Крылдаков РВ

АННОТАЦИЯ
диссертации на соискание ученой степени доктора философии (PhD) по
специальности 6D060800- «Экология»
Крылдакова Руслана Владимировича
«Экология вируса картофеля М в семействе Solanaceae»
Общая характеристика работы. Диссертационная работа посвящена
идентификации белков М вируса картофеля (PVM), которые вызывают
супрессию процесса РНК-интерференции в клетках зараженного растенияхозяина.
Актуальность исследования. М вирус картофеля - один из наиболее
вредоносных для сельского хозяйства, потеря урожая из-за которого составляет
от 30 до 60%. Разработка новых технологий, эффективно снижающих
заболеваемость вирусными инфекциями для картофеля, являются актуальной
задачей сельскохозяйственной биотехнологии. В этой связи исследования
молекулярных механизмов супрессии РНК-интерференции, используемой
данным вирусом в растениях картофеля, представляются весьма актуальными.
Также весьма перспективными представляются поиски возможных механизмов
защиты от РНК-интерференции, которые могут быть использованы в
биоинженерии растений для повышения экспрессии трансгенов, кодирующих
ценные белки. Познание этих механизмов послужит созданию эффективных
биотехнологий защиты растений методами генетической инженерии.
Успехи молекулярной биологии, генетической и клеточной инженерии
высших растений, достигнутые в последние годы, способствовали созданию
новых сортов ряда культурных растений с заданными свойствами, в том числе
увеличение урожайности, усиление устойчивости к неблагоприятным
экологическим факторам окружающей среды, ряду вирусных заболеваний.
В данной работе рассмотрена экология вируса с точки зрения стратегии
его выживания и защитных механизмов, выработанных вирусом в процессе
эволюции.
Объект исследования. М вирус картофеля, его геномная (г)РНК; растения
семейства Solanaceae - табак (N. benthamiana линии 16С) и картофель (Solanum
tuberosum).
Предмет исследования. Белки М-вируса картофеля, супрессирующие
процесс RNAi.
Цель исследования. Изучение на молекулярно-генетическом и
организменном уровне экологии PVM в растениях семейства паслёновых,
обладающих различной чувствительностью к инфекции, путём определения
специфических белков PVM, которые вызывают супрессию процесса РНКи в
зараженных клетках растения-хозяина.
Задачи исследования.
1. Анализ геномной РНК PVM для выявления открытых рамок считывания
(ОРС), а также консервативных нуклеотидных последовательностей, наиболее
подходящих в качестве мишеней при индукции РНК-интерференции в
генетически модифицированных растениях.
2. Дизайн и синтез олигонуклеотидных праймеров, а также амплификация
кДНК-фрагментов, которые содержат ОРС2 - ОРС6, кодирующие белки PVM.
3. Клонирование каждого из амплифицированных кДНК-фрагментов в
бактериальных и растительных экспрессионных векторах.
4. Экспрессия каждой из клонированных ОРС в модельных индикаторных
растениях (N. benthamiana линии 16С) из семейства Solanaceae и
идентификация белков PVM – супрессоров РНК-интерференции.
5. Создание рекомбинантных ДНК-конструкций, которые несут в прямой и
обратной ориентациях нуклеотидные последовательности ОРС гРНК,
кодирующие белки PVM с установленной RNAi-супрессорной активностью,
для получения трансгенных растений с генетически закрепленной
устойчивостью против PVM.
Методы исследования. В работе использованы как классические методы
микробиологии и вирусологии, так и современные методы молекулярной
биологии, генной и растительной биоинженерии.
Основные результаты исследования и их новизна. Впервые проведено
систематическое исследование способности многих белков М-вируса картофеля
подавлять процесс РНК-интерференции в инфицированных клетках растений
семейства Solanaceae.
Для этого кДНК-фрагменты гРНК PVM, содержащие ОРС2 (25К), ОРС3
(12К), ОРС4 (7К), ОРС5 (34К) и ОРС6 (11К) клонированы в растительном
экспрессионном векторе pMDC32 под контролем 35S промотора CaMV и nosтерминатора транскрипции, и каждая конструкция была трансфецирована в
клетки Agrobacterium tumefaciens штамма C58.
Методом коинфильтрации с агробактериями каждая из клонированных
ОРС была экспрессирована в индикаторных растениях Nicotiana benthamiana
(линии 16С), что позволило впервые идентифицировать белки PVM, наиболее
интенсивно супрессирующие РНК-интерференцию:
 12К-протеин (TGBp2, кодируемый ОРС3); и
 34К-протеин (СР, кодируемый ОРС5).
Значительно меньшую супрессорную активность проявляют 25К-протеин
(TGBp1, кодируемый ОРС2) и 11К-протеин (CYS-белок, кодируемый ОРС6), а
белок, кодируемый ОРС4 (7К-протеин или TGBp3), супрессорной активности
не имеет.
Впервые созданы экспрессируемые в растениях конструкции, в которых
кДНК-гены PVM, кодирующие установленные белки-супрессоры RNAi (12К и
34К), клонированы в прямой и обратной ориентации для индукции у
трансгенных растений картофеля процесса RNAi против гРНК PVM и других
родственных вирусов.
Получены трансгенные растения картофеля, содержащие в геноме
последовательности генов PVM, кодирующих белки TGBp2 (12К) и белка
оболочки (34К) в смысловой и антисмысловой ориентации.
Новизна работы заключается в том, что впервые выявлены белки PVM TGB2 (12К-протеин) и белок оболочки (СР или 34К-протеин), обладающие
наиболее выраженной активностью в подавлении РНК-интерференции у
растений семейства пасленовых.
Теоретическое и практическое значение работы. Исследование
биогенеза РНКи на растительных объектах является перспективным для
познания молекулярных механизмов защиты от вирусных заболеваний. Для
выбранного объекта – МВК – такие исследования являются приоритетными. До
настоящего времени белкам-супрессорам МВК уделялось сравнительно
немного внимания и в данном проекте они будут исследованы впервые.
Впервые проведен поиск и идентификация белков PVM, подавляющих
защитный механизм RNAi клеток картофеля – естественного хозяина этого
вируса. Знание этих белков и механизмов их действия позволит с помощью
методов генной и клеточной инженерии создавать перспективные исходные
линии картофеля с повышенной и генетически закрепленной устойчивостью
против PVM, а также против близких ему по строению вирусов (PVS, PVX).
Культивирование растений картофеля с генетически закрепленной
устойчивостью к патогенным вирусам, позволит значительно (в 2-3 раза)
повысить его урожайность и снизить необходимость применения пестицидов и
инсектицидов, что должно сэкономить сотни миллионов тенге, а также
благоприятно сказаться на оздоровлении экологической обстановки в
республике Казахстан.
Публикации. Основные содержание диссертации изложено в 20 печатных
работах, из них: 3 статьи в зарубежных научных журналах, входящих в базы
данных Thomson Reuters и Scopus; 7 статей в журналах РК, рекомендованных
Комитетом науки МОН РК; 6 тезисов в материалах конференций зарубежья, 3
тезиса в материалах международных конференций РК; 1 инновационный патент
(принята заявка, регистрационный №2014/0167.1, дата поступления 12.02.2014).
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 103
страницах и включает Введение, Обзор литературы, Материалы и методы
исследования, Результаты исследования и обсуждение, Заключение, Список
использованных источников из 270 наименований. Работа содержит 23 рисунка
и 7 таблиц.