Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН На правах рукописи Симакова Мария Николаевна ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ СИСТЕМ ИНФИЦИРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ Т4 И PHIKZ И НЕКОТОРЫХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ 03.01.02 – биофизика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель: доктор химических наук Мирошников Константин Анатольевич Москва 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5 ГЛАВА 1 ПРОБЛЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ ВИРУСНЫХ И МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ (литературный обзор)...............................…...........……………………….................13 1.1 Сведения о структуре бактериофага Т4………............................................13 1.2 Адсорбция бактериофага Т4 на бактерии.....................................................14 1.3 Длинные хвостовые фибриллы (ДХФ) ....................................................….16 1.3.1 Функциональная роль ДХФ...................................................................…..16 1.3.2 Физико-химические характеристики белкового комплекса ДХФ…….17 1.3.3 Структурная характеристика белков ДХФ.......................................….....18 1.4 Короткие хвостовые фибриллы (КХФ)..............................................….......21 1.4.1 Функциональная роль КХФ.......................................………….……...…..21 1.4.2 Молекулярная организация КХФ............................…........................….. 22 1.5 Бактериофаг phiKZ…………………………………………………….…….24 1.6 Фаговая терапия. Энзибиотики………………………………………..……25 1.7 Мембранные белки……………………………………………………….….27 1.7.1 Бактериородопсин в пурпурных мембранах галобактерий……….……27 1.7.2 Структура и фотоцикл бактериородопсина………………………….…..33 1.7.3 Экспрессия бактериородопсина в различных системах………….……..38 1.7.4 Практическое применение бактериородопсина в технике………….…..42 1.8 Методы теоретического исследования структуры белков…………..……45 1.9 Вторичная структура белков.................................................................….…48 1.9.1 Варианты -спирального coiled-coil..................................................….…48 1.9.2 Элементы -структуры в фибриллярных белках вирусов и бактериофагов..........................................................................................50 1.9.3 Элементы вторичной структуры в трансмембранных белках …….…..51 1.10 Выводы по главе и постановка задач исследования…………………......55 3 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ…………….....….59 2.1 Материалы, использованные в эксперименте по исследованию белков бактериофагов Т4 и phiKZ (штаммы, ферменты, реактивы).....................59 2.2 Материалы, использованные в эксперименте по исследованию бактериородопсина и его делеционных мутантов (штаммы, ферменты, реактивы)…………………………………………..61 2.3 Методы генной инженерии.................................................................….…...65 2.3.1 Методы генной инженерии, использованные в эксперименте по исследованию белков бактериофагов Т4 и phiKZ…………………………………………………………………65 2.3.2 Особенности методов генной инженерии, использованных при исследовании белка gp181 бактериофага phiKZ с помощью направленного делеционного мутагенеза………………………….……69 2.3.3 Методы генной инженерии, использованные при исследовании бактериородопсина и его делеционных мутантов…………………………………………….72 2.4 Методы компьютерного анализа и биоинформатики, применяемые для теоретического исследования белков……………………………………..85 2.4.1 Методы биоинформатики для исследования периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4…………………………………………………………..85 2.4.2 Вычислительные методы предсказания вторичной структуры мембранных белков по их аминокислотной последовательности…….92 2.5 Заключение по главе 2………………………………………………….…...95 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ….…...97 3.1 Исследование периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках и литических ферментах бактериофагов Т4 и phiKZ методами биоинформатики ………………………………….97 4 3.2 Экспериментальное исследование белков систем инфицирования бактериофагов Т4 и phiKZ …………...........................................................108 3.3 Результаты предсказания вторичной структуры мембранных белков вычислительными методами по их аминокислотным последовательностям……………………………………………...……….119 3.4 Экспериментальное исследование бактериородопсина (bR) и его делеционных мутантов………………………………………………135 ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................…..........157 СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ..........................................….160 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................…...........162 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Белки играют чрезвычайно важную роль почти во всех биологических процессах. Они имеют разнообразное строение и функционируют в различных клетках и тканях. Поэтому исследование структуры белков, которая определяет их функциональные свойства, является очень важной, интересной и актуальной проблемой для молекулярной биологии, медицины и фармакологии. В природе существует группа (биологический таксон) различных вирусов - бактериофагов, объединенных одним общим признаком: все они размножаются в бактериальных клетках. Бактериофаги имеют важное значение при изучении структурно-функциональной организации биологических макромолекул и механизмов сборки надмолекулярных комплексов и вирусов [1-7]. Классическим объектом для изучения на молекулярном уровне является бактериофаг Т4. Вирусные фибриллярные белки и литические ферменты играют основную роль в процессе инфицирования вирусом клетки-хозяина. Поэтому определение структуры таких белков, изучение их функциональных доменов и механизмов их взаимодействий с клеточными рецепторами являются очень важными аспектами в развитии методов контроля и борьбы с вирусными инфекциями. Фибриллярные белки и литические ферменты вирусов являются также удобными модельными объектами для изучения механизмов генетической рекомбинации и фолдинга белка. Кроме того, такие области медицинской биоинженерии, как, например, генная терапия или терапия рака, основаны на использовании вируса как носителя здорового гена или как "оружия" против раковых клеток. Поэтому изучение структур и свойств вирусных белков, их классификация, а также создание искусственных белков методами белковой инженерии являются не только интересными, но и необходимыми задачами. 6 Мембранные белки являются основными участниками очень большого числа клеточных процессов. С помощью мембранных белков осуществляется транспорт внутрь клетки и наружу огромного количества различных ионов, питательных веществ, отходов, гормонов, лекарств и таких больших молекул, как белки и ДНК. Мембранные белки также в значительной мере ответственны за коммуникацию между клетками и окружающей их средой и за процессы энергетического обмена. Клетки производят огромное количество мембранных белков. Так, приблизительно 25% генов в геноме человека кодируют мембранные белки. Медицинское значение при изучении этого огромного семейства белков не может быть переоценено. Мутации, происходящие в мембранных белках, являются причинами возникновения большинства распространенных заболеваний, таких как болезни сердца и головного мозга, а также рак. Таким образом, с биомедицинской точки зрения можно отметить, что мембранные белки составляют приблизительно 50% возможных мишеней для применения новых лекарственных препаратов, начиная от препаратов, действующих на нервную систему, и до новой антимикробной терапии. Поэтому изучение структуры и функциональных свойств мембранных белков является одной из самых актуальных задач современной структурной биологии. Диссертационная работа выполнялась в ИБХ им. Шемякина и Овчинникова РАН, в Институте комплексных систем Научно- исследовательского центра г. Юлиха (Германия), Институте структурной биологии г. Гренобля (Франция). Исследования по теме данной диссертации проводились при финансовой поддержке РФФИ по проектам № 02-04-50012-a и № 05-0449636-a, а также по плану НИР для государственного контракта № 02.740.11.0299 по теме: “Клеточная биология и физические свойства мембранных белков”. 7 Целями и задачами данной работы явились исследования структуры и свойств 3-х типов белков, а, именно: фибриллярных белков бактериофага Т4 Escherichia coli, литического фермента бактериофага phiKZ Pseudomonas aeruginosa и интегральных мембранных белков, в частности, бактериородопсина Halobacterium salinarum с использованием комбинации теоретических и экспериментальных методов. В теоретической части исследований, включающей применение методов биоинформатики и компьютерного моделирования, цель работы достигалась решением следующих задач. 1. Выбор оптимального варианта преобразования Фурье для анализа периодичности аминокислотных последовательностей в различных белках. Исследование периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 и анализ аминокислотной последовательности Pseudomonas литического aeruginosa с фермента помощью бактериофага phiKZ оптимизированного метода преобразования Фурье с целью предсказания вторичной структуры этих белков. 2. Применение оптимального варианта метода Фурье для исследования периодичности расположения аминокислот гидрофобной группы в последовательностях мембранных белков для предсказания их вторичной структуры; разработка и использование нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белков, основанного на применении функции и шкалы гидрофобности для предсказания вторичной структуры мембранных белков; сравнение оптимизированного метода преобразования Фурье и нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белков между собой и с другими известными методами. В экспериментальной части исследований, включающей использование ряда генетических, биохимических и биофизических методов, цель работы достигалась решением следующих задач. 8 1. Создание плазмидных векторов для рекомбинантной экспрессии в клетках E. coli двух фибриллярных белков – продуктов генов бактериофага Т4 E. coli, нескольких бактериофага делеционных phiKZ мутантов Pseudomonas литического aeruginosa, фермента бактериородопсина Halobacterium salinarum и нескольких его делеционных мутантов. 2. Выделение и препаративных очистка полученных количествах для рекомбинантных предполагаемой белков в последующей кристаллизации, решения их структуры и выяснения функций. 3. Исследование ферментативной активности нескольких делеционных мутантов литического фермента бактериофага phiKZ, а также анализ их КД-спектров. Научная новизна работы заключается в следующем. 1. С использованием наиболее оптимального преобразования Фурье установлена определенная периодичность в 8-ми исследованных белках систем инфицирования бактериофагов Т4 и phiKZ (для 6-ти из них впервые) и в 24-х мембранных белках. Для 2-х вирусных и 14-ти мембранных полученные белков установлено, что результаты о периодичности согласуются с известными данными об их структуре. 2. Впервые обнаружены относительно большие периоды расположения аминокислот, которыми последовательности всех 6-ти исследованных фибриллярных белков бактериофага Т4 делятся на 4 или 6 равных частей. 3. Впервые получены экспериментальные данные о ферментативной активности и структуре рекомбинантных белков, выделенных при экспрессии делеционных мутантов литического фермента бактериофага phiKZ. Так, было установлено, что белок gp181E, полученный в результате экспрессии делеционного мутанта, кодирующего С-концевую часть литического фермента, является гидрофобным и взаимодействует с различными штаммами клеток Pseudomonas aeruginosa, но не лизирует их, 9 в отличие от белка, полученного при экспрессии делеционного мутанта gp181MA, кодирующего лизоцимный домен литического фермента. С помощью гель-фильтрации было установлено, что белок gp181E является не мономером, а димером или тримером. Анализ КД-спектров полученных рекомбинантных белков привел к выводу о том, что их вторичная структура, по-видимому, представляет собой -спиральный coiled coil. Теоретическое предположение о роли C-концевого домена литического фермента (белка gp181E), как сенсорной “молекулярной” иглы, участвующей в процессе инфицирования бактериофагом phiKZ клетки, получило дополнительное экспериментальное обоснование вышеприведенными новыми данными о свойствах делеционных мутантов gp181. 4. Плазмида pUCBM20 и модифицированная плазмидная конструкция NTS11233 на основе белков MBP и TrxA впервые были использованы для клонирования и экспрессии бактериородопсина и двух его делеционных мутантов в E. coli. Теоретическая и практическая значимость работы. 1. Данные о периодичности фибриллярных белков бактериофага Т4, полученные с помощью преобразования Фурье, впоследствии были использованы при конструировании методами генной инженерии биологически активного химерного белка, состоящего из фрагмента фибриллярного белка gp37 и C-концевого домена белка gp5 бактериофага Т4. Технология с использованием такого химерного белка в дальнейшем позволила преодолеть ряд проблем рекомбинатной экспрессии целевого белка gp37. 2. Полученные данные о периодичности исследованных белков в сочетании с результатами кристаллографических и электронно-микроскопических 10 экспериментов могут быть полезными при установлении для этих белков элементов вторичной и третичной структуры. 3. Сравнение результатов, компьютерного анализа полученных в данной аминокислотных работе путем последовательностей мембранных белков с известными данными об их структуре, показало применимость обоих предложенных методов: оптимизированного метода преобразования Фурье и нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белков как по отдельности, так и совместно, для предсказания признаков неизвестной вторичной структуры 24-х мембранных белков и обусловленных этими признаками функциональных свойств этих белков. Ценность обоих методов простота, быстрота и экономичность применения. 4. Результаты, полученные в экспериментах по клонированию и экспрессии бактериородопсина и двух его делеционных мутантов в E. coli, могут иметь практическое значение при решении проблемы выбора определенной гетерологичной системы для экспрессии конкретного мембранного белка. Они частично отвечают на вопрос: почему для экспрессии специфического мембранного белка стоит (или не стоит) использовать определенный вектор в сочетании с клеткой-хозяином и условиями культивирования? Так, полученные нами экспериментальные данные показали, что экспрессионная система на основе белков MBP и TrxA, впервые использованная для экспрессии бактериородопсина в E. coli, не является оптимальной из-за малого выхода целевого белка и трудностей, возникающих в процессе его очистки. Автор защищает следующие положения. 1. Обоснование выбора метода преобразования Фурье для анализа периодичностей аминокислотных последовательностей в различных белках, оптимального по наибольшей достоверности частотного спектра Фурье, простоте алгоритма и экономичности вычислений. 11 2. Применение выбранного оптимального метода преобразования Фурье к анализу периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 и белке gp181 бактериофага phiKZ Pseudomonas aeruginosa, что в результате позволило выявить в последовательностях фибриллярных белков не только малые периоды чередования аминокислот, но и относительно большие периоды их следования. 3. Предсказание структурных особенностей белков систем инфицирования бактериофагов T4 и на phiKZ основе теоретического анализа, использованное при создании плазмидных векторов для экспрессии 3-х делеционных мутантов белка gp181 с последующим выделением и очисткой полученных рекомбинантных белков. 4. Экспериментальное исследование ферментативной мутантов белка gp181, анализ их КД-спектров, активности 2-х выводы о вторичной структуре С-концевого домена белка gp181 бактериофага phiKZ,. 5. Разработку и применение, наряду с вышеупомянутым оптимизированным методом преобразования Фурье, нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков мембранных белков для предсказания вторичной структуры этих белков, основанного на использовании функции и шкалы гидрофобности, более предпочтительного по сравнению методом Фурье и другими известными методами. Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Национальных и Международных конференциях: “Математические методы в технике и технологиях” - XXV Международная научная конференция (Харьков, 2012), “Математические методы в технике и технологиях” - XVII Международная научная конференция (Кострома, 2004), “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” - XVI Зимняя молодежная научная школа ИБХ РАН 12 (Москва, 2004), “Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук” - XLVI Научная конференция МФТИ (Москва-Долгопрудный, 2003), и на научных семинарах: в Лаборатории молекулярной биоинженерии ИБХ РАН (Москва, 2003-2005), в Институте Комплексных Систем (ICS-5: Молекулярная биофизика, 20092012) Научно-исследовательского центра г. Юлиха (г. Юлих, Германия), Институте Структурной Биологии (г. Гренобль, Франция, 2011). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, включая Литературный обзор, Материалы и методы исследований, Результаты исследований и их обсуждение, и заключения, содержит 158 страниц основного текста, 48 рисунков, 7 таблиц, список цитируемой литературы из 196 наименований. Общий объем - 181 с. 13 ГЛАВА 1 ПРОБЛЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ ВИРУСНЫХ И МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ (литературный обзор) 1.1 Сведения о структуре бактериофага Т4 Бактериофаг Т4 E. coli является одним из самых сложных по строению вирусов [8]. Вирус состоит из капсида с геномной линейной двухцепочечной ДНК, сократительного чехла и базальной пластинки, к которой прикреплены хвостовые фибриллы (рисунок 1.1). Геном фага имеет размер около 168000 пар оснований и содержит порядка 300 открытых рамок считывания [9]. Рисунок 1.1 - Бактериофаг Т4: a – капсид с геномной ДНК, b – хвост, c – длинные хвостовые фибриллы [10] Капсид имеет форму икосаэдра. Хвост состоит из сократимого чехла, жесткого полого стержня и базальной пластинки. Именно хвост отвечает за введение фаговой ДНК в клетку-хозяина и обеспечивает высокую эффективность инфицирования, доходящую до 100%. Головка фага присоединена к хвосту с помощью воротничка с бакенбардами. Длинные хвостовые фибриллы отвечают за специфичность узнавания клетки-хозяина. 14 1.2 Адсорбция бактериофага Т4 на бактерии Инфицирование фагом клетки E. coli начинается с обратимого связывания длинных хвостовых фибрилл (ДХФ) с липополисахаридными рецепторами на поверхности бактерии [11]. После того как произошло связывание не менее 3-х ДХФ, короткие хвостовые фибриллы (КХФ) разворачиваются под базальной пластинкой и необратимо связываются с другим типом рецепторов на внешней мембране клетки-хозяина [12]. Затем происходит реорганизация базальной пластинки из шестиугольной формы в форму шестиконечной звезды [12]. Одновременно с этим инициируется сокращение фагового чехла, и происходит инжекция фаговой ДНК в цитозоль клетки через хвостовой стержень, который проникает под мембрану бактерии [11]. В результате сокращения длина фагового чехла уменьшается с 95 нм до 38 нм. Это проникновение осуществляется благодаря комплексу белков gp5 и gp27 (в составе базальной пластинки), который, проходя сквозь внутреннюю мембрану, разрушает слой пептидогликана, позволяя ДНК бактериофага оказаться внутри клетки бактерии [13]. Gp5 представляет собой структурный белок, имеющий функциональный домен, обладающий свойствами лизоцима [14]. Данный белок входит в состав “машины” проникновения ДНК в клетку и состоит из трех доменов (рисунок 1.2). N-terminal OBfold domain 1 Linker1 129 Lysozyme domain 174 339 gp5* C-terminal domain Linker2 351 389 352 575 gp5C Рисунок 1.2 - Схематичная презентация доменов в gp5 бактериофага Т4 [13] Предположительно заключается в функция связывании ОВ (oligosaccaride олигосахаридов binding)-домена периплазматического 15 пептидогликанового слоя для последующего расщепления лизоцимным доменом. Лизоцимный домен gp5* локализован на С-конце молекулы. Он связан линкером 1 с богатым β-структурами ОВ доменом и с помощью линкера 2 - с β-структурным доменом на С-конце молекулы. Между С-концевым доменом и доменом лизоцима локализован сайт расщепления gp5 при созревании. C-концевой домен представляет собой βструктурный домен, который, по-видимому, входит в цилиндрическую структуру, образуемую тримерами gp27, и служит каналом для проникновения ДНК внутрь клетки (рисунок 1.3). Рисунок 1.3 - Структура комплекса белков gp5-gp27 [13] Когда gp5 встраивается в состав базальной пластинки бактериофага Т4, происходит протеолитическое расщепление gp5 с образованием двух продуктов: gp5* и gp5С, причем оба из них остаются в структуре базальной пластинки. Gp5С – это SDS-устойчивый белок с богатой β-структурной составляющей [15]. Комплекс gp5 и gp27, наблюдаемый и in vitro, и in vivo, образует гетералогичный ансамбль (gp27-gp5*-gp5С)3. При повышении температуры комплекс распадается на три гетеродимера (gp27-gp5*) и гомотример (gp5С)3. 16 Процесс инфицирования не требует энергии извне. Спустя 30 минут после инфицирования происходит разрушение бактериальной клетки, и из нее выходят около 100 новых фаговых частиц. 1.3 Длинные хвостовые фибриллы (ДХФ) 1.3.1 Функциональная роль ДХФ Длинные хвостовые фибриллы инициируют адсорбцию фага на поверхности бактериальной клетки [16]. Мутанты бактериофага, в которых отсутствуют ДХФ, неинфекционны. Однако при этом присоединение таких мутантов к бактерии наблюдается, хотя оно и не сопровождается сокращением хвостового чехла и вводом фаговой ДНК в цитозоль клеткихозяина [17]. Известно, что связывание всех длинных и коротких фибрилл с клеточными рецепторами является необратимым [18], однако точное количество рецепторов, необходимое для этого, не определено. При взаимодействии с рецепторами трех длинных хвостовых фибрилл из шести связывание фага с клеткой является обратимым [11]. Процесс прикрепления бактериофага Т4 к поверхности клетки E. coli осуществляется при взаимодействии дистальной (удаленной от базальной пластинки) части ДХФ с глюкозно-гептозным участком липополисахаридных рецепторов клетки [11]. Непосредственной группой взаимодействия является терминальная -(1-4)-глюкоза [19]. Адсорбция фага с помощью длинных фибрилл сопровождается механизмом запуска структурной реорганизации базальной пластинки, в результате которой происходит сокращение чехла и введение ДНК в клетку [11, 12]. Предполагают, что по длинным хвостовым фибриллам передается сигнал (вероятно, через медиатор – белок gp9) о наличии соответствующих рецепторов, после чего начинается конформационная перестройка базальной пластинки [20, 21]. После присоединения к клеточной стенке коротких фибрилл перестройка базальной пластинки завершается. 17 1.3.2 Физико-химические характеристики белкового комплекса ДХФ Препарат длинных хвостовых фибрилл был впервые выделен в 1959 году в результате разрушения фага [22]. В дальнейшем были разработаны методики получения длинных хвостовых фибрилл и в неденатурирующих условиях [23, 24]. Согласно результатам, полученным с помощью электронной микроскопии, длинные хвостовые фибриллы имеют размеры 150 х 4.5 нм с утолщением в середине, которое разделяет их на две части по отношению к базальной пластинке фага – проксимальную (прилежащую к базальной пластинке) и дистальную (удаленную) [25]. Дистальная и проксимальная половинки фибрилл расположены друг к другу под углом около 156o. Они соединены жестко, но нековалентно. С базальной пластинкой ДХФ связаны подвижно, что позволяет им перемещаться относительно частицы фага. В формировании фибрилл участвуют шесть генов, из которых четыре кодируют структурные белки – gp34, gp35, gp36 и gp37, а два другие гена кодируют белки – gp38 и gp57, которые помогают при сборке, но не включаются в конечную структуру. Впоследствии были определены нуклеотидная последовательность этих генов и аминокислотный состав кодируемых ими структурных белков [1, 26]. Молекулярные массы белков представлены в таблице 1.1. Стехиометрия белкового комплекса длинных хвостовых фибрилл в течение длительного времени не была точно установлена. Данные, полученные при исследовании белков расчетными методами [27], анализом нуклеотидной последовательности генов [2], количественным SDS- электрофорезом c использованием красителей [28] и радиоактивных меток [29] и сканирующей электронной микроскопией (STEM) [30], существенно различались. Однако в результате совершенствования экспериментальных методик и накопления сведений о структурной организации других 18 фибриллярных белков вирусной природы, а также коротких хвостовых фибрилл бактериофага Т4 [31], была выдвинута гипотеза [30], что для длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4 характерна тримерная организация структурных белков, т.е. стехиометрическое соотношение белков gp35, gp34, gp36, gp37 составляет соответственно 1:3:3:3. Из экспериментальных данных известно, что проксимальная часть длинных хвостовых фибрилл является гомоолигомером gp34. Дистальная же часть сформирована продуктами трех генов: gp35, gp36 и gp37 [2, 27]. Сборка дистальной половинки начинается с тримеризации gp37, в результате чего образуется предшественник фибриллы длиной около 65 нм [2]. На следующем этапе присоединяются три копии gp36 c удлинением предшественника на 17 нм [2]. Формирование длинных хвостовых фибрилл завершается присоединением одной копии gp35, играющего роль соединителя двух половинок фибрилл. Таблица 1.1 - Молекулярные массы белков длинных хвостовых фибрилл [2, 27] Белок gp34 gp35 gp36 gp37 gp38 gp57 Молек. 120 - 160 31 - 40 24 – 27 100 – 130 23 – 26 8 – 12 не преодолены масса, кДа 1.3.3 Структурная характеристика белков ДХФ В настоящее время еще окончательно экспериментальные сложности в получении белков длинных хвостовых фибрилл в индивидуальном состоянии, как выделенных из бактериофага, так и рекомбинантных. Поэтому анализ их структурной организации в основном базируется на данных об аминокислотной последовательности. В проксимальной и дистальной половинках длинных хвостовых фибрилл выявлены все канонические элементы вторичной структуры, существование которых подтверждено анализом спектров кругового дихроизма [24, 25] (таблица 1.2). 19 Таблица 1.2 - Содержание элементов вторичной структуры (%) в длинных хвостовых фибриллах бактериофага Т4 (расчет из спектров кругового дихроизма) [24] -спираль -структура Половинка -изгиб Неупорядоченная фибрилл структура Проксимальная 28 41 11 20 7 54 12 26 (gp34) Дистальная (gp36 + gp37) Высокоразрешающая микроскопия STEM позволила выделить в структуре длинных хвостовых фибрилл ряд характерных доменов [30], помимо ранее известного проксимального утолщения [2]. Так, в проксимальной части фибрилл были обнаружены три глобулярных домена (Р3 – Р5). Дистальная часть состояла из набора утолщений разных размеров, распределенных вдоль нитей [32]. Позже положение утолщений было уточнено и открыто еще три домена (D1 – D3), непосредственно прилежащих к соединительному “колену” [30]. Распределение доменов длинных хвостовых фибрилл по массе позволило сопоставить их положение и аминокислотную последовательность с высокой точностью (рисунок 1.4, таблица 1.3). Рисунок 1.4 - Изображения длинной хвостовой фибриллы (b), а также проксимальной (а) и дистальной (с) ее частей, полученные микроскопией STEM темного поля. Положение соединительного “колена” ДХФ указано на (b). Домены ДХФ указаны на (d) [30] 20 Таблица 1.3 - Положение и массы доменов длинных хвостовых фибрилл [21] Проксимальная половинка Домен Дистальная половинка Остатки gp34 2 – 422 Домен P1 Масса, кДа 141 D3 Масса, кДа 28 Остатки gp37 2 - 82 P2 151 423 – 893 D4 36 83 - 191 P3 33 894 – 996 D5 49 192 - 341 P4 30 997 – 1091 D6 32 342 - 440 P5 52 1092 – 1247 D7 38 441 - 557 “колено” - 1248 – 1289 D8 29 558 - 650 D9 49 651 - 802 D10 38 803 - 925 D11 31 926 - 1026 Между самими модулями одного и того же белка гомология практически не наблюдается, в то время как с аналогичными модулями подобных белков других фагов гомология последовательности порой достигает 90% [30, 31, 33]. Особый интерес вызывает структура домена, расположенного на Сконце gp37, который представляет собой тонкую, но жесткую “иглу” размером ~ 2.5 15 нм на конце дистальной половинки длинных фибрилл. Этот домен (D11) содержит шесть гомологичных мотивов TxxxGxHxH или “гистидиновых рамок” [34]. Существенное содержание остатков глицина позволяет предположить, что структура “иглы” отличается от структуры остальной части длинных хвостовых фибрилл. В качестве гипотетической структуры домена D11 была предложена полиглициновая тройная спираль типа II [35], которая недопустимо ниже имеет расчетную плотность ~1.0 нм/кДа, что значения, полученного экспериментально [30]. Альтернативная гипотеза предполагает наличие в “игле” коллагеноподобной тройной спирали [36], что лучше согласуется с экспериментальными данными. Эта модель, однако, не обеспечивает жесткость, наблюдаемую в 21 домене D11 ДХФ. Таким образом, вопрос о структуре “иглы”, равно как и остальных частей длинных хвостовых фибрилл, остается открытым. Интересным является также исследование функциональных свойств домена D11. Именно “игла” длинных хвостовых фибрилл содержит сенсоры, которые распознают липополисахаридные рецепторы на поверхности клетки E. coli. Другие вирусы Т-четной группы имеют сходную локализацию сенсоров, которые, тем не менее, реагируют на другие типы рецепторов [2, 26, 37]. Установлено, что количество гистидиновых рамок и их взаимное расположение существенно влияет на специфичность выбора бактериофагом клетки-хозяина [37]. Таким образом, исследование структуры “иглы” длинных хвостовых фибрилл интересно не только с точки зрения структурной биологии, но и представляет практический интерес для генетики и медицины. 1.4 Короткие хвостовые фибриллы (КХФ) 1.4.1 Функциональная роль КХФ Короткие хвостовые фибриллы входят в состав базальной пластинки бактериофага Т4. Они представляют собой протяженные структуры, которые обеспечивают необратимость адсорбции и инфекционность фага [38, 39]. После того, как длинные хвостовые фибриллы связались с липополисахаридными рецепторами на поверхности клеточной стенки, короткие фибриллы, находящиеся в свернутом состоянии, разворачиваются и взаимодействуют со своими клеточными рецепторами. После разворачивания фибрилл, которое приводит к перестройке базальной пластинки из гексагональной формы в форму шестилучевой звезды, длина коротких хвостовых фибрилл становится равной 40 нм [16]. Этот процесс вызывает сокращение хвостового чехла и последующее введение ДНК фага в бактериальную клетку [20]. Известно, что рецепторами для длинных хвостовых фибрилл являются липополисахариды клеточной стенки E. coli [11, 19]. Вероятно, рецепторы 22 коротких хвостовых фибрилл, которые также имеют липополисахаридную природу, отличаются от рецепторов, необходимых для взаимодействия с длинными хвостовыми фибриллами. Было показано, что участки связывания с клеточными рецепторами у длинных и коротких фибрилл имеют гомологию аминокислотной последовательности, но не идентичны [40]. Также наблюдается взаимодействие коротких фибрилл с рецепторами клеток E. coli штамма В/4, на котором не могут сорбироваться длинные хвостовые фибриллы [41]. Короткие хвостовые фибриллы обеспечивают инфекционность фаговой частицы. Дефектные фаговые частицы, у которых отсутствуют короткие хвостовые фибриллы, не являются инфекционными [39, 42], в то время как обработка клетки E. coli изолированными короткими фибриллами или полными фагами приводит к ее гибели [38]. Механизм инфицирования пока до конца не определен, хотя предполагается, что короткие хвостовые фибриллы принимают участие в образовании трансмембранных каналов. Добавление фага Т4 или коротких фибрилл к суспензии компетентных клеток E. coli приводит к утечке ионов калия из клетки и нарушению энергетического потенциала мембраны [42]. 1.4.2 Молекулярная организация КХФ Структурный белок коротких хвостовых фибрилл бактериофага Т4 кодируется геном 12, входящим в кластер поздних генов базальной пластинки [39, 40]. Каждая короткая фибрилла является гомотримером gp12 [38, 43], в состав которого также входит 1 атом цинка на каждую копию gp12 [43]. В сборке коротких хвостовых фибрилл участвует собственный шаперон бактериофага Т4 – gp57 [27]. При изучении структурной организации коротких хвостовых фибрилл и gp12 возникают некоторые затруднения, связанные с тем, что выделенный белок сильно агрегирует и необратимо сорбируется на многих хроматографических носителях [39, 41]. Была 23 разработана методика выделения и очистки gp12 в присутствии мочевины и последующего рефолдинга [42], а также выделения целых КХФ в неденатурирующих условиях [31]. С помощью этой методики удалось получить относительно стабильный в растворе препарат, исследование которого позволило получить ряд детальных сведений о структуре и функциях gp12. По данным электронной микроскопии длина коротких хвостовых фибрилл составляет 38-52 нм, а диаметр около 2.5 нм. Один из концов фибриллы, соответствующий С-концу gp12, имеет массивную “головку” длиной около 10 нм. Вдоль белковой молекулы распределены восемь бусообразных утолщений диаметром 3.3-3.8 нм [31, 41], в ее середине располагается гибкая перемычка. Короткая хвостовая фибрилла заканчивается доменом длиной около 4 нм. Этот домен, соответствующий N-концу gp12, отвечает за прикрепление фибриллы к базальной пластинке и расположен глубоко в теле фага [31]. Основной фрагмент полипептидной цепи gp12 (остатки 48…320) состоит из шести тандемных повторов, в каждом из которых около 40 а.о. и еще двух более коротких, но подобных одиночных повторов [31]. С помощью компьютерных методов была предсказана вторичная структура этих повторов, представляющая собой набор чередующихся -тяжей и изгибов. Повторы gp12 имеют довольно высокую степень гомологии с аналогичными повторами длинных хвостовых фибрилл. Предполагается, что переход базальной пластинки из гексагонального состояния в звездообразное [20] сопровождается конформационным изменением gp12 [31]. Такой переход обусловлен наличием гибкой области существованием двух изоформ gp12 c pI 7.0 и 7.2 [44]. и согласуется с 24 1.5 Бактериофаг phiKZ Бактериофаг phiKZ – это вирус, который инфицирует бактерию Pseudomonas aeruginosa, являющуюся патогенной для человека. Его геном имеет размер 280334 пар оснований и является линейной, переставляемой по кругу и избыточной на концах А+Т-богатой двухнитевой молекулой ДНК [45]. ДНК бактериофага phiKZ не имеет заметной гомологии в последовательности с другими вирусами и микроорганизмами и не содержит сайты рестрикцирующих эндонуклеаз NotI, PstI, SacI, SmaI, XhoI и XmaIII. С помощью компьютерного анализа было установлено, что геном имеет 306 открытых рамок считывания, варьирующихся по размеру от 50 до 2237 аминокислотных остатков [46]. Сравнение этих выделенных аминокислотных последовательностей с другими аминокислотными последовательностями из баз данных для различных белков показало, что только 59 белков бактериофага phiKZ имеют четкую гомологию с белками, у которых функции известны. Кроме того, в белках бактериофага phiKZ были обнаружены 56 консервативных доменов. Подобные выводы были сделаны и при изучении бактериофага Т4, а именно: только 50 белков из 300 имеют заметную гомологию по аминокислотной последовательностями других последовательности белков. Низкая с гомология известными с другими бактериофагами как на уровне ДНК, так и на уровне белков ясно показывает, что бактериофаг phiKZ представляет собой ветвь, эволюционно отличную от ранее известных представителей семейства Myoviridae. Частица бактериофага phiKZ имеет сократимый хвост длиной ∼2000 Å и большой икосаэдрический капсид диаметром ∼1450 Å, содержащий двухнитевую ДНК (рисунок 1.5). Внутри капсида была обнаружена плотная спиральная структура, и было установлено, что суперспиральная геномная ДНК закручена вокруг этого “внутреннего тела” [47]. Большой размер капсида делает бактериофаг phiKZ удобным объектом для исследования с 25 помощью криоэлектронной микроскопии высокого разрешения и рентгеноструктурного анализа. phiKZ Т4 100 нм Электронная микрофотография − негативное контрастирование при 0.75% уранил формиата, рН 4.5. На вставке изображен капсид phiKZ с сократимым чехлом [46]. Рисунок 1.5 - Сравнение морфологии фагов phiKZ и Т4 1.6 Фаговая терапия. Энзибиотики Бактериофаг phiKZ эффективно инфицирует различные штаммы бактерии Pseudomonas aeruginosa, но он может быть полезен для разработки способов борьбы и с другими бактериальными инфекциями, например, для разработки фаговой терапии. Так, фаг phiKZ очень стабилен, его можно легко и быстро наработать, поэтому его производство коммерчески выгодно. Псевдомонады – это аэробные бактерии, которые имеют значительную научную и практическую важность. Они являются активными участниками процесса минерализации и участвуют в разрушении огромного числа различных органических соединений [48]. Некоторые виды псевдомонад, например, P. aeruginosa проявляют устойчивость к антибиотикам. P. aeruginosa – один из основных патогенов в ICU-пневмонии, первичной бактеримии при СПИДе и кистозном фиброзе [49]. Бактерия P. aeruginosa устойчива почти ко всем общеизвестным антибиотикам и первого, 26 и второго поколений, таким как пенициллин, цефалоспорин, тетрациклин, хлорамфеникол и ванкомицин. Совсем недавно с помощью многочисленных экспериментов было показано, что фаги могут спасать животных от различных видов смертельных инфекций, в том числе и от тех, которые вызываются бактерией P. aeruginosa [50, 51]. Бактериофаги могут быть эффективны в борьбе против бактериальных инфекций, которые не лечатся с помощью антибиотиков. Но в фаговой терапии есть ряд ограничений: это и трудность доставки фага к инфицированной области организма, и иммуногенность фаговых частиц, и потенциально патогенные участки ДНК в составе фагов. Так, в бактериофаге phiKZ обнаружены белки, которые имеют очень сильное сходство с белками опасных вирусов. Например, gp70 имеет домены, сходные с гемагглютинином, а gp164 имеет гомологию с гемолизином. Кроме того, большое количество белков патогенных организмов (H. influenzae, M. tuberculosis, V. cholerae, etc.) являются гомологами белков фага phiKZ, что подтверждает необходимость строгого контроля перед применением фаговой терапии. Предполагается, что некоторые из вредных генов, входящих в состав ДНК бактериофага phiKZ и кодирующих эти опасные белки, могли быть захвачены фагом при инфицировании бактерий. Другим новым методом борьбы с бактериальными инфекциями, устойчивыми к синтетическим антибиотикам, является использование литических ферментов бактериофагов. В работе [52] было показано, что муреиновая гидролаза из стрептококкового бактериофага G1, называемая лизином, убивает А стрептококки как in vitro, так и in vivo, при этом не действуя отрицательно на другие микроорганизмы. Кроме этого, в работе [53] также была установлена высокая скорость лизиса клеток Streptococcus pneumonae под действием литического фермента Pal из фага пневмококка. А в работах [54, 55] при совместном действии литических ферментов Pal и Clp-1 на клетки Streptococcus pneumonae выявляется увеличение скорости деградации клеточной стенки бактерий, по сравнению с индивидуальными 27 белками. Эти ферменты обладают различной активностью (Clp-1 - мурамидаза и Pal - амидаза), что, по-видимому, и объясняет увеличенную активность за счет кооперативного эффекта этих ферментов. В работе [56] был исследован PlyG-лизин, полученный из γ фага Bacillus anthraсis. Установлено, что он способен лизировать как взрослые клетки, так и споры. Применение энзибиотиков также может быть полезным при лечении инфекции, вызываемой P. aeruginosa. Геном phiKZ кодирует два литических фермента – литическую трансгликозилазу (gp144) и пептидогликановую гидролазу (структурный лизин gp181), разрущающих слой бактериальной клетки P. aeruginosa пептидогликановый в процессе ее инфицирования фагом. Белок gp144, имеющий 260 аминокислотных остатков, является гомологом литических ферментов различных штаммов Bacillus, пенициллинустойчивой DD-карбоксипептидазы aeruginosa. Интересно отметить, и ORF11 белок бактериофага gp181, состоящий CTX из P. 2242 аминокислотных остатков, имеет четкую гомологию по последовательности с белком gp144 [46]. Таким образом, исследование литического фермента gp181 фага phiKZ является актуальной задачей молекулярной биологии и медицины. Изучению белка gp181 с помощью направленного делеционного мутагенеза посвящена часть данной работы. 1.7 Мембранные белки 1.7.1 Бактериородопсин в пурпурных мембранах галобактерий Как известно, мембранные белки являются очень сложными объектами для изучения и манипуляций с ними. Особенность их природы в том, что они находятся в гидрофобном окружении липидного бислоя. Добавление детергентов становится необходимым условием для работы с такими белками, однако при извлечении из нативного липидного окружения они становятся нестабильными. 28 Чтобы понять и научиться контролировать функции мембранных белков, важно как можно точнее узнать их трехмерную структуру, которая обычно определяется методом рентгеновской кристаллографии [57, 58]. Однако, трудности, возникающие при работе с этими белками, сдерживают изучение их структур, и на сегодняшний день известны структуры не более 300 мембранных белков, что составляет менее 1 % от всех известных белковых структур. Поэтому мембранные белки остаются одними из наиболее важных объектов исследования в современной структурной биологии. Идеальной моделью для изучения мембранных белков может служить бактериородопсин (bR). С момента своего открытия в 1971 году bR продолжает оставаться объектом пристального изучения [59]. Лаборатории по всему миру проводят многочисленные исследования, ставящие своей целью получение детальной и полной картины строения и функционирования этого белка, тем самым создавая основу для дальнейших изучений других трансмембранных белков. Бактериородопсин представляет собой сравнительно небольшой по массе (~26 кДа) трансмембранный белок, состоящий из 7-ми α-спиралей, который был обнаружен в пурпурных мембранах (ПМ) галобактерий Halobacterium salinarum (иначе называемых H. salinarium и H. halobium). Галобактерии относятся к архебактериям, которые представляют собой совершенно особую линию эволюции, отличающуюся как от прокариот, так и от эукариот. Археи – единственные организмы, способные существовать в экстремальных условиях солевых озер, концентрация NaCl в которых достигает очень высоких значений (до 5 М или 25%), создавая тем самым, так называемые, “автостерильные” физиологические условия. Органический материал, который время от времени приносится в солевые озера свежей морской водой, может быть использован, как источник для жизни и размножения бактерий в условиях, когда возможны окислительные реакции. Через некоторое время, когда кислород заканчивается, единственным 29 источником энергии остается солнечный свет. В ходе эволюции и в процессе адаптации к внешним условиям H. salinarum приобрели фототропную способность к бесхлорофилльному фотосинтезу. Этот галофильный аэробный организм может производить энергию даже при низком парциальном давлении кислорода в окружающей среде (но при наличии освещения) по альтернативному пути − без использования электрон-транспортной дыхательной цепи. Галобактерии обладают уникальным в своем роде фотосинтетическим механизмом, главную роль в котором играет bR [60, 61]. Бактериородопсин имеет связанную ковалентно молекулу ретиналя, которая реагирует на действие фотонов [59]. После поглощения кванта света ретиналь изомеризуется, вызывая конформационные изменения в белке, которые в свою очередь создают трансмембранный градиент протонов. Протоны выкачиваются из цитоплазмы во внеклеточное пространство, преобразуя световую энергию в химическую [62]. Эффективность такого механизма достигает 15%, что заметно ниже хлорофильного фотосинтеза (35%) [63]. Образованный в результате действия bR протонный градиент в дальнейшем используется для различных нужд бактериальной клетки, в наибольшей степени для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ) посредством фермента АТФ-синтазы [64]. Когда освещение отсутствует, а парциальное давление кислорода высоко, бактерии возвращаются к аэробному окислительному фосфорилированию [65]. Схема главных функциональных систем галобактерии показана на рисунке 1.6, заимствованном из работы [66]. На рисунке 1.6 видно, что галобактериальная клетка содержит в своей клеточной мембране двумерные кристаллические массивы, состоящие из однонаправлено ориентированных молекул bR и липидов. Такие двумерные кристаллы называются пурпурными мембранами благодаря их интенсивной и специфической окраске. Другие компоненты, входящие в состав клеточной мембраны и участвующие в фотосинтетических процессах: АТФ-синтаза, сенсорные родопсины SR I и SR II, галородопсин hR и жгутиковый мотор [66]. 30 Рисунок 1.6 - Схема галобактериальной клетки и ее главных функциональных систем для фототаксиса и фотосинтеза [66] Согласно рисунку 1.6, кроме bR галобактерии имеют ряд других bRподобных белков. В том числе два рецепторных белка − сенсорные родопсины SR I и SR II. Они позволяют бактерии детектировать в световом спектре наличие диапазона длин волн, пригодного для осуществления фотоцикла. Это связанно с тем фактом, что бактериородопсин работает как протонная помпа лишь при его освещении зеленым или желтым светом. Избыточное синее освещение ингибирует фотоцикл. Белки SR I и SR II, реагируя на различные длины волн, запускают каскад сигналов, приводящих, в конечном счете, к активации бактериальной локомоторной системы, осуществляющей с помощью жгутиков перемещение клетки в область пространства с подходящим для фотосинтеза спектральным составом света. Мембраны галобактерий содержат еще один белок, относящийся к группе bR-подобных. Это – галородопсин (hR), "светозависимая помпа", поддерживающая в клетке физиологическую концентрацию ионов хлора [66]. На рисунке 1.7, взятом из работы [67], представлено схематическое изображение взаимосвязанных систем жизнедеятельности галобактерий, основанных на различных типах бактериальных родопсинов. 31 1 - перенос протона из клетки с помощью электрон-транспортной дыхательной цепи; 2 - светозависимый протонный насос bR; 3 - образование АТФ с помощью АТФ-синтазы и протонного градиента; 4 - переносчик (антипортер) ионов Na+/Н+; 5 - транспорт аминокислот, зависимый от градиента концентрации ионов Na+; 6 - транспорт ионов калия, зависимый от мембранного потенциала; 7 - светонезависимая система переноса ионов Cl− (совместно с Na+ ); 8 – галородопсин Рисунок 1.7 - Схема транспорта ионов в клетке галобактерии [67] Кратко эту схему можно описать следующим образом. Создаваемая дыхательной системой (при высокой концентрации кислорода) или bR (в условиях недостаточной аэрации) разность потенциалов на мембране используется для синтеза АТФ, переноса ионов калия в клетку, а ионов натрия − во внешнюю среду. А созданный таким образом градиент ионов натрия используется в свою очередь для переноса аминокислот и ионов хлора в клетку. У галобактерий бактериородопсин in vivo организован в интегрированные в мембрану двумерные гексагональные комплексы, в которые помимо собственно трех молекул бактериородопсина, повернутых на 120˚ друг относительно друга и образующих тример, входят специфические липиды. На рисунке 1.8, заимствованном из работы [68], 32 хорошо различимы тримеры бактериородопсина, периодически расположенные и образующие пурпурную мембрану. Рисунок 1.8 - Изображения внеклеточной стороны ПМ, полученные с высоким разрешением с помощью атомно-силовой микроскопии [68] До 80% поверхности бактериальных клеток могут быть покрыты участками ПМ. Все молекулы bR ориентированы в ПМ в одном направлении, так что карбоксильный участок белка расположен во внутренней части клетки. ПМ состоят на 75% (по сухому весу) из белка bR и на 25% из смеси сульфатных гликолипидов, фосфолипидов, фосфатидилглицерофосфатов и эфирносвязанного липида сквалена [69, 70]. Суммируя результаты исследований ПМ, проводимых в течение последних трех десятилетий, можно отметить следующие их особенности. Пурпурные мембраны состоят из липидов и bR в молярном соотношении 10:1; имеют нерегулярную форму с поперечными размерами до 5 мкм и постоянной толщиной, равной 5 нм [66]. ПМ отличаются очень высокой стабильностью к различным физико-химическим воздействиям. В частности, ПМ сохраняют свои свойства после длительного (несколько лет) пребывания на солнечном свету в присутствии кислорода, а также при высушивании. Также ПМ выдерживают в воде температуры до 80˚С, а в сухом состоянии – до 140˚С, однако подобная стабильность утрачивается при разрушении кристаллической структуры ПМ [66, 71]. Устойчивость к значениям pH наблюдается в диапазоне от 0 до 12 единиц. ПМ устойчивы в растворах с высокой ионной силой и стабильны в растворах NaCl с концентрацией до 3 33 М. ПМ чувствительны к воздействию полярных органических растворителей, таких как этанол и ацетон, однако устойчивы в неполярных растворителях, таких как гексан [66, 72]. 1.7.2 Структура и фотоцикл бактериородопсина Апопротеин (apoprotein) бактериоопсин (bO), кодируемый геном bop в геноме бактерий H. salinarum, состоит из 248 аминокислот и имеет молекулярный вес 26 кДа [73, 74]. Пространственная структура этого белка состоит из 7-ми гидрофобных α-спиралей, пронизывающих липидный бислой клеточной мембраны и соединенных петлями с каждой стороны мембраны. Эти α-спирали обозначают латинскими буквами от A до G в порядке следования. N- и С-концы полипептидной цепи находятся по разные стороны цитоплазматической мембраны: N-конец обращен во внешнюю среду, а Сконец - внутрь клетки. Упакованные таким образом молекулы белка организованы в тримеры, которые образуют кристаллическую гексагональную структуру. К аминокислотному остатку Lys 216, расположенному в средней части спирали G, ковалентно через Шиффово основание присоединен хромофор ретиналь [59]. В результате связывания ретиналя с апопротеином возникает хромобелок бактериородопсин. Ретиналь находится в окружении α-спиралей в центре белка, разделяя его на две "половины" – цитоплазматическую и внеклеточную [59]. Ретиналь представляет собой каротиновую производную витамина А. Этот хромофор, не связанный с белком и растворенный в этаноле, имеет максимум поглощения света на длине волны 380 нм. Когда бактериородопсин пребывает в состоянии “покоя”, то есть не поглощает фотон, ретиналь находится в термодинамическом равновесии между двумя формами – all-trans и 13-cis, 15-syn в отношении 1:2, соответственно, таким образом тример бактериородопсина содержит один изомер all-trans и два 34 изомера 13-cis, 15-syn [75, 76]. Максимум поглощения такого хромобелка находится на 558 нм и определяет, так называемую, Dark Adapted (DA) form – адаптированную к темноте форму бактериородопсина. Когда bR в форме DA освещается, равновесие между двумя формами ретиналя полностью теряется – все молекулы ретиналя переходят в форму all-trans, определяя, адаптированную к так свету называемую, форму Light Adapted бактериородопсина (LA) с form – максимумом поглощения на 568 нм у bR дикого типа. Бактериородопсин в форме LA начинает фотоцикл: при поглощении кванта света определенной длины волны ретиналь претерпевает процесс фотоизомеризации и переходит в состояние 13-cis, 15-anti. Фотоизомеризация запускает процесс переноса протона с цитоплазматической стороны мембраны во внешнюю среду через ряд промежуточных состояний. Детальный механизм фотоцикла будет рассмотрен ниже. Многообразие накопленных спектроскопических данных вместе с информацией, полученной с помощью рентгеновской кристаллографии низкого разрешения, позволили надежно определить следующие основные шаги в механизме переноса протона [77–83]. После фотоизомеризации ретиналя из all-trans формы в форму 13-cis, 15-anti протон с Шиффова основания переносится на аминокислотный остаток Asp 85, расположенный на внеклеточной стороне цепи (рисунок 1.9), и протон затем выбрасывается во внеклеточное пространство. Следующий этап – это репротонирование Шиффова основания через предполагаемую сеть молекул воды, заключающееся в переносе на него протона с аминокислотного остатка Asp 96, расположенного на цитоплазматической стороне цепи, который затем протонируется за счет цитоплазматического протона. Заключительный этап цикла – это реизомеризация ретиналя в форму all-trans и депротонирование Asp 85 [84]. Весь фотоцикл длится порядка 10 мс, причем бактериородопсин не обладает рефрактерным 35 периодом, т.е. по завершении одного фотоцикла, он готов к следующему [85]. Рисунок 1.9 - Структура бактериородопсина (слева) и кинетическая схема его фотоцикла (справа) На заимствованном из работы [84] рисунке 1.9 слева показана структура bR с функциональными боковыми цепями, ретиналем и молекулой воды 402, справа – кинетическая схема его фотоцикла. Стадии K, L, M, N и O различаются по их спектральным свойствам, определенным с помощью спектроскопии в видимом и инфракрасном свете, спектроскопии Рамана и ЯМР. Также эти стадии различимы по их кристаллическим структурам, когда эти структуры известны. Промежуточные состояния (подсостояния) M1, M2, M'2, N' определяются из кинетических и спектральных данных, а также по их структурным отличиям. Только состояния BR и O имеют ретиналь в форме all-trans. На всех остальных стадиях ретиналь находится в форме 13-cis,15anti. Выброс протона во внешнюю среду и захват протона из цитоплазмы показаны так, как это происходит при физиологических условиях: pH>7. 36 Еще в самых ранних работах, посвященных изучению динамики протонного транспорта бактериородопсином, были описаны квазистабильные состояния белка, различимые спектроскопически, рисунок 1.9. Эти стадии, последовательно сменяющие друг друга в фотоцикле, были обозначены латинскими буквами от J до O. Лишь первая из реакций фотоцикла J зависит от света, остальные реакции представляют собой реакции термического типа, сходные с такими же реакциями в других биологических транспортных системах. Каждая реакция соответствует определенному физическому процессу, поэтому ряд спектроскопически неразличимых (батохромных) состояний был разделен впоследствии на подсостояния: M1, M2, M'2 и N, N' [84]. Модель фотоцикла, полученная для бактериородопсина, является наиболее детальной среди моделей, известных для других ионных насосов. Несмотря на это, все еще остается ряд важных невыясненных вопросов, связанных с протонным транспортом в бактериородопсине. Например, как энергия сохраняется на молекуле ретиналя, и как эта энергия переносится на белок? Какой переключатель задает протонному насосу направленность действия – из цитоплазмы во внеклеточное пространство? Если сеть водородных связей, образованная между молекулами воды, создана для улучшения репротонирования Шиффова основания, то, где располагаются эти молекулы воды, и как сеть водородных связей формируется [84]? Но за последние несколько лет произошел большой прогресс в структурных методах и подходах. И есть надежда, что на все еще не выясненные вопросы, связанные с транспортом протонов в бактериродопсине, будут получены ответы. Исследования, проводимые с помощью ЯМР твердого тела, позволили получить некоторые критические для понимания механизма межатомные расстояния и валентные углы, а также их изменения после фотоизомеризации ретиналя [86, 87]. Фурье-спектроскопия в ИК-диапазоне (FTIR-spectroscopy) дает все более специфические представления о механистической сути 37 протонного транспорта [88, 89]. Развитие метода кристаллизации в кубической липидной фазе [90] сделало возможным выращивание трехмерных кристаллов bR с высоким качеством для рентгеновской дифракции. При этом разрешение структур улучшилось с 2.5 Å [91] до 2.3 Å [92], 1.9 Å [93], 1.55 Å [94], а затем и до 1.43 Å [95]. Сообщения о полученных кристаллографических структурах для промежуточных состояний бактериородопсина K [95, 96], L [97], M [98-101] и N [102], а также его мутантов, предположительно имеющих сходство с состояниями N [103, 104] и O [105] в отсутствии освещения, дали надежду на то, что механизм протонного транспорта скоро будет понят на беспрецедентном молекулярном уровне. Однако в настоящий момент обилие накопленной информации о структуре бактериородопсина, полученной разными научными лабораториями, остается предметом споров и противоречий. Это касается не только гипотез и интерпретаций по поводу механизма протонного транспорта. Данные, полученные по структуре bR, также часто являются противоречивыми [84]. Кроме того, все еще существуют проблемы с разрешением кристаллов: кристаллы бактериородопсина имеют склонность к образованию двойников (crystal twinning), фотостационарные состояния bR в фотоцикле существуют очень короткое время [106, 107]. Все это очень затрудняет изучение промежуточных стадий в фотоцикле бактериородопсина в освещенном состоянии. Эти трудности усугубляются тем фактом, что большинство структурных изменений, относящихся к транспорту ионов и представляющих собой образование и разрушение водородных связей при движении боковых цепей и молекул воды, имеют величину только в несколько ангстремов. Для преодоления этих трудностей необходимо получать кристаллы очень высокого качества и находить оптимальные условия для изучения промежуточных состояний в фотоцикле [106]. 38 1.7.3 Экспрессия бактериородопсина в различных системах Как было доказано с помощью многочисленных исследований, процесс получения мембранных белков, как в гомологичных, так и в гетерологичных экспрессионных системах намного сложнее процесса получения растворимых белков [108]. Подбор эффективной системы для экспрессии мембранных белков является ключевым моментом для успешного их получения и последующего изучения. Так, например, благодаря созданию специфических плазмидных конструкций для последующей экспрессии мембранных белков, стало возможным разделение белковых комплексов на водорастворимые и мебранные домены, что безусловно облегчает исследования таких комплексов. Кроме того, введение специфических “хвостов” (например, Histag из 6-ти остатков гистидина для металлической аффинной хроматографии или пептидный хвост для специфического узнавания определенными антителами) помогает значительно облегчить процесс очистки рекомбинантных мембранных белков. В кристаллизационных экспериментах сам белок и его свойства являются определяющими факторами для подбора условий кристаллизации. Выбор правильной системы экспрессии может позволить изменить белок и его свойства для улучшения процесса кристаллизации: подвижные части молекулы, которые затрудняют кристаллизацию, могут быть удалены; сайты трансляционных и послетрансляционных модификаций, которые могут быть источниками негомогенности белка, могут быть изменены точечными мутациями или отрезанием; синтез мембранных доменов с доменами, инициирующими кристаллизацию, может быть полезным для получения высокоупорядоченных кристаллов мембранных белков [108]. На сегодняшний день не существует строго определенной и универсальной системы для экспрессии мембранных белков. Например, несколько белков - бактериородопсин, галородопсин и транспортеры сахара - 39 было экспрессировано в гомологичных системах на достаточно высоком уровне. Но эти же белки и многие другие были экспрессированы также и в различных гетерологичных системах. Одной из самых популярных гетерологичных систем экспрессии является бактериальная экспрессионная система на основе грамотрицательной бактерии E. coli. Это связано с тем, что этот организм может быть с легкостью генетически модифицирован. Кроме того, всестороннее понимание процессов транскрипции и трансляции в этой бактерии дает возможность достигать высоких уровней экспрессии белков. Высокая скорость роста бактерий и относительно низкая стоимость использования метода также являются привлекательными условиями. Существует ряд других гетерологичных систем, в которых были экспрессированы мембранные белки: дрожжи, клетки млекопитающих (методом трансфекции), клетки насекомых (на основе бакуловирусной системы), in vivo (трансгенные животные), экстрамембранные системы экспрессии (экспрессия в цитоплазме бактерии и cell-free экспрессионная система) [109, 110]. Как уже было упомянуто выше, бактериородопсин был получен в различных экспрессионных системах. В этих исследованиях можно выделить несколько этапов, которые были связаны как с развитием приборной базы, так и с появлением новых методологических подходов. В 1970-е годы бактериородопсин был впервые выделен напрямую из природного источника - пурпурных мембран галобактерий Halobacterium salinarum [59, 111, 112]. Проводились биохимические и биофизические исследования bR, выделенного из ПМ, были определены его функции в клетке [73], обнаружен фотоцикл и изучены его кинетические особенности [113], определена аминокислотная последовательность [114] и предложен ряд гипотез о механизме протонного транспорта. В конце 80-х годов стал возможен прорыв в определении механизма функционирования bR благодаря использованию сайт-специфичного 40 мутагенеза. Так, впервые была разработана система, в которой химическисинтезированный ген бактериородопсина был экспрессирован в E. coli [115117]. Эта экспрессионная система позволила использовать сайт- направленный мутагенез для изучения механизма протонного транспорта в bR, в частности, были определены аминокислотные остатки, вовлеченные на разных стадиях в этот механизм [118]. Примерно в тоже время была создана другая экспрессионная система, позволяющая получать бактериородопсин в дрожжах, а, именно, в Schizosaccharomyces pombe [119]. Другой альтернативой для изучения bR и его мутантов был отбор белка с природными мутациями или классический мутагенез [120], но этот подход не обладает избирательной способностью, которая есть у сайт-направленного мутагенеза. В начале 90-х годов группой ученых была разработана новая система трансформации, использующая галобактериальный плазмидный вектор и позволяющая вставлять bop-ген в bR-дефицитные штаммы галобактерии Halobacterium salinarum экспрессировался [121]. С бактериородопсин плазмиды, в несущей количествах, bop-ген, сравнимых с полученными из нескольких штаммов bR дикого типа [121]. Также эта система позволяла создавать мутанты bR с помощью сайт-направленного мутагенеза. Однако, в молекулярной генетике галофильных археев, особенно в Halobacterium salinarum, существует проблема: при введении коротких последовательностей ДНК (insertion sequence elements) в геном и вставке плазмидных векторов штаммы бактерии становятся нестабильными [122]. Кроме того, клетки, производящие мутантов бактериородопсина, не всегда воспроизводят его так же, как клетки дикого типа [122]. Безусловно, использование природного источника, а именно, пурпурных мембран для получения бактериородопсина и его мутантов было бы предпочтительнее. Но, как было сказано выше, существует ряд трудностей, связанных с получением мутантов bR в галобактериях. Между тем, есть еще одна причина, подтолкнувшая ученых к разработке новых 41 гетерологичных систем экспрессии бактериородопсина: выращивание галобактерий и выделение из них достаточного количества белка для его исследований и кристаллизации занимает длительное время, до нескольких месяцев. Предполагалось возможным создать систему экспрессии, позволяющую получать готовый белок быстрее. На сегодняшний день самой распространенной гетерологичной системой экспрессии бактериородопсина и его мутантов является экспрессионная система на основе бактерии E. coli [123]. Так как формирование нативной укладки бактериородопсина затруднено в мембранах E. coli [124], рекомбинантный bR был получен в форме апопротеина – бактериоопсина (bO), который затем был восстановлен до bR с помощью ретиналя in vitro [125]. Первоначально экспрессированный в E. coli бактериородопсин имел низкий выход из-за активной протеолитической деградации в цитоплазме [115]. Однако, использование экзогенных Nконцевых последовательностей помогло при встраивании bO во внутреннюю мембрану бактерии и тем самым повысило выход и стабильность белка [116, 124]. Наилучшим выходом ренатурированного bR, полученного таким образом, было количество в 17 мг/л [126, 127], но тем не менее неконтролируемый протеолиз белка в клетке привел к тому, что полученный bR был негомогенным. Позже была разработана система экспрессии bR, использующая стратегию создания гибридных белков и позволяющая получить bO в форме телец включения [128, 129], что, безусловно, уменьшило количество проблем, связанных с нестабильностью белка и его токсичностью для клеток. Кроме того, в качестве N-концевых белков-переносчиков, помогающих при встраивании бактериородопсина в мембрану E. coli, были успешно использованы мальтоза-связывающий белок (Maltose-Binding Protein − MBP) и фрагмент β-галактозидазы (454 а.о.). При этом уровень экспрессии таких гибридных белков составлял около 200 мг/л [130]. Однако, при очистке и 42 ренатурации значительная часть белка терялась, и выход очищенного и ренатурированного bR был порядка 6-10 мг/л [130]. В настоящее время белки-носители, такие как MBP с N-концевой сигнальной последовательностью [131], Mistic [130, 132] или GlpF [133] могут быть успешно использованы для эффективного встраивания bR и других гетерологичных белков в мембрану E. coli, тем самым позволяя экспрессировать рекомбинантные мембранные белки с большим выходом, достаточным для очистки и последующей кристаллизации. 1.7.4 Практическое применение бактериородопсина в технике Предположения об использовании бактериородопсина (дикого типа или его мутантов) для различных технических нужд начали появляться практически сразу после его открытия. Этому, в частности, способствовали детальные исследования белка учеными самого разного профиля. Технические приложения бактериородопсина были собраны в ряд масштабных направлений [66]: 1) протонный транспорт: генерация АТФ в реакторах, опреснение морской воды, генерация электрической энергии из света; 2) фотоэлектрические применения: ультрабыстрое детектирование света, создание искусственной сетчатки, детектирование движения; 3) фотохромные применения: хранение информации на 2D-, 3D- и голографических носителях; обработка информации с использованием световых переключателей, оптической фильтрации; создание нейросетей; распознавание образов; интерферометрия; 4) другие применения: детектирование радиации, биосенсорные приложения. На сегодняшний момент существует порядка 100 патентов на изобретения, в основе которых лежит использование bR. Самое раннее изобретение, к котором бактериородопсин был использован в качестве 43 преобразователя солнечной энергии в химическую и электрическую, датируется 1980 годом [134]. Однако оказалось, что использованию bR в качестве преобразователя световой энергии препятствует ряд факторов, например, техническая невозможность создавать стабильные пленки bR больших размеров с равномерными свойствами по поверхности [66]. Кроме того, разработка таких систем на основе bR превышает стоимость реализации процессов преобразования энергии с помощью уже имеющихся устройств. В связи с этим основной областью для технического применения бактериородопсина стала оптическая обработка данных, основанная на его фотохромных свойствах. Устройства для хранения и обработки информации на основе bR обладают рядом преимуществ по сравнению с уже известными аналогами. Основные требования к материалам для молекулярной электроники состоят в том, что они должны обратимо изменять свою структуру в ответ на некое физическое воздействие и существовать, по крайней мере, в двух состояниях, которые заметно различаются по легко измеряемым физическим характеристикам, например, по спектральным или оптическим свойствам. Хотя на настоящий момент синтезирован целый ряд фотохромных органических соединений, альтернативных бактериородопсину [135], они не обладают достаточными для использования в технике свойствами − высокой цикличностью и одновременно достаточно высоким квантовым выходом [136]. Под цикличностью понимается число циклов фотопревращений молекул между двумя основными состояниями до разрушения или денатурации 37 % образца [137]. Цикличность же молекул bR превышает 106, что достаточно для его использования в устройствах не только для хранения информации (например, для CD-RW необходима цикличность 104−105), но и для обработки информации. Например, при обработке изображения в реальном времени требуется приблизительно 106 циклов WRE (write-readerase − запиcывать-читать-стирать) за день работы, что невозможно для 44 большинства синтетических органических фотохромных материалов [66, 137]. В 1980-х годах бактериородопсин впервые был использован для создания голографических изображений [138, 139]. Запись голографических изображений на пленках bR основана на интерференции двух когерентных лазерных лучей. В результате образуется голографическая решетка (пространственное распределение интермедиатов бактериородопсина B и M, где B – первоначальное LA состояние bR, M – наиболее долго живущий интермедиат bR), которая возникает благодаря изменению оптической плотности и показателя преломления пленки bR при поглощении кванта света. Проведенные исследования показали, что молекулярная память на основе бактериородопсина имеет определенные преимущества перед традиционной полупроводниковой памятью. Во-первых, благодаря достижениям в биотехнологии и генетической инженерии стало возможным получать bR – основу такой памяти – в больших количествах при относительно невысоких денежных затратах. Во-вторых, система может функционировать в более широком диапазоне температур, чем полупроводниковая память. В-третьих, данные сохраняются постоянно: даже если выключить электропитание системы памяти, это не приведет к потере информации. По оценкам исследователей данные, записанные на таком запоминающем устройстве, должны сохраняться не менее пяти лет. Вчетвертых, оптический носитель информации на основе bR позволяет осуществлять запись по всему объему, а не только по поверхности (как это реализуется на магнитных носителях), что значительно увеличивает его емкость. Так, группой исследователей был разработан прототип подсистемы памяти, использующей для запоминания в качестве цифровых бит промежуточные состояния бактериородопсина [140]. Определенно установлено, что использование бактериородопсина в качестве молекулярного переключателя в оптоэлектронных и других 45 приложениях технически возможно. Но это не может служить основанием для того, чтобы прекратить научные исследования технических применений бактериородопсина и перейти только на коммерческие проекты. Основной причиной для использования биоматериалов в технических системах вместо обычных органических материалов или электроники является увеличение производительности таких систем. Фотохромизм бактериородопсина является природной функцией, поэтому эволюция оптимизировала эту функцию на протяжении миллионов лет. Генная инженерия в настоящее время используется для "второй эволюции", цель которой усилить фотохромные свойства bR, не теряя при этом уникальных свойств обратимости молекулы. Возможности технического применения bR были обнаружены более 30 лет назад. Текущие исследования направлены на разработку способов интеграции бактериородопсина в технические системы. Поскольку не существует таких технических систем, в которых можно удалить один из компонентов и просто заменить его новым, сделанным из бактериородопсина, то необходимо реконструировать технические системы для того, чтобы использовать в них bR. Бактериородопсин не является изолированным исключительным объектом исследований, он стал основой технологической платформы, на которой с помощью различных инструментов разрабатываются новые и полезные материалы [66]. 1.8 Методы теоретического исследования структуры белков Известно, что структуру белков не всегда удается решить с помощью экспериментальных методов из-за сложности получения этих белков в кристаллическом состоянии. Тем не менее, знание пространственной структуры белков очень важно. Поэтому часто применяются различные теоретические методы исследования и предсказания структуры белков. 46 К наиболее распространенным из них можно отнести статистические методы, основанные на анализе белков с известной структурой. Эти методы учитывают частоты локализации аминокислотных остатков в разных типах вторичной структуры: -спираль, -тяж, -поворот, неупорядоченная структура [141]. Такие статистические методы отражают закономерности ближнего и среднедистанционного взаимодействия, такие как геометрия остатка, и в соответствии с этим, возможность встраивания в ту или иную структуру. Можно выделить группу методов, основанных на идентификации паттернов, где строго определенные позиции на участке последовательности заняты строго определенными остатками. Эти методы учитывают как среднедистанционные, так и дальние взаимодействия. Консервативные гидрофобные позиции в паттернах вторичных структур указывают на контакты между отдельными частями белковой молекулы. Последовательности -тяжей, входящих в состав гидрофобного ядра, состоят в основном из остатков с крупными разветвленными боковыми группами (Val, Leu, Ile) [142], а паттерны -листов, лежащих между гидрофобным ядром и водным окружением, состоят из перемежающихся полярных и неполярных остатков (типа Val-Ser-Leu) [142]. Более разнообразны паттерны различных вариантов упаковки спиралей. Установлено, что -спирали могут контактировать между собой различными способами. В частности, контакт между двумя спиралями чаще всего происходит под углом около 50. При этом расположение неполярных остатков, формирующих область контакта, определяет паттерн того или иного варианта упаковки. Определены паттерны α-спиралей, прилежащих к -листу [142]. В настоящее время успешно выявляются также паттерны супервторичных структур типа -шпилек, -, - и -петель [143], которые, вероятно, могут играть роль инициаторов фолдинга белка. 47 Однако, эффективность предсказаний, основанных на паттерн-методах, невелика, т.к. они плохо учитывают, что для элементов вторичной структуры часто характерна избыточность гидрофобных остатков. Исключение составляют фибриллярные белки, у которых удельная поверхность больше, и паттерны укладки могут быть определены с большей вероятностью. Паттерны, аминокислотных связанные остатков с периодическим определенных расположением типов, могут быть идентифицированы с помощью преобразования Фурье. Как уже отмечалось в п. 1.3.3 и п. 1.7.1, экспериментальные трудности получения белков ДХФ и различных мембранных белков в кристаллическом состоянии в настоящее время не преодолены. Поэтому анализ их структуры основывается в первую очередь на данных о последовательности аминокислотных остатков полипептидной цепи и является актуальной задачей. Предполагалось, что в структуре белков ДХФ имеет место некоторая периодичность [144]. Для анализа этой периодичности наряду с новыми методами, например, методом “информационного разложения” [145] можно применять хорошо известные теорию и методы преобразования Фурье [146150]. Более подробно о методе Фурье будет рассказано в главе 2. Из многообразия всех мембранных белков значительный интерес вызывает группа интегральных трансмембранных белков, имеющих несколько гидрофобных участков, насквозь пронизывающих мембрану и совместно выполняющих функцию транспортных каналов для различных веществ. Очевидная особенность этих белков состоит в том, что свойство повторяемости (возможно, периодической) в расположении гидрофобных аминокислот им органически присуще. Если отмеченная повторяемость периодическая, то она как признак вторичной структуры белка может быть выявлена с использованием преобразования Фурье, как это делалось в случае фибриллярных белков. 48 Поскольку трансмембранные участки белка состоят в большей степени из гидрофобных трансмембранных аминокислот участков [151], были для анализа разработаны расположения численные методы, основанные на применении к белковой последовательности ее функции гидрофобности и различных шкал гидрофобности аминокислот [151-155]. Более подробно периодичности о применении расположения метода Фурье аминокислот для гидрофобной исследования группы в последовательностях мембранных белков и об использовании нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белка, основанного на применении функции гидрофобности, будет рассказано в главе 6. 1.9 Вторичная структура белков Основные типы вторичной структуры были впервые найдены в фибриллярных белках [156]. Эта группа белков до сих пор является наиболее удобным объектом для теоретического исследования мотивов укладки. 1.9.1 Варианты -спирального coiled-coil Структурный элемент coiled coil впервые был предложен в 1953 году Полингом и Кори [157] и независимо от них Криком [158], как главный структурный элемент большого класса фибриллярных белков, таких как кератин, миозин и фибриноген. В структурном плане coiled coil представляет собой суперспираль, образованную двумя, тремя или четырьмя спиралями. Известны даже белки coiled coil, содержащие пять спиралей [159]. Спирали могут быть упакованы в одном (параллельный coiled coil) или в противоположных направлениях (антипараллельный coiled coil). Регулярное строение coiled coil требует периодичности в упаковке боковых цепей остатков аминокислот в ядре протяженной структуры. Однако такая регулярность невозможна без 49 искажений канонической -спирали, где на один оборот приходится 3.6 аминокислотных остатка. В структуре coiled coil -спираль деформируется таким образом, что число остатков на виток уменьшается до 3.5, и положения боковых цепей повторяются через два оборота. Обычно последовательность аминокислот суперспиральных белков имеет гептадную периодичность. В каждой гептаде в первой и четвертой позициях находятся гидрофобные остатки, боковые группы которых обеспечивают межспиральные взаимодействия и формируют гидрофобное ядро (core) суперспирали. Если позиции аминокислот в гептаде обозначить соответственно как (a, b, c, d, e, f, g)n, то гидрофобные остатки занимают положения a и d, а в положениях b, c, e, f, g обычно находятся гидрофильные остатки, образующие экспонированную в растворитель внешнюю поверхность coiled coil (рисунок 1.10). Рисунок 1.10 - Взаимодействие -спиралей при образовании coiled coil структуры [160] На рисунке 1.10 из работы [160] показан вид с торца для параллельных димерного (А) и тримерного (Б) coiled coil. Гидрофобные взаимодействия между остатками a и d показаны пунктиром, электростатические взаимодействия между остатками e и g показаны штриховой линией. 50 1.9.2 Элементы -структуры в фибриллярных белках вирусов и бактериофагов Физико-химическое исследование ряда белков, ответственных за адсорбцию фагов на клеточной мембране, выявило преобладание конформации в их вторичной структуре. К указанной группе можно отнести белки дистальной и проксимальной половинок длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4 [24], хвостовой белок (gp9) фага P22. Такие же особенности отмечены для белка фибрилл аденовируса [161], который также необходим для специфической адсорбции вириона. Во всех указанных белках большую часть молекулы составляют фибриллярные структуры. По результатам анализа спектров кругового дихроизма дистальной половинки длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4 было сделано предположение, что каждый из мономеров данного белка образует длинный и узкий антипараллельный -лист, составленный из тяжей, перпендикулярных к оси фибриллы. Два -листа образуют сильно перекрученную структуру типа cross- [32]. Подобная модель раньше была предложена для кератина пера. При анализе последовательностей gp37 и gp36 были найдены стереохимические паттерны cross- в виде фрагментов чередующихся полярных и неполярных остатков [26]. Предсказанные структурные участки занимают большую часть последовательности gp37. Отдельные участки заняты паттернами -спиралей, которые могут формировать coiled-coil. Несмотря на экспериментальные сложности выделения белков и получения их в кристаллическом состоянии, структура 20-ти белков бактериофага Т4 была решена методами рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии. 51 Так, например, методом рентгеноструктурного анализа была решена структура белка gp5. В его структуре был обнаружен уникальный мотив – тримерная -спираль (рисунок 1.11) [13]. По результатам рентгеноструктурного анализа установлено, что молекула лизоцима фага Т4 имеет размеры примерно 50×30×30 Å3 и состоит из 165 аминокислотных остатков (молекулярный вес равен 18.7 кДа). Она подразделяется на два домена: один состоит из спиральных участков и трех антипараллельных β-слоев, а другой − только из спиральных участков. A B C A − вид сбоку (вертикальная проекция), B − вид сверху, C − вид сбоку (горизонтальная проекция) [13] Рисунок 1.11 - Структура gp5 бактериофага Т4 Между собой домены соединены длинным спиральным участком длиной в 20 а.о. Таким образом, примерно, 70% от общего числа аминокислотных остатков включены в более или менее регулярные структуры: около 60% а.о. образуют спиральные участки, а 16 остатков образуют β-слой. 1.9.3 Элементы вторичной структуры в трансмембранных белках Мембранные белки могут быть разделены на две основные категории: интегральные белки, которые пронизывают мембрану насквозь и называются 52 трансмембранными белками, и периферические белки, которые расположены на внешней стороне мембраны или прилегают к ее внутренней стороне. Большинство биомембран содержит оба вида мембранных белков. На рисунке 1.12, заимствованным из [162], представлена схематическая диаграмма биологической мембраны, в состав которой входят интегральные и периферические мембранные белки. Фосфолипидный бислой, основная структура всех клеточных мембран, состоит из двух слоев фосфолипидных молекул, жирные ациловые хвосты которых формируют внутреннюю часть бислоя, а полярные гидрофильные группы головок образуют поверхность бислоя. Олигосахариды в основном связаны с мембранными белками, однако, некоторые прикрепляются к липидам, формируя гликолипиды. Рисунок 1.12 - Схематическая диаграмма типичных мембранных белков в биологической мембране [162] Трансмембранные белки, которые составляют большинство в группе интегральных мембранных белков, пронизывают бислой насквозь, но некоторые из интегральных белков соединены с бислоем только на одной его стороне с помощью связанной ковалентно липидной якорной группы. Гидрофобные аминокислотные остатки интегральных мембранных белков взаимодействуют с жирными ациловыми группами фосфолипидов в 53 мембране, таким образом, закрепляя белок в мембране [162]. Такое гидрофобное взаимодействие может быть разрушено только при добавлении детергентов Интегральные или некоторых других трансмембранные белки неполярных включают растворителей. многочисленные рецепторы, каналы, транспортеры, фотосистемы и респираторные комплексы [163]. Периферические белки связаны с мембраной намного слабее, чем интегральные белки. Соединение с мембраной у них осуществляется главным образом посредством специфических белковых взаимодействий. Так, периферические белки прикреплены либо к полярным головкам липидов в липидном бислое, либо к интегральным белкам с помощью гидрофобных, электростатических или других нековалентных взаимодействий. Этот вид белков не взаимодействует с гидрофобной внутренней частью фосфолипидного бислоя. Поэтому для отделения периферических белков от мембраны не требуется ее разрушения. Для диссоциации достаточно использовать растворы с низким или высоким значением pH и высокой концентрацией соли. К периферическим мембранным белкам относятся ассоциированные с мембраной ферменты, транспортеры, сигнальные липидсвязанные домены, гормоны, токсины и т.д. [163-166]. Трансмембранные белки содержат от одного до нескольких доменов, пронизывающих бислой − трансмембранные домены, и домены, выходящие с обеих сторон бислоя в водное окружение − топологические домены. Во всех трансмембранных белках, исследованных на сегодняшний день, элементы вторичной структуры в трансмембранных доменах состоят либо из αспиралей, либо из β-тяжей. Структуры, состоящие из α-спиралей, являются наиболее распространенными у трансмембранных белков [162]. На рисунке 1.13 схематически изображены трансмембранные белки, трансмембранные домены которых состоят из α-спиралей и β-складчатой структуры. 54 Трансмембранные домены состоят из единичной трансмембранной α-спирали и множественных трансмембранных α-спиралей – A, β-складчатой структуры – B. Рисунок 1.13 - Схематическое изображение трансмембранных белков Интегральные белки, содержащие α-спиральные домены, пронизывающие мембрану, удерживаются в ней посредством гидрофобных взаимодействий с внутренней частью липидного бислоя и, вероятно, также с помощью ионных фосфолипидов. взаимодействий Например, с гликофорин, полярными группами головок главный мембранный белок эритроцитов, имеет оба вида указанных взаимодействий с мембраной. В мембране эритроцитов гликофорин представляет собой димер, состоящий из двух идентичных полипептидных цепей. Два трансмембранных α- спиральных домена гликофорина пронизывают бислой, формируя coil-coiled структуру [162]. Большой и важный класс интегральных трансмембранных белков определяется наличием у них 7-ми трансмембранных α-спиралей. Более 150 таких белков было идентифицировано. Типичным представителем класса семиспиральных трансмембранных белков является бактериородопсин. Другие белки, входящие в этот класс, включают опсины и GPCRs (G-proteincoupled receptors) [109]. Трансмембранные представлены, во белки, внешних имеющие мембранах β-складчатую грамотрицательных структуру, бактерий, митохондрий и хлоропластов. Так, например, во внешней мембране E.coli были найдены несколько типов поринов, структура которых радикально отличается от других интегральных трансмембранных белков. Порины во 55 внешней мембране E.coli образуют каналы или поры для прохождения различных молекул. Аминокислотные последовательности поринов, главным образом, полярные и не содержат длинных гидрофобных доменов, типичных для α-спиральных интегральных белков. С помощью рентгеновской кристаллографии было установлено, что порины образуют тримеры, состоящие из идентичных субъединиц. В каждой субъединице из 16 β-тяжей формируется β-складчатая структура в виде бочонка (β-barrel) с порой в центре [162]. 1.10 Выводы по главе и постановка задач исследования На основе вышеприведенного анализа современных проблем исследования структуры и свойств вирусных и мембранных белков, можно сделать следующие выводы. Безусловно, одним из главных и активно развивающихся направлений в сегодняшней науке является структурная биология, нацеленная на изучение структуры и свойств белков различной природы, что может быть полезным для понимания фундаментальных природных механизмов жизни и развития медицины. Определение структуры белков может базироваться как на экспериментальных, так и на теоретических методах. Несмотря на существующие экспериментальные сложности в получении фибриллярных белков бактериофага Т4 в кристаллическом состоянии, решение структуры этих белков по-прежнему остается актуальной задачей для разработки способов борьбы с вирусными инфекциями. Для преодоления трудностей в эксперименте по исследованию фибриллярных белков необходимо совершенствовать экспериментальные подходы и методы. Однако, исследования, развитие таких и как использование компьютерное теоретических методов моделирование, методы 56 биоинформатики также являются ключевыми инструментами для изучения и предсказания структуры фибриллярных белков. Новым методом борьбы с бактериальными инфекциями, устойчивыми к синтетическим антибиотикам, является использование литических ферментов бактериофагов в качестве энзибиотиков. Для создания эффективных лекарств необходимо знать структуру и функции литических ферментов, а также их ферментативную активность. Роль мембранных белков во всех биологических процессах, происходящих в природе, невозможно переоценить. Но из-за объективных сложностей с экспериментальным получением мембранных белков и их кристаллов, к сожалению, структура лишь малой их части решена с помощью рентгеновской кристаллографии. Структура бактериородопсина – модельного объекта для изучения мембранных белков – была экспериментально определена ранее. Но все еще остается ряд противоречий, касающихся понимания механизма протонного транспорта, осуществляемого этим белком. Поэтому развитие и усовершенствование экспериментальных методов исследования мембранных белков, проводимое на бактериородопсине, могло бы помочь как для разрешения противоречий в понимании структуры и механизма действия самого bR, так и для разработки подходов к исследованию других мембранных белков. Параллельно, а зачастую и в качестве альтернативы экспериментальному подходу при исследовании структуры мембранных белков, активно развиваются и применяются методы компьютерного моделирования. В соответствии с изложенным в данной главе в теоретической части исследований, включающей применение методов биоинформатики и компьютерного моделирования, предполагалось решить следующие задачи. 1. Выбор оптимального варианта преобразования Фурье для анализа периодичности аминокислотных последовательностей в различных 57 белках. Исследование периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 и анализ аминокислотной последовательности литического фермента бактериофага phiKZ Pseudomonas aeruginosa с помощью оптимизированного метода преобразования Фурье с целью предсказания вторичной структуры этих белков. 2. Применение исследования оптимального варианта периодичности метода Фурье расположения для аминокислот гидрофобной группы в последовательностях мембранных белков для предсказания использование их нового вторичной метода структуры; разработка компьютерного и анализа расположения трансмембранных участков белков, основанного на применении функции и шкалы гидрофобности, для предсказания вторичной структуры мембранных белков; сравнение оптимизированного метода преобразования Фурье и нового метода компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белков между собой и с другими известными методами. В экспериментальной части исследований, включающей использование ряда генетических, биохимических и биофизических методов, планировалось решение следующих задач. 1. Создание плазмидных векторов для рекомбинантной экспрессии в клетках E. coli двух фибриллярных белков – продуктов генов бактериофага Т4 E. coli, нескольких делеционных мутантов литического фермента бактериофага phiKZ Pseudomonas aeruginosa, бактериородопсина Halobacterium salinarum и нескольких его делеционных мутантов. 2. Выделение и очистка полученных рекомбинантных белков в препаративных количествах для предполагаемой последующей кристаллизации, решения их структуры и выяснения функций. 58 3. Исследование ферментативной делеционных мутантов активности нескольких литического фермента бактериофага phiKZ, а также анализ их КД-спектров для выявления элементов вторичной структуры. 59 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 Материалы, использованные в эксперименте по исследованию белков бактериофагов Т4 и phiKZ (штаммы, ферменты, реактивы) Штаммы бактериальных культур. Для экспрессии гена 35 бактериофага Т4, клонированного в плазмидный вектор pET-23d(+) E. coli (Novagen, США) с промотора фага Т7, использовали штамм E. coli BL21(DE3) (Novagen, США). Для экспрессии гена клонированного в плазмидный вектор 181 бактериофага phiKZ, pQE-30 E. coli (QIAgen, США) с промотора фага Т5, использовали штамм E. coli AD494(DE3) (Novagen, США). Для наработки плазмидных конструкций со вставкой гена 35 и гена 181 был использован штамм E. coli Top10 (Invitrogen, США). Среды для выращивания бактерий. Использовали жидкую питательную среду 2хTY: 16 г триптона (ДИА-М, Россия), 10 г дрожжевого экстракта (DIFCO, США) и 5 г NaCl (Реахим, Россия) на 1 л воды. В качестве твердой питательной среды использовали 2хTY среду, содержащую 1,5% агара (DIFCO, США). Все среды стерилизовали автоклавированием. Векторы для клонирования. Плазмиды. Векторы для клонирования и экспрессии гена 35 и гена 181 pET-23d(+) (Novagen, США) и pQE-30 (QIAgen, США), соответственно. Вектор pQE-30 имеет His-tag или “гистидиновый хвост”, состоящий из шести остатков His. Белок, экспрессированный в таком векторе, будет содержать на своем N-конце шесть дополнительных остатков гистидина, что облегчает процесс очистки белка с помощью аффинной никель-хелатной хроматографии. Плазмиды с фрагментами ДНК, полученные в процессе исследований: 1) pl_g35 вектор pET-23d(+) со вставкой по сайтам NcoI-BamHI, содержащей ген 35 ДХФ (1140 п.н). 2) pl_g35-36 в качестве вектора использовали плазмиду pl_g35 (pET-23d(+), NcoI-BamHI), линеаризованную по сайтам BamHI-XhoI, в качестве вставки 60 плазмиду pl_g36 (pET-23d(+), NcoI-BamHI), порезанную по сайтам BglII-XhoI и содержащую ген 36 ДХФ (660 п.н.). Плазмида pl_g36 была также получена в нашей лаборатории. 3) pl_g181M вектор pQE-30 со вставкой по сайтам BamHI-HindIII, содержащей ген g181M. 4) pl_g181MA вектор pQE-30 со вставкой по сайтам BamHI-HindIII, содержащей ген g181MA. 5) pl_g181E вектор pQE-30 со вставкой по сайтам BamHI-HindIII, содержащей ген g181E. Ферменты. В работе использовались рестриктирующие эндонуклеазы NcoI, BamHI, HindIII, XhoI, BglII и ДНК лигаза фага Т4 фирмы Fermentas (Литва), ДНК полимераза Thermophilus aquaticus (Taq – полимераза) фирмы New England Biolabs (США). Реакции рекомендациям рестрикции и лигирования фирм-изготовителей с проводили использованием согласно прилагаемых буферов. Олигонуклеотиды для проведения ПЦР. Прямой праймер (g35-FOR): 5’- ggt acc atg gaa att tat gg - 3’ Обратный праймер (g35-REV): 5’- gaa gga tcc cta aat tta aac ttc - 3’ Прямой праймер (g181M-FOR): 5’ – aga gga tcc gct caa gct aca – 3’ Прямой праймер (g181E-FOR): 5’ – tat gga tcc atg gag aat aag – 3’ Обратный праймер (g181-REV): 5’ - tat aag ctt acc aag tga ttg act att – 3’ Реактивы. Использовали агарозу, акриламид, ТЕМЕД, PMSF, ампициллин, фенол, хлороформ, IPTG, бромистый этидий фирмы Sigma (США), бакто-триптон, дрожжевой экстракт фирмы Difco (США), SDS (Serva, Германия), Coomassie R (Sigma, США), уксусную кислоту (Реахим, Россия), Tris-НСl (Sigma, США), EDTA (Serva, Германия), лизоцим (Serva, Германия). Растворы приготавливались с использованием полученной на установке Millipore (США). воды Milli-Q, 61 2.2 Материалы, использованные в эксперименте по исследованию бактериородопсина и его делеционных мутантов (штаммы, ферменты, реактивы) Штаммы бактериальных культур. Для экспрессии гена bO (и его делеционных мутантов), выделенного из плазмиды pUCBM20 [167] и клонированного в плазмидный вектор NTS1-1233 [168, 169] с lac промотора, использовали различные штаммы E. coli – DH5α, ER2507, BL21(DE3), BL21Star, BL21(DE3)(pLysS) (New England Biolabs GmbH (NEB), Германия). Для наработки плазмидных конструкций со вставкой гена bO и его делеционных мутантов были использованы штаммы E. coli XL10-Gold (Stratagene, США) и Top10 (Invitrogen, США). Среды для выращивания бактерий. Использовали ряд жидких питательных сред: 1) 2хTY - 16 г триптона (AppliChem GmbH, Германия), 10 г дрожжевого экстракта (AppliChem GmbH, Германия) и 5 г NaCl (AppliChem GmbH, Германия) на 1 л воды; 2) LB - 10 г триптона (AppliChem GmbH, Германия), 5 г дрожжевого экстракта (AppliChem GmbH, Германия) и 10 г NaCl (AppliChem GmbH, Германия) на 1 л воды; 3) TB - 12 г триптона (AppliChem GmbH, Германия), 24 г дрожжевого экстракта (AppliChem GmbH, Германия), 5 г глицерола (MP Biomedicals LCC, Франция), 16.43 г K2HPO43H2O (AppliChem GmbH, Германия), KH2PO4 (AppliChem GmbH, Германия) на 1 л воды; 4) SOC - 2% триптон (AppliChem GmbH, Германия), 0.5% дрожжевой экстракт (AppliChem GmbH, Германия), 10 mM NaCl (AppliChem GmbH, Германия), 2.5 mM KCl (AppliChem GmbH, Германия), 10 mM MgCl2 (AppliChem GmbH, Германия), 10 mM MgSO4 (AppliChem GmbH, Германия), 20 mM глюкоза (Sigma-Aldrich, Германия). 62 В качестве твердой питательной среды использовали LB среду, содержащую 1,5% агара (MP Biomedicals LCC, Франция). Все среды стерилизовали автоклавированием. Векторы для клонирования, плазмиды. Векторы для клонирования и экспрессии pUCBM20 [167] и NTS1-1233 [168, 169]. Плазмида pUCBM20 была любезно предоставлена нашей лаборатории профессором, доктором М. Энгельхардом (Prof. Dr. M. Engelhard, Max-Planck Institute of Molecular Physiology, Otto-Hahn-Str. 11, 44227 Dortmund, Germany), а плазмида NTS11233 − доктором Р. Гриссхаммером (Dr. R. Grisshammer, Membrane Protein Structure Function Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, Rockville, MD 20852, USA). Плазмида pUCBM20 (3525 п.н.) является плазмидой для cell-free экспрессии и имеет в качестве вставки ген bO без лидерного пептида и Asp 249 на С-конце. Плазмида NTS1-1233 (8600 п.н.) имеет His-tag или “гистидиновый хвост”, состоящий из десяти остатков His, наличие которых призвано облегчить процесс очистки белка с помощью аффинной никель-хелатной хроматографии. Также вектор NTS1-1233 содержит крысиный нейротензиновый рецептор (NTR), к N-концу которого присоедин белок MBP (42 кДа), а к C-концу - бактериальный белок тиоредоксин А (TrxA, 12 кДа), который призван стабилизировать конструкцию и увеличить уровни экспрессии и очистки. Ниже приведен список из трех запланированных для получения в процессе исследований плазмид с фрагментами ДНК. Все теоретические разработки плазмид были сделаны с помощью программы APE_Plasmid Editor. В качестве вектора использовалась плазмида NTS1-1233 (сокращенно v.1233), порезанная по сайтам NcoI-HindIII, вставка состояла из трех фрагментов ДНК. 1) pl_bOWT v.1233/NcoI-HindIII со вставкой по сайтам NcoI-HindIII, 63 вставка NA-bOWT-fr.1233: фрагмент NA (219 п.н.), ген bOWT (744 п.н.), fr.1233 (450 п.н.). 2) pl_bO10 − v.1233/NcoI-HindIII со вставкой по сайтам NcoI-HindIII, вставка NE-bO10-fr.1233: фрагмент NE (223 п.н.), ген bO10 (702 п.н.), fr.1233 (450 п.н.). 3) pl_bO13 − v.1233/NcoI-HindIII со вставкой по сайтам NcoI-HindIII, вставка NE-bO13-fr.1233: фрагмент NE (223 п.н.), ген bO13 (693 п.н.), fr.1233 (450 п.н.). Фрагменты NA и являются NE важными участками последовательности в плазмиде NTS1-1233, кодирующими часть MBP и сайт узнавания TEV-протеазой, но при удалении гена, кодирующего NTR, с помощью рестрикции, эти участки вырезаются из последовательности. Из-за трудностей, возникших у нас при клонировании фрагментов NA и NE обратно в плазмиду v.1233, их синтез был заказан в фирме GenScript (США), где они были заклонированы в плазмиду pUC57. Ферменты. В работе использовались рестриктирующие эндонуклеазы NcoI, AatII, Eco47III, XmaI, HindIII, SspI, EcoRI, ScaI фирмы Fermentas GmbH (Германия), ДНК полимераза Phusion® Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific Germany, Finnzymes, Германия), ДНК полимераза Thermophilus aquaticus (Taq – полимераза), ДНК лигаза фага Т4, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов dNTP фирмы NEB GmbH (Германия), щелочная фосфатаза Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (Fermentas GmbH, Германия). Реакции рекомендациям рестрикции и лигирования фирм-изготовителей с проводили использованием согласно прилагаемых буферов. Олигонуклеотиды для проведения ПЦР. Прямой праймер (bRWT-FRW, bR10-FRW, bR13-FRW): frwAatIIEco47 5' - caccggacgtccggagtggatctggctagcgctcggtacggcgctaatgggac - 3' Обратный праймер (bRWT-REV): revBR712XmaI 64 5' - tttcccggggctggtcgcggccgcgccgtcg - 3' Обратный праймер (bR10-REV): revBR659EndoXmaI 5' - tttcccgggtttgtcgtcgtcgtcttcggcttcgccgaagatcgcacgac - 3' Обратный праймер (bR13-REV): revBr347FXaXmaI 5' - tttcccgggccgcccttcgatttcgccgaagatcgcacgactgc - 3' Прямой праймер (fr.1233-FRW): frwXma 45 5' - tttcccggggagaacctgtacttccagtctaacaacaataacaac - 3' Обратный праймер (fr.1233-REV): revHindIII 28 5' - tgccaagctttctagattattaatggtg - 3' Реактивы. Использовали агарозу (Bio-Rad Laboratories GmbH, Германия), краситель нуклеиновых кислот в агарозном геле GelRed Nucleic Acid Stain (Biotium, США), маркер молекулярных масс для электрофореза ДНК - GeneRuler 1kb DNA Ladder, маркер молекулярных масс для электрофореза белков - PageRuler Prestained Protein Ladder, гликоген (Fermentas GmbH, Германия), ДНК-азу, лизоцим, IPTG, имидазол, Tris-НСl, Tris-base, EDTA, PEG 6000, глюкозу, глицин, мальтозу (Sigma-Aldrich, Германия), акриламид и ТЕМЕД (Carl Roth GmbH, Германия), NaCl (Merck KGaA, Германия), PMSF, ампициллин, SDS, N-lauroylsarcosine sodium salt (NLS, Sarkosyl), Coomassie R250, DTT (AppliChem GmbH, Германия), ингибитор протеаз Complete (Roche Applied Science, США), TEV-протеазу (Promega, США), детергенты n-Decyl-β-D-maltopyranoside (DM), n-Dodecyl-βD-maltopyranoside (DDM), Lauryldimethylamine-N-oxide ammonio]-1-propanesulfonate n-Dodecylphosphocholine (LDAO), (CHAPS) (FOS-12), 3-[(3-cholamidopropyl)dimethyl(Affymetrix, США), первичные антитела anti-His (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Германия) и anti-MBP (NEB GmbH, Германия), вторичные антитела anti-Mouse (Sigma-Aldrich, Германия), субстрат NBT-BCIP для иммуноблоттинга (ThermoScientific Germany, Германия), носитель агарозу Ni-NTA(QIAgen, Германия), носитель amylose resin (амилоза) (NEB GmbH, Германия). 65 Растворы приготавливались с использованием воды Milli-Q, полученной на установке Millipore (США). 2.3 Методы генной инженерии 2.3.1 Методы генной инженерии, использованные в эксперименте по исследованию белков бактериофагов Т4 и phiKZ Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Фрагменты ДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции с использованием многоканального амплификатора ДНК МС-2 (ДНК-технологии, Россия). Реакционная смесь содержала следующие компоненты (Promega, США): 10буфер для амплификации.............................................................................5 l MgCl2 (25 mM исх.).............................................................................................8 l Матричная ДНК (плазмида или ДНК фагов Т4/phiKZ с конц. 100 ng/µl).....2 l Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (конц.10 mM).....................................1 l Taq-полимераза................................................................................................0.5 l Pr – FOR………………………………………………………………………...3 l Pr – REV………………………………………………………………...…........3 l Вода mQ…........................................................................(27.5 l) до объема 50 l Поверх реакционной смеси наслаивали 25 l минерального масла (Sigma, США) для предотвращения испарения. Реакцию начинали со стадии предварительной денатурации ДНК при 94оС в течение 3 мин. Затем выполняли 30 циклов амплификации при следующих условиях по температуре и временной продолжительности стадий: 1) 94оС, 1 мин; 2) при соответствующей праймеру температуре отжига Тотж, 1 мин; 3) 720С, 1 мин. По окончанию 30 циклов делали достройку концов при Тдостр =720С в течение 3 мин. Оптимальная температура отжига для данной пары праймеров оказалась Тотж =450С. 66 Праймеры были синтезированы таким образом, чтобы в них содержались нужные последовательности нуклеотидов (сайты рестрикции), отсутствующие в генах 35 и 181; по этим сайтам в дальнейшем производилась рестрикция. Очистка амплифицированных фрагментов. Амплифицированные фрагменты ДНК анализировали по подвижности с помощью электрофореза в 1-2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия по стандартной методике Маниатиса [170]. Продукты амплификации очищали с помощью набора реактивов QIAquick PCR фирмы QIAgen (Германия) согласно инструкции фирмы изготовителя. Выделение и очистка плазмидной ДНК. ДНК выделяли из геля и очищали с помощью набора реактивов QIAquick Gel Extraction фирмы QIAgen (Германия) согласно инструкции фирмы изготовителя. Плазмидную ДНК в аналитических количествах выделяли из 3-10 мл среды с помощью набора реактивов QIAprep Spin фирмы QIAgen (Германия) согласно инструкции фирмы изготовителя. Рестрикция и лигирование. Рестрикция осуществлялась по сайтам NcoI-BamHI (pl_g35), BamHI-XhoI, BglII-XhoI (pl_g35-36) и BamHI-HindIII (pl_g181M, pl_g181MA и pl_g181E) в буфере R+ (Fermentas, Литва), наиболее подходящем для использовали данных вектор, ферментов. линеаризованный Для по постановки лигирования соответствующим сайтам рестрикции и трехкратный избыток клонируемого фрагмента. Реакцию проводили в объеме 20 µl с использованием Т4-ДНК-лигазы и соответствующего буфера в течение 4 часов при 160С. Трансформация компетентных клеток E. coli. После реакции лигирования производили трансформацию компетентных клеток лигазной смесью. К 10 l лигазной смеси добавляли 200 l компетентных клеток штамма Top10 E. coli и инкубировали 30 мин во льду. Потом делали тепловой шок при 420С в течение 1.5 мин. Затем реакционную смесь охлаждали во льду 5 мин, добавляли 200 l 2хYT бульона без ампициллина и 67 инкубировали 1 час при 370С. Выросшие клетки высевали на чашки Петри с 2xYT агаром с добавлением 100 g/ml ампициллина. Смесь втирали стерильным шпателем в агаровый слой и инкубировали в течение ночи при 370С. Селекция клонов клеток Тор10, содержащих рекомбинантные плазмиды. Отбор клонов производился с помощью быстрого скрининга. Как правило, трансформация компетентных клеток Top10 E. coli лигазной смесью давала 15-40 колоний клеток, получивших устойчивость к антибиотику. Собранные с помощью стерильных зубочисток клоны помещали в стерильные пробирки, содержащие по 200 l среды с ампициллином 100 g/ml, и выращивали в течение 3 часов при 370С. Выросшие клетки центрифугировали 1 мин на 12000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 20 l 10 mМ Tris-Cl pH 8,0 и добавляли 20 l смеси фенола и хлороформа (1:1). Экстракционную смесь перемешивали и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Водный слой, содержащий плазмидную ДНК, анализировали методом электрофореза в 1% агарозном геле по стандартной методике Маниатиса [170]. Клетки Тор 10, в клонах которых наблюдалось изменение электрофоретической подвижности плазмиды по сравнению с исходным вектором, переносили в 4 ml 2xYT бульона с добавлением ампициллина и инкубировали при 370С в течение ночи с интенсивной аэрацией. Плазмидную ДНК выделяли и очищали с помощью набора реагентов QIAprep по стандартной методике [171]. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывали соответствующими рестриктазами и анализировали длину фрагментов с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Экспрессия клонированных генов в E. coli. Экспрессию гена, клонированного в соответствующий плазмидный вектор и находящегося под контролем промотора фага Т7, осуществляли по методу Стадиера [172]. Компетентные клетки BL21(DE3) трансформировали сконструированной плазмидой, высевали на чашки с агаром, содержащим ампициллин 100 g/ml, и инкубировали при 37оС в течение 12-18 ч. Колонии трансформантов 68 инокулировали в 4 ml среды 2xTY, содержащей ампициллин 200 g/ml, и выращивали при 37оС до плотности А600 0.6 о.е. Для индукции экспрессии добавляли IPTG до конечной концентрации 1 mМ и продолжали инкубацию в течение 3 ч при 37оС. Клетки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 5 мин (Мegafuge 2.0 R, Heraeus, Германия). Для препаративной наработки полноразмерных рекомбинантных белков gp35 и gp35-36 объем среды культивирования увеличивали до 500 ml. Электрофоретический анализ рекомбинантных белков. 30 l культуры клеток после экспрессии смешивали с 10 l 4-кратного буфера для образцов (0.25 М Трис-НСl, pH 6.8, 8% SDS, 40% (об./об.) глицерина, 0.02% (вес/об.) бромфенолового синего), прогревали при 100 оС в течение 3-5 мин и наносили на гель по 10-20 l. Электрофорез в денатурирующих условиях в присутствии SDS проводили в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Лэммли [29]. Гели окрашивали 0.3% Coomassie R в растворе уксусной кислоты/этанола/воды (1:3:6, об./об./об.), отмывали раствором, содержащим 50% этанола и 7% уксусной кислоты. В качестве маркера молекулярных масс использовали стандартную смесь белков (Pharmacia Biotech, Швеция), содержащую -лактальбумин (14.4 кДа), соевый ингибитор трипсина (20.1 кДа), карбоангидразу (30.0 кДа), овальбумин (43.0 кДа), бычий сывороточный альбумин (БСА) (67.0 кДа), гликогенфосфорилазу (94.0 кДа). Анализ белков на растворимость. После экспрессии клетки центрифугировали и замораживали при температуре -20оС, а затем ресуспендировали в 4 ml TE-буфера (50 mМ Tris-НСl рН 8.0, 5 mМ EDTA) и лизировали в течение 15 мин при комнатной температуре в присутствии 10 l лизоцима (конц. 10 mg/ml). Клеточную суспензию подвергали ультразвуковому разрушению в течение 2-3 мин (разрушение по 15 с, затем перерыв по 15-20 с) на дезинтеграторе UD-20 (Techpan, Польша). Остатки клеточных стенок удаляли центрифугированием при 12000 g в течение 10 69 мин (J2-21, Beckman, Германия). Супернатант и осадок анализировали в 12% SDS-ПААГ. Выделение, рефолдинг и очистка gp35. Белок gp35 при экспрессии в системе E. coli BL21(DE3) дает нерастворимые тельца включения. Осадок клеток из 500 ml культуры ресуспендировали в 4 ml мл буфера, содержащего 50 mМ Tris-HCl pH 8.0, 5 mМ EDTA. Клетки разрушали ультразвуком. Затем центрифугировали в течение 10 мин при 15000 об/мин, 4 oC (ротор Sorvall J21) для удаления клеточных стенок. Супернатант удаляли, а осадок снова растворяли в том же буфере. Этот процесс проводился 4 раза и был необходим для очистки gp35 от клеточных белков. Белок, находящийся в промытом осадке телец включения, ресуспендировали в 2 ml 8 М мочевины. После удаления нерастворившихся частиц центрифугированием, солюбилизированный в мочевине белок наносили на анионообменную колонку (Mono-Q cartridge 5 ml, Pharmacia Biotech, Швеция), предварительно промытую буфером, содержащим 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA и 8 М мочевину, и элюировали линейным градиентом NaCl от 100 до 600 mМ. Фракции, имеющие искомый белок (обычно 100 - 200 mМ NaCl), объединяли, добавляли 0.5 mM PMSF и диализовали в буфере, содержащем 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA. Диализ проводили в течение ночи. Продукты диализа анализировали в 12% SDS-ПААГ. 2.3.2 Особенности методов генной инженерии, использованных при исследовании белка gp181 бактериофага phiKZ с помощью направленного делеционного мутагенеза Экспрессия клонированных генов в E. coli. Экспрессию генов, клонированных в плазмидный вектор pQE-30 и находящихся под контролем промотора фага Т5, Сконструированными осуществляли плазмидами по pl_g181E, методу Стадиера pl_g181M и [172]. pl_g181MA трансформировали компетентные клетки AD494(DE3), имеющие геномную 70 устойчивость к канамицину. Затем клетки, трансформированные плазмидами pl_g181M, pl_g181MA и pl_g181E, соответственно, высевали на чашки с агаром, содержащим ампициллин (100 g/ml) и канамицин (50 g/ml). Чашки с содержимым инкубировали при 37оС в течение 12-18 часов. Затем колонии трансформантов, несущих плазмиды pl_g181M, pl_g181MA и pl_g181E, инокулировали в 150 ml среды 2xTY, содержащей ампициллин (100 g/ml) и канамицин (50 g/ml). Наращивали при 37оС до плотности А600 , примерно, равной 0.6 о.е. Для индукции экспрессии добавляли IPTG до конечной концентрации 1 mM и продолжали инкубацию в течение ночи при 18оС. Клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Для препаративной наработки полноразмерных рекомбинантных gp181MA и gp181E объем среды культивирования увеличивали до 500 ml. Выделение белков и их анализ на растворимость. После центрифугирования клетки ресуспендировали в 20 ml буфера (25 mM TrisНСl рН 8.0, 200 mМ NaCl, 10% сахароза, 0.2% Tween 20), добавляли 1 mM PMSF. Детергент Tween 20 и сахарозу использовали для улучшения солюбилизации. Клеточную суспензию обрабатывали в течение 2-3 мин на ультразвуковом дезинтеграторе за несколько циклов: разрушение 15 с, затем перерыв 15-20 с. Остатки клеточных стенок удаляли центрифугированием при 15000 g в течение 15 мин (J2-21, Beckman, Германия). Супернатант и осадок анализировали в 12% SDS-ПААГ. Очистка белков gp181M, gp181MA и gp181E. После выделения растворимые белки gp181MA и gp181E очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке (High-Trap chelating Ni, 5 ml, Pharmacia Biotech, Швеция) при скорости v = 2 ml/min в ступенчатом градиенте имидазола (050 mM-200 mM), используя буфер 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl. Белок gp181M при экспрессии в системе E. coli AD494(DE3) дает нерастворимые тельца включения. Поэтому белок gp181M, содержащийся в промытом осадке телец включения, ресуспендировали в 10 ml 8 М мочевины (pH 8.1). После удаления нерастворившихся частиц центрифугированием 71 солюбилизированный белок чистили на колонке с носителем Ni-NTA agarose (QIAgen, США), элюируя его натрий-фосфатным буфером в ступенчатом градиенте pH (pH 8.1 - 6.3 - 5.0, 100 mM фосфата натрия, 10 mM Tris HCl, 8 M мочевины). Искомый белок gp181M элюировали мочевиной при pH 5.0. Затем все белки диализовали в буфере, содержащем 20 mM Tris HCl pH 7.5, 200 mM NaCl, 0.5% Tween 80, 0.1% сахарозу. Диализ проводили в течение ночи. Продукты диализа анализировали в 12% SDS-ПААГ. Взаимодействие белков gp181MA и gp181E с различными штаммами бактерии Pseudomonas aeruginosa. Для этого исследования использовались три штамма – PAO, 1 и 37. К 200 l суспензии клеток добавляли 10 l белка gp181E. Центрифугировали на 11 000 об/мин в течение 6 мин. Супернатант и осадок анализировали в 12% SDS-ПААГ. Спектры кругового дихроизма для белков gp181E и gp181MA. Очень важную роль в определении вторичной структуры белков играет метод кругового дихроизма (КД). Он не требует знания общей пространственной структуры белка. Наоборот, структурное исследование белка обычно начинается с получения спектров КД. Метод КД основан на различии в поглощении право- и левополяризованного света в спиралях различной закрученности. Из-за этого различия в поглощении плоскополяризованный свет превращается в эллиптически поляризованный [143]. Для белков gp181E и gp181MA были сняты спектры эллиптичности в ультрафиолетовой области 190-250 нм. Белки gp181E и gp181MA имели концентрацию 1.38 mg/ml и 0.98 mg/ml, соответственно. Определение олигомерности белка gp181E гель-фильтрацией. Препарат очищенного белка gp181E наносили на колонку Superose12 HR10/30 (Pharmacia Biotech, Швеция), уравновешенную буфером, содержащим Tris-HCl pH 8.0, и элюировали со скоростью 0.5 ml/min. Предварительно колонку калибровали стандартами белков. По графику зависимости логарифма молекулярной массы белка от объема элюции определяли наблюдаемую молекулярную массу белка gp181E. 72 2.3.3 Методы генной инженерии, использованные при исследовании бактериородопсина и его делеционных мутантов Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Фрагменты ДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции с использованием многоканального амплификатора ДНК Arktik (ThermoScientific Germany, Германия). Для проведения ПЦР в случае амплификации генов bOWT, bO10, bO13 реакционная смесь содержала следующие компоненты: 10буфер для амплификации.............................................................................2 l MgCl2 (25 mM исх.).............................................................................................2 l Матричная ДНК (плазмида pUCBM20/EcoRI с конц. 131.8 ng/µl)................1 l Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (конц.10 mM)..................................0.4 l Taq-полимераза................................................................................................0.5 l Pr - FOR (bRWT-FRW, bR10-FRW, bR13-FRW)......................................0.2 l Pr - REV (bRWT-REV, bR10-REV, bR13-REV)........................................0.2 l Вода mQ…........................................................................(13.7 µl) до объема 20 l Для проведения ПЦР в случае амплификации фрагмента fr.1233 реакционная смесь содержала следующие компоненты: 10буфер для амплификации.............................................................................2 l MgCl2 (25 mM исх.).............................................................................................2 l Матричная ДНК (плазмида v.1233 с конц. 100 ng/µl).....................................1 l Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (конц.10 mM)..................................0.4 l Taq-полимераза................................................................................................0.5 l Pr - FOR (fr.1233-FRW)……………................................................................0.5 l Pr - REV (fr.1233-REV)…................................................................................0.5 l Вода mQ…........................................................................(13.1 µl) до объема 20 l 73 Для всех четырех фрагментов ДНК был поставлен отрицательный контроль без матрицы. Реакцию начинали со стадии предварительной денатурации ДНК при 98оС в течение 2 мин. Затем выполняли 35 циклов амплификации при следующих условиях по температуре и временной продолжительности стадий: 1) при 98оС, 15 с; 2) при соответствующей праймеру температуре отжига Тотж, 25 с; 3) при 72оС, 45 с. По окончании 35 циклов производилась достройка концов при Тдостр=72оС в течение 10 мин. Оптимальной температурой отжига для прямой и обратной пары праймеров при амплификации генов bOWT, bO10, bO13 оказалась Тотж=67оС. При амплификации фрагмента fr.1233 оптимальной температурой отжига для прямой и обратной пары праймеров является Тотж =55оС. Кроме того, в этом случае первая стадия амплификации проводилась в течение 20 с при 98оС. Остальные условия проведения реакции для фрагмента fr.1233 такие же, как и при амплификации генов bOWT, bO10, bO13. Праймеры были синтезированы таким образом, чтобы в них содержались нужные последовательности нуклеотидов (сайты рестрикции), отсутствующие в генах bOWT, bO10, bO13 и во фрагменте fr.1233; по этим сайтам в дальнейшем производилась рестрикция. Очистка амплифицированных фрагментов. Амплифицированные фрагменты ДНК анализировали по подвижности с помощью электрофореза в 1-2% агарозном геле с добавлением краски GelRed по стандартной методике Маниатиса [170]. Продукты амплификации очищали с помощью набора реактивов QIAquick PCR Purification Kit фирмы QIAgen (Германия) и набора реактивов GeneClean Turbo Protocols MP Biomedicals (США) согласно инструкциям фирмы-изготовителя. Выделение и очистка плазмидной ДНК. ДНК выделяли из агарозного геля и очищали с использованием набора реактивов QIAquick Gel Extraction фирмы QIAgen (Германия), набора реактивов GeneClean Turbo 74 Protocols MP Biomedicals (США), набора реактивов NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel GmbH & Co, Германия) согласно инструкциям фирмы-изготовителя. Плазмидную ДНК в аналитических количествах выделяли из 3-10 мл среды с помощью набора реактивов QIAprep Spin Miniprep Kit фирмы QIAgen (Германия) и NucleoSpin Plasmid MiniPrep (Macherey-Nagel GmbH & Co, Германия) согласно инструкциям фирмы-изготовителя. Большее количество плазмидной ДНК выделяли из 25-100 мл среды с использованием набора реактивов QIAgen Plasmid Midi Kit фирмы QIAgen (Германия) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Концентрация ДНК после выделения измерялась с помощью NanoDrop 2000 Micro-Volume UV-Vis Spectrophotometer for Nucleic Acid and Protein Quantitation (ThermoScientific Germany, Германия). Переосаждение ДНК с помощью этанола. ДНК переосаждали этанолом в двух случаях: для замены буфера во время проведения рестрикции при использовании рестриктаз, работающих в разных буферах; перед проведением реакции лигирования вектор и вставка переосаждались вместе для их лучшего перемешивания. Переосаждение проводилось по стандартной методике с использованием компонентов: осадителя гликогена, 3M AcONa (pH=5.2), 100% EtOH и 70% EtOH. Секвенирование ДНК. Все плазмиды, используемые и полученные в процессе исследований, были секвенированы для определения их нуклеотидной последовательности с помощью специфических праймеров в компаниях Cogenics_Beckman Coulter Genomics (Великобритания) и Eurofins MWG Operon (Германия). Рестрикция, лигирование, трансформация компетентных клеток E. coli. После вышеописанной амплификации фрагментов ДНК (bOWT, bO10, bO13, fr.1233), проверки их двухцепочечности с помощью рестрикции по сайту ScaI для bOWT, bO10, bO13 и по сайту EcoRI для 75 fr.1233, они были залигированы в плазмиду pUCBM20, предварительно порезанную по сайту рестрикции SspI, который при разрезании образует тупые концы. подходящих Реакции рестрикции проводились в буферах, наиболее для данных ферментов согласно инструкциям фирмы- изготовителя (Fermentas GmbH, Германия). Клонирование по тупым концам мотивировано следующим образом. Если проводить реакцию рестрикции амплифицированных фрагментов по введенным в них сайтам узнавания рестриктазами напрямую, а затем анализировать результаты рестрикции с помощью электрофореза в агарозном геле, то не представляется возможным увидеть несколько отрезанных букв в сайтах рестрикции, а значит, нельзя проконтролировать возможное “недорезание” на концах вставок перед лигированием. Как известно, при проведении реакции лигирования по тупым концам необходимо использовать пятикратный избыток клонируемого фрагмента, т.е. молярное соотношение вектор:вставка=1:5. В данном случае, учитывая длины вектора pUCBM20 и вставок bOWT, bO10, bO13, fr.1233, молярные соотношения вектор:вставка при лигировании были вычислены следующими: 1:1 - для bOWT, bO10, bO13, и 1:0.67 - для fr.1233. Вектор и вставка перед реакцией лигирования были переосаждены вместе для улучшения их перемешивания. Реакцию проводили в объеме 20 µl с использованием Т4-ДНК-лигазы (NEB GmbH, Германия) и соответствующего буфера с добавлением ATP (10 mM, исх.) в течение ночи при 16оС. В случае лигирования по тупым концам в реакционную смесь также был добавлен 15% PEG 6000. После лигирования лигазную смесь ставили в термостат (65оС, 10 мин) для инактивации фермента лигазы. Перед трансформацией в лигазную смесь был добавлен рестрикционный фермент SspI для того, чтобы уничтожить будущие клоны без вставок, так как у таких клонов не разрушен сайт SspI, а значит, ДНК порежется по нему. Рестрикция проводилась в лигазном буфере, 76 так как буфер для фермента SspI по своему составу мало отличается от лигазного. После рестрикции лигазная смесь снова была переосаждена. Затем была проведена трансформация компетентных клеток штамма Top10 E. coli лигазной смесью. К 100 l компетентных клеток добавляли 10 l лигазной смеси и инкубировали в течение 30 мин во льду. Потом для клеток создавали тепловой шок при 420С в течение 45 с, после чего реакционную смесь охлаждали во льду 2 мин, добавляли 700 l питательной среды SOC без ампициллина, инкубировали в течение 45 мин при 37 0С, центрифугировали 3 мин на частоте n=3000 об/мин (Eppendorf centrifuge 5417 R, США). После центрифугирования большую часть супернатанта сливали, а в оставшемся количестве, примерно, 100 l ресуспензировали осадок клеток, которые высевали на чашки Петри с LB агаром с добавлением 200 g/ml ампициллина. Смесь втирали стерильным шпателем в агаровый слой и инкубировали в течение ночи при 370С. После того, как на чашках выросли колонии клеток, была проведена селекция клонов клеток Тор10, содержащих рекомбинантные плазмиды. Как правило, трансформация компетентных клеток Top10 E. coli лигазной смесью давала 15-40 колоний клеток, получивших устойчивость к антибиотику. Выросшие колонии пересевали в стерильные пробирки, содержащие по 3 ml среды с ампициллином 150 g/ml, и выращивали в течение ночи при 37оС с интенсивной аэрацией. После этого клетки центрифугировали в течение 10 мин при n=4000 об/мин (Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16 R centrifuge, Германия). Плазмидную ДНК выделяли и очищали с помощью набора реагентов NucleoSpin и QIAprep по стандартной методике [171]. Выделенную плазмидную ДНК обрабатывали соответствующими рестриктазами (bOWT/SspI, SphI; bO∆10/SphI; bO∆13/SphI; fr.1233 /XmaI, HindIII) и анализировали длину фрагментов с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. В общей сложности для 4-х фрагментов было проанализировано, примерно, 130 клонов. Для каждого из фрагментов были найдены клоны, 77 содержащие плазмиду со вставкой нужного размера: bOWT_cl.19; bO∆10_cl.32, 33, 34; bO∆13_cl.13; fr.1233_cl.20, 34. Эти плазмидные ДНК были секвенированы для подтверждения их нуклеотидных последовательностей. Была выявлена на 100% гомология с теоретической последовательностью для клонов bOWT_cl.19; bO∆10_cl.32, bO∆13_cl.13. Для клонов 20 и 34 fr.1233 гомология с теоретической последовательностью составляла 99%. Плазмида pUCBM20, содержащая вставку, была выделена из 50 ml жидкой культуральной среды (с ампициллином 150 g/ml) с использованием набора реактивов QIAgen Plasmid Midi Kit. Затем была проведена рестрикция плазмиды pUCBM20 по сайтам рестрикции с учетом вставки: bOWT/AatIIXmaI, bO10/Eco47III-XmaI, bO13/Eco47III-XmaI, fr.1233/XmaI-HindIII. Рестрикция синтезированных фрагментов NA и NE осуществлялась по сайтам NcoI-AatII и NcoI-Eco47III соответственно при выделении их из плазмиды pUC57. Для постановки окончательного лигирования с тремя вставками использовали вектор v.1233, предварительно выделенный из 50 ml жидкой культуральной среды с помощью набора реактивов QIAgen Plasmid Midi Kit, линеаризованный по сайтам NcoI-HindIII и дефосфорилированный с помощью щелочной фосфатазы SAP (Fermentas GmbH, Германия) для избежания его “залипания” самого на себя. Создание окончательных конструкций для экспрессии начинали с лигирования двойных фрагментов по липким концам NA-bOWT/AatII-XmaI и по тупым концам NE-bO10/Eco47III-XmaI, NE-bO13/Eco47III-XmaI. При лигировании двух фрагментов друг с другом необходимо, чтобы молярное соотношение между фрагментами было 1:1. Но при этом более длинного фрагмента необходимо брать во столько же раз больше по массе, во сколько раз он длиннее другого. Отбор вставок нужного размера проводили с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. 78 Так как в нуклеотидной последовательности фрагмента fr.1233, клонированного в плазмиду pUCBM20, содержалась ошибка, было принято решение не продолжать анализировать клоны, а сделать лигирование фрагмента fr.1233, полученного с помощью ПЦР, напрямую в вектор v.1233. Для этого ПЦР-фрагмент fr.1233 был порезан по сайтам рестрикции XmaIHindIII, введенным в него с помощью соответствующих праймеров. Затем были проведены реакции лигирования и трансформации, а также отбор клонов. При проведении лигирования по липким концам необходимо использовать трехкратный избыток клонируемого фрагмента, чему соответствует молярное соотношение вектор:вставка=1:3. Было выявлено 6 искомых клонов, проверенных секвенированием и содержащих в себе плазмидную ДНК v.1233 со вставкой fr.1233. Окончательным этапом в создании экспрессионных плазмид было лигирование двойных вставок NA-bOWT, NE-bO10, NE-bO13 и вектора v.1233, уже имеющего fr.1233. Электропорация. Отбор клонов. После реакции лигирования была проведена электропорация компетентных клеток штамма Top10 E. coli с помощью ячеек Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories GmbH, Германия). Этот метод более чувствительный, чем обычная трансформация, и позволяет получить большее число колоний. Для каждого из трех видов рекомбинантной плазмиды была произведена селекция клонов с помощью рестрикции и электрофореза в 1% агарозном геле. Выделенные плазмидные ДНК были отсеквенированы для подтверждения их нуклеотидных последовательностей. Оказалось, что из трех запланированных конструкций (pl_bOWT, pl_bO∆10, pl_bO∆13) одна плазмида pl_bOWT содержала нужную вставку ген bOWT. Для двух других конструкций (pl_bO∆10 и pl_bO∆13) после электропорации было проанализировано путем секвенирования порядка 300 клонов, но ни в одном из них не было обнаружено нужных вставок. Экспрессия клонированных генов в E. coli. Экспрессию гена, клонированного в соответствующий плазмидный вектор и находящегося под 79 контролем lac промотора, осуществляли в 5-ти различных штаммах E. coli и в 3-х различных питательных средах 2хTY,TB, LB, указанных выше в разделах Штаммы бактериальных культур и Среды для выращивания бактерий. Во время экспрессии в разных штаммах каждые три часа проводился отбор образцов из культуральной среды для того, чтобы сделать сравнительный анализ белкового состава клеточных лизатов с целью выявления наиболее подходящего штамма и среды для экспрессии целевого белка. Штамм компетентных клеток E. coli ER2507 и среда 2хTY оказались наиболее благоприятными для экспрессии бактериородопсина. Штамм E. coli ER2507 интересен тем, что он является дефицитным по гену malE. Компетентные клетки ER2507 трансформировали сконструированной плазмидой, высевали на чашки с LB агаром, содержащим ампициллин (200 g/ml), стрептомицин (50 g/ml) и канамицин (15g/ml), и инкубировали при 37оС в течение 12-18 час. Экспрессия белка проводилась в 4.8 л культуральной среды 2xTY, содержащей ампициллин (150 g/ml) и глюкозу (0.2% вес/об., или 0.2 г на 100 мл) в шейкере Infors HT Multitron (Германия). Для получения предкультуры колонии трансформантов инокулировали в 500 ml среды 2xTY, содержащей ампициллин (150 g/ml) и глюкозу 0.2% (вес/об.), и наращивали при 37оС до плотности А600 1 о.е. Затем предкультура была добавлена к культуральной среде 2xTY с учетом того, что начальная оптическая плотность среды после добавления предкультуры должна быть А600 0.1 о.е. Когда оптическая плотность достигала значения А600 0.8 о.е., производилась индукция экспрессии с помощью IPTG с конечной концентрацией 0.25 mМ. Во время индукции к культуральной среде также был добавлен 50 mM ретиналь, растворенный в 100% EtOH, для того, чтобы ретиналь встроился в бактериоопсин, и бактериородопсин стал функциональным. После этого продолжали инкубацию в течение 16 час при 22оС. Затем клетки осаждали центрифугированием при n=5000 об/мин в течение 30 мин (Beckman Coulter GmbH, Avanti centrifuge J-26 XP, Германия). Осадок клеток замораживали в жидком азоте и хранили при -80оС. 80 Электрофоретический анализ рекомбинантных белков. 40 l осадка культуры клеток после экспрессии, промытого 0.5 M NaCl (этот шаг использовался для удаления экзополисахаридов и улучшения клеточного лизиса) и растворенного в воде mQ, смешивали с 10 l 5-кратного буфера для образцов (0.25 М Tris-НСl, pH 6.8, 10% SDS, 50% (об./об.) глицерина, 0.02 % (вес/об.) бромфенолового синего, 0.5 M DTT), замораживали при -80оС и размораживали (повторяли это несколько раз), прогревали при 95оС в течение 5 мин, ставили в лед на несколько секунд. Затем центрифугировали при n=14000 об/мин в течение 10 мин. для осаждения клеточных стенок и ДНК. После чего денатурирующих наносили условиях в на гель по присутствии 25 SDS l. Электрофорез проводили в в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Лэммли [29]. Гели окрашивали в растворе: 0.25% (вес/об.) Coomassie R250, 10% (об./об.) уксусная кислота, 45% (об./об.) MetOH, 45% (об./об.) вода, отмывали раствором, содержащим 7% уксусной кислоты. В качестве маркера молекулярных масс использовали маркер для электрофореза белков - PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas GmbH, Германия). Western blot или белковый иммуноблот для определения целевого белка в образце. Для детектирования бактериородопсина в осадке культуры клеток после экспрессии, а также в других случаях, когда необходимо увидеть искомый белок в образце, использовали метод Western blot [173]. Сначала проводили электрофорез в денатурирующих условиях в присутствии SDS в 10% ПААГ. Затем для того, чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану в буфере для переноса (Transfer buffer: 47.9 mM Tris-base, 38.6 mM глицин, 0.0385% SDS, 20% MetOH, mQ) с помощью камеры для мокрого переноса Mini Trans-blot electrophoretic transfer cell (BioRad Laboratories GmbH, Германия). Для блокирования неспецифичных связываний мембрана после переноса была помещена в блокирующий буфер TBST (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 5% глицерин, 0.05% Tween20, 81 0.02% NaN3, 3% обезжиренное сухое молоко, mQ) и выдерживалась при +4оС в течение 12-16 час. После блокирования разведенные в буфере TBST первичные антитела инкубировали с мембраной и слегка встряхивали на качалке в течение 2-х час при комнатной температуре. Разведение делалось в пропорции 1:1000 для аnti-His (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Германия) и в пропорции 1:16000 для anti-MBP (NEB GmbH, Германия). Затем мембрана отмывалась от несвязавшихся первичных антител буфером TBST. После этого мембрана инкубировалась с разведенными в буфере TBST вторичными антителами в течение 1.5 час при комнатной температуре на качалке. Разведение было сделано в пропорции 1:2000 для anti-Mouse (Sigma-Aldrich, Германия). Затем мембрана отмывалась от несвязавшихся вторичных антител буфером TBST и буфером TBST без молока. Для детектирования белка к отмытой мембране добавляли 8 ml субстрата NBT-BCIP (ThermoScientific Germany, Германия). Получение клеточных мембран. Осадок клеток, хранившийся при 80оС, размораживали в воде. Затем ресуспендировали его в лизирующем буфере (Lysis buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCl , 5% glycerol) из расчета 10 ml буфера на каждый грамм клеток (wet weight) и инкубировали с добавлением 0.5 mg/ml лизоцима, ДНКазыI и ингибиторов протеаз (0.5 mM PMSF, Complete). После этого клетки разрушали с помощью пресса (French press, SLM-Aminco Spectronic Instruments, США). Для выделения клеточных мембран из разрушенных клеток использовали ультрацентрифугирование на частоте 45000 об/мин в течение 60 мин при +4оС (Beckman Coulter GmbH, Optima L-90K ultracentrifuge, Германия). Осадки, содержащие клеточные мембраны, гомогенизировали в лизирующем буфере, содержащем 40 mM имидазола. Солюбилизация (выделение белка из мембраны) и скрининг детергентов. Для солюбилизации мембранных белков используются различные детергенты, которые должны поддерживать стабильность таких белков после их выделения из мембранного окружения. Обычно 82 используются 1-2% детергенты, в зависимости от их вида и CMC (critical micelle concentration). Был проведен скрининг детергентов для выявления наиболее подходящего для солюбилизации бактериородопсина, экспрессированного в системе, описанной выше. В процессе скрининга проверялось влияние 7 различных детергентов (DM, DDM, CHAPS, SDS, FOS-12, NLS, LDAO) на солюбилизацию bR. Для проведения солюбилизации к гомогенизированным клеточным мембранам добавлялись детергенты с концентрацией от 0.2% до 2%. Суспензия перемешивалась на магнитной мешалке при низкой скорости в течение 14-18 час при +4оС. После солюбилизации проводилось ультрацетрифугирование на частоте 45000 об/мин в течение 60 мин при +4оС для отделения несолюбилизировавшихся мембран (Beckman Coulter GmbH, Optima L-90K ultracentrifuge, Германия). На каждом из этапов получения клеточных мембран и солюбилизации были отобраны образцы для проведения электрофореза в SDS-ПААГ и Western blot’а. Очистка рекомбинатного bO на amylose resin. Бактериоопсин в составе комплекса MBP-bO-TrxA-His10 был очищен с помощью аффинной хроматографии на амилозном носителе (NEB GmbH, Германия). Очистка проводилась в двух вариантах: с выделением клеточных мембран (из мембранной фракции) и без выделения клеточных мембран, т.е. из общего клеточного лизата. Эти варианты различаются по времени проведения ультрацентрифугирования и чистоте получаемого белка. При выделении мембран ультрацентрифугирование проводится сразу после разрушения клеток с использованием пресса (French press), и солюбилизация осуществляется непосредственно из мембран. При очистке из общего клеточного лизата солюбилизации подвергаются все разрушенные клетки, и только после этого проводится ультрацентрифугирование. В обоих случаях для ресуспендирования клеток перед их разрушением с помощью French press и во время очистки использовался лизирующий буфер Lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 83 DTT, 5% glycerol). Белок, солюбилизированный в 1-2% детергенте, разбавлялся лизирующим буфером в 2-2.5 раза, т.к. большая концентрация детергента может помешать связыванию белка с носителем из-за того, что белок окружен детергентной "шубой". Согласно руководству фирмыизготовителя (NEB Manual) 1 ml носителя amylose resin связывает до 3 mg белка. Белок может быть нанесен на колонку двумя способами: самотеком и в объеме. Первый вариант длительнее, но предпочтительнее второго, так как белок в этом случае связывается с носителем более равномерно (кольцом), занимая вакантные места постепенно. При нанесении в объеме белок распределяется по носителю неравномерно – “размазывается” и при элюировании не сходит одним пиком. Исходя из этого, разбавленный белок наносился на колонку с амилозой, предварительно промытую водой и уравновешенную лизирующим буфером с 0.1-0.2% детергентом, который использовался также в качестве Washing buffer. Белок элюировался лизирующим буфером с 0.1-0.2% детергентом и 10 mM мальтозой. Обычно собиралось 10-20 фракций по 0.4-1 ml каждая. Фракции, содержащие искомый белок (обычно, первые 5-7 фракций), объединяли и концентрировали с помощью центриконов (50 kDa, Millipore, Amicon Ultra, США). Очистка рекомбинатного bO на Ni-NTA resin. Бактериоопсин в составе комплекса MBP-bO-TrxA-His10 был очищен с помощью аффинной хроматографии на носителе nickel nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) (QIAgen, Германия). Основные этапы очистки на носителе Ni-NTA идентичны этапам очистки на амилозе. Но есть ряд важных отличий. Для очистки на Ni-NTA используется лизирующий буфер Lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCl, 5% glycerol), в котором отсутствуют компоненты EDTA и DTT, использующиеся при очистке на амилозе, т.к. они разрушают носитель NiNTA. Однако, во время солюбилизации и на всех стадиях очистки в лизирующий буфер добавляется 40 mM имидазола. Количество носителя, 84 необходимое для очистки, определялось в соответствии с руководством фирмы-изготовителя (QIAgen Manual), указывающим, что связывающая емкость Ni-NTA resin составляет 50 mg/ml. Белок элюировался лизирующим буфером с 0.1-0.2% детергентом и 500 mM имидазола. Собиралось 10-20 фракций по 2 ml каждая. Фракции, содержащие искомый белок (обычно белок начинает элюироваться в 6-7 фракциях), объединяли и концентрировали с помощью центриконов (50 kDa, Millipore, Amicon Ultra, США). Отрезание аффинных тэгов (tags) от белкового комплекса, содержащего рекомбинантный bO, с помощью TEV-протеазы. После очистки белкового комплекса, содержащего рекомбинантный bO, с использованием аффинной хроматографии на носителях Ni-NTA resin и/или amylose resin необходимо было отделить рекомбинантный бактериоопсин от аффинных тэгов (хвостов), с помощью которых белковый комплекс осаждался на носителях, а именно, His10-tag на С-конце и MBP на N-конце. Для отрезания тэгов использовалась TEV-протеаза (Promega, США), сайты узнавания которой были закодированы в рекомбинантной плазмиде. Так как TEV-протеаза чувствительна к некоторым детергентам, а в сильных денатурирующих детергентах, таких как SDS, эта протеаза неактивна, был проведен сравнительный анализ работы TEV-протеазы в 3-х различных детергентах (NLS, DDM, FOS-12), которые лучше других подошли для солюбилизации и процедуры очистки бактериоопсина. После очистки и концентрирования белка был проведен его диализ против лизирующего буфера, содержащего 0.2% детергента. Это делалось для того, чтобы уменьшить количество детергента и удалить имидазол после очистки на Ni-NTA, т.к. TEV-протеаза не функционирует при высоких концентрациях детергентов 1% и в присутствии имидазола. Диализ проводился в течение ночи при +4оС. После диализа белок концентрировали и обрабатывали TEV-протеазой по протоколу, описанному фирмойизготовителем (Promega, ProTEV Protease General Protocol, США). Реакция 85 проводилась в однократном буфере (1×ProTEV Buffer) с добавлением 1 mM DTT в течение ночи при +30оС. Результаты реакции анализировались в 10% SDS-ПААГ. Измерение концентрации белка. Для того, чтобы определить концентрацию белка, использовался спектрофотометр DU800 UV/Vis Spectrophotometer (Beckman Coulter GmbH, Германия). В контрольной кювете находился буфер, в котором был растворен белок. Измерялись максимумы поглощения белка на длинах волн 280 нм (абсорбционный максимум для ароматических аминокислот) и 558 нм (абсорбционный максимум для адаптированной к темноте форме − Dark Adapted form − бактериородопсина). 2.4 Методы компьютерного анализа и биоинформатики, применяемые для теоретического исследования белков 2.4.1 Методы биоинформатики для исследования периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 Неединственность периодичности преобразования Фурье аминокислотных для анализа последовательностей. Последовательности аминокислот некоторых фибриллярных белков могут иметь периодическое строение. Для анализа этой периодичности иногда используют преобразование Фурье математического образа символьной последовательности аминокислот в белке. Преобразование для символьной последовательности аминокислот в полипептидной цепи может быть выполнено не единственным образом – можно предложить способов. несколько Во-первых, различающихся по-разному можно отдельными выполнить деталями перекодировку (“оцифровку”), т.е. замену буквенной последовательности ее математическим образом – функцией f(x). Последняя может быть выбрана кусочно-гладкой 86 [174, 175], например, представлять в графическом виде последовательность прямоугольных импульсов одинаковой амплитуды и одинаковой (или разной, с учетом размеров элементов полипептидной цепи) ширины, или дискретной функцией F(k) от порядковых номеров k мест, занимаемых элементами последовательности [146, 150]. Во-вторых, выбранную функцию-образ можно представлять в виде ряда или интеграла Фурье с соответственно дискретным или непрерывным спектрами частот [175]. В-третьих, амплитудные коэффициенты гармоник ряда (или интеграла) могут быть действительными или комплексными числами и по-разному пронормированы [146, 150, 174], что, впрочем, никак не влияет на относительную интенсивность гармоник в спектре. Проведенное нами сравнение различных способов преобразования показало, что оптимальным для анализа периодичностей аминокислотной последовательности белка представляется разложение ее дискретной функции-образа F(k) в ряд Фурье [150]. Такого рода дискретное преобразование Фурье использовалось уже в одной из ранних работ [146] по этой теме. Алгоритм метода Фурье в применении к последовательности аминокислот белка. Рассмотрим, например, относительно короткую последовательность аминокислот белка gp36: MADLKVGSTTGGSVIWHQGNFPLNPAGDDVLYKSFKIYSEYNKPQAADN DFVSKANGGTYASKVTFNAGIQVPYAPNIMSPCGIYGGNGDGATFDKANI DIVSWYGVGFKSSFGSTGRTVVINTRNGDINTKGVVSAAGQVRSGAAAPIA ANDLTRKDYVDGAINTVTANANSRVLRSGDTMTGNLTAPNFFSQNPASQP SHVPRFDQIVIKDSVQDFGYY. Она состоит из L=221 члена, которые представляют собой чередующиеся аминокислотные остатки, все 20 типов которых можно классифицировать 4мя следующими группами [176]: 1) гидрофобные (сокращенно – gfb): A; F; G; I; L; V; W; Y; 2) гидрофильные с положительным зарядом (сокращенно – gfl “+”): H; K; R; 87 3) гидрофильные с отрицательным знаком заряда (сокращенно – gfl “–”): D; E; 4) все остальные (сокращенно – rem): M; N; P; Q; S; T; C. При исследовании Фурье-методом периодичности расположения в аминокислотной последовательности белка элементов какой-либо одной (или объединяющей сразу 2-3) из указанных групп данную буквенную последовательность надо заменить ее математическим образом – кусочногладкой f(x) или дискретной F(km) функцией от порядковых номеров km мест, занимаемых в цепи M элементами (m=1, 2,…M) интересующей группы, после чего они становятся неразличимы (рисунок 2.1). f(x), F(km) F(km) f(x) 1 x 0 1 2 3 4 L-2 L-1 L Рисунок 2.1 - Кусочно-непрерывная функция f(x) и дискретная функция F(km) – математические образы последовательности аминокислот в белке Предположим, функция f(x) задана на множестве x[0, L], например, в виде M f ( x ) ((k m 1) (k m )) , m 1 (2.1) 88 где (x) - ступенчатая функция Хевисайда [174]. График функции (2.1) представляет собой последовательность прямоугольных импульсов с шириной и амплитудой, равными 1, каждый из которых расположен между значениями аргумента km1 и km (рис. 2.1). Функция (2.1) удовлетворяет условиям абсолютной интегрируемости, кусочной гладкости и может быть представлена тригонометрическим рядом Фурье [174, 175] f (x) nmax a0 a (an cos(n x ) bn sin(n x )) 0 (an cos(n x ) bn sin(n x )) 2 n 1 2 n 1 (2.2) с коэффициентами an 2L f ( x ) cos(n x )dx , L0 bn 2L f ( x ) sin(n x )dx , L0 n=2n/L, n=0, 1, 2…L. (2.3) (2.4) Такое преобразование функции f(x) характеризуется зависимостью I(n)=c(n) 2=cn2=an2+bn2, (2.5) которую называют спектром Фурье, а cn2 – интенсивностью гармоники с частотой n [146]. Для ряда (2.2) набор частот спектра (2.4) – дискретный. Если доопределить (в соответствии с теорией [175]) функцию f(x) на всей числовой оси x(–, ), положив ее значения равными нулю за пределами отрезка [0, L], то получившуюся таким образом функцию можно представить в виде интеграла Фурье f ( x ) (a() cos( x ) b() sin( x )) d , =2n/L, n[0, ) (2.6) 0 с непрерывным спектром I()=c2()=a2()+b2(), где a() 2L f ( x ) cos( x )dx , L0 b() 2L f ( x ) sin( x )dx . L0 (2.7) Интегралу соответствует более подробный непрерывный спектр c2(), в котором пики оказываются более плавными, чем в дискретном. Однако, путем статистического последовательности со анализа случайным непрерывного расположением спектра элементов для можно показать, что в нем при небольших полуцелых значениях n=3/2, 5/2, 7/2… могут возникать ложные интенсивные пики, затрудняющие анализ 89 периодичности. Поэтому представление функции f(x) рядом (2.2) лучше и проще, чем интегралом (2.6). Другой вариант – задать f(x) на дискретном множестве x=k=1, 2,…L (рис. 2.1), например, используя обобщенную -функцию Дирака [174]: M f ( x ) f (k ) F (k m ) ( x k m ) . (2.8) m 1 В этом случае вместо интегралов в формулах (2.2) вычисляются суммы an 2 M cos(n k m ) , L m1 bn 2 M sin(n k m ) , L m1 (2.9) что, конечно же, гораздо удобнее, поэтому дискретная функция (2.8) предпочтительнее непрерывной (2.1). Отметим, что дискретную функцию типа (2.8) иногда называют функцией положения [150], она принимает всего 2 значения: f=1 при k=km, и f=0 при остальных k. Разные варианты нормировочными Фурье-преобразования множителями. Так, в могут работе [146] отличаться в формулах, аналогичных (2.9), перед знаком суммы используется множитель 1/L вместо 2/L. Соответственно, для правильного восстановления функции f(x) другим должен быть и общий множитель у членов ряда (2.2) или в обратном преобразовании Фурье. Но это непринципиально, т.к. при анализе периодичности в спектрах Фурье сравнивают относительные интенсивности различных спектральных компонент cn2. В этом смысле разложения дискретной функции (2.8) в действительный (2.2) или комплексный ряд Фурье [146, 150] совершенно эквивалентны. Стоит отметить, что дискретные прямое и обратное преобразования являются взаимно-однозначными f(k)cn, (k, n=1, 2,...L) [150]. Это обстоятельство рассматривают как преимущество данного способа Фурье-трансформации перед другими при анализе периодичности последовательности f(k), поскольку эта периодичность проявляется особенностями в спектре cn2, например, наличием серии эквидистантных (по переменной n) пиков [150]. Таким образом, последовательности для белка анализа из периодичностей нескольких аминокислотной возможных способов 90 преобразования Фурье: ряд (2.2) или интеграл (2.6), для непрерывной (2.1) или дискретной (2.8) функции f(x) наиболее оптимальным представляется дискретное преобразование Фурье по формулам (2.2), (2.9), (2.5). Статистические характеристики и особенности Фурье-спектров для символьных последовательностей аминокислот в белке. В Фурьеспектрах, полученных любым из вышеуказанных возможных способов, присутствует много пиков разной интенсивности I(n). Возникает вопрос: как отличить достоверные от случайных? Он решался путем проведения статистического анализа спектра Фурье для дискретной функции типа (2.8), соответствующей символьной последовательности аминокислот со случайным расположением в ней элементов выделенной группы [146, 150]. В результате было установлено, что среднее значение интенсивностей <I>=<c2> спектральных компонент в Фурье-преобразовании (2.2), (2.9), (2.5) может быть определено по простой формуле с2 4M L M . L2 L 1 (2.10) Замечание: эта формула отличается от аналогичной формулы, полученной в работе [146], числовым множителем 4, что обусловлено присутствием в формулах (2.9) числового коэффициента 2, которого нет в соответствующих выражениях для an и bn работы [146]. В работе [146] была подробно выведена также и формула для дисперсии 2, т.е. среднего значения квадрата отклонения интенсивности c2 пиков от ее среднего значения <с2>. В соответствии с последним замечанием, для Фурье-спектра, определяемого формулами (2.5) и (2.9), формула для дисперсии содержит дополнительный числовой множитель 16: 2 при В 16 M (M 1)(L M )(L M 1) L, M 1 зависимости L3 (L 1)2 (L 2 ) , (2.11) 2 M LM 2 2 2 2 16 c I 2 L 1 L от жесткости требований, (2.12) предъявляемых к достоверности пиков в Фурье-спектре аминокислотной последовательности 91 белка, доверительный уровень их интенсивности может быть выбран разным: IJ =<I>+J, J=0, 1, 2, 3... Интенсивность пиков в спектре распределена по закону 2, который при больших длинах L последовательности и большом числе M элементов, представляющих в ней исследуемую на периодичность группу аминокислот, стремится к нормальному распределению Гаусса [146, 149]. Поэтому для J=0, 1, 2, 3 вероятность того, что интенсивность пика случайно превысит уровень IJ, составляет, соответственно, 50%, 16%, 2,3% и 0,13% [174], то есть, чем выше уровень доверия J, тем меньше вероятность его случайного превышения каким-либо пиком в Фурье-спектре. Полученные нами спектры для последовательностей аминокислот фибриллярных белков представлены и проанализированы в главе 3. Здесь же стоит сделать ряд следующих замечаний об особенностях таких спектров. 1) О пиках на кратных частотах. Если на какой-то частоте n=2n/L (периоде Тn=2/n=L/n, n=1, 2,…L) обнаруживается достаточно интенсивный пик I(Тn)>I1, то и на кратных ей больших частотах np=pn при p=2, 3, 4… (периодах Tnp=Тn/p<Tn) также могут быть обнаружены пики I(Тnp), сравнимой с I(Тn) несколько большей или меньшей интенсивности. Это та самая “серия эквидистантных пиков” [150]. При этом все пики в ней порождаются одной и той же периодичностью с основным наибольшим периодом Тn, а пики с меньшими периодами Tnp=Тn/p можно не принимать во внимание. 2) О неточности определения периода. Период Тn=L/n каждой спектральной компоненты определяется с погрешностью Tn=Tn/n(n)=Tn2/L(n), где n=1/2 – половина шага изменения номеров n гармоник, определяющая минимальную полуширину пика Tn на графике спектра I(Tn). 3) О спектрах взаимно дополняющих групп. Спектры Фурье для каждой пары аминокислотных групп, представляющих соответственно M и LM членов, взаимно дополняющих друг друга до полной 92 последовательности, абсолютно одинаковы (принцип взаимности), например, спектр объединенной gfb+gfl-группы (без различения знака заряда в gflгруппе) и спектр объединяющей остальные аминокислоты rem-группы. 4) О симметрии частотного спектра Фурье. Частотный спектр обладает симметрией относительно его середины по оси частот: I(n)= I(Ln) [146, 150]. 5) О нормировке спектров. Все приведенные в данной работе спектры нормированы делением интенсивности I(Tn) на ее среднее по спектру значение <I> так, что средний уровень I0=1=, а другие уровни доверия IJ=J+1, J=1, 2, 3. 2.4.2 Вычислительные методы предсказания вторичной структуры мембранных белков по их аминокислотной последовательности Применение метода Фурье для исследования периодичности расположения аминокислот гидрофобной группы в последовательностях мембранных белков. Из многообразия всех мембранных белков значительный интерес вызывает группа интегральных трансмембранных белков, имеющих пронизывающих несколько мембрану и гидрофобных совместно участков, насквозь выполняющих функцию транспортных каналов для различных веществ. Очевидная особенность этих белков состоит в том, что свойство повторяемости (возможно, периодической) в расположении гидрофобных аминокислот им органически присуще. Если отмеченная повторяемость периодическая, то она как глобальное свойство и признак вторичной структуры белка может быть выявлена вышеописанным методом с использованием преобразования Фурье для исследования фибриллярных белков [177]. Этот же алгоритм применим к исследованию периодичности различных трансмембранных белков. 93 В спектре Фурье для последовательности каждого из исследованных мембранных белков проявлялся период, который, согласно данным источника [178], трансмембранном в среднем был участке-домене равен (TMD) общему и числу примыкающем членов к в нему топологическом домене (TPD). Тогда число NTMD трансмембранных участков (иначе говоря, число альфа-спиралей в цепи) можно приближенно определить по предлагаемой формуле NTMD = L/T–1 = n−1, (2.13) где L вся длина цепи, T главный период последовательности, определенный из ее спектра Фурье для аминокислот гидрофобной группы по пику с максимальной интенсивностью I(T) среди пиков с большими значениями периодов T. Он равен средней длине участков повторения элементов цепи. Вычитание единицы в формуле (2.13) учитывает, что число TPD на единицу больше, чем число TMD. Новый метод анализа расположения трансмембранных участков белка путем многократного усреднения функции гидрофобности внутри “окна”, перемещаемого вдоль полипептидной цепи. Поскольку TMD состоят в большей степени из гидрофобных аминокислот [151], понятно, что средняя по такому участку величина гидрофобности, задаваемая в последовательности белка некоторой функцией f(k) = HN[i(k)] от номера k аминокислоты в цепи, должна быть выше, чем в примыкающих к нему с обеих сторон гидрофильных TPD. Причем, это локальное свойство совершенно не зависит от периодичности расположения характерных участков TMD и TPD в последовательности аминокислот белка. Здесь i(k) = 1, 2,…20 это номер той из известного ряда 20 аминокислот (табл. 2.1), которая стоит в последовательности белка на месте с номером k. Впервые эту идею реализовали авторы работы [151], которые использовали усреднение функции f(k) в пределах перемещаемого вдоль 94 последовательности аминокислот сегмента “окна” шириной d = 5, 7, 9, 11, 13 a.о. Результат последовательности усреднения присваивали f1(k) с номером члену новой числовой k, соответствующим текущему положению средней точки сегмента. Используемая в этом методе шкала гидрофобности HN(i) может быть задана многими способами (таблица 2.1) в зависимости от характеризующей это свойство и физически измеряемой величины [151-155]. Таблица 2.1 - Шкалы гидрофобности HN(i) i Код Название H1(i), H2(i), H3(i), H4(i), H5(i), H6(i), [176] [154] [154] [154, 179] [155] [153] 1 A Alanine 1 0 0 0.74 0.62 1.60 2 C Cysteine 0 1 1 0.91 0.29 2.00 3 D Aspartic acid 0 0 -1 0.62 -0.90 -9.20 4 E Glutamic acid 0 0 -1 0.62 -0.74 -8.20 5 F Phenylalanine 1 1 1 0.88 1.19 3.70 6 G Glycine 1 0 -1 0.72 0.48 1.00 7 H Histidine 0 0 0 0.78 -0.40 -3.00 8 I Isoleucine 1 1 1 0.88 1.38 3.10 9 K Lysine 0 0 -1 0.52 -1.50 -8.80 10 L Leucine 1 1 1 0.85 1.06 2.80 11 M Methionine 0 1 1 0.85 0.64 3.40 12 N Asparagine 0 0 -1 0.63 -0.78 -4.80 13 P Proline 0 0 -1 0.64 0.12 -0.20 14 Q Glutamine 0 0 -1 0.62 -0.85 -4.10 15 R Arginine 0 0 -1 0.64 -2.53 -12.3 16 S Serine 0 0 -1 0.66 -0.18 0.60 17 T Threonine 0 0 -1 0.70 -0.05 1.20 18 V Valine 1 1 1 0.86 1.08 2.60 19 W Tryptophan 1 1 1 0.85 0.81 1.90 20 Y Tyrosine 1 0 0 0.76 0.26 -0.70 В работах [151153] в качестве меры гидрофобности использовали изменение величины свободной энергии боковых групп аминокислот при их 95 переносе из гидрофобной среды в воду. В работах [154, 179] мера (шкала) гидрофобности аминокислот определена в виде функции Н4(i) = 1−<A>/A0 (табл. 2.1) по величинам площади A0(i) поверхности аминокислотного остатка, доступной для растворителя в стандартном состоянии, и средней площади <A(i)>, доступной в свернутом состоянии белка. В работе [154] установлена корреляция между величиной свободной энергии и площадью поверхности доступной для растворителя. В данной работе сначала использовали ту же простейшую функцию гидрофобности (2.8), что и в вышеописанном методе преобразования Фурье. Процедура усреднения функции f(k) по шкале HN(i) отлична от той, которую использовали в работе [151]. В данном исследовании усреднение проводилось не один, а несколько раз по алгоритму , n = 1, 2,…5, f0(k) = f(k), (2.14) где каждое новое усреднение производили над предыдущей функцией по окну большей ширины d = 2n + 1: первое усреднение по 3 элементам, второе – по пяти и т.д. Наилучший результат, на наш взгляд, достигался при n = 4, усреднении по окну шириной d = 9 a.о. (иногда при n = 5, d = 11 a.о.). 2.5 Заключение по главе 2 Таким образом, в данной главе описаны экспериментальные методы генной инженерии, используемые для получения белков, и компьютерные методы исследования их структуры. К первым относятся клонирование генов, экспрессия и очистка белков. Ко вторым – оптимизированный метод Фурье, позволяющий исследовать периодичность аминокислотной последовательности белка, а также впервые предложенный в данной работе новый метод анализа расположения трансмембранных участков белка путем 96 многократного усреднения функции гидрофобности перемещаемого вдоль полипептидной цепи. внутри “окна”, 97 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Исследование периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках и литических ферментах бактериофагов Т4 и phiKZ методами биоинформатики Решение структуры фибриллярных белков интересно не только с научной точки зрения, но также и с практической. Фибриллярные белки, выполняющие разнообразные биологические функции, являются одними из наиболее интересных и важных объектов современной молекулярной биологии. Так, вирусные белки фибриллярной природы играют первостепенную роль в процессе инфицирования. Узнавание специфических рецепторов на поверхности клетки-хозяина и адсорбция вируса на мембране происходит именно при помощи фибриллярных адгезинов. Таким образом, исследование функциональных участков этих белков, определение их структуры и механизма взаимодействия с рецепторами клетки представляют интерес для разработки способов борьбы с вирусными инфекциями. Целью данной части работы было применение описанного в главе 2 оптимального преобразования Фурье для исследования периодичностей фибриллярных белков и литических ферментов бактериофагов Т4 и phiKZ. Интерпретация рассчитанных Фурье-спектров для фибриллярных белков и анализ их периодичности. На языке программирования Delphi была написана специальная программа, с помощью которой для некоторых белков бактериофага Т4 были получены спектры Фурье несколькими возможными способами из вышеописанных. Их сравнение показало, что количество наиболее интенсивных пиков в спектрах и их положение могут различаться, в них могут быть как общие достаточно интенсивные пики, так и индивидуальные. При этом были подтвержден вывод о том, что наиболее подходящим преобразованием Фурье для анализа периодичности полипептидных цепей является способ с использованием формул (2.5), (2.9). 98 Этим оптимальным методом Фурье-трансформации аминокислотных последовательностей сначала были исследованы пять (gp34-gp38) из шести белков, участвующих в формировании длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4, а также два других его белка gp5 и gp12 с уже известной целиком или частично структурой [13, 180]. Были получены Фурье-спектры I(n) как для полных последовательностей, так и для их частей, построены соответствующие графики зависимости интенсивности пиков I(Tn), которая пропорциональна вероятности повторения аналогичных элементов цепи c периодом Tn, для гидрофобных (gfb), гидрофильных (gfl) групп аминокислот и объединяющей их gfb+gfl-группы (рисунки 3.1-3.4). На рисунке 3.1 представлены спектры Фурье, полученные для двух аминокислотных групп белка gp36. gp36 (gfb) gp36 (gfl) 4 55.5 11.6 5.1 3 14.7 I3 15.8 Intensity 7.6 2 I0 1 0 10 Period 100 горизонтальные линии – уровни I0 и I3 Рисунок 3.1 - Спектры Фурье для групп гидрофобных (gfb) и гидрофильных (gfl) аминокислот в белковой последовательности gp36 99 Очевидно, в спектре gfb-группы на рисунке 3.1 присутствует достаточно интенсивный (I>I3) пик с относительно малым периодом Т=14.70.515. Как и должно быть, согласно замечанию 1) в п. 2.4.1, тот же пик воспроизводится на кратных частотах: двукратной с периодом Т=7.60.17.5 и трехкратной частоте с периодом Т=5.10.15. В спектре gfl-группы на рисунке 3.1 также имеется пик с малым периодом Т=15.80.6 (близким к 15), он же воспроизводится на трехкратной частоте с Т5. Кроме того, здесь присутствует другой очень интенсивный и широкий пик с максимумом на относительно большом периоде Т=55.3557 (он же, как видно, воспроизводится на пятикратной частоте с периодом Т11.60.3). Пик с таким же периодом Т=55.3 имеет место и в спектре, полученном для объединенной gfb+gfl-группы гидрофобных и гидрофильных аминокислот. Интересно отметить, что вся последовательность белка gp36 длиной L=221 делится большим периодом Т=55.25=L/4 на 4 равные части. На рисунке 3.2 представлены спектры, полученные для белка gp35. Очевидно, в спектре gfb-группы присутствует спектральная компонента с малым периодом Т=15.30.415, а также пик на двукратной частоте с периодом Т=7.40.1. Такой же пик имеется на рисунке 3.2 в спектре для объединенной gfb+gfl-группы. Кроме того, в обоих спектрах есть пик с большим периодом Т=464. Не исключено, что он и воспроизводится на указанных малых периодах Т=15 и 7.5. Вся последовательность белка gp35 длиной L=275 делится большим периодом Т=45.7275/6=L/6 на 6 равных частей. На рисунке 3.3 приведены спектры, рассчитанные для объединенной gfb+gfl-группы аминокислот белка gp38 и для группы гидрофобных аминокислот в C-концевой части белковой последовательности gp5 (с 441 по 552 элементы). В спектре белка gp38 на рисунке 3.3 среди всех имеющихся выделяется очень интенсивный пик с малым периодом Т=9.60.310 и еще один достаточно интенсивный пик с большим периодом Т=45.6466, 100 которым вся последовательность аминокислот данного белка делится на 4 равные части. С учетом погрешности пик с меньшим периодом из двух здесь указанных может рассматриваться как соответствующий пятикратной частоте другого или как самостоятельный. gp35 (gfb) gp35(gfb+gfl) 7.4 7 45.7 6 5 15.3 Intensity 4 5.8 13.1 I3 17.3 3 2 I0 1 0 10 100 Period Рисунок 3.2 - Спектры Фурье для группы гидрофобных (gfb) аминокислот и объединенной gfb+gfl-группы в белковой последовательности gp35 С помощью созданной программы также исследовались на периодичность белки gp5 и gp12, структура которых была определена ранее методами рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии STEM [13, 180]. Данные о периодичности, полученные методом преобразования Фурье, хорошо согласуются с экспериментальными. Так, известно, что для Cконцевых частей белков gp5 и gp12 характерны повторы с периодом Т=8. Аналогичный период был установлен в их Фурье-спектрах, один из которых представлен на рисунке 3.3. 101 gp5C (gfb) 6 gp38 (gfb+gbl) 9.6 8.3 5 45.6 Intensity 4 I3 3 2 I0 1 0 10 100 Period Рисунок 3.3 - Спектры Фурье для объединенной gfb+gfl-группы аминокислот в белковой последовательности gp38 и для группы гидрофобных аминокислот в C-концевой части белковой последовательности gp5 На рисунке 3.4 приведен Фурье-спектр для группы гидрофобных аминокислот белка gp34, также полученный лишь для части полипептидной цепи длиной L=280 (с номерами 438-717). Наиболее интенсивными в этом спектре являются 5 пиков с указанными на графике периодами T=40.22.8; 20.10.7; 9.80.2; 5.960.06; 4.910.04. С учетом приведенных погрешностей T и факта существования пиков на кратных частотах, вполне вероятно, что первый пик (с наибольшим по величине периодом) воспроизводится остальными соответственно на 2-х-, 4-х-, 7-ми- и 8-микратной частотах, и эти четыре пика из пяти, выделенных на рисунке 3.4, можно исключить из последующего рассмотрения, отчего анализ спектра заметно упрощается. Стоит заметить, что в Фурье-спектре полной последовательности 102 аминокислот белка gp34, являющейся самой длинной (L=1289) из исследованных, присутствует тот же, что и в части цепи, основной пик с периодом T=41.70.7, а также и другие воспроизводящие его на кратных частотах пики. gp34_del(gfb) 8 4.9 5.9 9.8 Intensity 6 20.1 4 40.2 I3 2 I1 0 10 100 Period Рисунок 3.4 - Спектр Фурье для группы гидрофобных аминокислот в части белковой последовательности gp34 с номерами элементов с 438 по 717 Таким образом, анализ полученных Фурье-спектров приводит к следующим заключениям. Аналогичные пики с малым периодом Т15 обнаружены для аминокислот gfb-группы в спектрах сразу нескольких исследованных белков: gp35, gp36 и gp37, а в некоторых белках (gp35, gp36) и для gfl-групп тоже, что свидетельствует о некоторой общности для всех них такого рода периодичности. Нередко встречаются малые периоды другой величины, например, T=8 в белках gp5 и gp12, Т=9.610 в белке gp38, T=40 в белке 103 gp34. Такого рода периодичность с периодами T из 8-20 аминокислот характерна для элементов вторичной структуры -структур [150]. Большие периоды следования аминокислот объединенной gfb+gflгруппы обнаружены также у нескольких белков: для gp38 – Т=45.75=183/4=L/4, gp37 – Т=256.5=1026/4=L/4, gp36 – Т=55.25=221/4=L/4, gp35 – Т=45.83=275/6=L/6, gp34 – T=214.8=1289/6=L/6. То есть повторяемость фрагментов белковой цепи с относительно большим периодом также оказалось общим свойством для целого ряда исследованных белков. Авторы работы [145] полагают, что такого рода периодичность “может быть связана с доменной организацией аминокислотных последовательностей и укладкой их в белковую “глобулу”, т.е. характеризует третичную структуру белков [150]. В спектрах отдельных белков, например, gp35 все или некоторые пики на малых периодах - Т15; 7.5 - могут быть результатом воспроизводства пика с большим периодом Т45 на (3-х- и 6-ти-) кратных частотах и отражать наличие той же самой периодичности. В противном случае (например, как в белке gp34) аминокислотная последовательность может иметь повторяемость как на больших (T=215), так и на малых (T=40) периодах, что также согласуется с результатами и выводами работы [145]. Выравнивание полипептидных цепей с учетом установленных данных об их периодичности. На основании полученных данных о периодичности фибриллярных белков было проведено выравнивание их аминокислотных последовательностей по выявленным периодам и большим, и малым. Это проводилось с использованием компьютера как по другой специально разработанной нами программе, так иногда и “вручную”. На рисунках 3.5 и 3.6 показаны фрагменты выровненных полипептидных цепей: gp34 - с периодом Т=40, выявленным в спектре на рисунке 3.4, и С-концевой части gp5 - с периодом Т=8, обнаруженным в спектре на рисунке 3.3. Самым темным серым фоном обозначены аминокислоты gfl-группы, промежуточным серым фоном – gfb-группы, 104 самым светлым фоном - остальные, входящие в rem-группу. Можно видеть, что повторяемость с указанными периодами в расположении элементов разных аминокислотных групп в полипептидных цепях действительно имеет место. Рисунок 3.5 - Результаты выравнивания фрагмента аминокислотной последовательности gp34 с 438 по 717 элементы по периоду Т=40 Периодически упорядоченное расположение аминокислот в первичной структуре белка схематически можно представить себе в виде достаточно простого зрительного образа – трехмерной “спирали”, точнее, винтовой линии, вроде, обмотки соленоида. Этот образ допускает наличие в нем периодов разной длины одновременно. Например, один виток может представлять малый период, а несколько таких витков, образующих один слой обмотки – большой период. Другими словами, в аминокислотных последовательностях не исключено наличие полипериодичности – повторяемости различных элементов структуры с несколькими разными периодами, о чем свидетельствуют и Фурье-анализ, и результаты, полученные другими методами [145]. Ранее методом STEM в белках gp34 и gp37 были обнаружены некоторые повторяющие участки последовательностей, схожие по составу и порядку следования входящих в них конкретных аминокислот с некоторым общим для них шаблоном [180]. С помощью компьютерного анализа удалось найти новые повторы аналогичных шаблону фрагментов, не выявленные прежде с помощью сравнения по гомологии (рисунок 3.7). Интересно 105 отметить, что в белке gp34 указанные фрагменты повторяются с периодом Т=40, обнаруженным методом преобразования Фурье (рисунок 3.4). Рисунок 3.6 - Результаты выравнивания фрагмента С-концевой части аминокислотной последовательности gp5 с 441 по 552 элементы по периоду Т=8 Однако в gp35, gp36 и gp38 именно такие повторяющиеся фрагменты отсутствуют, поэтому можно сделать вывод, что эти белки содержат другие повторяющиеся участки. Расчет спектра Фурье для белка gp181 бактериофага phiKZ. Как было выше сказано и показано на рисунке 3.3, в спектре Фурье для Сконцевой части литического фермента gp5С (структурного лизоцима бактериофага Т4) были обнаружены повторы с периодом Т=8, образующие уникальный паттерн, показанный на рисунке 3.6. При исследовании этого белка с помощью рентгеноструктурного анализа была выявлена такая же периодичность [13]. Кроме того, в структуре gp5 был обнаружен уникальный мотив – тримерная -спираль, о которой говорилось в литобзоре (п. 1.9.2 106 главы 1). Результаты, полученные при исследовании gp5, явились новыми и интересными для фундаментальной и прикладной науки. Рисунок 3.7 - Выявленные повторяющиеся фрагменты полипептидных цепей белков gp34 и gp37 Поэтому в данной части работы представилось интересным и целесообразным исследовать литический фермент gp181 (структурный лизоцим бактериофага phiKZ) и попробовать обнаружить в нем схожую периодичность, а также изучить его структуру для понимания механизма его действия при инфицировании бактериофагом phiKZ клетки. В исследовании применялись как теоретические – преобразование экспериментальные методы, описанные ранее в главе 2. Фурье, так и 107 На рисунке 3.8. приведен Фурье-спектр для группы гидрофобных аминокислот белка gp181, полученный для С-концевой части полипептидной цепи длиной L=1570. I1 , I3 – уровни интенсивности, вероятность случайного превышения которых составляет 16% и 0.13%, соответственно. Рисунок 3.8 - Спектр Фурье для группы гидрофобных аминокислот в белковой последовательности gp181C Самым интенсивным в этом спектре является пик с периодом T=7.70.48. Этот результат совпадает с результатом, полученным для gp5 (рисунок 3.3). Но при выравнивании аминокислотной последовательности по выявленному периоду Т=8 не было найдено паттерна, аналогичного обнаруженному в С-концевой части gp5 бактериофага Т4. Результаты и выводы исследования периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках и литических ферментах бактериофагов Т4 и phiKZ. 1. Численными экспериментами установлено, что для анализа периодичности аминокислотных последовательностей оптимальным является 108 дискретное преобразование Фурье, определяемое соотношениями (2.2), (2.9), (2.5), или аналогичное [146, 150]. 2. С использованием этого оптимального Фурье-преобразования удалось подтвердить наличие определенной периодичности в исследованных фибриллярных белках бактериофага Т4. Для ряда белков выявлено чередование аминокислот разных групп с относительно малым периодом Т=15, а для некоторых – с другими периодами: 8, 10, 40. 3. Безусловно, новым результатом явилось обнаружение относительно больших периодов следования аминокислот, которыми вся их последовательность в белке делится на 4 или 6 равных частей. 4. Полученные данные о периодичности позволяют выровнять аминокислотные последовательности с учетом установленных периодов обоих типов, что в сочетании с результатами кристаллографических и электронно-микроскопических экспериментов может быть полезным при установлении для белков бактериофага Т4 элементов вторичной и третичной структуры. 5. Нам удалось подтвердить наличие определенной периодичности в белке gp181 бактериофага phiKZ, а, именно, с тем же периодом Т=8, который был обнаружен в белке gp5 бактериофага Т4. 3.2 Экспериментальное исследование белков систем инфицирования бактериофагов Т4 и phiKZ Для фибриллярных белков бактериофага Т4 прежде всего были получены две запланированные плазмидные конструкции pl_g35 и pl_g35-36 для экспрессии белков gp35 и gp35-36 в E. coli. Плазмиды были созданы с использованием вектора pET-23d(+) (Novagen, США) и содержали в себе полноразмерные гены g35 (1140 п.н.) и g35-36 (1800 п.н.) бактериофага Т4. Ген 35 был амплифицирован с помощью ПЦР, в качестве матрицы использовалась ДНК фага Т4. ПЦР - продукт был клонирован в вектор pET- 109 23d(+) по сайтам NcoI и BamHI (рисунок 3.9а). Плазмидная конструкция, содержащая g35-36, была получена на основе предыдущей (рисунок 3.9б). Вектор (плазмида pl_g35) и вставка (плазмида pl_g36) были линеаризованы с помощью рестрикции по сайтам BamHI-XhoI и BglII-XhoI соответственно (см. п. 2.3.1). Затем была проведена реакция лигирования. После этого полученными плазмидными конструкциями трансформировали компетентные клетки Top10 и отобрали клоны, содержащие вставку. Этими клонами был трансформирован экспрессионный штамм BL21(DE3) E. coli, содержащий ген РНК-полимеразы Т7. (1140 п.н.) (3600 п.н.) Рисунок 3.9a - Схема плазмидной конструкции, содержащей g35 Рисунок 3.9б - Схема плазмидной конструкции, содержащей g35-36 После экспрессии был проведен анализ рекомбинантных белков на растворимость, который показал, что белок gp35 и комплекс белков gp35-36 110 экспрессируются в нерастворимой форме, а именно, в виде телец включения. Экспрессия проводилась при различных температурах: 37С, 30С, 25С, однако, результат был одним и тем же. На рисунке 3.10 представлены картины электрофореза белков из экстракта клеток в 12% SDS-ПААГ, из которых видно, что белки gp35 и gp36 находятся во фракции осадка. a b 94кДа 67кДа 43кДа gp35 (41кДа) gp36 (24кДа) 30кДа с d e f g с, d − супернатант и осадок gp35-36, соответственно (экспрессия проводилась при 30С); e, f − супернатант и осадок gp35-36, соответственно (экспрессия проводилась при 37С); a, b − супернатант и осадок gp35, соответственно; g − белковый маркер Рисунок 3.10 - Результаты анализа белков на растворимость после обработки ультразвуком Был проведен рефолдинг белка gp35, предварительно очищенного на колонке Mono-Q в 8 М мочевине, с целью получения этого белка в растворимой форме. Однако, gp35, по всей вероятности, принял неустойчивую конформацию и, вследствие этого, оказался нестабильным. Из рисунка 3.11 видно, что после диализа наряду с основной полосой белка появляется минорная, которая, по-видимому, представляет собой продукт протеолитической деградации. Исследование белка gp181 бактериофага phiKZ проводилось с помощью направленного делеционного мутагенеза. Ген 181 имеет размер 6726 п.н., а белок gp181, кодируемый этим геном, соответственно, 2242 а.о., вычисленная молекулярная масса белка – 246,6 кДа. 111 gp35 до очистки gp35 после очистки Рисунок 3.11 - Деградация gp35 в процессе рефолдинга (12% SDS-ПААГ) Прежде чем приступить к исследованию gp181 с помощью делеционного мутагенеза, мы проанализировали его аминокислотную последовательность с помощью программы BLAST [181] с целью выявить консервативные домены в структуре этого белка. Используя эту программу, нам удалось предсказать, что в С-концевой части белка gp181 (аминокислотные остатки 672-2242) находится домен пептидогликановой гидролазы или лизоцимный домен. С учетом этих данных, а также данных об одинаковой периодичности в С-концевых частях gp181 и gp5 (т.е. с учетом имеющейся аналогии этих белков), были получены три делеционных мутанта гена 181, а именно: ген g181MA (582 п.н.), кодирующий лизоцимный домен, ген g181E (603 п.н.), кодирующий С-концевую часть белка gp181, расположенную после лизоцимного домена и ген g181M, являющийся объединением генов g181MA и g181E (рисунок 3.12). Были созданы три плазмидные конструкции с использованием вектора pQE-30 E. coli (рисунок 3.13), содержащие гены g181M, g181MA и g181E бактериофага phiKZ, соответственно, pl_g181M, pl_g181MA и pl_g181E. Гены были амплифицированы с помощью ПЦР, в качестве матрицы использовалась ДНК фага phiKZ. ПЦР-продукты были клонированы в вектор pQE-30 по сайтам BamHI и HindIII (рисунок 3.14). 112 Стрелки указывают направление транскрипции Рисунок 3.12 - Делеционные мутанты гена g181 Рисунок 3.13 - Вектор pQE-30 E.coli 113 Рисунок 3.14 - Схема плазмидной конструкции Вектор и вставка были линеаризованы с помощью рестрикции по сайтам BamHI и HindIII, соответственно (п. 2.3.1, глава 2). Затем была проведена реакция лигирования. После лигирования трансформировали полученными компетентные клетки плазмидными Top10 и конструкциями отбирали клоны, содержащие вставку. Клонами со вставкой g181M, g181MA и g181E был трансформирован экспрессионный штамм AD494(DE3) E. сoli, содержащий ген РНК- полимеразы Т5. После экспрессии был проведен анализ рекомбинантных белков на растворимость, который показал, что при температуре 37С белок gp181M экспрессируется полностью в нерастворимой форме, белок gp181E частично находится в супернатанте, а белок gp181MA полностью растворим. При проведении экспрессии при пониженной температуре 18С белок gp181M также экспрессировался в нерастворимой форме, однако доля белка gp181E, экспрессировавшегося в растворимой форме, существенно повысилась. На рисунке 3.15 представлены картины электрофореза белков из экстракта клеток в 12% SDS-ПААГ, из которых видно, что gp181M находится во фракции осадка, а gp181E во фракции супернатанта. Известно, что белки, которые экспрессируются в виде телец включения, можно перевести в растворимую форму с помощью рефолдинга. Поэтому был проведен рефолдинг белка gp181M, предварительно очищенного в денатурирующих условиях с целью получения этого белка в 114 растворимой форме. Белок gp181M диализовали в буфере, содержащем 20 mM Tris HCl pH 7.5, 200 mM NaCl, 0.5% Tween 80, 0.1% сахарозу. После диализа, проведенного в течение ночи против использованного буфера, продукт рефолдинга gp181M оказался нерастворимым. a − осадок белка gp181M, c − супернатант белка gp181E, b − белковый маркер. Рисунок 3.15 - Экспрессия белков Белки gp181MA и gp181E диализовали для того, чтобы избавиться от избытка имидазола в буфере. Так как диализ белков gp181MA и gp181E прошел успешно, было проведено их концентрирование с помощью концентратора Centricon10 (Amicon, США). Для этого белковые растворы были центрифугированы на 3000 об/мин в течение 15 минут 4 раза. При этом белки сконцентрировались в 2.5 раза. На рисунке 3.16 представлена картина электрофореза белков в 12% SDS-ПААГ до концентрации и после концентрации. Белки gp181E и gp181MA имеют расчетный молекулярный вес 21.3 кДа и 21.4 кДа, соответственно. Но из рисунка видно, что их подвижность в SDSПААГ соответствует молекулярному весу порядка 30 кДа. Это можно объяснить устойчивостью этих белков к SDS и тем, что они не являются мономерами. 115 a b c d e a, b − gp181MA до и после концентрирования, соответственно; c, d − gp181E до и после концентрирования, соответственно; e − белковый маркер. Рисунок 3.16 - Концентрирование белков После концентрирования также был проведен анализ взаимодействия белков с различными штаммами бактерии Pseudomonas aeruginosa. Белок gp181MA, являясь цитолитическим ферментом, а именно пептидогликановой гидролазой, лизирует клетки. Белок gp181E взаимодействует со всеми тремя штаммами бактерии, но не лизирует их. На рисунке 3.17 представлена картина электрофореза в 12% SDSПААГ. a, c – супернатант gp181E +РАО и E.coli, соответственно; e – супернатант РАО, g – супернатант gp181E; b, d – осадок gp181E +РАО и E.coli, соответственно; f – осадок РАО; h – осадок gp181E; i – белковый маркер. Рисунок 3.17 - Взаимодействие gp181E со штаммом РАО Pseudomonas aeruginosa 116 Белок gp181E находится во фракции осадка при взаимодействии со штаммом РАО Pseudomonas aeruginosa. В качестве контроля использовали бактерию E. сoli. При добавлении gp181E к E. сoli взаимодействия не наблюдается – на рисунке 3.17 видно, что белок gp181E полностью во фракции супернатанта. Перед началом экспериментальных исследований белка gp181E предполагалось, что его С-концевая часть (gp181E) может играть роль сенсорной молекулярной наблюдавшимся иглы. взаимодействием Это предположение gp181E с клетками согласуется с Pseudomonas aeruginosa. Для белков gp181E и gp181MA были также сняты КД-спектры. Они представлены на рисунках 3.18 и 3.19, соответственно. эллиптичность [] 10-3, град см2 / дмоль длина волны , нм Рисунок 3.18 - КД-спектр белка gp181E Для оценки вкладов вторичных структур (-спиралей, - и неупорядоченных структур) использовано программное обеспечение CDPro (Colorado State University, Fort Collins, CO), алгоритм CONTINLL с набором базисных белков IBasis7 [SDP48] (λ = 240 - 190 nm). Обработка спектров показала, что эти белки в основном состоят из -спиралей: gp181E – на 71.5% и gp181MA – на 68%. 117 эллиптичность [] 10-3, град см2 / дмоль длина волны , нм Рисунок 3.19 - КД-спектр белка gp181MA Результаты и выводы эксперимента по исследованию фибриллярных белков gp35 и gp36, продукта гена 181 бактериофага phiKZ и его делеционных мутантов. 1. Был создан плазмидный вектор для экспрессии белка gp35 в клетках E. coli и получена плазмидная конструкция для коэкспрессии белкового комплекса gp35-36 бактериофага Т4 в клетках E. coli. 2. Экспрессированные рекомбинатные белки gp35 и gp35-36 выделялись и очищались. 3. Белок gp35 и комплекс белков gp35-36 экспрессировались при различных условиях экспрессии в нерастворимой форме, а именно, в виде телец включения; при попытке перевода белка gp35 в растворимую форму путем рефолдинга он деградировал. 4. Таким образом, из-за возникших объективных сложностей в экспериментальном исследовании продуктов генов 35 и 36, нам не удалось получить их в препаративных количествах для последующей кристаллизации и решения их вторичной структуры методом рентгеноструктурного анализа. 118 5. Были созданы плазмидные векторы для экспрессии трех делеционных мутантов гена 181 в клетках E. coli. 6. Три полученных рекомбинантных белка были выделены и очищены. 7. Установлено, что белок gp181M экспрессируется в нерастворимой форме, в виде телец включения; перевести его в растворимую форму не удалось, а белок gp181MA полностью растворим. Белок gp181E экспрессируется при пониженной температуре и становится растворимым в присутствии детергента и сахара; солюбилизация в присутствии детергента и сахара косвенно свидетельствует об аффинности этого белка к полисахаридным (LPS) рецепторам клеточной стенки бактерии. 8. Белок gp181E является гидрофобным и взаимодействует с различными штаммами клеток Pseudomonas aeruginosa, но не лизирует их, в отличие от gp181MA. 9. Белок gp181E является не мономером, а димером или тримером, что было установлено с помощью гель-фильтрации. 10. В результате анализа КД-спектров для белков gp181E и gp181MA было установлено, что их вторичная структура в значительной мере (примерно, на 70%) состоит из -спиралей; этот факт является интересным, т.к. большая часть структурных внутриклеточных белков, например, тропомиозин, миозин, кератин, фибриноген, трансмембранные белки оболочечных вирусов и некоторые глобулярные белки состоят из спиралей. 11. Предположение о том, что С-концевой домен белка gp181 может играть роль сенсорной “молекулярной” иглы в процессе инфицирования бактериофагом phiKZ клетки, выдвинутое с учетом установленной периодичности (Т=8) аминокислотной последовательности этого домена, получило дополнительные экспериментальные обоснования. Однако, вторичная структура этого домена не является родственной -спирали белка gp5 бактериофага Т4, а представляет собой, вероятно, -спиральный coiled 119 coil. Указанное отличие вторичных структур этих белков может определять различие механизмов их взаимодействия с клетками. Можно предположить, что gp181 представляет собой не функциональный гомолог gp5 бактериофага Т4, а довольно распространенный альтернативный случай, когда структурный литический фермент является продолжением “белка-рулетки”, который определяет длину хвоста вируса. Однако, механизм взаимодействия gp181 с клетками до конца еще не исследован. 3.3 Результаты предсказания вторичной структуры мембранных белков вычислительными методами по их аминокислотным последовательностям Исследования мембранных белков (к которым относится и bR) играют очень важную роль, как для развития биологической науки, так и для фармакологии и медицины. Мембранные белки составляют, примерно, 25% всех белков, кодируемых геномом человека. Они отвечают за многие функции клеток, в частности: обеспечивают избирательный обмен веществ между клеткой и окружающей ее средой, поддерживают разность электрических потенциалов внутри клетки и снаружи, обеспечивают передачу электрических сигналов в клетку и из нее, участвуют в производстве и переносе энергии в организме. Поэтому действие более половины фармацевтических препаратов направлено именно на мембранные белки. Функции, выполняемые белком, определяются его пространственной трехмерной структурой. Определение этой структуры белка представляет собой очень сложную проблему. Основным экспериментальным методом детального исследования рентгеноструктурный структуры анализ [57, 58]. мембранных Этот метод белков является непосредственно применяют к кристаллам белка, которые необходимо предварительно получить, используя очень сложную и трудоемкую технологию. Как 120 отмечалось в литобзоре (п. 1.7.2 главы 1), несмотря на то, что бактериородопсин тщательно изучают более 40 лет, до сих пор не преодолены объективные экспериментальные трудности в достижении высокого кристаллографического разрешения кристаллов bR. Поэтому остается ряд противоречий, касающихся понимания механизма протонного транспорта и данных о структуре bR и его мутантов. С учетом перечисленных обстоятельств актуальной альтернативой экспериментальному методу рентгеновской кристаллографии при исследовании структуры мембранных белков стали методы компьютерного моделирования, основанные на использовании данных о первичной структуре белка символьной последовательности его аминокислот [145, 146, 148, 150, 177, 182]. Так, например, в работе [177] исследовалась периодичность расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 методом преобразования Фурье цифрового образа символьной последовательности аминокислот белка. В частности, была изучена повторяемость расположения аминокислотных остатков (а.о.), принадлежащих к разным группам: гидрофобным или гидрофильным. Особенность и органическое свойство политопических мембранных белков повторяемость трансмембранных участков, состоящих из аминокислот гидрофобной группы. Упорядоченную повторяемость (периодичность), которая относится к элементам вторичной структуры белка, можно выявить методом Фурье, применяя его к цифровому образу символьной последовательности аминокислот в белке. Цель данной части работы выяснение применимости к исследованию вторичной структуры мембранных белков двух частных методов компьютерного моделирования, описанных в главе 2: известного метода с использованием преобразования Фурье и усовершенствованного нами метода 121 "скользящего окна", и сравнение их между собой и с другими известными методами. В численном эксперименте, описанном в начале главы 3, для нескольких исследованных белков выявлена повторяемость с характерными малыми периодами Т = 8, 10, 15 a.о. и большими Т = 46, 55, 215, 256 a.о. Последние делят всю последовательность белка на 4 или 6 равных частей и могут быть признаками его третичной структуры [145]. Результаты численного моделирования учтены в успешно выполненном эксперименте, направленном на получение рекомбинантной формы белка gp37 посредством создания химерного белка [182]. Исследование периодичности расположения аминокислот гидрофобной группы в последовательностях мембранных белков методом Фурье. Описанный в главе 2 алгоритм [177] вместе с реализующей его компьютерной программой сначала применили к исследованию периодичности 6 трансмембранных белков. В нижеследующем перечне этих белков приведено название по-русски, по-английски, сокращенное обозначение, код белка и название организма в соответствии с источником [178]: 1) бактериородопсин, bacteriorhodopsin, bR, P02945, Halobacterium salinarium; 2) галородопсин, halorhodopsin, hR, P15647, Natronomonas pharaonis; 3) сенсорный родопсин 2, sensory rhodopsin-2, sR2, P42196, Natronomonas pharaonis; 4) коннексин-32, connexin-32, Cx32, P08034, Homo sapiens; 5) зависимый от циклического нуклеотида калиевый канал, cyclic nucleotidegated potassium channel mll3241, CNG (обозначение, сокращенное авторами данной статьи, так как общепринятого нет), Q98GN8, Mesorhizobium loti; 6) метаботропный глутаматный рецептор 6, metabotropic glutamate receptor 6, GRM6, O15303, Homo sapiens. 122 Некоторые результаты расчета спектров Фурье представлены на рисунке 3.20. Условием нормировки интенсивностей I(ωn) гармоник в спектре было равенство <I> = 1. 10 bR sR2 hR Intensity 8 6 4 32.8 29.7 36.4 2 0 10 100 Period Рисунок 3.20 - Фурье-спектры для гидрофобной группы аминокислот в символьных последовательностях трансмембранных белков: bR, sR2, hR В спектре Фурье для последовательности bR (длиной L = 262 a.о.) (рисунок 3.20) четко проявился пик с периодом Т = 33 и относительной интенсивностью I(T) = 3.5, для которого по формуле (2.13) находим NTMD = 7, что совпадает с известным числом альфа-спиралей в структуре этого белка [178]. В спектре последовательности белка sR2 на рис. 3.20 очевиден пик с частотой n = 6, периодом T6 = L/n = 39.8 и очень большой интенсивностью I(T6) = 8.38. Но частота этого пика оказывается двукратной к частоте n = 3 другого, менее интенсивного пика с периодом T3 = L/n = 79.7, слишком большим и потому маловероятным для TMD. Поэтому с учетом вышеприведенного замечания оба этих кратных по частоте пика можно исключить из рассмотрения. Следующим по интенсивности I(T) = 2.12 среди пиков с большим периодом 20 < Т < 80 является пик с периодом T = 29.7 и 123 частотой n = L/T ≈ 8. Для него по формуле (2.13) вычисляем число NTMD = 7, что опять совпало c числом TMD в структуре белка, описанной в работе [178]. Заметим, что у этой цепи длиной L = 239 a.о. есть 7 TMD различной длины (22, 22, 22, 23, 28, 28, 33 a.о.), и 8 TPD имеют очень разные длины (3, 8, 14, 3, 4, 4, 8, 17 a.о.). В спектре последовательности hR имеется пик с относительно большой интенсивностью I(T8) = 2.48, большим периодом Т8 = 36.4 и частотой n = 8, для которого NTMD = 7, что снова совпадает c числом TMD в предсказываемой по аналогии (“similarity” − [178]) структуре этого белка. В спектре Фурье присутствует также пик, сравнимый с вышеуказанным по интенсивности I = 2.33 и периоду Т = 29.1. Это, по-видимому, обусловлено существенными нарушениями периодичности белковой последовательности hR по сравнению с bR и sR2. По данным о ее структуре длины TMD , примерно, одинаковы (26, 24, 22, 24, 23, 24, 29 a.о.), а длины TPD (30, 6, 34, 3, 3, 12, 9, 22 a.о.) очень сильно (до 10 раз) отличаются [178]. В этом состоит особенная сложность этого белка. Стоит подчеркнуть, что три рассмотренные белковые последовательности (bR, sR2, hR) содержат в своей структуре по 7 альфаспиралей, и метод преобразования Фурье это надежно выявляет. В Фурье-спектре последовательности белка Cx32 (рисунок 3.21) проявился пик с периодом Т = 56.6 и очень большой относительной интенсивностью I(T) = 9.8, для которого по формуле (2.13) нашли NTMD = 4, что в точности совпало с числом альфа-спиралей в вероятной структуре данного белка. И это удалось, несмотря на то, что, по известным данным [178], при приблизительно равных длинах (23, 20, 23, 23 a.о.) трансмембранных участков, топологические домены могут значительно различаться по длине (22, 30, 35, 38, 69 a.о.), особенно “хвостовой” домен. Белок CNG содержит 6 TMD примерно одинаковой длины (18, 23, 20, 18, 21, 25 a.о.) [178]. Тогда как длины его TPD сильно отличаются (12, 8, 13, 0, 17, 11, 5, 145 a.о.), особенно четвертого (с длиной, равной нулю, т.е. вовсе 124 отсутствующего) и последнего – концевого. Кроме того, между пятым и шестым TMD расположен необычный участок длиной 19 a.о., примерно, как TMD, в котором гидрофобные и гидрофильные аминокислоты представлены почти поровну. 29.7 8 Intensity Cx32 CNG GRM6 56.6 10 41.7 6 4 2 0 10 100 Period Рисунок 3.21 - Фурье-спектры для гидрофобной группы аминокислот в символьных последовательностях трансмембранных белков: Cx32, CNG, GRM6 Для того, чтобы упростить расчет Фурье-спектра символьной последовательности белка CNG и повысить достоверность результата, мы сначала попробовали “отрезать” хвостовой TPD. В полученном для оставшейся части цепи (длиной L = 210 a.о.) спектре (рисунок 3.21) наблюдается пик с самой большой интенсивностью I(T) = 7.85, периодом Т ≈ 30 и частотой n = L/T = 7, для которого по формуле (2.13) число альфаспиралей NTMD = 6, что соответствует известным данным о структуре белка CNG [178]. При расчете спектра Фурье (на рисунке 3.21 не показан) для полной последовательности белка CNG (с длиной цепи L = 355 без обрезания) проявился пик с наибольшей интенсивностью I(T) = 5.23 и почти тем же, что 125 и у обрезанной цепи, периодом Т = 29.6, но другой частотой n = 12. Откуда следует значение числа NTMD = 11. Это можно понять так: к 6-ти периодам, укладывающимся на части цепи без “хвостового” домена добавились 5 периодов, которые могли бы уложиться на “хвостовом” TPD (145/30=4.8≈5). Следовательно, даже если число альфа-спиралей NTMD в сложной цепи по формуле (2.13) определено неверно, то основной период T чередования TMD, все равно вычисляется правильно. В последовательности белка CNG основной период T ≈ 30, примерно, равен общим длинам пар TMD вместе с предшествующим TPD, которые составляют (30, 31, 33,..., 30, 30 a.о.). Отметим, что здесь пропущены особые участки цепи. Белок GRM6 имеет особенно сложную структуру [178]. Она предположительно содержит сигнальный пептид длиной 24 a.о., очень длинный (561 а.о.) первый TPD, 7 трансмембранных участков с близкими длинами (23, 21, 19, 21, 22, 23, 26 a.о.), между которыми находятся 6 TPD и в конце цепи еще один. Эти топологические домены тоже имеют разные длины (14, 11, 24, 30, 13, 13, 32 a.о.). Сначала для упрощения расчета спектра мы “отрезали” передний кусок длиной (585 а.о.), состоящий из сигнального пептида и первого TPD. Предварительная оценка среднего периода для остальной части длиной L = 292 a.о. дала <T> = L/7 = 41.7. В полученном для нее спектре Фурье (рисунок 3.31) очевидно, что пик с самой большой интенсивностью I(T) = 5.84 имеет тот же период T = 41.7 и частоту n = L/T = 7. Для него по формуле (2.13) получаем число NTMD = 6, что оказалось на единицу меньше числа TMD в предполагаемой структуре. Можно сказать, что здесь метод Фурье предсказал число TMD с точностью до (минус) единицы. Затем мы получили спектр для всей, необрезанной, цепи длиной L = 877 a.о. В спектре Фурье (на рисунке 3.31 не показан) наблюдали ряд пиков с кратными частотами и слишком большим и потому маловероятным для TMD основным периодом T > 60, за что эти пики можно было сразу исключить из рассмотрения. Среди пиков, подходящих по периоду (Т ≈ 40) интересен пик 126 достаточно большой интенсивности I(T) = 2.5 с периодом Т = 41.7, тем же, что установлен в спектре Фурье, полученном для “обрезанной” цепи. Для этого периода частота n = 21 и по формуле (2.13) получили число NTMD = n–1 = 20, что значительно отличается от предполагаемого числа TMD в структуре, равного 7. Следовательно, даже для всей длинной последовательности метод Фурье позволяет правильно определить, если не число TMD, то период их следования в трансмембранной части цепи. Таким образом, данное исследование периодичности трансмембранных белков методом Фурье показало следующее. Если некоторые элементы, части последовательности повторяются практически периодически, то и период повторения T, и число NTMD трансмембранных участков в цепи определяются верно, как для белков bR, sR2, hR и Cx32. Если же периодичность есть лишь на части последовательности, а на другой ее части периодичности нет, то основной период T следования TMD в трансмембранной части цепи, как “обрезанной”, так и “необрезанной”, определяется по спектру Фурье верно, а вычисленное по его значению число TMD в “необрезанной” цепи может оказаться неверным. Чтобы преодолеть этот недостаток, был предложен и использован другой метод компьютерного анализа символьной последовательности белка, также описанный в главе 2, а именно, следующий. Компьютерный анализ расположения трансмембранных участков белка методом многократного усреднения функции гидрофобности внутри перемещаемого вдоль цепи “окна”. На рисунке 3.22 представлены результаты усреднения функции гидрофобности для последовательности белка Cx32 по самой простой и грубой шкале H1(i) в таблице 2.1. Очевидно, что, если исключить из рассмотрения два узких пика на краях графика функции f4(k), то оставшиеся 4 широких пика, превышающие средний уровень u = <fn(k)> = 0.49, как раз будут соответствовать четырем TMD в предполагаемой структуре этого белка. В графике функции f2(k) 127 второй TMD еще не разрешен, на его месте и в других местах присутствуют несколько узких пиков. f2(k) Cx32 1,0 f4(k) 0,8 fn(k) 0,6 0,4 0,2 0,0 0 50 100 150 200 250 300 k Рисунок 3.22 - Функции гидрофобности fn(k) для Cx32 после усреднения при n = 2 и n = 4 по шкале H1(i) в таблице 2.1 В случае последовательности белка bR обработка с тем же набором гидрофобных аминокислот не позволила правильно определить на среднем уровне <f4(k)> все 7 его трансмембранных участков: пара последних слилась в один, другие два (3 и 5) оказались разделенными на два участка. Чтобы обработать описанным методом функции f(k) этого белка, больше подошла предложенная в работах [154, 179] гидрофобная группа, которая включала в себя аминокислоты: C, F, I, L, M, V, W. На рисунке 3.23 представлены результаты, полученные для bRпоследовательности с использованием этой гидрофобной группы и шкалы гидрофобности H2(i) в таблице 2.1. 128 Очевидно, в отличие от функции f2(k) на графике, соответствующем f4(k), выше среднего уровня u = 0.41 разрешены все 7 TMD, известные для структуры bR [178]. f2(k) 1,0 bR f4(k) f5(k) 0,8 fn(k) 0,6 0,4 0,2 0,0 0 50 100 150 200 250 k Рисунок 3.23 - Функции гидрофобности fn(k) для bR после усреднения при n = 2 и n = 4 по шкале H2[i] и усреднения при n = 5 по шкале H4(i) в таблице 2.1 Затем функцию f(k) несколько усложнили. В соответствии с работой [179] использовали деление 20 аминокислот по величине их гидрофобности на 3 группы: гидрофобные – C, F, I, L, M, V, W – всего 7; гидрофильные – D, E, G, K, N, P, Q, R, S, T – всего 10; нейтральные – A, H, Y – всего 3. Гидрофильным аминокислотам в шкале HN(i) присвоили значение −1, гидрофобным – значение +1, нейтральным – значение 0. Так получили грубую шкалу H3(i) в таблице 2.1. На рисунке 3.24 приведены графики рассчитанных с использованием этой шкалы функций f2(k) и f4(k) для bR. На графике, соответствующем f4(k), выше среднего уровня u = −0.01 определены все 7 TMD [178]. 129 На рисунке 3.23 представлена также функция f5(k) после усреднения по более точной шкале гидрофобности H4(i), приведенной в работах [154, 179]. Очевидно, что на среднем уровне <f(k)> = 0.76 не разрешен ни один TMD, а выше некоторого уровня f5(k) = 0.83, граничного для гидрофобной и нейтральной групп аминокислот, разрешены все те же 7 TMD. bR 1,0 f2(k) f4(k) fn(k) 0,5 0,0 -0,5 -1,0 0 50 100 150 200 250 300 k Рисунок 3.24 - Функции гидрофобности fn(k) для bR после усреднения при n = 2 и n = 4 по шкале H3(i) в таблице 2.1 По пересечению графика функции fn(k) с прямой среднего уровня u = <f(k)> определяли границы трансмембранных участков (TMD) различных белков, которые приведены в таблице 3.1. В той же таблице для сравнения приведены границы TMD из работы [178]. С учетом погрешностей Δk≈d/2≈5 определения границ TMD-участков можно признать хорошим согласие результатов расчета положения границ TMD и данных работы [178]. Отметим, что обработка с многократным (45 раз) усреднением функции гидрофобности fn(k) при использовании разных шкал, грубых 130 или H1(i)H3(i) более точных H4(i)H6(i), дает для границ TMD отличающиеся значения. Иногда эти различия незначительны, а иногда существенны. Так, для белка GRM6 применение шкал H3(i) и H4(i) выявило только 6 TMD вместо 7, как и преобразование Фурье. А применение шкал H5(i) и H6(i) определило все 7 TMD, предполагаемых в его структуре. Напротив, для белка bR расчет по шкалам H2(i)H4(i) показал все 7 TMD, а по шкале H5(i) – только 6 TMD. Таблица 3.1 - Сравнение с известными данными сайта [178] границ TMD, вычисленных при обработке функций гидрофобности fn(k) при n = 4 и n = 5** по шкалам H3(i) и H5(i) для шести различных мембранных белков Номер и границы трансмембранных и интрамембранного * участков Код Источник белка данных 1 2 3 4 5 6 7 bR [178] 24−42 57−75 92−109 121−140 148−167 186−204 217−236 H3(i) 23−44 59−81 96−114 122−130 146−168 188−204 216−239 [178] 4−25 34−55 70−91 95−117 122−149 154−181 190−222 H3(i) 5−23 40−62 74−91 99−116 126−142 165−182 192−215 [178] 31−56 63−86 121−142 146−169 173−195 208−231 241−269 H3(i) 39−55 69−77 132−140 154–164 175−197 215−240 251−265 [178] 23−45 76−95 131−153 192−214 H3(i) 22−41 68−96 130−169 190−216 [178] 586−608 623−643 655−673 698−718 749−770 784−806 820−845 591−606 625−649 655−666 692−719 748−769 784−808 818−845 [178] 13−30 39−61 75−94 95−112 130−150 162−180* 186−210 H3(i) 4−28 41−59 77−90 99−107 133−149 165−172 191−206 sR2 hR Cx32 GRM6 H5(i) CNG ** В работах [183185] метод “скользящего окна” с однократным усреднением значений плотности окружения, или гидрофобности, или заряда аминокислотных остатков в последовательностях глобулярных и “нативноразвернутых” белков применяли в программе FoldAmyloid [186] для предсказания агрегационных и амилоидогенных участков. Эти участки так же, как и трансмембранные участки в мембранных белках, обогащены гидрофобными остатками. Поэтому указанная программа может быть использована для предсказания трансмембранных α-спиралей. 131 Попытка применить программу FoldAmyloid с окном шириной 11 a.о. к вышеуказанным шести белкам, исследованным в данной работе, оказалось отчасти удачной. В случае четырех белков (sR2, hR, Cx32, GRM6) границы трансмембранных участков определены практически правильно, почти также как в таблице 3.1. Результаты хуже для двух белков: у bR четвертый TMD участок вообще не определен, а первый и седьмой разделены на 2 части каждый, у CNG первый TMD участок не обнаружен. В целом, границы трансмембранных участков в указанных шести белках с использованием программы FoldAmyloid определены, на наш взгляд, не лучше, чем предлагаемым методом многократного усреднения функции гидрофобности по каждый раз изменяющейся ширине скользящего окна. Заметим, что в данной работе установлена как оптимальная ширина окна 911 a.о. Поиск трансмембранных участков приводит к гораздо худшим результатам в обоих сравниваемых методах при ширине окна 5 a.о., рекомендованной для программы FoldAmyloid в работе [185]. При дополнительном тестировании и сравнении между собой методы, алгоритмы которых изложены в данной работе, кроме шести вышеописанных белков применили еще к 18 белкам (результаты в таблице 3.2), вторичная структура которых, экспериментально определенная или предсказанная другими методами, представлена также и на сайте [178]. Это белки из интересовавших нас и рассмотренных выше групп bR, sR, hR и connexin с кодами из следующего ряда: O93740, P42197, P71411, P25964, P33743, O93743, P16102, Q48314, O93741, O93742, P33742, P28230, O75712, Q6PEY0, P28235, P28234, Q96KN9, P23242. Таблица 3.2 - Сравнение с известными данными [178] границ TMD, вычисленных при обработке функций гидрофобности fn(k) при n=4 и n=5** по шкалам H3(i) и H5(i) для 24 мембранных белков Имя, код белка Источник данных bR, P02945 bR, [178] H3(i), 262 aa [178], similar 1 24−42 23−44 19-37 Номер и границы 2 3 57−75 92−109 59−81 96−114 52-70 87-104 трансмембранных доменов 4 5 6 121−140 148−167 186−204 122−130 146−168 188−204 116-135 143-162 181-199 7 217−236 216−239 213-232 132 O93740 sR2, P42196 sR2, P42197 **H3(i), 250 aa [178] H3(i), 239 aa [178], similar **H3(i), 236 aa sR2, P71411 sR1, P25964 [178], similar H3(i), 237 aa [178], similar **H3(i), 239 aa 18-32 4−25 5−23 4-25 7-12, 17-19 3-23 5-20 4-25 10-26 50-70 34−55 40−62 34-55 39-56 88-107 70−91 74−91 70-91 69-90 119-130 95−117 99−116 95-117 101-113 149-162 122−149 126−142 122-149 127-145 182-199 154−181 165−182 154-182 165-187 211-233 190−222 192−215 191-236 193-218 32-53 38-46 35-56 40-53 68-89 70-88 71-92 72-86 93-115 98-113 96-118 101-114 120-147 121-139 123-150 126-149 151-178 157-180 154-181 163-181 187-214 189-213 190-222 194-216 трансмембранных доменов 4 5 6 97-119 124-151 155-182 101-116 124-148 165-183 97-119 124-151 155-182 101-118 125-147 162-183 146−169 173−195 208−231 154–164 175−197 215−240 131-154 158-180 193-216 132-149 157-181 199-224 7 191-223 197-213 191-223 195-214 241−269 251−265 227-255 234-253 131-154 135-153 158-180 157-183 226-254 238-253 Продолжение Таблицы 3.2 Имя, код белка sR1, P33743 sR, O93743 hR, P15647 hR, P16102 Источник данных [178], similar **H3(i), 247 aa [178], similar H3(i), 254 aa [178], similar H3(i), 291 aa [178] **H3(i), 274 aa 1 5-26 0-25 5-26 8-26 31−56 39−55 26-51 32-50 hR, Q48314 [178], similar H3(i), 276 aa 26-51 31-50 Номер и границы 2 3 36-57 72-93 42-57 72-90 36-57 72-93 40-59 72-89 63−86 121−142 69−77 132−140 58-81 106-127 64-73, 116-129 85-88 58-81 106-127 61-73 116-126 hR, O93741 hR, O93742 [178], similar H3(i), 297 aa [178], similar H3(i), 282 aa 46-71 51-72 30-55 36-54 78-101 81-100 62-85 65-76 126-147 136-148 110-131 120-129 151-174 151-171 135-158 146-153 178-200 180-202 162-184 163-186 hR, P33742 GRM6, O15303 CNG, Q98GN8 Cx32, P08034 Cx32, P28230 Cx31, O75712 Cx25, Q6PEY0 Cx37, P28235 [178], similar **H3(i), 284 aa [178], potential **H5(i), 877 aa [178] H3(i), 355 aa [178], probable H3(i), 283 aa [178], potential H3(i), 283 aa [178], potential H3(i), 270 aa [178], potential **H3(i), 223 aa [178], potential H3(i), 333 aa 31-56 36-55 586 - 608 591 - 606 13 - 30 4 - 28 23−45 22−41 23-45 22-42 21-40 22-42 20-40 22-41 21-40 20-42 113-132 120-130 655 - 673 655 - 666 75 - 94 77 - 90 131−153 130−169 131-153 129-170 127-149 127-177 122-142 122-146 149-171 149-199 136-159 143-154 698- 718 692 - 719 95 - 112 99 - 107 192−214 190−216 192-214 190-217 188-210 187-216 178-198 178-211 209-231 207-238 163-185 163-188 749 - 770 748 - 769 130 - 150 133 - 149 Cx40, P28234 Cx40.1, Q96KN9 Cx43, P23242 [178], potential **H3(i), 356 aa [178], potential H3(i), 370 aa [178], potential H3(i), 382 aa 20-40 22-38 20-40 0-41 14-36 23-42 63-86 66-77 623 - 643 625 - 649 39 - 61 41 - 59 76−95 68−96 76-95 63-97 76-98 73-96 76-96 72-95 77-99 66-99, 123-137 77-97 73-97 77-97 63-98 77-99 69-101 164-184 150-182 147-167 142-169 155-177 150-185 205-225 204-227 197-217 196-219 209-231 207-236 193-216 199-215, (221-226) 213-236 219-246 197-220 203-220, (224-232) 198-221 204-233 784 - 806 784 - 808 162 - 180 165 - 172 247-275 258-273 230-258 242-256 231-259 242-258 820 - 845 818 - 845 186 - 210 191 - 206 Human Mouse Human Human Mouse Rat u = 0.0 Human u = - 0.03 Mouse 133 Результаты тестирования при исследовании в общей сложности 24 белков показали, что с помощью метода с использованием преобразования Фурье число трансмембранных участков NTMD правильно определено по формуле (2.13) для 14 белков, а в 10 случаях оказалось на 12 TMD больше (или меньше), чем иными методами. Тестирование другого предложенного в данной работе и выраженного формулой (2.14) метода (каскадного усреднения функции гидрофобности в пределах скользящего окна) показало, что из 24 исследованных этим новым методом белков число трансмембранных участков правильно определено для 19 белков (в 79% случаев), а в пяти случаях (коды белков в таблице 3.3 выделены серым тоном) выявлено на 1 TMD больше, чем иными методами. Кроме того, для 19 белков, с верно определенным числом TMD, разногласие с результатами других методов в положении границ TMD не превосходит ошибок их определения (k < 6) у 182 границ из 224, т.е. в 81% случаев. Выводы о применимости предложенных компьютерных методов предсказания структуры мембранных белков по их аминокислотной последовательности. 1. Повторяемость расположения аминокислот гидрофобной (и/или гидрофильной) группы в белковых последовательностях один из признаков вторичной и третичной структуры белка. Это верно для фибриллярных, глобулярных и мембранных белков. 2. Если повторяемость периодическая, то эту периодичность можно выявить, применяя известный метод преобразования Фурье к цифровому образу символьной последовательности аминокислот белка. В данной работе этот метод применили к 24 трансмембранным белкам, для 14 из них – успешно. Число трансмембранных участков, определяемое по формуле (2.13) через основной период повторяемости аминокислот гидрофобной группы в белковой последовательности, правильно выявлено для 58% исследованных белков. Невысокое значение этой доли обусловлено отклонением от периодичности в последовательностях значительной части белков. Оценить 134 местоположение и протяженность гидрофобных участков этим методом можно лишь очень грубо, с точностью до половины основного периода повторяемости гидрофобных аминокислот в последовательности белка. 3. Если повторяемость трансмембранных участков непериодическая, то для ее выявления можно использовать другой метод – с многократным (45 раз) усреднением функции гидрофобности белка в пределах перемещаемого вдоль последовательности “окна” шириной 911 a.о. Этот новый метод применен к тем же 24 трансмембранным белкам (успешно для 19 из них) и показал большую, чем метод Фурье, пригодность для прогнозирования вторичной структуры такого рода белков и соответствующих ей функциональных свойств. 4. Из двух рассмотренных в данной работе методов более предпочтительным оказался метод многократного (45 раз) усреднения функции гидрофобности f(k) белка внутри “окна” шириной 911 a.о., перемещаемого вдоль аминокислотной последовательности. Число трансмембранных участков правильно предсказано этим методом для 79% исследованных белков. Доля правильно предсказанных границ трансмембранных участков составляет 81%. 5. Шкала и функция гидрофобности могут быть заданы многими способами известно более 30. Сравнение различных шкал и функций гидрофобности, выполненное в данной работе, показало, что определяемое с их использованием число и расположение трансмембранных участков часто практически одинаковы, даже для очень простых (грубых) шкал, например, H2(i) и H3(i) (см. таблицу 2.1). Но иногда для данного белка одна из шкал может оказаться предпочтительнее из-за того, что она позволяет лучше определить близкорасположенные трансмембранные участки. 6. Сравнение результатов, полученных в данной работе путем компьютерного анализа аминокислотных последовательностей 24 белков, с известными данными об их структуре показало применимость обоих предложенных методов, как по отдельности, так и совместно, для 135 предсказания признаков неизвестной вторичной структуры мембранных белков и обусловленных этими признаками функциональных свойств этих белков. Ценность обоих методов простота, быстрота и экономичность применения. 3.4 Экспериментальное исследование бактериородопсина (bR) и его делеционных мутантов Предпосылки и особенности экспериментального исследования белка bR из Halobacterium salinarum. Направленный делеционный мутагенез продукта гена bR. Сложная и трудоемкая технология получения мембранных белков в кристаллическом состоянии включает в себя следующие основные стадии: создание плазмидной конструкции, содержащей ген, кодирующий данный белок; экспрессию белка в клетках реципиента; разрушение клеток и отделение клеточных мембран, солюбилизацию белка в присутствии соответствующего детергента; очистку и концентрирование белка; реконституцию белка и его кристаллизацию. Наиболее критичными для достижения конечной цели являются стадия очистки из-за значительных потерь белка (до 40% на каждом из нескольких этапов) и стадия его кристаллизации из-за неопределенности необходимых условий ее проведения для данного конкретного белка. В силу указанных трудностей структура мембранных белков установлена к настоящему времени лишь для очень ограниченной их части (< 4%). Для достижения высокого разрешения структуры белка необходимо, чтобы кристаллы этого белка имели очень высокое качество. Качество кристаллов зависит от многих факторов, но одним из определяющих требований является наличие достаточного количества гомогенного и чистого продукта для кристаллизации. Целью данного экспериментального исследования являлось получение достаточного количества гомогенного и, следовательно, чистого белка 136 бактериородопсина и его делеционных мутантов путем рекомбинантной экспрессии в грамотрицательной бактерии E. coli. Как известно, бактериоопсин (bO), апопротеин без хромофора ретиналя, синтезируется как предшественник бактериородопсина, имеющий на N-конце сигнальную последовательность (лидерный пептид), состоящую из 13 а.о. Эти аминокислотные остатки, также как один а.о. на C-конце (Asp 249), удаляются за несколько шагов во время посттрансляционного процессирования и сборки мембраны [74, 187, 188]. Причинами негомогенности bR, полученного из ПМ Halobacterium salinarum, могут являться частичное удаление сигнальной последовательности вследствие неполного процессирования предшественника и неконтролируемого дифференциального протеолиза, а также, возможно, недостаточное удаление Asp 249. Негомогенность продукта была экспериментально подтверждена наличием многополосной картины в результатах, полученных при электрофорезе и изоэлектрическом фокусировании бактериородопсина [187, 188]. Тем не менее, авторы статьи [187] сообщают, что при достаточной аэрации становится возможным получать гомогенный bR, т.к. функция и регуляция пептидаз, ответственных за процессирование предшественника, зависят от наличия кислорода. Однако, эти же авторы говорят о том, что способность клеток производить гомогенный bR является штамм-зависимой. С учетом этих фактов и изложенной в литобзоре (п. 1.7.3 главы 1) информаци об экспрессии bR в различных системах, преставилось целесообразным использовать в качестве системы для экспрессии bR и его делеционных мутантов гетерологичную бактериальную систему на основе грамотрицательной бактерии E. coli. Для решения проблемы негомогенности белков у bR и двух его делеционных мутантов методами генной инженерии был удалены лидерные пептиды, а также Asp 249 с C-конца. Создание делеционных мутантов бактериородопсина было обусловлено тем, что часть аминокислотных остатков у bR дикого типа (bRWT) не видна на карте электронной плотности 137 при расшифровке структуры, а именно, 4 а.о. с N-конца белка и 15 а.о. с Cконца белка. Это может быть обусловлено тем, что они находятся в свободном состоянии, т.е. не встроены в мембрану, что отрицательно сказывается на качестве кристалла и, соответственно, на его разрешении. Было выяснено, что у гомологов бактериоопсина bO (SG1bO, Au2bO, HhbO), а также у галоопсина (hO) и сенсорного опсина I (sOI) сигнальной пептидазой отрезается 5 аминокислотных остатков после лидерного пептида [189]. Это было проверено для бактериородопсина с помощью программы SignalP 3.0 Server, предсказывающей присутствие и расположение сигнальных последовательностей в различных организмах и сайты их отрезания. Для того, чтобы отрезать аминокислотные остатки, находящиеся в свободном состоянии на C-конце белка, с помощью методов генной инженерии необходимо ввести сайты для узнавания протеазой. Из пяти вариантов набора аминокислотных остатков, остающихся на C-конце bR после отрезания четырьмя различными протеазами, были выбраны два, наилучшим образом учитывающие возможные конформационные изменения в белке, его стабильность и фолдинг, образование дополнительных водородных связей, а значит, влияющие на качество кристаллов. Таким образом, было запланировано получить 3 следующих функциональных белка. 1) bR дикого типа: bRWT (248 а.о.) – отсутствует лидерный пептид, Asp 249 на С-конце. Два делеционных мутанта: 2) bR∆10 (234 а.о.) – отсутствует лидерный пептид, 5 а.о. (QAQIT) на N-конце, Asp 249, 10 а.о. (AGDGAAATSD) на С-конце; введен сайт для отрезания энтерокиназой – D-D-D-D-K^. 3) bR∆13 (231 а.о.) – отсутствует лидерный пептид, 5 а.о. (QAQIT) на N-конце, Asp 249, 13 а.о. (EPSAGDGAAATSD) на С-конце; введен сайт для отрезания протеазой Factor Xa – I-E-G-R^. 138 Известно, что лидерный пептид необходим для встраивания бактериородопсина в цитоплазматическую мембрану и предотвращения его деградации [124, 190]. Как было отмечено в литобзоре (п. 1.9.3 главы 1), использование экзогенных N-концевых последовательностей помогло при встраивании bO во внутреннюю мембрану бактерии и тем самым повысило выход и стабильность белка. Привлекательной системой для экспрессии bR в E.coli представлялся гибрид bO с MBP (Maltose Binding Protein). Белок MBP кодируется геном malE и имеет на своем N-конце собственный лидерный пептид для транслокации этого белка в периплазму бактерии. Поэтому можно было предположить, что конструкция MBP-bO способна обеспечить эффективное встраивание bO в цитоплазматическую мембрану. Доктор Р. Гриссхаммер и его коллеги, начиная с 1993 года, изучали экспрессию крысиного нейротензинового рецептора (NTR) в E. coli [168, 191, 192]. Эти исследователи сравнили уровни экспрессии у NTR дикого типа, у NTR, соединенного с N-конца с последовательностью сигнального пептида энтеротоксина B, и у NTR, соединенного N-концом с C-концом MBP [109]. Уровень экспрессии соединения MBP-NTR в 40 раз превышал уровни экспрессии в двух других случаях, что без сомнения означает, что использование соединений с геном malE является более предпочтительным вариантом. Наиболее выгодные аспекты в работе с бактериальными системами – это относительная легкость и быстрота, с которой желаемые экспрессионные конструкции могут быть разработаны, модифицированы и оценены. Доктор Р. Гриссхаммер с коллегами систематически изменял экспрессионные конструкции для NTR, каждый раз оценивая уровни выхода белка, степень очистки и эффективность. При этом из 250 г клеток ими получено и очищено до гомогенного состояния 10 мг функционального NTR [168, 169]. Белок MBP может быть легко отделен от NTR с помощью созданного методами генной инженерии сайта узнавания протеазой, находящегося в линкерной области между двумя белками. Протеаза вируса табачной мозаики 139 (TEV) эффективно расщепляет сайт узнавания из 8-ми аминокислотных остатков, созданный между двумя белками (рисунок 3.25) [109]. NTR является интрегральным мембранным белком и относится к классу GPCRs (G-protein-coupled receptors). Рецепторы GPCRs характеризуются тем, что имеют 7 гидрофобных трансмембранных доменов, которые соединены петлями различной длины [169]. Как известно, bR не относится к классу GPCRs, но в своей структуре также имеет 7 гидрофобных трансмембранных доменов. С учетом этого обстоятельства, а также информации, изложенной выше, было принято решение использовать одну из плазмидных конструкций, созданных доктором Р. Гриссхаммером и его коллегами для экспрессии bRWT, bR∆10, bR∆13 в E.coli. 1 − белок MBP, 2 − его сигнальный пептид, 3 − мембранный белок. SP – обозначение сайта, по которому природная пептидаза отрезает лидерный пептид при производстве зрелого белка. TEV – сайт для разрезания TEV-протеазой, чтобы отделить два белка после экспрессии и очистки [109] Рисунок 3.25 - Схематическое изображение гибрида MBP с мембранным белком Анализ результатов экспериментального исследования бактериородопсина и его делеционных мутантов. Подробное описание эксперимента по клонированию гена бактериоопсина и двух его делеционных мутантов в вектор v.1233 было изложено в п. 2.3.3. В данном разделе приведена краткая схема, которая была использована для получения плазмидных конструкций pl_bOWT, pl_bO∆10, pl_bO∆13. 1) Синтез фрагментов: 140 NA 219 п.н. v.1233/ NcoI-AatII NE 223 п.н. v.1233/NcoI-Eco47III 2) ПЦР: фрагмента 1233 450 п.н. v.1233/XmaI-HindIII bOW 744 п.н. pUCBM20/AatII-XmaI bO∆10 702 п.н. pUCBM20/Eco47III-XmaI bO∆13 693 п.н. pUCBM20/Eco47III-XmaI 3) Лигирование ПЦР-продуктов по тупым концам (SspI): фрагмент1233 – pUCBM20/SspI bOWT – pUCBM20/SspI bO∆10 – pUCBM20/SspI bO∆13 – pUCBM20/SspI 4) Трансформация Top10 и отбор клонов, содержащих вставки, с помощью рестрикционного анализа и электрофореза в 2% агарозном геле 5) Рестрикция вставок: bOWT/AatII-XmaI bO10/Eco47III-XmaI bO13/Eco47III-XmaI fr.1233/XmaI-HindIII 6) Выделение фрагментов NA и NE из плазмиды pUC57 с помощью рестрикции: NA/NcoI-AatII NE/NcoI-Eco47III 7) Лигирование фрагментов по липким концам: NA – bOWT Лигирование фрагментов по тупым концам: NE - bO∆10 NE - bO∆13 8) Отбор вставок нужного размера с помощью электрофореза в 1% агарозном геле 141 9) Клонирование ПЦР-фрагмента fr.1233 напрямую в v.1233, т.к. клонированный в плазмиду pUCBM20 фрагмент 1233 имеет ошибку в нуклеотидной последовательности: ПЦР-фрагмент fr.1233/ XmaI-HindIII v.1233/XmaI-HindIII 10)Трансформация Top10 и отбор клонов, содержащих fr.1233, с помощью рестрикционного анализа и электрофореза в 2% агарозном геле 11) Клонирование двойных вставок NA – bOWT, NE - bO∆10, NE - bO∆13 в вектор v.1233, содержащий fr.1233: v.1233/NcoI-HindIII 12) Электропорация и отбор клонов, содержащих нужные вставки с помощью рестрикции и электрофореза в 1% агарозном геле. Из трех запланированных конструкций (pl_bOWT, pl_bO∆10, pl_bO∆13) для экспрессии бактериородопсина и двух его делеционных мутантов в E. coli удалось получить одну конструкцию pl_bOWT, содержащую ген bOWT, рисунок 3.26. Рисунок 3.26 - Схемы плазмидных конструкций, составленные с помощью программы APE_Plasmid Editor, для экспрессии бактериоопсина и двух его 142 делеционных мутантов в E. coli: A − pl_bOWT, B − pl_bO∆10, C − pl_bO∆13 Для двух других конструкций (pl_bO∆10 и pl_bO∆13) после электропорации было проанализировано порядка 300 клонов, но ни в одном из них не было обнаружено нужных вставок (bO∆10 и bO∆13 соответственно), что было подтверждено с помощью секвенирования. Экспрессию гена bOWT, клонированного в плазмидный вектор pl_bOWT и находящегося под контролем lac промотора, осуществляли в штамме E. coli ER2507, дефицитном по гену malE. После экспрессии был проведен анализ белкового комплекса (fusionprotein) MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10×His, имеющего молекулярную массу MW≈87 кДа, в состав которого входит рекомбинатный белок bOWT (рисунок 3.27). Анализ белка осуществлялся с помощью электрофореза в 10% SDSПААГ и Western blot’а, при этом белок отбирался как из общего клеточного лизата, так и непосредственно из самих мембран. Рисунок 3.27 - Схема белкового комплекса MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10×His (MW≈87 кДа), содержащего рекомбинантный bOWT и экспрессированного с плазмиды pl_bOWT В таблице 3.3 представлено описание проведенных опытов по очистке белкового комплекса, содержащего рекомбинантный bOWT. Разработанные протоколы процедур очистки белка были подробно рассмотрены в разделе 2.3.3. Здесь же будут изложены полученные результаты. Для солюбилизации белкового комплекса MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA10×His (сокращенно fp_bOWT) и последующих манипуляций с ним в первых 4-х опытах по его очистке был использован детергент DM, относящийся к 143 классу мальтозидов, солюбилизации и которые очистки наиболее часто мембранных белков, применяются для в для частности рекомбинантного бактериородопсина, экспрессированного в E. coli. при концентрациях DM от 0.2% до 2%. Таблица 3.3. Описание опытов по очистке белкового комплекса, содержащего рекомбинантный bOWT № Название опыта Кол-во клеток, g Тип носителя Параметры и условия опытов Тип Вид Способ детергента и первичнанесения на его ных колонку; концентраантител элюирование ция при для WB солюбилизации, % 0.2% DM antiсамотеком; MBP элюирование – Lysis buffer с 200 mM имидазола 1 очистка 1 Получение белка с выделением мембран (+) или без выделения мембран (-) - 2 очистка 1 - Ni-NTA 0.2% DM anti-His 3 очистка 10 - Ni-NTA 1.5% DM antiMBP 4 очистка 10 + Ni-NTA 2% DM antiMBP 5 скрининг детергентов 7 + Ni-NTA 1% DM, DDM, CHAPS, SDS, FOS12, NLS, LDAO anti-His antiMBP 6 очистка 10 + Ni-NTA 1% NLS anti-His 7 разрезание TEVпротеазой и очистка _ _ Ni-NTA 0.2% DDM, 0.2% NLS, 0.2% FOS12 _ 8 очистка 10 + Ni-NTA 1% NLS antiMBP Amylose resin cамотеком; элюирование – Lysis buffer c 200 mM имидазола cамотеком; элюирование – Lysis buffer с 200 mM имидазола cамотеком; элюирование – Lysis buffer с 200 mM имидазола в объеме, 4 часа на качалке, при +4оС; элюирование – Lysis buffer с 500 mM имидазола cамотеком; элюирование – Lysis buffer с 500 mM имидазола в объеме, 4 часа на качалке, RT; элюирование – Lysis buffer с 500 mM имидазола самотеком; элюирование – Lysis buffer с 500 mM имидазола Результат очистки № рис. По-видимому, большая часть белка “проскакивает” через колонку, не связыаясь Весь белок “проскакивает” через колонку, не связываясь 3.23 Белок недостаточно солюбилизируется, поэтому плохо связывается с носителем Белок недостаточно солюбилизируется, поэтому плохо связывается с носителем Очистка лучше всего идет в 3-х детергентах – NLS, DDM, FOS-12 3.24, 3.25 Небольшая часть белка связывается с носителем - Во всех 3-х детергентах неполный протеолиз. При очистке после разрезания TEVпротеазой белок bRWT теряется настолько, что он не детектируется с помощью электрофореза в SDS-ПААГ и по методу Western blot В основном белок находится в цитоплазме. Большая его часть “проскакивает” через колонку, не 3.27 - 3.25 3.26 3.28 144 9 очистка супернатанта после выделения мембран из опыта 8 10 + Ni-NTA 1% NLS antiMBP самотеком; элюирование – Lysis buffer с 500 mM имидазола связываясь Большая часть белка “проскакивает” через колонку, не связываясь с носителем 3.28, 3.29 Но белок, полученный в данной экспрессионной системе, плохо солюбилизировался. Использование большей концентрации детергента могло препятствовать связыванию белка с носителем, потому что в этом случае белок окружен, так называемой, детергентной “шубой”. Следствием неполной солюбилизации белка являлось то, что аффинный хвост, в данном случае 10-His-tag, недостаточно экспонировался для связывания с носителем. Вероятно, поэтому белок плохо связывался с носителем, и большая его часть проскакивала через колонку. Недостаточное экспонирование His-tag также может быть подтверждено тем, что при анализе образцов белка после очистки по методу Western blot с использованием первичных антител на гистидиновый хвост (anti-His антител) отсутствовали соответствующие сигналы на мембране, а при использовании первичных антител на MBP (anti-MBP антител) для анализа тех же белковых фракций полосы, соответствующие целевому белку, детектировались. На рисунке 3.28 представлены результаты очистки белка на амилозном носителе (таблица 3.3, опыт 1) с использованием для солюбилизации 0.2% DM. Согласно данным руководства фирмы-изготовителя (NEB GmbH, Германия), низкая концентрация детергента обусловлена чувствительностью амилозного носителя к различным детергентам. Как видно из рисунка 3.28, большая часть белка не связывается с носителем. Так как в первом опыте большая часть целевого белка "проскочила" через колонку, то было принято решение дочистить белок с помощью аффинной хроматографии на носителе Ni-NTA (таблица 3.3, опыт 2). Для этого фракции проскока, промыва и элюции из первого опыта были объединены и диализированы в течение ночи против лизирующего буфера, 145 несодержащего компоненты EDTA и DTT, которые разрушают носитель NiNTA. Оказалось, что во время очистки весь белок "проскочил" через колонку, не связываясь с носителем. Цифрами обозначены номера дорожек для рисунков A и B, соответственно: 1. Проскок 2. Промыв 3 - 8. Элюции 1 – 6 9. Белковый маркер 1. Проскок 2. Промыв 3 - 14. Элюции 1 – 12 15. Белковый маркер Рисунок 3.28 - Изображения, полученные при детектировании целевого белка fp_bOWT 2-мя методами: A – электрофорез в 10% SDS-ПААГ; B − по методу Western blot (опыт 1) В опыте 3, как видно на рисунке 3.29, белок плохо связывался с носителем, вероятно, из-за недостаточной солюбилизации в 1.5% DM. Цифрами обозначены номера дорожек: 1. Клетки после French press до солюбилизации 2. После солюбилизации, супернатант 3. После солюбилизации, осадок (мембраны) 146 4. Проскок (после загрузки супернатанта на колонку с Ni-NTA) 5. Промыв 6-14. Элюции 4 - 12 15. Белковый маркер Рисунок 3.29 - Изображение, полученное при детектировании целевого белка fp_bOWT с помощью электрофореза в 10% SDS-ПААГ, опыт 3 В трех вышеописанных опытах по очистке белка он был солюбилизирован из общего клеточного лизата, т.е. без выделения клеточных мембран. В опыте 4 выделение белка осуществлялось непосредственно из мембран с использованием 2% DM. А, именно, осадки, полученные ультрацентрифугированием после солюбилизации в 1.5% DM (недосолюбилизированные мембраны) в опыте 3, были гомогенизированы в лизирующем буфере и солюбилизированы в 2% DM. После солюбилизации и ультрацентрифугирования супернатант был нанесен на колонку с Ni-NTA. Как можно видеть из рисунка 3.30, больше всего белка находится в первой дорожке, соответствующей белку до солюбилизации. Но сравнимое количество белка присутствует и во второй дорожке, соответствующей супернатанту после солюбилизации в 1.5% DM. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Цифрами обозначены номера дорожек: Клетки после French press до солюбилизации (опыт 3) После солюбилизации, супернатант (опыт 3) После солюбилизации, осадок (мембраны) (опыт 3) Проскок (после загрузки супернатанта на колонку с Ni-NTA) (опыт 3) Промыв (опыт 3) После солюбилизации, супернатант После солюбилизации, осадок (мембраны) Проскок 147 9. Промыв 10. Белковый маркер 11 – 12. Элюции 6 – 7 Рисунок 3.30 - Изображение, полученное при детектировании целевого белка fp_bOWT по методу Western blot, опыт 4 В проскоке после нанесения супернатанта (дорожка 4) белок есть, но его меньше, чем до нанесения. Кроме того, на дорожках 11-12 также видны слабые полосы, соответствующие элюированному белку. Значит, какая-то часть белка все-таки связывается с носителем, но плохо элюируется 200 mM имидазола, который был использован в элюирующем буфере в 4-х описанных экспериментах. Поэтому было принято решение увеличить концентрацию имидазола в элюирующем буфере до 500 mM. Также стоит отметить, что, судя по множественным полосам в дорожках, белок во время солюбилизации и очистки подвергается сильной протеолитической деградации, несмотря на добавление ингибиторов протеаз. В супернатанте после повторной солюбилизации в 2% DM белка значительно меньше, чем было до этого. Однако, это может быть связано с погрешностью переноса. Тем не менее, белок все еще есть в осадках мембран (дорожка 7). Из описанных выше экспериментов был сделан вывод, что детергент DM плохо подходит для солюбилизации белкового комплекса MBP-TevbOWT-Tev-TrxA-10×His и последующих манипуляций с ним. Поэтому нами был проведен скрининг семи детергентов для выявления наиболее подходящего детергента для солюбилизации и очистки бактериородопсина, полученного в данной экспрессионной системе. Результаты скрининга представлены в таблице 3.3 (опыт 5) и на рисунке 3.31. Из рис. 3.31 (A) видно, что белок лучше всего солюбилизировался в четырех детергентах: DDM, NLS, FOS-12, SDS. В дорожках, соответствующих осадкам, полученным после солюбилизации мембран в этих детергентах, осадки визуально кажутся более чистыми – содержат меньшее количество неспецифики. 148 На рисунке 3.31 (B, C) показаны результаты очистки белка на носителе Ni-NTA, солюбилизированного в 1% DDM, NLS, FOS-12, SDS. На изображении B видны полосы в элюатах для 3-х детергентов - DDM, FOS-12, NLS. Визуально представляется, что в 10-11 дорожках, соответствующих детергенту NLS, белок – наиболее чистый. Здесь использованы сокращения: суп. − супернатант после солюбилизации и ультрацентрифугирования, ос. – гомогенизированный осадок (мембраны) после солюбилизации и ультрацентрифугирования Цифрами обозначены номера дорожек для рис. A (колонка слева), B и C (колонка справа): 1. DM, суп. 1. DDM, проскок 2. DM, ос. 2. DDM, промыв 3. DDM, суп. 3. DDM, элюция 1 4. DDM, ос. 4. DDM, элюция 2 5. CHAPS, суп. 5. FOS-12, проскок 6. CHAPS, ос. 6. FOS-12, элюция 1 7. LDAO, суп. 7. FOS-12, элюция 2 8. LDAO, ос. 8. NLS, проскок 9. NLS, суп. 9. NLS, промыв 10. NLS, ос. 10. NLS, элюция 1 11. FOS-12, суп. 11. NLS, элюция 2 12. FOS-12, ос. 12. SDS, проскок 13. SDS, суп. 13. SDS, элюция 1 14. SDS, ос. 14. SDS, элюция 2 15. Белковый маркер 15. Белковый маркер Рисунок 3.31 - Изображения, полученные при детектировании целевого белка fp_bOWT двумя методами: A, C − по методу Western blot, B − при электрофорезе в 10% SDS-ПААГ (опыт 5) Изображение C получено при детектировании белка по методу Western blot с использованием первичных антител на гистидиновый хвост - anti-His антител. На этот раз после добавления субстрата впервые были получены соответствующие сигналы, указывающие на присутствие His-tag в 149 исследуемом белковом комплексе. Как было сказано выше, до этого сигналы проявлялись только при использовании первичных антител на MBP (antiMBP антител). Отсюда можно сделать вывод, что детергенты DDM, NLS, FOS-12 лучше солюбилизируют белок, тем самым делая гистидиновый хвост более доступным для связывания с носителем. Судя по изображению C, нам представляется, что детергенты NLS и DDM наилучшим образом подходят для солюбилизации и очистки белкового комплекса MBP-Tev-bOWT-TevTrxA-10×His. В опыте 6 белковый комплекс MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10×His, полученный из мембран солюбилизацией в 1% NLS, подвергался очистке на носителе Ni-NTA. Часть белка связывалась с носителем, что было детектировано с помощью электрофореза в SDS-ПААГ и Western blotанализа с использованием anti-His антител. Оценка выхода чистого белка дала значение, примерно, 50 µg/L, что сравнимо по порядку величины с выходом белка 84 µg/L, достигнутым при экспрессии рекомбинантного bR в E.coli и его очистке на колонке Ni-NTA авторами работы [193]. Все фракции после элюирования, содержащие искомый белок, были объединены, сконцентрированы и диализированы для понижения концентрации NLS (до 0.2%) и избавления от имидазола для последующего разрезания TEVпротеазой. Параллельно с предыдущим проводился опыт 7, направленный на проверку действия TEV-протеазы в трех детергентах, отобранных в опыте 5 (DDM, NLS, FOS-12). Результаты, полученные в ходе этого опыта, показывают, что TEV-протеаза, несмотря на свою чувствительность к действиям детергентов, функционирует во всех трех детергентах. Как и следовало ожидать, наиболее эффективный протеолиз наблюдается в неионном детергенте DDM. Это видно на рисунке 3.27, полученном при детектировании белка с помощью электрофореза в SDS-ПААГ: на дорожке 3 визуально наблюдается меньше всего исходного белка. Однако, на той же 150 дорожке присутствуют полосы, которые, возможно, соответствуют неспецифичному протеолизу. На рисунке 3.32 представлены результаты, полученные при обработке белка TEV-протеазой, очищавшегося в опыте 6, и результаты, полученные после скрининга действия TEV-протеазы в различных детергентах. Цифрами обозначены номера дорожек: 1. Белок после очистки (опыт 6) и до разрезания TEV-протеазой 2. Белок после очистки (опыт 6) и после разрезания TEV-протеазой 3. Белок после разрезания TEV-протеазой, DDM 4. Белок после разрезания TEV-протеазой, FOS-12 5. Белок после разрезания TEV-протеазой, NLS 6. Белковый маркер Рисунок 3.32 - Изображение, полученное при детектировании целевых белков fp_bOWT и bOWT с помощью электрофореза в 10% SDS-ПААГ, опыт 7 На рисунке 3.32 также видно, что TEV-протеаза в детергенте NLS “порезала” белок лишь частично: во 2-й и 5-ой дорожках наблюдается полоса, соответствующая по молекулярному весу исходному белковому комплексу MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10×His. Однако, в дорожке 3 можно увидеть полосу, соответствующую 26 kDa - молекулярному весу бактериородопсина. После обработки исходного белкового комплекса TEV-протеазой были измерены максимумы поглощения белка на длинах волн 280 нм и 558 нм. На 558 нм пик отсутствовал, что говорит о том, что во время экспрессии 151 ретиналь не встроился в bO. Но это некритично, т.к. существуют методики по ренатурации bO с помощью ретиналя после экспрессии [130]. Затем была проведена очистка соответствующей дорожке 2 (рисунок 3.32) белковой смеси на колонке с носителем Ni-NTA, направленная на удаление TEV-протеазы, которая на своем N-конце имеет HQ-tag, предназначенный для связывания с Ni-носителем. При детектировании белка после очистки с помощью электрофореза в SDS-ПААГ было обнаружено, что в элюате присутствовуют TEV-протеаза и недорезанный ею белковый комплекс, который тоже связался с носителем и элюировался с помощью 500 mM имидазола. Однако, в проскоке на уровне, соответствующем bOWT (26 kDa), белок не детектировался ни с помощью электрофореза в SDS-ПААГ, ни по методу Western blot. Вероятно, после протеолиза в опыте 6 белка было настолько мало, что он весь терялся в процессе очистки. Для очистки белка, осуществленной в опытах 8 и 9 (таблица 3.3), была наработана биомасса, условия получения которой были немного изменены, а именно: после индукции экспрессии с помощью IPTG инкубацию клеток проводили при 25оС в течение 16 час, а не при 22оС. Как выяснилось с помощью электрофореза в SDS-ПААГ и анализа по методу Western blot, увеличение температуры на 3 градуса привело к тому, что основная часть белка не встроилась в мембрану, а, предположительно, осталась в цитоплазме (рисунок 3.33, дорожки 1 и 2). На рисунке 3.33 представлены результаты очистки белка, экспрессированного при 25оС и солюбилизированного из мембран с помощью 1% NLS. Как видно из рисунка, количество белка, находящего в супернатанте (дорожка 1), т.е. не встроившегося в мембрану, значительно превышает количество белка, солюбилизированного из мембран (дорожка 2). Кроме того, большая часть белка из мембран проскакивает через колонку, не садясь: при детектировании белка с помощью электрофореза в 10% SDSПААГ элюаты практически не видны, и детектируются по методу Western blot только при использовании первичных anti-MBP антител, но не при 152 использовании первичных anti-His антител. Это может свидетельствовать о том, что гистидиновый хвост практически недоступен для связывания с антителами и носителем Ni-NTA. Цифрами обозначены номера дорожек: 1. Супернатант после ультрацентрифугирования при выделении мембран 2. Супернатант после солюбилизации в 1% NLS и ультрацентрифугирования 3. Проскок после загрузки супернатанта (того же, что на дорожке 2) на колонку с NiNTA 4. Промыв 5-14. Элюции 1 – 10 15. Белковый маркер Рисунок 3.33 - Изображение, полученное при детектировании целевого белка fp_bOWT по методу Western blot, опыт 8 На рисунке 3.34 показаны результаты очистки белка, находившегося в цитоплазме и не встроившегося в мембрану (рисунок 3.33, дорожка 1). После этой очистки были сделаны те же выводы, что и при анализе рисунка 3.33. Таким образом, несмотря на то, что количество цитоплазматической фракции белка MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10×His, экспрессированного при температуре 25оС в опытах 8 и 9, значительно превышает количество белка, экспрессированного при температуре 22оС и встроившегося в мембрану, белок по-прежнему плохо сорбируется на колонке Ni-NTA, что затрудняет его очистку. 153 Нельзя ничего определенного сказать о функциональности фракции бактериоопсина, находившегося в цитоплазме и не встроившегося в мембрану. В обзоре [194] указывалось, что экспрессия функционального белка зависит от эффективности встраивания природного полипептида в мембрану. А в статье [195] было показано, что бактериоопсин, являющийся гетерологичным мембранным белком в E.coli, встраивается в мембрану E.coli по пути, используемому нативными мембранными белками этой бактерии, т.е. направляется в мембрану с помощью signal recognition particle (SRP) и встраивается в мембрану во время трансляции. Цифрами обозначены номера дорожек: 1. Супернатант после ультрацентрифугирования при выделении мембран (рисунок 3.28, дорожка 1) 2. Проскок после загрузки супернатанта (того же, что на дорожке 1) на колонку с Ni-NTA 3. Промыв 4-13. Элюции 3 – 12 14. Элюция после ночи в элюирующем буфере с 500 mM имидазола 15. Белковый маркер Рисунок 3.34 - Изображение, полученное при детектировании целевого белка fp_bOWT по методу Western blot, опыт 9 С другой стороны, авторы работ [128, 196] показали, что белковый комплекс MBP-bO может быть экспрессирован в виде телец включения, а также молекулы MBP-bO могут образовывать водорастворимые олигомеры, так называемые “белковые мицеллы”, в которых гидрофильные глобулы MBP окружают гидрофобные последовательности bO. Недостатком 154 “белковых мицелл” в данном случае является то, что в таких мицеллах сайтспецифическое расщепление становится недоступным для протеаз, и Histag также практически не доступен для связывания с носителем, как было упомянуто выше. Кроме того, как видно на рисунках 3.28, 3.30, 3.33, 3.34, полученных при детектировании белка по методу Western blot, белок подвергается сильной протеолитической деградации, которая также наблюдалась авторами работы [193] при экспрессии bO в E.coli. Таким образом, выбранная экспрессионная система оказалась не оптимальной для экспрессии bR в E.coli из-за малого выхода целевого белка и трудностей, возникающих в процессе его очистки, которые приводят к практически модификации, полной потере происходящие белка. с Возможные белком на посттрансляционные стадии экспрессии в гетерологичной системе, и сильная протеолитическая деградация, которой повергается белок, также могут нарушить функциональность белка, что отмечалось и в работе [193]. Результаты и выводы экспериментального исследования бактериородопсина и его делеционных мутантов. 1. Для экспрессии бактериородопсина в E. coli удалось получить одну конструкцию pl_bOWT, содержащую ген bOWT, что было подтверждено с помощью секвенирования. 2. Для двух других конструкций (pl_bO∆10 и pl_bO∆13) после электропорации было проанализировано порядка 300 клонов, но ни в одном из них не было обнаружено нужных вставок bO∆10 и bO∆13. 3. Экспрессию гена bO, клонированного в плазмидный вектор pl_bOWT, осуществляли в 5-ти различных штаммах E. coli и в 3-х различных питательных средах 2хTY, TB, LB; штамм компетентных клеток E. coli ER2507 и среда 2хTY оказались наиболее благоприятными для экспрессии бактериородопсина. 155 4. Проведен скрининг 7 различных детергентов (DM, DDM, CHAPS, SDS, FOS-12, NLS, LDAO) для выявления наиболее подходящего их них для солюбилизации бактериородопсина, экспрессированного в системе pl_bOWT; при этом выяснилось, что детергент DM плохо подходит для солюбилизации белкового комплекса MBP-Tev-bOWT-Tev-TrxA-10×His и последующих манипуляций с ним, а детергенты DDM, NLS, FOS-12 лучше солюбилизируют белок, тем самым делая гистидиновый хвост более доступным для связывания с носителем. 5. Проведен сравнительный анализ протеолитического действия TEVпротеазы в 3-х различных детергентах (NLS, DDM, FOS-12), которые лучше других подошли для солюбилизации и очистки бактериоопсина; TEVпротеаза, несмотря на свою чувствительность к действиям детергентов, функционирует во всех трех детергентах. 6. Выбранная экспрессионная система не является оптимальной для экспрессии bR в E.coli из-за объективных трудностей, возникающих в процессе очистки белка и последующего его протеолиза, которые приводят к практически полной потере белка. Кроме того, по результатам описанного в данной главе эксперимента можно сделать ряд общих и важных выводов. 7. Чтобы получить большое количество гомогенных функциональных мембранных белков для структурных исследований, необходимо ясно понимать процессы, которые происходят в клетках-хозяевах при рекомбинантной экспрессии этих белков. Различные клетки-хозяева имеют индивидуальные биологические свойства, поэтому экспрессируемые в них мембранные белки могут отличаться последовательностью аминокислотных остатков, стабильностью и уровнем выхода. 8. Для разработки будущих экспериментов по экспрессии необходим переход от описательных исследований (с концентрацией внимания на сообщениях об уровнях экспрессии) к пониманию основных механизмов. Это поможет в решении проблемы, как соединить специфический мембранный 156 белок с определенным вектором для экспрессии, клеткой-хозяином и условиями культивирования. 9. Дальнейший прогресс в совершенствовании использования шкалы биологической гидрофобности в математических моделях, например, в предложенном нами новом методе предсказания TMDs, может позволить рассчитывать эффективность встраивания природных полипептидов в мембрану. И таким образом мембранные белки для экспериментальных исследований с целью достижения наилучшей функциональной экспрессии могут быть выбраны на основе их последовательностей, как ранее отмечалось доктором Р. Гриссхаммером в работе [194]. 157 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Проведенное сравнение различных способов преобразования Фурье для анализа периодичности аминокислотных последовательностей в различных белках позволило выбрать дискретное преобразование рядом Фурье в качестве наиболее оптимального варианта по наибольшей достоверности частотного спектра Фурье, простоте алгоритма и экономичности вычислений. 2. При исследовании выбранным методом периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 были получены данные, позволившие выровнять аминокислотные последовательности с учетом установленных малых и больших периодов. Оптимальный метод преобразования Фурье был также применен к 24 трансмембранным белкам, для 14 из них – успешно. 3. Проведенный анализ аминокислотной последовательности литического фермента бактериофага phiKZ - белка gp181 - показал наличие периодичности в его С-концевой части с тем же периодом Т = 8, что и в Сконцевой части литического фермента бактериофага Т4 - белка gp5. С учетом выявленной аналогии этих белков было выдвинуто предположение о том, что С-концевой домен белка gp181 играет роль сенсорной “молекулярной” иглы в процессе инфицирования бактериофагом phiKZ клетки, которое затем получило экспериментальное обоснование. 4. В качестве альтернативы методу Фурье в данной работе предложен новый метод компьютерного анализа расположения трансмембранных участков белков, основанный на применении функции и шкалы гидрофобности. Его особенность заключается в многократном усреднении функции гидрофобности внутри “окна”, перемещаемого вдоль полипептидной цепи. 158 Этот новый метод был применен к тем же 24 трансмембранным белкам, что и метод Фурье, для 19 из них − успешно. Он показал большую, чем метод Фурье, пригодность для прогнозирования вторичной структуры такого рода белков и соответствующих ей функциональных свойств. 5. Сравнение результатов, полученных путем компьютерного анализа аминокислотных последовательностей 24 трансмембранных белков, с известными данными об их структуре показало применимость обоих предложенных методов, как по отдельности, так и совместно, для предсказания признаков неизвестной вторичной структуры мембранных белков и обусловленных этими признаками функциональных свойств этих белков. 6. Экспериментальные полученных путем исследования фаговых рекомбинантной и мембранных экспрессии с белков, использованием созданных в работе плазмид, позволило установить для них ряд структурных особенностей и свойств и сопоставить их с теоретическими предсказаниями. В частности, белок gp181MA фага phiKZ экспрессировался полностью в растворимой форме. Белок gp181E, экспрессированный при пониженной температуре, становился растворимым в присутствии детергента и сахара. Он оказался гидрофобным и взаимодействовал с различными штаммами клеток Pseudomonas aeruginosa, но не лизировал их, в отличие от gp181MA. Путем гель-фильтрации установлено, что белок gp181E – не мономер, а димер или тример. Спектры КД для белков gp181E и gp181MA показывают, что их вторичная структура примерно на 70% состоит из спиралей длиной около 8 а. о. Экспериментальные данные свидетельствуют о различиях во вторичной структуре С-концевого домена белка gp181 бактериофага phiKZ и -спирали белка gp5 бактериофага Т4, что может определять различие механизмов их взаимодействия с клетками. 159 Благодарности. Автор благодарен д.б.н., профессору Месянжинову В.В. за предоставленную возможность выполнить часть данной работы в Лаборатории молекулярной биоинженерии ИБХ РАН. Автор благодарит своего научного руководителя д.х.н., зав. Лабораторией молекулярной биоинженерии ИБХ РАН Мирошникова К.А за постановку научных задач и продуктивное обсуждение результатов работы. Автор благодарен к.ф-м.н., профессору Университета Аахена (г. Аахен, Германия), зав. Лабораторией клеточной и молекулярной биофизики Института Комплексных систем Научно-исследовательского Центра (г. Юлих, Германия) Горделию В.И. за предоставленную возможность выполнить часть данной работы в указанной лаборатории и в Институте Структурной Биологии (г. Гренобль, Франция) и за постановку научных задач. Автор выражает слова благодарности к.б.н. Бегуновой Е.А. за помощь в проведении биологических экспериментов, за обучение биохимическим методам эксперимента, за консультации и участие в обсуждениях исследований, дружескую поддержку и внимание. Автор признателен к.б.н. Эдельвейс Э.Ф. за ценные советы, обсуждение молекулярно-биологических аспектов исследований и соучастие в них. Автор искренне благодарит своего отца д.ф-м.н., профессора Симакова Н.Н. за продуктивное обсуждение результатов работы и формирование новых идей, за помощь в разработке алгоритмов численного моделирования, за ценные замечания и полезные советы при выполнении работы, а также при ее написании и оформлении, за доброту, внимание и неизменную моральную поддержку. 160 СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ kDa - килодальтон (кДа) ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция EDTA - этилендиаминтетраацетат натрия SDS - додецил сульфат натрия (ДСН) IPTG - изопропил-1-тио--D-галактопиранозид PMSF - фенилметилсульфонилфторид Tris - гидроксиметиламинометан gp - gene product (продукт гена) п.н. - пар нуклеотидов а.о. - аминокислотный остаток о.е. - оптическая единица bR - bacteriorhodopsin (бактериородопсин) MBP - Maltose Binding Protein NTR - нейротензиновый рецептор GPCRs - G-protein-coupled receptors His-tag - гистидиновый хвост TrxA - тиоредоксин А dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфат SAP - Shrimp Alkaline Phosphatase PEG - полиэтиленгликоль ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин NLS (Sarkosyl) - N-lauroylsarcosine sodium salt DM - n-Decyl-β-D-maltopyranoside DDM - n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside FOS-12 - n-Dodecylphosphocholine LDAO - Lauryldimethylamine-N-oxide CHAPS - 3-[(3-cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propanesulfonate 161 DTT - дитиотреитол TEV - tobacco etch virus (вирус табачной мозаики) MetOH - метанол Taq - полимераза - Thermophilus aquaticus полимераза AcONa - ацетат натрия EtOH - этанол ATP - Adenosine-5'-triphosphate NaCl - хлорид натрия Coomassie - краситель на основе трифенилметана mQ – вода Milli-Q Tween 20 – полярный неионный детергент NaN3 – азид натрия TBST - Tris-buffered saline with Tween NBT-BCIP – субстрат 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate-Nitro blue tetrazolium glycerol – глицерин Complete – ингибитор протеаз CMC - critical micelle concentration Ni-NTA - nickel-nitrilotriacetic acid TMD - трансмембранный участок-домен TPD - топологический домен 162 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Geidushek E.P. Regulation of expression of the late genes of bacteriophage T4 // Annu Rev Genet. 1991. Vol. 25, pp. 437-60. 2. Wood W.B. Undelivered summary remark for the 1974 Squaw Valley meeting on assembly mechanisms // J Supramol Struct. 1974. Vol. 2. No. 2-4, pp. 512514. 3. Hohn B., Wutz M., Klein B., Lusting A., Hohn T. Phage lambda DNA packaging in vitro // J. Supramol.Struct. 1974. Vol. 2. No. 2-4, pp. 302-317. 4. Kaiser A.D., Syvanen M., Mazuda T. Processing and assembly of the head of bacteriophage lambda // J. Supramol. Struct. 1974. Vol. 2. No. 2-4, pp. 318-328. 5. Voyles B.A.: The biology of viruses. 1993. Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, MO, pp. 8-9. 6. Kikuchi Y., King J. Genetic control of bacteriophage T4 baseplate and morphogenesis. III. Formation of the central plug and overall assembly pathway // J. Mol. Biol. 1975. Vol. 99. No. 4, pp. 695-716. 7. Kikuchi Y., King J. Assembly of the tail of bacteriophage T4 // J Supramol Struct. 1975. Vol. 3. No. 1, pp. 24-38. 8. Eiserling F.A. & Black L.W. Pathways in T4 morphogenesis. In Molecular Biology of Bacteriophage T4. 1994. (Karam J.D., ed.). ASM Press, Washington, DC, pp. 209-213. 9. E. Kutter, G. Mosiz et al. Genomic map of bacteriophage T4. 1993. S.J. O’Brien (Ed.), Genomic Maps, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, pp. 1-27. 10. Kostyuchenko V.A., Navruzbekov G.A., Kurochkina L.P., Strelkov S.V., Mesyanzhinov V.V., Rossmann M.G. The structure of bacteriophage T4 gene product 9: the trigger for tail contraction // Structure. 1999. Vol. 7. No. 10, pp. 1213-1222. 163 11. Goldberg E., Grinius L. & Letteler L. Recognition, attachment and injection. In the Molecular biology of bacteriophage T4. 1994. (Karam J.D., ed.). ASM Press, Washington, DC, pp. 347-356. 12. Crowter R.A., Lenk E.V., Kikuchi Y. & King J. Molecular reorganization in the hexagon to star transition of the baseplate of bacteriophage T4 // J. Mol. Biol. 1977. Vol. 116. No. 3, pp. 489-523. 13. Kanamaru S., Leiman P.G., Kostyuchenko V.A., Chipman P.R., Mesyanzhinov V.V., Arisaka F. and Rossmann M.G. Structure of the cell-puncturing device of bacteriophage T4 // Nature. 2002. Vol. 415. No. 6871, pp. 553-557. 14. Nakagawa H., Arisaka F., Ishii S. Isolation and characterisation of the bacteriophage T4 tail-associated lysozyme // J. Virol. 1985. Vol. 54. No. 2, pp. 460-466. 15. Kanamaru S., Gassner N.C., Ye N., Takeda S. and Arisaka F. The C-terminal fragment of the precursor tail lysozyme of bacteriophage T4 stays as a structural component of the baseplate after cleavage // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. No. 9, pp. 2739-2744. 16. Simon L.D., Anderson T.F. The infection of Escherichia coli by T2 and T4 bacteriophages as seen in electron microscope. I. Attachment and generation // Virology. 1967. Vol. 32. No. 2, pp. 279-297. 17. Yamamoto M., Uchida H. Organization and function of the tail of bacteriophage T4. II. Structural control of the tail contraction // J. Mol. Biol. 1973. Vol. 92. No. 2, pp. 207-223. 18. Simon L.D., Swan J.G., Flatgaart J.E. Functional defects in T4 bacteriophage lacking the gene 11 and gene 12 products // Virology. 1970. Vol. 41. No. 1, pp. 77-90. 19. Dawes J. Characterization of the bacteriophage T4 receptor site // Nature. 1975. Vol. 256. No. 5513, pp. 127-128. 20. Crowter R.A., Lenk E.V., Kikuchi Y., King J. Molecular reorganization in the hexagon to star transition of the baseplate of bacteriophage T4 // J. Mol. Biol. 1977. Vol. 116. No. 3, pp. 489-523. 164 21. Watts N.R. & Coombs D.H. Structure of the bacteriophage T4 baseplate as determined by chemical cross-linking // J. Virol. 1990. Vol. 64. No. 1, pp. 143154. 22. Brenner S., Streisinger G., Horne W., Champe S. P., Barnett L., Benzer S., Rees M. W. Structural components of bacteriophage // J. Mol. Biol. 1959. Vol. 1, pp. 281-292. 23. Голицына Н.Л., Селиванов Н.А., Рустамбеков О.С., Месянжинов В.В. Выделение биологически активных половинок длинных хвостовых фибрилл и бакенбард бактериофага Т4 // Биол. Науки. 1983. №. 4. С. 27-32. 24. Селиванов Н.А., Беньяминов С.Ю., Голицина Н.Л., Николаева Л.И., Месянжинов В.В. Структура и регуляция сборки фибриллярных белков бактериофага Т4. Выделение и спектральные свойства длинных хвостовых фибрилл // Молек. Биология. 1987. Т. 21. С. 1258-1267. 25. Yamamoto M., Uchida H. Organization and function of bacteriophage T4 tail. I. Isolation of heat-sensitive T4 tail mutants // J. Mol. Biol. 1973. Vol. 52. No. 1, pp. 234-245. 26. Oliver D.B., Crowther R.A. DNA sequence of the tail fibre genes 36 and 37 of bacteriophage T4 // J. Mol. Biol. 1981. Vol. 153. No. 3, pp. 545-568. 27. Dickson R.C. Assembly of bacteriophage T4 tail fibers. IV. Subunit composition of tail fibers and fiber precursors // J. Mol. Biol. 1973. Vol. 79. No. 4, pp. 633647. 28. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. No. 5259, pp. 680-685. 29. King J., Laemmli U.K. Polypeptides of tail fibres of bacteriophage T4 // J. Mol. Biol. 1971. Vol. 62. No. 3, pp. 465-472. 30. Cerritelli M.E., Wall J.S., Simon M.N., Conway J.F., Steven A.C. Stoichiometry and domainal organization of the long tail-fiber of bacteriophage T4: a hinged viral adhesin // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 260. No. 5, pp. 767-780. 31. Makhov A.M., Trus B.L., Conway J.F., Simon M.N., Zurabishvili T.G., Mesyanzhinov V.V., Steven A.C. The short tail fiber of bacteriophage T4: 165 Molecular structure and a mechanism for its conformational transition // Virology. 1993. Vol. 194. No. 1, p. 117- 127. 32. Earnshaw W.G., Goldberg E.B., Crowther E.A. The distal half of the tail fibre of the bacteriophage T4. Rigidly linked domains and cross-beta structure // J. Mol. Biol. 1979. Vol. 132. No. 1, pp. 101-113. 33. Zandmeier H., Iida S., Arber W. DNA inversion regions Min of plasmid p15B and Cin of bacteriophage P1: evolution of bacteriophage tail fiber genes // J. Bacteriol. 1992. Vol. 174. No. 12, pp. 3936-3944. 34. Michel C.J., Jacq B., Arques D.G., Bickle T.A. A remarkable amino acid sequence homology between a phage T4 tail fibre protein and ORF314 of phage lambda located in the tail operon // Gene. 1986. Vol. 44. No. 1, pp. 147-150. 35. Follansbee S.E., Vanderslice R.W., Chavez L.G., Yegian C.D. A new set of adsorption mutants of bacteriophage T4D: identification of a new gene // Virology. 1974. Vol. 58. No. 1, pp. 180-199. 36. Engel J., Prockop D.J. The zipper-like folding of collagen triple helices and the effects of mutations that disrupt the zipper // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1991. Vol. 20, pp. 137-152. 37. Montag D., Riede I., Eschbach M.L., Degen M., Henning U. Receptorrecognizing proteins of T-even type bacteriophages. Constant and hypervariable regions and an unusual case of evolution // J. Mol. Biol. 1987. Vol. 196. No. 1, pp. 165-174. 38. Kells S.S., Haselkorn R. Bacteriophage T4 short tail fibers are the product of gene 12 // J. Mol. Biol. 1974. Vol. 83, No. 4, pp. 473-485. 39. Mason W.S., Haselkorn R. Product of T4 gene 12 // J. Mol. Biol. 1972. Vol. 66. No. 3, pp. 445-469. 40. Selivanov N.A., Prilipov A.G., Efimov V.P., Marusich E.I., Mesyanzhinov V.V. Cascade of overlapping late genes in bacteriophage T4 // Biomed Sci. 1990. Vol. 1. No. 1, pp. 55-62. 41. Zorzopulos J., Kozloff L.M., Chapman V., DeLong S. Bacteriophage T4D receptors and Escherichia coli cell wall structure: role of spherical particles and 166 protein b of the cell wall in bacteriophage infection // J. Bacteriol. 1979. Vol. 137. No. 1, pp. 545-555. 42. Зинченко В.П., Рудик О.Л., Селиванов Н.А., Месянжинов В.В. Функциональная активность коротких фибрилл бактериофага Т4 // Докл. АН СССР. 1982. Т. 267. С. 974-977. 43. Zorzopulos J., Kozloff L.M. Identification of T4D bacteriophage gene product 12 as the baseplate zinc metalloprotein // J. Biol. Chem. 1978. Vol. 253. No. 15, pp. 5543-5547. 44. Куриц Т.С., Селиванов Н.А., Месянжинов В.В. Особенности молекулярной организации коротких фибрилл бактериофага Т4 // Докл. АН СССР. 1984. Т. 274. С. 448-452. 45. Тяглов Б.В., Крылов В.Н., Плотникова Т.Г., Минаев И.Е., Пермогоров В.И. Некоторые физико-химические свойства бактериофага phiKZ // Молекулярная биология. 1980. Т. 14. № 5. С. 1019-1022. 46. Mesyanzhinov V.V., Robben J., Grymonprez B., Kostyuchenko V.A., Bourkaltseva M.V., Sykilinda N.N., Krylov V.N., Volckaert G. The genome of bacteriophage phiKZ of Pseudomonas aeruginosa // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 317. No. 1, pp. 1-19. 47. Krylov V.N., Smirnova T.A., Minenkova I.B., Plotnikova T.G., Zhazikov I.Z., Khrenova E.A. Pseudomonas bacteriophage phiKZ contains an inner body in its capsid // Can. J. Microbiol. 1984. Vol. 30. No. 6, pp. 758-762. 48. Ahearn D.G., Borazjani R.N., Simmons R.B., Gabriel M.M. Primary adhesion of Pseudomonas aeruginosa to inanimate surfaces including biomaterials // Methods Enzymol. 1999. Vol. 310, pp. 551-557. 49. Giamarellou H. Therapeutic guidelines for Pseudomonas aeruginosa infections // Int. J. Antimicrob. Agents. 2000. Vol. 16. No. 2, pp. 103-106. 50. Carlton R.M. Phage therapy: past history and future prospects // Arch. Immunol. Ther. Exp. 1999. Vol. 47. No. 5, pp. 267-274. 51. Summers W.C. Bacteriophage therapy // Annu. Rev. Microbiol. 2001. Vol. 55, pp. 437-451. 167 52. Nelson D., Loomis L., Fishetti V.A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteiophage lytic enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. No. 7, pp. 4107-4112. 53. Loeffler J.M., Nelson D. and Fischetti V.A. Rapid killing of Streptococcus pneumonia with bacteriophage cell wall hydrolase // Science. 2001. Vol. 294. No. 5549, pp. 2170-2172. 54. Loeffler J.M., Fischetti V.A. Synergistic lethal effect of a combination of phage lytic enzymes with different activities on penicillin-sensitive and -resistant Streptococcus pneumonae strains // Antimicrob. Agents Chemoter. 2003. Vol. 47. No. 1, pp. 375-377. 55. Jado I., Lopez R., Garcia E., Fenoll A., Casal J., Garcia P. Phage lytic enzymes as therapy for antibiotic-resistant Streptococcus pneumonae infection in a murine sepsis model // J. Antimicrob. Chemoter. 2003. Vol. 52. No. 6, pp. 967973. 56. Schuch R., Nelson D., Fischetti V.A. Bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis // Nature. 2002. Vol. 418. No. 6900, pp. 884-889. 57. Kendrew J., Bodo G., Dintzis H., Parrish R., Wyckoff H., Phillips D. A threedimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis // Nature. 1958. Vol. 181. No. 4610, pp. 662-666. 58. Deisenhofer J., Epp O., Miki K., Huber R., Michel H. Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3Å resolution // Nature. 1985. Vol. 318. No. 6047, pp. 618-624. 59. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium // Nat New Biol. 1971. Vol. 233. No. 39, pp. 149-52. 60. Haupts U., Tittor J., Oesterhelt D. Сlosing in on bacteriorhodopsin: Progress in Understanding the Molecule // Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1999. Vol. 28. No. 1, pp. 367-399. 168 61. Findlay J. B. and Pappin D. J. The opsin family of proteins // Biochem J. 1986. Vol. 238. No. 3, pp. 625-42. 62. Dannon A., Stoeckenius W. Photophosphorylation in Halobacterium halobium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. Vol. 71. No. 4, pp. 1234-1238. 63. Oesterhelt D. Light-energy transformation in halobacteria – a second path to the nature of photosynthesis // Nova Acta Leopoldina. 1982. NF 55, Nr. 246, 21-28. 64. Oesterhelt D., Hess B. Reversible photolysis of the purple complex in the purple membrane of Halobacterium halobium // Eur J Biochem. 1973. Vol. 37. No. 2, pp. 316-26. 65. Lanyi J. K. Light energy conversion in Halobacterium halobium // Microbiol Rev. 1978. Vol. 42. No. 4, pp. 682-706. 66. Hampp N. Bacteriorhodopsin as a photochromic retinal protein for optical memories // Chem Rev. 2000. Vol. 100. No. 5, pp. 1755-1776. 67. Oren A. Bioenergetic aspects of halophilism // Microbiol Mol Biol Rev. 1999. Vol. 63. No. 2, pp. 334-348. 68. Stark M., Moeller C., Mueller D.J., Guckenberger R. From images to interactions: high-resolution phase imaging in tapping-mode atomic force microscopy // Biophys J. 2001. Vol. 80. No. 6, pp. 3009-3018. 69. Henderson R. The structure of the purple membrane from Halobacterium halobium: analysis of the X-ray diffraction pattern // J. Mol. Biol. 1975. Vol. 93, No. 2, pp. 123-138. 70. Corcelli A., Lattanzio V.M., Mascolo G., Papadia P., Fanizzi F. Lipid-protein stoichiometries in a crystalline biological membrane: NMR quantitative analysis of the lipid extract of the purple membrane // J Lipid Res. 2002. Vol. 43. No. 1, pp. 132-140. 71. Shen Y., Safinya C.R., Liang K.S., Ruppert A.F., Rothschild K.J. Stabilization of the membrane protien bacteriorhodospin to 140 ˚C in two dimensional films // Nature. 1993. Vol. 366, pp. 48-50. 169 72. Eisenbach M., Caplan S.R. Interaction of purple membrane with solvents. II. Mode of interaction // Biochim Biophys Acta. 1979. Vol. 554, No. 2, pp. 281292. 73. Ovchinnikov Y.A., Abdulaev N.G., Feigina M.Y., Kiselev A.V., Lobanov N.A. The structural basis of the functioning of bacteriorhodopsin: An overview // FEBS Lett. 1979. Vol. 100. No. 2, pp. 219-224. 74. Dunn R., McCoy J., Simsek M., Majumdar A., Chang S.H., Rajbhandary U.L., Khorana H.G. The bacteriorhodopsin gene // Proc Natl Acad Sci USA. 1981. Vol. 78. No. 11, pp. 6744-6748. 75. Scherrer P., Mathew M.K., Sperling W., Stoeckenius W. Retinal isomer ratio in dark-adapted purple membrane and bacteriorhodopsin monomers // Biochemistry. 1989. Vol. 28. No. 2, pp. 829-834. 76. Hirai T., Subramaniam S. Structural insights into the mechanism of proton pumping by bacteriorhodopsin // FEBS Letters. 2003. Vol. 545. No. 1, pp. 2-8. 77. Henderson R., Baldwin J. M., Ceska T. A., Zemlin F., Beckmann E., Downing K. H. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 213. No. 4, pp. 899-929. 78. Grigorieff N., Ceska T.A., Downing K.H., Baldwin J.M., Henderson R. Electron-crystallographic refinement of the structure of bacteriorhodopsin // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 259, No. 3, pp. 393-421. 79. Kimura Y., Vassylyev D.G., Miyazawa A., Kidera A., Matsushima M., Mitsuoka K., Murata K., Hirai T., Fujiyoshi Y. Surface of bacteriorhodopsin revealed by high-resolution electron crystallography // Nature. 1997. Vol. 389. No. 6647, pp. 206-211. 80. Mathies R., Lin S., Ames J., Pollard W. From femtoseconds to biology: mechanism of bacteriorhodopsin’s light-driven proton pump // Annu. Rev Biophys Biophys Chem. 1991. Vol. 20, pp. 491–518. 81. Ebrey T.G. Light energy transduction in bacteriorhodopsin. In Thermodynamics of membranes, receptors and channels. 1993. Ed. M. Jackson, Boca Raton, Fla: CRC Press, pp. 353-387. 170 82. Lanyi J.K. Proton translocation mechanism and energetics in the light driven pump bacteriorhodopsin // Biochim Biophys Acta. 1993. Vol. 1183, pp. 241-61. 83. Oesterhelt D. The structure and mechanism of the family of retinal proteins from halophilic archaea // Curr Opin Struct. Biol. 1998. Vol. 8, pp. 489-500. 84. Lanyi J. Bacteriorhodopsin //Annu Rev Physiol. 2004. Vol. 66, pp. 665-688. 85. Dancshazy Z., Groma G., Oesterhelt D., Tittor, J. The photochemical cycle of bacteriorhodopsin has no refractory period // FEBS Letters. 1986. Vol. 196, pp. 198-202. 86. Herzfeld J., Tounge B. NMR probes of vectoriality in the proton-motive photocycle of bacteriorhodopsin: evidence for an “electrostatic steering” mechanism // Biochim Biophys Acta. 2000. Vol. 1460. No. 1, pp. 95-105. 87. Herzfeld J., Lansing J. Magnetic resonance studies of the bacteriorhodopsin pump cycle //Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2002. Vol. 31, pp. 73-95. 88. Dioumaev A.K. Infrared methods for monitoring the protonation state of carboxylic amino acids in the photocycle of bacteriorhodopsin // Biochemistry (Mosc). 2001. Vol. 66. No. 11, pp. 1269-1276. 89. Maeda A. Internal water molecules as mobile polar groups for light-induced proton translocation in bacteriorhodopsin and rhodopsin as studied by difference FTIR spectroscopy // Biochemistry (Mosc). 2001. Vol. 66. No. 11, pp. 12561268. 90. Landau E.M., Rosenbusch J.P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins // Proc Natl Acad Sci. USA. 1996. Vol. 93. No. 25, pp. 14532-35. 91. Pebay-Peyroula E., Rummel G., Rosenbusch J.P., Landau E.M. X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms from microcrystals grown in lipidic cubic phases // Science. 1997. Vol. 277. No. 5332, pp. 1676-81. 92. Luecke H., Richter H.T., Lanyi J.K. Proton transfer pathways in bacteriorhodopsin at 2.3 angstrom resolution // Science. 1998. Vol. 280. No. 5371, pp. 1934-1937. 171 93. Belrhali H., Nollert P., Royant A., Menzel C., Rosenbusch J.P, Landau E.M., Pebay-Peyroula E. Protein, lipid and water organization in bacteriorhodopsin crystals: a molecular view of the purple membrane at 1.9 Å resolution // Structure. 1999. Vol. 7. No. 8, pp. 909-917. 94. Luecke H., Schobert B., Richter H.T., Cartailler J.P., Lanyi J.K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 Å resolution // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 291. No. 4, pp. 899-911. 95. Schobert B., Cupp-Vickery J., Hornak V., Smith S., Lanyi J. Crystallographic structure of the K intermediate of bacteriorhodopsin: conservation of free energy after photoisomerization of the retinal // J. Mol. Biol. 2002.Vol. 321. No. 4, pp. 715-726. 96. Edman K., Nollert P., Royant A., Belrhali H., Pebay-Peyroula E., Hajdu J., Neutze R., Landau E.M. High-resolution X-ray structure of an early intermediate in the bacteriorhodopsin photocycle // Nature. 1999. Vol. 401. No. 6755, pp. 822-826. 97. Royant A., Edman K., Ursby T., Pebay-Peyroula E., Landau E. M., Neutze R. Helix deformation is coupled to vectorial proton transport in the photocycle of bacteriorhodopsin // Nature. 2000. Vol. 406. No. 6796, pp. 645-648. 98. Luecke H., Schobert B., Richter H.T., Cartailler J.P., Lanyi J.K. Structural changes in bacteriorhodopsin during ion transport at 2 Å resolution // Science. 1999. Vol. 286. No. 5438, pp. 255-261. 99. Luecke H., Schobert B., Richter H. T., Cartailler J., Rosengarth A., Needleman R., Lanyi J.K. Coupling photoisomerization of the retinal in bacteriorhodopsin to directional transport // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 300. No. 5, pp. 1237-1255. 100. Sass H. J., Bueldt G., Gessenich R., Hehn D., Neff D., Schlesinger R. et al. Structural alterations for proton translocation in the M state of wild-type bacteriorhodopsin // Nature. 2000. Vol. 406. No. 6796, pp. 649-653. 101. Facciotti M.T., Rouhani S., Burkard F.T., Betancourt F.M. et al. Structure of an early intermediate in the M-state phase of the bacteriorhodopsin photocycle // Biophys. J. 2001. Vol. 81. No. 6, pp. 3442-3455. 172 102. Vonck J. Structure of the bacteriorhodopsin mutant F219L N intermediate revealed by electron crystallography // EMBO J. 2000. Vol. 19. No. 10, pp. 2152-2160. 103. Subramaniam S., Henderson R. Molecular mechanism of vectorial proton translocation by bacteriorhodopsin // Nature. 2000. Vol. 406. No. 6796, pp. 653-657. 104. Subramaniam S., Lindahl M., Bullough P., Faruqi A. R., Tittor J., Oesterhelt D. et al. Protein conformational changes in the bacteriorhodopsin photocycle // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 287. No. 1, pp. 145-161. 105. Rouhani S., Cartailler J., Facciotti M., Walian P., Needleman R., Lanyi J. et al. Crystal structure of the D85S mutant of bacteriorhodopsin: a model of an O-like photocycle intermediate // J. Mol. Biol. 2001. Vol. 313, No. 3, pp. 615-628. 106. Lanyi J.K., Luecke H. Bacteriorhodopsin: Review // Curr Opin Struct Biol. 2001.Vol. 11. No. 4, pp. 415-419. 107. Lanyi J., Schobert B. Crystallographic structure of the retinal and the protein after deprotonation of the Schiff base: the switch in the bacteriorhodopsin photocycle // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 321. No. 4, pp. 727-737. 108. Schertler G. Overproduction of membrane proteins // Curr Opin Struct Biol. 1992. No. 2, pp. 534-544. 109. Mancia F., Hendrickson W.A. Expression of recombinant G-Protein Coupled Receptors for structural biology // Mol BioSyst. 2007. Vol. 3. No. 10, pp. 723734. 110. Bernaudat F., Frelet-Barrand A. et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host // PLoS One. 2011. 6(12):e29191, DOI: 10.1371/journal.pone.0029191 111. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Isolation of the cell membrane of Halobacterium halobium and its fractionation into red and purple membranes // Methods Enzymol. 1974. Vol. 31, pp. 667-678. 112. Happe M., Overath P. Bacteriorhodopsin depleted of purple membrane lipids // Biochem Biophys Res Commun. 1976. Vol. 72. No. 4, pp. 1504-1511. 173 113. Ovchinnikov Yu.A. Bioorganic chemistry of rhodopsins // Pure Appl. Chem. 1986. Vol. 58. No. 5, pp. 725-736. 114. Овчинников Ю.А., Абдулаев Н.Г., Фейгина М.Ю., Киселев А.В., Лобанов Н.А., Назимов И.В. Первичная структура бактериородопсина // Биоорган. Химия. 1978. Т. 4. № 11. С. 1573-1574. 115. Dunn R.J., Hackett N.R., McCoy J.M., Chao B.H., Kimura K., Khorana H.G. Structure-function studies on bacteriorhodopsin. I. Expression of the bacterioopsin gene in E. coli // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No. 19, pp. 9246-9254. 116. Karnik S., Nassal M., Doi T., Jay E., Sgaramella V., Khorana H.G. Structurefunction studies on bacteriorhodopsin. II. Improved expression of the bacterioopsin gene in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No. 19, pp. 9255-9263. 117. Nassal M., Mogi T., Karnik S., Khorana H. G. Structure-function studies on bacteriorhodopsin. III. Total synthesis of a gene for bacterio-opsin and its expression in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No. 19, pp. 9264-9270. 118. Hackett N.R., Stern L.J., Chao B.H., Kronis K.A., Khorana H.G. Structurefunction studies on bacteriorhodopsin. V. Effects of amino acid substitutions in the putative helix F // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No. 19, pp. 9277-9284. 119. Hildebrandt V., Ramezani-Rad M., Swida U., Wrede P., Grzesiek S., Primke M., Bueldt G. Genetic transfer of the pigment bacteriorhodopsin into the eukaryote Schizosaccharomyces pombe // FEBS Letters. 1989. Vol. 243. No. 2, pp. 137-140. 120. Soppa J., Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin mutants of Halobacterium sp. GRB. I. The 5-bromo-2'-deoxyuridine selection as a method to isolate point mutants in halobacteria // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. No. 22, pp. 13043-8. 121. Ni B., Chang M., Duschl A., Lanyi J., Needleman R. An efficient system for the synthesis of bacteriorhodopsin in Halobacterium halobium // Gene. 1990. Vol. 90. No. 1, pp. 169-172. 174 122. Hampp N., Oesterhelt D. Chapter 11. Bacteriorhodopsin and its potential in technical applications. Nanobiotechnology: Concepts, Applications and Perspectives. 2005. DOI: 10.1002/3527602453.ch11. 123. Khorana H.G. Two light-transducing membrane proteins: bacteriorhodopsin and the mammalian rhodopsin // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. Vol. 90. No. 4, pp. 1166-1171. 124. Karnik S., Doi T., Molday R., Khorana H.G. Expression of the archaebacterial bacterio-opsin gene with and without signal sequences in Escherichia coli: the expressed proteins are located in the membrane but bind retinal poorly // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. Vol. 87. No. 22, pp. 8955-8959. 125. Braiman M.S., Stern L.J., Chao B.H., Khorana H.G. Structure–function studies on bacteriorhodopsin. IV. Purification and renaturation of bacterio-opsin polypeptide expressed in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. No. 19, pp. 9271-9276. 126. Shand R.F., Miercke L.J., Mitra A.K., Fong S.K. Stroud R.M., Betlach M.C. Wild-type and mutant bacterioopsins D85N, D96N, and R82Q: high-level expression in Escherichia coli // Biochemistry. 1991. Vol. 30. No. 12, pp. 30823088. 127. Miercke L.J., Betlach M.C., Mitra A.K., Shand R.F., Fong S.K., Stroud R.M. Wild-type and mutant bacteriorhodopsins D85N, D96N, and R82Q: purification to homogeneity, pH dependence of pumping, and electron diffraction // Biochemistry. 1991. Vol. 30. No. 12, pp. 3088-3098. 128. Chen G.Q., Gouaux J.E. Overexpression of bacterio-opsin in Escherichia coli as a water-soluble fusion to maltose binding protein: efficient regeneration of the fusion protein and selective cleavage with trypsin // Protein Sci. 1996. Vol. 5. No. 3, pp. 456-467. 129. Pompejus M., Friedrich K., Teufel M., Fritz H.J. High-yield production of bacteriorhodopsin via expression of a synthetic gene in Escherichia coli // Eur J Biochem. 1993. Vol. 211. No. 1-2, pp. 27-35. 175 130. Nekrasova O. et al. A new hybrid protein for production of recombinant bacteriorhodopsin in Escherichia coli // J Biotechnol. 2010. Vol. 147. No. 3-4, pp. 145-150. 131. Ramachandran S., Lu H., Prabhu U., Ruoho A.E. Purification and characterization of the guinea pig sigma-1 receptor functionally expressed in Escherichia coli // Protein Expr Purif. 2007. Vol. 51. No. 2, pp. 283-292. 132. Roosild T.P., Greenwald J., Vega M., Castronovo S., Riek R., Choe S. NMR structure of Mistic, a membrane-integrating protein for membrane protein expression // Science. 2005. Vol. 307. No. 5713, pp. 1317-1321. 133. Neophytou I., Harvey R., Lawrence J., Marsh P., Panaretou B., Barlow D. Eukaryotic integral membrane protein expression utilizing the E. coli glycerolconducting channel protein (GlpF) // Appl Microbiol Biotechnol. 2007. Vol. 77. No. 2, pp. 375-381. 134. Ang P.G.P., Sammells A.F. Conversion of solar energy to chemical and electrical energy. U.S. Patent No. 4,215,182, July 29, 1980. 135. Bouas-Laurent H., Duerr H. Organic photochromism (IUPAC Technical report) // Pure Appl Chem. 2001. Vol. 73. Iss. 4, pp. 639-665. 136. Braeuchle C., Hammp N., Oesterhelt D. Optical application of bacteriorhodopsin and its mutated variants // Adv. Mater. 1991. Vol. 3. No. 9, pp. 420-428. 137. Birge R.R., et al. Biomolecular electronics: protein-based associative processors and volumetric memories // J Phys Chem. B. 1999. Vol. 103. No. 49, pp. 10746-10766. 138. Всеволодов Н.Н., Полторацкий В.А. Голограммы на биологическом ФХМ -биохроме // ЖТФ. 1985. Т. 55. № 10. С. 2093-2094. 139. Hampp N., Braeuchle C., Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin wildtype and variant aspartate-96 → aspargine as reversible holographic media // Biophys J. 1990. Vol. 58. No. 1, pp. 83-93. 140. Birge R.R. Protein-based computers // Sci. Am. 1995. Vol. 272. No. 3, pp. 9095. 176 141. Chou P.Y., Fasman G.D. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino-acids sequence // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1978. Vol. 47, pp. 45-148. 142. Thornton J. M., Taylor, W. R. Structure prediction // Protein sequencing: a practical approach (Findlay, J. B. C. and Geisgow, M. J., eds.). 1989. IRL Press/Oxford University Press, Oxford, pp. 147-190. 143. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями // 2-е изд., исп. и доп. М.: Книжный дом “Университет”, 2002. 376 c. 144. Karam J.D. Molecular biology of bacteriophage T4 // Washington, D.C.: American Society of Microbiology. 1994, pp. 161-175. 145. Коротков Е.В., Короткова М.А., Френкель Ф.Е., Кудряшов Н.А. Информационная концепция поиска периодичности в символьных последовательностях // Молекуляр. биология. 2003. Т. 37, № 3, С. 436-451. 146. McLachlan A.D., Stewart M. The 14-fold periodicity in -tropomyosin and the interaction with actin // J. Mol. Biol. 1976. Vol. 103. No. 2, pp. 271-298. 147. Турыгин А.Ю., Чечеткин В.Р. О критериях беспорядка в апериодических последовательностях // ЖЭТФ. 1994. Т. 106. С. 335-354. 148. Макеев В.Ю., Туманян В.Г. О связи методов внутренних гомологий, корреляционных функций и Фурье-анализа при поиске периодичностей в первичных структурах биополимеров // Биофизика. 1994. Т. 39. С. 294-297. 149. Макеев В.Ю., Франк Г.К., Туманян В.Г. Статистика периодических закономерностей в последовательностях интронов человека // Биофизика. 1996. Т. 41. С. 241-246. 150. Лобзин В.В., Чечеткин В.Р. Порядок и корреляции в геномных последовательностях ДНК. Спектральный подход // Успехи физических наук. 2000. Т. 170. № 1. С. 57-81. 151. Kyte J., Doolittle R.F. A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein // J. Mol. Biol. 1982. Vol. 157. No.1, pp. 105-132. 177 152. Froemmel C. The apolar surface area of amino acids and its empirical correlation with hydrophobic free energy // J Theor Biol. 1984.Vol. 111. No. 2, 247-260. 153. Engelman D.M., Steitz T.A., Goldman A. Identifying nonpolar transbilayer helices in amino acid sequences of membrane proteins // Annu Rev Biophys Biophys Chem. 1986. Vol. 15, pp. 321-353. 154. Rose G.D., Geselowitz A.R., Lesser G.J., Lee R.H., Zehfus M.H. Hydrophobicity of amino acid residues in globular proteins // Science. 1985. Vol. 229. No. 4716, pp. 834-838. 155. Eisenberg D., Schwarz E., Komaromy M., Wall R. Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot // J. Mol. Biol. 1984. Vol. 179. No. 1, pp. 125-142. 156. Fraser R.D.B., MacRae T.P. Conformation in fibrous proteins and related synthetic polypeptides // Academic Press, London, New York. 1973. 628 pp. 157. Pauling L., Corey R.B. Compound helical configurations of polypeptide chains: structure of proteins of the alpha-keratin type // Nature. 1953. Vol. 171. No. 4341, pp. 59-61. 158. Crick F.N.C. The packing of -helices: simple coiled-coil // Acta. Crystallogr. 1953. Vol. 6, pp. 689-697. 159. Efimov V.P., Engel J., Malashkevich V.N. Crystallization and preliminary crystallographic study of the pentamerizing domain from cartilage oligomeric matrix protein: a five-stranded α-helical bundle // Proteins. 1996. Vol. 24. Iss. 2, pp. 259-262. 160. Cohen C., Parry D.A. -helical coiled-coiles and bundles: how to design an helical protein // Proteins. 1990. Vol. 7. No. 1, pp. 1-15. 161. Stouten P.F., Sander C., Rugrok R.W., Cusack S. New triple-helical model for the shaft of the adenovirus fiber // J. Mol. Biol. 1992. Vol. 226. No. 4, pp. 1073-1084. 162. Lodish H., Berk A., Zipursky S.L. et al. Molecular Cell Biology. 4th edition // New York: W.H. Freeman. 2000. 178 163. Lomize A.L., Pogozheva I.D., Lomize M.A., Mosberg H.I. The role of hydrophobic interactions in positioning of peripheral proteins in membranes // BMC Struct Biol. 2007. Vol. 7, pp. 44. 164. Johnson J.E., Cornell R.B. Amphitropic proteins: regulation by reversible membrane interactions // Mol Membr Biol. 1999. Vol. 16. No. 3, pp. 217-235. 165. Goni F.M. Non-permanent proteins in membranes: when proteins come as visitors // Mol Membr Biol. 2002.Vol. 19. No. 4, pp. 237-245. 166. Cho W., Stahelin R.V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking // Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2005. Vol. 34, pp. 119-151. 167. Kalmbach R., Chizhov I., Schumacher M.C., Friedrich T., Bamberg E., Engelhard M. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 371. No. 3, pp. 639-648. 168. White J.F., Trinh L.B., Shiloach J., Grisshammer R. Automated large-scale purification of a G protein-coupled receptor for neurotensin // FEBS Letters. 2004. Vol. 564. No. 3, pp. 289-293. 169. Grisshammer R., White J.F., Trinh L.B., Shiloach J. Large-scale expression and purification of a G-protein-coupled receptor for structure determination – an overview // J Struct. Funct Genomics. 2005. Vol. 6, No. 2-3, pp. 159-163. 170. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning // A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Laboratory Press. N.Y. 1989, pp.1.53-1.56. 171. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning // A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Laboratory Press. N.Y. 1989, pp. 1.341.45. 172. Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes // J. Mol. Biol. 1986. Vol. 189. No. 1, pp. 113-130. 173. Burnette W.N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate − polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and 179 radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A // Anal Biochem. 1981. Vol. 112. No. 2, pp. 195-203. 174. Корн Г., Корн Т. Справочник по математике для научных работников и инженеров. – М.: Наука, 1977. – 832 с. 175. Кудряцев Л.Д. Математический анализ. – М.: Высшая школа. 1973, т. 2. – 470 с. 176. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. - М.: МЦНМО, 2002. – 248 с. 177. Симакова М.Н., Симаков Н.Н. Исследование периодичности расположения аминокислот в фибриллярных белках бактериофага Т4 // Молекуляр. биология. 2005. Т. 39. № 2. С. 321-329. (Для англ. версии − Simakova M.N., Simakov N.N. Investigation of periodic distributions of amino acids in the sequences of fiber proteins of bacteriophage T4 // Mol Biol. (Mosc.) 2005. Vol. 39. No. 2, pp. 284-291.). 178. URL: http://www.uniprot.org 179. Lesser G.J., Lee R.H., Zehfus M.H., Rose G.D. Hydrophobic Interactions in Proteins // Protein Engineering. Eds Oxender D.L., Fox C.F., N.Y.: Alan R. Liss. 1987, pp. 175−179. 180. Van Raaij M.J., Schoehn G., Burda M.G., Miller S. Crystal structure of a heat and protease-stable part of the bacteriophage T4 short tail fibre // J. Mol. Biol. 2001. Vol. 314. No. 5, pp. 1137-1146. 181. Altschul S.F., Madden T.L., Schäffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25. No. 17, pp. 3389-3402. 182. Чупров-Неточин Р.Н., Файзулина Н.М., Сыкилинда Н.Н., Симакова М.Н., Месянжинов В.В., Мирошников К.А. Бета-спиральный домен бактериофага Т4 управляет укладкой фрагмента длинных фибрилл в составе химерного белка // Биоорган. химия. 2010. Т. 36. №2. С. 193-199. (Для англ. версии − Chuprov-Netochin R.N., Faizullina N.M., Sykilinda N.N., 180 Simakova M.N., Mesyanzhinov V.V., Miroshnikov K.A. The β-helical domain of bacteriophage T4 controls the folding of the fragment of long tail fibers in a chimeric protein // Russ J Bioorg Chemistry. 2010. Vol. 36. No. 2, pp. 172178.) 183. Галзитская О.В., Гарбузинский С.А., Лобанов М.Ю. Предсказание нативно-развернутых участков белковой цепи // Молекуляр. биология. 2006. Т. 40. № 2. С. 341-348. (Для англ. версии − Galzitskaya O.V., Garbuzynskiy S.O., Lobanov M.Yu. Prediction of Natively Unfolded Regions in Protein Chains // Mol Biol. (Mosc.) 2006. Vol. 40. No. 2, pp. 298-304.) 184. Галзитская О.В., Гарбузинский С.А., Лобанов М.Ю. 2006. Поиск амилоидогенных участков белковой цепи. Молекуляр. биология. Т. 40. № 5. С. 910-918. (Для англ. версии − Galzitskaya O.V., Garbuzynskiy S.O., Lobanov M.Yu. (2006) A Search for Amyloidogenic Regions in Protein Chains. Mol. biol. (Mosc.) Vol. 40. No. 5, pp. 821-828.) 185. Garbuzynskiy S.O., Lobanov M.Yu., Galzitskaya O.V. FoldAmyloid: a method of prediction of amyloidogenic regions from protein sequence // Bioinformatics. 2010. Vol. 26. No. 3, pp. 326-332. 186. URL: http://bioinfo.protres.ru/fold-amyloid/oga.cgi 187. Lorber B., DeLucas L.J. Large scale preparation of homogeneous bacteriorhodopsin // FEBS Letters. 1990. Vol. 261. No. 1, pp. 14-18. 188. Miercke L.J., Ross P.E., Stroud R.M., Dratz E.A. Purification of bacteriorhodopsin and characterization of mature and partially processed forms // J Biol Chem. 1989. Vol. 264. No. 13, pp. 7531-7535. 189. Soppa J., Duschl J., Oesterhelt D. Bacterioopsin, Haloopsin, and Sensory Opsin I of the halobacterial isolate Halobacterium sp. Strain SG1: three new members of a growing family // J Bacteriol. 1993. Vol. 175. No. 9, pp. 2720-2726. 190. Xu Z.J., Moffett D.B., Peters T.R., Smith L.D., Perry B.P., Whitmer J., Stokke S.A., Teintze M. The Role of the leader sequence coding region in expression and assembly of bacteriorhodopsin // J Biol Chem. 1995. Vol. 270. No. 42, pp. 24858-63. 181 191. Grisshammer R., Duckworth R., Henderson R. Expression of a rat neurotensin receptor in Escherichia coli // Biochem. J. 1993. Vol. 295, pp. 571-576. 192. Tucker J., Grisshammer R. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli // Biochem. J. 1996. Vol. 317, pp. 891-899. 193. Hohenfeld I.P., Wegener A.A., Engelhard M. Purification of histidine tagged bacteriorhodopsin, pharaonis halorhodopsin and pharaonis sensory rhodopsin II functionally expressed in Escherichia coli // FEBS Letters. 1999. Vol. 442. No. 2-3, pp. 198-202. 194. Grisshammer R. Understanding recombinant expression of membrane proteins // Curr Opin in Biotechnol. 2006. Vol. 17. No. 4, pp. 337-340. 195. Raine A., Ullers R., Pavlov M., Luirink J., Wikberg J.E., Ehrenberg M. Targeting and insertion of heterologous membrane proteins in E. coli // Biochimie. 2003. Vol. 85. No. 7, pp. 659-68. 196. Tagvey A.I., Nekrasova O.V. Improved production of recombinant bacteriorhodopsin in E. coli as a fusion to maltose-binding protein // International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov. Moscow-Puschino. 2009. Abstracts. Vol. 2, pp. 234-235.
