие вирусы быстро инактивируются в выжатом соке растения,
теряют свою инфекционность при нагревании до 35-50°С, разрушаются при
химических воздействиях. К нестойким вирусам относятся вирус скручивания
листьев картофеля, Y вирус картофеля, большинство вирусов плодовых и
ягодных культур.
Неблагоприятные условия окружающей среды, ослабляя растения, как
правило, усиливают репродукцию вирусов в них, повышая вредоносность
заболевания. Недостаточная освещенность и пониженная температура
увеличивают вредоносность комплексного вирусного заболевания томата —
стрика. Заболевание малины и земляники мозаикой сильнее проявляется при
пониженных температурах (весной и осенью), а окаймление жилок
крыжовника, наоборот, активизируется при повышенных температурах (летом).
Неблагоприятным фактором, способствующим развитию вирусных болезней,
может быть несбалансированное внесение удобрений.
1.1.9 Экология вирусов растений
Для того, чтобы вирус мог продолжать свое существование, необходимо
подходящее растение, в котором он может размножаться, эффективные
способы распространения и заражения, а также резерв соответствующих
растений-хозяев, поражая которые он может распространяться. Существующая
в действительности ситуация, определяющая развитие каждого данного вируса
в какой-то определенной местности или в мировом масштабе, является
результатом сложного взаимодействия многих физических и биологических
факторов. Понимание экологии вируса в применении к отдельной культуре и к
определенной местности важно для разработки соответствующих методов
борьбы с вызываемым вирусом заболеванием [19].
1.1.9.1 Биологические факторы
1) Стабильность вируса и концентрация в растении относятся к
биологическим факторам. При прочих равных условиях вирус, который
стабилен, находясь как внутри, так и вне растения, и достигает в тканях
высокой
концентрации,
имеет
большую
вероятность
выжить и
распространиться, чем тот, который этими свойствами не обладает. Например,
TMV может в течение длительного периода сохраняться в мертвом
растительном материале, находящемся в почве, которая в таком случае
становится источником инфекции для последующих культур [20].
23
2) Скорость передвижения и распространения вирусов по растению.
Вирусы, медленно передвигающиеся по растению от того места, где произошло
заражение, имеют меньшую вероятность выжить и затем эффективнее
распространиться, чем те из них, которые перемещаются быстро. Вирусы,
которые могут проникать в семена и сохраняться там, имеют существенное
преимущество по сравнению с другими вирусами с точки зрения их
распространения, а также способности к выживанию. Распространение вируса
некроза табака у большинства растений-хозяев ограничивается их корневой
системой, и существование этого вируса в природе зависит от способности
грибов-переносчиков передавать его через почву и заражать, таким образом,
другие растения.
3) Степень поражения. Вероятность выживания вируса, вызывающего
быстро распространяющееся системное заболевание и тем самым приводящего
растение к гибели, гораздо меньше, чем в том случае, когда вирус вызывает у
растений лишь слабые или средней тяжести заболевания, позволяющие им
нормально вегетировать и размножаться. Возможно, что в полевых условиях
существует естественный отбор, направленный против штаммов, вызывающих
быструю гибель растений-хозяев. Цикадки, родившиеся на западе США,
инфицируются первоначально штаммами вируса курчавости верхушки
сахарной свеклы, которые вызывают слабые симптомы на растении-хозяине.
Вирулентные штаммы этого вируса вызывают гибель некоторых видов
растений до того, как на них закончит развитие очередное поколение цикадок.
Таким образом, в пустынных районах вирулентные штаммы имеют тенденцию
к самоуничтожению [20, 21].
4) Мутабильность вирусов и отбор штаммов. Частота, с которой вирус
мутирует и образует штаммы, способные приспособиться к изменениям
окружающей среды, может благоприятствовать его выживанию и
распространению. Так, по данным Kassanis (1957), в некоторых районах Индии
клубни картофеля, которые хранятся в обычных складах, могут освободиться от
вируса скручивания листьев, тогда как клубни, содержащиеся в охлажденных
хранилищах, остаются полностью инфекционными [22].
Сельскохозяйственная практика может различными путями оказывать
воздействие на отбор штаммов вируса, которые становятся доминирующими
для какой-то культуры. При заражении растений картофеля, свободных от X
вируса, этим же вирусом, полученным от другого бессимптомно зараженного
сорта, не наблюдалось проявления симптомов непосредственно в тот год, когда
проводили заражение. В следующем году болезнь имела самые различные
проявления, даже на разных ростках, возникших из одного и того же клубня.
По данным Matthews, некоторые ростки были поражены штаммами,
вызывающими резкую некротизацию и отмирание, тогда как на других
появлялась слабая пятнистость или же симптомов не было вовсе [23].
Когда сельскохозяйственные мероприятия или некоторые другие факторы
существенно не меняются, можно ожидать, что в отношении каких-то
определенных видов растений-хозяев и условий окружающей среды отбор
штаммов вируса будет идти до тех пор, пока не станут доминировать штаммы,
24
наилучшим образом приспособленные к условиям существования. Основные
факторы, влияющие на выживаемость штамма, таковы: эффективная передача
насекомыми или иными способами; более быстрое размножение и
распространение по растению, чем у конкурирующих штаммов; развитие
слабой или не слишком сильной формы заболевания.
5) Спектр растений-хозяев вируса. Вирусы широко варьируют в
отношении спектра тех видов растений-хозяев, которые они поражают. Вирусы
с очень узким набором растений-хозяев, вероятно, выживают либо потому, что
эти растения являются многолетними, либо размножаются вегетативным путем,
либо же вследствие того, что такие вирусы передаются через семена.
Широкий набор растений-хозяев дает вирусу гораздо больше
возможностей для сохранения и широкого распространения. Вирусы, которые
так же успешно поражают многолетние декоративные растения, как и
сельскохозяйственные и плодовые культуры, широко распространены по
земному шару. Основные примеры их: вирус желтой мозаики фасоли,
резерватором которых служат гладиолусы; вирус бронзовости томатов,
который поддерживается в георгинах; вирус огуречной мозаики, который
резервируется в лилиях, часто не изменяя внешнего вида растений [19].
6) Распространение через воздушную среду. Оценивая вирусы растений в
целом, можно сказать, что бесспорно наиболее важным агентом
распространения, а, следовательно, и выживания вирусов являются летающие и
питающиеся соком растений насекомые-переносчики, в особенности тли.
Способ распространения вируса в пределах определенной культуры, а также
скорость и расстояние, на которое он может быть передан, зависят от многих
факторов. Среди них следует отметить следующие: источник инокулюма;
количество потенциально пригодного инокулюма; природа и образ жизни
переносчика; передается ли вирус с помощью стилета, является ли он
циркулирующим или размножается в переносчике; время, когда переносчик
становится активным, по отношению к срокам вегетации растений данной
культуры; погодные условия [15, 19].
7) Распространение через почву. Существует три группы вирусов,
передающихся через почву: вирусы, переносчик которых неизвестен; вирусы,
которые передаются грибами; вирусы, которые передаются нематодами.
Вероятно, TMV является одним из немногих вирусов, в заметной степени
передаваемых через почву без помощи какого-либо известного переносчика.
Стабильность этого вируса позволяет ему от сезона к сезону сохраняться в
растительных остатках в том случае, если условия благоприятствуют этому.
Заражение происходит при выращивании восприимчивых культур в
зараженной почве и осуществляется, по-видимому, через небольшие ранки,
возникающие на корнях во время посадки растений или обработки почвы.
Вирус крупных жилок салата-латука, передаваемый через почву грибом
Olpidium, имеет узкий круг растений-хозяев, но может легко пережить какие-то
неблагоприятные для него условия в почве, находясь в покоящихся спорах
этого гриба. Этот вирус способен в течение многих лет сохраняться в сухой
почве, не имея доступа к растениям-хозяевам.
25
Несомненно, наиболее важной группой вирусов, передающихся через
почву, по мнению Р. Мэтьюза, являются вирусы, распространяемые с помощью
нематод [19]. Экология этих вирусов значительно отличается от экологии
вирусов, которые распространяются летающими переносчиками. Нематоды
живут долго, имеют широкий круг хозяев и в течение длительных периодов
могут сохраняться при неблагоприятных для них условиях и при отсутствии
соответствующих растений-хозяев. Так, Harrison et al. (1963) обнаружил, что
при отсутствии растений нематода Longidorus elongatus сохраняется во
влажной почве при комнатной температуре более двух лет. Этот срок был в
опыте наибольшим [24]. В теле переносчиков, которые не питаются, вирус
способен сохраняться на протяжении нескольких недель или месяцев.
8) Распространение на большие расстояния. Распространение вирусов на
относительно большие расстояния, вероятно, происходит время от времени
естественным путем. Установить, как часто происходит распространение
вирусов таким способом, очень трудно. Зачастую сложно определить, откуда
мигрировал переносчик, и проследить за маршрутом миграции, а еще труднее
доказать, что насекомые принесли с собой какой-то определенный вирус.
Циркулирующие и полуперсистентные вирусы могут легко сохраняться в
переносчике в течение времени, необходимого для того, чтобы впоследствии
осуществить заражение. По данным Johnson (1967), даже неперсистентный (не
сохраняющийся долго в переносчике) вирус при безостановочном полете
насекомого может быть перенесен на расстояние 60 км и более [25].
Передающиеся через семена вирусы, вполне возможно, могут
переноситься на значительные расстояния птицами. По данным Proctor (1968),
жизнеспособные семена могут сохраняться в пищеварительном тракте морских
птиц в течение 340 часов – время, вполне достаточное для перелета на
несколько тысяч километров [26].
За последние несколько столетий многие вирусы, ограниченные до этого
одной или несколькими географическими зонами, широко распространились по
свету, и несомненно, что основную ответственность за это несет человек.
Вирусы переносились в растениях или частях растений, а иногда, возможно, и в
беспозвоночных-переносчиках. Многие вирусные болезни картофеля были,
безусловно, завезены в Европу из Америки вместе с этой культурой, а затем
попали с клубнями во многие другие страны.
9) Приемы возделывания сельскохозяйственных культур. На поражаемость
какой-либо культуры вирусной болезнью значительное влияние могут
оказывать методы ее выращивания и способы обработки, применяемые в той
или иной зоне в течение всех четырех сезонов. Влияние различного рода
факторов, которые имеют в данном случае значение, можно
проиллюстрировать ниже на нескольких примерах:
- Срок сева. Зависимость между заражением растений вирусной
болезнью и сроками сева можно четко проследить на примере
выращивания озимой пшеницы в провинции Альберта. По данным
Slykhuis et al., обычно процент поражения этой культуры вирусом
26
полосатой мозаики пшеницы заметно зависит от сроков ее посева [27].
Высокие температуры воздуха могут привести к резкому уменьшению
количества тлей, которые являются переносчиками инфекции. Если
задержать время сева до момента преобладания высоких температур,
то озимая культура может быть поражена в гораздо меньшей степени.
- Севооборот. Тип севооборота оказывает определенное внимание на
распространение вирусов, способных перезимовывать в сорняках или
в проростках падалицы предшествующей культуры. В некоторых
культурах большое количество спонтанно выросших растений,
содержащих вирус, может вегетировать в течение длительного
времени. Doncaster et al. показали, что для того, чтобы избавиться от
таких растений картофеля, засоряющих поля, занятые этой культурой,
требуется 5-6 лет [28].
- Обработка почвы. На распространение и сохранение вирусов в почве
или в растительных остатках могут оказывать влияние методы
обработки почвы. Нематоды, а также грибы, являющиеся
переносчиками вирусов, могут распространяться при перемещении
почвы, происходящем во время обработки. Если предшествующей
культурой был картофель, то обработка полей во время холодной
погоды может в значительной степени снизить выживание
невыкопанных клубней [28].
- Размер поля. Влияние размера поля на распространение вируса
сильно зависит от источника первончальной инфекции. Если
источник инфекции находится за пределами поля, занятого какой-то
культурой, тогда, как указывает van der Plank, концентрация растений
на больших полях компактной формы приводит к тому, что
возможность заражения извне оказывается минимальной [29].
- Густота насаждений и размер растений. Летающие насекомые,
заносящие вирус извне на какую-либо культуру, на каждой данной
площади заражают большее количество растений, если они
расположены достаточно далеко друг от друга, чем при густых
посадках. По данным Blencowe et al., Broadbent (1957), Steudel et al.,
случаи поражения вирусом желтухи свеклы, вирусом мозаики свеклы
и вирусом мозаики цветной капусты отмечались реже в тех случаях,
когда расстояние между растениями или между рядами растений
было меньше [30, 31, 32].
1.1.9.2 Физические факторы
1) Сезонность и погодные условия. Необычные погодные условия могут
привести к сильной вспышке заболевания, которое обычно наблюдается в
какой-то определенной области и на какой-то культуре каждый год, однако в
довольно слабой степени. На скорость размножения и передвижения
распространяющихся по воздуху переносчиков вирусных болезней могут
оказывать значительное влияние отдельные факторы, формирующие погоду в
какой-то определенной местности, как, например, температура воздуха,
27
влажность и ветер. Сокращению некоторых популяций тлей, вероятно,
способствуют высокие температуры воздуха. Ветер, по-видимому, является
важным фактором, который не только содействует распространению вирусов
передающимися через воздух переносчиками или задерживает его, но также
определяет основное направление этого распространения. Порывы ветра могут
приводить к локальному уменьшению количества переносчиков и больных
растений [33].
2) Почва. Почвенные условия могут различным образом сказываться на
степени поражения вирусной болезнью. На высокоплодородных почвах
возможность распространения вирусных болезней увеличивается. Так, по
данным Broadbent et al., внесение органических, а также некоторых
неорганических удобрений увеличивало на картофельных полях число
растений, пораженных вирусом скручивания листьев и Y вирусом [34].
Некоторые виды тлей-переносчиков быстрее размножаются на таких растениях.
На степень поражения, несомненно, оказывает влияние и питание растений,
подавляя симптомы заболевания или делая их более отчетливыми.
Почвенные условия могут играть заметную роль, оказывая влияние на
сохранение TMV в растительных остатках. Johnson et al. пишет, что
инактивация вируса происходит быстрее во влажных, хорошо аэрируемых
почвах, чем в сухих, плотных или заболоченных почвах [19, 35].
1.1.9.3 Сохранение вируса на протяжении годового цикла
Сохранение вируса в течение зимнего периода может осуществляться поразному. Существуют вирусы, способные перезимовывать с помощью
нескольких различных способов [19]:
Многие вирусы легко сохраняются от одного сезона до другого в одном и
том же растении-хозяине или в посадочном материале. Сюда относятся вирусы,
переживающие неблагоприятное время года в многолетних растениях, в
клубнях, отводках и т.д., а также вирусы, передающиеся через семена.
Вирусы, для которых характерен широкий спектр растений-хозяев, хорошо
приспособлены к сохранению в природе, если в числе восприимчивых к ним
растений имеются многолетники, группа видов однолетних растений, у
которых периоды вегетации не совпадают, а лишь накладываются один на
другой, или же виды, способные передавать вирус через семена.
Вирусы, передающиеся цикадками трансовариально, могут зимовать в
яйцах, отложенных насекомыми.
TMV и некоторые другие вирусы могут сохраняться в течение зимы при
благоприятных условиях в почве (в растительных остатках и, возможно, в
свободном виде).
Вирус крупных жилок салата-латука может в течение длительного времени
сохраняться в покоящихся спорах Olpidium.
Сельскохозяйственные мероприятия могут приводить к тому, что в
определенных местностях вирус в течение всего года сохраняется на
сменяющих друг друга посевах одного и того же растения. Это может
28
происходить там, где климатические условия позволяют собирать урожай в
течение всего года.
1.1.9.4 Сельскохозяйственные мероприятия и эволюция вирусов
Сельское хозяйство даже на самых ранних, примитивных его стадиях
должно было изменить условия окружающей среды, в которой существовали
вирусы, что происходило, по мнению К.В. Попковой и Р. Мэтьюза,
несколькими путями [15, 19]:
Селекция растений, а позднее выведение новых их сортов привели к
возникновению растений-хозяев с новыми генотипами, которые реагировали на
существующие вирусы уже иным образом.
Сельскохозяйственное производство привело к новым контактам растений
различных видов, в результате чего образовались новые растительные
сообщества, включающие полезные виды и сорняки, связанные с культурными
растениями.
Такие сельскохозяйственные сообщества растений распространялись по
всему миру и оказывались, таким образом, по соседству с местными флорами.
Вирусы,
характерные
для
этих
флор,
распространялись
на
сельскохозяйственные культуры.
Вместе с растениями в новые зоны передвигались насекомые-переносчики
и виды, могущие служить потенциальными переносчиками. Насекомые, ранее
обитавшие
в
этих
зонах,
могли
также
распространяться
на
сельскохозяйственные культуры.
Выращивание на больших площадях какого-то одного основного вида
растений могло привести к развитию громадной популяции насекомыхпереносчиков и последующей сильной вспышке заболевания. Вероятность
этого увеличивалась при выращивании определенной культуры на протяжении
нескольких лет на одном и том же участке.
Такие методы обработки почвы, как культивация и дренаж, могли
изменять почвенные условия и оказывать, таким образом, сильное влияние на
обитающих в почве переносчиков вирусов.
Прививки, не считая их роли в распространении вирусов, могли приводить
к появлению новых заболеваний в результате селекции вирусных штаммов и
инфицирования ранее не зараженных видов и сортов растений.
1.1.10 Распространенные типы заболеваний картофеля и симптомы
По данным В.А. Шкаликова, Р. Мэтьюза, В.Ф. Пересыпкина [18, 19, 36],
среди инфекционных болезней картофеля есть большая группа поражений,
которые проявляются в виде разнообразных мозаик, деформаций, хлороза,
угнетения роста, отмирания отдельных частей растений или участков тканей.
Возбудители этих болезней – вирусы, вироиды и фитоплазмы – инфекционные
агенты, широко распространенные в природе.
Вирусы, вироиды и фитоплазмы существенно различаются между собой по
биологии и характеру воздействия на картофельное растение. Но они имеют и
29
много общего: способность передавать инфекцию последующим вегетативным
репродукциям, перенос большинства возбудителей насекомыми.
1) Полосчатая мозаика проявляется вначале на нижних и средних листьях в
виде мозаики, а позже в виде некротических темных полосок, точек и пятен на
жилках и в углу между жилками (угловатая пятнистость). Первоначально
некрозы появляются на мелких жилках по краю листа, а затем на больших
жилках (рисунок 1). Часто они обнаруживаются на черешках листьев и стеблях.
Со временем листья становятся хрупкими, темнеют, отмирают, опадают или
остаются висеть на тонких высохших черешках под острым углом к основному
стеблю.
Возбудитель болезни – вирус Y. Передается тлями и механически с
инфекционным соком. Зимует в клубнях картофеля. Полосчатая мозаика –
очень вредоносное заболевание, вызывающее резкое снижение урожая клубней
картофеля.
2) Морщинистая мозаика вызывает сильное вздутие участков листовой
поверхности между жилками и свертывание долек листа вниз (рисунок 1). В
первые годы заражения растений морщинистая мозаика обычно проявляется
слабо, но в потомстве (через 2-3 года) вызывает отставание растений в росте,
укорочение междоузлий и образование мелких курчавых хлоротичных листьев.
У некоторых сортов наблюдается полегание стеблей. Больные растения не
цветут и заканчивают вегетацию на 3-4 недели раньше здоровых. Морщинистая
мозаика относится к смешанному типу инфекции. Ее вызывает вирус Y в
комбинации с другими вирусами (X, S, K, A). Заболевание приводит к
глубоким физиологическим расстройствам у растений, а нередко к их гибели.
Причина этого в нарушении деятельности устьичного аппарата и пониженной
водоудерживающей способности тканей.
Передаются вирусы с клубнями, а во время вегетации распространяются
тлями, а также механическим путем. С семенами заболевание не передается.
3) Скручивание листьев распространено повсеместно. Характерные
признаки болезни особенно четко проявляются на второй и третий год после
заражения. В первый год у заболевшего растения закручиваются вверх края
долек молодых листьев. На второй и третий год наблюдается скручивание
листьев нижнего, а затем и более верхних ярусов. Они становятся кожистыми,
хрупкими, желтоватыми, нередко с красноватым, фиолетовым или бронзовым
оттенком. Дольки пораженных листьев свертываются вдоль средней жилки в
трубочку (рисунок 1).
30
А – морщинистая мозаика; Б – крапчатая мозаика; В – полосчатая мозаика;
Г – скручивание листьев
Рисунок 1 – Болезни картофеля, по данным В.А. Шкаликова и др., 2003 [18]
Возбудитель заболевания – вирус Potato leaf roll virus (PLRV). В стеблях и
черешках вызывает утолщение стенок клеток первичной флоэмы. В результате
значительного отхождения оболочек клеток образуются небольшие
межклеточные пространства и происходит облитерация ситовидных трубок.
Клубнеобразование у пораженных растений подавлено.
Возбудитель болезни передается клубнями, а во время вегетации – тлей.
Кроме пасленовых, поражает различные виды Amaranthus, Gomphrena globosa и
др. Потери урожая могут составлять 30-40%.
4) Столбур впервые описан на томате, но симптомы его совершенно
отличны от проявления на картофеле, хотя идентичность болезни доказана К.С.
Суховым и А.М. Вовком [37] в опытах с прививками. Установлено, что столбур
вызывают микоплазменные тела.
31
Характеризуется окаймлением долек, верхушечных листьев, измельчением
отрастающих листьев, укорочением междоузлий и разрастанием пазушных
листьев. Заболевание передается клубнями. Переносчиками микоплазменных
тел являются цикадки.
5) Готика проявляется заметной вытянутостью растения. Листья мелкие, со
слабо закрученными дольками вдоль средней жилки, имеют темно-зеленую или
фиолетовую окраску, морщинистые, от стебля отходят под более острым углом,
чем у здоровых растений. Клубни у больных растений в большинстве случаев
веретеновидные, многоглазковые, с неправильными очертаниями. В
засушливых условиях у некоторых сортов клубни покрываются крупными
некротическими пятнами и трещинами.
Заболевание вызывается вироидом – специфическим инфекционным
агентом, существующим в виде рибонуклеиновой кислоты, без белкового
компонента. Вироид самопроизводится в растительной клетке и вызывает
нарушение жизнедеятельности растений. Передается патоген с клубнями и
распространяется сосущими насекомыми.
6) Крапчатая, или обыкновенная, мозаика проявляется обычно на молодых
листьях в виде тонкой светло-зеленой крапчатости неправильной формы
(рисунок 1). На одних сортах по мере старения растений признаки болезни
исчезают, на других заболевание характеризуется образованием черных
некротических пятен. Есть также сорта, у которых внешние признаки
заболевания маскируются.
Возбудитель заболевания – вирус X. Иногда вместе с вирусом X
выявляются вирусы S, M, Y, A, F. В поле здоровые растения могут заражаться в
результате соприкосновения с ботвой больных растений при ветре. Заболевание
также может передаваться насекомыми. Передается с посадочными клубнями.
Резерваторами вирусов могут быть дурман, томат, белена, паслен черный,
табак.
При заболевании растений крапчатой мозаикой резко снижается
активность фотосинтеза в листьях, затрудняется отток ассимилятов.
7) «Ведьмины метлы» вызывают фитоплазменные организмы. На
зараженных растениях сначала появляется хлороз верхних листьев. Растения
образуют большое количество тонких боковых побегов округлого сечения с
мелкими бледно-зелеными листьями. Наблюдается торможение роста основных
побегов в длину.
Листья пораженных растений редуцированные, простые или с
уменьшенным числом долей. Клубни многочисленные, мелкие. В почве
прорастают нитевидными ростками.
8) Закручивание листьев вызывает PVM. Верхние листья мозаичные,
закручиваются. Дольки листьев закручиваются вдоль средней жилки краями
вниз. От скручивания листьев заболевание отличается отсутствием общего
хлороза растений, кожистости и хрупкости листьев. Вирус распространяется с
зараженными клубнями и переносится тлями.
В настоящее время известно около 40 фитопатогенных вирусов,
идентифицированных на картофеле в различных странах и регионах с
32
разнообразными
природно-климатическими
условиями.
На
основе
современных представлений и сведений, опубликованных в мировой
литературе по культуре картофеля в последние годы, к числу наиболее важных
фитопатогенных
вирусов,
получивших
практически
повсеместное
распространение везде, где возделывается картофель, относятся:
- вирус скручивания листьев картофеля (PLRV);
- Y вирус картофеля (PVY);
- X вирус картофеля (PVX);
- S вирус картофеля (PVS);
- M вирус картофеля (PVM) [17].
Только из-за поражения вирусами Y, M, X, S, L (наиболее
распространенными в основных картофелеводческих районах Республики
Казахстан урожайность картофеля снижается на 40-50%, в некоторых районах
потери урожая могут достигать 80% [38]. Причем растения картофеля
поражаются двумя, в большинстве случаев тремя-четырьмя в различных
сочетаниях. В данном случае наблюдается явление синергизма, когда
отрицательное эффект многократно усиливается [39]. Ввиду тетраплоидности и
высокой гетерозиготности генома, картофель размножают вегетативным путем
через клубни. Поэтому вирусы, присутствующие в посевном материале
неизбежно передаются следующему поколению растений. Кроме того,
большинство вирусов картофеля активно переносятся насекомыми (тлями) на
стадии вегетации.
Развитие методов традиционной селекции и внедрение методов
биотехнологии, направленных на создание источников, доноров и новых сортов
с высокой устойчивостью к вирусам и их переносчикам, позволяет надеяться на
прогресс в повышении и стабилизации урожаев картофеля [40]. Создание
трансгенных форм растений, генетически устойчивых к вирусной инфекции,
является идеальным подходом к решению проблемы повышения урожайности
сельскохозяйственных культур, уменьшая опасность загрязнения окружающей
среды пестицидами. Известно, что устойчивость трансгенных растений,
обусловленная нарушениями репликации и/или трансляции вирусных белков,
связана с механизмами посттранскрипционного замолкания вирусных генов.
Этот тип устойчивости характеризуется высокоспецифичной деградацией
вирусной РНК при взаимодействии с трансгенной дсРНК, для чего необходима
высокая степень их гомологии [40, 41].
1.1.11 Типы устойчивости растений картофеля к вирусам
Различия в терминологии, критериях и обозначениях различных типов
устойчивости к вирусам (К.З. Будин, Valkonen et al., Solomon-Blackburn et al.
[42, 43, 44]) объясняются огромным разнообразием видов и сортов картофеля,
обусловливающим широкий диапазон реакций растений на вирусные
инфекции, наличием большого числа штаммов вирусов, а также влиянием
условий среды на экспрессию разных генов устойчивости.
В настоящее время, по мнению Т.А. Гавриленко и др. [40], различают
следующие типы специфической устойчивости растений картофеля к вирусам:
33
1) Крайняя устойчивость (ER = extreme resistance). У растений,
обладающих таким типом устойчивости, репликация вирусного генома, или
перемещение вирусов из инфицированных клеток в незараженные, подавляется
на самых ранних стадиях инфекции, причем в норме данный тип устойчивости
не связан с гибелью клеток растений. Растения с крайней устойчивостью не
проявляют никаких симптомов после вирусной инокуляции либо иногда на их
листьях и/или стеблях образуются ограниченные некрозы в виде точечных
поражений. Данный тип устойчивости обусловливает предельно низкий титр
вируса в инфицированных растениях, который нельзя выявить общепринятыми
мерами (ELISA) даже после инокуляции прививкой. ER обусловливает
устойчивость к разным штаммам одного вируса, а в ряде случаев и к
нескольким вирусам одной группы [45, 46].
2) Устойчивость на основе реакции сверхчувствительности (HR =
hypersensitive resistance) выражается в гибели клеток в месте контакта с
вирусом, что приводит к локализации инфекции и предотвращению
распространения вирусов по растению. HR проявляется в виде локальных
некрозов в местах проникновения вируса или, напротив, в виде системных
некрозов на растении [45, 46].
3) Устойчивость к инфицированию, или полевая устойчивость,
обусловливает низкую вероятность инфицирования растений вирусами в
естественных условиях среды. Полевая устойчивость к вирусной инфекции
связана с неблагоприятным воздействием растений на насекомых или с
устойчивостью растений к векторному переносу (например, с устойчивостью к
тлям), обусловленной непредпочитаемостью растений насекомыми [44-46].
4) Устойчивость к вирусной аккумуляции, при которой в
инфицированном растении сохраняется относительно низкая концентрация
вирусных частиц [44, 46].
5) Устойчивость к распространению вирусов обусловлена ограничением
их транспорта по растению [44, 46].
6) Толерантность (выносливость) рассматривают как устойчивость к
развитию вирусных болезней. В этом случае инфицированные растения,
имеющие относительно высокий титр, не проявляют видимых симптомов
инфекции [44, 45, 46]. Толерантные растения представляют опасность для
восприимчивых сортов картофеля как скрытый источник распространения
вирусных болезней.
7) Устойчивость трансгенных форм к вирусам рассматривается как
отдельный тип вирусоустойчивости [47].
1.1.12
Генетический контроль устойчивости растений к вирусным
заболеваниям. Картирование генов устойчивости
По мнению Т.А. Гавриленко и др. [40], наиболее подробно изучена
генетика устойчивости картофеля к вирусам Y, X, A, V, M, S и L. Крайняя
устойчивость к вирусам контролируется доминантными R-генами, а
устойчивость по типу реакции сверхчувствительности – доминантными Nгенами. Действие R-генов более стабильно и обусловливает устойчивость к
34
нескольким штаммам одного вируса, тогда как проявление реакции
сверхчувствительности зависит от условий среды и физиологического
состояния растений. Кроме того, обычно действие N-генов специфично к
определенному штамму вируса [45, 46].
Таблица 1 – Идентифицированные гены устойчивости к вирусам у картофеля,
по данным Т.А. Гавриленко и др., 2005 [40]
Ген
(синонимы)
Устойчивость
тип
источник
Локализация
(хромосома,
локус)
XII
V
IX, длинное
плечо
IV,
между
маркерами
TG 316 и TG
208
XI, сцеплен с
маркером GP
125
Rx (Rxadg)
Rx2 (Rx2acl)
Nxphu
ER к PVX
ER к PVX
HR к PVX
S. tuberosum
S. acaule
S. phurea
Nytbr
HR к PVY
S. tuberosum
PLRV1
устойчивость S. chacoense
к
ассимиляции
PLRV
HR к PVS
S. tuberosum,
VIII, сцеплен
subsp. andigena с GP 126 GP
189, СР 16
ER к PVM
S.gourlayi
HR к PVM
S.megistacrolo- bum
HR к PVA
S. tuberosum
-
Ns
Gm
Nm
Natbr(Na)
Литература
[50, 51, 52]
[53]
[54]
[55]
[56]
[57]
[48]
[48]
[51]
Показано наличие генов-модификаторов устойчивости к М вирусу
картофеля. Крайняя устойчивость к этому вирусу интрогрессирована от
Solanum gourlayi, основана на взаимодействии двух комплементарных генов
Gm и Ma и обусловлена медленным перемещением и низкой концентрацией
вируса М в инфицированных растениях [48, 49]. Устойчивость к PVM у
Solanum megistacrolobum основана на реакции сверхчувствительности и
контролируется доминантной аллелью гена Nm [48].
К настоящему времени идентифицировано около 30 генов,
контролирующих устойчивость растений картофеля к вирусам T, X, A, V и M
[43, 45, 46]. Из них 13 генов картированы в IV, V, VIII, IX, XI и XII хромосомах
картофеля (таблица 1).
1.1.13 Механизмы устойчивости
35
Устойчивость растений к вирусам рассматривают в рамках общей
концепции «ген-на-ген», которая принадлежит Флору [58]. Согласно этой
концепции каждому гену, контролирующему устойчивость растения-хозяина,
соответствует специфический ему ген, контролирующий вирулентность
патогена. Устойчивость наблюдают в случае взаимодействия доминантной
(функциональной) аллели гена устойчивости растения-хозяина с доминантной
аллелью гена авирулентности патогена.
Реакции HR предшествует распознавание растением специфичных
сигнальных молекул вируса – элиситоров (to elicit – вызывать). Синтез
элиситоров контролируют гены авирулентности (Avr-гены) патогена, которые
обусловливают способность вируса заражать растения определенного генотипа.
Показано, что в качестве элиситиров могут выступать следующие
вирусоспецифичные белки: белок вирусной оболочки (CP), вирусная репликаза
и транспортный белок (MP).
В жизненном цикле вирусов белок оболочки необходим для загрузки
вирусов во флоэму, благодаря чему и происходит их распространение по
растению. Т.е. CP-гены вирусов табачной и томатной мозаики (TMV и ToMV),
кодирующие капсидные белки (CP), являются генами авирулентности и
соответствуют гену устойчивости растений N’, контролирующему у Nicotiana
sylvestris устойчивость по типу сверхчувствительности [59].
Транспортный белок способствует проводимости плазмодесм для
вирусной РНК [60]. Гены вируса табачной мозаики, кодирующие вирусную
репликазу и транспортный белок размером 30кДа, являются Avr-генами,
активирующими гены устойчивости томата Tm1 и Tm2 соответственно. Гены
Tm1 и Tm2 контролируют индукцию реакции сверхчувствительности при
инфицировании растений томата вирусов TMV [56, 61].
Гены устойчивости растений, как правило, кодируют рецепторы к
элиситорам, или отвечают за передачу сигнала от рецептора к ядру клетки.
Образование комплекса элиситор-рецептор запускает в клетке каскад реакций
(сигнальная трансдукция), приводящих в итоге к синтезу веществ, высокие
концентрации которых токсичны как для патогена, так и для клетки, в
результате чего инфицированные клетки растений погибают.
Таким образом индуцируется реакция сверхчувствительности, которая
развивается в растении в виде некрозов. Если растение неспособно
вырабатывать
специфические
рецепторы,
то
вирусная
инфекция
распространяется по всему растению и приводит к его гибели.
В настоящее время клонирован и секвенирован целый ряд R-генов
растений, определяющих устойчивость к разным патогенам, в том числе и гены
устойчивости к вирусу картофеля X [62]. Белки, являющиеся продуктами Rгенов устойчивости к неродственным патогенам, содержат общие
функциональные домены. Наиболее частый домен R-белков – это лейцинбогатый мотив, LRR (leucine rich repeat), представляющий собой многократный
повтор из 24 аминокислот. Белки, содержащие такие повторы, склонны к
димеризации друг с другом. Контакты между разными LRR-доменами
36
поддерживают правильную конформацию самого R-белка, обеспечивают
взаимодействия белок-белок, а также могут узнавать и передавать белковые
сигналы, в том числе и от вирусных элиситоров. Многие R-белки содержат
также домен NBS (nucleotide binding domain), способный связывать АТФ и
ГТФ; трансмембранный домен (ТМ), обеспечивающий локализацию белка в
мембране; домен PK (protein kinase), характерный для сериновых и
треониновых протеинкиназ, которые регулируют уровень активности белков
цитоплазмы [40].
Оба типа устойчивости (ER и HR) могут быть индуцированы одним и тем
же геном. Например, ген Ryna определяет крайнюю устойчивость к вирусу Y и
сверхчувствительность к вирусу А [46].
1.1.14 Защита растений от вирусных болезней
По многочисленным данным (К.В. Попкова, В.А. Шкаликов, В.Ф.
Пересыпкин), получено достаточное количество информации, что выбор
приемов защиты от определенной вирусной болезни зависит от биологических
свойств вируса и поражаемого растения. Меры борьбы с вирусными болезнями
растений можно разделить на профилактические приемы и терапию: первые
направлены на предотвращение заболевания, терапия – это лечение уже
больных растений Решающая роль принадлежит профилактическим
мероприятиям, которые призваны не допустить появления болезни, а при
возникновении ее ограничить беспрепятственное распространение [15, 18, 36].
1.1.14.1 Терапевтические мероприятия
1) Термотерапия. В некоторых случаях вирусную инфекцию в растении
можно подавить воздействием повышенных температур. Этим способом можно
освободить от многих вирусов вегетативно размножаемые культуры. Для
теплового воздействия применяют горячую воду (50-550С) или горячий воздух.
Температуру и экспозицию (продолжительность обработки) варьируют в
зависимости от биологических особенностей вируса и пораженного растения
(таблица 2).
Режимы обработки подбирают с таким расчетом, чтобы вирусы
инактивировались, а ткани растения сохраняли жизнеспособность. Для этого
выявляют условия, при которых различия в чувствительности растения и
вируса к температуре будут максимальными. Так, при одной и той же
повышенной температуре вода сильнее повреждает растения, чем воздух.
37
Таблица 2 – Режим термотерапии некоторых растений при вирусных болезнях,
по данным Nyland и Goheen, 1969 [63]
Болезнь
Растениехозяин
Скручивание Картофель
листьев
картофеля
Заболевание, Картофель
вызываемое
вирусами
картофеля X,
S, М
Режим обработки
температура,
время
способ
0
С
50
17 мин.
водный
7 сут.
38
воздушный
Термотерапию используют для освобождения семян, посадочного и
прививочного материала от возбудителей вирусных болезней. Вирусы, которые
не удается подавить полностью путем термотерапии, в условиях повышенных
температур размножаются и распространяются медленнее. В результате побеги,
образовавшиеся на растении в период воздействия высокими температурами,
могут не содержать вируса. Поэтому метод термотерапии часто используют
совместно с методом культуры апикальных меристем. Растения предварительно
выдерживают при повышенных температурах и лишь затем срезают у них
верхушечные меристемы.
2) Химиотерапия. Химические приемы борьбы с вирусной инфекцией
имеют ограниченное значение. Поскольку вирусы являются внутриклеточными
паразитами, химические вещества одновременно воздействуют и на вирус, и на
клетку
растения.
Поэтому
химические
соединения,
подавляющие
(инактивирующие) вирусы, не должны быть токсичными для клеток растения.
Ведутся многочисленные исследования по изысканию таких веществ, но пока
ни один способ химической обработки растений не применяют на практике.
3) Ингибиторы вирусов. Некоторые соединения тормозят размножение
вируса, но не уничтожают его. Такие вещества получили название ингибиторов
вирусов. Эти соединения разнообразны по химическому составу. Среди
ингибиторов вирусов обнаружены протеиды, полисахариды, нуклеиновые
кислоты и низкомолекулярные соединения. По механизму действия их делят на
две группы: ингибиторы заражения и ингибиторы размножения. Ингибиторы
заражения блокируют вирусные частицы, вследствие чего последние
утрачивают инфекционность. Ингибиторы размножения изменяют обмен
веществ клетки растения-хозяина и тем самым повышают устойчивость его к
вирусу. Некоторые ингибиторы применяют на практике. Так, антибиотики
иманин и аренарин эффективны для борьбы с ВТМ на табаке и томате.
1.1.14.2 Профилактические мероприятия
38
1) Использование безвирусного посадочного материала. Здоровый
посадочный материал получают от растений, свободных от вирусных
инфекций. Для контроля за состоянием семеноводческих посевов их регулярно
обследуют и удаляют зараженные вирусами растения. Широко применяются
методы диагностики вирусных заболеваний – визуальный, серологический, а
также метод культуры апикальных меристем.
2) Борьбы с переносчиками. Большое значение в защите растений от
вирусных болезней имеет борьба с насекомыми – переносчиками вирусов и
уничтожение сорных растений – резерваторов вирусных инфекций. Борьба с
переносчиками вирусами осуществляется в основном химическим способом.
Особенно эффективны в борьбе с переносчиками системные инсектициды,
которые на длительное время защищают растение от насекомых.
3)
Агротехнические
приемы.
От
технологии
возделывания
сельскохозяйственных культур во многом зависит распространение вирусов.
Поэтому агротехнические приемы входят в комплекс мероприятий по защите
растений от вирусных болезней. Основными приемами в этом комплексе
служат сроки посева, густота стояния растений.
4) Вакцинация, или перекрестная защита, - это прием заражения растения
слабопатогенным штаммом вируса, защищающим это растение от сильного
штамма того же вируса. Метод показал хорошие результаты при вакцинации
тепличной культуры томата слабыми штаммами вируса табачной мозаики для
защиты от агрессивных штаммов этого вируса. Но в целом, вакцинация не
получила широкого применения из-за возможности появления изменчивости
патогена, усиления его вредоносности при совместном заражении с другими
патогенами.
5) Самый эффективный и экономически выгодный способ защиты от
вирусных
болезней
–
возделывание
вирусоустойчивых
сортов
сельскохозяйственных культур. Особенно важное значение имеют сорта,
обладающие устойчивостью к нескольким вирусам (см. раздел 1.1.11).
Для многих сельскохозяйственных культур созданы сорта, устойчивые к
вирусным болезням. Например, сорта томата для защищенного грунта Соната
F1, Русич F1 и Карлсон F1 устойчивы к ВТМ.
Известен способ получения трансгенных растений с устойчивостью к
вирусам, которая обеспечивается с помощью экспрессии сателлитной или
специфической вирусной антисмысловой РНК (асРНК) в растениях, а также
продукцией в трансгенном растении вирусных белков. Так, показано
повышение устойчивости растений, экспрессирующих асРНК белка оболочки
вируса [64, 65], белка, участвующего в репликации вируса золотистой мозаики
томатов [66], и антисмысловой последовательности межцистронной области
вируса мозаики костра [67]. Недостатками этого способа являются
специфическая устойчивость только к одному вирусу (или группе
близкородственных вирусов), а также нестабильность вновь созданных
механизмов устойчивости к вирусной инфекции [68]. Наблюдаемая в ряде
случаев ограниченная эффективность асРНК может быть связана с
локализацией ее репликации в цитоплазме. Стратегия асРНК может быть более
39
перспективной в защите от вирусов, имеющих ядерную фазу репликации [69,
70].
В 1986 году группой Abel были впервые получены устойчивые к TMV
растения табака путем переноса в их генетический материал гена этого вируса,
кодирующего образование белка оболочки [71]. Трансгенные растения,
экспрессирующие кДНК белков оболочки вируса, проявляют устойчивость к
инфекции гомологичными или близкородственными вирусами [72]. Другие
гены и элементы вирусного генома также используются для защиты растений
от вирусной инфекции. Это показано в случае кДНК вирусных сателлитных
РНК [73, 74] и гена репликазы вируса табачной мозаики [75, 76]. В целях
защиты растений от вирусных инфекций перспективно также применение
дефектных генов вирусных репликаз, кодирующих нефункциональные
продукты [77, 78]. Таким образом, экспрессия в трансгенных растениях
отдельных элементов вирусного генома может влиять на разные этапы
скоординированного цикла размножения вирусов и на распространение
вирусной инфекции [70].
Оригинальная стратегия получения устойчивых к вирусам трансгенных
растений была впервые сформулирована и опробована в лаборатории Atabekov
[79, 80]. В ней предложено использование мутантных нефункциональных генов
транспорта вирусов из зон репликации в неинфицированные клетки растений. В
трансгенных растениях табака дефектный ген транспортного белка ВТМ
экспрессировал нефункциональный белок, блокирующий межклеточный
транспорт инфицирующего вируса [80]. Следует отметить, что в устойчивых к
вирусам трансгенных растениях с генами вирусных репликаз заингибирован
межклеточный транспорт вирусной РНК [70, 81].
На основе трансгенных технологий получены различные растения с
повышенной устойчивостью к болезням, вредителям и неблагоприятным
факторам среды. Некоторые из таких растений уже нашли практическое
применение, а другие проходят полевые испытания. Вероятно, не все
разработанные трансгенные стратегии защиты растений найдут применение в
селекции и будут соответствовать требованиям биологической безопасности.
Необходимо учитывать длительную и часто сопряженную эволюцию растений
и их патогенов, в результате которой между ними установилось динамическое
равновесие. Культивирование на больших площадях трансгенных растений с
«абсолютной» устойчивостью может привести к нарушению общего
равновесия в агробиоценозах и вызвать появление новых непредвиденных
фитопатогенов и вредителей. В этой связи использование генов природных
систем защиты растений представляется предпочтительным. Так как
конститутивная экспрессия защитных генов может способствовать отбору
устойчивых патогенов и вредителей, стратегия индуцируемой защиты является
более перспективной. Не исключено, что свойства устойчивости растений
определяются комплексной системой различных генов, в которую можно
эффективно
включать
отдельные
гены
устойчивости
различного
происхождения. При использовании трансгенных растений в качестве пищевых
продуктов необходимо контролировать отсутствие у них новых иммуногенов и
40
аллергенов. В ряде случаев эту проблему можно преодолеть. Дальнейшие
успехи в исследовании молекулярно-генетических механизмов специфических
узнавания патогенов растениями, трансдукции защитного сигнала и защитного
ответа будут способствовать развитию наиболее оптимальных трансгенных
стратегий защиты растений от заболеваний и вредителей [70].
1.2 М вирус картофеля рода Carlavirus
Род Carlavirus принадлежит семейству Flexiviridae. Типичным
представителем является Carnation latent virus, от имени которого род и
получил свое название. По мнению Martelli et al. (2007) и Ryu et al. (2008), на
2008 г. род включал в себя 39 установленных и 29 вероятных видов [82, 83].
При сравнительном филогенетическом анализе, отдельные виды показывают
идентичность между генами белков оболочки или репликазы (72%
нуклеотидного состава или 80% аминокислотного состава).
М вирус картофеля (PVM) является типичным представителем рода
Carlavirus семейства Flexiviridae (по данным Zavriev et al., 1991 [84]).
Симптомы М вируса картофеля были впервые описаны на картофеле в
1923 г. (Schultz et al.) [85]. Вирус, до его определения как PVM, называли Potato
leaf rolling mosaic virus [85], Potato interveinal mosaic virus [86], Potato virus E
[87], Potato virus K [88], Fortuna virus [89].
До сравнительно недавнего времени PVM, как и другие представители
рода Carlavirus, не привлекал внимания фитопатологов, потому что, при
инфицировании растений не проявлял, за редким исключением, ярко
выраженных симптомов. Открытие в 1964 г. Potato virus S побудило ученых
заняться этой группой вплотную, т.к. выяснилось, что PVS (зачастую – вместе с
PVM) распространен повсеместно и поражает большинство сортов картофеля
[90].
В 2010 Xu et al. методами ELISA, RT-PCR, RFLP и сиквенс-анализа белка
оболочки установили, что все распространенные штаммы и изоляты PVM
можно разделить на 2 группы, которые в свою очередь подразделяются на
подгруппы (таблица 3) [91].
Таблица 3 – Географическое распространение штаммов и изолятов PVM
Группа
I
II
Подгруппа
Страна распространения
Китай, Польша
Италия, Германия, Россия
США, Канада
a
b
a
b
Частицы этих вирусов имеют вид гибких палочек и состоят из
единственной однонитевой плюс - цепи геномной (г)РНК с мол. массой 2,4 х
106 Dа и множества одинаковых субъединиц капсидного белка с мол. массой 34
кDа, которые упаковывают гРНК в виде спирали (рисунок 2) [92, 93, 94].
Вирионы PVM длиной 650 нм и 12-13 нм в диаметре имеют коэффициент
41
седиментации (S20, w) около 176 S. Согласно материалам сайта Национального
Центра Биотехнологической Информации (NCBI), основанным на данных
Rupasov et al. (1989) и Zavriev et al. (1991), полная последовательность генома
М вируса картофеля составляет 8533-8534 нуклеотида [95]. По уточненным
данным Ryu et al. (2008), полная последовательность PVM состоит из 8553
нуклеотидов [83]. Также, по данным этих авторов, Изоэлектрическая точка
вирионов карлавирусов составляет около pH4,5, точка термической
инактивации (TIP) – 50-850C, конечная точка разведения (DЕP) 10-2-10-7 [83].
5'-концевая большая ОРС кодирует РНК-зависимую РНК полимеразу
(репликазу), 3 перекрывающиеся ОРС кодируют транспортные белки (TGB),
затем идут белок оболочки (СР) и белок, связывающий нуклеиновые кислоты
(NB). РНК-зависимая РНК полимераза содержит в себе следующие домены: MT
– метилтрансфераза, P-Pro – папаин-подобная протеаза, HEL – хеликаза, POL РНК-зависимая РНК полимераза
Рисунок 2 – Морфология частиц и геномная организация
М вируса картофеля, по данным Ryu и Lee, 2008 [83]
5’- нетранслируемая последовательность (НТП) состоит из 75
нуклеотидов, а 3’-НТП – из 70 нуклеотидов, по данным Ryu et al., 2008 [83].
Показано, что 3'-конец гРНК PVM полиаденилирован [94, 96]. В опытах по
трансляции РНК М-ВК in vitro и в протопластах было установлено, что эта РНК
направляет синтез крупного белка с мол. массой 200-220 кDа. Трансляция in
vitro полностью ингибировалась добавлением м7ГМФ [91, 96], что указывает на
наличие кэп-структуры на 5'-конце гРНК PVM. Ген белка оболочки PVM
локализован в 3'-концевой области генома и in vivo экспрессируется при
трансляции соответствующих субгеномных (сг)РНК, образующихся в
зараженных клетках (рисунок 3).
42
Рисунок 3 – Возможные субгеномные РНК PVM [97]
Присутствие небольшой (молекулярный вес 0,65 х 106) было
детектировано в 1981 группой Szybiak et al. [98]. В дальнейшем, наличие
короткой сгРНК было обнаружено другими группами ученых в препаратах
РНК, выделенных из протопластов, зараженных PVM [91, 99].
Первая из шести открытых рамок считывания (ОРС) кодирует большой
полипептид (223 kDa), вирусную репликазу. Она содержит консервативные
последовательности: метилтрансферазу, папаин-подобную протеазу, хеликазу и
РНК-зависимую РНК полимеразу. ОРС2, ОРС3, ОРС4 формируют
тройственный блок генов (TGB), кодирующий 25kDa, 12kDa и 7kDa
полипептиды последовательно, которые отвечают за распространение вируса из
клетки в клетку. ОРС 5 кодирует белок оболочки 34 kDa (СP). Последняя рамка,
ОРС6, кодирует цистеин-богатый 11kDa белок, обладающий РНК-связывающей
активностью. Функции этого пептида не выяснены. Есть предположения (Ryu
et al., 2008), что он может способствовать в передачу вектором вируса, либо
вовлечен в транскрипцию вирусной РНК, либо может являться детерминантом
патогенности для защитной системы вируса [83].
Кроме того, внутри CP-последовательности имеется еще одна
последовательность (7262-7462), которая кодирует небольшой протеин с
молекулярным весом 7 kDa. Этот 7К* белок является основным (pI=10) и,
скорее всего, РНК-связывающим.
Компьютерный анализ, произведенный с помощью функции Protein
BLAST на сайте NCBI [95] показал идентичность в аминокислотной
последовательности белка оболочки различных штаммов и изолятов PVM от 88
до 98% (таблица 4). Кроме того, аналогичный анализ показал идентичность
между последовательностями в белке оболочки PVM и PVS на 47%.
43
Таблица 4 – Идентичность в аминокислотной последовательности белка
оболочки различных штаммов PVM
№
Штамм / изолят PVM
Идентичность
1
Германия
98%
2
Китай (Hangzhou)
96%
3
Польша (Uran)
96%
4
США (Idaho)
88%
Ген TGBp1 PVM, как и аналогичные гены PVS и потексвирусов, а также
58К белок Barley stripe mosaic virus (Gustafson et al., 1986) и 42К белок Beet
necrotic yellow vein virus (Bouzoubaa et al., 1988), содержат консервативный
NTP-связывающий мотив ДНК хеликаз (Gorbalenya et al., 1988), включая
последовательность GKS/T (рисунок 4). Эта последовательность повторяется в
ОРС PVM, присутствуя, в частности, в одном из доменов гена 223К протеина
(Morozov et al., 1990) [100, 101, 102, 103].
PVM – potato virus M, PVS – potato virus S, CVB – Chrysanthemum virus B,
LSV – Lily symptomless virus. Звездочками * обозначен консервативный GKS
трипептид. Консервативный остаток аргинина, вовлеченный в РНК-связывание,
обозначен #
Рисунок 4 – Аминокислотные последовательности, расположенные перед
консервативным мотивом I в хеликазном домене TGBp1 карлавирусов [105]
Эта консервативная последовательность, т.н. мотив I, вместе с мотивом II
ответственна за связывание АТФ и ионов Mg2+ (рисунок 5) и соответствуют
сайтам “Walker A” и “Walker B”, обнаруженным в некоторых АТФсвязывающих белках [104].
Темно-серые районы обозначают расположение домена с хеликазной
последовательностью с 7 консервативными мотивами I-VI
Рисунок 5 – Молекулярная организация TGBp1 Карлавирусов [105]
44
По данным Morozov et al. (1987, 1989), TGBp2 и TGBp3 содержат
гидрофобные последовательности, которые, по всей видимости, вовлечены во
взаимодействия белка с мембранами [106, 107]. TGBp2 содержит 2
гидрофобных сегмента и консервативный центральный район между ними
(рисунок 6).
А
Б
Темно-серые районы обозначают гидрофобные трансмембранные
последовательности. Указаны консервативные последовательности.
А – TGBp2; Б – TGBp3
Рисунок 6 – Молекулярная организация TGBp2 и TGBp3 [105]
В отличие от TGBp2, TGBp3 содержит одну гидрофобную
последовательность на N-конце, за которой следует консервативный район с
характерным мотивом CX5GX8C (рисунок 5) [105].
Существует последовательность ACAAGNNNN-GAANNGC(Nn)AUG,
обнаруженная перед старт-кодонами ОРС, которая, по-видимому, играет
важную роль в экспрессии генома PVM (рисунок 7) [84].
Консервативная последовательность обозначена жирным
Цифры слева обозначают положение первого нуклеотида
шрифтом.
Рисунок 7 – Сравнение нуклеотидных последовательностей перед
старт-кодонами ОРС 223К, TGBp1, TGBp2 и TGBp3 гРНК PVM, по данным
Zavriev et al., 1991
Эта нуклеотидная последовательность обнаружена перед старт-кодоном
223К протеина и генами TGB, но отсутствует перед старт-кодонами CP и 11К
белка. По данным Zavriev et al., данная последовательность необходима для
трансляции белков TGB, будучи сигналом для ре-инициации трансляции или
же независимой инициации трансляции [84].
Распространение вируса в зараженном растении не является
тканеспецифичным. Вирионы обычно находят в цитоплазме, иногда – в
хлоропластах или митохондриях.
45
Симптомы, вызываемые инфекцией растений картофеля PVM, изменяются
от умеренной до ярко выраженной морщинистости и мозаики листьев.
Инфекция некоторыми штаммами вируса может вызывать небольшое
мозаичное закручивание верхних листьев [17]. В некоторых случаях инфекция
может носить латентный характер. Отмирание тканей (некроз) появляется на
семенах при поражении томата [15]. В целом, симптоматика поражения PVM
варьируется в зависимости от штамма вируса и сорта картофеля, как то: пороки
развития листовой пластинки, некрозы черешков и стеблей, мозаики листьев
PVM может передаваться при механическом контакте между растениями, а
также неперсистентно тлями. Круг хозяев является достаточно узким, тем не
менее, PVM распространен повсеместно и, особенно, в областях с умеренным
климатом, где произрастает картофель (Solanum tuberosum). PVM является
экономически важным, т.к. потери урожая, вызванные инфекцией растений
картофеля PVM, обычно составляет около 25-40% [17], но в сочетании с
другими вирусами могут быть значительно выше (до 80%) [12]. Кроме того,
снижается содержание крахмала в клубнях на 2-3% [17].
Flatken et al. в 2008 году получили полнодлинную копию кДНК генома
PVM, которой произвели успешное инфицирование нескольких различных
растений-хозяев. Симптомы, причиняемые этим клоном, не отличались от
таковых у дикого типа вируса [93].
Dziewonska et al. (1978) и Ruiz de Galarreta et al. (1998) обобщили данные о
генах устойчивости к PVM, найденные в диких и культурных сортах Solanum
[48, 108]. Ген устойчивости к PVM Rm происходит от S. megistacrolobum и
отвечает за гиперчувствительный ответ растений на инфекцию PVM. Растения
картофеля, несущие Rm ген, не поражаются вирусом либо, в случае
механического инокулирования, проявляют слабые симптомы – только
некротические пятна на листьях. Доминантный ген Gm был получен от
S.gourlayi и показывает иной тип устойчивости, чем Rm ген. Даже после
механической инокуляции, PVM не распространяется в растениях картофеля.
Gm ген локализован в центральном районе хромосомы IX. Rm ген локализован
на коротком плече хромосомы XI. Несмотря на продолжающиеся исследования
по дальнейшему картированию генов устойчивости, эти работы трудоемки и
затратны. Достаточно сказать, что в Польше, которая несет большие потери изза PVM, зарегистрировано только 2 сорта картофеля, показывающих
гиперчувствительный ответ на поражение М вирусом [109].
Из всех Карлавирусов, только для PVS указано создание трансгенных
растений (картофель и Nicotiana debney), устойчивых к этому вирусу [83].
1.3 РНК-интерференция
В настоящее время РНК-интерференция (RNA interference, RNAi) признана
одним из важнейших клеточных механизмов, участвующих в метаболизме
РНК. RNAi играет важную роль не только в процессах защиты против вирусов
[110], транспозонов [111, 112], регуляции экспрессии генома [113, 114], но
также в регуляции процессов трансляции мРНК, транскрипции генов,
поддержании структуры хроматина и целостности генома [1, 115, 116, 117].
46
Интерференция РНК – феномен, ведущий к посттранскрипционному
молчанию генов (ПТМГ от англ. Post-Transcriptional Gene Silencing, PTGS).
Явление РНК-интерференции было открыто в ходе экспериментов по
подавлению экспрессии генов при помощи антисмысловой РНК (асРНК) у
Caenorabditis elegans. Предполагалось, что аcРНК после комплементарного
узнавания мРНК препятствует ее трансляции. Однако в некоторых
экспериментах было обнаружено, что инъекции контрольной смысловой РНК
(сРНК) вызывают такой же эффект подавления экспрессии гена, как и инъекция
асРНК [118]. Более тщательный анализ показал, что агентом, нарушающим
экспрессию, является не смысловая и не антисмысловая РНК, а двуспиральная
(дс)РНК, которая содержалась в качестве примеси в обоих препаратах.
Ранее уже было известно, что в клетках животных только очень малые
концентрации (10-8 – 10-7 г/мл, но не 10-5 г/мл) дсРНК активируют
протеинкиназу
PKR,
которая
весьма
специфично
фосфорилирует
аминокислотный остаток Ser-53 на альфа-субъединице белкового фактора
инициации трансляции 2 (meIF2αP) [119, 120]. При фосфорилировании
примерно 30% meIF2αP от общего количества молекул meIF2 в клетке
происходило неспецифическое ингибирование трансляции почти всех
клеточных мРНК [120].
В отличие от этого эффекта дсРНК, РНК-интерференция предполагает
специфическое нарушение экспрессии только тех генов, которые обладают
достаточно большой степенью сходства (т.е. практически идентичны) по
нуклеотидной последовательности с введенной дсРНК. Позже выяснилось, что
этот феномен широко распространен среди эукариотических организмов,
включая простейших, животных, грибы и растения. Интерференция РНК
заключается в разрезании дсРНК на короткие фрагменты (20-26 нуклеотидов),
которые играют роль «прицела» для узнавания комплементарных РНК и
разрезания их на нефункциональные фрагменты [121].
Уже сразу после открытия РНК-интерференция стала использоваться как
мощный и удобный способ специфического подавления экспрессии целевых
эукариотических генов. Одновременно начались исследования самого
механизма РНК-интерференции с использованием как генетического, так и
биохимического подходов [122, 123, 124].
По мере выяснения действия дсРНК в клетках беспозвоночных
становилось все более ясно, что феномен РНК-интерференции имеет много
общего с другим явлением, открытым за несколько лет до этого у растений –
«косупрессией» [125, 126]. Косупрессия у растений была обнаружена в ходе
опытов по введению (путем трансгеноза) дополнительных копий генов в
надежде получить увеличение их экспрессии и в результате - необходимый
фенотип. В противоположность ожиданиям исследователей, у трансгенных
растений часто обнаруживалось не увеличение, а подавление экспрессии генов,
при этом в таких случаях оказывались подавленными не только введенные
трансгены, но и нормально экспрессирующийся до этого клеточный ген,
обладающий большим сходством нуклеотидной последовательности с
введенными трансгенами [127].
47
Сейчас становится ясно, что РНК-интерференция и косупрессия у
растений входят в широкий круг явлений, названный зависимым от гомологии
подавлением экспрессии генов (HDGS от homology-dependent gene silencing).
Сюда относятся все явления, при которых наблюдается подавление экспрессии
генов, как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровне,
требующее
наличия
высокого
уровня
идентичности
между
взаимодействующими последовательностями генов [128].
Известно, что различные пути RNAi служат не только защитой от
заражения вирусами и от экспансии мобильных элементов в геноме, но также
становится важнейшими регуляторами активности генов. Таким образом, у
растений RNAi является важным звеном своеобразного "внутриклеточного
иммунитета", позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужую РНК.
Молекулярные механизмы, лежащие в основе процесса RNAi, регулируют
крупные процессы, связанные с гаметогенезом, эмбриогенезом и
дифференциацией многоклеточных организмов.
Практическая значимость работы состоит в том, что искусственно
индуцируя
внутриклеточный
процесс
RNAi,
можно
получать
сельскохозяйственные растения практически полностью иммунные к
фитопатогенным вирусам.
Интерференция РНК служит для защиты от проникновения в клетку
молекулярных паразитов, таких как вирусы, геномы которых представлены
молекулами РНК (одно-цепочечными как плюс- так и минус- полярности, а
также двуспиральными) [129]. При репликации вирусных РНК в клетке хозяина
всегда образуется двуспиральная репликативная форма, в ответ на которую в
клетке запускается (индуцируется) механизм RNAi, который постепенно
разрушает не только реплицирующиеся дсРНК, но и одно-цепочечные копии
вирусных молекул РНК, в том числе мРНК, с которых будут синтезированы
вирусные белки [130, 131].
Однако эволюция вирусов не стояла на месте, они приобрели способность
противостоять клеточной защите [132]. Например, установлено, что белок HCPro, кодируемый PVY, ингибирует работу белковых комплексов, вовлеченных в
механизм RNAi. Такие вирусные белки, которые обладают способностью
нарушать и (или) блокировать клеточный механизм РНК-интерференции
получили название супрессоров RNAi. Белки–супрессоры RNAi кодируются
геномами многих (если не всех) вирусов растений, причем некоторые из них
уже хорошо изучены как по структуре, так и по механизму супрессии [132].
Установлено также, что RNAi служит для контролирования активности
мобильных элементов. Мобильный элемент, или транспозон, это участок
внутри ДНК какого-либо организма способный к копированию самого себя и
встраиванию в любую часть генома. Если бы все транспозоны в клетке
находились в активном состоянии они начали бы беспорядочно встраиваться в
некодирующие участки генома, что может быть не так страшно, а также в
кодирующие участки, что неминуемо привело бы к нарушению работы генов,
кодирующих белки и РНК, и к гибели организма [112, 133].
48
Предполагается, что механизм RNAi препятствует активации транспозонов
и расселению их по геному. Таким образом, взаимодействие RNAi и
транспозонной активности может способствовать формированию структуры
геномов большинства организмов. Считается, что транспозоны могут быть
потомками ретровирусов, встроившихся когда-то в геном и существующими
как внутренние паразиты. Из вышесказанного следует, что RNAi служит
защитой как с внешней стороны - вирусы, так и с внутренней - транспозоны.
Рибонуклеиновый компонент системы РНК-интерференции может быть
представлен эндогенными и экзогенными короткими (20-25 нуклеотидов)
двухцепочечными олигонуклеотидами двух типов - микро (ми)РНК (miRNA) и
короткими интерферирующими (ки)РНК (short interfering RNA, siRNA).
1.3.1 Механизм действия RNAi
РНК-интерференция является РНК-зависимым процессом «замолкания»
генов, который контролируется RISC-комплексом. Длинные двухцепочечные
РНК (как экзогенные, так и эндогенные) разрезаются белком Dicer или Dicerподобным
(DCL) на
21-26-нуклеотидные siRNA. Эти
короткие
интерферирующие РНК встраиваются в протеиновый комплекс, называемый
RISC (от RNA-induced silencing complex). В результате активности RISC
одноцепочечный
фрагмент
РНК
соединяется
с
комплементарной
последовательностью молекулы мРНК-мишени и вызывает разрезание мРНК
белком Argonaute либо ингибирование трансляции и/или деаденилирование
мРНК (рисунок 8) [134, 135, 136, 137].
Рисунок 8 – Схема РНК интерференции, по данным В.В. Оберемка [137]
49
Согласно современным представлениям [138, 139] известно три механизма
замолкания генов у растений: пост-транскрипционное замолкание трансгенных
и вирусных РНК (VIGS), замолкание эндогенных мРНК (PTGS),
транскрипционное замолкание генов (TGS).
1.3.2 Пост-транскрипционное замолкание генов
Транскрибированная с трансгена, одноцепочечная мРНК превращается в
двухцепочечную (дц)РНК при участии клеточного фермента РНК-зависимой
РНК-полимеразы (RdRp от RNA-dependent RNA-polymerase). Этот фермент
обнаружен у растений многих видов. Пониженная экспрессия гена,
кодирующего RdRp I, приводила к более интенсивному накоплению Y-вируса
картофеля в растениях табака сорта Samsun NN и к снижению содержания
альтернативной митохондриальной оксидазы, ингибитора вирусной репликации
и транскрипционного фактора ERF5 [140]. При заражении растений РНКсодержащими вирусами в клетках синтезируется вирусная RdRp, которая
образует вирусную репликативную дцРНК. Эти дцРНК включают механизм
деградации РНК в строгой зависимости от ее последовательности, индуцируя
повышение активности специфической РНКазы III, гидролизующей дцРНК.
Этот фермент впервые был выявлен в клетках Drosophila и получил название
Dicer [36]. У растений аналогичный фермент назвали Dicer-like (DCL) [141].
Геномы человека, мышей и нематод содержат по одному гену Dicer, у
насекомых и грибов – по два гена. У растений генов DCL больше: A. thaliana –
четыре гена, тополь Populus trichocarpa Torr. & A. Gray – пять, рис Oryza sativa
L. – шесть [142]. У растений A. thaliana DCL1 участвует в образовании миРНК,
DCL2 – киРНК, DCL3 ответственен за модификацию хроматина, DCL4 – трансдействующих киРНК. МикроРНК (миРНК) – дцРНК длиной 21-25 нуклеотидов
с двумя некомплементарными 3'-концевыми нуклеотидами образуются при
нарезании клеточных шпилечных РНК. Короткие интерферирующие (ки)РНК –
дцРНК длиной 21-25 нуклеотидов с двумя некомплементарными 3'нуклеотидами и монофосфатом на 5’-конце образуются при нарезании длинных
трансгенных и вирусных дцРНК. Транс-действующие киРНК – подобно миРНК
комплементарно взаимодействуют с мРНК другого локуса [141].
Ферменты DCL являются многокомпонентными белками и содержат один
или более домен, связывающий дцРНК, сигнал ядерной локализации,
двухдоменную хеликазу, двухдоменную РНКазу III, а также домены PIWI,
Argonaute, Zwille (PAZ), обеспечивающие специфическое взаимодействие с
двумя неспаренными 3'-нуклеотидами. Кроме того, все известные ферменты
DCL содержат домен Duf283 с неизвестной функцией. В результате
взаимодействия дцРНК с DCL2 каждая цепь дцРНК разрезается в двух местах,
отстоящих друг от друга на 2 нуклеотида с образованием киРНК.
1.3.2.1 Короткие интерферирующие РНК
Короткие интерферирующие РНК (киРНК или siRNA) представляют собой
короткие (длиной 20-25 нуклеотидов) двухцепочечные РНК с двумя
50
неспаренными выступающими нуклеотидами на 3'-концах. Каждая из двух
цепей РНК имеет фосфатную группу на 5'-конце и гидроксильную группу на 3'конце. Короткие интерферирующие РНК с такой структурой образуются в
результате активности фермента Dicer, субстратами которого являются
длинные двухцепочечные (дц)РНК или короткие РНК, содержащие шпильки
[143, 144]. Дуплексы малых интерферирующих РНК поступают далее в
каталитический комплекс RISC, где при участии белка Argonaute происходит
расплетание дуплекса и образование комплементарного комплекса короткой
антисмысловой РНК со специфической последовательностью в мРНК-мишени,
что приводит к дальнейшей деградации последней (рисунок 8). В отличие от
микроРНК, короткие интерферирующие РНК, как правило, точно
гибридизуются с мишенью и приводят к эндонуклеолитическому расщеплению
единственной специфической мРНК [145]. Короткие интерферирующие РНК
могут быть искусственно введены в клетки для «нокдауна» (временного
замолкания) определенного гена. При этом экспрессия практически любого
гена с известной последовательностью нуклеотидов может быть
целенаправленно
изменена.
Данное
свойство
делает
короткие
интерферирующие РНК удобным инструментом для исследования функций
генов и изучения мишеней лекарственных средств [146, 147].
1.3.2.2 МикроРНК
МикроРНК (англ. microRNA, miRNA) представляют собой некодирующие
РНК длиной 21—22 нуклеотида, принимающие участие в регуляции экспрессии
генов. МикроРНК связываются со специфическими последовательностями
мРНК в 3'-нетранслируемой области и вызывают ингибирование трансляции
либо удаление поли(А)-хвоста (рисунок 8). Молекулы микроРНК
транскрибируются РНК полимеразой II (Pol II) в виде первичных транскриптов
длинных генов, кодирующих предшественники микроРНК (англ. pri-miRNA,
primary miRNA), и содержат кэп-структуру и poly(A)-последовательность на 5'и 3'-концах соответственно. После процессинга в ядре клетки с участием DCL1
представляют собой pre-miRNA - структуры вида стебель-петля длиной около
70 нуклеотидов. Комплекс процессинга pri-miRNA в pre-miRNA содержит
фермент с активностью РНКазы III, называемый Drosha, и белок, связывающий
двухцепочечную РНК, - Pasha. Двухцепочечная часть pre-miRNA связывается и
разрезается белком Dicer. При этом образуется зрелая молекула микроРНК,
которая может далее поступать в RISC [148, 149, 150].
Идентифицировано более 100 микро РНК у Arabidopsis thaliana. Сравнение
микроРНК из растений разных родов показало, что многие из них
консервативны [151].
У животных микроРНК обычно имеют неполную комплементарность с
мРНК-мишенью и могут ингибировать трансляцию многих мРНК со сходными
последовательностями. У растений комплементарность во многих случаях
может быть полной [152].
51
1.3.2.3 RISC-комплекс
RNA-induced silencing complex или RISC - мультибелковый комплекс, в
состав которого входит один из белков семейства Argonaute и короткие
интерферирующие РНК (киРНК или siRNA), предварительно подвергшиеся
процессингу эндонуклеазой Dicer. Когда Dicer расщепляет предшественник
siRNA, представляющий собой двухцепочечную молекулу РНК (dsRNA) на
короткие фрагменты, в состав RISC всегда включатся только одна из цепей
[153, 154]. Предпочтение отдается фрагменту c наиболее термодинамически
нестабильным 5'-концом [155]. Оставшаяся цепь, так называемая
«пассажирская», деградирует как субстрат для RISC-комплекса [156]. Затем
RISC образует комплекс с мРНК-мишенью, что приводит либо к репрессии ее
трансляции в случае неполной комплементарности, либо к расщеплению её
последовательности приблизительно в середине участка гибридизации в случае
полной или почти полной комплементарности (рисунок 8). Белок Argonaute
(Ago), основной компонент RISC, разрезает РНК-мишень в участке
комплементарного взаимодействия с киРНК. Белки Ago выявлены в составе
RISC у всех изученных организмов. В настоящее время в растениях
идентифицировано 10 белков Ago [141].
К настоящему времени механизм, по которому RISC находит
комплементарную мРНК внутри клетки, изучен недостаточно. Показано, что
для успешной деградации мРНК комплексом siRISC трансляция не требуется
[157]. Более того, показано, что путь РНК-интерференции может быть более
эффективным против мРНК-мишеней, трансляция которых не осуществляется в
текущий момент времени [158].
Данный процесс имеет значение как в регуляции активности генов с
помощью microRNA, так и в защите от вирусных инфекций, так как вирусы
часто используют двухцепочечные РНК как инфекционный вектор [129, 154].
1.3.3
Замолкание эндогенных мРНК, вызванное микроРНК
По данным В.И. Малиновского (2010, [141]), это механизм регуляции
экспрессии генома растений с помощью миРНК. У растений миРНК
образуются в три этапа при участии DCL1. Сначала синтезированная РНКполимеразой II pri-микроРНК превращается в pre-микроРНК, которая
преобразуется в более короткий предшественник. Затем формируется зрелая
миРНК [159]. У растений A. thaliana идентифицирован белок HASTY,
необходимый для переноса зрелых миРНК или комплекса микроРНК-DCL1 из
ядра в цитоплазму [160, 161]. На всех этапах созревания микроРНК участвует
дцРНК -связывающий белок HYL1, способный входить в комплекс с DCL1 и
Ago [162]. Затем miRNA, подобно siRNA, взаимодействует с RISC, где
комплементарно связывается с эндогенными мРНК и белок Ago разрезает РНКмишень. Количество идентифицированных растительных мРНК, у которых есть
специфические микроРНК-партнеры, постоянно увеличивается.
52
1.3.4
Транскрипционное замолкание генов
Впервые этот механизм был выявлен у трансгенных растений табака со
встроенной последовательностью кДНК вироида веретеновидности клубней
картофеля, которая метилировалась после заражения вироидом [141]. Авторы
(Wassenegger et al [163]) пришли к заключению, что реплицирующаяся
вироидная РНК вызывает специфичное метилирование гомологичных
последовательностей в растительном геноме. Этот феномен получил название
РНК-зависимое метилирование ДНК. Позже было действительно показано
[164], что экспрессия дцРНК, которая соответствует последовательности
промотора, включает строго зависящее от последовательности специфичное
метилирование этого промотора с последующим транскрипционным
замолканием гена. Этот процесс осуществляется при участии специфических
киРНК и модифицированного гистона [165]. В РНК-зависимом метилировании
ДНК de novo участвуют ДНК метилтрансферазы 1 и 2, а гистон деацетилаза 6
усиливает их активность, что приводит изменению гетерохроматина в участке
локуса-мишени [166].
1.3.5
Распространение замолкания генов по растению
Во многих работах (Palauqui et al., 1997; Voinnet et al., 1997; Tournier et al.,
2006) показано, что замолкание генов, возникнув в какой-нибудь клетке,
распространяется по растению, вызывая системное замолкание гена-мишени
[167, 168, 169].
Сигнал замолкания перемещался от клетки к клетке по плазмодесмам
(ближний транспорт) на расстояние 10-15 клеток от места индукции и по
флоэме в другие органы (дальний транспорт). Возможно, эти два вида
транспорта имеют различные механизмы, так как они неодинаково
ингибировались солями кадмия, вирусными белками и генными мутациями
[170, 171, 172]. Так как в процессе транспорта сигнал замолкания генов может
сильно слабеть (утихать), то необходима его амплификация в клеткахреципиентах. Она осуществляется при участии RdRp и хеликазы [171, 173, 174].
Сигнал замолкания генов транспортируется как вверх, так и вниз по
растению, но вверх более активно [175, 176]. Однако в клетках крайних зон
меристем стебля и корня замолкание генов не обнаружено, что свидетельствует
об отсутствии транспорта сигнала замолкания в эти зоны или не способности
этих клеток отвечать на сигнал [175].
Природа сигнала замолкания генов пока неясна. Показано, что
распространение замолкания всегда строго специфично по отношению к
последовательности РНК-мишени, означая, что распространяемым сигналом
является или дцРНК или киРНК [171, 177, 178]. Во флоэмном соке растений
были обнаружены как короткие [179], так и более длинные молекулы РНК [180,
181]. В соке также был найден низкомолекулярный белок, способный связывать
25-нуклеотидные одноцепочечные (оцРНК) и было показано, что он может
содействовать ближнему транспорту этих РНК, но не дцРНК [141, 179].
53
1.3.6
Замолкание генов и антивирусная защита растений
Феномен восстановления растений после вирусного поражения был описан
более 80 лет назад. Первоначально инфицированные листья имели признаки
поражения болезнью. Однако верхние листья не имели симптомов болезни и
становились иммунными к вирусу. Как следствие, растение становилось
устойчивым к повторному поражению этим вирусом или близкородственными
патогенами. Этот факт привел к развитию концепции перекрестной защиты
(cross protection). Перекрестная защита – тип индуцируемой устойчивости,
которая базируется на положении, что инфицирование одним вирусом может
привести к устойчивости к близкородственным вирусам. Хотя и
восстановление растений после болезни, и перекрестная защита были известны
давно, до последнего времени механизмы их действия оставались неизвестны.
Тем не менее, факт перекрестной защиты показал наличие у растений
собственной адаптивной антивирусной защитной системы. Открытие явления
замолкания генов (RNAi) показало схожесть этих двух процессов, т.к. RNAi
действует как природная защитная система против вирусов.
Успешная вирусная инфекция в растениях нуждается в процессах
репликации в инфицированных клетках, движении вируса из клетки в клетку, и
в дальнем транспорте по всему растению. Несмотря на это, растения пытаются
защитить себя, и процесс RNAi развивался и эволюционировал в этом
направлении – поиск и деградация чужеродных молекул РНК. Подавляющая
часть фитовирусов имеет в качестве генома молекулы РНК, которые могут
вызывать RNAi.
Однако и вирусы, после длительной совместной эволюции с растениями,
разработали собственный защитный механизм против клеточного процесса
RNAi – белки-супрессоры [151].
1.3.7
Вирусные белки - супрессоры замолкания генов
Несмотря на наличие у растений эффективного защитного механизма
(RNAi), основанного на узнавании и деградации вирусных РНК благодаря
точному узнаванию последовательности их РНК, тем не менее, многие вирусы
все же поражают растения. Дело в том, что в ходе эволюции вирусы приобрели
способность преодолевать клеточную защиту. Как указывал Ю.Л. Дорохов
(2007, [139]), два способа – быстрая сборка вирионов и компартментализация –
были известны задолго до открытия замолкания генов. Сборка вирионов
(«одевание» вирусной нуклеиновой кислоты белковой оболочкой) и
компартментализация (размещение вирусного материала в обособленных, как
правило, мембранами, участках клеток) являются эффективной защитой
вирусного генома от воздействий. Кроме того, некоторые вирусы содержат
гены, кодирующие белки-супрессоры замолкания генов. Первым известным и
одним из наиболее изученных супрессоров является специфичная протеиназа
(helper component-proteinase, HC-Pro), кодируемая потивирусами. Так, было
показано, что в трансгенных растениях табака, экспрессирующих встроенный
ген HC-Pro, увеличивалось накопление ВТМ и вируса огуречной мозаики [182;
54
183]. Такой эффект был обусловлен тем, что белок HC-Pro подавляет
замолкание генов [184, 185, 186]. Активность HC-Pro как супрессора
определяется аминокислотными остатками в позициях 180, 205 и 396 [187].
В настоящее время супрессоры идентифицированы примерно у 30 вирусов
растений и животных. Вирусные супрессоры ингибируют накопление ки РНК, а
также некоторые из них способны связываться с киРНК и миРНК и
маскировать их [138, 139]. Также было установлено, что мутанты Х-вируса
картофеля, не способные подавлять замолкание генов, не могли
транспортироваться от клетки к клетке [188]. Вирусные супрессоры влияют на
развитие растений и формирование симптомов заболевания [117, 152, 189, 190].
Возможно, белки-супрессоры развивались независимо в разных вирусных
группах, т.к. структурно и функционально все они различны, и не наблюдается
никакой гомологии в структуре отдельных супрессоров [141, 151].
1.3.7.1 Белок HC-Pro вирусов рода Potyvirus
Геном вирусов рода Potyvirus кодирует супрессор RNAi HC-Pro (helper
component proteinase), который является классическим примером вирусного
мультифункционального белка, ответственного за успешное системное
распространение вирусов этого семейства в инфицированном организме (Р.Т.
Омаров и др., 2010; Omarov et al., 2012 [5, 191]). Многочисленными
биологическими процессами, в которых функционально участвует белок HCPro являются: вирусная репликация, системное и межклеточное движение и
автокаталитическое расщепление вирусного полипротеина [192, 193, 194].
Однако наиболее важной биологической функцией HC-Pro является его участие
в супрессии RNAi. Первым зафиксированным, но все же косвенным
доказательством того, что HC-Pro участвует в супрессии RNAi, было
наблюдение, что в трансгенных растениях, экспрессирующих 5'-концевой
сегмент генома Tobacco etch virus (TEV), который кодирует сегмент P1/HC-Pro,
происходило усиление симптомов заболевания при заражении другими
вирусами [195]. Последующие независимые исследования показали, что белок
HC-Pro является ключевым фактором в супрессии RNAi в инфицированных
растениях [184, 185, 196]. Дальнейший мутационный анализ вируса показал,
что для супрессорной активности белка HC-Pro необходим центральный район,
в то время как его N-концевая часть не является обязательной для данной
функции [186]. Довольно интересным представляется наблюдение, что HC-Pro
взаимодействует с белком rgsCaM, который является эндогенным супрессором
RNAi в растениях [197].
Позднее появилось предположение, что механизм действия HC-Pro
заключается в ингибировании DCL, так как трансгенная экспрессия вирусного
белка в растениях связана с аккумулированием длинных необработанных
dsRNAs [198, 199]. Было также показано, что экспрессия HC-Pro приводит к
дефектам в росте и дифференцировки растений Arabidopsis, предположительно
благодаря ингибированию miRNA-ассоциированного гидролиза мРНК
транскрипционных факторов [200]. Таким образом, впервые была установлена
функциональная связь между молекулярными факторами, вовлеченными в
55
процессы роста и дифференцировки, с одной стороны, и антивирусной RNAi –
с другой. Более того, была впервые предложена причина возникновения
симптомов заболевания в инфицированных растениях как результат экспрессии
вирусного RNAi -супрессорного белка [189].
Биохимические исследования HC-Pro показали, что его способность
формировать димеры и мультимеры является критической для функции в
качестве супрессора RNAi [201]. В ранних работах было показано, что HC-Pro
блокирует образование киРНК [202]. В ходе дальнейших работ было показано,
что HC-Pro предотвращает образование киРНК определенного размера [203].
Кроме того, супрессорная функция HC-Pro может быть также связана с
понижением стабильности siRNA, так как трансгенная экспрессия белка
приводит к существенно уменьшенной 3'-концевой модификации вирусных 21нт siRNAs [205]. Более того, было обнаружено, что HC-Pro препятствует
функциональному метилированию mi/siRNA [206] и связыванию дуплексов
siRNA [207]. Недавние исследования выявили функциональную роль участка
FRNK в структуре HC-Pro белка для связывания siRNA и показали, что данная
функция взаимосвязана с селективным связыванием miRNAs и степенью
проявления симптомов вирусного заболевания [208].
1.3.7.2 Белок P19 вирусов рода Tombusvirus
Ранние генетические исследования белка P19, который кодируется
геномом вирусов Tombusviridae, показали участие белка в процессах
репродукции, движения, упаковки РНК и векторной трансмиссии вируса [209].
Позднее было обнаружено, что P19 является важным патогенным фактором,
который необходим для развития симптомов инфекции [210]. Например, P19
вируса кустистости и задержки роста томата (Tomato bushy stunt virus, TBSV)
не оказывает существенного влияния на начальные этапы инфекции в
растениях Nicotiana benthamiana, но необходим для системного вторжения в
другие организмы, такие как перец (Capsicum annum) и шпинат (Spinacia
oleracea) [211, 212]. Участие P19 в супрессии RNAi было впервые
продемонстрировано на трансгенных растениях, экспрессирующих зеленый
флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP), инфицированных Xвирусом картофеля, который был использован в качестве вектора для
экспрессии P19 [213]. Дальнейшие исследования показали решающую роль
TBSV P19 в защите вирусной РНК в ходе системной инфекции в растениях N.
benthamiana [214, 215]. Более того, биологическая активность белка зависела от
его количества, т.е. успешная инфекция, степень проявления симптомов, а
также стабильность вирусной РНК требуют достаточно высокого уровня
экспрессии P19 [215, 216].
Вероятно, наиболее весомым объяснением супрессорной функции белка
p19 является определение его структуры. Исследования, проведенные двумя
независимыми научными группами, полученные методом рентгеновской
кристаллографии, указали на существование комплекса между димерами P19 и
двухцепочечными молекулами siRNA [217, 218]. Данные структурные
исследования выдвинули первое объяснение возможного молекулярного
56
механизма функционирования вирусного супрессора в процессе блокирования
RNAi. Более того, прямое физическое взаимодействие между P19 и вирусными
siRNAs было также обнаружено in planta, т.е. в инфицированных растениях
[219, 220]. Эти исследования выявили существование корреляции между
способностью P19 эффективно связывать siRNA и степенью проявления
симптомов вирусного заболевания в некоторых (хотя и не во всех) растенияххозяевах [221].
Таким образом, функция P19 в качестве вирусного супрессора состоит в
том, что в ходе инфекции белок P19 связывает обильно циркулирующие
вирусные siRNA, делая их недоступными для программирования RISC,
активность которого направлена на разрушение вирусной РНК. В результате
этого происходит аккумуляция вирусных молекул РНК в инфицированном
организме (Омаров и др., 2010; Omarov et al., 2012 [5, 191]). Доказательством в
поддержку данной модели служит тот факт, что инфекция N. benthamiana с
дефектными по P19 мутантами TBSV ассоциирована с присутствием в
растениях RISC комплекса, который содержит вирусные siRNA и имеет
специфичную рибонуклеазную активность [222, 223]. Также было показано, что
P19 препятствует процессу защитного метилирования miRNAs [206]. Таким
образом, есть основание предполагать, что способность P19 связывать siRNA
может препятствовать работе фермента HEN1, ответственного за
метилирование siRNA (это было показано для некоторых других вирусных
супрессоров).
1.3.7.3 Белки-супрессоры М вируса картофеля
В 2011 Senshu et al. опубликовали свои данные о белках-супрессорах М
вируса картофеля [224]. Основываясь на литературных данных, что белки
TGB1 и ОРС6 вирусов других родов идентифицированы как супрессоры RNAi,
они решили проверить эти же белки у PVM. TGB1 потексвирусов (род
Potexvirus семейства Flexiviridae) подавляет RNAi как на локальном, так и на
системном уровне в экспериментах с GFP ко-экспрессией [188, 225]. ОРС6,
кодируемые вирусами других различных родов, таких как Tobravirus,
Hordeivirus, Pecluvirus и Vitivirus, и содержащие характерную цистеиновую
последовательность, были также охарактеризованы как супрессоры RNAi [4,
226, 227, 228, 229].
В частности, группой Senshu et al. были получены данные о том, что ОРС6
PVM подавляет локальную RNAi и повышает уровень содержания вирусной
РНК на клеточном уровне. Супрессия внутриклеточного механизма RNAi
ингибирует накопление siRNA и тем самым предотвращает распространение
RNAi как в клетках, так и в растениях в целом [224].
Далее, согласно их экспериментальным данным с транзиентной GFP коэкспрессией, TGB1 не ингибировал локальную RNAi. Хотя TGB1
супрессировал распространение замолкания GFP, что, по мнению Senshu et al.,
свидетельствует о целевой специфичности TGB1 на распространение сигнала
РНК-интерференции.
57
1.4 Генетически модифицированные (ГМ) организмы
С 1994 по 2004 г. ГМ-источники пищи на мировом продовольственном
рынке были представлены ГМ-растениями первого поколения, обладающими
устойчивостью к гербицидам, вредителям, вирусам, грибковым инфекциям и
новыми потребительскими качествами. Растения второго поколения (2005-2015
гг.) будут устойчивы к пестицидам, вредителям, патогенам, воздействию
климатических факторов, засолению почв и т.д., а также иметь
пролонгированный срок хранения, высокую пищевую ценность, улучшенные
пищевые качества, характеризоваться отсутствием аллергенов, способностью к
продуцированию иммунных препаратов и лекарств. Для культур третьего
поколения (2015 г. и далее), кроме вышеперечисленных качеств, будут
характерны изменение времени цветения и плодоношения, изменение размера и
количества плодов, повышение эффективности фотосинтеза, продуцирование
пищевых веществ с повышенным уровнем ассимиляции. Биотехнология
продолжает интенсивно развиваться. В 2007 г. в более чем в 20 странах (в том
числе и европейских) трансгенными культурами засеяно уже около 110 млн.
гектаров сельскохозяйственных земель. К 2015 г. этот показатель может
достигнуть 200 млн. гектаров (около 14% всех возделываемых на Земле
площадей) [230, 231, 232].
Тем не менее, один из самых перспективных путей увеличения
продовольственных ресурсов – применение методов современной
биотехнологии, возникшей на стыке ряда фундаментальных научных
направлений и представляющей собой мощную производственную силу,
способную в значительной степени решить проблему продовольственного
обеспечения людей. Проблема практического использования ГМ-источников
пищи включает несколько аспектов, равноценных по значимости [230].
Первый касается собственно технологии разработки и доведения
производства нового вида растения до промышленных масштабов. Еще недавно
это был не только в высшей степени наукоемкий, но самый длительный и
объемный по времени и материальным затратам процесс. Однако в последние
годы по мере накопления опыта, развития методологии и совершенствования
техники и технологий наблюдается тенденция к снижению временных и
материальных затрат при сохранении высокого научного потенциала.
Одновременно существенно возрастает роль и значение второго аспекта,
касающегося проблемы разработки и совершенствования системы медикобиологической оценки безопасности новой продукции. Именно этот аспект в
настоящее время является приоритетным при решении вопроса о допуске ГМрастений к промышленному производству и о возможности их использования в
качестве продовольственного сырья и пищевых продуктов.
Третий аспект – обеспечение защиты общества от намеренно
антигуманного использования новейших биотехнологий. Очевидно, что любую
технологию, в том числе высокую, можно применить как во благо, так и во вред
человеку. Важнейший и едва ли не единственный способ защиты от возможных
отрицательных последствий научно-технического прогресса – высокий уровень
58
общественной и производственной культуры и дисциплины, строжайшее
соблюдение требований технических регламентов, объективно жесткие
контрольные и надзорные мероприятия.
И, наконец, четвертый аспект, объединяющий ряд проблем, которые на
первый взгляд могут показаться несущественными, однако исключительно
важны и связаны с вопросами информационного обеспечения данной области
знаний в среде специалистов и населения.
В 2007 г. в мире зарегистрировано и допущено к промышленному
производству около 170 линий ГМ-растений, в том числе 22 линии картофеля,
устойчивого к колорадскому жуку и Y вирусу картофеля [230]. Результаты
исследований показали отсутствие статистически достоверных различий между
картофелем, устойчивым к колорадскому жуку, и его традиционным аналогом
[233].
Согласно
результатам
токсикологических
исследований,
неблагоприятные эффекты инсектицидного белка CRYIIIA отсутствовали даже
при введении его максимальной дозы. Отсутствие гомологии белка CRYIIIA с
известными белковыми аллергенами по аминокислотному составу, быстрая
перевариваемость в желудочном и кишечном соке и при приготовлении пищи,
незначительное количество данного белка в клубнях картофеля позволили
сделать вывод об отсутствии аллергенности [230].
В целом, в данном обзоре литературы обобщены научные данные,
касающихся структурно-функциональных аспектов устойчивости растений
семейства пасленовых к вирусным заболеваниям.
Прежде всего, собраны многочисленные данные молекулярногенетического подхода к познанию явления РНК-интерференции. Однако,
работы по изучению RNAi в растительных клетках, и по идентификации
вирусных супрессоров этого процесса в частности, находятся на стадии
становления. Результаты наших исследований представляют собой
определенный вклад в эту область знания и являются приоритетными и
актуальными.
59
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы исследования
Объектом исследования явилась геномная РНК М вируса картофеля рода
Carlavirus.
В ходе работы использовали следующие плазмидные векторы: pDONR207,
pMDC32, pCambia2300, 35SplGUS.
Для приготовления буферных растворов использовали реактивы ≥98%,
≥98,5% и ≥99% степеней чистоты, производимых фирмами “Sigma”, “Merck”.
Также в работе использовали ферменты и киты производства “Fermentas”, “New
England Biolabs”, “Invitrogen”, “Applied Biosystems”.
2.2 Компьютерный анализ
Компьютерный анализ фрагментов и полноразмерной гРНК PVM
проводили с использованием программ “VectorNTI” и “GeneRunner”, задавая
параметры анализа по умолчанию. Последовательности геномных РНК вирусов
были взяты из базы данных NCBI [95].
2.3 Выделение М вируса картофеля
Листья с симптомами системной реакции на заражение гомогенизировали
в 0,2 М калий - фосфатном буфере рН 7,6, содержащем 0,2 % меркаптоэтанола,
3% мочевины и 1% тритон Х-100 в соотношении 1 г листьев в 2 мл буфера.
Центрифугировали при 8000 x g в течение 15 мин (3 раза): супернатант
собирали, а осадки отбрасывали.
Затем добавляли равный объем смеси четыреххлористый углерод /
хлороформ (1/1) по отношению к объему супернатанта и центрифугировали
8000xg в течение 20 мин: супернатант (водную фазу) собирали, а нижнюю фазу
органических растворителей отбрасывали.
Далее проводили очистку через 20% сахарозную «подушку» с 3%
мочевины центрифугированием при 31000хg, в течение 3 часов. Осадок
суспендировали на качалке в 0,1 М калий - фосфатном буфере, рН 7,0 в течение
ночи в холодильнике при +4 °С. Суспензию осветляли при 8000 x g в течение
15 мин и, затем, супернатант центрифугировали в градиенте сахарозы 10-40%
на 0,1 М калий - фосфатном буфере, рН 7,0 в роторе SW-28 при 22000 х g в
течение 3,5 часов.
Фракции сахарозного градиента, содержащие очищенный М-вирус,
центрифугировали при 8000 х g в течение 10 мин для удаления возможных
агрегатов.
2.4 Выделение РНК М вируса картофеля
В ходе эксперимента 500 мг листьев растений Datura stramonium
растирали в ступках в присутствии жидкого азота до порошкообразного
состояния. В гомогенат добавляли 10 мл Тризола, помешивая до прозрачности.
Добавляли 2 мл хлороформа из расчета 1:5 к объему Тризола. Экстракцию
60
нуклеиновых кислот проводили в центрифужных пробирках, путем
перемешивания и инкубации в течение 5 мин. при комнатной температуре.
Для разделения фаз центрифугировали 15 мин. при 10000 об/мин и 4 oC. К
водной фазе добавляли равный объем (5,8 мл) изопропанола из расчета 1:1.
После инкубации во льду 30 мин. проводили центрифугирование в течение 15
мин. при 12000 об/мин и 4oC. Полученный осадок промывали 70% этанолом с
последующим центрифугированием (10 мин. при 10000 об/мин.) и после
подсушивания на воздухе растворяли в 200 мкл стерильной воды.
Дальнейшая очистка препарата осуществлялась гель-фильтрацией на
колонках Сефадекс G-25 (“Amersham”). Концентрацию РНК замеряли на
спектрофотометре (1,6 мкг/мкл).
Одномерный электрофорез белков по Лэмли в ПАА-геле в присутствии
0,1% ДС-Na проводили по стандартной методике [234] на приборе Mighty-small
фирмы “Hoefer”. Гели окрашивали 0,125% раствором Кумасси бриллиантового
голубого R-250 фирмы “Serva”. Полипептиды, синтезированные в системе in
vitro
в
присутствии
[35S]метионина,
детектировали
с
помощью
авторадиографии. Для этого ПАА-гель после электрофореза сушили и
экспонировали с рентгеновской пленкой «» в течение ночи.
2.5 Реакция обратной транскрипции
Реакция обратной транскрипции проводилась по следующему протоколу:
2 пикомоля олигонуклеотидов, от 1 до 5 нг РНК, 10 мМ каждого
дезоксирибонуклеозидтрифосфата, при общем объеме смеси 12 мкл.
Инкубировали 5 мин. при 65оС. Быстро охлаждали во льду. Далее добавляли 5кратный буфер первой цепи (“Fermentas”) и 0,1М дитиотрейтола.
Инкубировали 2 мин. при 42оС. Для синтеза второй цепи добавляли 200 ед.
обратной транскриптазы SuperScript II RT и инкубировали 50 мин. при 42 оС.
Инактивировали фермент добавлением хлороформа и последующим
центрифугированием (5 мин. при 12000 об/мин.).
2.6 Полимеразная цепная реакция
Амплификация ДНК проводилась на градиентном амплификаторе с
участием Pfu-полимеразы (“Eppendorf”) и олигонуклеотидов для каждой ОРС в
следующем температурном режиме:
Стадия 1 – 5 мин. 94оС
- 1 цикл
о
Стадия 2 – 1 мин. 94 С, 1 мин. 40оС-50оС-60оС, 1 мин. 72оС - 40 циклов
Стадия 3 – 5 мин. 72оС
- 1 цикл
Продукты ПЦР анализировались в 1% агарозном геле и в дальнейшем
использовались для клонирования.
2.7 Трансляция in vitro в бесклеточной системе из зародышей пшеницы.
Буфер для растительной бесклеточной системы имеет следующий состав: 10
мМ трис-(ОАc) рН 7,6; 90 мМ K(ОАc); 3 мМ Mg(ОAc)2; 5 мМ дитиотрейтола
(ДТТ); 5% глицерина. Реакционная смесь содержала следующие компоненты: 20
мM трис-(ОАс) (pH 7.6); 90мM K(ОАc); 2,5мM Mg(ОAc)2; 1,6 мM ДTT; 1 мM
61
ATФ; 0,1 мM ГTФ; 10 мM фосфокреатин; 0,12 мг/мл фосфокреатин киназы; 0,1
мM спермин; по 0,1 мM аминокислот; 0,08 мг/мл мРНК. Если необходимо было
получить радиоактивно меченые продукты трансляции, к реакционной смеси
дополнительно прибавляли 0,075 мМ [35S]-L-метионина (37,0 МБк). В 25 мкл
реакционной смеси для бесклеточной системы трансляции содержалось 11 мкл
экстракта из зародышей пшеницы. Смеси инкубировали при 26 C в течение 1
часа или при 37С в течение 2 часов.
2.8 BP реакция с использованием Gateway технологии
Клонирование в промежуточный вектор pDONR207 было осуществлено с
помощью набора Gateway-kit (“Invitrogen”). Реакционная смесь объемом 8 мкл
содержала: 5х BP Clonase буфер, 200 ng вектора pDONR207, 40 fmol PCR
продукта. Добавили 1 мкл BP Clonase. Инкубировали 3 час при 25°С.
Останавливали реакцию добавлением 1 мкл протеиназы К. Инкубировали 10
мин. при 37°С. Продукты реакции рекомбинации (BP реакция) были
использованы для трансформации компетентных клеток.
2.9 Трансформация компетентных клеток
Трансформация компетентных клеток бактерий Escherichia coli штамма
DH5α методом теплового шока. 5 мкл реакционной смеси инкубировали в
течение часа во льду с 100 мкл компетентных клеток бактерий. Затем их
подвергали шоку, инкубируя 90 сек. при 42°С. Инкубировали с 400 мкл среды
LB в течение часа при 37°С. Наносили 300 мкл на чашки Петри со средой LB с
агаром и селективным антибиотиком (100 мкг/мл гентамицина). Инкубировали
при 37°С в течение ночи.
2.10 LR реакция с использованием Gateway технологии
Клонирование в вектор назначения pMDC32 было осуществлено с
помощью набора Gateway-kit (“Invitrogen”). Реакционная смесь объемом 20 мкл
содержала: 200 нг ДНК (ENTRY Clone), 400 нг вектора pMDC32, 4 мкл LR
Clonase, 50 mM Tris-HCl pH7,5, 0,25 mM EDTA, 2,5 mM spermidine HCl, 0,2
мг/мл БСА. Добавили 4 мкл смеси BP Clonase (“Invitrogen”). Инкубировали 1
час при 25°С. Останавливали реакцию добавлением 2 мкг протеиназы К.
Инкубировали 20 мин. при 37°С. Таким образом подготовили реакционную
смесь для трансформации. Трансформация компетентных клеток бактерий
Escherichia coli штамма DH5α методом теплового шока проводилась по такой
же схеме, как и в пункте №2.7. Селективный антибиотик – канамицин (100
мкг/мл).
2.11 Трансформация клеток Agrobacterium tumefaciens
Трансформация Agrobacterium tumefaciens (штамм С58) методом
электропорации на приборе GenePulser II (“Bio-Rad”). 200 нанограмм ДНК
(клоны в pMDC32) смешивали на льду с 50 мкл компетентных клеток.
Переносили в кювету с зазором 0.2 см. Параметры электропорации: 25μF, 2.5
kV, 200 Ом. Время импульса – 3-5 миллисекунд. Промывали кювету 500 μl
62
холодной среды LB. Инкубировали 3 часа при 28°С. 100 мкл смеси наносили на
чашки Петри с LB и селективным антибиотиком канамицином (100 мкг/мл).
Инкубировали 2 дня при 28°С.
2.12 Коинфильтрация Nicotiana benthamiana линии 16C
Коинфильтрация тестовых растений Nicotiana benthamiana линии 16C
была произведена по методу [235]. Agrobacterium tumefaciens (штамм С58)
растили на LB среде, содержащей 10 mM MgCl2, 10 μM MES, 100 μM
ацетосирингона до значения 2 при ОД600. Культура инкубировалась ночь при
комнатной температуре. Используя 1-мл шприц без иглы, культура была
инфильтрирована в нижнюю часть листовых пластинок между жилок.
2.13 Общие методы
Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном и ПАА-гелях, выделение
РНК, определение концентрации РНК проводили по стандартным методикам
[234].
63
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Анализ РНК растений с помощью нозерн-блот гибридизации
Для нозерн анализа РНК использовались ткани растений картофеля
(Solanum tuberosum) сорта Тамаша, районированного в Алматинской области
(пос. Чемолган, Чилик и Иссык), и растения томата (Licopersicon esculentum)
сорта Berner-Rose. Растения картофеля были пророщены из клубней. Все
растения были инфицированы PVM или PVY в одно время, на 3-4 неделе, по 3
растения на вариант; в общей сложности по 9 растений картофеля и 3 растения
томата были инфицированы каждым из вирусов. Сбор тканей (2-3 верхняя
кисть) был осуществлен на 28 день после инфицирования. Для анализа были
использованы специфические олигонуклеотиды PVM5GATEs и PVM6GATEs к
PVM (см. таблицу 6), а также олигонуклеотид к HC-Pro PVY в прямой
ориентации. Концентрация каждого олигонуклеотида составляла 10µМ. Целью
данного эксперимента являлся качественный, а не количественный анализ на
присутствие РНК PVM или PVY в растениях. Согласно рисунку 9 четко видно,
что РНК PVM присутствовала даже в контрольном растении картофеля,
которое не было инфицировано вовсе, а также в растении, зараженном только
PVY (рисунок 9, дорожки 1 и 3 соответственно). Напротив, в растениях томата
титр РНК PVM присутствовал только в том варианте, который и был
инфицирован (рисунок 9, дорожка 5). Это свидетельствует, что процент
пораженных PVM растений картофеля в Алматинской области очень высок,
уже на стадии клубней.
1
2
3
4
5
6
Обозначения: 1 - картофель контроль; 2 – картофель, зараженный PVM;
3 – картофель, зараженный PVY; 4 – томат контроль; 5 – томат, зараженный
PVM; 6 – томат, зараженный PVY
Рисунок 9 - Нозерн блот анализ мРНК
64
3.2 Получение очищенного препарата М вируса картофеля
Для изучения круга растений-хозяев, оптимальных для накопления PVM,
использовали растения картофеля Solanum tuberosum (чувствительный к
вирусам сорт Герта), а также растения табака Nicotianа debnеy и дурмана Datura
stramonium.
Наилучшее заражение вирусом наблюдалось на растениях дурмана Datura
stramonium, которые реагировали на заражение появлением точечной
мозаичности и сворачиваемостью вверх листовых пластинок. Наличие и титр
вируса определяли в листьях методом иммуноферментного анализа (ELISA).
Для выделения вируса М использовали метод [92], модифицированный нами
для растений семейства пасленовых.
В результате очистки нами был получен очищенный вирусный препарат
PVM. Показатель чистоты вируса (А260 –А320) / (А280 – А320), во фракции
сахарозного градиента №5 составил 0,9; во фракции №6 – 1,2; во фракции №7 –
0,9. Концентрацию вируса определяли, учитывая, что вирус в концентрации 1
мг/мл дает поглощение 2,8 оптических единиц при 260 нм. Выход М-вируса
составил 20 мкг на 1г листьев.
Электрофоретический анализ препаратов белка оболочки PVM по мере его
очистки приведен на рисунке 10, из которого видно, что очищенные препараты
PVM содержат главный белок с молекулярной массой приблизительно 35 кDа,
который соответствует капсидному белку PVM с известной молекулярной
массой 34700 Da.
Количества анализируемого белка: 1 - 15 мкг; 2 - 20 мкг; 3 - 5 мкг. М маркерные белки, размеры которых указаны слева в килодальтонах.
Электрофорез проводили в 10% полиакриламидном геле с додецилсульфатом
натрия
Рисунок 10 – Электрофорез белков из препаратов М вируса картофеля
различной степени очистки
65
В препаратах наблюдаются также минорные низкомолекулярные пептиды,
представляющие собой контаминанты клеточного происхождения. Таким
образом, чистота препаратов PVM оценивается нами в 95-97%. Из полученного
препарата PVM в дальнейшем выделялась геномная РНК по стандартной
методике с использованием ДС-Na-фенольной депротеинизации [236].
3.3 Кодирующие районы гРНК PVM и возможные способы экспрессии
генов
Компьютерный анализ последовательности геномной РНК PVM
обнаруживает шесть протяженных открытых рамок считывания (ОРС, см.
рисунок 11 и таблицу 5).
Гены представлены в виде прямоугольников, для которых указаны
молекулярные массы кодируемых белков. Гены белков, участвующих в
репликации гРНК PVM, кодируются первой открытой рамкой считывания (ОРС
223К) в виде полипротеина, в котором указаны положения консервативных
белковых доменов: метилтрансферазы (МТ), протеазы (PRO), хеликазы (HEL) и
полимеразы (POL). Гены тройного генного блока (TGB от Triple Gene Block)
обозначены как TGBp1 (ОРС25К), TGBp2 (ОРС12К) и TGBp3 (ОРС7К). Ген
белка оболочки - СР (ОРС34К). Ген белка, богатого цистеином - cys (ОРС11К)
Рисунок 11 – Схематическое изображение геномной РНК
М-вируса картофеля (PVM) и кодируемых ею полипептидов, по данным
Morozov et al., 2003 [105]
5'-Концевая нетранслируемая последовательность имеет длину 75
нуклеотидов. Первая с 5'-конца и наиболее протяженная ОРС кодирует
полипептид длиной 1968 аминокислот и мол. массой 223 кDа (223К-белок
PVМ). Анализ аминокислотной последовательности белка 223К обнаруживает
четкую гомологию с аналогичными белками Потексвирусов: с 165К-белком Хвируса картофеля [237], 147К-белком вируса мозаики белого клевера [238], и
другими, а также тимовирусов: с белками 206К и 205К вирусов мозаики
турнепса [239] и вируса мозаики баклажана [240] соответственно.
В частности, один из гомологичных доменов содержит последовательность
T/SG---T---N, после которой через приблизительно 22 аминокислоты следует
последовательность GDD. Такое сочетание аминокислот является высоко
консервативной и характерной особенностью РНК-репликаз большинства
вирусов растений и животных, содержащих однонитевые плюс-РНК [241].
66
Высокий уровень сродства в GDD домене было обнаружено между белками
репликазы Карлавирусов и 216.5К белком вируса хлоротичной пятнистости
яблонь рода Клостеровирусов [242].
Вторая протяженная ОРС, начиная с 5'-конца проанализированной области
геномной РНК PVM кодирует потенциальный полипептид с мол. массой 24615
(25К-белок). Эта рамка начинается с AUG-кодона в положении 6019 и
заканчивается терминирующим кодоном в положении 6708. 25К белок
содержит небольшой участок последовательности ДНК хеликаз [102], включая
GKS/T последовательность. Эта характерная последовательность повторяется в
белках PVM, присутствуя в том числе, в одном из доменов 223К белка [103].
Сравнение белков репликаз Карлавирусов и Потексвирусов подтверждают
ранее сделанные выводы о сходстве в геномной организации этих 2 групп [99,
243].
Третья ОРС начинается с инициаторного кодона в положении 6686,
заканчивается в положении 7015 и кодирует потенциальный полипептид с мол.
массой 11893 (12К-белок). Четвертая ОРС начинается AUG-кодоном в
положении 7012, заканчивается терминатором в положении 7203 и кодирует
потенциальный белок с мол. массой 6739 (7К-белок). Все вместе эти три белка
(25К, 12К и 7К) составляют так называемый TGB (triple gene block),
ответственный за транспорт вируса из клетки в клетку [105]. Второй и третий
белки в этом триплете (TGBp2 и TGBp3) содержат гидрофобные
последовательности, которые, скорее всего, позволяют этим белкам
взаимодействовать с клеточными мембранами [106, 107]. Предполагают, что
РНК-связывающая активность TGBp1 связана с образованием геномных
рибонуклеопротеидных комплексов, ответственных за транспорт вируса [105].
Пятая ОРС кодирует полипептид размером 304 аминокислоты и мол.
массой 33906. Эта ОРС начинается с AUG-кодона в положении 7225 и
заканчивается терминирующим кодоном в положении 8139 (34К-белок).
Кодирует белок оболочки М-вируса картофеля [84].
Шестая ОРС (положения 8136-8462) кодирует белок с мол. массой 10948
(11К-белок), обладающий РНК-связывающей активностью и содержащий
металло-связывающий участок, способный формировать структуру т.н. «Znпалец» («Zn-finger») [244]. Подобные последовательности найдены и в геномах
других фитовирусов [245], особенно у Тобравирусов [246, 247].
Функциональная роль подобных белков неясна. Можно предположить, что они
участвуют в начальном этапе сборки вирусных частиц и/или вовлечены в
процесс репликации вирусной РНК [84, 248].
3'-концевой нетранслируемый район имеет длину 70 нуклеотидов и
следующую за ним поли(А)-последовательность длиной 120-150 нуклеотидов
[249]. Еще одна, седьмая, ОРС, кодирующая потенциальный белок с мол,
массой 6952 (7К-белок), имеется внутри гена 34К-белка (положения 7264—
7464). Аналогичные ОРС, кодирующие небольшие потенциальные белки, были
обнаружены также и внутри генов белков оболочки нескольких Потексвирусов
[250].
67
Таблица 5 - Расположение открытых рамок считывания по геному и размеры
кодируемых белков
Обозначение Наименование
протеина
протеина
ОРС 1
ОРС 2
ОРС 3
ОРС 4
ОРС 5
ОРС 6
доп. ОРС7*
Полипротеин
25К (TGBp1)
12К (TGBp2)
7К (TGBp3)
34К (СР)
11К (cys)
7К*
Начало,
№
нуклеотида
74
6019
6686
7012
7225
8136
7262
Конец,
№
нуклеотида
5980
6708
7015
7203
8139
8462
7462
Длина
(аминокислот)
1968
229
109
63
304
108
66
Экспериментами ряда исследований последних лет (Chiba et al., 2006
[251]), наиболее вероятным кандидатом на роль супрессора клеточного
механизма РНК-интерференции (RNAi) является именно последний, цистеинбогатый белок PVM - 11К (cys) (Lukhovitskaya et al., 2005 [252]), а также TGBp1
(Morozov et al., 2003 [105]) и TGBp2 (Seppänen et al., 1997 [253]).
Задачей нашей дальнейшей работы явилась проверка супрессорной
активности всех белков M вируса картофеля.
Как было отмечено выше, структура и локализация гомологичных генов в
3'-концевых областях геномных РНК PVM и Потексвирусов очень схожи. Это
сходство дает основание предположить, что механизм экспрессии 3'проксимальных
цистронов
Карлавирусов
аналогичен
таковому
у
Потексвирусов. Действительно, вирус-специфические субгеномные РНК были
найдены в препаратах, полученных из растений, зараженных рядом
Потексвирусов [254] и протопластов, зараженных PVM [96].
Используя бесклеточную белоксинтезирующую систему, было показано,
что примерно 5—10% рибосом не диссоциируют с матрицы при достижении
терминирующего кодона 5'-проксимального гена, а реинициируют трансляцию
следующего цистрона [255]. Следует отметить, что для Каулимовирусов,
использующих такой механизм экспрессии генов, частичное перекрывание
терминирующего и инициирующею кодонов является весьма типичным [256].
Возможно, что таким путем экспрессируются только те вирусные гены,
продукты которых при развитии инфекции требуются в небольших
количествах. Исходя из этого, можно предположить, что продукты генов,
кодирующих TGBp2, TGBp3 и 11К белок, необходимы в количествах, меньших,
чем продукты генов TGBp1 и белка оболочки.
Таким образом, Gramstat et al. (1990, 1994), Brattey et al. (2002) высказали
мнение, что имеются, по крайней мере, две субгеномные РНК PVM. При этом
TGBp2 и TGBp3 синтезируются на субгеномной РНК TGBp1, а 11K-белок - на
субгеномной РНК белка оболочки, используя механизм реинициации
68
трансляции [257, 96, 258]. Morozov et al. полагал, что для трансляции трех
белков TGB нужны две субгеномные РНК: более длинная служит матрицей для
трансляции TGBp1, а короткая – для TGBp2 и TGBp3 [105].
3.4 Выделение геномной РНК PVM
Из полученных очищенных препаратов вируса PVM выделяли гРНК по
стандартной методике с использованием ДС-Na и фенольной депротеинизации
смесью фенола и хлороформа (1:1) с предварительной диссоциацией капсидных
белков при помощи мягкой обработки вирусных частиц в 1% ДС-Na [91]. Для
проверки качества выделенных препаратов вирусных мРНК проводили их
электрофорез в 1% агарозном геле (рисунок 12).
Из рисунка 12 (дорожка 1) следует, что нами выделены полноразмерная
геномная РНК, длина которой составляет 8535 нт для PVM. В последующем
полученные полноразмерные геномные РНК были использованы в реакции
обратной транскрипции для синтеза необходимых вирус-специфических кДНК
фрагментов, а фрагментированная РНК PVM (рисунок 12 дорожка 2)
использовалась для трансляции in vitro в бесклеточной системе из зародышей
пшеницы.
М - маркерные ДНК, размеры которых приведены в нуклеотидах справа.
1 - РНК, выделенная из осадка после центрифугирования вируса через
слой 20% сахарозы;
2 - РНК, выделенная из вируса и его фрагментов, содержащихся в слое
20% сахарозы
Рисунок 12 – Электрофорез в 1% агарозном геле геномной РНК
М-вируса картофеля
69
Как видно из рисунка 12, РНК, выделенная из осадка вирусных частиц
после центрифугирования через слой 20% сахарозы (как описано в разделе 2.1)
является полноразмерной. В тоже время, РНК, выделенная из слоя 20%
сахарозы содержит значительной количество мелких фрагментов (вплоть до
700 нуклеотидов), что свидетельствует о существенной фрагментированности
вирионов, содержащихся в этом слое.
3.5 Получение бесклеточной системы из зародышей пшеницы и
трансляция РНК PVM
Покоящиеся зародыши пшеницы (5 г) гомогенизировали в 15мл буфера
содержащего: 10 мМ Трис-НCl рН7,6; 50 мМ КСl; 3 мМ MgCl2; 8 мМ 2-МЭТ;
5% глицерина. Гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 8000 g.
Надосадочную жидкость повторно центрифугировали в течение 20 мин при
23000 g, осторожно отсасывали верхние 2/3 объема и наносили на колонку с
сефадексом G-25, уравновешенную тем же буфером. Цитоплазматический
экстракт собирали в объеме исключения, инкубировали на ледяной бане в
течение 15 мин и центрифугировали 15 мин при 23000 g. Надосадочную
жидкость отсасывали и использовали для синтеза белка в условиях in vitro.
Реакционная смесь в 25 мкл содержала: 20 мМ Трис-HCl рН 7,6; 100 мМ
КСl; 2,5 мМ MgCl2; 10 мМ креатинфосфат; 2,5 мкг креатинфосфокиназы; 1 мМ
АТФ; 0,1 мМ ГТФ; 0,1 мМ спермин; 10мкг тРНК Е. coli; 80 мкМ смеси
аминокислот без метионина; 200 кБк [35S]метионина; 0,3-0,5 о.е. А280
цитоплазматического экстракта, 2-4 мкг мРНК PVM, анализ которой приведен
на рисунке 11 (дорожка 2). Трансляцию проводили в течение 1час при 26 оС.
Для регистрации новосинтезированных вирусных полипептидов продукты
реакции трансляции подвергали электрофорезу в ПАА-геле с ДС-Na, затем гели
высушивали и проводили авторадиографию на рентгеновской пленке РМ-В
(рисунок 13).
Как видно из рисунка 13, новосинтезированные продукты трансляции
геномных вирусных РНК содержат многие вирус-специфические полипептиды,
включая капсидные белки оболочки с молекулярными массами 35700 Dа для
PVM и 30500 Da для PVY.
В некоторых случаях по окончании времени инкубации к смеси добавляли
избыток 5% трихлоруксусной кислоты, инкубировали 15 мин при 96оС и
наносили на стекловолокнистые фильтры GFC (“Миллипор”). Радиоактивность
фильтров определяется на счетчике фирмы «Beckman» в толуольном
сцинтилляторе.
70
Электрофорез проводили в 10% полиакриламидном геле
додецилсульфатом натрия. Цифрами указаны размеры полипептидов в кDа
с
Рисунок 13 – Радиоавтограмма полипептидов, меченых [35S]метионином в
результате трансляции геномной РНК PVM в бесклеточной системе из
зародышей пшеницы
3.6 Амплификация целевых кДНК-фрагментов гРНК PVM
Для того чтобы амплифицировать целевые фрагменты гРНК PVM с
помощью РОТ-ПЦР необходимо использовать пары специфических
олигонуклеотидных праймеров.
Прямые и обратные олигонуклеотидные праймеры, использованные для
создания плазмидных конструкций, указаны в Таблице 6:
Таблица 6 - Олигонуклеотидные праймеры, использованные для амплификации
открытых рамок считывания гРНК PVM
ОРС
ОРС1
(223К)
ОРС2 (25К)
TGBp1
ОРС3 (12К)
TGBp2
ОРС4 (7К)
TGBp3
ОРС5 (34К)
СР
ОРС6 (11К)
CYS
Праймер
PVM1GATEs
PVM1GATEas
PVM2GATEs
PVM2GATEas
PVM3GATEs
PVM3GATEas
PVM4GATEs
PVM4GATEas
PVM5GATEs
PVM5GATEas
PVM6GATEs
PVM6GATEas
Последовательность
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatggcagtcacatacagaacg
ggggaccactttgtaacaagaaagctgggtcttaaagcacttcaaatacttg
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatggatgtgattgtagatttg
ggggaccactttgtaacaagaaagctgggtctcaggcggcggtgtaagtgg
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatgccacttacaccgccgcc
ggggaccactttgtaacaagaaagctgggtctcatgtgtgtgagcccgcac
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatgatagtgtatgtacttgtag
ggggaccactttgtaacaagaaagctgggtcttatgacctaaaggaaccacac
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatgggagattcaacgaagaaag
ggggaccactttgtaacaagaaagctgggtctcattttctattagactttacat
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatgaaggacgtaaccaaggtggctt
ggggaccactttgtaacaagaaagctgggtcctactctcgcttgttgatgac
71
Была проведена амплификация кДНК, соответствующих ОРС 25К, 12К и
7К, которые составляют тройной генный блок и обозначаются также как
TGBp1, TGBp2 и TGBp3 соответственно, а также белок оболочки и 11К белок.
Известно, что вирусные белки, кодируемые первыми тремя генами, принимают
участие в распространении вируса между соседними клетками, а также на
большие расстояния внутри растения-хозяина [105, 259].
Для удобства клонирования праймеры содержали на концах короткие
последовательности, необходимые для дальнейшего встраивания в плазмидный
вектор и клонирования в бактериях.
С выделенным и очищенным препаратом гРНК PVM с помощью
«обратных» праймеров была проведена реакция обратной транскрипции (РОТ)
и получены кДНК-фрагменты (рисунок 14), которые использовались в
дальнейшем для проведения полимеразной цепной реакций (ПЦР).
А
Б
А - Амплификация фрагментов генома PVM, кодирующих белки 25К, 12К
и 7К.
1 – маркеры, 2 – отрицательный контроль реакции, 3 – ПЦР-продукт для
TGBp1, 4 – ПЦР-продукт для TGBp2, 5 – ПЦР-продукт для TGBp3. Цифрами
указаны размеры фрагментов в нуклеотидах.
Б - Амплификация фрагментов генома PVM, кодирующих белки 34К (CP)
и 11К(cys).
1 и 2 – ПЦР-продукт с ОРС34К; 3 – маркеры; 4 и 5 – ПЦР-продукт с
ОРС11К. Цифрами справа указаны размеры фрагментов маркеров в
нуклеотидах
Рисунок 14 – Результаты электрофореза продуктов обратной транскрипции
и сопряженной полимеразной цепной реакции с участием гРНК PVM и
специфических праймеров
72
3.7 Клонирование амплифицированных кДНК-фрагментов гРНК
PVM в бактериальном векторе с использованием Gateway-технологии
Бактериальный вектор pDONR207 (рисунок 15, часть А), применяющийся
в Gateway технологии [260, 261] имеет в своем составе специфические
последовательности, т.н. attP1 и attP2, которые рекомбинируют с районами
attB1 и attB2, находящимся соответственно на 5'- и 3'-концах всех
амплифицированных нами кДНК-фрагментов гРНК PVM.
А
Б
А - промежуточный вектор pENTR207;
Б - вектор назначения pMDC32
Рисунок 15 – Векторы Gateway технологии
Все олигонуклеотидные праймеры несли на своем 5'-конце
последовательность ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatg, которая формирует
attB1-сайт. На 3'-конце все праймеры содержали последовательность
ggggaccactttgtaacaagaaagctgggtc, которая формирует attB2-сайт (таблица 6).
В результате BP-реакции при участии ферментов BP Clonase происходит
рекомбинация attB1 и attB2 (в составе ПЦР-продукта) соответственно с attP1 и
attP2 (в составе вектора) с переходом ПЦР-продукта в состав вектора и с
изменением рекомбинировавших фланговых последовательностей на attL1 и
attL2 соответственно (рисунок 16). Таким образом, были получены
промежуточные векторы pENTR207, несущие в своем составе вставки
амплифицированных кДНК-фрагментов гРНК PVM (т.н. «Entry-векторы»).
73
Треугольниками обозначены сайты рекомбинации. Целевой кДНКфрагмент гРНК PVM обозначен как “gene”; “Donor” - донорный вектор
pDONR207; “Entry Clone” –промежуточный вектор pENTR207 со вставкой
целевого кДНК-фрагмента гРНК PVM
Рисунок 16 – Схема клонирования с использованием Gateway технологии
с участием ферментов рекомбинации BP Clonase,
по данным Hartley et al., 2000 [260]
Общеизвестно, что метод трансформации компетентных клеток бактерий
Escherichia coli штамма DH5α с использованием теплового шока позволяет
наработать рекомбинантную ДНК в достаточно больших количествах, чтобы
далее манипулировать ею при помощи методов рестрикции и лигирования.
Оценка результатов в каждом конкретном эксперименте позволяла достаточно
полно контролировать ход и эффективность трансформации (фаза роста клеток,
частота, доля компетентных клеток). Анализ выращенных колоний бактерий
проводился методами рестрикции и ПЦР.
3.8 Клонирование амплифицированных кДНК-фрагментов с ОРС
гРНК PVM в растительном векторе с использованием Gateway-технологии
Целевые кДНК-фрагменты гРНК PVM, клонированные в состав Entryвектора pENTR207, имеют на своих 5'- и 3'-концах специфические
последовательности, т.н. attL1 и attL2, образовавшиеся в результате BPрекомбинации (рисунок 17). Таким образом амплифицированные фрагменты
могут быть переклонированы в Destination-вектор pMDC32 (рисунок 15, часть
Б).
Для этого проводилась реакция рекомбинации между Entry-вектором
pENTR207 и Destination-вектором pMDC32 в присутствии комплекса
ферментов LR-Clonase, включающего белки рекомбинации (Int, IHF, Xis). В
результате рекомбинации между участками attL Entry-вектора pENTR207 и
участками attR Destination-вектора pMDC32, целевые фрагменты гРНК PVM
были перенесены в составе Destination-вектора pMDC32 под контролем
двойного 35S-промотора.
74
Треугольниками обозначены сайты рекомбинации; целевой фрагмент
гРНК PVM обозначен “gene”; “Entry Clone” – промежуточный вектор
pENTR207; “Expression Clone” –вектор назначения pMDC32 с целевым
фрагментом гРНК PVM в составе
Рисунок 17 – Схема клонирования с использованием Gateway технологии
с участием ферментов рекомбинации LR Clonase, по данным Hartley et al., 2000
[260]
Реакция рестрикции по уникальным сайтам проводилась по стандартной
методике. Были подобраны оптимальные условия реакции для каждого
фрагмента гРНК PVM. Так как каждая рестриктирующая эндонуклеаза (SacI,
KpnI) лучше всего функционировала в разных по ионному составу буферных
системах, был подобран оптимальный буфер для обеих рестриктаз – Tangoбуфер. При двукратном значении этой буферной системы, активность обеих
рестриктирующих эндонуклеаз составляла около 50%. Анализ результатов
рестрикции проводили в 1% агарозном геле (рисунок 18).
Таким образом, необходимый фрагмент гРНК PVM встраивался в
векторную кассету с двойным 35S-промотором, nos-терминатором и геном
устойчивости к селективному антибиотику. Амплифицированные фрагменты,
TGBp1, TGBp2, TGBp3, ОРС34К и ОРС11К были клонированы сначала в
вектор pDONR207. В качестве селективного антибиотика использовался
гентамицин. Клонирование происходило по рекомбинационным сайтам attP и
attB, с помощью комплекса ферментов BP-клоназы. Далее, с использованием
реакции LR-рекомбинации целевые фрагменты гРНК PVM были клонированы в
вектор назначения pMDC32 под контролем двойного 35S промотора вируса
мозаики цветной капусты (CaMV). В качестве селективного антибиотика
использовался канамицин.
Таким образом, все амплифицированные фрагменты гРНК PVM были
клонированы сначала в бактериальных, а затем и в растительных векторах.
75
1 – маркер; 2 и 3 – вектор pMDC32 cо вставкой ОРС34К, обработанный
рестриктазами SacI и KpnI; 4 – отрицательный контроль.
Рисунок 18 – Электрофорез в 1% агарозном геле фрагментов ДНК,
образующихся после обработки рестриктазами SacI и KpnI
рекомбинантного вектора pMDC32 cо вставкой ОРС34К,
кодирующей капсидный белок (СР) PVM
3.9 Идентификация супрессоров РНК-интерференции методом
коинфильтрации растений Nicotiana benthamiana
Для определения супрессорной активности каждого из этих белков был
применен метод агроинфильтрации, модифицированный в лаборатории
профессора Томаса Хона (Th.Hohn, Botanical Institute, Basel, Switzerland). Для
этого каждый агробактериальный штамм, трансформированный различными
генами PVM, от ОРС2 до ОРС6, был смешан со штаммом, несущим только 35SdsGFP (GFP-IR), и инфильтрирован в листья N. benthamiana линии 16С. В
качестве отрицательного контроля были использованы компетентные
(нетрансформированные) клетки А. tumefaciens. В качестве положительного
контроля были использованы конструкции, содержащие гены HC-Pro Y вируса
картофеля и P19 вируса кустистости и остановки роста томата (TBSV),
известные как явные супрессоры РНК-интерференции [184, 262].
Растения N. benthamiana трансгенной линии, экспрессирующие GFP
(линия 16C), демонстрируют сильный зеленый флюоресцирующий сигнал под
ультрафиолетовым светом. При агроинфильтрации листьев 6-7-недельных
растений N. benthamiana линии 16C агробактериальными штаммами, несущими
35S-GFP или 35S-dsGFP конструкции, инфильтрированные ткани, при осмотре
спустя неделю под ультрафиолетовым излучением, изменяют цвет на красный.
Исчезновение зеленого цвета свидетельствует о сокращении уровня экспрессии
GFP или, другими словами, указывает на индукцию RNAi против GFP-гена.
76
Экспрессия GFP достигала высокого уровня во всех инфильтрованных
листьях на 5-7 день после инфильтрации (д.п.и.) (рисунок 19). Интенсивность
зеленого свечения оставалась сильной в листьях, инфильтрованных
конструкциями с ОРС3 (TGBp2, 12К) и ОРС5 (СР, 34К), даже спустя 9-12 д.п.и.,
и была сравнима с таковой у эталонных растений, инфильтрированных генами
HC-Pro PVY и P19 TBSV. Интенсивность свечения GFP в листьях,
инфильтрованных ОРС2 (TGBp1, 25К) и ОРС6 (CYS, 11К), в тот же период
также наблюдалась, но была не такой сильной, как в случае ОРС3 и ОРС5.
В растениях, инфильтрованных конструкцией с ОРС4 (TGBp3, 7К),
интенсивность зеленого свечения снижалась уже к 3-му д.п.и. и полностью
пропадала к 5-му д.п.и.. Как показано другими исследованиями ранее,
исчезновение GFP-флюоресценции является результатом RNAi [185].
Для каждого варианта использовалось от 4 до 5 растений N. benthamiana.
Эксперимент был повторен в трех независимых экспериментах.
Обозначения фотографий: 1 – HC-Pro PVY; 2 – P19 TBSV; 3 – ОРС2 PVM
(TGBp1, 25К); 4 – ОРС3 PVM (TGBp2, 12К); 5 – ОРС4 PVM (TGBp3, 7К);
6 – ОРС5 (CP, 34К); 7 – ОРС6 (CYS, 11К)
Рисунок 19 - Эффект подавления РНК-интерференции в клетках табака
Nicotiana benthamiana (линии 16С), вызываемого экспрессией
различных вирусных генов
Таким образом, нами впервые идентифицированы белки PVM, способные
наиболее эффективно супрессировать процесс РНК-интерференции клеток
растения-хозяина: TGBp2 (12К, кодируемый ОРС3); и белок оболочки СР (34К,
кодируемый ОРС5). Описанные ранее в литературе, белок TGBp1 (25К,
кодируемый ОРС2) и цистеин богатый белок CYS (11К, кодируемый ОРС6)
проявили свойства супрессоров, но в значительно меньшей степени.
77
TGBp2 является вторым белком в тройном блоке генов (TGB), который
отвечает за транспорт вируса из клетки в клетку. Это соотносится с данными о
его аналоге у представителя Потексвирусов – PVX, у которого один белок в
TGB (TGB1) также является супрессором сайленсинга [225]. Мутации,
произведенные с последовательностью TGB1 PVX для удаления его
супрессорной активности, также ингибировали транспорт вируса из клетки в
клетку [188]. Это свидетельствует, что супрессия сайленсинга крайне важна для
транспорта вируса через плазмодесму. По данным группы Zamyatnin (2004),
TGB2 и TGB3 верхушечного вируса картофеля (PMTV) были необходимы для
транспорта TGB1 к плазмодесмам и через них [263]. Кроме того, белок HC-Pro
Потивирусов, являющийся супрессором сайленсинга (см. раздел 1.3.7.1), среди
многих других функций (вовлечение в процесс амплификации вирусного
генома [264], участие в передаче вируса вектором-тлей [265]) выполняет также
и транспортную роль между клетками и по всему растению [186].
Кроме того, есть данные, что вирусный белок оболочки, кроме функции
защиты вирусного генома от инактивации, также необходим для транспорта
вируса из клетки в клетку [266, 267]. CP многих вирусов рода Sobemovirus
также выполняет, кроме своей структурной функции, еще и транспортную
роль, и взаимодействует с белком P1, известным супрессором сайленсинга [268,
269]. В то же время было показано, что CP вируса мозаики ежи сборной (CfMV)
этого же семейства сам действовал как супрессор RNAi и не участвовал ни в
дальнем транспорте, ни в проникновении вируса из клетки в клетку [270].
Белки оболочки некоторых вирусов могут являться очень сильными
супрессорами сайленсинга, как, например, CP вируса морщинистости репы
(TCV). Он подавляет как локальный PTGS, так и системный, в прямой форме
(sense), обратной (antisense) и двухцепочечной (double-stranded) [204].
3.10 Получение трансгенных растений картофеля, содержащих в
геноме кодирующие последовательности генов белка 12К и белка оболочки
PVM
После выделения геномной РНК М-вируса картофеля была проведена
реакция обратной транскрипции (РОТ) и сопряженной полимеразной реакции
(ПЦР) с использованием олигонуклеотидов 03s-s и 03s-as для амплификации
кДНК-фрагмента, содержащего смысловую копию ОРС12К, а также с
олигонуклеотидами 03as-s и 03as-as для амплификации антисмысловой копии
фрагмента ОРС12К. Аналогично этому олигонуклеотиды 05s-s и 05s-as были
использованы для
амплификации смысловой копии
ОРС34К, а
олигонуклеотиды 05as-s и 05as-as - для амплификации антисмысловой копии
кДНК-фрагмента, содержащего кодирующую область ОРС34К PVM (таблица
7).
78
Таблица 7 - Олигонуклеотидные праймеры, использованные для амплификации
открытых рамок считывания гРНК PVM в смысловом и антисмысловом
направлении
ОРС
ОРС12К
Копия
смысловая
антисмысловая
смысловая
ОРС34К
антисмысловая
Праймер
03s-s
03s-as
03as-s
03as-as
05s-s
05s-as
05as-s
05as-as
Последовательность
gcacatctagagtcctgatgccacttaca
cgctggatcctacaagtacatacactat
tacaagtcgacacactatcatgtgtgtg
cgaagagctctgcacatcttgtgtcctg
gaacgacccgggaaattcgagctcg
tacaagatctctagtgcgctccggacca
tacatgtcgactagtgcgctccggaccat
gaacgacccgggaaattcgagctcgtgag
Далее для клонирования смысловой копии фрагмента кодирующей
последовательности одного из двух генов М-вируса картофеля (ОРС12К либо
ОРС34К) был использован плазмидный вектор pUC19, содержащий интрон I
гена каталазы 1 (cat1 Ricinus communis), необходимый для создания конечной
ДНК-конструкции. В данную плазмиду по сайтам рестрикции XbaI и BamHI
вставляли фрагмент, амплифицированный нами с помощью пар
олигонуклеотидов 03s-s и 03s-as, а также 05s-s и 05s-as. После анализа клонов с
помощью ПЦР, а также рестрикционного анализа была отобрана плазмидная
ДНК, в которой смысловой фрагмент гРНК PVM расположен на 3'-конце от
35S-промотора вируса мозаики цветной капусты.
В результате клонирования этого фрагмента была создана рекомбинантная
ДНК, содержащая в своем составе следующие компоненты:
35S-промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV); смысловую копию
фрагмента гРНК PVM; растительный интрон и nos-терминатор.
На следующем этапе клонирования в созданную нами ДНК-конструкцию,
несущую все указанные выше компоненты, между сайтами рестрикции SstI и
SalI вставляли ПЦР-продукт, амплифицированный с помощью праймеров 03ass и 03as-as, а также 05as-s и 05as-as, и несущий антисмысловую копию
фрагмента кодирующей области гРНК PVM. В конечном итоге нами была
получена плазмидная ДНК, содержащая в своем составе полную кассету [35Sпромотор CaMV]-[смысловая копия фрагмента гРНК PVM]-[растительный
интрон]-[антисмысловая копия фрагмента гРНК PVM]-[nos-терминатор],
представленную в схематичном виде на рисунке 20.
79
HindIII
35S-про
XbaI
BamHI
сенс ОРС PVM
SalI
интрон
антисенс ОРС PVM
SacI
EcoRI
nos-тер
Рекомбинантный агробактериальный вектор в пределах Т-ДНК содержит
следующие регуляторные элементы (стрелкой указано направление
транскрипции): «35S-про» – промотор вируса мозаики цветной капусты; «nosтер» – терминатор транскрипции гена нопалинсинтетазы; «интрон» – интрон
гена каталазы из Ricinus communis; «сенс ОРС PVM» – последовательность
геномной РНК PVM, кодирующая фрагмент ОРС PVM в смысловой
ориентации; «антисенс ОРС PVM» – последовательность геномной РНК PVM,
кодирующая фрагмент ОРС PVM в антисмысловой ориентации
Рисунок 20 – Схематичное представление рекомбинантной конструкции,
созданной в результате клонирования смыслового и антисмыслового
фрагментов ОРС PVM в плазмидные вектора
В дальнейшем, полученную кассету переклонировали по сайтам
рестрикции HindIII и EcoRI в состав бинарного агробактериального вектора
pCambia2300. При этом из данного вектора удаляли фрагмент HindIII-EcoRI и
вместо него вставляли собранную нами кассету регуляторных элементов, схема
которой приведена на рисунке 20.
В результате были получены агробактериальные плазмиды, содержащие
смысловые и антисмысловые вставки гРНК PVM. Эти конструкции имели все
необходимое для репликации и селекции плазмидной ДНК в клетках бактерий.
Присутствие клонированных фрагментов геномной РНК М-вируса картофеля
проверяли методом ПЦР и рестрикционным анализом (рисунок 21), а
ориентацию подтверждали секвенированием.
Как видно на рисунке 21 (А), в результате обработки рестриктазами HindIII
и EcoRI плазмидного вектора, несущего фрагменты генома PVM ОРС12К в
прямой и обратной ориентации, образуется фрагмент величиной около 2100
нуклеотидов, как и ожидалось. Т.е. вся рекомбинантная конструкция,
включающая 35S-промотор, 2 последовательности ОРС12К в прямой и
обратной последовательности, интрон и nos-терминатор. Аналогичным образом
был проверен плазмидный вектор, несущий фрагменты генома PVM ОРС34К в
прямой и обратной ориентации. На рисунке 21 (Б) можно наблюдать
фрагменты, соответствующие ОРС34К геномной РНК PVM, образующиеся
после обработки рестриктазами SmaI и HindIII (для фрагмента прямой
ориентации) и SalI и SacI (для фрагмента обратной ориентации).
80
А
Б
А – Результаты рестрикционного анализа плазмидного вектора, несущего
фрагменты генома PVM ОРС12К в прямой и обратной ориентации.
1 – маркеры, 2 и 3 – клоны, обработанные HindIII и EcoRI. Цифрами слева
указаны размеры фрагментов в нуклеотидах.
Б - Результаты рестрикционного анализа плазмидного вектора, несущего
фрагменты генома PVM ОРС34К в прямой и обратной ориентации.
1 – маркер; 2 – вектор, обработанный SmaI и HindIII; 3 – вектор,
обработанный SalI и SacI. Цифрами слева указаны размеры фрагментов
маркеров в нуклеотидах
Рисунок 21 – Электрофорез в 1% агарозном геле фрагментов ДНК,
образующихся после обработки рестриктазами рекомбинантных векторов cо
вставками ОРС12К и ОРС34К, в прямой и обратной последовательности
Полученные рекомбинантные вектора вводили в штамм Agrobacterium
tumefaciens EHA 105 методом электропорации. Отбор трансформированных
клеток проводили на селективной среде с канамицином 100 мкг/л. Выросшие на
селективной среде колонии агробактерий использовали для дальнейшей
трансформации растений.
Созданные нами штаммы агробактерий использовали для трансформации
сегментов междоузлий пробирочных растений картофеля сорта «Тамаша».
Через 8-10 недель регенерации эксплантов на селективных средах были
получены пробирочные растения (рисунок 22).
81
Рисунок 22 – Каллусогенез (слева) и пробирочные трансгенные растения
картофеля (справа)
Из листьев растений выделяли тотальные препараты ДНК, которые
анализировали методом ПЦР на присутствие клонированных нами
последовательностей.
Реакцию
проводили
с
участием
праймеров,
специфически подобранных для синтеза тех или иных вирусных участков
геномных РНК МВК. Результаты анализа приведены на рисунке 23.
1 и 9 – маркер; 2-7 – ПЦР продукт с праймерами к фрагменту ОРС12К
прямой ориентации; 8 – положительный контроль; 10-15 – ПЦР продукт с
праймерами к фрагменту ОРС12К обратной ориентации; 16 – положительный
контроль
Рисунок 23 – Электрофорез в 1% агарозном геле фрагментов ДНК,
амплифицируемых в результате ПЦР тотального препарата ДНК из
трансформированных растений картофеля
82
Присутствие на электрофореграммах амплифицированных фрагментов,
размеры которых полностью соответствуют ожидаемым величинам, позволило
идентифицировать несколько трансгенных линий картофеля.
83
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проделанной работы получен очищенный препарат вируса
PVM и выделена полноразмерная геномная РНК этого вируса с целью
амплифицировать и клонировать многие фрагменты вирусного генома в состав
рекомбинантных векторных ДНК. В ходе проведения компьютерного анализа
нуклеотидной последовательности геномной РНК PVM получены данные об
общей структурной организации генома карлавирусов и выдвинуто
предположение о возможной функциональной роли некоторых белков,
кодируемых геномом PVM. В результате трансляции гРНК PVM in vitro в
бесклеточной системе пшеницы были идентифицированы вирус-специфические
полипептиды.
С помощью РОТ и ПЦР амплифицированы кДНК-фрагменты гРНК PVM,
кодирующие транспортные белки тройного блока TGBp1 (25К, ОРС2), TGBp2
(12К, ОРС3) и TGBp3 (7К, ОРС4), белок оболочки вируса (СР, 34К, ОРС5), а
также цистеин-богатый белок (11К, CYS, ОРС6).
Все амплифицированные целевые кДНК-фрагменты вирусного генома
клонированы в составе рекомбинантных векторов. С использованием
технологии BP и LR реакций целевые фрагменты гРНК PVM были перенесены
в состав вектора pMDC32 под контроль двойного 35S-промотора вируса
мозаики цветной капусты (CaMV) с последующим терминатором
транскрипции. Корректность клонирования после каждого этапа была
проверена рестрикционным и ПЦР анализом, а также секвенированием.
Налажена трансформация клеток Agrobacterium tumefaciens штамма C58
методом их электропорации и инкубации в присутствии рекомбинантных
генетических конструкций. С отобранными клонами агробактерий проведена
коинфильтрация индикаторных растений табака Nicotiana benthamiana линии
16С. Впервые идентифицированы как сильные супрессоры РНК-интерференции
белки PVM, кодируемые ОРС3 (12К-протеин) и ОРС5 (белок оболочки), а
также, в меньшей степени, ОРС2 (25К-протеин) и ОРС6 (11К-протеин).
Созданы ДНК-конструкции, несущие в прямой и обратной ориентациях
ОРС гРНК PVM, кодирующие установленные белки – супрессоры РНКи (ОРС3
и ОРС5).
Создание таких конструкций позволило получить трансгенные растения
картофеля с генетически закрепленной способностью индуцировать в клетках
процесс РНК-интерференции против PVM, а также сходных по строению
вирусов PVS и PVX.
Генная инженерия с использованием как транс-, так и цис-генов,
предлагает
один
из
самых
перспективных
путей
увеличения
продовольственных ресурсов – применение методов современной
биотехнологии, возникшей на стыке ряда фундаментальных научных
направлений и представляющей собой мощную производительную силу,
способную в значительной степени решить проблему продовольственного
обеспечения людей.
84
По результатам диссертационной работы сделаны следующие выводы:
1. Впервые проведено систематическое исследование способности многих
белков М-вируса картофеля подавлять процесс РНК-интерференции в
инфицированных клетках растений семейства Solanaceae.
Для этого кДНК-фрагменты гРНК PVM, содержащие ОРС2 (25К), ОРС3
(12К), ОРС4 (7К), ОРС5 (34К) и ОРС6 (11К) клонированы в растительном
экспрессионном векторе pMDC32 под контролем 35S промотора CaMV и nosтерминатора транскрипции, и каждая конструкция была трансфецирована в
клетки Agrobacterium tumefaciens штамма C58.
2. Методом коинфильтрации с агробактериями каждая из клонированных
ОРС была экспрессирована в индикаторных растениях Nicotiana benthamiana
(линии 16С), что позволило впервые идентифицировать белки PVM, наиболее
интенсивно супрессирующие РНК-интерференцию:
- 12К-протеин (TGBp2, кодируемый ОРС3); и
- 34К-протеин (СР, кодируемый ОРС5).
Значительно меньшую супрессорную активность проявляют 25К-протеин
(TGBp1, кодируемый ОРС2) и 11К-протеин (CYS-белок, кодируемый ОРС6), а
белок, кодируемый ОРС4 (7К-протеин или TGBp3), супрессорной активности
не имеет.
3. Впервые созданы экспрессируемые в растениях конструкции, в которых
кДНК-гены PVM, кодирующие установленные белки-супрессоры RNAi (12К и
34К), клонированы в прямой и обратной ориентации для индукции у
трансгенных растений картофеля процесса RNAi против гРНК PVM и других
родственных вирусов.
4. Получены трансгенные растения картофеля, содержащие в геноме
последовательности генов PVM, кодирующих белки TGBp2 (12К) и белка
оболочки (34К) в смысловой и антисмысловой ориентации.
Теоретические результаты, а также клонированные кДНК-фрагменты
гРНК PVM и рекомбинантные конструкции, созданные на их основе, могут
найти применение в генной инженерии и биотехнологии растений для создания
новых исходных линий картофеля с генетически закрепленной устойчивостью
к PVM. Эти линии можно использовать для получения гибридов и выведения
новых сортов растений семейства Solanaceae с полной устойчивостью к М-, Sи Х- вирусам.
85
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1 Baulcombe D. RNA silencing in plants // Nature.-2004.-Vol. 431.-P. 356-363.
2 Voinnet O. Post-transcriptional RNA silencing in plant-microbe interactions: a
touch of robustness and versatility // Current Opinion in Plant Biology.-2008.-Vol.11,
№4.-P.464-470.
3 Ruiz-Ferrer V., Voinnet O. Roles of plant small RNAs in biotic stress
responses // Annual Review of Plant Biology.-2009.-Vol. 60.-P. 485-510.
4 Alvarado V., Scholthof H.B. Plant responses against invasive nucleic acids:
RNA silencing and its suppression by plant viral pathogens // Seminars in Cell and
Developmental Biology.-2009.-Vol.20,№9.-P.1032-1040.
5 Омаров Р.Т., Берсимбай Р.И. Биохимические механизмы супрессии РНКинтерференции вирусами растений // Биохимия.-2010.-Т.75,вып.8.-С. 10621069.
6 Белоконев О. Нобелевские премии 2006 года. Заглушки для РНК // Наука
и жизнь.-2006.-Т.11.-С.13-14.
7 Жизнь растений, под ред. Тахтаджяна А.Л.-М.: Просвещение, 1974.-6
томов.
8 Барабанов Е.И. Ботаника: учебник для студентов высших учебных
заведений.-М: Академия, 2006.-448С.
9 Бабаев С.А., Токбергенова Ж.А., Амренов Б.Р. Пути повышения качества
семенного картофеля в Казахстане // Генетические и агротехнологические
ресурсы повышения качества продовольственного и технического картофеля:
материалы III научно-практической конференции.-М.,2013.-С.4-6.
10 Красавин В.Ф., Айтбаев Т.Е., Красавина В.К. Результаты оценки сортов
картофеля казахстанской селекции на пригодность к переработке //
Генетические и агротехнологические ресурсы повышения качества
продовольственного и технического картофеля: материалы III научнопрактической конференции.-М.,2013.-С.32-33.
11 Хасанов В.Т., Дюсенова Г.Т. Сравнительное изучение различных схем
иммунизации лабораторных животных с целью получения антител
специфичных к М-вирусу картофеля // Вестник науки Казахского
агротехнического университета им. С.Сейфулина.-2013.-Т.1(86).-С.16-20.
12 Сарсекова А.Н., Каримова В.К., Магзумова Г.К., Какимжанова А.А.
Использование биотехнологических методов для создания ценных форм
картофеля, устойчивых фитофторозу // Онлайн-журнал Биотехнология. Теория
и практика.-2012.-Т.4.
13 Балпанов Д.С., Матрос О.А. Биотехнологические аспекты получения
микроклубней картофеля в in vitro условиях // Applied and Fundamental Studies:
Proceedings of the 4th International Academic Conference. USA: Missouri, 2013.Vol.1.-P.7-10.
14 Красавин В.Ф. Селекция картофеля на юго-востоке Казахстана.Алматы: Онер, 2009.-224с.
15 Общая фитопатология, под ред. Попковой К.В.-М.: Дрофа, 2005.-445с.
86
16 Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая
и молекулярная фитопатология.-М.: Общество фитопатологов, 2001.-302с.
17 Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков, под ред.
С.Н.Еланского.-М.: Картофелевод, 2009.-272с.
18 Защита растений от болезней, под ред. Шкаликова В.А.-М.: КолосС,
2003.-255с.
19 Мэтьюз Р. Вирусы растений.-М.: Мир, 1973.-600с.
20 Broadbent L., Fletcher J.T. The epidemiology of tomato mosaic: Sources of
TMV in commercial tomato crops under glass // Annals of Applied Biology.-1966.Vol.57.-№1.-P.113-120.
21 Bennett C.W. Highly virulent strains of curly top virus in sugar beet in
Western United States // Journal of American Society of Sugar Beet Technologists.1963.-Vol.12, №6.-P.515-520.
22 Kassanis B. Effects of changing temperature on plant virus diseases //
Advances in virus research.-1957.-Vol.4.-P.221-241.
23 Matthews R.E.F. Studies on potato virus X I. Types of change in potato virus
X infections // Annals of Applied Biology.-1949.-Vol.36, №4.-P.448-459.
24 Harrison B.D., Hooper D.J. Longevity of Longidorus elongatus (de Man) and
other nematodes in soil kept in polythene bags // Nematologica.-1963.-Vol.9.-P.158160.
25 Johnson C.G. International dispersal of insects and insectborne viruses //
Netherlands Journal of Plant Pathology.-1967.-Vol.73, Suppl.1.-P.21-43.
26 Proctor V.W. Long-distance dispersal of seeds by retention in digestive tract
of birds // Science.-1968.-Vol.160.-P.321-322.
27 Slykhuis J.T., Andrews J.E., Pittman U.J. Relation of date of seeding winter
wheat in southern Alberta to losses from wheat streak mosaic, root rot and rust //
Canadian Journal of Plant Science.-1957.-Vol.37, №2.-P.113-127.
28 Doncaster J.P., Gregory P.H. The spread of virus diseases in the potato crop.Agricultural Research Council Report Series, 1948.-№7.-189p.
29 van der Plank J.E. The relation between the size of fileds and the spread of
plant disease into them. Part I. Crowd diseases // Empire Journal of Experimental
Agriculture.-1948.-Vol.16.-P.134-142.
30 Blencowe J.W., Tinsley T.W. The influence of density of plant population on
the incidence of yellows in sugar beet crops // Annals of Applied Biology.-1951.Vol.38, №2.-P.395-401.
31 Broadbent L. Investigation of virus diseases of brassica crops.-London:
Cambridge University Press, 1957.-94p.
32 Steudel W., Heiling A. Die Vergilbungskrankheit der Rübe.-Berlin, 1954.132p.
33 Lewis T., Artificial windbreaks and the distribution of turnip mild yellow
virus and Scaptomyza apicalis (Diptera) in a turnip crop // Annals of Applied
Biology.-1966.-Vol.58.-P.371-376.
34 Broadbent L., Gregory P.H., Tinsley T.W. The influence of planting date and
manuring on the incidence of virus diseases in potato crops // Annals of Applied
Biology.-1952.-Vol.39.-P.509-524.
87
35 Johnson J., Ogden W.B. The overwintering of tobacco mosaic virus.Madison, 1929.-25p.
36
Пересыпкин В.Ф.
Сельскохозяйственная фитопатология.-М.:
Агропромиздат, 1989.-480с.
37 Сухов К.С., Вовк А.М. Столбур пасленовых и меры борьбы с ним.-М.:
Пищепромиздат, 1946.-32с.
38 Sozinova L, Abay A, Ramankulov E, Nachmias A, Loebenstein G. Reducing
Virus Incidence in Potato Seed Tubers by Rapid Propagation: A Pilot Scheme in
Kazakhstan // The 28th Congress of the Israeli Phytopathological Society.- 2007.The Volcani Center, Israel.
39 Оспанова Г.С., Бозшатаева Г.Т., Турабаева Г.К., Алиханова А.
Вирусные болезни пасленовых в Казахстане // Международный журнал
прикладных и фундаментальных исследований.-2014.-№3.-С.62-64.
40 Гавриленко Т.А., Рогозина Е.В., Антонова О.Ю. Создание устойчивых к
вирусам растений картофеля на основе традиционных подходов и методов
биотехнологии // Идентифицированный генофонд растений и селекция.-2005.СПб.-С.644-662.
41 English J.J., Mueller E., Baulcombe D.C. Suppression of Virus
Accumulation in Transgenic Plants Exhibiting Silencing of Nuclear Genes // The
Plant Cell.-1996.-Vol.8.-P.179-188.
42 Будин К.З. Генетические основы селекции картофеля.-Ленинград:
«Агропромиздат», 1986.-192с.
43 Valkonen J.P.T., Jones R.A.C., Slack S.A., Watanabe K.N. Resistance
specificities to viruses in potato: Standardization of nomenclature // Plant Breeding.1996.-Vol.115, №6.-P.433-438.
44 Solomon-Blackburn R.M., Barker H. Breeding virus resistant potatoes
(Solanum tuberosum): a review of traditional and molecular approaches // Heredity.2001.-Vol.86.-P.17-35.
45 Valkonen J.P.T. Natural genes and mechanisms for resistance to viruses in
cultivated and wild potato species // Plant Breeding.-1994.-Vol.112, №1.-P.1-16.
46 Solomon-Blackburn R.M., Barker H. A review of host major-gene resistance
to potato viruses X, Y, A and V in potato: genes, genetics and mapped locations //
Heredity.-2001.-Vol.86.-P.8-16.
47 Swiezynski K.M. Inheritance of resistance to viruses // Potato genetics, eds
Bradshow J.E., Mackay G.R.-Wallingford: CAB International, 1994.-P.339-363.
48 Dziewonska M.A., Ostrowska K. Resistance to potato virus M in certain wild
potato species // Potato Research.-1978.-Vol.21, №2.-P.129-131.
49 Was M., Dziewonska M., Ostrowska K. Further characteristics of reaction to
potato virus M (PVM) in hybrids between Solanum gourlayi Hawk. and S.tuberosum
// Plant Virology: Proceedings of the 9th Conference of the Czechoslovak Plant
Virologists.-1981.-Brno, Czechoslovakia.-P.201-203.
50 Bendahmane A., Kanyuka K., Baulcombe D.C. High-resolution genetical and
physical mapping of the Rx gene for extreme resistance to potato virus X in tetraploid
potato // Theoretical and Applied Genetics.-1997.-Vol.95, №1/2.-P.153-162.
88
51 Cockerham G. Genetical studies on resistance to potato viruses X and Y //
Heredity.-1970.-Vol.25.-P.309-348.
52 van der Voort J.R., Kanyuka K., van der Vossen E., Bendahmane A.,
Mooijman P., Klein-Lankhorst R., Stiekema W., Baulcombe D., Bakker J. Tight
physical linkage of the nematode resistance gene Gpa2 and the virus resistance gene
Rx on a single segment introgressed from the wild species Solanum tuberosum subsp.
Andigena CPC 1673 into cultivated potato // Molecular Plant-Microbe Interactions.1999.-Vol.12, №3.-P.197-206.
53 Ritter E., Debener T., Barone A., Salamini F., Gebhardt C. RFLP mapping on
potato chromosomes of two genes controlling extreme resistance to potato virus X
(PVX) // Molecular and General Genetics.-1991.-Vol.227, №1.-P.81-85.
54 Tommiska J., Hämäläinen J.H., Watanabe K.N., Valkonen J.P.T. Mapping of
the gene Nx(phu) that controls hypersensitive resistance to potato virus X in Solanum
phureja LvP35 // Theoretical and Applied Genetics.-1998.-Vol.96.-P.840-843.
55 Celebi-Toprak F., Slack S.A., Jahn M.M. A new gene, Nytbr, for
hypersensitivity to Potato virus Y from Solanum tuberosum maps to Chromosome IV
// Theoretical and Applied Genetics.-2002.-Vol.104, №4.-P.669-674.
56 Marczewski W., Flis B., Syller J., Schäfer-Pregl R., Gebhardt C. A major
quantitative trait locus for resistance to Potato leafroll virus is located in a resistance
hotspot on potato chromosome XI and is tightly linked to N-Gene-like markers //
Molecular Plant-Microbe Interactions.-2001.-Vol.14, №12.-P.1420-1425.
57 Marczewski W., Hennig J., Gebhardt C. The Potato virus S resistance gene
Ns maps to potato chromosome VIII // Theoretical and Applied Genetics.-2002.Vol.105, №4.-P.564-567.
58 Flor H.H. Genetics of pathogenicity in Melampsora lini // Journal of
Agricultural Research.-1946.-Vol.73.-P.335-357.
59 Culver J.N., Dawson W.O. Tobacco mosaic virus elicitor coat protein genes
produce a hypersensitive phenotype in transgenic Nicotiana sylvestris plants //
Molecular Plant-Microbe Interactions.-1991.-Vol.4, №5.-P.458-463.
60 Culver J. Viral avirulence genes // Plant-microbe interactions, ed. Stacey G.,
Keen N.T.-1996.-New York, USA.-P.196-219.
61 Weber H., Schultze S., Pfitzner A.J.P. Two amino acid substitutions in the
Tomato mosaic virus 30-kilodalton movement protein confer the ability to overcome
the Tm-22 resistance gene in the tomato // Journal of Virology.-1993.-Vol.67, №11.P.6432-6438.
62 Bendahmane A., Kanyuka K., Baulcombe D.C. The Rx gene from potato
controls separate virus resistance and cell death responses // The Plant Cell.-1999.Vol.11.-P.781-791.
63 Nyland G., Goheen A.C. Heat therapy of virus diseases of perennial plants //
Annual Review of Phytopathology.-1969.-Vol.7.-P.331-354.
64 Hemenway C., Fang R.-X., Kaniewski W.K., Chua N.-H., Tumer N.E.
Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato
virus X coat protein or its antisense RNA // The EMBO Journal.-1988.-Vol.7, №5.P.1273-1280.
89
65 Cuozzo M., O’Connel K.M., Kaniewski W.K., Fang R.-X., Chua N.-H.,
Tumer N.E. Viral protection in transgenic plants expressing the cucumber mosaic
virus coat protein or its antisense RNA // Bio/Technology.-1988.-Vol.6.-P.549-557.
66 Day A.G., Bejarano E.R., Buck K.W., Burrell M., Lichtenstein C.P.
Expression of an antisense viral gene in transgenic tobacco confers resistance to the
DNA virus tomato golden mosaic virus // Proceedings of the National Academy of
Sciences of the USA.-1991.-Vol.88, №15.-P.6721-6725.
67 Huntley C.C., Hall T.C. Interference with brome mosaic virus replication by
targeting the minus strand promoter // Journal of General Virology.-1993.-Vol.74.P.2445-2452.
68 Murant A.F., Mayo M.A. Satellites of plant viruses // Annual Review of
Phytopathology.-1982.-Vol.20.-P.49-68.
69 Kawchuk L.M., Martin R.R., McPherson J. Sense and antisense RNAmediated resistance to Potato leafroll virus in Russet Burbank potato plants //
Molecular Plant-Microbe Interactions.-1991.-Vol.4, №3.-P.247-253.
70 Бурьянов Я.И., Кадо К.И. Стратегии создания трансгенных растений с
устойчивостью к фитопатогенам и вредителям // Биоорганическая химия.-1999.Т.25, №12.-С.903-910.
71 Abel P.P., Nelson R.S., De B., Hoffmann N., Rogers S.G., Fraley R.T.,
Beachy R.N. Delay of disease development in transgenic plants that express the
tobacco mosaic virus coat protein gene // Science.-1986.-Vol.232.-P.738-743.
72 Beachy R.N., Loesch-Fries S., Tumer N.E. Coat protein-mediated resistance
against virus infection // Annual Review of Phytopathology.-1990.-Vol.28.-P.451474.
73 Harrison B.D., Mayo M.A., Baulcombe D.C. Virus resistance in transgenic
plants that express cucumber mosaic virus satellite RNA // Nature.-1987.-Vol.328.P.799-802.
74 Gerlach W.L., Llewellyn D., Haseloff J. Construction of a plant disease
resistance gene from the satellite RNA of tobacco ringspot virus // Nature.-1987.Vol.328.-P.802-805.
75 Golemboski D.B., Lomonossoff G.P., Zaitlin M. Plants transformed with a
tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus //
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.-1990.-Vol.87.P.6311-6315.
76 Carr J.P., Marsh L.E., Lomonossoff G.P., Sekiya M.E., Zaitlin M. Resistance
to tobacco mosaic virus induced by the 54-kDa gene sequence requires expression of
the 54-kDa protein // Molecular Plant-Microbe Interactions.-1992.-Vol.5, №5.-P.397404.
77 Anderson J.M., Palukaitis P., Zaitlin M. A defective replicase gene induces
resistance to cucumber mosaic virus in transgenic tobacco plants // Proceedings of the
National Academy of Sciences of the USA.-1992.-Vol.89.-P.8759-8763.
78 Longstaff M., Brigneti G., Boccard F., Chapman S., Baulcombe D. Extreme
resistance to Potato virus X infection in plants expressing a modified component of
the putative viral replicase // The EMBO Journal.-1993.-Vol.12, №2.-P.379-386.
90
79 Atabekov J.G., Dorokhov Yu.L. Plant virus-specific transport function and
resistance of plants to viruses // Advances in virus research.-1984.-Vol.29.-P.313364.
80 Malyshenko S.I., Kondakova O.A., Nazarova Ju.V., Kaplan I.B., Taliansky
M.E., Atabekov J.G. Reduction of tobacco mosaic virus accumulation in transgenic
plants producing non-functional viral transport proteins // Journal of General
Virology.-1993.-Vol.74.-P.1149-1156.
81 Nguyen L., Lucas W.J., Ding B., Zaitlin M. Viral RNA trafficking is
onhibited in replicase-mediated resistant transgenic tobacco plants // Proceedings of
the National Academy of Sciences of the USA.-1996.-Vol.93.-P.12643-12647.
82 Martelli G.P., Adams M.J., Kreuze J.F., Dolja V.V. Family Flexiviridae: A
case study in virion and genome plasticity // Annual Review of Phytopathology.2007.-Vol.45.-P.73-100.
83 Ryu K.H., Lee B.Y. Carlavirus // Desk Encyclopedia of plant and fungal
virology, ed. Mahy B.W.J., van Regenmortel M.H.V.-Elsevier.-2008.-P.139-143.
84 Zavriev S.K., Kanyuka K.V., Levay K.E. The genome organization of potato
virus M RNA // Journal of General Virology.-1991.-Vol.72.-P.9–14.
85 Schultz E.S, Folsom D. Transmission, variation and control of certain
degeneration diseases of Irish potatoes // Journal of Agricultural Research.-1923.Vol.25.-P.43-117.
86 McKay M.B., Dykstra T.P. Potato diseases. Oregon Investigations, 19241929 // Bulletin of Oregon Agricultural Experiment Station.-1932.-Vol.294.-P.1-40.
87 Dykstra T.P. Report on potato virus diseases in 1938 // American Potato
Journal.-1939.-Vol.16, №8.-P.204-212.
88 Köhler E. Untersuchungen über das K-Virus des Kartoffel // Mitteilungen
Angew. Botanik.-1942.-Vol.24.-P.118-130.
89 Wetter C., Brandes J. Untersuchungen über das Kartoffel-S-Virus //
Phytopath. Z.-1956.-Vol.26.-P.81-92.
90 Zavriev S.K. Carlaviruses // Encyclopedia of Virology, ed. by Granoff A.,
Webster R.G. –San Diego: Academic Press, 1999.-P.238-242.
91 Xu H., D’Aubin J., Nie J. Genomic variability in Potato virus M and the
development of RT-PCR and RFLP procedures for the detection of this virus in seed
potatoes // Virology Journal.- 2010.-Vol.7.-P.25-31.
92 Proll E., Leiser R.M., Ostermann W.D., Spaar D. Some physicochemical
properties of potato virus M // Potato Research.-1981.-Vol.24.-P.1–10.
93 Flatken S., Ungewickell V., Menzel W., Maiss E. Construction of an
infectious full-length cDNA clone of potato virus M // Archives of Virology.-2008.Vol.153.-P.1385–1389.
94 Tavantzis S.M. Physicochemical properties of potato virus M // Virology.1984.-Vol.133.- P.427-430.
95 http://www.ncbi.nlm.nih.gov
96 Gramstat A., Prüfer D., Rohde W. The nucleic acid-binding zinc finger
protein of potato virus M is translated by internal initiation as well as by ribosomal
frameshifting involving a shifty stop codon and a novel mechanism of P-site slippage
// Nucleic Acids Research.-1994.-Vol.22, №19.-P. 3911-3917.
91
97 Swiss Institute of Bioinformatics (viralzone.expasy.org).
98 Szybiak U., Legocki A.B. Translation in vitro of ribonucleic acids from
Potato virus X, Potato virus M and White clover mosaic virus // Acta Biochimica
Polonica.-1981.-Vol.28, №2.-P.99-104.
99 Rupasov V.V., Morozov S.Yu., Kanyuka K.V., Zavriev S.K. Partial
nucleotide sequence of Potato virus M RNA shows similarities to potexviruses in
gene arrangement and the encoded amino acid sequences // The Journal of General
Virology.-1989- Vol.70.-P.1861-1869.
100 Gustafson G., Armour S.L. The complete nucleotide sequence of RNAβ
from the type strain of barley stripe mosaic virus // Nucleic Acids Research.-1986.Vol.14, №9.-P.3895-3909.
101 Bouzoubaa S., Ziegler V., Beck D., Guilley H., Richards K., Jonard G.
Nucleotide sequence of Beet necrotic yellow vein virus RNA-2 // Journal if General
Virology.-1986.-Vol.67.-P.1689-1700.
102 Gorbalenya A.E., Koonin E.V., Donchenko A.P., Blinov V.M. A novel
superfamily of nucleoside triphosphate-binding motif containing proteins which are
probably involved in duplex unwinding in DNA and RNA replication and
recombination // FEBS Letters.-1988.-Vol.235.-P.16-24.
103 Morozov S.Yu., Kanyuka K.V., Levay K.E., Zavriev S.K. The Putative
RNA Replicase of Potato Virus M: Obvious Sequence Similarity with Potex- and
Tymoviruses // Virology.-1990.-Vol.179.-P.911-914.
104 Gorbalenya A., Koonin E. Helicases: amino-acid sequence comparisons and
structure-function relationships // Current Opinion in Structural Biology.-1993.Vol.3, №3.-P.419-429.
105 Morozov S.Yu., Solovyev A.G. Triple gene block: modular design of a
multifuctional machine for plant virus movement // Journal of General Virology.2003.-Vol.84.-P.1351-1366.
106 Morozov S.Yu., Lukasheva L., Chernov B.K., Skryabin K.G., Atabekov
J.G. Nucleotide sequence of the open reading frames adjacent to the coat protein in
potato virus X genome // FEBS Letters.-1987.-Vol.213.-P.438-442.
107 Morozov S.Yu., Dolja V.V., Atabekov J.G. Probable reassortment of
genomic elements among elongated RNA containing plant viruses // Journal of
Molecular Evolution.-1989.-Vol.29(1).-P.52-62.
108 Ruiz de Galarreta J.I., Carrasco A., Salazar A., Barrena I., Iturritxa E.,
Marquinez R., Legorburu F.J., Ritter E. Wild Solanum species as resistance sources
against different pathogens of potato // Potato Research.-1998.-Vol.41.-P.57-68.
109 Marczewski W., Strzelczyk-Zyta D., Hennig J., Witek K., Gebhardt C.
Potato chromosomes IX and XI carry genes for resistance to potato virus M //
Theoretical and Applied Genetics.-2006.-Vol.112.-P.1232-1238.
110 Voinnet O., RNA silencing as a plant immune system against viruses //
TRENDS in Genetics.-2001.-Vol.17, №8.-P.449-459.
111 Ketting R., Haverkamp T., van Luenen H., Plasterk R. mut-7 of C.elegans,
required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner
syndrome helicase and RNaseD // Cell.-1999.-Vol.99.-P.133-141.
92
112 Wu-Scharf D., Jeong B.-R., Zhang C., Cerutti H. Transgene and Transposon
Silencing in Chlamydomonas reinhardtii by a DEAH-Box RNA Helicase // Science.2000.-Vol.290.-P.1159-1162.
113 Grishok A., Pasquinelli A.E., Conte D., Na Li, Parrish S., Ilho Ha, Baillie
D.L., Fire A., Ruvkun G., Mello C.C. Genes and Mechanisms Related to RNA
Inteeference Regulate Expression of the Small Temporal RNAs that Control
C.elegans Developmental Timing // Cell.-2001.-Vol.106.-P.23-24.
114 Hutvagner G. McLachlan J., Pasquinelli A.E., Balint E., Tuschl T., Zamore
P.D. A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of
the let-7 small temporal RNA // Science.-2001.-Vol.293.-P.834-838.
115 Hamilton A., Voinnet O., Chappell L., Baulcombe D. Two classes of short
interfering RNA in RNA silencing // The EMBO Journal.-2002.-Vol.21, №17.P.4671-4679.
116 Bagasra O., Prilliman K.R. RNA interference: The molecular immune
system // Journal of Molecular Histology.-2004.-Vol.35.-P.545-553.
117 Zhang B., Pan X., Cobb G.P., Anderson T.A. Plant microRNA: A small
regulatory molecule with big impact // Developmental Biology.-2006.-Vol.289.-P.316.
118 Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C.
Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis
elegans // Nature.-1998.-Vol.391.-P.806-11.
119 Proud C.G. PKR: a new name and new roles // Trends in Biochemical
Sciences.-1995.-Vol.20.-P.241-246.
120 Clemens M.J. PKR – a protein kinase regulated by double-stranded RNA //
The international journal of biochemistry and cell biology.-1997.-Vol.29.-P.945-949.
121 Brodersen P., Voinnet O. The diversity of RNA silencing pathways in
plants // TRENDS in Genetics.-2006.-Vol.22, №5.-P.268-280.
122 Jorgensen R.A., Atkinson R.G., Forster R.L., Lucas W.J. An RNA-based
information superhighway in plants // Science.-1998.-Vol.279.-P.1486-1487.
123 Marano M.R., Baulcombe D. Pathogen-derived resistance targeted against
the negative-strand RNA of tobacco mosaic virus: RNA strand-specific gene
silencing? // The Plant Journal.-1998.-Vol.13(4).-P.537-546.
124 Tang G., Reinhart B.J., Bartel D.P., Zamore P.D. A biochemical framework
for RNA silencing in plants // Genes and Development.-2003.-Vol.17.-P.49-63.
125 van Blockland R., van der Geest N., Mol J.N.M., Kooter J.M. Transgenemediated suppression of chalcone synthase expression in Petunia hybrid results from
an increase in RNA turnover // The Plant Journal.-1994.-Vol.6.-P.861-877.
126 Antisense Nucleic Acids and Proteins: Fundamentals and Applications // ed.
by Mol J.N.M., van der Krol A.R.-1991, New York.-248P.
127 van der Krol A.R., Mur L.A., Beld M., Mol J.N., Stuitje A.R. Flavonoid
genes in Petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a
suppression of gene expression // Plant Cell.-1990.-Vol.2.-P.291-299.
128 Matzke M., Matzke A.J., Kooter J.M. RNA: guiding gene silencing //
Science.-2001.-Vol.293.-P.1080-1083.
93
129 Cao X., Zhou P., Zhang X., Zhu S., Zhong X., Xiao Q., Ding B., Li Y.
Identification of an RNA Silencing Suppressor from a Plant Double-Stranded RNA
Virus // Journal of Virology.-2005.-Vol.79, №20.-P.13018-13027.
130 Goldbach R., Bucher E., Prins M. Resistance mechanisms to plant viruses:
an overview // Virus Research.-2003.-Vol.92.-P.207-212.
131 Lecellier Ch.-H., Voinnet O. RNA silencing: no mercy for viruses? //
Immunological Reviews.-2004.-Vol.198.-P.285–303
132 Moissiard G., Voinnet O. Viral suppression of RNA silencing in plants //
Molecular Plant Pathology.-2004.-Vol.5.-P.71-82.
133 Stram Y., Kuzntzova L. Inhibition of Viruses by RNA Interference // Virus
Genes.-2006.-Vol.32.-P.299-308.
134 Kim V.N. RNA interference in functional genomics and medicine // Journal
of Korean Medical Science.-2003.-Vol.18(3)-P.309-318.
135 Wall N.R., Shi Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for
therapy? // The Lancet.-2003.-Vol.362.-P.1401-1403.
136 Campbell T.N., Choy F.Y.M. RNA Interference: Past, Present and Future //
Current Topics in Molecular Biology.-2005.-Vol.7.-P.1-6.
137 Генетики, молекулярные биологи и их открытия, сост. Оберемок В.В.Симферополь, 2008.-35с.
138 Bucher E., Prins M. RNA silencing: a natural resistance mechanism in
plants // Natural resistance mechanisms of plants to viruses. 2006. Springer. Printed
in the Netherlands. Ed. Loebenstein G., Carr J. P. P. 45-72.
139 Дорохов Ю.Л. «Умолкание» генов у растений // Молекулярная
биология.-2007.-Т. 41, № 4.-С. 579-592.
140 Rakhshandehroo F., Takeshita M., Squires J., Palukaitis P., The influence of
RNA-dependent RNA polymerase 1 on potato virus Y infection and on other antiviral
response genes // Molecular Plant-Microbe Interactions.-2009.-Vol.22, №10.-P.13121318.
141 Малиновский В.И. Механизмы устойчивости растений к вирусам.Владивосток: Дальнаука, 2010.-324с.
142 Margis R., Fusaro A.F., Smith N.A., Curtin S.J., Watson J.M., Finnegan
E.J., Waterhouse P.M. The evolution and diversification of Dicers in plants // FEBS
Letters.-2006.-Vol.580.-P.2442-2450.
143 Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J. Role for a
bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference // Nature.-2001.Vol.409.-P.363-366.
144 Hamilton A.J., Baulcombe D.C. A Species of Small Antisense RNA in
Posttranscriptional Gene Silencing in Plants // Science.-1990.-Vol.286, №5441.P.950-952.
145 Pillai R.S., Bhattacharyya S.N., Filipowicz W. Repression of protein
synthesis by miRNA: how many mechanisms? // Trends in Cell Biology.-2007.Vol.17.-P.118-126.
146 Summerton J.E. Morpholino, siRNA, and S-DNA Compared: Impact of
Structure and Mechanism of Action on Off-Target Effects and Sequence Specificity //
Current Topics in Medicinal Chemistry.-2007.-Vol.7.-P.651-660.
94
147 Ding S.-W., Voinnet O. Antiviral Immunity Directed by Small RNAs //
Cell.-2007.-Vol.130.-P.413-426.
148 Gregory R.I., Chendrimada T.P., Shiekhattar R. MicroRNA biogenesis:
isolation and characterization of the microprocessor complex // Methods in Molecular
Biology.-2006.-Vol.342.-P.33-47.
149 Wang Q.-L., Li Z.-H. The functions of microRNAs in plants // Frontiers in
Bioscience.-2007.-Vol.12.-P.3975-3982.
150 Zhao Y., Srivastava D. A developmental view of microRNA function //
Trends in Biochemical Sciences.-2007.-Vol.32.-P.189-197.
151 Szittya G., Dalmay T., Burgyan J. Plant Antiviral Defense: Gene Silencing
Pathway // Desk Encyclopedia of plant and fungal virology, ed. Mahy B.W.J., van
Regenmortel M.H.V.-Elsevier.-2008.-P.30-38.
152 Bartel D.P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function
// Cell.-2004.-Vol.116.-P.281-297.
153 Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A., Bartel D.P. RNAi: Double-Stranded
RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide
Intervals // Cell.-2000.-Vol.101.-P.25-33.
154 Vermeulen A., Behlen L., Reynolds A., Wolfson A., Marshall W.S.,
Karpilow J., Khvorova A. The contributions of dsRNA structure to Dicer specificity
and efficiency // RNA.-2005.-Vol.11.-P.674-682.
155 Siomi H., Siomi M.C. On the road to reading the RNA-interference code //
Nature.-2009.-Vol.457.-P.396-404.
156 Gregory R.I., Chendrimada T.P., Cooch N., Shiekhattar R. Human RISC
couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing // Cell.-2005.Vol.123(4).-P.631-640.
157 Sen G.L., Wehrman T.S., Blau H.M. mRNA translation is not a prerequisite
for small interfering RNA-mediated mRNA cleavage // Differentiation.-2005.Vol.73.-P.287-293.
158 Gu S., Rossi J.J. Uncoupling of RNAi from active translation in mammalian
cells // RNA.-2005.-Vol.11.-P.38-44.
159 Kurihara Y., Watanabe Y. Arabidopsis micro-RNA biogenesis through
Dicer-like 1 protein function // Proceedings of the National Academy of Sciences of
the USA.-2004.-Vol.101, №34.-P.12753-12758.
160 Bollman K.M., Aukerman M.J., Park M.-Y., Hunter C., Berardini T.Z.,
Poethig R.S. HASTY, the Arabidopsis ortholog of exportin 5/MSN5, regulates phase
change and morphogenesis // Development.-2003.-Vol.130, №8.-P.1493-1504.
161 Park M.., Wu G., Gonzalez-Sulser A., Vaucheret H., Poethig R.S. Nuclear
processing and export of microRNAs in Arabidopsis // Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA.-2005.-Vol.102, №10.-P.3691-3696.
162 Kurihara Y., Takashi Y., Watanabe Y. The interaction between DCL1 and
HYL1 is important for efficient and precise processing of pri-miRNA in plant
microRNA biogenesis // RNA.-2006.-Vol.12.-P.206-212.
163 Wassenegger M., Heimes S., Riedel L., Sänger H.L. RNA-directed de novo
methylation of genomic sequences in plants // Cell.-1994.-Vol.76.-P.567-576.
95
164 Mette M.F., Aufsatz W., van der Winden J., Matze M.A., Matzke A.J.M.
Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded
RNA // The EMBO Journal.-2000.-Vol.19, №19.-P.5194-5201.
165 Zilberman D., Cao X., Jacobsen S.E. ARGONAUTE4 control of locusspecific siRNA accumulation and DNA and histone methylation // Science.-2003.Vol.299, №5607.-P.716-719.
166 Matzke M., Aufsatz W., Kanno T., Daxinger L., Papp I., Mette M.F.,
Matzke A.J.M. Genetic analysis of RNA-mediated transcriptional gene silencing //
Biochimica et Biophysica Acta.-2004.-Vol.1677.-P.129-141.
167 Palauqui J.-C., Elmayan T., Pollien J.-M., Vaucheret H. Systemic acquired
silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting
from silenced stocks to non-silenced scions // The EMBO Journal.-1997.-Vol.16,
№15.-P.4738-4745.
168 Voinnet O., Baulcombe D.C. Systemic signaling in gene silencing //
Nature.-1997.-Vol.389, №6651.-P.553.
169 Tournier B., Tabler M., Kalantidis K. Phloem flow strongly influences the
systemic spread of silencing in GFP Nicotiana benthamiana plants // Plant Journal.2006.-Vol.47, №3.-P.383-394.
170 Ueki S., Citovsky V. RNA commutes to work: regulation of plant gene
expression by systemically transported RNA molecules // BioEssays.-2001.-Vol.23,
№12.-P.1087-1090.
171 Himber C., Dunoyer P., Moissiard G., Ritzenthaler C., Voinnet O.
Transitivity-dependent and –independent cell-to-cell movement of RNA silencing //
The EMBO Journal.-2003.-Vol.22, №17.-P.4523-4533.
172 Schwach F., Vaistij F.E., Jones L., Baulcombe D.C. An RNA-Dependent
RNA Polymerase prevents meristem invasion by Potato Virus X and is required for
the activity but not the production of a systemic silencing signal // Plant Physiology.2005.-Vol.138, №4.-P.1842-1852.
173 Palauqui J.C., Vaucheret H. Transgenes are dispensable for the RNA
degradation step of cosuppression // Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America.-1998.-Vol.95.-P.9675-9680.
174 Garcia-Perez R.D., van Houdt H., Depicker A. Spreading of posttranscriptional gene silencing along the target gene promote systemic silencing // The
Plant Journal.-2004.-Vol.38.-P.594-602.
175 Voinnet O., Vain P., Angel S., Baulcombe D.C. Systemic spread of
sequence-specific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized
introduction of ectopic promoterless DNA // Cell.-1998.-Vol.95.-P.177-187.
176 Sonoda S., Nishiguchi M. Graft transmission of post-transcriptional gene
silencing: target specificity for RNA degradation is transmissible between silenced
and non-silenced plants, but not between silenced plants // The Plant Journal.-2000.Vol.21, №1.-P.1-8.
177 Mallory A.C., Mlotshwa S., Bowman L.H., Vance V.B. The capacity of
transgenic tobacco to send a systemic RNA silencing signal depends on the nature of
the inducing transgene locus // The Plant Journal.-2003.-Vol.35.-P.82-92.
96
178 Dunoyer P., Himber C., Voinnet O. DICER-LIKE 4 is required for RNA
interference and produces the 21-nucleoride small interfering RNA component of the
plant cell-to-cell silencing signal // Nature Genetics.-2005.-Vol.37.-P.1356-1360.
179 Yoo B.-., Kragler F., Varkonyi-Gasic E., Haywood V., Archer-Evans S.,
Lee Y.M., Lough T.J., Lucas W.J. A systemic small RNA signaling system in plants
// The Plant Cell.-2004.-Vol.16.-P.1979-2000.
180 Ruiz-Medrano R., Xoconostle-Cazares B., Lucas W.J. Phloem long-distance
transport of CmNACP mRNA: implication supracellular regulation in plants //
Development.-1999.-Vol.126.-P.4405-4419.
181 Haywood V., Yu T.-S., Huang N.-C., Lucas W.J. Phloem long-distance
trafficking of GIBBERELLIC ACID-INSENSITIVE RNA regulates leaf
development // The Plant Journal.-2005.-Vol.42.-P.49-68.
182 Pruss G., Ge X., Shi X.M., Carrington J.C., Vance V.B. Plant viral
synergism: the potyviral genome encodes a broad-range pathogenicity enhancer that
transactivates replication of heterologous viruses // The Plant Cell.-1997.-Vol.9.P.859-868.
183 Shams-Bakhsh M., Canto T., Palukaitis P. Enhanced resistance and
neutralization of defense responses by suppressors of RNA silencing // Virus
Research.-2007.-Vol.130, №1-2.-P.103-109.
184 Anandalakshmi R., Pruss G.J., Ge X., Marathe R., Mallory A.C., Smith
T.H., Vance V.B. A viral suppressor of gene silencing in plants // Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America.-1998.-Vol.95.P.13079-13084.
185 Brigneti G., Voinnet O., Li W.-X., Ji L.H., Ding S.-W., Baulcombe D.C.
Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana
benthamiana // The EMBO Journal.-1998.-Vol.17, №22.-P.6739-6746.
186 Kasschau K.D., Carrington J.C. Long-distance movement and replication
maintenance functions correlate with silencing suppression activity of potyviral HCPro // Virology.-2001.-Vol.285.-P.71-81.
187 Wu H.-W., Lin S.-S., Chen K.-C., Yeh S.-D., Chua N.-H. Discriminating
mutations of HC-Pro of Zucchini yellow mosaic virus with differential effects on
small RNA pathways involved in viral pathogenicity and symptom development //
Molecular Plant-Microbe Interactions.-2010.-Vol.23, №1.-P.17-28.
188 Bayne E.H., Rakitina D.V., Morozov S.Y., Baulcombe D.C. Cell-to-cell
movement of Potato Potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing //
The Plant Journal.-2005.-Vol.44.-P.471-482.
189 Chapman E.J., Prokhnevsky A.I., Gopinath K., Dolja V.V., Carrington J.C.
Viral RNA silencing suppressors inhibit the microRNA pathway at an intermediate
step // Genes and Development.-2004.-Vol.18.-P.1179-1186.
190 Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P., Bartel B. MicroRNAs and their
regulatory roles in plants // Annual Review of Plant Biology.-2006.-Vol.57.-P.19-53.
191 Omarov R.T., Scholthof H.B. Biological chemistry of virus-encoded
suppressors of RNA silencing: an overview // Methods in molecular biology.-2012.Vol.894.-P.39-56.
97
192 Verchot J., Herndon K.L., Carrington J.C. Mutational analysis of the
tobacco etch potyviral 35-kDa proteinase: identification of essential residues and
requirements for autoproteolysis // Virology.-1992.-Vol.190, №1.-P.298-306.
193 Cronin S., Verchot J., Haldeman-Cahill R., Schaad M.C., Carrington J.C.
Long-distance movement factor: a transport function of the potyvirus helper
component proteinase // The Plant Cell.-1995.-Vol.7.-P.549-559.
194 Kasschau K.D., Carrington J.C. Requirement for HC-Pro processing during
genome amplification of Tobacco Etch potyvirus // Virology.-1995.-Vol.209.-P.268273.
195 Vance V.B., Berger P.H., Carrington J.C., Hunt A.G., Shi X.M. 5’ Proximal
potyviral sequences mediate potato virus X/potyviral synergistic disease in transgenic
tobacco // Virology.-1995.-Vol.206.-P.583-590.
196 Kasschau K.D., Carrington J.C. A counterdefensive strategy of plant
viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing // Cell.-1998.-Vol.95.P.461-470.
197 Anandalakshmi R., Marathe R., Ge X., Herr J.M., Mau C., Mallory A.,
Pruss G., Bowman L., Vance V.B. A calmodulin-related protein that suppress
posttranscriptional gene silencing in plants // Science.-2000.-Vol.290, №5489.-P.142144.
198 Dunoyer P., Lecellier C.-H., Parizotto E.A., Himber C., Voinnet O. Probing
the microRNA and small interfering RNA pathways with virus-encoded suppressor
of RNA silencing // The Plant Cell.-2004.-Vol.16.-P.1235-1250.
199 Mallory A.C., Reinhart B.J., Bartel D., Vance V.B., Bowman L.H. A viral
suppressor of RNA silencing differentially regulates the accumulation of short
interfering RNAs and micro-RNAs in tobacco // Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA.-2002.-Vol.99, №23.-P.15228-15233.
200 Kasshau K.D., Xie Z., Allen E., Llave C., Chapman E.J., Krizan K.A.,
Carrington J.C P1/HC-Pro, a viral suppressor of RNA silencing, interferes with
Arabidopsis development and miRNA function // Developmental Cell.-2003.-Vol.4.P.205-217.
201 Plisson C., Drucker M., Blanc S., German-Retana S., Le Gall O., Thomas
D., Bron P. Structural characterization of HC-Pro, a plant virus multifunctional
protein // The Journal of Biological Chemistry.-2003.-Vol.278, №26.-P.23753-23761.
202 Mallory A.C., Ely L., Smith T.H., Marathe R., Anandalakshmi R., Fagard
M., Vaucheret H., Pruss G., Bowman L., Vance V.B. HC-Pro suppression of
transgene silencing eliminates the small RNAs but not transgene methylation or the
mobile signal // The Plant Cell.-2001.-Vol.13.-P.571-583.
203 Miller W.A., Waterhouse P.M., Brown J.W.S., Browning K.S. Meeting
report: the RNA world in plants: post-transcriptional control // Plant Cell.-2001.Vol.13.-P.1710-1717.
204 Qu F., Ren T., Morris T.J. The Coat protein of Turnip crinkle virus
suppresses posttranscriptional gene silencing at an early initiation step // Journal of
Virology.-2003.-Vol.77, №1.-P.511-522.
205 Ebhardt H.A., Thi E.P., Wang M.-B., Unrau P.J. Extensive 3’ modification
of plant small RNAs is modulated by helper component-proteinase expression //
98
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.-2005.-Vol.102, №38.P.13398-13403.
206 Yu B., Chapman E.J., Yang Z., Carrington J.C., Chen X. Transgenically
expressed viral RNA silencing suppressors interfere with microRNA methylation in
Arabidopsis // FEBS Letters.-2006.-Vol.580.-P.3117-3120.
207 Lakatos L., Csorba T., Pantaleo V., Chapman E.J., Carrington J.C., Liu Y.P., Dolja V.V., Calvino L.F., Lopez-Moya J.J., Burgyan J. Small RNA binding is a
common strategy to suppress RNA silencing by several viral suppressors // The
EMBO Journal.-2006.-Vol.25.-P.2768-2780.
208 Shiboleth Y.M., Haronsky E., Leibman D., Arazi T., Wassenegger M.,
Whitham S.A., Gaba V., Gal-On A. The conserved FRNK box in HC-Pro, a plant
viral suppressor of gene silencing, is required for small RNA binding and mediates
symptom development // Journal of Virology.-2007.-Vol.81.-P.13135-13148.
209 Russo M., Burgyan J., Martelli G.P. Molecular biology of tombusviridae //
Advances in virus research.-1994.-Vol.44.-P.381-428.
210 Scholthof H.B. The Tombusvirus-encoded P19: from irrelevance to
elegance // Nature reviews. Microbiology.-2006.-Vol.4, №5.-P.405-411.
211 Chu M., Desvoyes B., Turina M., Noad R., Scholthof H.B. Genetic
dissection of Tomato bushy stunt virus p19-protein-mediated host-dependent
symptom induction and systemic invasion // Virology.-2000.-Vol.266.-P.79-87.
212 Turina M., Omarov R., Murphy J.F., Bazaldua-Hernandez C., Desvoyes B.,
Scholthof H.B. A newly identified role for Tomato bushy stunt virus P19 in short
distance spread // Molecular plant pathology.-2003.-Vol.4, №1.-P.67-72.
213 Voinnet O., Pinto Y.M., Baulcombe D.C. Suppression of gene silencing: A
general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants // Proceedings of
the National Academy of Sciences of the USA.-1999.-Vol.96, №24.-P.14147-14152.
214 Qu F., Morris T.J. Efficient infection of Nicotiana benthamiana by Tomato
bushy stunt virus is facilitated by the coat protein and maintained by p19 through
suppression of gene silencing // Molecular Plant-Microbe Interactions.-2002.-Vol.15,
№3.-P.193-202.
215 Qiu W., Park J.-W., Scholthof H.B. Tombusvirus P19-mediated suppression
of virus-induced gene silencing is controlled by genetic and dosage features that
influence pathogenicity // Molecular Plant-Microbe Interactions.-2002.-Vol.15, №3.P.269-280.
216 Scholthof H.B., Desvoyes B., Kuecker J., Whitehead E. Biological activity
of two Tombusvirus proteins translated from nested genes is influenced by dosage
control via context-dependent leaky scanning // Molecular Plant-Microbe
Interactions.-1999.-Vol.12, №8.-P.670-679.
217 Ye K., Malinina L., Patel D.J. Recognition of small interfering RNA by a
viral suppressor of RNA silencing // Nature.-2003.-Vol.426, №6968.-P.874-878.
218 Vargason J.M., Szitty G., Burgyan J., Tanaka Hall T.M. Size selective
recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor // Cell.-2003.-Vol.115.-P.799811.
99
219 Lakatos L., Szittya G., Silhavy D., Burgyan J. Molecular mechanism of
RNA silencing suppression mediated by p19 protein of tombusviruses // The EMBO
Journal.-2004.-Vol.23.-P.876-884.
220 Omarov R., Sparks K., Smith L., Zindovic J., Scholthof H.B. Biological
relevance of a stable biochemical interaction between the Tombusvirus-encoded P19
and short interfering RNAs // Journal of Virology.-2006.-Vol.80.-P.3000-3008.
221 Hsieh Y.-C., Omarov R.T., Scholthof H.B. Diverse and newly recognized
effects associated with short interfering RNA binding site modifications on the
Tomato bushy stunt virus P10 silencing suppressor // Journal of Virology.-2009.Vol.83.-P.2188-2200.
222 Pantaleo V., Szittya G., Burgyan J. Molecular basis of viral RNA targeting
by viral small interfering RNA-programmed RISC // Journal of Virology.-2007.Vol.81.-P.3797-3806.
223 Omarov R.T., Ciomperlik J.J., Scholthof H.B. RNAi-associated ssRNAspecific ribonucleases in Tombusvirus P19 mutant-infected plants and evidence for a
discrete siRNA-containing effector complex // Proceedings of the National Academy
of Sciences of the USA.-2007.-Vol.104, №5.-P.1714-1719.
224 Senshu H., Yamaji Y., Minato N., Shiraishi T., Maejima K., Hashimoto M.,
Miura Ch., Neriya Yu., Namba Sh. A dual strategy for the suppression of host
antiviral silencing: two distinct suppressors for viral replication and viral movement
encoded by potato virus M // Journal of Virology.-2011.-Vol.85, №19.-P.1026910278.
225 Voinnet O., Lederer C., Baulcombe D.C. A viral movement protein
prevents spread of the Gene Silencing signal in Nicotiana benthamiana // Cell.-2000.Vol.103.-P.157-167.
226 Dunoyer P., Pfeffer S., Fritsch Ch., Hemmer O., Voinnet O., Richards K.E.
Identification, subcellular localization and some properties of a cysteine-rich
suppressor of gene silencing encoded by peanut clump virus // The Plant Journal.2002.-Vol.29, №5.-P.555-567.
227 Ghazala W., Waltermann A., Pilot R., Winter S., Varrelmann M. Functional
characterization and subcellular localization of the 16K cysteine-rich suppressor of
gene silencing protein of tobacco rattle virus // Journal of General Virology.-2008.Vol.89.-P.1748-1758.
228 Yelina N.E., Savenkov E.I., Solovyev A.G., Morozov S.Y., Valkonen J.P.T.
Long-distance movement, virulence, and RNA silencing suppression controlled by a
single protein in Hordei- and Potyviruses: complementary functions between virus
families // Journal of Virology.-2002.-Vol.76, №24.-P.12981-12991.
229 Zhou Z.Sh., Dell’Orco M., Saldarelli P., Turturo C., Minafra A., Martelli
G.P. Identification of an RNA-silencing suppressor in the genome of Grapevine virus
A // Journal of General Virology.-2006.-Vol.87.-P.2387-2395.
230 Генетически модифицированные источники пищи: оценка
безопасности и контроль, под ред. Тутельяна В.А.-М.: Издательство РАМН,
2007.-444c.
100
231 Harlander S.K. The Evolution of Modern Agriculture and its Future with
Biotechnology // Journal of the American College of Nutrition.-2002.-Vol.21, №3.P.161S-165S.
232 Vasil I.K. The science and politics of plant biotechnology – a personal
perspective // Nature Biotechnology.-2003.-Vol.21.-P.849-851.
233 Consensus document on compositional considerations for new varieties of
potatoes: key food and feed nutrients, anti-nutrients and toxicants. Series on the
safety of novel foods and feeds. OEDS, Paris, 2002, №4.
234 Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning // A laboratory
manual: 3 vols, New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.
235 English J.J., Davenport G.F., Elmayan T., Vaucheret H., Baulcombe D.C.
Requirement of sense transcription for homology-dependent virus resistance and
trans-inactivation // The Plant Journal.-1997.-Vol.12(3).-P.597-603.
236 Искаков Б.К., Айтхожин М.А. // В кн.: Методы молекулярной
биологии, биохимии и биотехнологии растений.-1988.- Алма-Ата: Наука.-С. 517.
237 Huisman M.J., Linthorst H.J.M., Bol J.F., Conelissen B.J.C. The complete
nucleotide sequence of potato virus X and its homologies at the amino acid level with
various plus-stranded RNA viruses // Journal of General Virology.-1988.-Vol. 69.-P.
1789-1798.
238 Forster R.L.S., Bevan M.W., Harbison S.-A., Gardner R.C. The complete
nucleotide sequence of the potexvirus white clover mosaic virus // Nucleic Acids
Res.-1988.-Vol.16.-P. 291-303.
239 Morch M.-D., Boyer J.-C., Haenni A.-L. Overlapping open reading frames
revealed by complete nucleotide sequencing of turnip yellow mosaic virus genomic
RNA // Nucleic Acids Res.- 1988.-Vol.16.-P. 6157-6173.
240 Orosio-Keese M.E., Keese P., Gibbs A. Nucleotide sequence of the genome
of eggplant mosaic tymovirus // Virology.-1989.-Vol. 172.-P. 547-554.
241 Poch O., Sauvaget I., Delarue M., Noel T. Identification of four conserved
motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements // The EMBO
Journal.-1989.-Vol.8.-P.3867-3874.
242 German S., Candresse T., Lanneau M., Huet J.C., Pernollet J.C., Dunez J.
Nucleotide sequence and genomic organization of apple chlorotic leaf spot
closterovirus // Virology.-1990.-Vol.179.-P.104-112.
243 Memelink J., van der Vlugt C.I.M., Linthorst H.J.M., Derks A.F.L.M.,
Asjes C.J., Bol J.F. Homologies between the genomes of a carlavirus (lily
symptomless virus) and a potexvirus (lily virus X) from lily plants // Journal of
General Virology.-1990.-Vol.71.-P.917-924.
244 Klug A., Rhodes D. “Zinc fingers”: a novel protein motif for nucleic acid
recognition // Trends in Biochemical Sciences.-1987.-Vol.12.-P.464-469.
245 Sehnke P.C., Mason A.M., Hood S.J., Lister R.M., Johnson J.E. A “zincfinger”-type binding domain in tobacco streak virus coat protein // Virology.-1989.Vol.168.-P.48-56.
101
246 Hamilton W.D.O., Boccara M., Robinson D.J., Baulcombe D.C. The
Complete Nucleotide Sequence of Tobacco Rattle Virus RNA-1 // Journal of General
Virology.-1987.-Vol.68.-P.2563-2575.
247 MacFarlane S.A., Taylor S.C., King D.I., Hughes G., Davies J.W. Pea early
virus RNA1 encodes four polypeptides including a putative zinc-finger protein //
Nucleic Acids Research.-1989.-Vol.17.-P.2245-2260.
248 Ryu J.H., Park H.W., Park W.M., Lee S.Y., Ryu K.H. Molecular Analysis
of the 3’-Terminal Region of Lily Latent Carlavirus from Lilium lancitoium // Plant
Pathology Journal.-2000.-Vol.16(4).-P.231-235.
249 Канюка К.В. Структура 3’-концевой области РНК М вируса картофеля
и возможные механизмы экспрессии генома вируса // дисс. на соиск. уч.степени
к.б.н.-Москва.-1991.-23 с.
250 Zuidema D., Linthorst H.J.M., Huisman M.J., Asjes C.J., Bol J.F.
Nucleotide sequence of narcissus mosaic virus RNA // Journal of General Virology.1989.-Vol. 70.-P. 267-276.
251 Chiba M., Reed J.C., Prokhnevsky A.I., Chapman E.J., Mawassi M.,
Koonin E.V., Carrington J.C., Dolja V.V. Diverse suppressors of RNA silencing
enhance agroinfection by a viral replicon // Virology.-2006.-Vol.346.-P. 7-14.
252 Lukhovitskaya N.I., Solovyev A.G., Koshkina T.E., Zavriev S.K., Morozov
S.Yu. Interaction of the Carlavirus Cysteine-Rich Protein with the Plant Defense
System // Molecular Biology.-2005.-Vol.39, №5.-P.896-904.
253 Seppänen P., Puska R., Honkanen J., Tyulkina L.G., Fedorkin O., Morozov
S.Yu., Atabekov J.G. Movement protein-derived resistance to triple gene blockcontaining plant viruses // Journal of General Virology.-1997.-Vol.78.-P.1241-1246.
254 Dolja V.V., Grama D.F., Morozov S.Yu., Atabekov J.G. Potato virus Xrelated single- and double-stranded RNAs. Characterization and identification of
terminal structures // FEBS Letters.- 1987.-Vol. 214.-P. 308-312.
255 Gordon К., Pfeiffer P., Futterer J., Hohn T. In vitro expression of
cauliflower mosaic virus genes // The EMBO Journal.-1988.-Vol.7.-P. 309-317.
256 Hull R., Sadler J., Longstaff M. The sequence of carnation etched ring virus
DNA: comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses // The EMBO
Journal.-1986.-Vol.5.-P.3083-3090.
257 Gramstat A., Courtpozanis A., Rohde W. The 12kDa protein of potato virus
M displays properties of a nucleic acid-binding regulatory protein // FEBS Letters.1990.-Vol.276.-P.34-38.
258 Brattey C., Badge J.L., Burns R., Foster G.D., George E., Goodfellow H.A.,
Mulholland V., McDonald J.G., Jeffries C.J. Potato latent virus: a proposed new
species in the genus Carlavirus // Plant Pathology.-2002.-Vol.51.-P.495-505.
259 Carrington J.C., Kasschau K.D., Mahajan S.K., Schaad M.C. Cell-to-Cell
and Long-Distance Transport of Viruses in Plants // The Plant Cell.-1996.-Vol.8.P.1669-1681.
260 Hartley J.L., Temple G.F., Brasch M.A. DNA cloning using in vitro sitespecific recombination // Genome Res.-2000.-Vol.10.-P. 1788-1795.
261 Katzen F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system
// Expert Opin. Drug Discov.-2007.-Vol. 2(4).-P. 571-589.
102
262 Silhavy D., Molnar A., Lucioli, Szittya G., Homyik C., Tavazza M.,
Burgyan J. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated,
21- to 25-nucleotide double-stranded RNAs // The EMBO Journal.-2002.-Vol.21,
№12.-P.3070-3080.
263 Zamyatnin A.A., Solovyev A.G., Savenkov E.I., Germundsson A.,
Sandgren M., Valkonen J.P.T., Morozov S.Y. Transient coexpression of individual
genes encoded by the Triple Gene Block of Potato mop-top virus reveals
requirements for TGBp1 trafficking // Molecular Plant-Microbe Interactions.-2004.Vol.17, №8.-P.921-930.
264 Klein P.G., Klein R.R., Rodriguez-Cerezo E., Hunt A.G., Shaw J.G.
Mutational analysis of the Tobacco vein mottling virus genome // Virology.-1994.Vol.204, №2.-P.759-769.
265 Huet H., Gal-On A., Meir E., Lecoq H., Raccah B. Mutations in the helper
component protease gene of zucchini yellow mosaic virus affect its ability to mediate
aphid transmissibility // Journal of General Virology.-1994.-Vol.75.-P.1407-1414.
266 Donald R.G.K., Jackson A.O. RNA-binding activities of barley stripe
mosaic virus γb fusion proteins // Journal of General Virology.-1996.-Vol.77.-P.879888.
267 Narayanasamy P., Molecular Biology in Plant Pathogenesis and Disease
Management: Disease Development.-Springer, 2008.-Vol.2.-246P.
268 Opalka N., Brugidou C., Bonneau C., Nicole M., Beachy R., Yeager M.,
Fauquet C. Movement of rice yellow mottle virus between xylem cells through pit
membranes // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.-1998.Vol.95.-P.3323-3328.
269 Chowdhury S.R., Savithri H.S. Interaction of Sesbania mosaic virus protein
with the coat protein – implications for viral spread // The FEBS Journal.-2011.Vol.278, №2.-P.257-272.
270 Olspert A., Kamsol K., Sarmiento C., Gerassimenko J., Truve E. Cocksfoot
mottle virus coat protein is dispensable for the systemic infection // Virology
Journal.-2014.-Vol.11, №1.-Article 19
103