ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ»
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ» СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК На правах рукописи ЛЕБЕДЕВА Александра Михайловна ВЛИЯНИЕ ПРОДУКТОВ РАЗРУШЕНИЯ STREPTOCOCCUS PYOGENES НА ФУНКЦИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ИХ СПОСОБНОСТЬ К МИГРАЦИИ ИЗ КРОВЯНОГО РУСЛА В ОЧАГ ИНФЕКЦИИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор медицинских наук, член-корр. РАН, профессор Фрейдлин Ирина Соломоновна кандидат биологических наук Старикова Элеонора Александровна Санкт-Петербург 2014 –2– Оглавление Список сокращений ...................................................................................................................................................... 5 ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................................................................................... 7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................................................................. 11 1.1. Взаимодействие моноцитов крови с эндотелиальными клетками сосудов ................. 11 1.1.1. Морфологические характеристики взаимодействующих клеток ............................ 11 1.1.2. Этапы мобилизации моноцитов из кровяного русла в очаг инфекции ........................ 13 1.1.3. Секреторная активность моноцитов крови человека ............................................................ 22 1.2. Влияние Streptococcus pyogenes и его компонентов на процессы мобилизации моноцитов в очаг воспаления .............................................................................................................................. 29 1.2.1. Факторы патогенности (вирулентности) гноеродного стрептококка .......................... 29 1.2.2. Влияние бактериальных компонентов на функции моноцитов крови ........................ 32 1.2.3. Влияние бактериальных компонентов на функции эндотелиальных клеток .......... 34 1.3. Влияние компонентов гноеродного стрептококка на регуляцию взаимодействия моноцитов крови с эндотелиальными клетками сосудов .................................................................... 37 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ..................................................................................................................... 40 2.1. Культуры клеток ................................................................................................................................................. 40 2.2. Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови доноров................ 42 2.4. Характеристика супернатанта разрушенных S. pyogenes .............................................................. 43 2.5. Оценка интенсивности апоптоза и некроза в исследуемых культурах ................................. 44 2.6. Оценка адгезионной активности моноцитов крови человека и клеток линии ТНР-1 .. 46 2.6.1. Оценка адгезионной активности клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток ..................................................................................................................................... 46 2.6.2. Оценка адгезионной активности моноцитов крови к монослою эндотелиальных клеток .......................................................................................................................................................................... 47 2.6.3. Оценка адгезионной активности мононуклеарных лейкоцитов крови к пластику .......................................................................................................................................................................................... 48 2.7. Оценка миграционной активности моноцитов крови и клеток линии ТНР-1 .................. 48 2.7.1. Оценка миграционной активности клеток линии ТНР-1 ..................................................... 50 2.7.2. Оценка миграционной активности моноцитов крови человека ...................................... 50 2.8. Исследование уровней экспрессии адгезионных молекул .......................................................... 52 2.9. Количественная оценка цитокинов в супернатантах ..................................................................... 52 2.10. Исследование уровней экспрессии фосфокиназ ............................................................................. 52 –3– 2.11. Статистическая обработка результатов .............................................................................................. 54 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ............................................................................................................................................... 55 3.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции клеток линии ТНР-1 .............................................................................................................................................................................................. 55 3.1.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток ........................................................................................... 55 3.1.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию клеток линии ТНР-1 ...................................................................................................................... 58 3.1.3. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграционную активность клеток линии ТНР-1 ............................................................................................................................................. 59 3.1.4. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии адгезионных молекул на клетках линии ТНР-1 .................................................................................... 60 3.1.5. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфо-NFκB в клетках линии ТНР-1 ............................................................................................................ 62 3.1.6. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию клеток линии ТНР-1 (интактных и преинкубированных с токсином коклюша) к эндотелиальным клеткам ....................................................................................................................................................................... 63 3.1.7. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию интактных и преинкубированных с токсином коклюша клеток линии ТНР-1 .......................................................................................................................................................................................... 64 3.1.8. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на интенсивность миграции интактных и преинкубированных с токсином коклюша клеток линии ТНР-1 .................... 66 3.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции моноцитов периферической крови человека ....................................................................................................................... 67 3.2.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию моноцитов крови человека к монослою эндотелиальных клеток ..................................................................................... 67 3.2.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию мононуклеарных лейкоцитов крови человека к пластику .................................................................................................... 69 3.2.3. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию моноцитов крови человека ....................................................................................................... 71 3.2.4. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграцию моноцитов крови человека ........................................................................................................................................................ 72 3.2.5. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграцию интактных и преинкубированных с токсином коклюша моноцитов крови человека .................................. 75 –4– 3.2.6. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии адгезионных молекул на моноцитах крови человека ........................................................................ 77 3.2.7. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на секрецию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами .................................................................................................................. 78 3.2.8. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфокиназ моноцитами крови человека ................................................................................................ 79 3.3. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции эндотелиальных клеток .......................................................................................................................................................................... 81 3.3.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии адгезионных молекул на поверхности эндотелиальных клеток ................................................. 81 3.3.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфо-NFκB в эндотелиальных клетках .................................................................................................... 83 3.4. Исследование токсического эффекта супернатанта разрушенных стрептококков на мононуклеарные лейкоциты крови человека и клетки перевиваемых линий ТНР-1 и EA.hy 926 ...................................................................................................................................................................................... 84 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................................................................................................... 86 4.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции клеток линии ТНР1. ...................................................................................................................................................................................... 86 4.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции моноцитов крови человека. ..................................................................................................................................................................... 89 Заключение .................................................................................................................................................................... 94 ВЫВОДЫ .......................................................................................................................................................................... 96 Список используемой литературы .................................................................................................................... 97 –5– Список сокращений ПКС – полная культуральная среда СРС – супернатант разрушенных стрептококков мАт - моноклональные антитела ОП – отическая плотность ЭК – эндотелиальные клетки 7-AAD – 7-aminoactinomycin-D (7-аминоактиномицин-D) сАМР – cycle adenosine monophosphate (циклический аденозинмонофосфат) CFSE – carboxyfluorescein succinimidyl ester (карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфир) ESL-1 – E-selectin ligand-1 (лиганд Е-селектина) FHL-1 – factor H-like-1 (Н-подобный фактор) FITC – fluorescein isothiocyanate (флуоресцеин изотиоцианат) FSC – forward light scatter (прямое светорассеяние) fMLP – N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланин GAS – group A streptococci (стрептококки группы А) GAPDH - глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназа GM-CSF – granulocyte-macrophage colonystimulating factor (гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор) GPCR – G-protein coupled receptors (рецепторы, сопряженные с G-белками) HUVEC – human umbilical vein endothelial cells (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) ICAM – Intercellular Adhesion Molecule (молекула межклеточной адгезии) IFN – interferon (интерферон) Ig – immunoglobulin (иммуноглобулин) IL – interleukine (интерлейкин) JAK – Janus kinase (янус киназы) JAM – junctional adhesion molecules (молекулы межклеточных контактов) LFA – lymphocyte function-related antigen (антиген, связанный с функцией лимфоцитов) LPS – lipopolysaccharide (липополисахарид) LTA – lipoteichoic acid (липотейхоевая кислота) MAPK – mitogen-activated protein kinase (митоген-активируемая протеинкиназа) MCP – monocyte chemotactic protein (хемотаксический белок моноцитов) –6– MFI – mean fluorescence intensity (среднее значение интенсивности флуоресценции) MHC – major histocompatibility complex (главный комплекс гистосовместимости) MIF – migration inhibitory factor (фактор, ингибирующий миграцию) MIPs – macrophage inflammatory protein (воспалительный белок макрофагов) MLCK – miosine light chain kinase (киназа легкой цепи миозина) MMP – matrix metalloproteinase (металлопротеиназа матрикса) MR – mannose receptor (маннозный рецептор) NFκB – nuclear factor κB (транскрипционный фактор κB) NK – natural killer (естественные киллеры) NLR – NOD-like receptors (NOD-подобные рецепторы) РЕ – phykoeritrine (фикоэритрин) PECAM-1 – Platelet-endothelial cell adhesion molecule-1 (молекула адгезии тромбоцитэндотелиальных клеток) PGN – peptidoglycan (пептидогликан) РМА - форбол-12-миристат-13-ацетат PRR – pattern recognition receptor (паттерн-распознающий рецептор) PSGL-1 – P-selectin glycoprotein ligand-1 (гликопротеиновый лиганд Р-селектина) RANTES – regulated on activation normal T-cell expressed and secreted (регулятор активации процессов экспрессии и секреции нормальных Т-лимфоцитов) RCA – regulators of complement activation (регуляторы активации комплемента) SCP – streptococcal cysteine protease (цистеиновая протеаза стрептококков) SDH – streptococcal surface dehydrogenase (поверхностная дегидрогеназа стрептококка) SR – scavenger receptor (скавенжер рецептор) SSC – side light scatter (боковое светорасеяние) STAT – signal transducer and activator of transcription (сигнальный белок, активатор транскрипции) TCR – T-cell receptor (Т-клеточный рецептор) TF – tissue factor (тканевой фактор) TGFβ – transforming growing factor β (трансформирующий ростовой фактор) TLR – toll-like receptor (толл-подобные рецепторы) TNF – tumor necrosis factor (фактор некроза опухоли) VCAM-1 – vascular cell adhesion molecule (молекула адгезии сосудистого эндотелия) VE-cadherin – vascular endothelial cadherin (кадгерин сосудистого эндотелия) VLA – very late antigen (очень поздний антиген) –7– ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Система мононуклеарных фагоцитов включает происходящие из единой стволовой клетки костномозговые предшественники – монобласты и промоноциты, циркулирующие в крови моноциты и тканевые макрофаги, имеющие сходную морфологию, цитохимические и функциональные характеристики (Фрейдлин И. С., 1984; van Furth et al., 1972). Мононуклеарные фагоциты обеспечивают защиту организма за счет своей фагоцитарной функции. Секретируемые макрофагами молекулы выполняют регуляторные функции и обеспечивают привлечение и активацию не только самих макрофагов, но и других защитных клеток (Тотолян и Фрейдлин, 2000). Для осуществления своих функций моноциты должны мигрировать из кровяного русла в очаг инфекции, минуя эндотелиальный барьер. Процесс мобилизации лейкоцитов в ткани состоит из этапов роллинга лейкоцитов по люминальной поверхности эндотелия, прочной адгезии к поверхности эндотелия и трансэндотелиальной миграции. На всех этих этапах основную роль играет взаимодействие моноцитов с эндотелиальными клетками выстилки сосудов (Cook-mills J.M., 2005, Guo et al., 2009, Imhof and Aurrand-Lions, 2004, Johnson-Leger et al., 2000, Muller and Randolf, 1999, Herter and Zabrock, 2013, Фрейдлин И.С., 2006). При стрептококковых инфекциях мононуклеарные фагоциты первыми распознают консервативные структуры бактерий. Это приводит к активации защитных механизмов, в результате чего происходит фагоцитоз и разрушение бактерий. В крови накапливаются продукты, секретируемые живыми бактериальными клетками, а также продукты их деградации. Клетки крови и эндотелия сосудов становятся мишенями для этих факторов (Cook-mills and Deem, 2005, Kaur et al., 2010, Miettinen et al., 2008, Molinari and Chatwal, 1999, Pahlman et al., 2007). Одной из актуальных проблем иммунологии и клеточной биологии является конкретизация изменений свойств моноцитов и эндотелиальных клеток при их взаимодействии в условиях инфекции. В настоящее время достаточно хорошо изучено взаимодействие живых бактериальных клеток с мононуклеарными фагоцитами и эндотелиальными клетками (Nobbs et al., 2009, Pahlman et al., 2006, Pahlman et al., 2007, Nerlich et al., 2009, Sun et al., 2006, Cleveland et al., 1996). Менее изученным остается влияние продуктов деградации стрептококков на функции моноцитов крови и процессы их мобилизации из кровяного русла. –8– Полученные результаты позволят конкретизировать механизмы действия продуктов разрушения S. pyogenes на свойства и функции мононуклеарных фагоцитов, определяющие их способность к миграции из кровяного русла в очаг инфекции. В условиях эксперимента моделировали разрушение стрептококков ультразвуковой дезинтеграцией с последующим центрифугированием и стерилизующей фильтрацией, в результате чего получали супернатант, содержащий продукты разрушения стрептококков (СРС). Цель работы. Изучение влияния продуктов разрушения пиогенных стрептококков на функции мононуклеарных фагоцитов крови человека, определяющие их мобилизацию из кровяного русла в очаг инфекции in vitro. Решались следующие задачи: 1. Изучить характер влияния супернатанта разрушенных стрептококков на адгезионную и миграционную активности моноцитов крови человека и клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, а также на их миграцию через монослой эндотелиальных клеток in vitro; 2. Провести анализ механизмов влияния супернатанта разрушенных стрептококков на функции моноцитов крови человека и клеток ТНР-1, определяющие их способность к трансэндотелиальной миграции; 3. Оценить влияние супернатанта разрушенных стрептококков на экспрессию клетками фосфокиназ; 4. Оценить влияние супернатанта разрушенных стрептококков на экспрессию клетками адгезионных молекул; 5. Оценить влияние супернатанта разрушенных стрептококков на продукцию мононуклеарными лейкоцитами провоспалительных цитокинов. Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование влияния продуктов разрушения стрептококков на свойства и функции моноцитов, от которых зависит эффективность мобилизации клеток из кровяного русла в очаг инфекции. Показано, что влияние продуктов разрушения пиогенных стрептококков на свойства и функции моноцитов крови человека и клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, определяющие их трансэндотелиальную миграцию in vitro, не связано с изменением свойств –9– эндотелиальных клеток, изменением экспрессии на них адгезионных молекул и активацией NFkB, а обусловлено изменением свойств самих мигрирующих клеток и активацией на них рецепторов, сопряженных с G-белками. Впервые выявлено разнонаправленное действие продуктов разрушения стрептококков на миграционную активность моноцитов крови человека, зависящее от концентрации супернатанта. Также выявлены индивидуальные особенности ответа моноцитов крови отдельных доноров на влияние продуктов разрушения стрептококков. Впервые проведено сравнительное изучение влияния продуктов разрушения стрептококков на свойства моноцитов крови человека и клеток моноцитоподобной линии THP-1, которое позволило выявить разную чувствительность этих клеток к влиянию продуктов разрушения стрептококков. Теоретическая и практическая значимость результатов работы. В результате проведенных исследований были получены новые данные о механизмах влияния продуктов разрушения S. pyogenes на свойства моноцитов крови человека и их трансэндотелиальную миграцию in vitro. Показано, что под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков происходит активация моноцитов крови, проявляющаяся усилением их адгезионной и миграционной активности. Результаты работы способствуют углублению представлений о механизмах влияния продуктов разрушения S. pyogenes на взаимодействие мононуклеарных фагоцитов крови человека с клетками эндотелия сосудов человека, а, следовательно, важны для развития представления о воспалительных процессах при стрептококковых инфекциях. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Продукты разрушения Streptococcus pyogenes серологической группы А (тип М22, штамм AL168) усиливают адгезионную и миграционную активности клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, а также их миграцию через монослой эндотелиальных клеток человека in vitro. 2. Продукты разрушения S. pyogenes усиливают адгезию моноцитов крови человека к эндотелиальным клеткам, но оказывают разнонаправленное действие на миграционную активность этих клеток, зависящее от концентрации супернатанта. 3. Эффект супернатанта разрушенных S. pyogenes на трансэндотелиальную миграцию моноцитов крови и клеток ТНР-1 связан с изменением свойств мигрирующих клеток и активацией на них рецепторов, связанных с G-белками. – 10 – Личный вклад автора. Планирование работы, получение большей части экспериментальных результатов, их статистическая обработка и подготовка материала к публикациям выполнены соискателем. Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность применяемых результатов методов, обеспечена разнообразием соответствующих цели и и адекватностью задачам исследования, воспроизводимостью результатов, корректной обработкой результатов на основе методов статистического анализа. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 4 статьи, опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Материалы конференции диссертационной молодых ученых работы представлены «Проблемы на биомедицинской Всероссийской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010), на Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (СанктПетербург, 2010), на XIV Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в СанктПетербурге» (Санкт-Петербург, 2011), на XI Международном Конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011), на Всероссийской конференции по онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2011), на 16й Международной школе-конференции Молодых Ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2012), на II Всероссийской научной конференции молодых ученых "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия" (Санкт-Петербург, 2012), на V международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (СанктПетербург, 2013), на Обществе патофизиологии ФГБУ «НИИЭМ» международном симпозиуме, Иммунологов СЗО РАМН посвященном в отделе Общей (Санкт-Петербург, стрептококкам и патологии 2013), на и XIX стрептококковым заболеваниям (Аргентина, Буэнос Айрес, 2014). Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и включает 25 таблиц и 28 рисунков; состоит из введения, списка используемых сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (162 источника, из которых 148 на иностранных языках). – 11 – ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Взаимодействие моноцитов крови с эндотелиальными клетками сосудов В ходе развития воспалительного процесса или внедрения инфекционных агентов циркулирующие в крови лейкоциты мобилизируются в очаги поражения. Этот процесс является ключевым в системе защиты организма. Процесс мобилизации лейкоцитов в ткани состоит из этапов роллинга, прочной адгезии к поверхности эндотелия, миграции через монослой эндотелиальных клеток и базальную мембрану и хемотаксиса. В основе взаимодействия моноцитов с эндотелиальными клетками лежат межклеточные контакты, опосредованные рецепторами и их лигандами при участии секреторных продуктов активированных клеток. 1.1.1. Морфологические характеристики взаимодействующих клеток Моноциты относятся к системе мононуклеарных фагоцитов и происходят из промоноцитов костного мозга. В норме в крови взрослого человека количество моноцитов составляет 1-10% от общего числа лейкоцитов (Луговская С.А., 1997). Моноциты – самые крупные из лейкоцитов, их размер колеблется от 14 до 20 мкм. Ядро занимает большую или равную с цитоплазмой часть клетки и имеет неправильную бобовидную или подковообразную форму. Хроматин ядер рыхлый, распределен равномерно, образуя ячейки разной величины и формы (Луговская С.А., 1997). При стандартной гематологической окраске по Романовскому-Гимзе ядро окрашивается в красновато-фиолетовый цвет — более светлый, чем у нейтрофилов и лимфоцитов. Цитоплазма моноцитов слабо базофильна, окрашивается в бледно-голубой цвет (по периферии более темный, чем около ядра) и часто содержит в большом количестве мелкие азурофильные гранулы (лизосомы). В цитопламзе макрофагов выявляются лизосомы, фаголизосомы, пиноцитозные везикулы, эндоплазматический ретикулум, хорошо развитый комплекс Гольджи, множество митохондрий и незначительное количество полисом. Мембрана моноцитов неровная, с множеством псевдоподий (van Furth et al., 1972). – 12 – Моноциты крови представляют собой подвижный пул относительно незрелых клеток, находящихся на пути из костного мозга в ткани. Внесосудистый пул моноцитов в 25 раз превышает циркулирующий (Луговская С.А., 1997). Время пребывания моноцитов в периферической крови – от 1,5 суток до 4 дней. После чего моноциты мигрируют в ткани и под влиянием микроокружения дифференцируются в макрофаги. В тканях, под влиянием цитокинов, гормонов или факторов экзогенного происхождения макрофаги могут значительно изменять свое функциональное состояние (Зенков и др., 2007). Возникновение очага воспаления в любой ткани приводит к активации тканевых макрофагов с изменением их фенотипа. Морфологические и метаболические характеристики макрофагов зависят от того, в каких органах они локализуются. При любой локализации макрофаги выполняют определенные физиологические функции. Дифференцировка моноцита в макрофаг сопровождается увеличением размеров, возрастанием числа неровностей на наружной мембране клетки, увеличением количества лизосом и митохондрий (van Furth et al., 1972). Повышается активность многих ферментов, теряется активность миелопероксидазы, формируются рецепторы к иммуноглобулинам (Луговская С.А., 1997, Тотолян и Фрейдлин, 2000). Продолжительность жизни макрофагов в тканях составляет более 30 дней. Площадь поверхности кровеносных сосудов взрослого человека составляет ~ 4000 м2, а общий вес эндотелиальных клеток 1,5-2 кг (Danese et al., 2007, Гомазков О.А., 2000). Эндотелий образует внутреннюю выстилку кровеносных, лимфатических сосудов и полостей сердца. Это непрерывный однослойный пласт клеток мезенхимного происхождения, связанных различными типами адгезионных структур (Johnson-Leger et al., 2000) и щелевыми соединениями (Шубич и др., 2005). Для клеток эндотелия характерна полярность. Форма эндотелиальных клеток может быть различной. Хотя обычно это полигональные уплощенные клетки, в посткапиллярных венулах они имеют кубическую форму. Толщина эндотелиоцитов варьируется от 0,1 µм в капиллярах и венах до 1 µм в аорте (Aird C.A., 2007). Эндотелиальное дерево не однородно по своей архитектуре. Эндотелиальные клетки различных сосудов существенно различаются по генной и биохимической специфичности, типам рецепторов, наборам белков-предшественников, ферментов, трансмиттеров (Гомазков О.А., 2000). Форма ядер эндотелиоцитов овальная или лопастная, с многочисленными инвагинациями кариолеммы. В большинстве клеток ядро сравнительно светлое – 13 – (преобладает эухроматин), содержит хорошо заметное крупное ядрышко. В цитоплазме сконцентрированы элементы гранулярной эндоплазматической сети, митохондрии со светлым матриксом и малым числом крист, первичные лизосомы. Некоторые эндотелиоциты содержат осмиофильные гетерогенные структуры - специфические тельца Weibel-Palade. В большинстве эндотелиоцитов встречаются прикрепленные микропиноцитозные везикулы, клатрин-окантованные везикулы, мультивезикулярные тельца, лизосомы, фенестры и поры, обеспечивающие транспорт веществ 2007). Для эндотелиоцитов характерна диплазматическая (Aird C.A., дифференцировка цитоплазмы. Она разделяется на эндоплазму, располагающуюся вокруг ядра и содержащую большую часть органелл и эктоплазму, относительно свободную от органелл (Быков В.Л., 1999). Цитоскелет эндотелиоцитов хорошо развит и представлен микротрубочками, микрофиламентами и виментиновыми промежуточными филаментами. Выделяют апикальную, латеральную и базальную поверхности эндотелиоцитов. Базальная поверхность эндотелиоцитов прилежит к базальной мембране. На апикальной поверхности эндотелиальных клеток экспрессируются молекулы, участвующие в процессах роллинга и адгезии лейкоцитов. 1.1.2. Этапы мобилизации моноцитов из кровяного русла в очаг инфекции Процесс мобилизации лейкоцитов в ткани состоит из этапов роллинга лейкоцитов по люминальной поверхности эндотелия, прочной адгезии к поверхности эндотелия и трансэндотелиальной миграции или диапедеза, миграции через базальную мембрану и хемотаксиса. Длительность всего процесса миграции лейкоцитов от этапа роллинга до этапа диапедеза in vivo составляет 15-45 минут, in vitro этот процесс занимает 2 минуты (Parish C.R., 2006). Все стадии адгезии и трансмиграции зависят от активации эндотелиальных клеток и лейкоцитов, от усиления экспрессии на них адгезионных молекул. Для каждого этапа миграции клеток характерно участие определенных молекул адгезии и хемотаксических агентов. Адгезия необходима для осуществления большинства функций моноцитов и макрофагов: миграции (хемотаксиса), мобилизации в ткани и продукции медиаторов воспаления, фагоцитоза, цитотоксичности, а также презентации антигена. Медиаторы – 14 – воспаления активируют эндотелиальные клетки сосудов, на поверхности которых экспрессируются адгезионные молекулы. Активированные эндотелиальные клетки секретируют хемокины, которые привлекают циркулирующие лейкоциты и способствуют их адгезии к поверхности эндотелия с последующей миграцией. Циркулирующие лейкоциты обычно вступают лишь в мимолетные контакты с эндотелиальными клетками: они как бы «скользят» (роллинг) по люминальной поверхности эндотелия стенки сосудов. Эти контакты опосредованы главным образом связыванием селектинов с соответствующими лигандами. Селектины — трансмембранные белки, обладающие сродством к концевым остаткам маннозы и фукозы. В настоящее время к селектинам относят три гликопротеина: Р (от Platelet — тромбоцитарный), Е (от Endothelial — эндотелиальный) и L (от Lymphocyte — лимфоцитарный). В состав этих гликопротеинов входит 3 домена: наружный (лектиновый), промежуточный (подобный эпидермальному фактору роста), и несколько коротких консенсусных повторов, прилегающих к мембране (домены контроля комплемента). Число повторов варьируется у разных видов селектинов (Petri et al., 2008). Цитоплазматический участок селектинов связан с молекулами кальмодулина и актина (Fernandez-Borja et al., 2010). Для связывания селектинов с лигандами необходимо присутствие ионов Са2+ (Kerr, 1999). Молекулы Р-селектина преформированы в секреторных гранулах эндотелиальных клеток (тельцах Weibel-Palade) и тромбоцитов (α-гранулах). После активации эндотелиальных клеток провоспалительными медиаторами (тромбин, лейкотриены, оксиданты, гистамин) молекулы Р-селектина экспрессируются на поверхности клетки и могут быть смыты с нее во внеклеточную среду. Кроме активации тромбоцитов, Рселектин участвует в ранних этапах миграции лейкоцитов в очаг воспаления (Petri et al., 2008). Е-селектин — основной селектин клеток эндотелия сосудов. Е-селектин конститутивно не экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток in vivo и in vitro (Meager A., 1999; Petri et al., 2008; Ley et al., 2007). Его экспрессию могут индуцировать провоспалительные цитокины или бактериальные компоненты. Пик экспрессии Eселектинов наступает через 2 часа после стимуляции (Meager A., 1999). Е-селектин играет основную роль в ранних этапах миграции лейкоцитов из сосудистого русла. L-селектин конститутивно экспрессируется на поверхности нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов и обеспечивает осуществление роллинга этих клеток. Селектины распознают маннозные и фукозные концевые остатки, входящие в состав – 15 – полисахаридов и гликоконъюгатов. Основные лиганды L-селектина: молекула CD34, подокаликсин, эндогликан и GlyCAM-1 на эндотелиальных клетках. Молекулы CD34 и подогликана присутствуют в неактивной форме на любых эндотелиоцитах. После активации клеток эти молекулы приобретают способность связываться с L-селектином. Молекула GlyCAM-1 существует в растворимой форме и в форме трансмембранного белка. L-селектин формирует слабую связь с адрессинами, к тому же его молекула легко смывается с поверхности клеток. Поэтому опосредованный L-селектином контакт между лейкоцитом и эндотелиальной клеткой неустойчив. Это проявляется в перекатывании лейкоцитов вдоль сосудистой стенки. Только после экспрессии Е- и Р-селектинов на поверхности эндотелиальных клеток адгезионные силы становятся достаточно сильными, чтобы «задержать» циркулирующие в кровотоке клетки. При недостатке Рселектина роллинг лейкоцитов полностью прекращается, в то время как нехватка Lселектина не нарушает начавшийся роллинг лейкоцитов, хотя и значительно снижает его. Недостаток Е-селектина не влияет на роллинг лейкоцитов (Meager A., 1999). Лигандами к Р- и Е-селектинам являются, муцины, содержащие sLex (CD66, CD24 и др.) и некоторые интегрины (например, α4β7) (Meager A., 1999; Petri et al., 2008). Еселектин также связывается с CD44 и ESL-1 (лиганд Е-селектина) (Ley et al., 2007). Лигандом для всех трех селектинов является молекула PSGL-1 (гликопротеиновый лиганд Р-селектина, CD162) (Ley et al., 2007). PSGL-1 экспрессируется на нейтрофилах, моноцитах, большинстве лимфоцитов. PSGL-1 имеет довольно протяженный цитоплазматический участок, связанный с тирозинкиназой Syk, что определяет способность этой молекулы передавать в клетку активационный сигнал. При активации моноцитов PSGL-1 слущивается с поверхности лейкоцитов (Davenpeck et al. 2000). Связывание Е- и Р-селектинов с соответствующими лигандами инициирует повышение концентраций ионов Са2+ в цитоплазме эндотелиальных клеток (van Buul and Hordijk, 2004; Muller W.A., 2003). Роллинг лейкоцитов также может быть опосредован связыванием β2- и α4β1интегринов лейкоцитов с молекулами VCAM (молекула адгезии сосудистого эндотелия)-1 на эндотелии (Cook-Mills and Deem, 2005; Ley et al., 2007; Petri et al., 2008). Селектиновые связи не могут прочно закрепить клетку, циркулирующую в кровотоке. Однако такие связи приводят к промежуточной активации интегринов на поверхности перекатывающихся лейкоцитов, в результате чего снижается скорость роллинга (Herter and Zarbock, 2013; Parish C.R., 2006). Замедленный роллинг лейкоцитов по поверхности эндотелия делает возможным связывание других адгезионных молекул – 16 – на поверхности клеток. Прочная адгезия является результатом взаимодействия β2-интегринов и α4β1интегринов на поверхности лейкоцитов с соответствующими молекулами межклеточной адгезии ICAM (Intercellular Adhesion Molecule)-1, 2 и VCAM-1 на поверхности эндотелия (Herter and Zarbock, 2013; Guo et al., 2009; Weber et al. 1999). При этом показано, что αvβ3интегрины могут регулировать β2-интегрин-зависимую адгезию лейкоцитов и их последующую миграцию (Weerasinghe et al. 1998). Интегрины — полифункциональные молекулы адгезии. Они опосредуют сигналы, связывающие внутриклеточную среду с внеклеточной. Интегрины состоят из двух нековалентно связанных трансмембранных гликопротеинов (α и β). Гликопротеины имеют протяженный внеклеточный домен, трансмембранный домен и короткий цитоплазматический участок. Цитоплазматическая часть интегринов связана с компонентами цитоскелета (талин-1, киндлин-3), что и определяет многие функции этих молекул (Ley et al., 2007; Herter and Zarbock, 2013). В настоящее время идентифицировано 24 варианта интегринов, представляющих собой комбинации из 18 вариантов α- и 8 вариантов β-цепей (Herter and Zarbock, 2013). Интегрины экспрессируются на поверхности различных типов клеток, в том числе на эпителиальных и нервных, но особенно важную роль интегрины и их лиганды играют в функционировании клеток мезенхимального происхождения: лейкоцитов, тромбоцитов, стромальных клеток и клеток сосудистого эндотелия. Наибольший интерес представляют интегрины β1 и β2 семейств, опосредующие участие лейкоцитов в иммунных процессах: адгезии лейкоцитов к эндотелию сосудов и их миграции из кровотока в очаг воспаления, взаимодействии с клетками-мишенями и т.д. (Meager A., 1999; Kerr J.R., 1999; Herter and Zarbock, 2013). β1-Интегрины (молекулы группы VLA) взаимодействуют с компонентами межклеточного матрикса (фибронектином, ламинином, коллагеном, фибриногеном). Из 11 вариантов β1-интегринов широко представлено 6 (VLA-1 —VLA-6), из них все, кроме VLA-3 характерны для лейкоцитов (Ярилин А.А., 2010). Важную роль в физиологии моноцитов/макрофагов играет интегрин VLA-4 (α4β1). β2-Интегрины экспрессируются на поверхности лейкоцитов. На поверхности моноцитов представлены интегрины LFA (антиген, ассоциированный с функцией лимфоцитов)-1 (αLβ2), Mac-1 (αМβ2) и р150/р95 (αХβ2). Молекулы Мас-1 и р150/р95 служат рецепторами для компонентов комплемента (iС3b) и компонентов внеклеточного матрикса (фибронектин, фактор Х, коллаген, фибриноген, кининоген, гепарин) (Meager A., – 17 – 1999). Показано, что LFA-1 играет доминирующую роль в адгезии и трансмиграции лейкоцитов (Meager A., 1999). Для активации β2-интегринов на моноцитах необходим белок киндлин-3 (Herter and Zarbock, 2013). Интегрины существуют в клетке в неактивной и активной формах. Для LFA-1 показана третья промежуточная форма активации (Herter and Zarbock, 2013). Покоящиеся клетки характеризуются низкой связывающей способностью интегринов. В результате взаимодействия интегринов со своими рецепторами на поверхности эндотелиальных клеток формируется кластер из нескольких интегриновых молекул и генерируется сигнал, направленный во внутриклеточное пространство (Meager A., 1999). Через цитоплазматический домен сигнал достигает белка талина-1 или киндлина-3, которые связаны с актиновым цитоскелетом (Herter and Zarbock, 2013). В результате происходит реорганизация цитоскелета, что приводит к индукции сигнала, направленного изнутри наружу, повышающего сродство рецептора к лиганду. Молекулы интегрина при этом подвергаются конформации. Для конформационных изменений α и β субъединиц интегрина необходимы двухвалентные ионы металлов (главным образом – Са2+, Mg2+ и Mn2+) (Meager A., 1999; Herter and Zarbock, 2013). Лиганды интегринов – молекулы ICAM и VCAM – относятся к суперсемейству иммуноглобулинов. Лигандом β1-интегринов является молекула VCAM-1 (CD106). VCAM-1 экспрессируется активированными клетками эндотелия (Meager A., 1999; Ley et al., 2007; Cook-Mills and Deem, 2005). Связывание VCAM-1 с лигандами повышает концентрацию ионов Са2+ в цитоплазме эндотелиальных клеток (Muller W.A., 2003). Лигандами β2интегринов являются мембранные молекулы ICAM — ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102) (Fernandez-Borja et al., 2010; Weber et al. 1999; Imhof and Aurrand-Lions 2004). Молекулы ICAM-1 представлены на мембране клетки в форме димера. Только ICAM-2 конститутивно экспрессируется на эндотелиальных клетках, экспрессия ICAM-1 индуцируется под влиянием цитокинов или других провоспалительных факторов (Meager A., 1999; Weber et al. 1999; Imhof and Aurrand-Lions 2004). С-терминальный домен ICAM-1 напрямую связывается с α-актинином, β-тубулином и глицеральдегид-3-фосфатом, ICAM-1 также связан с белком цитоскелета эзрином посредством связывания с фосфатидилинозитол-4,5-бифосфатом. Сигналы от ICAM-1 и VCAM-1 вызывают перестройки актинового цитоскелета (Cook-Mills and Deem, 2005; Fernandez-Borja et al., 2010). Некоторые из ICAM-1-опосредованных сигналов, которые регулируют цитоскелет эндотелиальных клеток, могут быть важны для миграции лейкоцитов или регуляции фокальной адгезии (Cook-Mills and Deem, 2005). – 18 – Под влиянием хемоаттрактантов, действующих через рецепторы, сопряженные с Gбелками (G-protein coupled receptors, GPCR), происходит активация интегринов и изменение их конформации. В результате происходит их связывание с ICAM-1,2 и VCAM-1 (Nourshargh and Marelli-Berg, 2005; Herter and Zarbock, 2013; Martins-Green et al., 2013). Фракталкин (СХ3СL1) – молекула, опосредующая как интегрин-зависимую, так и интегрин-независимую адгезию лейкоцитов к эндотелию (Goda et al. 2000). Фракталкин экспрессируется на активированных эндотелиальных клетках. Связывание фракталкина с его рецептором на лейкоцитах обеспечивает адгезию этих клеток к эндотелию. Растворимый s-фракталкин проявляет хемоаттрактные свойства и опосредует прочную адгезию клеток, повышая авидность β1- и β2-интегринов на поверхности лейкоцитов (Goda et al. 2000). После активации интегринов и поляризации клетки, лейкоциты передвигаются вдоль люминальной поверхности сосудистого эндотелия и затем мигрируют, главным образом проходя между смежными эндотелиальными клетками (парацеллюлярный тип миграции, paracellular). Было показано, что лейкоциты мигрируют главным образом в местах соединения трех эндотелиальных клеток (Sumagin et al., 2010). Однако есть данные о том, что лейкоциты могут также проходить через тело эндотелиальной клетки (трансцеллюлярный тип миграции, transcellular) (Imhof and Aurrand-Lions 2004; Nourshargh and Marelli-Berg, 2005; Ley et al., 2007; Mamdouh et al., 2009). Связывание Е-, Р-селектинов, ICAM-1 и VCAM-1 на эндотелиальных клетках с соответствующими лигандами вызывает повышение концентрации внутриклеточного Са2+ (Fernandez-Borja et al., 2010; Muller W.A., 2003). Повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме эндотелиальных клеток приводит к активации киназы легкой цепи миозина (MLCK), это вызывает сокращение молекул миозина II и ретракцию эндотелиальных клеток. Благодаря этим процессам контакты между соседними клетками ослабевают и повышается проницаемость монослоя эндотелиальных клеток, что облегчает миграцию лейкоцитов в субэндотелиальное пространство (Muller W.A., 2003; van Buul and Hordijk, 2004). В процессе трансэндотелиальной миграции важную роль играют молекулы, локализованые в участках контактов эндотелиальных клеток друг с другом. Взаимодействие эндотелиальных клеток друг с другом опосредовано главным образом двумя типами межклеточных контактов – адгезионными и плотными (tight junctions) контактами. В образовании плотных контактов участвуют белки окклюдины, клаудины, – 19 – белки семейства JAM (молекулы адгезионных контактов). Внутри клетки эти молекулы связаны с актином через скаффолд-белки ZO-1 и ZO-2 (Weber et al., 2007; Fernandez-Borja et al., 2010; Imhof and Aurrand-Lions 2004). В процессе трансэндотелиальной миграции участвуют JAM (Fernandez-Borja et al., 2010). JAM – белки иммуноглобулинового суперсемейства. JAM-А и JAM-С экспрессируются и на моноцитах крови, и на эндотелиальных клетках, в то время как JAM-В – только на эндотелиальных клетках. Для JAM свойственны как гомофильные, так и гетерофильные взаимодействия, в том числе JAM могут связываться с α4β1- и β2-интегринами (Imhof and Aurrand-Lions 2004; Weber et al., 2007; Fernandez-Borja et al., 2010). Под влиянием TNFα и IFNγ происходит перераспределение JAM из мест контактов клеток друг с другом на люминальную поверхность, при этом общий уровень экспресии JAM не меняется (JohnsonLéger et al., 2000; Bardin et al., 2009). Основной компонент адгезионных межклеточных контактов VE (vascular endothelial)-кадгерин. VE-кадгерин это трансмембранный белок, который образует гомотипические Са2+-зависимые взаимодействия со своим внеклеточным доменом. VEкадгерин связан с актиновым цитоскелетом через белки катенины и участвует в регуляции проницаемости сосудов и трансэндотелиальной миграции лейкоцитов in vivo и in vitro (Muller W.A., 2003; Fernandez-Borja et al., 2010; Imhof and Aurrand-Lions 2004). Комплексы, образуемые молекулами VE-кадгеринов, проталкиваются по латеральной поверхности эндотелиальных клеток мигрирующими лейкоцитами. После окончания миграции комплексы восстанавливаются в течение нескольких минут (Muller W.A., 2003). Миграция по трансцеллюлярному пути протекает без участия VE-кадгериновых комплексов (Mamdouh et al., 2009). PECAM-1 (адгезионная молекула тромбоцитов/эндотелиальных клеток; CD31) и CD99 так же экспрессируются на латеральной поверхности клеток эндотелия, в местах контактов эндотелиальных клеток друг с другом, но не участвуют в образовании прочных или адгезионных контактов (Johnson-Léger et al., 2000; Muller W.A., 2003; Fernandez-Borja et al., 2010). Молекулы РЕСАМ-1 гомологичны молекулам ICAM и VCAM — все они обладают адгезионными свойствами (Muller and Randolph, 1999). РЕСАМ-1 конститутивно экспрессируются на поверхности эндотелиальных клеток и лейкоцитов (Muller and Randolph, 1999; Muller W.A., 2003). Молекулы РЕСАМ-1 способны опосредовать гомофильную адгезию (связываются молекулы РЕСАМ-1 на разных клетках одного типа) или гетерофильную адгезию (связываются РЕСАМ-1, экспрессирующиеся на клетках – 20 – разных типов) (Muller and Randolph, 1999). CD31 активно рекрутируется по поверхности эндотелия в сайты миграции лейкоцитов. РЕСАМ-1 связаны с белками цитоскелета β- и γ-катенинами (Cook-Mills and Deem, 2005). Каскад сигналов от CD31 на лейкоцитах приводит к повышению адгезионной активности β2- (Muller and Randolph, 1999), α6β1- и α1β1-интегринов (CookMills and Deem, 2005; Nourshargh and Marelli-Berg, 2005). На эндотелиальных клетках связывание молекул РЕСАМ-1 активирует αVβ3-интегрины (Cook-Mills and Deem, 2005). Участие РЕСАМ-1 в межклеточных контактах эндотелиальных клеток играет важную роль в процессе трансэндотелиальной миграции лейкоцитов. Блокирование CD31 моноклональными антителами приводит к «задержке» лейкоцитов на апикальной поверхности эндотелиальной клетки (Muller W.A., 2003). Не во всех случаях миграция лейкоцитов опосредована РЕСАМ-1, однако молекулы, отвечающие за РЕСАМ-1независимую трансмиграцию, остаются неизвестными (Muller W.A., 2003; Cook-Mills and Deem, 2005). Молекула РЕСАМ-1 необходима так же на ранних этапах диапедеза (Muller W.A., 2003; van Buul and Hordijk, 2004). Блокирование РЕСАМ-1 ингибирует миграцию моноцитов до того, как начнется диапедез. Локализация молекул CD31 на эндотелиальных клетках регулируется цитокинами. Активация эндотелиальных клеток TNFα+IFN-γ или TNFα приводит к перераспределеню молекул РЕСАМ-1 (Cook-Mills and Deem, 2005) и CD99 (Bardin et al., 2009). РЕСАМ-1 и JAM связаны с системой кадгеринов через белки цитоскелета (катенины). В результате сигналинга от этих адгезионных молекул ослабевают контакты между VE-кадгеринами и повышается проницаемость сосудов (Ley et al., 2007). Подобно РЕСАМ-1, молекулы CD99 экспрессируются в участках контактов эндотелиальных клеток друг с другом (Imhof and Aurrand-Lions 2004) и обеспечивают миграцию лейкоцитов благодаря гомофильным взаимодействиям этих молекул на моноцитах и клетках эндотелия (Muller and Randolph, 1999; Cook-Mills and Deem, 2005). Молекулы CD99 контролируют более поздние этапы трансэндотелиальной миграции. Блокирующие антитела эндотелиальными против клетками: CD99 лидирующий «задерживают» конец лейкоцита лейкоциты между задерживается на латеральной поверхности эндотелиальных клеток, а хвостовой – остается на апикальной поверхности (Muller W.A., 2003; Cook-Mills and Deem, 2005). Т.о., CD99 контролирует стадию диапедеза, отличную от той, которую контролирует PECAM-1. Блокирующие антитела против CD99 и PECAM-1 оказывают аддитивный эффект, полностью останавливая диапедез (Muller W.A., 2003). – 21 – Для миграции лейкоцитов так же необходимо присутствие молекул ICAM-1 в участках миграции (Sumagin et al., 2010). После прохождения монослоя эндотелиальных клеток, лейкоцитам необходимо мигрировать через базальную мембрану. Периваскулярная базальная мембрана состоит из перицитов, связанных с комплексом белков внеклеточного матрикса. Взаимодействие мигрирующих моноцитов с компонентами внеклеточного матрикса опосредовано главным образом интегринами (Nourshargh and Marelli-Berg, 2005) и молекулами РЕСАМ-1 (Muller and Randolph, 1999) на лейкоцитах. В процессе трансэндотелиальной миграции лейкоцитов важную роль играют матриксные металлопротеиназы (ММР). Это группа цинк-зависимых протеаз, разрушающих компоненты внеклеточного матрикса, хемокины (Coito A.J., 2011; MartinsGreen et al., 2013; Yuan et al. 2013), регулирующих шеддинг гликопротеинов с поверхности эндотелиальных клеток (Lipowsky H.H., 2012). Ассоциированные с эндотелием ММР-2 и ММР-9 так же расщепляют VE-кадгерины, JAM, экспрессирующиеся в участках контактов клеток друг с другом (Cook-Mills and Deem, 2005; Deem and Cook-mills 2009). Связывание молекул ICAM-1 с β2-интегринами индуцирует секрецию хемокинов эндотелиальными клетками. Благодаря градиенту хемокинов, образующемуся на поверхности эндотелия, лейкоциты начинают процесс хемотаксиса (Cook-Mills and Deem, 2005). Движение клеток в отсутствие градиента концентрации хемоаттрактантов носит беспорядочный характер и называется спонтанной миграцией. Хемотаксис – это направленное движение клеток, определяемое градиентом химических факторов, хемотаксинов, или хемоаттрактантов. Функцию хемоаттрактантов могут выполнять компоненты и продукты микроорганизмов (fMLP, LPS, LTA), продукты деструкции тканей, продукты, выделяемые активированными клетками в очаге воспаления (цитокины, хемокины, гистамин, лейкотриен В4), продукты расщепления компонентов комплемента, протеолитические фрагменты факторов свертывания крови и фибринолиза, фрагменты иммуноглобулинов, С-реактивный белок, сАМР (Ярилин А.А., 2010, Wong et al., 2009; Liu et al. 2013). Процесс хемотаксиса чувствителен даже к очень небольшому изменению концентрации хемоаттрактанта в среде. Сигналинг от хемоаттрактантов обеспечивается активацией GPCR (Nourshargh and Marelli-Berg, 2005; Ley et al., 2007; Martins-Green et al., 2013; Liu et al. 2013). В основе направленного движения фагоцитов лежит реакция контрактильных – 22 – белков цитоскелета, прежде всего актина и миозина (Wong et al., 2009). В результате связывания молекул хемоаттрактанта соответствующим мембранным рецептором лейкоцитов, в ядро клетки передается сигнал активации, что приводит к реорганизации актинового цитоскелета. Это в свою очередь приводит к поляризации клетки – меняется форма клетки; в сторону объекта хемотаксиса выдвигается лидирующий конец (псевдоподия) – участки цитоплазмы, содержащие сеть микрофиламентов, в частности нитчатый F-актин, образующийся в результате поляризации G-актина. Для осуществления хемотаксиса клетки должны адгезировать к субстрату. Этот процесс опосредован адгезионными структурами, состоящими из активированных интегринов, актиновых фибрил и актин-связывающих белков (α-актинин, талин) (Ley et al., 2007; Wong et al., 2009). 1.1.3. Секреторная активность моноцитов крови человека В участке воспаления секретируется огромное количество цитокинов и ростовых факторов, каждый из которых может потенциально влиять на течение воспалительной реакции. В ответ на эти сигналы мононуклеарные фагоциты и эндотелиальные клетки отвечают изменением экспрессии адгезионных молекул и секреции хемокинов, цитокинов и ростовых факторов. Под влиянием компонентов бактерий и их секреторных продуктов клетки продуцируют цитокины и хемокины. LTA, PGN и М1-белки Streptococcus pyogenes активируют продукцию провоспалительных цитокинов (IL-8, IL-6, IL-1β, TNFα) мононуклеарными лейкоцитами и эндотелиальными клетками (van Amersfoort et al., 2003; Påhlman et al. 2006; Bryant and Stevens 2003; Santos-Sierra et al., 2006, Olsnes et al., 2011; Blease et al., 1999). ОК-432 (убитые пеницилином S. pyogenes) стимулируют секрецию хемокинов MIP-1 α/β и МСР-1 мононуклеарными фагоцитами крови (Olsnes et al., 2009). Многие цитокины оказывают влияние на процессы мобилизации лейкоцитов крови в очаг инфекции. Особое место среди цитокинов занимают провоспалительные цитокины TNFα, IFNγ, IL-1, IL-6, IL-12 и противовоспалительные цитокины IL-4, IL-10, а также ростовые факторы: TGFβ и др. Интерлейкин-1 (IL-1). К семейству интерлейкина-1 относятся полипептиды IL-1α и IL-1β, обладающие широким спектром провоспалительной, метаболической, физиологической, гемопоэтической и иммунологической активности. Обе формы IL-1, хотя и являются продуктами различных генов, взаимодействуют с общим рецептором и обладают сходными биологическими свойствами. Как правило, клетки организма не – 23 – способны к спонтанному синтезу IL-1, а продуцируют его в ответ на инфекцию, действие микробных токсинов, воспалительных агентов, других цитокинов, активированных компонентов комплемента или системы свертывания крови (Osterud and Bjorklid 2003; Симбирцев А. С., 2011, Пальцев М. А., 1996). Продуцентами IL-1 являются не только гемопоэтические клетки, но и эндотелиальные, эпителиальные, нервные и др. Спектр клеток-мишеней этого цитокина не менее широк. Вместе с TNFα и IL-6 IL-1 входит в группу провоспалительных цитокинов с перекрывающимися биологическими свойствами. IL-1 усиливает клеточную пролиферацию, инициирует или супрессирует экспрессию определенных генов. Повышение уровня IL-1 в крови приводит к активации эндотелиальных клеток (Meager A., 1999). IL-1, как и TNFα стимулирует экспрессию Еселектина эндотелиальными клетками, усиливает экспрессию на них лигандов Lселектина, адгезионных молекул ICAM-1, VCAM-1 (Meager A., 1999; Petri et al., 2008). IL-1 способен активировать синтез других цитокинов и хемокинов: IL-2-8, TNFα/β, IFNβ, GMCSF, G-CSF, M-CSF, MCPs, RANTES, MIPs, CX3CR1 (фракталкин) (Meager A., 1999; Johnson-Léger et al., 2000; Takahashi et al., 2001). Кроме того, IL-1 может индуцировать собственный синтез и экспрессию рецепторов для IL-2 (Takahashi et. al., 2001). При бактериемии наблюдается повышенная продукция IL-1 моноцитами крови человека (Nau and Eiffert 2002). Фактор некроза опухоли TNFα (кахектин) выполняет регуляторные и эффекторные функции при воспалении и иммунном ответе. Главными индукторами синтеза TNFα считаются компоненты бактерий (Nau and Eiffert 2002; Meager A., 1999). Также в качестве индукторов синтеза TNFα могут выступать и другие цитокины (IL-1, IL2, IFNα/β, GM-CSF). Для TNFα существуют два рецептора р55 (CD120а) и р75 (CD120b). Эти рецепторы обладают одинаковой афинностью для TNFα, но регулируются независимо. И моноциты, и эндотелиальные клетки экспрессируют оба рецептора TNFα – p55 и p75. На моноцитах крови в большей степени экспрессируется р75, эндотелиальные клетки активируются преимущественно через p55, однако при низких концентрациях TNFα связывается рецептором p75 (Mantovani et al., 1998; Meager A., 1999). TNFα усиливает экспрессию адгезионных молекул (ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1), Р-, Е-селектинов и лигандов L-селектина на поверхности эндотелиальных клеток. Под влиянием TNFα эндотелиальные клетки секретируют PAF, PGI2, NO, MIPs, CX3CL1, MCP-1, RANTES, LIF, IL-1, IL-6, IL-8, IFNβ, GM-CSF (Mantovani et al., 1998; Meager A., 1999; JohnsonLéger et al., 2000; Petri B. et al., 2008; Bardin et al., 2009; Osterud and Bjorklid 2003). TNFα индуцирует перераспределение молекул РЕСАМ-1, JAM, VE-кадгерина и CD99 (Meager A., – 24 – 1999; Bardin et al., 2009). Местная продукция TNFα в очаге инфекции обеспечивает хемотаксис моноцитов и гранулоцитов в очаг, усиление фагоцитоза и микробицидности моноцитов (Meager A., 1999). IL-6 – мультифункциональный цитокин, проявляет как провоспалительные, так и противовоспалительные свойства. Наиболее постоянными индукторами синтеза IL-6 являются IL-1 и LPS, в качестве дополнительных стимулов могут действовать TNFα и PGE2 (Meager A., 1999). В нормальных физиологических условиях IL-6 отсутствует в сыворотке крови, но его уровень повышается при различных микробных инфекциях, иммунологических реакциях, воспалении или повреждениях тканей (Тотолян и Фрейдлин, 2000; Nau and Eiffert 2002). При системных воспалительных реакциях продуцентами IL-6 служат моноциты крови, эндотелиальные клетки, фибробласты, гладкомышечные клетки (Ярилин А.А., 2010). IL-6 – главный активатор синтеза белков острой фазы (Clahsen and Schaper 2008). IL-6 снижает LPS-индуцированную продукцию IL-1 и TNF-α макрофагами in vivo и in vitro (Romano et al. 1997). Кроме того IL-6 усиливает продукцию моноцитами крови IL-1Ra, МСР-1 и TF, но ингибирует секрецию этими клетками IL-1β, TNF-α и IL-12 (Kaplanski et al. 2003). Под влиянием IL-6 усиливается секреция IL-6, МСР-1 и IL-8 эндотелиальными клетками (Kaplanski et al. 2003; Clahsen and Schaper 2008). Участие IL-6 в регуляции адгезии и миграции лейкоцитов опосредовано усилением экспрессии адгезионных молекул (ICAM-1, VCAM-1, Е-селектин) и полимеризации актина (Clahsen and Schaper 2008; Kaplanski et al. 2003). В присутствии IL-8 IL-6 может образовывать комплексы с растворимой формой рецептора sIL-6Rα. Комплексы IL-6/sIL-6Rα опосредуют мобилизацию лейкоцитов, активируя эндотелиальные клетки и усиливая секрецию ими МСР-1 (Marin et al. 2001). IL-12. Относится к провоспалительным цитокинам. Основными его продуцентами являются моноциты, макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы, активированные Вклетки (Тотолян и Фрейдлин, 2000). Индукторами синтеза IL-12 служат микробные компоненты и продукты, или другие провоспалительные цитокины. IL-12 является мощным антагонистом IL-10 (Тотолян и Фрейдлин, 2000). IL-12 усиливает продукцию IFNγ (Strasly et al. 2001) и TNFα (Osterud and Bjorklid 2003). IL-15 – плейотропный цитокин, опосредующий целый комплекс биологических функций в отношении различных типов клеток. Играет важную роль в развитии воспаления и защитных иммунных реакций в ответ на внедрение бактерий и паразитов. Несмотря на то, что многие типы клеток конститутивно экспрессируют мРНК IL-15, – 25 – обнаруживаемый уровень секреции этого цитокина характерен только для моноцитов, дендритных клеток, фибробластов, эпителиальных и стромальных клеток (Perera et al., 2012). Секретируемый моноцитами человека IL-15 представляет собой мембранносвязанный белок; его экспрессия усиливается под влиянием IFNγ. IL-15 индуцирует продукцию хемокинов (IL-8 и МСР-1) моноцитами человека (Perera et al., 2012). Под влиянием IL-15 макрофаги секретируют провоспалительные цитокины, причем в высоких концентрациях IL-15 стимулирует продукцию IL-1, IL-6 и TNF-α, а в низких концентрациях этот цитокин индуцирует секрецию IL-10 (Perera et al., 2012). IFNγ (интерферон γ). Под влянием IFNγ на эндотелиальных клетках и моноцитах индуцируется экспрессия молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) II класса и инвариантной цепи, усиливается экспрессия молекул MHC I класса на эндотелиальных клетках (Mantovani et al., 1997; Kimball et al., 1995; Donelly et al. 1993). IFNγ активирует макрофаги по классическому пути (Bonecchi et al. 2000). IFN-γ снижает экспрессию CCR2 на моноцитах (Bonecchi et al. 2000), повышает экспрессию TLR4, который является рецептором для компонентов грам-положительных бактерий, в том числе, S. pyogenes (Cohen J., 2002), стимулирует выброс NO моноцитами крови (Bronte and Zanovello 2005) и продукцию IL-1β (Osterud and Bjorklid 2003). На эндотелиальных клетках IFNγ усиливает экспрессию ICAM-1 и VCAM-1 (Lee et al. 2012) (Meager A., 1999), E-селектинов (Imhof and Aurrand-Lions 2004), но снижает индуцированную другими цитокинами экспрессию P-селектинов (Stocker et al. 2000). Под влиянием IFN-γ повышается экспрессия рецептора IL-10R1 на эндотелиальных клетках (Cattaruzza et al. 2003). Как и TNFα, IFN-γ вызывает перестройки молекул РЕСАМ-1 и JAM на поверхности эндотелия (Meager A., 1999; Johnson-Léger et al., 2000); вызывает секрецию хемокина МСР-1 (Janevey et al., 2008); регулирует активность ММР-9 на лейкоцитах (Coito A.J., 2011). IFNγ блокирует часть эффектов IL-4 (Osterud and Bjorklid 2003). IL-4 относится к противовоспалительным цитокинам. Он ингибирует секрецию провоспалительных цитокинов IL-6, TNFα, IL-1 моноцитами крови (Donelly et al. 1993, Orino et al. 1992, Пальцев М. А., 1996) и усиливает экспрессию на них рецепторов IL-1Ra (Orino et al. 1992). IL-4 снижает жизнеспособность IL-1- или LPS-индуцированных моноцитов (Mangan et al. 1992). IL-4 усиливает экспрессию рецепторов хемокинов CXCR1 и CXCR2 на моноцитах и макрофагах. Под влиянием IL-4 снижается LPS-индуцированная продукция моноцитами МСР-1, MIP-1 и IL-8 (Bonecchi et al. 2000). IL-4 индуцирует активацию макрофагов по – 26 – альтернативному (М2а) пути (Benoit et al., 2008). Под влиянием IL-4 на моноцитах индуцируется экспрессия молекул MHC II класса (Donelly et al. 1993) и снижается экспрессия молекул CD14 (Hart and Jones 1995). IL-4 блокирует некоторые эффекты IL-12 (Osterud and Bjorklid 2003). На эндотелиальных клетках IL-4 индуцирует экспрессию P-селектина и лиганда Lселектина (Meager A., 1999; Herter and Zarbock, 2013; Stocker et al. 2000), молекул VCAM-1 (Kaplanski et al. 1998), снижает IL-1- или TNFα-индуцированную экспрессию Е-селектина, а в сочетании с IFNγ снижает экспрессию Р-селектина (Meager A., 1999; Stocker et al. 2000). Под влиянием IL-4 усиливается секреция IL-8 и МСР-1 эндотелиальными клетками (Bonecchi et al. 2000; Luscinskas et al., 1994). IL-10 является антагонистом IFNγ. Эти два цитокина ингибируют как продукцию, так и биологическую активированными активность моноцитами друг и друга. лимфоцитами In vivo IL-10 (McInnes синтезируется et al., 2001). Противовоспалительный эффект этого цитокина обуславливается его негативной регуляцией взаимодействия лейкоцитов с эндотелиальными клетками и ингибированием продукции провоспалительных цитокинов и хемокинов (Osterud and Bjorklid 2003). IL-10 снижает уровень супероксида при воспалении (Gunnett et al. 2000). IL-10 ингибирует экспрессию МНС II класса на моноцитах крови и продукцию IL-1, IL-6, IL-8, TNFα, GM-CSF активированными человеческими моноцитами. IL-10 участвует в регуляции процессов коагуляции, ингибируя экспрессию тканевого фактора на моноцитах (Cohen J., 2002). IL-10 непосредственно регулирует активацию эндотелиальных клеток и ангиогенез in vitro (McInnes et al., 2001), снижает экспрессию адгезионных молекул ICAM-1, VCAM-1 на эндотелиальных клетках (Meager A., 1999) (Strazynski et al., 2004; Tedgui and Mallat 2001) и секрецию ими IL-6, IL-8 (Tedgui and Mallat 2001), коллагена и матриксных металлопротеиназ (McInnes et al., 2001). IL-13 – противовоспалительный цитокин, так же как и IL-4, ингибирует провоспалительные функции моноцитов. Продуцируется Т-лимфоцитами, нейтрофилами и некоторыми неиммунными клетками (Тотолян и Фрейдлин, 2000). На эндотелиальных клетках IL-13 снижает IL-1- или TNFα-индуцированную экспрессию Е-селектина, экспрессию молекулы ICAM-1 и индуцирует экспрессию VCAM-1 (Luscinskas et al., 1994; Meager A., 1999; Bonecchi et al. 2000) и транскрипцию гена Рселектина (Petri et al., 2008). Усиливает секрецию IL-8 эндотелиальными клетками (Bonecchi et al. 2000). Как и IL-4, IL-13 активирует макрофаги по альтернативному пути (Benoit, Desnues, – 27 – and Mege 2008), усиливает экспрессию CXCR1 и CXCR2 рецепторов хемокинов на моноцитах и макрофагах и снижает LPS-индуцированную продукцию МСР-1, MIP-1 и IL-8 моноцитами (Bonecchi et al. 2000). TGFβ (трансформирующий фактор роста β) – противовоспалительный цитокин. Снижает продукцию супероксидных радикалов и метаболитов NO активированными макрофагами (Osterud and Bjorklid 2003). На эндотелиальных клетках TGFβ снижает экспрессию Е-селектина и VCAM-1 (Osterud and Bjorklid 2003); при совместном действии TGFβ с IL-4 ингибиторный эффект на экспрессию Е-селектина усиливается (Meager A., 1999). Под влиянием TGFβ снижается индуцированная провоспалительными цитокинами TNFα и IL-1 продукция МСР-1 и IL-8 эндотелиальными клетками (Osterud and Bjorklid 2003). TGFβ регулирует экспрессию РЕСАМ-1 и РЕСАМ-1-опосредованную адгезию (Meager A., 1999). MIF (фактор, ингибирующий миграцию). Функцией этого фактора является торможение миграции фагоцитирующих клеток, в том числе – моноцитов. Уровень продукции MIF, как правило, повышается при инфекциях и воспалительных процессах (Тотолян и Фрейдлин, 2000). Этот цитокин способствует накоплению моноцитов/макрофагов в очаге воспаления. Важную роль в процессе трансэндотелиальной миграции лейкоцитов играют хемокины – белки с низкой молекулярной массой, которые секретируются лейкоцитами, эндотелиальными и стромальными клетками. Хемокины являются хемоаттрактантами для лейкоцитов. Также они способны активировать интегрины, повышать их авидность, тем самым оказывая влияние на прочную адгезию лейкоцитов к эндотелию. IL-8 (СХС–хемокин). Основными продуцентами IL-8 являются моноциты и макрофаги, однако его могут продуцировать нейтрофилы, Т-лимфоциты, NK-клетки, эндотелиальные клетки и др. Индукторами синтеза IL-8 могут служить бактериальные компоненты, TNF, IL-1, IL-6, IL-15 (Kaplanski et al. 2003; Blease et al., 1999; Meager A., 1999; Perera et al., 2012). Главной функцией этого цитокина является селективная для нейтрофилов высочайшая активность хемоаттрактанта. IL-8 усиливает адгезию нейтрофилов к эндотелию и их дегрануляцию (Тотолян и Фрейдлин, 2000). IL-8 повышает экспрессию интегринов на мембранах нейтрофилов и индуцирует респираторный взрыв (Тотолян и Фрейдлин, 2000). МСР-1 (хемотаксический хемоаттрактантом для белок моноцитов. МСР-1 моноцитов, усиливает СС-хемокин) секрецию является моноцитами – 28 – лизосомальных ферментов и продукцию супероксидных радикалов. Продуцентами МСР-1 выступают активированные мононуклеарные лейкоциты крови человека, эндотелиальные клетки, фибробласты и другие клетки (Тотолян и Фрейдлин, 2000). Продукцию МСР-1 усиливают IL-1, IL-4, IL-6, IL-15, TNFα, PDGF, IFNγ и иммунные комплексы (Kaplanski et al. 2003; Luscinskas et al., 1994; Meager A., 1999; Perera et al., 2012). – 29 – 1.2. Влияние Streptococcus pyogenes и его компонентов на процессы мобилизации моноцитов в очаг воспаления Streptococcus pyogenes – один из наиболее распространенных возбудителей бактериальных инфекций человека. Пиогенный стрептококк вызывает такие заболевания как ангина, фарингит, скарлатина, стрептодермия, рожистое воспаление, отит, менингит, сепсис и др. (Cunningham M.W., 2000). В последние десятилетия во всем мире отмечено преобладание тяжелых проявлений стрептококковых инфекций – развитие сепсиса, синдрома инфекционно-токсического шока. Кроме того, стрептококки могут провоцировать тяжелые аутоиммунные заболевания с поражением сердца, почек и суставов. 1.2.1. Факторы патогенности (вирулентности) гноеродного стрептококка В естественных условиях бактерии обычно растут на поверхностях, поэтому при заселении организмов млекопитающих, многие виды бактерий образуют сообщества в виде «биопленки» (biofilm). Формирование биопленок в первую очередь зависит от способности бактерий адгезировать к клеточной поверхности. Поверхностные и секреторные белки стрептококков обеспечивают адгезию и вирулентность, мембранные транспортеры участвуют в переносе питательных веществ и экспорте малых сигнальных молекул. На поверхности клеток стрептококков обнаруживаются филаментные структуры (фибрилы и фимбрии). Они опосредуют адгезию к клеткам хозяина и компонентам внеклеточного матрикса, способствуют агрегации бактерий (Crotty Alexander et al., 2010; Nobbs et al., 2009). Важным фактором вирулентности стрептококков является их капсула (рис. 1.2). Капсула состоит из полимеров гиалуроновой кислоты, содержащих гиалуроновую кислоту и N-глюкозамины (Patterson M. J., 1996; Cunningham 2000). Также капсула выполняет функции фактора адгезии и антифагоцитарного фактора. К капсуле и мембране прикреплены углеводные компоненты и поверхностные белки (Cunningham M.W., 2000). Клеточная стенка грам-положительных бактерий состоит из макромолекул пептидогликана (муреина), к которым присоединены тейхоевые, теихуроновые и липотейхоевые кислоты, полифосфаты и карбогидраты. Пептидогликан (PGN) – гетерополимер, состоящий из дисахаридных повторов: N-ацетилмурамовая кислота-(β1- – 30 – 4)-N-ацетилглюкозамин (MurNAc-GlcNAc). Длина гликановых цепей варьируется от 5 до 30 повторов в зависимости от типа бактерий (Navarre and Schneewind 1999). Пептиды соседних гликановых цепей связываются между собой, образуя трехмерную молекулярную сеть вокруг клетки, и выполняют роль экзоскелета. Рисунок 1.1. Факторы патогенности гноеродного стрептококка (http://www.satius.su). Все грам-положительные бактерии синтезируют анионные полимеры, которые ковалентно связаны с пептидогликаном клеточной стенки (тейхоевыми кислотами) или с липидами мембраны (липотейхоевыми кислотами - LTA). Тейхоевые кислоты – линейные полисахариды, состоящие из остатков глицеролфосфата, рибитолфосфата или гликозилфосфата. Они могут связываться с ферментами, которые способны проникать через пептидогликаны (Navarre and Schneewind 1999). Видоспецифичность тейхоевых кислот позволяет грам-положительным бактериям синтезировать «упаковочные» (envelope) структуры, химически отличные от аналогичных структур других организмов. LTA являются еще одним фактором вирулентности стрептококков (Patterson M. J., 1996; Cohen J., 2002; Nobbs et al., 2009). Они участвуют во взаимодействии стрептококков с компонентами тканей и белками внеклеточного матрикса. Кроме того, LTA является лигандом TLR 2 на поверхности эукариотических клеток (Cohen J., 2002; Nobbs et al., 2009). Стрептококки группы А (GAS) характеризуются высокой инвазивностью. Это обусловлено экспрессией широкого спектра адгезинов и инвазинов. Эти молекулы способны связываться с консервативными структурами на поверхности эукариотических клеток и компонентами внеклеточного матрикса; они стимулируют воспалительный и – 31 – иммунный ответы, участвуют в процессинге белков, поглощении питательных веществ и опосредуют межбактериальное связывание для конъюгационного переноса ДНК (Nobbs et al., 2009). Взаимодействия адгезинов с соответствующими рецепторами чаще всего являются белок-углеводными (лектин-подобными), но описаны также белок-белковые или углевод-углеводные взаимодействия (Nobbs et al., 2009; Navarre and Schneewind 1999; Cunningham M.W. 2000; Thern et al., 1998). Семейство М-поверхностных белков стрептококка состоит из родственных Emm (класс I и II), Enn и Mrp (FcrA) белков. Mga-регулон OF+-цепей GAS всегда содержит все три гена М-белков семейства (Navarre and Schneewind 1999). Члены семейства М-белков могут связываться с различными компонентами организма хозяина, включая иммуноглобулины, фибриноген, кининогены, плазминоген и альбумин, а также факторы, ингибирующие депозицию комплемента на поверхности бактерии (Cunningham M.W., 2000, Navarre and Schneewind 1999). Адгезины могут быть непосредственно прикреплены к клеточной поверхности бактерий или входить в состав других поверхностных структур (фимбрии) (Nobbs et al., 2009). Большинство поверхностных белков S. pyogenes принадлежат суперсемейству LPxTz. Гены, кодирующие эти полипептиды, сильно подвержены меж- и внутригенным рекомбинациям, дупликациям и точечным мутациям, с чем связано разнообразие их структур и функций (Nobbs et al., 2009; Navarre and Schneewind 1999). Для GAS характерна двухступенчатая модель взаимодействия с эукариотическими клетками. На первом этапе происходит слабое гидрофобное взаимодействие между LTA и соответствующими связывающими доменами на поверхности клеток хозяина. На следующем этапе в процесс связывания вовлекаются белковые адгезины, такие как Мбелок, фибронектин- и ламинин-связывающие белки, в зависимости от того, какие рецепторы присутствуют на поверхности клетки (Nobbs et al., 2009). S. pyogenes продуцируют различные ферменты (пирогенные экзотоксины (SpeА, SpeB), протеаза SpyCep, стрептолизин О и др.), которые также являются факторами вирулентности. Они участвуют в процессах инвазии бактерий в клетки хозяина (Burns et al., 1998; Kaur et al., 2010; Kerr J.R., 1999; Molinari and Chhatwal, 1999). Экзотоксины проявляют свойства суперантигенов и способны связываться с МНС II и Vβ-цепями Тклеточного рецептора (Kerr J.R., 1999; Cohen J., 2002). В литературе есть данные, что SpeB обеспечивает переход GAS из локального участка инфекции в кровь и их распространение в организме хозяина (Tart et al., 2007). Сериновая протеаза SpyCep (так же известная как – 32 – ScpC, PrtS) опосредует внедрение бактерий в эндотелиальные клетки человека по эндосомально-лизосомальному пути (Kaur et al., 2009). Пороформирующий токсин стрептолизин О участвует в образовании некрозов тканей (Tart et al., 2007). Инвазию бактерий опосредуют так же FbaB, SfbI (Amelung et al., 2011; Kaur et al., 2010; Schwarz-Linek et al., 2004). 1.2.2. Влияние бактериальных компонентов на функции моноцитов крови Мононуклеарные фагоциты служат эффекторами врожденного иммунитета и обеспечивают защиту организма за счет своей фагоцитарной функции. Секретируемые макрофагами молекулы выполняют эффекторные и регуляторные функции. Фагоциты преимущественно располагаются в тех тканях организма, куда возможно попадание инфекционных агентов. Обновление тканевых макрофагов происходит в основном за счет циркулирующих в крови моноцитов. Участие макрофагов в эффекторной фазе приобретенного иммунного ответа проявляется, в частности, их мобилизацией в очаг иммунного воспаления под влиянием лимфоцитарных продуктов (Ярилин А.А., 2010). Макрофаги также принимают участие в эффекторной фазе гуморального иммунного ответа, захватывая и уничтожая патогенные бактерии, опсонизированные специфическими антителами и комплементом. Для этого на мембране макрофагов экспрессированы специальные рецепторы для иммуноглобулинов, и для компонентов системы комплемента. Для связывания с бактериальными компонентами служат паттерн-распознающие рецепторы (PRR). К PRR относятся Tollподобные рецепторы (TLR). На моноцитах и макрофагах TLR представлены довольно разнообразно. TLR2 связывает пептидогликан клеточной стенки бактерий, липотейхоевые кислоты бактериальные липопротеины и липопептиды и зимозан (van Amersfoort et al., 2003; Graveline et al., 2007; Nobbs et al., 2009; Opitz et al., 2010). TLR-4 связывается с LPS грам-отрицательных бактерий и LTA грам-положительных бактерий (van Amersfoort et al., 2003), TLR7/8 опосредуют активацию в ответ на бактериальную одноцепочечную (ss) РНК, а TLR-9 – на СрG ДНК (Opitz et al., 2010; Harder et al. 2009; Miettinen et al. 2008). TLR-1 и TLR-6 могут образовывать функциональные пары с TLR-2 и тем самым так же могут опосредовать иммунный ответ на грам-положительные бактерии (Graveline R., 2007; Ozinsky et al. 2000, Opitz et al., 2010). Распознавание бактериальных компонентов толл-подобными рецепторами активирует р38 МАРК и NFκB (Beisswenger et – 33 – al., 2007, Маянский и др., 2007). В цитозольном пространстве компоненты бактерий распознают NLR (NOD-like receptors, NOD-подобные рецепторы) (Harder et al. 2009). На лейкоцитах крови экспрессируются NOD-1 и NOD-2. NOD-1 и NOD-2 распознают различные компоненты пептидогликанов бактерий. Связывание NLR с лигандами активирует NFκB (транскрипционный фактор κB) (Opitz et al., 2010). Для мононуклеарных фагоцитов свойственна также экспрессия других рецепторов врожденного иммунитета — лектиновых. Лектиновые рецепторы моноцитов и макрофагов распознают свободные D-гликозильные остатки глюкозы, галактозы, маннозы, фукозы, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилгалактозамина. И на моноцитах, и на макрофагах присутствуют лектиновые рецепторы MR (маннозный рецептор, CD206), DCSIGN (CD209) и дектин-1 (Ярилин A.A., 2010). Лектиновые рецепторы мононуклеарных фагоцитов распознают на поверхности бактерий гликоконъюгаты с неэкранированными гликозильными остатками. Скавенжер рецепторы (SR) принимают участие в процессах адгезии клеток и межклеточном взаимодействии, так же участвуют в фагоцитозе. Мононуклеарные фагоциты экспрессируют различные SR, например SR-A I/II/III, MARCO, CD36, CD163, CD68 (макросиалин), SR-C (de Winther et al., 2000; Maxeiner et al. 1998). Предполагают, что связывание SR с лигандами происходит за счет электростатических взаимодействий. Скавенжер рецепторы непосредственно распознают LTA и другие компоненты бактерий S. pyogenes, S. agalactiae, S. aureus и др. (Thomas et al. 2000; de Winther et al., 2000; Greenberg et al., 1996). Скавенжер рецептор MARCO так же участвует в распознавании антигенов бактерий (Fabriek et al., 2009). Было показано, что скавенжер рецептор CD163, экспрессированный на поверхности мононуклеарных фагоцитов, также способен распознавать антигены грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, и тем самым запускать продукцию этими клетками провоспалительных цитокинов (Fabriek et al., 2009). Для связывания мононуклеарных фагоцитов с иммуноглобулинами служат Fcрецепторы. Эти рецепторы обеспечивают распознавание и облегчают фагоцитоз и разрушение моноцитами и макрофагами опсонизированных антителами клеток (в том числе бактериальных). Моноциты экспрессируют полный набор Fcγ-рецепторов — FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). На моноцитах и макрофагах представлены также рецепторы для Fc-части IgA (FcαR) и низкоаффинные рецепторы для IgE — FcεRII (CD23) (Ярилин A.A., 2010). – 34 – Благодаря присутствию на поверхности моноцитов и макрофагов рецепторов для комплемента (CR) эти клетки распознают фрагменты комплемента, прикрепленные к поверхности патогенов. Большинство рецепторов распознает фрагменты СЗb и C3d — CR1 (CD35), CR3 (CD11b/CD18, или Мас-1) и CR4 (CD11c/CD18, или р150,95). Функция этих рецепторов сходна с таковой Fc-рецепторов: они облегчают распознавание клетокмишеней фагоцитами и поставляют в фагоцитирующие клетки активационные сигналы. Мононуклеарные фагоциты экспрессируют также рецепторы для фактора C1q и хемотаксических факторов-анафилатоксинов СЗа и С5а (Ярилин A.A., 2010). Антифагоцитарные свойства М-белков стрептококков объясняются их способностью связываться с факторами Н, FHL-1 (Н-подобный фактор), C4BP и C1q (Nobbs et al., 2009). Фактор Н, FHL-1 и C4BP относятся к семейству RCA (регуляторы активации комплемента) – молекул, регулирующих активность комплемента. Молекула CD46 экспрессируется на поверхности различных типов клеток, в том числе – на моноцитах. Эта молекула так же принадлежит к семейству RCA и инактивирует С3b и C4b белки системы комплемента. GAS способны инициировать воспалительный ответ посредством связывания М-белков с CD46 на поверхности клеток (Nobbs et al., 2009; Feito et al. 2007; Navarre and Schneewind 1999; Thern et al., 1998). Стрептококки экспрессируют ряд белков, связывающих имуноглобулины, что помогает бактериям избежать обнаружения иммунной системой. К таким белкам относятся М-белки, М-подобные белки (Enn, Mrp), протеин Н, Arp, Sir, SibA, SfbI (Nobbs et al., 2009). Взаимодействие IgG с белком G стрептококков делает невозможным связывание имуноглобулина с C1q компонентом комплемента, т.о., предотвращая активацию системы комплемента по классическому пути (Nobbs et al., 2009). S. pyogenes ингибирует пролиферацию мононуклеарных лейкоцитов (Degnan et al., 1998). Под влиянием LTA, PGN и М1-белка Streptococcus pyogenes мононуклеарные лейкоциты секретируют IL-8, IL-6, IL-1β, TNFα (van Amersfoort et al., 2003; Påhlman et al. 2006; Bryant and Stevens 2003). LTA из S. pyogenes индуцирует окислительный взрыв моноцитов крови человека (Levy et al. 1990). 1.2.3. Влияние бактериальных компонентов на функции эндотелиальных клеток Стрептококковая инфекция, как правило, сопровождается массивными – 35 – воспалительными реакциями. При инвазивной стрептококковой инфекции резко возрастает уровень цитокинов в крови. Усиленная секреция провоспалительных цитокинов способствует амплификации воспалительной реакции и приводит к массивным повреждениям тканей. Нарушения микроциркуляции, гипотензия, шок, полиорганная недостаточность, сопровождающие стрептококковую инфекцию, связаны в первую очередь с эндотелиальной дисфункцией (Tart et al., 2007; Sahni 2007; Påhlman et al. 2006; Påhlman et al. 2007). М-белок S. pyogenes индуцирует продукцию гепарин-связывающего белка, который индуцирует синдром «протекания сосудов» (Tart et al., 2007; Påhlman et al. 2006; Påhlman et al. 2007). Гиперпроницаемость эпителия и эндотелия, нарушение эпителиального и эндотелиального барьеров связывают также с усилением апоптоза и некроза эндотелиальных клеток (Lucas et al. 2009). В норме процесс апоптоза позволяет организму избавляться от инфицированных клеток и удалять потенциальные мишени для адгезии и интернализации патогена. В то же время, способность индуцировать апоптоз позволяет бактерии избежать фагоцитоза, что способствует более глубокому проникновению и распространению инфекции. GAS индуцируют апоптоз различных типов иммунных клеток, активируя оба пути (митохондриальный путь или через рецепторы на поверхности клетки) (Lucas et al. 2009). Многие эффекты стрептококков опосредованы TLR. Эндотелиальные клетки преимущественно микрососудов экспрессируют практически все известные TLR, за исключением TLR7, TLR8, TLR11 (Dunzendorfer et al., 2004; Danese et al., 2010). PGN и LTA, распознаваемые TLR2, индуцируют воспалительный ответ: активируется продукция провоспалительных цитокинов (TNF, IL-6, IL-1) и сигналинг через MAP-киназу JNK и NFκB. Результатом становится TLR-опосредованный апоптоз инфицированных клеток (SantosSierra et al., 2006). При инфицировании HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) стрептококками (S. viridans, S. gordonii) инвазия бактерий в клетки сопровождается гибелью эндотелиальных клеток. ATP, секретируемая GAS в повышенных концентрациях, регулирует сосудистый тонус (Schwiebert et al., 2002), повышает миграционную активность и индуцирует ангиогенез на «vasa vasorum» ЭК (Gerasimovskaya et al., 2008). При увеличении локальных концентраций аденозина и адениновых нуклеотидов (например, при повреждении клеток или ишемии), происходит повышение проницаемости кровеносных сосудов (Frantz et al. 2005). Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа GAPDH (не связанный с мембраной клеток фермент стрептококков) функционирует как комплекс по продукции АТР. АТР в – 36 – наномолярных концентрациях, связываясь со своим рецептором P2X на поверхности клеток, индуцирует их апоптоз (La Sala et al., 2003). Возможно, баланс между про- и антиапоптотическими эффектами стрептококков по отношению к клеткам организмахозяина играет важную роль в развитии заболеваний. Индуцируя апоптоз, бактерия избегает фагоцитоза, в то время как ингибирование апоптоза позволяет бактерии выживать проникая внутрь клетки (Nobbs et al., 2009). Все штаммы стрептококка группы А продуцируют внеклеточную цистеиновую протеазу (SCP). Механизм повреждающего действия SCP на эндотелий связан с активацией продукции эндотелиальными клетками металопротеиназ (MMP2, MMP9), которые разрушают белки внеклеточного матрикса и молекулы межклеточных контактов (Burns et al., 1996), что приводит к нарушению межклеточных контактов, целостности эндотелия и способствует диссеминации патогена. SpeB цистеиновая протеаза – ключевой фактор вирулентности, который регулирует функции поверхностных белков S. pyogenes. Цитопатическое действие стрептококков на эндотелиальные клетки вносит существенный вклад в патогенез инфекционного эндокардита и атеросклероза (Strasly et al. 2001), в процессы колонизации и деструкцию тканей. SpeB способна расщеплять белки внеклеточного матрикса, антимикробные пептиды, а также активировать ММР, что способствует усилению поражения тканей (Tsai et al., 1999; Nobbs et al., 2009; Navarre and Schneewind 1999; Cunningham M.W. 2000; Thern et al., 1998; Burns et al., 1996). SpeB2 может связываться с αvβ3- и αLβ3-интегринами на эндотелиальных клетках (Stockbauer et al., 1999; Kerr J.R., 1999). Взаимодействие GAS с эпителиальными клетками и тонзиллярными фибробластами индуцирует секрецию TGFβ1, что, в свою очередь, повышает на клетках уровень экспрессии α5-интегрина и индуцирует интеграцию и интернализацию бактериальных клеток (Nobbs et al., 2009). – 37 – 1.3. Влияние компонентов гноеродного стрептококка на регуляцию взаимодействия моноцитов крови с эндотелиальными клетками сосудов На поверхности стрептококков экспрессируется большое количество белков, взаимодействующих с компонентами внеклеточного матрикса. Используя белки внеклеточного матрикса в качестве «мостиков», стрептококки могут взаимодействовать с интегринами. Стрептококки, связываясь с интегринами на поверхности эукариотических клеток, используют внутриклеточные сигнальные пути этих молекул для реализации адгезии, колонизации и инвазии. Коллагеноподобные белки S. pyogenes SclA и SclB взаимодействуют с α2β1 и α11β1-интегринами (Nobbs et al., 2009). Белки стрептококков, связывающиеся с фибронектином, опосредуют адгезию GAS к α5β1- и α5β3-интегринам на эпителиальных и эндотелиальных клетках хозяина (Nobbs et al., 2009; Yamaguchi et al., 2013). Фибронектин – мультифункциональный гликопротеин, который обнаруживается в большинстве жидкостей организма в растворимой форме или является компонентом клеточных мембран и внеклеточного матрикса. Фибронектин имеет домены, которые способны связывать различные молекулы, такие как, коллаген, фибрин, актин, гепарин. Многие адгезины GAS (SfbI/протеин FI, SOF/SfbII, FbaB/протеин FII, Fbp54, FbaA, PfbpI, SfbX, ScpA (С5а-пептидаза), SDH (поверхностная дегидрогеназа стрептококков), Shr и семейство М-белков) проявляют фибронектин-связывающие свойства (Molinari and Chhatwal, 1999; Nobbs et al., 2009; Tart et al., 2007; Nerlich et al. 2009). Стрептококки экспрессируют широкий спектр фибриноген-связывающих белков (SOF/SfbII, Fbp54, SDH, Mrp и М-белки) и могут регулировать процессы коагуляции. Фибриноген является фактором свертывания крови. Под действием тромбина происходит протеолитический распад фибриногена с образованием фибрина. Фибрин, полимеризуется и формирует фибриновый сгусток, который препятствует дальнейшему кровотечению из поврежденных сосудов. Фибриноген принимает участие в процессе адгезии лейкоцитов к эндотелию, в миграции лейкоцитов и в активации β 2-интегринов, а также усиливает миграцию и пролиферацию фибробластов (Nobbs et al., 2009; Thern et al., 1998). В патогенезе стрептококковой инфекции, большую роль играют плазминоген– связывающие белки: α-энолаза, стрептокиназа (Ska). Плазминоген – биологически неактивный предшественник плазмина, фибринолитическая молекула (Navarre and Schneewind 1999). Связанный с поверхностью стрептококка плазмин активирует ММР или – 38 – коллагеназы, что способствует инвазии бактерии. Экспрессированная на поверхности GAS α-энолаза обладает выраженной плазминоген-связывающей и плазмин-связывающей активностями. Стрептокиназа Ska обладает фибринолитической активностью (Cunningham 2000). Таким образом, плазминоген-связывающие белки способствуют преодолению бактериями тканевых барьеров. Благодаря связыванию с фибриногеном, кининогеном и плазминогеном, бактерии приобретают способность проникать глубоко в ткани за счет увеличения проницаемости сосудов, растворения сгустков и внеклеточного матрикса, что инициирует воспалительный процесс. Некоторые ферменты, секретируемые S. pyogenes, могут оказывать влияние на мобилизацию лейкоцитов. Пирогенный экзотоксин А (SpeА) способен связываться с широким спектром адгезионных молекул, опосредующих этапы мобилизации лейкоцитов – селектины, α4-, β1-, β2-интегрины, ICAM-1,2, VCAM-1 (Kerr J.R., 1999). С5а-пептидаза (ScpA) и протеаза SpyCep, протеолитически инактивируют компонент комплемента С5а (Nobbs et al., 2009) и хемокин IL-8 (Edwards et al. 2005; Hidalgo-Grass et al. 2006; Kaur et al., 2010; Chiappini et al., 2012) соответственно. Так как С5а и IL-8 являются хемоаттрактантами для нейтрофилов, действие этих ферментов приводит к снижению миграции этих клеток в участок инфекции. С5а так же действует на эндотелий капилляров, расширяя сосуды и повышая их проницаемость. SDH может связываться с различными белками эукариотических клеток, в том числе – с актином и миозином (Navarre and Schneewind, 1999), тем самым опосредуя регуляцию адгезии и миграции клеток. Обзор литературы показывает, что, с одной стороны, процессы мобилизации моноцитов из кровяного русла и их взаимодействие с эндотелиальными клетками сосудов изучены достаточно подробно. С другой стороны, подробно изучены факторы патогенности гноеродного стрептококка, который циркулирует в кровотоке при сепсисе и индуцирует в тканях очаги воспаления. Мононуклеарные фагоциты, играя роль эффекторов врожденного иммунитета, участвуют в антибактериальной защите, которая обеспечивается их фагоцитарной и секреторной активностью. Для осуществления своих функций клетки должны мигрировать из кровяного русла в очаг инфекции, через эндотелиальный барьер. При стрептококковых инфекциях мононуклеарные фагоциты первыми распознают – 39 – консервативные структуры бактерий. Это приводит к активации защитных механизмов клеток, в результате чего происходит фагоцитоз и разрушение бактерий. В крови накапливаются продукты, секретируемые живыми бактериальными клетками, а также продукты их деградации. Клетки крови становятся мишенями для этих факторов. В настоящее время достаточно хорошо изучено взаимодействие живых бактериальных клеток с мононуклеарными фагоцитами и эндотелиальными клетками. Менее изученным остается влияние продуктов деградации стрептококков на функции моноцитов крови и процессы их мобилизации из кровяного русла. Целью настоящего исследования было изучение влияния продуктов разрушения Streptococcus pyogenes серологической группы А (тип М22, штамм AL168) на функции мононуклеарных фагоцитов человека, определяющие их способность к миграции из кровяного русла в очаг инфекции, in vitro. Вопрос этот привлекает внимание в связи с необходимостью уточнения патогенетической роли стрептококка при ряде заболеваний, проявляющихся тяжелой эндотелиальной дисфункцией и усовершенствования методов лабораторной диагностики и персонализированного лечения. – 40 – ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Культуры клеток EA.hy 926 – линия эндотелиальных клеток человека; получена путем гибридизации первичной эндотелиальной линии клеток пупочного канальца (HUVEC) с клетками перевиваемой линии карциномы легкого А-549 (рис. 2.1). Культура была любезно предоставлена Dr. Cora-Jean C. Edgell (Университет Северной Каролины, США). Клетки линии EA.hy 926 по основным фенотипическим, морфологическим и функциональным характеристикам схожи с эндотелиальными клетками макрососудов человека. Клетки спонтанно экспрессируют фактор вон Виллебрандта (vWf), tPA, ингибитор активатора плазминогена, тканевой фактор и тромбомодулин. После активации клетки экспрессируют ICAM-1, VCAM-1 и Е-селектин и секретируют хемокины IL-8 и MCP-1 (Mutin et al., 1998, Luscinskas et al., 2005, Bennet et al., 1997). Клеточная линия обладает развитым механизмом контактного торможения и не требует добавки ростовых факторов при культивировании. Клетки культивировали в 50 мл флаконах («Sarstedt», Австрия), в среде DMEM/F12 («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ICN», США), 50 мкг/мл гентамицина («Биолот», Санкт-Петербург, РФ), 2 мМоль глютамина («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) и HAT («ICN», США), при 37ºС во влажной атмосфере с 5% CO2. Пересев проводили 1 раз в 2-3 дня, добавлением равного количества полной культуральной среды. Для дезинтеграции монослоя клетки инкубировали в растворе Версена в течение 5-10 минут («Биолот», Санкт-Петербург, РФ). Клетки перевиваемой линии THP-1 были получены из периферической крови пациента с промоноцитарной лейкемией (рис. 2.2). Линия клеток ТНР-1 была любезно предоставлена профессором M. De Ley (Университет города Левена, Бельгия). Клетки экспрессируют адгезионные молекулы β2-интегрины (Hmama et al., 1999, Ronald et al., 2001), рецептор фракталкина (Goda et al. 2000, Umehara et al., 2001), рецептор ламинина, Fc-рецепторы и молекулы МНС II (Montuori et al., 1999). Под влиянием бактериальных продуктов способны секретировать TNFα, IL-1β, IL-8, MIP-1α,β (Harrison et al., 2005). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ICN», США), 50 мкг/мл гентамицина («Биолот», Санкт-Петербург, РФ), 2 мМоль глютамина («Биолот», СанктПетербург, РФ) при 370C во влажной атмосфере с 5% CO2. – 41 – Рисунок 2.1. Эндотелиальные клетки человека линии EA.hy 926. Фазовый контраст. Увеличение х100. Рисунок 2.2. Клетки моноцитоподобной линии ТНР-1. Окраска по Романовскому-Гимзе. Увеличение х200. – 42 – Пересев проводили 1 раз в 2-3 дня, добавлением равного количества полной культуральной среды. Для культивирования использовали пластиковые флаконы объемом 50 мл («Sarstedt», Австрия). Жизнеспособность клеток до и после инкубации с компонентами бактерий оценивали путем инкубации в 0,2% растворе трипанового синего. Жизнеспособность составляла не менее 95%. 2.2. Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови доноров Для выделения мононуклеарных лейкоцитов использовали донорскую кровь, взятую из локтевой вены здоровых доноров обоих полов в возрасте от 18 до 50 лет (Отделение переливания крови, Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П. Павлова). В качестве антикоагулянта использовали препарат гепарина (20-25 ЕД на 1 мл крови). Разделение фракций гранулоцитов и мононуклеарных лейкоцитов проводили с помощью осаждения клеток на градиенте плотности фиколлверографина («Биолот», Санкт-Петербург, РФ). Цельную кровь разводили в 2 раза в растворе Версена («Биолот», Санкт-Петербург, РФ), 10 мл разведенной крови наслаивали на 3,5 мл раствора фиколл-верографина и центрифугировали в горизонтальном роторе при 400g в течение 40 минут. Мононуклеарные лейкоциты (рис. 2.3) отбирали из интерфазного кольца, образовавшегося на границе смеси фиколл-верографин и разведенной крови, и отмывали 3 раза в растворе Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург, РФ). Жизнеспособность клеток определяли с помощью окраски 0,2% раствором трипанового синего, количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Доля моноцитов во взвеси мононуклеарных лейкоцитов составляла 10-20%. Мононуклеарные лейкоциты ресуспендировали в полной культуральной среде RPMI-1640 («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) с добавками, без НАТ или в среде RPMI-1640 с 2,5% содержанием сыворотки с добавками, без НАТ. В дальнейшем клеточную суспензию использовали для изучения взаимодействия моноцитов с эндотелиальными клетками линии EA.Hy 926. 2.3. Приготовление и окраска мазков клеток На обезжиренное предметное стекло наносили каплю суспензии клеток и равномерно распределяли ее по стеклу и высушивали на воздухе. После полного – 43 – высыхания мазок фиксировали метиловым спиртом в течение 2 мин. 2.3.1. Окраска по Май-Грюнвальду Высушенный мазок помещали на 5 минут в неразведенный раствор эозината метиленового синего в метиловом спирте, после чего добавляли равное количество дистиллированной воды и окрашивали еще 10 минут. После окраски препарат ополаскивали дистиллированной водой и высушивали. 2.3.2. Окраска по Романовскому-Гимзе Высушенный и фиксированный (или окрашеный по Май-Грюнвальду) мазок помещали на 10 минут в свежеприготовленный раствор красителя (смесь азура II – эозина, разведенная в дистиллированной воде). После окраски мазок ополаскивали дистиллированной водой и высушивали. Препараты фотографировали с помощью микроскопа Axio Observer D1 (Zeiss, Германия). Рисунок 2.3. Лейкоциты периферической крови человека. Окраска по Май-Грюнвальду и Романовскому-Гимзе. Увеличение х1000. 2.4. Характеристика супернатанта разрушенных S. pyogenes Супернатант разрушенных стрептококков (СРС) был приготовлен из Streptococcus pyogenes серологической группы А (тип М22, штамм AL168) сотрудником отдела – 44 – Молекулярной Микробиологии ФГБУ «НИИ Экспериментальной Медицины» СЗО РАМН д.м.н. Л.А. Буровой. Данный штамм был предоставлен Dr. Lindahl (Отдел лабораторной медицины Лундского Универcитета, Лунд, Швеция). В суточной культуре стрептококка количественными высевами контролировали концентрацию бактерий и доводили до стандартной 2,5 – 5,0 • 108 КОЕ/мл. Ультразвуковая дезинтеграция стрептококков проводилась в объеме 5 мл взвеси бактерий в забуференном физиологическом растворе при pH 7,0 трижды в течение 30 секунд при частоте 22 kHz и мощности 0,6-0,7 мА на дезинтеграторе (MSE, Великобритания). После центрифугирования при 14 000 об/мин супернатант подвергали стерилизации с использованием фильтров Filtropure S с размером пор 0,45 микрон («Sarstedt», Germany). В экспериментах использовали СРС в разведениях 1:25-1:2000. Все исследуемые концентрации были нетоксичны для клеток. В работе использовали коммерческие препараты: рекомбинантного TNFα «Рефнолин» (специфическая активность 1ЕД - 0,06 нг) в концентрации 100 ЕД/мл, («Рефнолин», НПО «Фермент», «Sanitas», Литва) и форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА) в концентрации 50 нг/мл (“Sigma”, США). 2.5. Оценка интенсивности апоптоза и некроза в исследуемых культурах Проводили посев эндотелиальных клеток линии EAhy 926 в 6-луночный планшет («Sarstedt», Австрия) из расчета 250 тыс клеток в лунку в 2 мл полной культуральной среды (ПКС) DMEM/F12 с добавками. Клетки инкубировали 24 часа во влажной атмосфере с 5% CO2 при 37ºС. После чего вносили СРС в разведении 1:25. Через 24 часа после 20 минутной экспозиции в растворе Версена («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) содержимое каждой лунки собирали в микропробирки. Свежевыделенные мононуклеарные лейкоциты вносили в лунки 24-луночного планшета («Sarstedt», Австрия) в концентрации 106 клеток в 1 мл полной культуральной среды RPMI 1640 с добавками без НАТ. Клетки инкубировали 4 часа в присутствии СРС в разведении 1:50. Клетки линии ТНР-1 вносили в лунки 24-луночного планшета в концентрации 0,5*106 клеток в 1 мл полной культуральной среды RPMI 1640 с добавками без НАТ. Клетки инкубировали 24 часа в присутствии СРС в разведении 1:25. – 45 – После окончания инкубации клетки собирали в микропробирки. Пробоподготовку и анализ образцов проводили с помощью стандартных коммерческих наборов фирмы «Beckman Coulter» (США), в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки осаждали центрифугированием, надосадок удаляли и ресуспендировали в 100 мкл связывающего буфера (4ºС). Производили окрашивание клеточной суспензии аннексином, меченным FITC (флуоресцеин изотиоционат), и 7-AAD (7-аминоактиномицин-D) при 4ºС 15 минут в темноте. Аннексин-V – молекула, которая связывается с фосфатидилсерином, экспрессирующимся на поверхности апоптотических клеток. 7-AAD свободно проникает в ядро и связывается с G≡C ДНК, когда происходит разрушение цитоплазматической и ядерной мембраны, что характерно для некроза и поздней стадии апоптоза. После инкубации добавляли 400 мкл связывающего буфера (4ºС). Измерение образцов проводили с помощью проточного цитофлуориметра Navios (Beckman Coulter, США). Проводили анализ исследуемых образцов в координатах FL-2-красная флюоресценция (ось абсцисс) и FL-1-зеленая флюоресценция (ось ординат) (рис. 2.4). Рисунок 2.4. Гистограмма, демонстрирующая количество клеток в стадиях раннего апоптоза, позднего апоптоза и некроза. Гейт АВ1 – процент клеток в раннем апоптозе, гейт АВ2 – процент клеток в позднем апоптозе, гейт АВ4 – процент клеток в некрозе. – 46 – 2.6. Оценка адгезионной активности моноцитов крови человека и клеток линии ТНР-1 2.6.1. Оценка адгезионной активности клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток Для исследования интенсивности адгезии клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток использовали метод, основанный на окраске внутриклеточного белка витальным флуоресцентным красителем carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) («Sigma», США). Предварительно эндотелиальные клетки культивировали в 96-луночном планшете до образования конфлюэнтного монослоя. В некоторых случаях проводили 24-часовую преинкубацию в присутствии СРС и TNFα только клеток ТНР-1, только эндотелиальных клеток или клеток обеих линий. После окончания преинкубации клетки линии THP-1 доводили до концентрации 106 клеток в 1 мл раствора Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург) и окрашивали путем 10 минутной инкубации в растворе CFSE на PBS («Sigma», США) в концентрации 0,0005 мг/мл во влажной атмосфере при 370C с последующей отмывкой холодным раствором Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург). Окрашенные клетки (в концентрации 150 тыс. в 100 мкл ПКС) вносили в лунки с эндотелиальными клетками. Одновременно вносили TNFα и СРС в исследуемых разведениях. Клетки инкубировали 1 час во влажной атмосфере с 5% СО2 при 370С. После инкубации проводили трехкратную отмывку от неадгезировавших клеток раствором Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург). После чего клетки лизировали при помощи лизирующего буфера (2М КОН на PBS). Интенсивность флюоресценции измеряли с помощью прибора Fluoroskan Ascent FL (Termoelectron Corporation, США) при длине волны 485 нм. Для изучения механизмов адгезии клеток ТНР-1 к эндотелиальным клеткам в присутствии СРС проводили предварительную 16-часовую инкубацию клеток линии ТНР1 с токсином коклюша («Sigma», США) в концентрации 25 нг/мл и 100 нг/мл. Для индукции экспрессии адгезионных молекул эндотелиальные клетки инкубировали в присутствии TNFα в концентрации 50 ЕД/мл в течение 24 часов. Далее эксперимент проводили согласно описанной методике (см. выше). – 47 – 2.6.2. Оценка адгезионной активности моноцитов крови к монослою эндотелиальных клеток За 3 дня до опыта проводили посев эндотелиальных клеток EA.hy 926 в 12луночный планшет («Nunc», Дания) из расчета 300 тыс. клеток в лунку в 2 мл полной культуральной среды DMEM/F12 с добавками. Клетки инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 при 37ºС. В некоторых экспериментах после достижения конфлюэнтности монослоя за 4 часа до опыта в опытные лунки вносили СРС или TNFα. Через 4 часа проводили однократную отмывку эндотелиальных клеток раствором Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург, РФ), после чего в лунки вносили суспензию мононуклеарных лейкоцитов из расчета 2 млн. клеток в 2 мл полной культуральной среды DMEM/F12 с добавками без НАТ и исследуемые вещества и инкубировали в течение 1 часа. После часовой инкубации при 37ºС во влажной атмосфере с 5% CO2 неадгезировавшие клетки удаляли двукратной отмывкой теплым раствором Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург, РФ). Содержимое каждой лунки собирали путем 20 минутной экспозиции в растворе Версена («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) и помещали в микропробирки. Клетки осаждали центрифугированием, надосадок удаляли, проводили однократную отмывку клеток в PBS, содержащим 0,1% NaN3 («Helicon», Москва, РФ). Оценку количества адгезировавших моноцитов проводили с помощью проточного цитофлуориметра Epics Altra фирмы «Beckman Coulter» с использованием моноклональных антител против поверхностной молекулы CD14 («Beckman Coulter» США), меченых FITC. Проводили выделение мононуклеарных лейкоцитов в координатах прямое светорассеяние прямого и бокового светорассеяния (рис. 2.5). Мононуклеарные лейкоциты CD14+ боковое светорассеяние CD14-FITC Рисунок 2.5. Выделение популяции моноцитов (CD14+ клеток) при оценке интенсивности адгезии моноцитов крови человека к эндотелиальным клеткам. – 48 – Затем клетки, попавшие в выделенный гейт, анализировали по экспрессии CD14маркера. Популяция эндотелиальных клеток выделялась на гистограмме как более гранулярные и большие по размеру клетки. Результаты выражали в процентах, за 100% принимали количество адгезировавших моноцитов в контрольных лунках. 2.6.3. Оценка адгезионной активности мононуклеарных лейкоцитов крови к пластику В лунки 96-луночного планшета вносили свежевыделенные мононуклеарные лейкоциты в концентрации 0,5 × 106 клеток в лунку в 100 мкл культуральной среды RPMI («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) с добавками с 2,5% сыворотки. В опытные лунки вносили СРС в концентрации 1:50 и TNFα в концентрации 50 ЕД/мл (1ЕД - 0,06 нг). После инкубации в течение 2 часов во влажной атмосфере с 5% CO2 при 37ºС проводили однократную отмывку от неадгезировавших клеток теплым раствором Хенкса («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) и добавляли в лунки по 50 мкл 0,2%-раствора кристаллическогофиолетового (Шосткинский завод химреактивов, РФ) на 5% растворе метанола. После 15минутной окраски проводили трехкратную отмывку лунок дистиллированной водой. Препараты высушивали и фотографировали (увеличение ×200) с помощью микроскопа Axio Observer.D1 (Zeiss, Германия). Для экстракции красителя во все лунки вносили по 100 мкл 10% уксусной кислоты и инкубировали до полного растворения красителя. Оптическую плотность (ОП) учитывали с помощью автоматического спектрофотометра (“SLT-Spectra”, Австрия) при длине волны 570 нм. 2.7. Оценка миграционной активности моноцитов крови и клеток линии ТНР-1 Для изучения влияния компонентов стрептококка на направленную миграцию (хемотаксис) и трансэндотелиальную миграцию моноцитов крови и клеток линии ТНР-1 использовали модифицированные камеры Бойдена (трансвеллы) с диаметром пор 8 мкм (Becton Dickinson, США) (Dunzendorfer S., 1998). Для исследования трансэндотелиальной миграции клеток за день до опыта проводили посев эндотелиальных клеток EA.hy 926 в трансвеллы с диаметром пор 8 мкм (Becton Dickinson, США) из расчета 35-40 тыс. клеток в трансвелл в 250 мкл полной культуральной среды DMEM/F12 («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) с добавками. – 49 – Трансвеллы помещали в лунки 24-луночного планшета («Sarstedt», Австрия) и инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 при 37ºС до образования конфлюэнтного монослоя. Конфлюэнтность оценивали микроскопически. Для оценки хемотаксиса клеток свежевыделенные мононуклеарные лейкоциты или клетки ТНР-1 вносили в верхние камеры трансвелл, не содержащих эндотелиальные клетки (рис. 2.6). Рисунок 2.6. Схема эксперимента по изучению миграционной активности. Для оценки трансэндотелиальной миграции клеток свежевыделенные мононуклеарные лейкоциты или клетки ТНР-1 вносили в верхние камеры трансвелл с эндотелиальными клетками (рис. 2.7). Рисунок 2.7. Схема эксперимента по изучению трансэндотелиальной миграции. В нижние камеры трансвелл вносили по 600 мкл культуральной среды RPMI-1640 – 50 – содержащей СРС. В качестве положительного контроля использовали среду RPMI-1640 с 20%-содержанием сыворотки. После инкубации в течение 2 часов во влажной атмосфере с 5% CO2 при 37ºС содержимое нижних камер собирали в микропробирки («Sarstedt»). Клетки осаждали центрифугированием, после чего в микропробирки с клетками добавляли калибровочные бусы (Flow-count Fluorospheres, «Beckman Coulter» США). Абсолютное число цитофлуориметра мигрировавших Navios фирмы клеток оценивали «Beckman Coulter», с помощью согласно проточного рекомендациям производителя. Результаты выражали в процентах от числа спонтанно мигрировавших клеток. 2.7.1. Оценка миграционной активности клеток линии ТНР-1 Большинство хемоаттрактантов взаимодействуют с клеткой через рецепторы, сопряженные с G-белками (Penela et al., 2014). Одним из ингибиторов сигнала о GPCR является токсин коклюша (Fabbri et al., 1999). Для оценки характера влияния СРС на миграцию клеток в некоторых экспериментах за 16 часов до опыта во флаконы с клетками ТНР-1 (концентрация 106 клеток в 1 мл ПКС) вносили токсин коклюша («Sigma», США) в концентрации 100 нг/мл и инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 при 37ºС. Интактные (или преинкубированные с токсином коклюша) клетки линии ТНР-1 вносили в верхние камеры трансвелл в концентрации 0,5 × 106 клеток в лунку в 250 мкл культуральной среды RPMI («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) c 2,5% содержанием сыворотки. Эксперимент проводили по стандартной схеме (рис. 2.6 или рис. 2.7). 2.7.2. Оценка миграционной активности моноцитов крови человека Свежевыделенные мононуклеарные лейкоциты крови человека вносили в верхние камеры трансвелл в концентрации 2 × 106 клеток в лунку в 250 мкл культуральной среды RPMI («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) c 2,5% содержанием сыворотки. Для оценки характера влияния СРС на миграционную активность моноцитов крови в некоторых экспериментах в верхние камеры трансвелл добавляли токсин коклюша («Sigma», США) в концентрации 100 нг/мл. Далее эксперимент проводили по стандартной схеме (рис. 2.6 или рис. 2.7). После 2-часовой инкубации содержимое нижних камер собирали в микропробирки («Sarstedt»). Клетки осаждали центрифугированием и инкубировали в присутствии мАт – 51 – против поверхностной молекулы CD14 (Beckman Coulter, США), меченных FITC 25 минут при комнатной температуре в темноте. После отмывки PBS, содержащим 0,1% NaN3 («Helicon», Москва, РФ), добавляли калибровочные бусы (Flow-count Fluorospheres, «Beckman Coulter» США). С помощью проточного цитофлуориметра Navios фирмы «Beckman Coulter» подсчитывали абсолютное число мигрировавших моноцитов. Для этого проводили выделение мононуклеарных лейкоцитов в координатах прямого и бокового светорассеяния; клетки, попавшие в выделенный гейт, анализировали по экспрессии CD14-маркера (рис. 2.8). Затем проводили подсчет количества CD14+-клеток в образцах. Результаты для каждого донора выражали в процентах от числа спонтанно мигрировавших клеток. прямое светорассеяние Мононуклеарные лейкоциты CD14+ боковое светорассеяние CD14-FITC Рисунок 2.8. Выделение популяции моноцитов крови (СD14+ клеток) при оценке миграционной активности моноцитов крови человека. Для оценки адгезивности мононуклеарных лейкоцитов к мембране трансвелл после окончания хемотаксиса удаляли содержимое верхних камер и проводили окрашивание наружной стороны мембраны трансвелл 0,2% раствором кристаллического-фиолетового (Шосткинский завод химреактивов, РФ) на 5% растворе метанола. После 15-минутной окраски проводили отмывку мембран дистиллированной водой. Препараты высушивали и фотографировали (×100). Интенсивность адгезии оценивали при помощи микроскопа Axio Observer.D1 (Zeiss, Германия). Проводили подсчет адгезировавших клеток на одинаковых по площади участках мембран (программа AxioVision). – 52 – 2.8. Исследование уровней экспрессии адгезионных молекул Экспрессию адгезионных молекул на поверхности моноцитов, эндотелиальных клеток или клеток линии ТНР-1 оценивали с помощью моноклональных антител против CD49d, CD29, CD62p меченых FITC (Beckman Coulter, США) и CD54, CD11b, CD62L, CD162, CD106, меченых РЕ (фикоэритрин) (Becton Dickinson and Company, США). Время инкубации клеток с СРС или TNFα составляло 2 часа. Клетки инкубировали в присутствии мАт соответствующей специфичности 25 минут при комнатной температуре в темноте. После двукратной отмывки PBS, содержащим 0,1% NaN3 («Helicon», Москва, РФ). Интенсивность флюоресценции оценивали с помощью проточного цитофлуориметра Navios («Beckman Coulter», США). Результаты выражали средними значениями интенсивности флюоресценции (mean fluorescence intensity – MFI). 2.9. Количественная оценка цитокинов в супернатантах Концентрацию цитокинов TNFα, IL-6 и IL-8 в супернатантах мононуклеарных лейкоцитов определяли методом иммуноферментного анализа с помощью микропланшетного анализатора («Bio-Rad», США) и коммерческих наборов фирмы ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург, РФ). Анализ проводили согласно рекомендациям производителя. Время инкубации клеток с СРС составляло 2 часа. 2.10. Исследование уровней экспрессии фосфокиназ Уровень экспрессии фосфокиназ NFκB и р38 оценивали с использованием моноклональных антител против фосфо-р38 и фосфо-NFκB (BD Pharmingen, США), меченых AlexaFluor 488. Пробоподготовку и анализ образцов проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Предварительно проводили подбор времени оптимального для оценки экспрессии киназ, что соответствовало пику фосфорилирования молекулы и максимальному уровню MFI. Для этого клетки вносили в микропробирки («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) из расчета по 106 клеток в 1 мл ПКС RPMI с добавками и инкубировали в присутствии стандартного индуктора РМА в течение 5, 15 и 30 минут при 37ºС. После окончания инкубации мононуклеарные лейкоциты фиксировали и пермеабилизировали с помощью Intra Prep fixation/permeabilisation Kit (Beckman Coulter, США). Проводили окрашивание – 53 – клеточной суспензии моноклональными антителами, меченными Alexa Fluor 488, 30 минут в темноте. Образцы анализировали на приборе Navios (Beckman Coulter, США). Проводили выделение популяции моноцитов в кординатах прямого и бокового светорассеяния (рис. 2.9). Затем клетки, попавшие в выделенный гейт, анализировали по экспрессии фосфор38 или фосфо-NFκB. Результаты выражали средними значениями интенсивности прямое светорассеяние флюоресценции (MFI). Моноциты боковое светорассеяние Рисунок 2.9. Диаграмма распределения мононуклеарных лейкоцитов крови в координатах прямого и бокового светорассеяния. Для оценки влияния компонентов стрептококка на экспрессию фосфо-р38 и фосфоNFκB суспензию мононуклеарных лейкоцитов вносили в микропробирки («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) из расчета по 2 млн клеток в 1 мл ПКС RPMI («Биолот», СанктПетербург, РФ) с СРС и с РМА в качестве положительного контроля и инкубировали в течение 15 минут. Для оценки влияния компонентов стрептококка на экспрессию фосфо-NFκB в эндотелиальных клетках или клетках линии ТНР-1 суспензию клеток вносили в микропробирки («Биолот», Санкт-Петербург, РФ) из расчета по 0,5 млн клеток в 1 мл ПКС с СРС и с TNFα качестве положительного контроля и инкубировали в течение 15 минут. После окончания инкубации клетки фиксировали и пермеабилизировали с помощью Intra Prep fixation/permeabilisation Kit (Beckman Coulter, США). Проводили окрашивание клеточной суспензии моноклональными антителами и анализ образцов, как описано выше. – 54 – 2.11. Статистическая обработка результатов Оценку достоверности различий между средними значениями в контрольных и опытных выборках проводили методом однофакторного дисперсионного анализа; попарное сравнение средних проводили с использованием апостериорных критериев (критерий Тьюки и критерий Т3 Даннета) или критерием Стьюдента с помощью пакетов программ Axio Vision 4.7, Kaluza Flow Analysis Software, Navios Software 1.0, Microsoft Office Excel 2010, IBM SPSS Statistics 20, STATISTICA 7.0. – 55 – ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции клеток линии ТНР-1 3.1.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток Для осуществления большинства функций моноцитов необходима их адгезия к эндотелию сосудов. В качестве стандартного вещества, усиливающего адгезию клеток моноцитоподобной линии ТНР-1 к эндотелию, был выбран провоспалительный цитокин TNFα. Механизмы усиления адгезионной активности лейкоцитов под влиянием этого цитокина в настоящее время хорошо изучены. Для исследования интенсивности адгезии клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток использовали метод, основанный на окраске внутриклеточного белка витальным флуоресцентным красителем CFSE. Интенсивность флюоресценции измеряли с помощью прибора Fluoroskan Ascent FL. Результаты экспериментов показали, что в присутствии TNFα адгезия клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток достоверно усиливалась по сравнению с их спонтанной адгезией (табл. 3.1). В присутствии СРС интенсивность адгезии клеток линии ТНР-1 к эндотелиальным клеткам была выше по сравнению с интенсивностью адгезии этих клеток в культуральной среде (табл. 3.1). Дозозависимости эффекта выявлено не было. Таблица 3.1. Адгезия клеток ТНР-1 к эндотелиальным клеткам в присутствии супернатанта разрушенных стрептококков (1 час). Доля адгезировавших клеток, % (M±SD) В культ. среде (контроль) В присутствии TNFα В присутствии супернатанта разрушенных стрептококков 1:25 1:50 1:100 100,00±15,35 122,16±47,60 136,20±57,04 144,77±59,83 127,92±40,15 n=27 n=31 * n=30 ** n=30 *** n=28 ** *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.01). – 56 – а. б. Рисунок 3.1. Адгезия клеток линии ТНР-1 к эндотелиальным клеткам человека: (а) спонтанная адгезия, (б) адгезия в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes. Клетки линии ТНР-1 окрашены CFSE. Микрофотографии получены в результате совмещения снимков объектов в фазовом контрасте и флуоресцентном режиме. Фильтр Alexa Fluor 488. Увеличение х100. – 57 – Для того чтобы оценить вклад активации эндотелиальных клеток и клеток ТНР-1 в наблюдаемое нами усиление адгезии проводили серию дополнительных экспериментов с 24-часовой преинкубацией в присутствии СРС. В качестве положительного контроля использовали провоспалительный цитокин TNFα. Преинкубация эндотелиальных клеток с TNFα приводила к усилению адгезии к ним как интактных клеток ТНР-1, так и преинкубированных с TNFα. Напротив, при проведении предварительной инкубации с TNFα клеток ТНР-1 наблюдалось снижение их адгезии к интактным эндотелиальным клеткам (табл. 3.2). Таблица 3.2. Адгезия клеток линии ТНР-1 к эндотелиальным клеткам в присутствии супернатанта разрушенных стрептококков (24-часовая преинкубация клеток). Преинкубация клеток с СРС (или TNFα) Доля адгезировавших клеток, % (M±SD) В культ. среде (контроль) В присутствии TNFα В присутствии супернатанта разрушенных стрептококков 1:25 1:50 72,8±26,1 55,9±28,4 69,7±29,3 100,0±15,4 ТНР-1 *** *** *** n=27 n=22 n=22 n=21 562,5±382,7 127,4±37,3 130,5±45,3 100,0±15,4 ЭК *** ** ** n=27 n=23 n=23 n=23 389,0±376,6 65,9±27,8 74,6±12,4 100,0±15,4 THP-1 и ЭК *** *** *** n=27 n=22 n=22 n=20 *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). 1:100 67,1±22,8 *** n=20 123,8±40,2 ** n=23 83,7±21,7 ** n=20 ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.01). Преинкубация клеток ТНР-1 с СРС приводила к снижению интенсивности их адгезии к эндотелию, независимо от того проводилась преинкубация эндотелия с СРС или нет. В случае проведения предварительной инкубации с СРС эндотелиальных клеток интенсивность адгезии к ним интактных клеток THP-1 достоверно возрастала (табл. 3.2). Очевидно, что усиление адгезии клеток в случае TNFα обусловлено, главным образом, влиянием на свойства эндотелиальных клеток. Напротив, повышение адгезионной активности клеток в присутствии СРС зависело от активизации свойств клеток ТНР-1. – 58 – 3.1.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию клеток линии ТНР-1 Интенсивность миграции клеток ТНР-1 оценивали методом проточной цитометрии с использованием калибровочных бус (рис. 3.2). Рисунок 3.2. Трансэндотелиальная миграция клеток линии ТНР-1: (а) спонтанная миграция, (б-в) миграция в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes (б – разведение 1:50; в – разведение 1:25). В качестве положительного контроля трансэндотелиальной миграции клеток использовали культуральную среду с 20% содержанием сыворотки. Было показано статистически значимое усиление трансмиграции клеток линии ТНР-1 в среде с 20% содержанием сыворотки (табл. 3.3). Таблица 3.3. Трансэндотелиальная миграция клеток линии ТНР-1 под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков. Доля мигрировавших клеток, % (M±SD) В культ. среде (контроль) В среде с 20% FCS 100,00±9,80 n=18 189,99±67,87 n=8 *** В присутствии супернатанта разрушенных стрептококков в разведении 1:25 1:50 1:100 339,51±69,00 n=3 *** 338,33±133,92 n=11 *** 259,95±75,55 n=6 *** *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). Трансэндотелиальная миграция клеток линии ТНР-1 в присутствии СРС во всех исследуемых разведениях достоверно усиливалась по сравнению с контролем (табл. 3.3). – 59 – 3.1.3. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграционную активность клеток линии ТНР-1 Миграция лейкоцитов в субэндотелиальное пространство осуществляется по градиенту концентрации хемоаттрактантов. Функцию хемоаттрактантов могут выполнять продукты и компоненты бактерий (Bokoch M.G., 1995, Johnston and Butcher, 2002; Mantovani et al., 1997). В данной серии экспериментов изучали хемоаттрактное действие продуктов разрушения S. pyogenes методом проточной цитометрии с использованием калибровочных бус (рис. 3.3). Рисунок 3.3. Миграция клеток линии ТНР-1: (а) спонтанная миграция, (б-г) миграция в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes (б – разведение 1:100; в – разведение 1:50; г – разведение 1:25). В качестве положительного контроля использовали культуральную среду с 20% сыворотки. Интенсивность миграции клеток линии ТНР-1 в присутствии среды с 20% содержанием сыворотки повышалась в три раза по сравнению с контролем (табл. 3.4). Таблица 3.4. Миграционная активность клеток линии ТНР-1 под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков. Доля мигрировавших клеток, % (M±SD) В культ. среде (контроль) В среде с 20% FCS В присутствии супернатанта разрушенных стрептококков в разведении 1:25 1:50 1:100 100,00±6,73 299,70±120,37 534,57±171,36 397,80±166,25 159,02±66,88 n=15 n=3 *** n=3 *** # n=12 *** # n=3 ** *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.01). # - различия статистически значимы по сравнению с миграционной активностью в присутствии СРС (1:100) (p<0.05). – 60 – В присутствии СРС в нижней камере наблюдалось статистически значимое дозозависимое усиление миграции клеток линии ТНР-1 по сравнению со спонтанной миграцией (табл. 3.4). Усиленная миграция клеток в присутствии СРС могла быть связана как с его хемоаттрактантным эффектом (направленная миграция), так и увеличением подвижности клеток (ненаправленная миграция). Для уточнения характера эффекта исследовали зависимость миграции клеток ТНР-1 от присутствия СРС в верхней и нижней камерах трансвелл (табл. 3.4а). Таблица 3.4а. Зависимость миграции клеток ТНР-1 от присутствия супернатанта разрушенных стрептококков в верхней и нижней камерах трансвелл. Доля мигрировавших клеток, % (m±SD) Нижняя камера Культуральная среда Верхняя камера Культуральная СРС 1:50 среда 100,00±16,76 n=9 96,49±44,32 n=4 629,47±261,45 251,60±43,93 n=5 *** # n=4 *** *** - различия статистически значимы по сравнению с миграцией в культуральной среде СРС 1:50 (p<0.001). # - различия статистически значимы по сравнению с миграцией в присутствиии СРС в обеих камерах (p<0.05). В случае, когда СРС находился только в верхней камере, интенсивность миграции клеток ТНР-1 достоверно не отличалась от контроля. Интенсивность миграции клеток при наличии СРС в обеих камерах была достоверно ниже, чем интенсивность миграции в присутствии СРС только в нижней камере, но выше, чем в контроле. Таким образом, СРС усиливал направленную миграцию клеток ТНР-1 (табл. 3.4а). 3.1.4. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии адгезионных молекул на клетках линии ТНР-1 Все этапы трансэндотелиальной миграции зависят от активации лейкоцитов и эндотелиальных клеток, от усиления экспрессии на них адгезионных молекул. Оценивали изменения поверхностного фенотипа клеток линии ТНР-1 под влиянием СРС методом проточной цитометрии с использованием мАт против CD11b, CD49d и CD162 (рис. 3.4, табл. 3.5). – 61 – Рисунок 3.4. Изменения уровней экспрессии молекул на поверхности клеток моноцитоподобной линии ТНР-1 после 2-часовой преинкубации с супернатантом разрушенных стрептококков. Серым цветом показан контроль изотипических антител; зеленым - спонтанная экспрессия; красным – экспрессия в присутствии СРС 1:50. Таблица 3.5. Изменения моноцитоподобной уровней линии ТНР-1 экспрессии под молекул влиянием на поверхности супернатанта клеток разрушенных стрептококков. Адгезионная молекула на ТНР-1 CD49d CD162 CD11b Уровень экспрессии молекул, MFI (M±SD) Контроль изотипических антител 1,12±0,20 n=3 5,54±1,39 n=3 3,88±2,80 n=3 В культуральной среде (контроль) 5,04±2,36 n=3 23,91±7,47 n=4 4,83±4,10 n=3 В присутствии СРС (1:50) 4,82±2,23 n=3 22,7±6,76 n=4 4,40±4,21 n=3 Статистически значимых изменений уровней экспрессии молекул CD11b, CD49d и CD162 на поверхности клеток ТНР-1 после 2-часовой инкубации с супернатантом разрушенных S. pyogenes выявлено не было (табл. 3.5). – 62 – 3.1.5. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфо-NFκB в клетках линии ТНР-1 Распознавание консервативных структур бактерий с помощью PRR на поверхности эукариотических клеток запускает сигнальный каскад, приводящий к фосфорилированию транскрипционного фактора NF-κВ и последующей активации клеток. Проводили исследование изменений уровня экспрессии фосфо-NFκВ в клетках ТНР-1 в присутствии СРС методом проточной цитометрии с использованием мАт против фосфо-NFκВ, меченых Alexa Fluor 488. В качестве стандартного индуктора использовали TNFα. Под влиянием TNFα уровень экспрессии фосфо-NFκВ достоверно повышался (рис. 3.5, табл. 3.6). Рисунок 3.5. Уровни экспрессии фосфо-NFκВ клетками моноцитоподобной линии ТНР-1 Серым цветом показан контроль изотипических антител, зеленым – спонтанная экспрессия, красным – экспрессия в присутствии СРС 1:50. Супернатант разрушенных S. pyogenes не оказывал влияния на экспрессию фосфоNFκВ в клетках линии ТНР-1 (табл. 3.6). – 63 – Таблица 3.6. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфо-NFκВ в клетках линии ТНР-1. Инкубация в присутствии Контроль изотипических антител Культ. среды (контроль) СРС (1:50) TNFα Уровень экспрессии 120,00±26,21 174,20±25,27 182,30±16,78 фосфо-NFκВ, n=4 n=4 n=4 MFI (M±SD) * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.05). 254,10±65,93* n=4 3.1.6. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию клеток линии ТНР-1 (интактных и преинкубированных с токсином коклюша) к эндотелиальным клеткам Большинство эндогенных хемоаттрактантов и хемоаттрактанты бактериального происхождения взаимодействуют с клеткой через рецепторы, связанные с G-белками (Gprotein-coupled receptors, GPCR) (Penela et al., 2014, Bokoch M.G., 1995, Mantovani et al., 1997). Одним из ингибиторов сигнала от GPCR является токсин коклюша. Он катализирует ADP-рибозилирование α-субъединицы G-белка, в результате чего активация G-белка не происходит (Munoz and Afi, 1985; Fabbri et al., 1999). Изучали зависимость адгезионной активности, интенсивности миграции и трансмиграции клеток линии ТНР-1 в присутствии СРС после их 16-часовой преинкубации в присутствии токсина коклюша. Интенсивность адгезии клеток ТНР-1, окрашенных CFSE, к монослою эндотелиальных клеток оценивали с помощью прибора Fluoroskan Ascent FL. Как было показано ранее, под влиянием СРС достоверно усиливается адгезия интактных клеток ТНР-1 к эндотелиальным клеткам по сравнению с их спонтанной адгезией (табл. 3.1, 3.7). После преинкубации клеток ТНР-1 с токсином коклюша их спонтанная адгезия к эндотелию была достоверно ниже, чем спонтанная адгезия к эндотелию интактных ТНР1 (табл. 3.7). В присутствии компонентов стрептококка адгезионная активность преинкубированных с токсином клеток линии ТНР-1 была достоверно ниже, чем адгезионная активность интактных клеток (табл. 3.7). Адгезия преинкубированных с – 64 – токсином клеток ТНР-1 в присутствии СРС достоверно не отличалась от спонтанной адгезии этих клеток. Таблица 3.7. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию клеток линии ТНР-1 (интактных и преинкубированных с токсином коклюша) к эндотелиальным клеткам. Преинкубация ТНР-1 в присутствии Доля адгезировавших клеток, % (M±SD) Культуральная среда (контроль) В присутствии СРС (1:50) Культуральная среда 100,00±8,25 n=15 120,73±27,99* n=15 Токсин коклюша (25 нг/мл) 72,51±9,05*** n=21 81,34±26,99## n=21 Токсин коклюша 82,14±13,29*** 91,02±24,56# (100 нг/мл) n=21 n=21 *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.05). ## - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим значением адгезионной активности интактных клеток ТНР-1 (p<0.01) # - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим значением адгезионной активности интактных клеток ТНР-1 (p<0.05). Таким образом, блокирование сигнала от GPCR токсином коклюша полностью подавляло как спонтанную, так и индуцированную влиянием СРС адгезию клеток линии ТНР-1 к эндотелию. 3.1.7. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию интактных и преинкубированных с токсином коклюша клеток линии ТНР-1 Количество интактных и преинкубированных с токсином коклюша клеток ТНР-1, мигрировавших в нижние камеры трансвелл, оценивали методом проточной цитометрии с использованием калибровочных бус (рис. 3.6). – 65 – Рисунок 3.6. Трансэндотелиальная миграция клеток ТНР-1 (интактных и преикубированных с токсином коклюша). (а) спонтанная миграция интактных клеток, (б) миграция интактных клеток в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes (1:50) в нижней камере; (в) спонтанная миграция преинкубированных с токсином клеток, (г) миграция преинкубированных с токсином клеток в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes (1:50) в нижней камере. СРС оказывал стимулирующее влияние на трансэндотелиальную миграцию клеток моноцитоподобной линии ТНР-1. Это согласуется с полученными ранее данными в табл. 3.3. Спонтанная трансэндотелиальная миграция преинкубированных с токсином коклюша клеток ТНР-1 была достоверно ниже, чем спонтанная трансмиграция интактных клеток (табл. 3.8). Таблица 3.8. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию клеток линии ТНР-1 (интактных и преинкубированных с токсином коклюша). Преинкубация ТНР-1 в присутствии Культуральная среда Доля мигрировавших клеток, % (M±SD) В культуральной среде (контроль) В присутствии СРС (1:50) 100,00±17,25 n=10 313,69±98,29 n=10 *** Токсин коклюша 24,93±10,32 57,64±22,21 (100 нг/мл) n=8 *** ### n=8 *** ### *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). ### - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим значением интенсивности миграции интактных клеток ТНР-1 (p<0.001). Под влиянием СРС было выявлено достоверное снижение трансмиграции – 66 – преинкубированных с токсином клеток ТНР-1 по сравнению с трансэндотелиальной миграцией интактных клеток ТНР-1 (табл. 3.8). 3.1.8. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на интенсивность миграции интактных и преинкубированных с токсином коклюша клеток линии ТНР-1 Под влиянием компонентов стрептококка наблюдалось статистически значимое усиление направленной миграции интактных клеток линии ТНР-1 по сравнению со спонтанной миграцией этих клеток (табл. 3.9). Это согласуется с полученными ранее данными в п. 3.2.1.3 (табл. 3.4). Рисунок 3.7. Миграция клеток ТНР-1 (интактных и преикубированных с токсином коклюша) (а) спонтанная миграция интактных клеток, (б) миграция интактных клеток в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes (1:50) в нижней камере; (в) спонтанная миграция преинкубированных с токсином клеток, (г) миграция преинкубированных с токсином клеток в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes (1:50) в нижней камере. Преинкубация клеток ТНР-1 с токсином коклюша приводила к снижению интенсивности их спонтанной миграции, по сравнению с интенсивностью спонтанной миграции интактных клеток. Направленная миграция преинкубированных с токсином коклюша клеток ТНР-1 в присутствии СРС была достоверно ниже, чем миграция интактных клеток ТНР-1 в присутствии СРС (табл. 3.9). – 67 – Таблица 3.9. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на интенсивность миграции клеток линии ТНР-1 (интактных и преинкубированных с токсином коклюша). Преинкубация ТНР-1 в присутствии Доля мигрировавших клеток, % (M±SD) в культуральной среде (контроль) В присутствии СРС (1:50) 100,00±3,21 n=14 431,59±158,30 n=10 *** Культуральная среда Токсин коклюша 21,80±8,15 71,22±15,72 (100 нг/мл) n=5 *** ### n=5 *** ### *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.01). ### - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим значением интенсивности миграции без преинкубации с токсином (p<0.001). Обобщая полученные данные, можно заключить, что преинкубация клеток ТНР-1 с токсином коклюша приводила к снижению адгезионной активности этих клеток, а так же к снижению спонтанной и индуцированной продуктами разрушения S. pyogenes миграции и трансэндотелиальной миграции этих клеток. 3.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции моноцитов периферической крови человека 3.2.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию моноцитов крови человека к монослою эндотелиальных клеток Начальным этапом процесса трансэндотелиальной миграции лейкоцитов в субэндотелиальное пространство является их адгезия к эндотелию сосудов. Для оценки влияния СРС на этот этап проводили серию экспериментов по адгезии моноцитов крови к монослою эндотелиальных адгезировавших клеток. CD14+-клеток в Для этого образцах проводили методом подсчет проточной количества цитометрии с использованием моноклональных антител против CD14, меченных FITC (рис. 2.5, рис 3.8.). В качестве стандартного индуктора использовали провоспалительный цитокин TNFα. В наших экспериментах в присутствии TNFα адгезия моноцитов к эндотелиальным клеткам усиливалась в два раза по сравнению с контролем (табл. 3.10). – 68 – Рисунок 3.8. Адгезия моноцитов крови человека (а) спонтанная адгезия, (б) адгезия в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes, (в) адгезия после преинкубации эндотелиальных клеток с супернатантом разрушенных S. pyogenes В присутствии супернатанта разрушенных ультразвуком S. pyogenes наблюдалось статистически значимое усиление адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам по сравнению со спонтанной адгезией моноцитов (табл. 3.10). Таблица 3.10. Адгезия моноцитов крови человека к монослою эндотелиальных клеток. Доля адгезировавших клеток, % (M±SD) В культ. среде (контроль) В присутствии СРС (1:50) После преинкубации ЭК с СРС (1:50) В присутствии TNFα После преинкубации ЭК с TNFα 100,00±5,61 n=14 216,94±87,11 n=12 *** 232,18±92,39 n=6 *** 200,45±99,34 n=11 *** 426,20±194,71 n=6 *** ## *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). ## - различия статистически значимы по сравнению с количеством адгезировавших клеток в присутствии TNFα, без преинкубации (p<0.01). Для оценки вклада эндотелиальных клеток и моноцитов в этот процесс изучали интенсивность их адгезии в тех же условиях, но после предварительной 4-часовой инкубации эндотелиальных клеток с исследуемыми веществами. Результаты экспериментов показали, что адгезия моноцитов к преинкубированному с TNFα монослою эндотелиальных клеток усиливалась почти в два раза по сравнению с адгезией клеток в присутствии TNFα (табл. 3.10). Напротив, преинкубация эндотелиальных клеток с СРС не оказывала влияния на интенсивность адгезии моноцитов. Полученные данные позволяют предположить, что усиление адгезии моноцитов, – 69 – вызванное СРС, не было связано с изменением свойств эндотелиальных клеток, в то время как усиление адгезии клеток в присутствии TNFα обусловлено, главным образом, изменением свойств эндотелиальных клеток. 3.2.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на адгезию мононуклеарных лейкоцитов крови человека к пластику Для оценки влияния СРС на адгезионную активность самих мононуклеарных фагоцитов крови изучали их адгезию к пластику в присутствии СРС (рис. 3.9). В качестве положительного контроля был выбран TNFα. В присутствии TNFα адгезия лейкоцитов крови к пластику достоверно усиливалась (табл. 3.11). Независимо от времени инкубации СРС в высокой концентрации (разведение 1:50) достоверно усиливал адгезионную активность мононуклеарных лейкоцитов (рис. 3.9, табл. 3.11). Таблица 3.11. Адгезия мононуклеарных лейкоцитов крови человека к пластику. Доля адгезировавших клеток, % (M±SD) в присутствии Время инкубации лейкоцитов 2 часа культ. среда (контроль) 100,00±7,16 n=35 супернатант разрушенных стрептококков 1:50 1:1000 1:2000 115,48±14,22 n=41 *** 99,06±4,61 n=10 97,62±3,18 n=10 TNFα 105,17±8,41 n=26 * 100,00±3,92 165,58±40,12 119,44±15,68 112,71±10,71 107,69±11,56 n=18 n=18 *** n=18 *** n=18 *** n=17 * *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). 21 час * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.05). 2-часовая инкубация в присутствии СРС в низких концентрациях (разведения 1:1000, 1:2000) не оказывала статистически значимого влияния на адгезию лейкоцитов к пластику. При длительной инкубации лейкоцитов с СРС в низких концентрациях их адгезия к пластику достоверно увеличивалась (табл. 3.11). В совокупности, полученные результаты позволяют предположить, что усиление адгезии моноцитов к эндотелию в присутствии СРС было связано с изменением свойств самих моноцитов, а не эндотелиальных клеток. – 70 – а. б. Рисунок 3.9. Адгезия мононуклеарных лейкоцитов крови к пластику (2 часа): (а) спонтанная адгезия; (б) адгезия в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes. Клетки окрашены кристаллическим фиолетовым. Снимки сделаны в проходящем свете. Увеличение х200. – 71 – 3.2.3. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию моноцитов крови человека Для оценки влияния СРС на миграционную активность моноцитов проводили подсчет количества CD14+-клеток (рис. 2.8), мигрировавших в нижние камеры трансвелл, содержащих культуральную среду или среду с СРС. Подсчет количества клеток осуществляли с помощью проточного цитофлуориметра с использованием моноклональных антител против CD14, меченых FITC и калибровочных бус Flowcount Fluorospheres (рис. 3.10). Рисунок 3.10. Трансэндотелиальная миграция моноцитов крови человека (а) спонтанная трансмиграция, (б-г) трансмиграция в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes в нижней камере (б – разведение 1:50; в – разведение 1:500; г – разведение 1:1000). Внесение культуральной среды с 20% сыворотки в нижнюю камеру трансвелл в качестве положительного контроля приводило к достоверному усилению трансэндотелиальной миграции моноцитов по сравнению с контролем (табл. 3.12). Таблица 3.12. Трансэндотелиальная миграция моноцитов под влиянием СРС. Доля мигрировавших клеток, % (M±SD) В культуральной среде (контроль) 20% FCS В присутствии супернатанта разрушенных стрептококков 1:50 1:100 1:500 100,00±10,60 2193,28±960,47 73,89±33,83 81,28±41,45 87,76±7,74 n=19 n=4 *** n=18 ** n=7 n=5 *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). 1:1000 84,98±15,99 n=6 ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.01). В присутствии СРС в разведении 1:50 в нижней камере трансвелл трансмиграция моноцитов достоверно снижалась по сравнению с контролем. В низких концентрациях – 72 – (1:100, 1:500 и 1:1000) супернатант разрушенных S. pyogenes не оказывал статистически значимого влияния на миграцию моноцитов крови через монослой эндотелиальных клеток (табл. 3.12). 3.2.4. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграцию моноцитов крови человека Подсчет моноцитов, мигрировавших в нижние камеры трансвелл, осуществляли методом проточной цитометрии с использованием мАт против CD14, меченных FITC и калибровочных бус Flowcounts Fluorospheres (рис. 3.11). Рисунок 3.11. Миграция моноцитов крови человека (а) спонтанная миграция, (б-в) миграция в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes в нижней камере (б – разведение 1:50; в – разведение 1:2000). Были проведены серии экспериментов, целью которых было выявление хемоаттрактного действия супернатанта разрушенных S. pyogenes по отношению к моноцитам крови человека. В качестве положительного контроля использовали среду с 20% сыворотки. Было показано, что в присутствии в нижней камере трансвелл среды с 20% сыворотки миграция моноцитов (СD14+-клеток) усиливается более чем в 2 раза по сравнению с контролем (табл. 3.13). В проведенных экспериментах СРС оказывал разнонаправленное дозозависимое влияние на миграцию моноцитов (табл. 3.13). Миграция моноцитов в присутствии СРС в разведении 1:50 в нижней камере трансвелл была достоверно ниже, чем спонтанная миграция. Однако при использовании низких концентраций СРС (разведения 1:500, 1:1000, 1:2000) миграция этих клеток повышалась (табл. 3.13). – 73 – Таблица 3.13. Миграция моноцитов крови человека под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков. Доля мигрировавших клеток, % (M±SD) В культуральной среде (контроль) 20% FCS В присутствии супернатанта разрушенных стрептококков 1:50 1:500 1:1000 1:2000 100,0±13,8 276,1±144,6 73,0±55,4 123,8±31,8 144,7±54,9* 153,5±52,7 *** ** ** ** *** n=38 n=21 n=36 n=11 n=10 n=17 *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.01). Следует отметить, что по интенсивности миграции моноцитов крови в присутствии СРС в разведении 1:50 доноры разделились на две группы (табл. 3.13а). Таблица 3.13а. Миграция моноцитов крови доноров разных групп под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков. Группа 1 Группа 2 Доля мигрировавших клеток, % (M±SD) В присутствии супернатанта В культуральной среде разрушенных стрептококков 2,5 % FCS 20% FCS 1:50 1:2000 (контроль) 100,00±15,80 212,52±82,11 44,56±19,48 151,55±61,05 n=29 n=15 *** n=28 *** n=9 *** 100,00±0,49 n=9 435,19±149,30 n=6 *** 157.85±36,57 n=9 *** 155,68±45,57 n=8 ** *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.01). Примерно у 75% всех доноров миграция моноцитов достоверно снижалась в присутствии СРС в данной концентрации, в то время как моноциты крови у 25% доноров в тех же условиях мигрировали сильнее, чем в контроле. При этом у всех доноров в присутствии СРС в низкой концентрации (1:2000) миграция моноцитов была выше, чем в контроле (табл. 3.13а). Для оценки влияния СРС на адгезию мононуклеарных лейкоцитов к мембранам камер Бойдена подсчитывали количество адгезировавших клеток на одинаковых по размеру участках мембран (рис. 3.12, рис. 3.13). – 74 – а. б. Рисунок 3.12. Адгезия мононуклеарных лейкоцитов к мембранам камер Бойдена а) в культуральной среде; б) в присутствии супернатанта разрушенных стрептококков (разведение 1:50). Клетки окрашены кристаллическим фиолетовым. Снимки сделаны в проходящем свете. Увеличение х100. – 75 – Рисунок 3.13. Адгезия мононуклеарных лейкоцитов к мембранам трансвелл под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков (M±SD). Не было выявлено статистически значимых отличий числа клеток, адгезировавших к мембранам в присутствии СРС, от числа спонтанно адгезировавших клеток (рис. 3.13). Таким образом, снижение миграции моноцитов в присутствии СРС в разведении 1:50 не было обусловлено их повышенной адгезией к мембранам трансвелл. 3.2.5. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на миграцию интактных и преинкубированных с токсином коклюша моноцитов крови человека Изучали влияние СРС на интенсивность миграции моноцитов крови, инкубированных с токсином коклюша, который блокирует сигнал от GPCR. Подсчет клеток, мигрировавших в нижние камеры трансвелл, проводили методом проточной цитометрии с использованием мАт против CD14, меченных FITC и калибровочных бус (рис. 3.14). Спонтанная миграция инкубированных с токсином моноцитов не отличалась от контроля (табл. 3.16). В присутствии СРС интенсивность миграции инкубированных с токсином моноцитов была достоверно ниже, чем интенсивность миграции интактных моноцитов (табл. 3.14). – 76 – Рисунок 3.14. Миграция моноцитов крови человека (интактных и преикубированных с токсином коклюша) (а) спонтанная миграция интактных моноцитов, (б) миграция интактных моноцитов в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes (1:2000) в нижней камере; (в) спонтанная миграция преинкубированных с токсином моноцитов, (г) миграция преинкубированных с токсином моноцитов в присутствии супернатанта разрушенных S. pyogenes (1:2000) в нижней камере. Таблица 3.14. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на интенсивность миграции моноцитов крови (интактных и инкубированных с токсином коклюша). Инкубация моноцитов в присутствии Доля мигрировавших клеток, % (M±SD) В культ. среде (контроль) В присутствии СРС (1:2000) В культ. среде с 20% FCS Культуральной среды 100,00±26,44 n=11 169,58±37,87 n=10 *** 417,84±181,98 n=6 *** Токсина коклюша (100 нг/мл) 92,36±42,02 n=7 115,37±57,89 n=7 # 225,92±66,83 n=5 *** *** - различия статистически значимы по сравнению с долей интактных моноцитов мигрирующих в культуральной среде (р<0,001). # - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим значением интенсивности миграции интактных моноцитов (р<0,05). Таким образом, блокирование сигналов от GPCR токсином коклюша снижало миграцию моноцитов в присутствии СРС до спонтанного уровня. – 77 – 3.2.6. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии адгезионных молекул на моноцитах крови человека Адгезия лейкоцитов к эндотелиальным клеткам опосредована адгезионными молекулами, которые конститутивно или индуцировано экспрессируются на этих клетках. Проводили оценку влияния СРС на экспрессию адгезионных молекул на поверхности моноцитов крови методом проточной цитометрии с использованием мАт. Для этого выделяли моноциты в координатах прямого и бокового светорассеяния. Затем, клетки, попавшие в выделенный гейт, оценивали по экспрессии CD162, CD11b, CD29, CD49d или CD62L (рис. 3.15). Рисунок 3.15. Оценка уровней экспрессии адгезионных молекул на поверхности моноцитов крови. Серым цветом показан контроль изотипических антител, зеленым – спонтанная экспрессия молекул, красным – экспрессия в присутствии СРС 1:50. 2-часовая преинкубация клеток с СРС приводила к достоверному повышению уровня экспрессии CD11b на поверхности моноцитов относительно уровня спонтанной экспрессии этой молекулы. Напротив, экспрессия на моноцитах молекулы CD162 под влиянием СРС достоверно снижалась (табл. 3.15). – 78 – Таблица 3.15. Изменение уровней экспрессии молекул на поверхности моноцитов периферической крови под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков. Уровень экспрессии молекул, MFI (M±SD) Адгезионная молекула на моноцитах Контроль изотипических антител В культуральной среде (контроль) В присутствии СРС (1:50) CD162 5,14±2,33 n=3 35,11±4,86 n=7 29,19±2,23 n=7 * CD11b 5,14±2,33 n=3 134,33±5,51 n=3 162,67±15,82 n=3 * CD62L 5,14±2,33 n=3 10,82±1,80 n=3 9,40±0,76 n=3 CD49d 1,03±0,12 n=3 4,93±0,76 n=6 4,82±0,72 n=6 1,03±0,12 11,05±2,01 10,60±1,69 n=3 n=6 n=6 * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.05). CD29 В наших экспериментах супернатант разрушенных стрептококков не оказывал влияния на уровни экспрессии адгезионных молекул CD49d, CD29 и CD62L на поверхности моноцитов (табл. 3.15). 3.2.7. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на секрецию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами Результаты, полученные в экспериментах по адгезии, миграции, экспрессии адгезионных молекул свидетельствовали об активации моноцитов под влиянием СРС, в то время как результаты трансэндотелиальной миграции демонстрировали ингибирующее действие СРС на функции этих клеток. Поэтому для уточнения характера влияния СРС на моноциты в дальнейших экспериментах мы изучали секрецию мононуклеарными лейкоцитами провоспалительных цитокинов методом иммуноферментного анализа. В наших экспериментах мононуклеарные лейкоциты спонтанно секретировали IL-8 в концентрациях близких к 150 пг/мл, в то время как уровень спонтанной секреции TNFα и IL-6 этими клетками был низким (табл. 3.16). После 2х-часовой инкубации мононуклеарных лейкоцитов в присутствии СРС в высокой концентрации (разведение 1:50) наблюдалось достоверное усиление секреции – 79 – ими TNFα, IL-6 и IL-8 по сравнению со спонтанной секрецией этих цитокинов (табл. 3.18). Таблица 3.16. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на секрецию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами. Провоспалительный цитокин Концентрация цитокина, пг/мл (M±SD) после инкубации в присутствии Культуральная среда (контроль) СРС (1:50) СРС (1:2000) TNFα 6,71±2,41 n=9 272,04±108,43 n=9 *** - IL-6 6,97±1,97 n=10 183,68±105,20 n=10 *** 13,57±3,21 n=5 *** IL-8 148,07±49,87 n=9 1646,37±838,76 n=11 *** 167,00±31,45 n=4 *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). СРС в низкой концентрации (разведение 1:2000) не оказывал статистически значимого влияния на секрецию клетками IL-8. Уровень секреция IL-6 после инкубации лейкоцитов с СРС в низкой концентрации достоверно повышался относительно спонтанного уровня, но был ниже, чем после инкубации с СРС в разведении 1:50 (табл. 3.16). 3.2.8. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфокиназ моноцитами крови человека В результате распознавания бактериальных продуктов паттерн-распознающими рецепторами на лейкоцитах происходит активация NFκB и р38 МАР киназы и последующих провоспалительных реакций (Beisswenger et al., 2007; Маянский А. Н., 2007). Оценку влияния СРС на активацию моноцитов проводили методом проточной цитометрии с использованием мАт против фосфо-р38 и фосфо-NFκB, меченных AlexaFluor 488. Проводили выделение популяции моноцитов в координатах прямого и бокового светорассеяния (рис. 2.9). Затем клетки, попавшие в выделенный гейт, анализировали по экспрессии фосфо-р38 и фосфо-NFκB. Предварительно проводили подбор времени оптимального для фосфорилирования оценки молекулы экспрессии и киназ, максимальному что уровню соответствовало MFI. пику Мононуклеарные лейкоциты крови человека инкубировали в присутствии стандартного индуктора РМА в – 80 – течение 5, 15 или 30 минут (табл. 3.17). Таблица 3.17. Уровень экспрессии фосфокиназ моноцитами периферической крови человека в разных условиях инкубации. Условия инкубации Интенсивность флуоресценции, MFI NFκB р38-МАРК Неокрашенные клетки 0,46 0,46 Культуральная среда 0,54 0,76 5 минут 1,87 2,90 15 минут 1,93 3,44 30 минут 1,76 3,47 РМА (50 нг/мл) Результаты экспериментов показали, что пик экспрессии моноцитами фосфо-NFκB наблюдается после 15-минутной инкубации с РМА, а экспрессия фосфо-р38 максимальна при 15-и 30-минутных инкубациях. Таким образом, оптимальное время инкубации клеток составляет 15 минут. Далее проводили исследование изменений уровней экспрессии фосфо-NFκВ и фосфо-р38 в присутствии СРС и РМА (рис. 3.16). Рисунок 3.16. Уровни экспрессии фосфокиназ моноцитами крови человека. Серым цветом показан контроль изотипических антител, зеленым – спонтанная экспрессия фосфокиназ, красным – экспрессия фосфокиназ в присутствии СРС (1:50). – 81 – В присутствии стандартного индуктора РМА уровени экспрессии фосфо-NFκB и фосфо-р38 МАР киназ в моноцитах крови человека достоверно возрастали по сравнению с контролем (табл. 3.18). Таблица 3.18. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфокиназ моноцитами периферической крови человека. Уровень экспрессии фосфокиназ, MFI (M±SD) В культуральной среде (контроль) В присутствии СРС (1:50) В присутствии РМА (50 нг/мл) 0,79±0,28 n=4 0,83±0,27 n=4 1,41±0,28* n=4 NFκB 0,91±0,24 1,40±0,36** 2,38±1,17* n=4 n=4 n=4 ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.01). р38 МАРК * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.05). После преинкубации моноцитов в присутствии СРС уровень экспрессии фосфоNFκB не изменялся (табл. 3.18). В то же время под влиянием компонентов стрептококка достоверно увеличивался уровень экспрессии фосфо-р38 МАР-киназы в моноцитах по сравнению со спонтанным уровнем экспрессии(табл. 3.18). 3.3. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции эндотелиальных клеток 3.3.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии адгезионных молекул на поверхности эндотелиальных клеток Адгезия и трансэндотелиальная миграция зависят не только от активации лейкоцитов и экспрессии на них адгезионных молекул. Важную роль в этих процессах играют так же молекулы, экспрессирующиеся на поверхности эндотелиальных клеток. В этой серии экспериментов проводили оценку влияния продуктов разрушения S. pyogenes на уровни экспрессии адгезионных молекул на эндотелиальных клетках методом проточной цитометрии с использованием мАт против CD54, CD106 и CD73, меченных РЕ (рис. 3.17, табл. 3.19). – 82 – Рисунок 3.17. Уровни экспрессии адгезионных молекул на поверхности эндотелиальных клеток. Серым цветом показан контроль изотипических антител, зеленым – спонтанная экспрессия молекул, красным – экспрессия молекул в присутствии СРС (1:50). Не было выявлено достоверных изменений экспрессии молекул CD54 и CD62р после 2-часовой преинкубации эндотелиальных клеток с супернатантом разрушенных S. pyogenes по сравнению со спонтанной экспрессией этих молекул (табл. 3.19). Таблица 3.19. Изменение уровня экспрессии молекул на поверхности эндотелиальных клеток под влиянием СРС. Адгезионная молекула на эндотелиальных клетках CD54 CD62p CD106 Уровень экспрессии молекул, MFI (M±SD) Контроль изотипических антител 1,10±0,67 n=3 1,08±0,05 n=3 2,08±0,05 n=3 В культуральной среде (контроль) 10,18±2,27 n=4 1,97±0,97 n=3 10,87±0,32 n=4 В присутствии СРС (1:50) 9,73±5,81 n=4 1,70±0,77 n=3 8,37±0,12 n=4 – 83 – 3.3.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на уровень экспрессии фосфо-NFκB в эндотелиальных клетках Для оценки влияния продуктов деградации S. pyogenes на активацию эндотелиальных клеток проводили исследование уровня фосфорилирования NFκB методом проточной цитометрии с использованием мАт против фосфо-NFκB, меченными AlexaFluor 488 (рис. 3.18). Рисунок 3.18. Уровень экспрессии фосфо-NFκB эндотелиальными клетками. Серым цветом показан контроль изотипических антител, зеленым – спонтанная экспрессия молекул, красным – экспрессия молекул в присутствии СРС (1:50). Таблица 3.20. Влияние СРС на уровень экспрессии фосфо-NFκB эндотелиальными клетками. Инкубация клеток в присутствии (15 мин.) Контроль изотипических антител культуральная среда (контроль) СРС (1:50) TNFα Уровень 178,50±36,50 247,10±30,84 245,50±24,39 394,30±133,46** экспрессии n=8 n=8 n=8 n=8 фосфо-NFκB, MFI (M±SD) ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.01). Было выявлено, что эндотелиальные клетки имели исходно низкий уровень – 84 – экспрессии фосфо-NFκB, который не изменялся после их инкубации в присутствии СРС. Напротив, в присутствии TNFα уровень экспрессии фосфо-NFκB достоверно повышался (табл. 3.20). 3.4. Исследование токсического эффекта супернатанта разрушенных стрептококков на мононуклеарные лейкоциты крови человека и клетки перевиваемых линий ТНР-1 и EA.hy 926 При гибели клеток могут наблюдаться два вида морфологических изменений, которые соответствуют различным механизмам ее развития – некроз и апоптоз. Для выявления возможных токсических эффектов супернатанта разрушенных стрептококков проводили серии экспериментов по оценке количества клеток в состояниях апоптоза и некроза. Апоптоз – запрограммированная асинхронная гибель клеток, обеспечивающая физиологическое равновесие и генетическую стабильность организма за счет самоуничтожения дефектных клеток. В процессе апоптоза активированные эндогенные нуклеазы расщепляют ДНК на фрагменты, при этом сохраняется целостность клеточных мембран и внутриклеточного содержимого, отсутствуют повреждения тканей и лейкоцитарная инфильтрация (Affara et. al., 2007). Для клеток различных тканей характерна специфичность сигналов активации апоптоза (Быков В. Л., 2002). Таблица 3.21. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на процессы апоптоза в исследуемых культурах. Условия инкубации, % клеток (m±SD) Культуры клеток культуральная среда СРС (в максимальной концентрации)* Мононуклеарные лейкоциты крови 12,47±4,04 n=3 11,90±3,28 n=3 EA.hy 926 13,16±3,85 n=3 11,00±3,42 n=3 ТНР-1 7,91±2,01 n=3 7,58±1,44 n=3 * разведение 1:50 для мононуклеарных лейкоцитов; разведение 1:25 для клеток линий EA.hy 926 и ТНР-1. В наших экспериментах преинкубация клеток в присутствии супернатанта – 85 – разрушенных стрептококков в максимальной концентрации не вызывала усиления их апоптоза (табл. 3.21). Некроз возникает под действием резко выраженных повреждающих факторов и представляет собой патологическую форму гибели клеток. При некрозе наблюдается ряд структурно-функциональных изменений клеток (набухание цитоплазмы и отдельных органелл, конденсация гетерохроматина, уменьшение и последующий распад ядра клетки, нарушение избирательной проницаемости мембраны). В отличие от апоптоза, некроз не сопровождается активацией сигнальных каскадов клетки (Быков В. Л., 2002). Результаты экспериментов показали, что после культивирования клеток в присутствии СРС в максимальной концентрации процент клеток в состоянии некроза не увеличивался (табл. 3.22). Таблица 3.22. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на процессы некроза в исследуемых культурах. Условия инкубации, % клеток (m±SD) Культуры клеток культуральная среда СРС (в максимальной концентрации) Мононуклеарные лейкоциты крови 7,18±2,43 n=3 6,85±4,26 n=3 EA.hy 926 5,32±2,38 n=3 4,09±1,31 n=3 ТНР-1 6,30±2,69 n=3 6,98±3,61 n=3 * разведение 1:50 для мононуклеарных лейкоцитов; разведение 1:25 для клеток линий EAhy. 926 и ТНР-1. Таким образом, эффекты супернатанта разрушенных стрептококков, полученные ранее, не были обусловлены ни апоптотической, ни некротической гибелью клеток. – 86 – ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ Для осуществления своих функций клетки должны быть мобилизованы из кровяного русла в очаг инфекции. На всех этапах мобилизации лейкоцитов важную роль играет активация лейкоцитов и эндотелиальных клеток, экспрессия генов этих клеток, регулирующих продукцию цитокинов и хемокинов, адгезионных молекул и ферментов, участвующих в воспалительных реакциях. При инфекциях взаимодействие эндотелиальных клеток и лейкоцитов происходит в присутствии инфекционных агентов или продуктов их разрушения. В наших экспериментах под влиянием продуктов разрушения стрептококков изменялась экспрессия адгезионных молекул CD162 и CD11b на моноцитах, повышалась экспрессия моноцитами фосфо-р38 МАРК, происходила индукция секреции провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-8, но не изменялась экспрессия фосфоNFκB. Продукты деградации стрептококков оказывали разнонаправленное влияние на этапы мобилизации моноцитов: в присутствии СРС повышалась миграционная и адгезионная активность моноцитов, однако, снижалась их миграция через монослой эндотелиальных клеток. Это может объясняться присутствием в составе СРС компонентов с разной биологической активностью. 4.1. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции клеток линии ТНР-1. Трансэндотелиальная миграция лейкоцитов in vivo представляет собой сложный, многоэтапный процесс. В данной работе изучалось влияние продуктов разрушения S. pyogenes на адгезию, миграцию и трансэндотелиальную миграцию лейкоцитов. Одним из этапов трансэндотелиальной миграции лейкоцитов является их адгезия к эндотелию. В наших экспериментах в присутствии СРС происходило усиление адгезии клеток THP-1 к эндотелиальным клеткам. Из данных литературы известно, что прочная адгезия является результатом взаимодействия β2-интегринов (CD11a/CD18 и CD11b/CD18) и α4β1-интегринов (CD49d/CD29) на поверхности лейкоцитов с молекулами иммуноглобулинового суперсемейства ICAM-1, 2 и VCAM-1 на поверхности эндотелия (Weber et al., 1999; Herter and Zarbock, 2013; Lee et al. 2012). Показано, что интегрины конститутивно экспрессируются на поверхности лейкоцитов. Адгезионные молекулы – 87 – ICAM-1 и VCAM-1 экспрессируются только на активированных эндотелиальных клетках и обеспечивают прочную адгезию в условиях воспаления (Imhof and Aurrand-Lions 2004; Meager A., 1999). В наших экспериментах в присутствии СРС экспрессия адгезионных молекул на эндотелиальных клетках не изменялась. Нельзя исключать, что адгезию эндотелиальных клеток и моноцитов в этих условиях опосредуют другие адгезионные молекулы – PECAM-1, CD99 и JAM. Под влиянием активационных стимулов эти молекулы из мест контактов эндотелиальных клеток выходят на апикальную поверхность и могут участвовать в адгезии лейкоцитов к эндотелию (Imhof and Aurrand-Lions 2004; Weber et al., 2007; Bardin et al., 2009). В качестве общепризнанного модельного активатора функций мононуклеарных фагоцитов мы использовали провоспалительный цитокин TNFα, который и в наших исследованиях стимулировал процесс адгезии мононуклеарных фагоцитов. Однако механизмы стимулирующего действия продуктов разрушения пиогенного стрептококка на те же процессы, как оказалось, отличаются от механизмов действия TNFα. Известно, что под влиянием TNFα на эндотелиальных клетках усиливается экспрессия адгезионных молекул, опосредующих роллинг лейкоцитов и их прочную адгезию к эндотелию (Р-, Еселектины, лиганды L-селектина, ICAM-1, VCAM-1) (Mantovani et al., 1997; Meager A., 1999; Johnson-Léger et al., 2000). Также TNFα стимулирует секрецию эндотелиальными клетками хемокинов (СХ3СL1, MCP-1, IL-8 и др.), привлекающих в очаг воспаления лейкоциты (Meager A., 1999; Johnson-Léger et al., 2000; Bardin et al., 2009; Старикова и др., 2008). Хемокины также опосредуют адгезию лейкоцитов к эндотелию, изменяя конформацию интегринов и вызывая усиление их аффинности и авидности (Nourshargh et al., 2005; Herter and Zarbock, 2013). Чтобы оценить вклад активации эндотелиальных клеток и клеток линии ТНР-1 в наблюдаемое усиление адгезии проводили предварительные инкубации клеток с СРС и TNFα. Было показано, что усиление адгезии клеток ТНР-1 к эндотелиальным клеткам под влиянием СРС зависит от изменения свойств клеток ТНР-1. Напротив, повышение адгезионной активности клеток в присутствии TNFα обусловлено, главным образом, изменением свойств эндотелиальных клеток. In vivo экспрессия адгезионных молекул на клетках и продукция клетками хемокинов контролируется активацией транскрипционного фактора NFκB (Маянский и др., 2007; Weber et al. 1999). Распознавание консервативных структур бактерий клетками запускает каскад внутриклеточных реакций, приводящих к фосфорилированию NFκB и последующему изменению экспрессии адгезионных молекул. В данной работе СРС не – 88 – оказывал влияния на уровень экспрессии фосфо-NFκB клетками линии ТНР-1 и эндотелиальными клетками. Полученные результаты позволяют предположить, что в основе усиления адгезии клеток ТНР-1 к эндотелиальным клеткам под влиянием СРС лежат механизмы, отличные от тех, которые обеспечивают усиление адгезии этих клеток под влиянием TNFα. Миграция лейкоцитов в субэндотелиальное пространство осуществляется по градиенту концентраций хемоаттрактантов, роль которых могут выполнять не только хемокины, но и бактериальные компоненты (Mantovani et al., 1997; Johnston and Butcher, 2002; Bokoch M.G., 1995). В данной работе проводили исследование хемоаттрактного действия продуктов разрушения S. pyogenes на клетки линии ТНР-1. Результаты экспериментов показали, что СРС усиливает направленную миграцию клеток, т.е. является хемоаттрактантом для ТНР-1. В регуляции хемотаксиса и трансэндотелиальной миграции клеток участвуют сигналы от рецепторов, связанных с G-белками (GPCR). Их лигандами являются хемоаттрактные белки – хемокины, компоненты комплемента, компоненты бактерий. (Penela et al., 2014; Mantovani et al., 1997). На этапе роллинга и адгезии сигналинг от GPCR приводит к изменению конформации интегринов и повышению их афинности и авидности. Кроме того сигналы от GPCR опосредуют направленную миграцию лейкоцитов к базальной поверхности ЭК и далее во внеклеточном матриксе (Penela et al., 2014; Imhof and Aurrand-Lions 2004; Le et al., 2000). Так как супернатант разрушенных стрептококков проявлял свойства хемоаттрактанта в отношении клеток линии ТНР-1, мы провели ингибиторный анализ с токсином коклюша. Блокирование сигнала от GPCR токсином коклюша полностью подавляло спонтанную и индуцированную влиянием СРС миграцию клеток ТНР-1. Это значит, что и спонтанная, и индуцированная миграция этих клеток зависела от присутствия в системе хемоаттрактантов, которые являются лигандами GPCR. Блокирование сигнальных путей от GPCR так же подавляло спонтанную и индуцированную адгезию клеток ТНР-1 к эндотелию. Вероятно, связывание GPCR на клетках ТНР-1 с лигандами в составе СРС приводило к изменению конформации и повышению афинности β2-интегринов на этих клетках. В таком случае взаимодействие интегринов на клетках ТНР-1 с конститутивно экспрессирующейся на эндотелиальных клетках молекулой ICAM-2 могло опосредовать прочную адгезию клеток ТНР-1 к эндотелию (Le et al., 2000). Кроме того для GPCR описан эффект десенситизации (десенсибилизации) гетерологичных рецепторов (Penela et al, 2014; Nasser et al. 2005; – 89 – Martins-Green et al., 2013). Длительная экспозиция лиганда с соответствующим GPCR приводит к потере чувствительности рецепторов, в этом случае не происходит изменения конформации интегринов. Не исключено, что снижение интенсивности адгезии преинкубированных с СРС клеток ТНР-1 было связано с десенситизацией GPCR. Можно заключить, что влияние СРС на адгезию и миграцию клеток ТНР-1 было опосредовано взаимодействием GPCR на клетках с хемоаттрактантом в составе СРС. Несмотря на отсутствие изменений экспрессии адгезионных молекул и фосфоNFκB, было отмечено значительное усиление трансэндотелиальной миграции клеток линии ТНР-1 в присутствии СРС. При этом блокирование сигнала от GPCR токсином коклюша полностью подавляло спонтанную и индуцированную влиянием СРС миграцию клеток. Это значит, что и спонтанная, и индуцированная трансмиграция клеток зависела от присутствия в системе хемоаттрактантов, которые являются лигандами GPCR. Из литературы известно, что молекулы межклеточных контактов JAM могут связываться с α4β1- и β2-интегринами (Weber et al., 2007; Fernandez-Borja et al., 2010). Можно предположить, что взаимодействие хемоаттрактантов в составе СРС с GPCR на ТНР-1 приводило к активации β1- и β2-интегринов. В этом случае связывание интегринов на клетках линии ТНР-1 с белками семейства JAM на эндотелиальных клетках опосредовало трансэндотелиальную миграцию лейкоцитов. 4.2. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на функции моноцитов крови человека. В присутствии супернатанта разрушенных стрептококков происходило усиление адгезии моноцитов крови. При этом преинкубация эндотелиальных клеток с СРС не оказывала влияния на адгезию к ним моноцитов. В то же время СРС повышал адгезионную активность самих моноцитов. Это позволяет предположить, что наблюдаемое усиление адгезии клеток в присутствии СРС было связано с изменением свойств самих моноцитов, а не эндотелиальных клеток. В наших экспериментах в присутствии СРС экспрессия адгезионных молекул на эндотелиальных клетках не изменялась, а на моноцитах – менялась разнонаправленно. Также СРС не оказывал влияния на экспрессию фосфо-NFκB моноцитами и эндотелиальными клетками. Следовательно, как и в случае клеток ТНР-1, мы не могли объяснить усиление адгезии моноцитов к эндотелию изменением экспрессии адгезионных молекул на клетках. В данном исследовании СРС усиливал экспрессию фосфо-р38 на моноцитах. Из – 90 – литературы известно, что киназа р38 МАРК опосредованно регулирует процессы адгезии и трансмиграции лейкоцитов. Активация р38 МАРК повышает Е-селектин- опосредованную адгезию лейкоцитов к клеткам, экспрессирующим Е-селектин и ICAM-1 (Stadtmann et al. 2012; Herter and Zarbock, 2013). Результаты наших экспериментов свидетельствуют в пользу того, что под влиянием СРС происходит активация моноцитов, и фосфорилирование р38 МАРК может вносить вклад в усиление адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам. На миграцию моноцитов крови СРС оказывал разнонаправленное действие. При низких концентрациях СРС наблюдалось достоверное усиление миграции моноцитов по сравнению с контролем. При повышении концентрации СРС эффект менялся на противоположный. Это говорит в пользу того, что в составе супернатанта разрушенных стрептококков присутствует фактор, проявляющий хемоаттрактантные свойства. Согласно литературным данным, одно и то же вещество, в зависимости от концентрации, может оказывать разнонаправленное действие на миграцию лейкоцитов: в низких концентрациях может выступать в качестве хемоаттрактанта, а при высоких концентрациях – действовать как хеморепеллент (Huttenlocher and Poznansky 2008; Tharp et al. 2006; Penela et al., 2014). В литературе есть данные об иерархии внутриклеточных сигналов в ответ на различные хемоаттрактанты (Heit et al. 2002). Так, например, сигналы от «целевых» (endtarget) хемоаттрактантов (например, fMLP, С5а), которые локализуются в участках инфекции, доминируют над сигналами от «хемоаттрактантов-посредников» (например, IL-8, LTB4). Показано, что ответы на эти хемоаттрактанты различны: сигналы от «посредников» PI3K/Akt-зависимы, в то время как «целевые» хемоаттрактанты индуцируют активацию р38 МАРК (Heit et al. 2002). В наших экспериментах в присутствии СРС повышался уровень фосфорилирования р38 МАРК в моноцитах. Активация этой киназы может также свидетельствовать в пользу того, что усиление миграции моноцитов главным образом обусловлено действием «целевого» хемоаттрактанта в составе СРС. Токсин коклюша снижал индуцированную СРС миграцию моноцитов крови до спонтанного уровня. Чувствительность к токсину доказывает, что влияние СРС на миграцию моноцитов было опосредовано взаимодействием GPCR на моноцитах с хемоаттрактантом в составе СРС. По интенсивности миграции моноцитов крови к СРС в разведении 1:50 доноры разделились на две группы. У 25% доноров наблюдали повышение миграции моноцитов к СРС, в то время как у 75% доноров миграция в тех же условиях снижалась. – 91 – Разнонаправленность изменений миграции моноцитов в присутствии СРС можно объяснить различиями чувствительности моноцитов разных доноров к компонентам в составе супернатанта. Принимая во внимание, что под влиянием СРС происходит усиление адгезии моноцитов крови к эндотелиальным клеткам и усиление их миграционной активности, парадоксальным представляется выявленное в данной работе подавление трансэндотелиальной миграции моноцитов в присутствии компонентов стрептококка в нижней камере. Это можно объяснить тем, что в используемой модели взаимодействия моноцитов и эндотелиальных клеток, в присутствии СРС секретируются факторы, ингибирующие трансмиграцию моноцитов. Молекула VCAM-1 участвует не только на этапе прочной адгезии лейкоцитов к эндотелиальным клеткам, но и на этапе трансэндотелиальной миграции (Lee et al. 2012). α4β1-интегрины связываются с 1 и 4 Ig-подобными доменами молекулы VCAM-1. Однако в литературе есть данные, что 6 Ig-подобный домен VCAM-1 так же участвует в процессе трансмиграции. Показано, что связывание специфичных к 6 Ig-подобному домену антител (VCAM-1-D6) с соответствующим доменом на VCAM-1 эндотелиальных клеток блокирует трансэндотелиальную миграцию лейкоцитов. При этом VCAM-1-D6 не снижает адгезию лейкоцитов к эндотелию и не влияет на TNFα-стимулированную продукцию цитокинов и хемокинов эндотелиальными клетками (Lee et al. 2012). Нельзя исключать, что какойлибо компонент СРС обладает подобной активностью в используемой нами модели. В наших экспериментах СРС индуцировал секрецию провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-8 мононуклеарными лейкоцитами крови. Согласно литературным данным IL-8 усиливает адгезию моноцитов, вызывая конформационные изменения β2-интегринов (Ma et al., 2004; Yang et al. 2005). IL-6 индуцирует секрецию МСР1 и IL-8 эндотелиальными клетками, тем самым оказывая косвенное влияние на миграцию лейкоцитов (Kaplanski et al. 2003). Кроме того, в литературе есть данные, о том что под влиянием IL-6 происходит активация β1-интегринов, усиливается полимеризация актина и адгезия моноцитов к эндотелиальным клеткам (Clahsen and Schaper 2008). Нельзя исключать, что влияние СРС на функции моноцитов может быть также связано с влиянием провоспалительных цитокинов, секретируемых как самими моноцитами, так и присутствующими в системе лимфоцитами, хотя, как показано выше, механизмы влияния продуктов деградации S. pyogenes и провоспалительного цитокина TNFα на процессы адгезии и миграции мононуклеарных фагоцитов были различны. Также следует учитывать, что присутствующие в системе лимфоциты могут – 92 – оказывать влияние на активацию моноцитов и выявленные изменения их функций в присутствии супернанта разрушенных стрептококков. Из литературы известно, что суперантигенные экзотоксины стрептококков активируют лимфоциты крови человека (Taylor et al., 2011, Chatellier and Kotb, 2000), индуцируют их пролиферацию (Eriksson and Norgren, 1999; Sriskandan et al., 1996) и продукцию цитокинов IL-6, IL-10, IL-12 и IFN-γ этими клетками (Klinman et al., 1996; Taylor et al., 2011). Первоначально в качестве модели мононуклеарных фагоцитов нами были выбраны клетки перевиваемой моноцитоподобной линии THP-1, свойства которых подробно изучены и во многом близки к моноцитам крови человека (Cleveland et al. 1996; Kawakami et al. 2007; Goda et al. 2000; Yu et al. 2003). Эти клетки предоставляли ряд технических преимуществ при разработке использованных методических подходов. Однако мы отдавали себе отчет, что клетки THP-1, как и клетки других перевиваемых линий, несут черты злокачественно трансформированных клеток. Также нельзя исключать, что эффект СРС на функции моноцитов крови опосредован влиянием продуктов, секретируемых присутствующими в системе активированными лимфоцитами. В наших исследованиях выявились существенные различия в характере ответа клеток THP-1 и моноцитов крови человека на действие продуктов разрушения пиогенного стрептококка (табл. 4.1). Таблица 4.1. Сопоставление стрептококков на направленности влияния продуктов процессы адгезии к эндотелиальным клеткам, разрушения миграции и трансэндотелиальной миграции моноцитов крови человека и клеток линии ТНР-1. Изучаемые процессы Культуры клеток Адгезия к эндотелиальным клеткам Миграция Трансэндотелиальная миграция Клетки линии ТНР-1 ↑ ↑ ↑ Моноциты крови человека ↑ ↑↓ ↓ *примечание: ↑ – усиливающий эффект; ↓ – ингибирующий эффект; В присутствии СРС адгезия клеток линии ТНР-1 к эндотелию усиливалась. СРС так же повышал миграцию и трансэндотелиальную миграцию этих клеток. Стимулирующий – 93 – эффект СРС на эти процессы был связан с хемоаттрактным действием продуктов разрушения стрептококков и не связан с изменением свойств эндотелиальных клеток. Как и адгезия клеток линии ТНР-1, адгезия моноцитов крови усиливалась в присутствии СРС. разнонаправленным Однако и влияние зависело СРС от на миграцию концентрации СРС этих и клеток было индивидуальной чувствительности доноров к продуктам деградации S. pyogenes. Эффект СРС на адгезию и миграцию моноцитов крови также был обусловлен взаимодействием GPCR на моноцитах и хемоаттрактантом в составе СРС. Несмотря на то, что влияние СРС в некоторых концентрациях на адгезию и миграцию моноцитов и клеток ТНР-1 было схожим, влияние СРС на трансэндотелиальную миграцию этих клеток было противоположным. В отличие от трансмиграции ТНР-1, трансмиграция моноцитов снижалась в присутствии СРС. – 94 – Заключение Мононуклеарные фагоциты обеспечивают защиту организма за счет своей фагоцитарной функции, кроме того секретируемые макрофагами молекулы цитокинов обеспечивают привлечение и активацию не только самих макрофагов, но и других защитных клеток (Тотолян и Фрейдлин, 2000). Для осуществления своих функций моноциты должны мигрировать из кровяного русла в очаг инфекции, через эндотелиальный барьер. На всех этих этапах мобилизации важную роль играет взаимодействие моноцитов с эндотелиальными клетками выстилки сосудов (Imhof and Aurrand-Lions, 2004, Johnson-Leger et al., 2000, Muller and Randolf, 1999, Herter and Zabrock, 2013, Фрейдлин И.С., 2006). При стрептококковых инфекциях это взаимодействие происходит в присутствии инфекционных агентов или продуктов их разрушения. В данной работе исследовалось влияние супернатанта разрушенных Streptococcus pyogenes (СРС) серологичекой группы А (тип М22, штамм AL168) на адгезионную и миграционную активность моноцитов крови человека и клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, а так же на их миграцию через монослой эндотелиальных клеток человека линии EA.hy 926 in vitro. Также изучалось влияние СРС на экспрессию клетками адгезионных молекул и стресс-киназ, на активацию рецепторов, связанных с G-белками, на секрецию провоспалительных цитокинов. Показано, что СРС стимулировал адгезионную и миграционную активность клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, усиливал трансэндотелиальную миграцию этих клеток; эффект СРС не был связан с изменением свойств эндотелиальных клеток, изменением экспрессии адгезионных молекул, а был обусловлен изменением свойств самих клеток ТНР-1 и активацией на них GPCR. СРС активировал моноциты крови человека через р38 МАР киназу, изменял экспрессию на них адгезионных молекул CD162 и CD11b и активировал рецепторы моноцитов, сопряженные с G-белками. Продукты деградации стрептококков также оказывали разнонаправленное влияние на этапы моблизации моноцитов крови: в присутствии СРС в одних и тех же концентрациях повышалась миграционная и адгезионная активность моноцитов, однако, их миграция через монослой эндотелиальных клеток снижалась или не изменялась. Под влиянием СРС происходила индукция секреции провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-8 мононуклеарными лейкоцитами крови. В ходе проведенных исследований были выявлены существенные различия в – 95 – характере ответа клеток моноцитоподобной линии ТНР-1 и моноцитов крови человека на действие продуктов разрушения стрептококков. В отличие от трансмиграции клеток ТНР1, трансэндотелиальная миграция моноцитов крови снижалась в присутствии СРС. Различная чувствительность моноцитов крови и клеток ТНР-1 к влиянию СРС может быть связана с разной концентрацией на этих клетках рецепторов к соответствующим компонентам в составе СРС. – 96 – ВЫВОДЫ 1. Супернатант разрушенных Streptococcus pyogenes серологической группы А (тип М22, штамм AL168) оказывает стимулирующее влияние на адгезионную и миграционную активности клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, а так же на их миграцию через монослой эндотелиальных клеток линии EA.hy 926 in vitro. 2. Наряду со стимулирующим эффектом продуктов разрушения стрептококков на адгезионную активность моноцитов крови человека выявлено зависимое от концентрации супернатанта разрушенных стрептококков разнонаправленное действие на интенсивность миграции этих клеток. 3. Эффект супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию моноцитов крови человека и клеток линии ТНР-1 не связан с изменением свойств эндотелиальных клеток, изменением экспрессии адгезионных молекул на клетках и активацией NFkB, а обусловлен изменением свойств самих мигрирующих клеток и активацией на них рецепторов, связанных с G-белками. 4. Продукты разрушения стрептококков активируют моноциты крови человека через р38 МАР киназу. 5. Супернатант разрушенных S. pyogenes оказывает стимулирующее действие на продукцию мононуклеарными лейкоцитами провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-8. – 97 – Список используемой литературы 1. Быков В. Л. Цитология и общая гистология. Функциональная морфология клеток и тканей человека / Быков В. Л. – СПб: Сотис, 2002. 2. Гомазков О. А. Эндотелий – «эндокринное дерево». / Гомазков О. А. // Природа. – 2000. - №5. – С. 3846-3856. 3. Зенков Н. К. Механизмы активации макрофагов. / Зенков Н. К., Меньшикова Е. Б., Шкурупий В. А. // Успехи современной биологии. – 2007. – Т.127. – № 3. – С. 243-256. 4. Луговская С. А. Структура и функции моноцитов и макрофагов. / Луговская С. А. // Клиническая лабораторная диагностика. – 1997. – №9. – C. 10-16. 5. Маянский А. Н. Нуклеарный фактор-κВ и воспаление. / Маянский А. Н., Маянский Н. А., Заславская М. И. // Цитокины и воспаление. – 2007. – Т. 6. – №2. – С. 3-9. 6. Пальцев М.А. Цитокины и их роль в межклеточных взаимодействиях. / М.А.Пальцев // Архив патологии. – 1996. – №6. – С. 3-6. 7. Симбирцев А. С. Интерлейкин-1. Физиология. Патология. Клиника. / Симбирцев А. С. – СПб: Фолиант, 2011. – 480 стр. 8. Старикова Э.А. Влияние бактериальных рецепторов моноцитоподобных клеток лигандов ТНР-1 на их паттерн-распознающих трансэндотелиальную миграцию. / Старикова Э.А., Соколов Д.И., Чернова А.А., Бурова Л.А., Сельков С.А., Фрейдлин И.С. // Медицинская Иммунология. – 2008. – Т.10. - №6. – С. 605-613. 9. Тотолян А. А. Анализ механизмов развития иммунопатологического острого постстрептококкового гломерулонефрита (AGN). / Тотолян А. А., Бурова Л. А., Нагорнев В. А., Пигаревский П. В. // Обзор. Терапевтический архив.– 2008. – №6. – С.90-95. 10. Тотолян А. А. Клетки иммунной системы. Том 1. /Тотолян А. А., Фрейдлин И. С. – СПб: Наука, 2000. – 231 стр. 11. Фрейдлин И. С. Система мононуклеарных фагоцитов / Фрейдлин И. С. – М: Медицина, 1984. – 272 с. 12. Фрейдлин И.С. Иммунофизиология эндотелиальных клеток. / Фрейдлин И. С. // Физиология человека. – 2006. – №3. – С. 124-135. 13. Шубич М. Г. Щелевые соединения – основные структуры, обеспечивающие межклеточную коммуникацию. / Шубич М. Г., Ерошенко Б. Г., Петров Ю. М., Дорофеева И. В. // Морфология. – 2005. – Т. 127. – №1. – С. 65-71. – 98 – 14. Ярилин А. А. Иммунология. / Ярилин А. А. – Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 752 стр. 15. Affara M. Understanding endothelial cell apoptosis: what can the transcriptome, glycome and proteome reveal? / Affara M., Dunmore B., Savoie C. et al. // Phil. Trans. R. Soc. B. – 2007. – Vol.362. – P.1469–1487. 16. Aird C. A. Phenotypic Heterogeneity of the endothelium I. Structure, Function and Mechanisms / Aird C. A. // Circ. Res. – 2007. – Vol. 100. – P. 158-173. 17. Amelung S. The FbaB-type fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes promotes specific invasion into endothelial cells. / Amelung S., Nerlich A., Rohde M. et al. // Cell Microbiol. – 2011. – Vol. 13 (8). – p. 1200-1211. 18. Van Amersfoort E.S. Receptors, Mediators, and Mechanisms Involved in Bacterial Sepsis and Septic Shock / Van Amersfoort E.S., van Berkel T.J.C., Kuiper J. // 2003. – Vol. 16. – N3. – P. 379–414. 19. Bardin N. CD146 and its Soluble Form Regulate Monocyte Transendothelial Migration / Bardin N., Blot-Chabaud M., Despoix N. et al. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2009. – Vol. 29. – P. 746-753. 20. Beisswenger C. Role of p38 MAP Kinase and Transforming Growth Factor-β Signaling in Transepithelial Migration of Invasive Bacterial Pathogens / Beisswenger C., Coyne C.B., Shchepetov M., Weiser J.N. // J. Biolog. Chem. – 2007. – Vol. 282 (39). – P. 28700-28708. 21. Bennett B. Interleukin-4 Suppression of Tumor Necrosis Factor a-stimulated E-selectin Gene Transcription Is Mediated by STAT6 Antagonism of NF-kB / Bennett B., Cruz R., Lacson R. G., Manning A. M. // J. of Bioil. Chem. - 1997. - Vol. 272. - P.10212-10219. 22. Benoit M. Macrophage polarization in bacterial infections / Benoit M., Desnues B., Mege J.-L. // J. Immunol. - 2008. – Vol. 181. – N6. – P. 3733–3739. 23. Blease K. Lipoteichoic Acid inhibits Lipopolysaccharide-Induced Adhesion Molecule Expression and IL-8 Release in Human Lung Microvascular Endothelial Cells / Blease K., Chen Y., Hellewell P.G. // J. Immunol. – 1999. – Vol. 163. – P. 6139-6147. 24. Bokoch M.G. Chemoattractant Signaling and Leukocyte Activation / Bokoch M.G. // Blood. – 1995. – Vol. 86. – N. 5. – P. 1649-1660. – 99 – 25. Bonecchi R. Induction of Functional IL-8 Receptors by IL-4 and IL-13 in Human Monocytes / Bonecchi R., Facchetti F., Dusi S. et al. // J. Immunol. – 2000. – Vol. 164. – N7. – P. 3862– 3869. 26. van den Bossche J. Regulation and function of the E-cadherin/catenin complex in cells of the monocyte-macrophage lineage and DCs / van den Bossche J., Malissen B., Mantovani A. et al. // Blood. – 2012. – Vol. 119 (7). – P. 1623–1633. 27. Bronte V. Regulation of immune responses by L-arginine metabolism / Bronte V., Zanovello P. // Nat. Rev. Immunol. – 2005. – Vol. 5. – N8. – P. 641–54. 28. Bryant A.E. M Type 1 and 3 Group A Streptococci Stimulate Tissue Factor-Mediated Procoagulant Activity in Human Monocytes and Endothelial Cells / Bryant A.E., Stevens D.L. // 2003. Т. 71. № 4. С. 1903–1910. 29. Burns E. Activation of a 66-Kilodalton Human endothelial Cell Matrix Metalloprotease by Streptococcus pyogenes Extracellular Cysteine Protease / Burns E., Marsiel A., Musser J. // Infection and Immunity. – 1996. – Vol.64. - №11. – P.4744–4750. 30. Burns E. H. Jr. Structure-function and pathogenesis studies of Streptococcus pyogenes extracellular cysteine protease. / Burns E. H. Jr., Marciel A. M., Musser J. M. // Adv Exp Med Biol. – 1997. – Vol. 418. – p. 589-592. 31. van Buul J.D. Signaling in Leukocyte Transendothelial Migration / van Buul J.D., Hordijk P.L. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2004. – Vol. 24. – P.824-833. 32. Cattaruzza M. Interleukin-10 induction of nitric-oxide synthase expression attenuates CD40-mediated interleukin-12 synthesis in human endothelial cells / Cattaruzza M., Słodowski W., Stojakovic M. // The Journal of Biological Chemistry. – 2003. – Vol. 278 (39). – P. 37874–37880. 33. Chatellier S. Preferential stimulation of human limphocytes by oligodeoxynucleotides that copy DNA CpG motifs present in virulent genes of group A streptococci. / Chatellier S., Kotb M. // Eur. J. Immunol. – 2000. – Vol. 30. – P.993-1001. – 100 – 34. Chiappini N. Streptococcus pyogenes SpyCEP influences host-pathogen interactions during infection in a murine air pouch model. / Chiappini N., Seubert A., Telford J.L. et al. // PLoS One. – 2012. – Vol. 7(7). 35. Clahsen T. Interleukin-6 acts in the fashion of a classical chemokine on monocytic cells by inducing integrin activation, cell adhesion, actin polymerization, chemotaxis, and transmigration / Clahsen T., Schaper F. // Journal of Leukocyte Biology. – 2008. – Vol. 84 (6). – P. 1521–1529. 36. Cleveland M. G. Lipoteichoic acid preparations of gram-positive bacteria induce interleukin-12 through a CD14-dependent pathway / Cleveland M. G., Gorham J. D., Murphy T. L. et al. // Infection and Immunity. – 1996. – Vol. 64 (6). – P. 1906–1912. 37. Cohen J. The Immunapathogenesis of Sepsis / Cohen J. // Nature. – 2002. – Vol. 420. – p. 885- 38. Coito A. J. Leukocyte Transmigration Across Endothelial and Extracellular Matrix Protein Barriers in Liver. // Currency Opinion Organ Transplantation. – 2011. – Vol. 16 (1). P. 34– 40. 39. Cook-mills J. M. Active participation of endothelial cells in inflammation / Cook-mills J. M., Deem T. L. // 2005. – Vol. 77. – P. 487–495. 40. Crotty Alexander L. E. M1T1 group A streptococcal pili promote epithelial colonization but diminish systemic virulence through neutrophil extracellular entrapment. / Crotty Alexander L. E., Maisey H.C., Timmer A.M. et al. // J Mol Med (Berl). – 2010. – Vol. 88 (4). – p. 371-381. 41. Cunningham M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections / Cunningham M. W. // Clinical Microbiology Reviews. – 2000. – Vol. 13 (3). – P. 470–511. 42. Danese S. Immune Regulation by Microvascular Endothelial Cells: Directing Innate and Adaptive Immunity, Coagulation, and Inflammation / Danese S., Dejana E., Fiocchi C. // J. Immunol. – 2007. – Vol. 178. – P. 6017-6022. 43. Davenpeck K. L. Activation of Human Leukocytes Reduces Surface P-Selectin Glycoprotein Ligand-1 (PSGL-1, CD162) and Adhesion to P-Selectin In Vitro / Davenpeck K. L., Brummet – 101 – M. E., Hudson S. A. et al. // The Journal of Immunology. – 2000. – Vol. 165 (5). – P. 2764– 2772. 44. Deem T. L. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species / Deem T. L., Cook-mills J. M. // Blood. – 2009. – Vol. 104 (8). – P. 2385–2393. 45. Degnan B.A. Inhibition of human peripheral blood mononuclear cell proliferation by Streptococcus pyogenes cell extract is associated with arginine deiminase activity / Degnan B.A., Palmer J.M., Robson T. et al. // Infect. Immun. – 1998. – Vol. 66 (7). – P. 3050-3058. 46. Donelly R.P. Tissue-specific regulation of IL-6 production by IL-4. Differential effects of IL-4 on nuclear factor-kappa B activity in monocytes and fibroblasts / Donelly R.P., Crofford L.J., Freeman S.L. et al. // J. Immunol. – 1993. – Vol. 151 (10). – P. 5603-5612. 47. Dunzendorfer S. Secretoneurin, a novel neuropeptide, is a potent chemoattractant for human eosinophils / Dunzendorfer S., Schratzberger P., Reinisch N. et al. // Blood. – 1998. – Vol. 91 (5). – p. 1527-1532. 48. Dunzendorfer S. Flow-dependent regulation of endothelial Toll-like receptor 2 expression through inhibition of SP1 activity / Dunzendorfer S., Lee H., Tobias P. // Circ.Res. – 2004. – Vol.95. – P.684-691. 49. Edwards R. J. Specific C-terminal cleavage and inactivation of interleukin-8 by invasive disease isolates of Streptococcus pyogenes / Edwards R. J., Taylor G. W., Ferguson M. et al. // The Journal of Infectious Diseases. – 2005. – Vol. 192 (5). – P. 783–790. 50. Eriksson A. The superantigenic activity of streptococcal pyrogenic exotoxin B is independent of the protease activity. / Eriksson A., Norgren M. // FEMS Immunol Med Microbiol. – 1999. – Vol. 25 (4). – P. 355-363. 51. Fabbri M. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules / Fabbri M., Bianchi E., Fumagalli L., Pardi R. // Inflammation research. – 1999. – Vol. 48. – P. 239-246. 52. Fabriek B. O. The Macrophage Scavenger Receptor CD163 Functions as an Innate Immune Sensor for Bacteria / Fabriek B. O., van Bruggen R., Deng D. M. // Blood. – 2009. – Vol.113. – №4. – P.887–892. – 102 – 53. Feito M. J. Membrane cofactor protein (MCP, CD46) binding to clinical isolates of Streptococcus pyogenes: binding to M type 18 strains is independent of Emm or Enn proteins / Feito M. J., Sánchez A., Oliver M. A. et al. // Molecular Immunology. – 2007. – Vol. 44 (14). – P. 3571–3579. 54. Fernandez-Borja M. The regulation of leucocyte transendothelial migration by endothelial signalling events / Fernandez-Borja M., van Buul J. D., Hordijk P. L. // Cardiovascular Research. – 2010. – Vol. 86 (2). – P. 202–210. 55. Frantz S. Innate immunity and angiogenesis / Frantz S., Vincent K. A, Feron O., Kelly R. A. // Circulation Research. – 2005. – Vol. 96 (1). – P. 15–26. 56. Van Furth R. The mononuclear phagocyte system: a new classification of macrophages, monocytes, and their precursor cells. / van Furth R., Cohn Z. A., Hirsch J. G. et al. // Bull. World Health Organ.. – Vol. 46(6). – 1972. – p. 845-852. 57. Gerasimovskaya E.V. Extracellular ATP is a pro-angiogenic factor for pulmonary artery vasa vasorum endothelial cells / Gerasimovskaya E.V., Woodward H.N., Tucker D.A. // Angiogenesis. – 2008. – Vol.11. - № 2. – P.169-182. 58. Goda S. CX3C-chemokine, fractalkine-enhanced adhesion of THP-1 cells to endothelial cells through integrin-dependent and -independent mechanisms / Goda S., Imai T., Yoshie O. // Journal of Immunology. – 2000. – Vol. 164 (8). – P. 4313–4320. 59. Graveline R. TLR-2-Dependent Recognition of Streptococcus suis is Modulated by the Presence of Capsular Polysaccharide Which Modifies Macrophage Responsiveness / Graveline R., Segura M., Radzioch D., Gottschalk M. // International Immunology. – 2007. – Vol. 19 (4). – P. 375-389. 60. Greenberg J. W. Influence of Lipoteichoic Acid Structure on Recognition by the Macrophage Scavenger Receptor / Greenberg J. W., Fischer W., Joiner K. A. // Infection and Immunity. – 1996. – Vol.64 (8). – P.3318–3325. 61. Gunnet C.A., Heistad D.D., Berg D.J., Faraci F.M. IL-10 deficiency increases superoxide and endothelial dysfunction during inflammation / Gunnet C.A., Heistad D.D., Berg D.J., Faraci F.M. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. – 2000. – Vol. 279 (4). – P. 1555-1562. – 103 – 62. Gunnett C.A., Lund D.D., Faraci F.M., Heistad D.D. Vascular interleukin-10 protects against LPS-induced vasomotor dysfunction. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. – 2005. – Vol. 289 (2). – P. 624-630. 63. Guo Y.-L. Role of junctional adhesion molecule-like protein in mediating monocyte transendothelial migration / Guo Y.-L., Bai R., Chen C. X.-J. et al. // Arteriosclerosis. Thrombosis, and Vascular Biology. – 2009. – Vol. 29 (1). – P. 75–83. 64. Harder J. Activation of the Nlrp3 inflammasome by Streptococcus pyogenes requires streptolysin O and NF-kappa B activation but proceeds independently of TLR signaling and P2X7 receptor / Harder J., Franchi L., Muñoz-Planillo R. et al. // Journal of Immunology. – 2009. – Vol. 183 (9). – P. 5823–5829. 65. Harrison L. C. Chemokine Expression in the Monocytic Cell Line THP-1 in Response to Purified Shiga Toxin 1 and/or Lipopolysaccharides / Harrison L. C., van den Hoogen W., van Haaften V. Tesh. // Infection and immunity. – 2005. – Vol. 73. – P. 403-412. 66. Hart H. Monocytes cultured in cytokine-defined environments differ from freshly isolated monocytes in their responses to lL-4 and IL-10 / Hart H., Jones A. // J. Leukoc. Biol – 1995. – Vol. 57. – P. 909–918. 67. Heit B. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients / Heit B., Tavener S., Raharjo E., Kubes P. // The Journal of Cell Biology. – 2002. – Vol. 159 (1). – P. 91–102. 68. Herter J. Integrin Regulation during Leukocyte Recruitment / Herter J., Zarbock A. // Journal of Immunology. – 2013. – Vol. 190 (9). – P. 4451–4457. 69. Hidalgo-Grass C. A streptococcal protease that degrades CXC chemokines and impairs bacterial clearance from infected tissues / Hidalgo-Grass C., Mishalian I., Dan-Goor M. et al. // The EMBO Journal. – 2006. – Vol. 25 (19). – P. 4628-4637. 70. Hmama Z. Monocyte Adherence Induced by Lipopolysaccharide Involves CD14, LFA-1, and Cytohesin-1 / Hmama Z., Knutson K. L., Herrera-Velit P. et al. // J. of Biol. Chem. – 1999. – Vol. 247. – P. 1050-1057. – 104 – 71. Huttenlocher A., Poznansky M. C. Reverse leukocyte migration can be attractive or repulsive / Huttenlocher A., Poznansky M. C. // Trends in Cell Biology. – 2008. – Vol. 18 (6). – P. 298–306. 72. Imhof B. A. Adhesion mechanisms regulating the migration of monocytes. Nature Reviews / Imhof B. A, Aurrand-Lions M. // Immunology. – 2004. – Vol. 4 (6). – P. 432–444. 73. Janeway C. A. Immunobiology. The immune system in health and disease / Janeway C. A., Travers P., Walport M., Shlomchik M. J. – New York: Garland Science, 2008. – 823 p. 74. Johnson-Léger C. The parting of the endothelium: miracle, or simply a junctional affair? / Johnson-Léger C., Aurrand-Lions M., Imhof B. A. // Journal of Cell Science. – 2000. – Vol. 113 (6). – P. 921–933. 75. Johnston B. Chemokines in Rapid Leukocyte Adhesion Triggering and Migration / Johnston B., Butcher E.C. // Seminars in Imunology. – 2002. – Vol. 14. – P. 83-92. 76. Kaplanski G. Thrombin-activated human endothelial cells support monocyte adhesion in vitro following expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1; CD54) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1; CD106) / Kaplanski G., Marin V., Fabrigoule M. et al. // Blood. – 1998. – Vol. 92 (4). – P. 1259–1267. 77. Kaplanski G. IL-6: a regulator of the transition from neutrophil to monocyte recruitment during inflammation / Kaplanski G., Marin V., Montero-Julian F. et al. // Trends in Immunology. – 2003. – Vol. 24 (1). P. 25–29. 78. Kaur S.J. The CXC Chemokine-Degrading Protease SpyCep of Streptococcus pyogenes Promotes Its Uptake into Endothelial Cells / Kaur S.J., Nerlich A., Bergmann S. et al. // The Journal of Biological Chemistry. – 2010. – Vol. 285. – N. 36. – P. 27798-27805. 79. Kawakami A. Apolipoprotein CIII-induced THP-1 cell adhesion to endothelial cells involves pertussis toxin-sensitive G protein- and protein kinase C alpha-mediated nuclear factorkappaB activation / Kawakami A., Aikawa M., Nitta N. et al. // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. – 2007. – Vol. 27 (1). – P. 219–225. 80. Kerr J.R. Cell Adhesion Molecules in the Pathogenesis of and Host Defence against Microbial Infection / Kerr J.R. // J. Clin. Pathol.: Mol. Pathol. – 1999. – Vol.52. – p.220-230. – 105 – 81. Kimball S. Activation of cytokine production and adhesion molecule expression on THP-1 myelomonocytic cells by macrophage colony-stimulating factor in combination with interferon-γ / Kimball S., Kovacs E., Clark M.C., Schneider C.R. // J. Leukoc. Biol. – 1995. – Vol. 58. – P. 585–594. 82. Klinman D.M. CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma. / Klinman D.M., Yi A.K., Beaucage S.L. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 1996. – Vol. 93 (7). – p. 2879-2883. 83. La Sala A. Alerting and turning the immune response by extracellular nucleotides / La Sala A., Ferrari D., Di Virgilio F., Idzko M. // J. Leukoc. Biol. – 2003. – Vol. 73. – P. 339-343. 84. Le Y. Novel Pathophysiological Role of Classical Chemotactic Peptide Receptors and Their Communications with Chemokine Receptors / Le Y., Li B., Gong W. et al. // Immunological Reviews. – 2000. – Vol. 177. – P. 185-194. 85. Lee S. An antibody to the sixth Ig-like domain of VCAM-1 inhibits leukocyte transendothelial migration without affecting adhesion / Lee S., Yoon I.-H., Yoon A. et al. // Journal of Immunology. – 2012. – Vol. 189 (9). – P. 4592–4601. 86. Levy R. Stimulation of Oxidative Burst in Human Monocytes by Lipoteichoic Acids / Levy R., Kotb M., Nagauker O. et al. // Infection and Immunity. – 1990. – Vol. 58 (2). – P. 566-568. 87. Ley K. Getting to the Site of Inflammation: the Leukocyte Adhesion Cascade Updated / Ley K., Laudanna C., Cybulsky M.I., Nourshargh S. // Nature. – 2007. – Vol.7. – p. 678-. 88. Lipowsky H.H. The Endothelial Glycocalyx as a Barrier to Leukocyte Adhesion and its Mediation by Extracellular Proteases / Lipowsky H.H. // Ann. Biomed. Eng. – 2012. – Vol. 40 (4). – P. 840-848. 89. Liu Z. TLR4 Signaling augments monocyte chemotaxis by regulating G protein-coupled receptor kinase 2 translocation / Liu Z., Jiang Y., Li Y. et al. // Journal of Immunology. – 2013. – Vol. 191 (2). – P. 857–864. 90. Lucas R. Regulators of endothelial and epithelial barrier integrity and function in acute lung injury / Lucas R., Verin A. D., Black S. M., Catravas J. D. // Biochemical Pharmacology. – 2009. – Vol. 77 (12). – P. 1763–1772. – 106 – 91. Luscinskas F. The Role of Endothelial cell Latheral Junctions During Leukocyte Trafficking / Luscinskas F., Ma S., Nusrat A. et al. // Immunol. Rev. – 2002. – Vol. 186. – P. 57-67. 92. Luscinskas F. W. Monocyte rolling, arrest and spreading on IL-4-activated vascular endothelium under flow is mediated via sequential action of L-selectin, β1-integrins, and β2integrins / Luscinskas F. W., Kansas G. S., Ding H. et al. // J. Cell Biol. – 1994. – Vol. 125 (6). – P. 1417–1427. 93. Ma Y.-Q. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils / Ma Y.-Q., Plow E. F., Geng J.-G. // Blood. – 2004. – Vol. 104 (8). – P. 2549–56. 94. Mamdouh Z. Trancellular Migration of Leukocytes is Mediated by the Endothelial Lateral Border Recycling Compartment / Mamdouh Z., Mikhailov A., Muller W.A. // J. Exp. Med. – 2009. – Vol. 206 (12). – P.2795-2808. 95. Mangan D.F. IL-4 enhances programmed cell death (apoptosis) in stimulated human monocytes / Mangan D.F., Robertson B., Wahl S.M. // J. Immunol. – 1992. – Vol. 148 (6). – P. 1812-1816. 96. Mantovani A. Regulation of endothelial function by pro- and anti-inflammatory cytokines / Mantovani A., Garlando C., Introna M., Vecchi // Transplantation proceeding. – 1998. – Vol. 30. – P. 4239-4243. 97. Mantovani A. Cytokine regulation endothelial cell function: from molecular level to bedside / Mantovani A., Bussolino F., Martino I. // Immunology today. - 1997. – Vol. 1. – P. 231-239. 98. Marin V. The IL-6-Soluble IL-6R α Autocrine Loop of Endothelial Activation as an Intermediate Between Acute and Chronic Inflammation: an Experimental Model Involving Thrombin / Marin V., Montero-Julian F. A., Grès S. et al. // J. Immunol. – 2001. – Vol. 67. – P. 3435-3442. 99. Martins-Green M. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing / Martins-Green M., Petreaca M., Wang L. // Advances in Wound Care. – 2013. – Vol. 2 (7). – P. 327–347. – 107 – 100. Maxeiner H. Complementary roles for scavenger receptor A and CD36 of human monocytederived macrophages in adhesion to surfaces coated with oxidized low-density lipoproteins and in secretion of H2O2 / Maxeiner H., Husemann J., Thomas C. A. et al. // J. Exp. Med. – 1998. – Vol. 188 (12). – P. 2257–2265. 101. McInnes I. B. IL-10 improves skin disease and modulates endothelial activation and leukocyte effector function in patients with psoriatic arthritis / McInnes I. B., Illei G. G., Danning C. L. et al. // J. Immunol. – 2001. – Vol. 167 (7). – P. 4075–4082. 102. Meager A. Cytokine regulation of cellular adhesion molecule expression in inflammation / Meager A. // Cytokine and growth factor reviews. – 1999. – Vol. 10. – P. 27-39. 103. Miettinen M. Live Lactobacillus rhamnosus and Streptococcus pyogenes differentially regulate Toll-like receptor (TLR) gene expression in human primary macrophages / Miettinen M., Veckman V., Latvala S. et al. // Journal of Leukocyte Biology. – 2008. – Vol. 84 (4). – P. 1092–1100. 104. Miettinen H. Lactobacilli and streptococci induce interleukin 12 (IL-12), IL-18 and gamma interferon production in human peripheral blood mononuclear cells. / Miettinen H., Maticainen S., Vuopio-Varkila J. // Infect Immun. – 1998. – Vol. 66 (12). – P.6058-6062. 105. Molinari G., Chhatwal G. S. Streptococcal invasion / Molinari G., Chhatwal G. S. // Current Opinion in Microbiology. – 1999. – Vol. 2. – P. 56–61. 106. Montuori N. Expression of the 67-kDa Laminin Receptor in Acute Myeloid Leukemia Cells Mediates Adhesion to Laminin and Is Frequently Associated with Monocytic Differentiation / Montuori N., Selleri C., Risitano A. M. et al. // Clinical Cancer Research. – 1999. – Vol. 5. – P. 1465-1472. 107. Muller W.A. Leukocyte-Endothelial-Cell Interactions in Leukocyte Transmigration and the Inflammatory Response / Muller W.A. // TRENDS in Immunology. – 2003. – Vol. 24. – N.6. – P.326-. 108. Muller W. Migration of Leukocytes across Endothelium and Beyond: Molecules Involved in the Transmigration and Fate of Monocytes / Muller W., Randolph G.J. // Journal of Leukocyte Biology. – 1999. – Vol. 66. – P. 698-704. – 108 – 109. Munoz J. J. The Inhibition of Neutrophil Granule Enzyme Secretion and Chemotaxis by Pertussis Toxin Inhibition by Pertussis Toxin of Granule Enzyme / Munoz J. J., Afi R. I. S. H. A. // 1985. – Vol. 5. – P. 1641–1646. 110. Mutin M. Immunologic phenotype of cultured endothelial cells: quantitative analysis of cell surface molecules / Mutin M., Dignat-George F., Sampol J. // Tissue antigens. - 1998. - Vol.50. - P. 449-458. 111. Nasser M. W. Cross-Desensitization among CXCR1, CXCR2, and CCR5: Role of Protein Kinase C- / Nasser M. W., Marjoram R. J., Brown S. L., Richardson R. M. // The Journal of Immunology. – 2005. – Vol. 174 (11). – P. 6927–6933. 112. Nau R. Modulation of Release of Proinflammatory Bacterial Compounds by Antibacterials : Potential Impact on Course of Inflammation and Outcome in Sepsis and Meningitis / Nau R., Eiffert H. // Clin. Microbiol. Rev. – 2002. – Vol. 15 (1). – P. 95–110. 113. Navarre W. W. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope / Navarre W. W., Schneewind O. // Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. – 1999. – Vol. 63 (1). – P. - 174–229. 114. Nerlich A. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism / Nerlich A., Rohde M., Talay S. R. et al. // The Journal of Biological Chemistry. – 2009. – Vol. 284 (30). – P. 20319–20328. 115. Nobbs A. H. Streptococcus adherence and colonization / Nobbs A. H., Lamont R. J., Jenkinson H. F. // Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. – 2009. – Vol. 73 (3). – P. 407–450. 116. Nourshargh S. Transmigration Throw Venular Walls: a Key Regulator of Leukocyte Phenotype and Function / Nourshargh S., Marelli-Berg F.M. // Trends In Immunology. – 2005. – Vol. 26. – N.3. – p. 157-. 117. Olsnes C. Chemokines are secreted by monocytes following OK-432 (lyophilized Streptococcus pyogenes) stimulation. / Olsnes C., Stavang H., Brokstad K. et al. // BMC Immunol. – 2009. – Vol. 10. – 109 – 118. Olsnes C. MAPKs ERK and p38, but not JNK phosphorylation, modulate IL-6 and TNF-α secretion following OK-432 in vitro stimulation of purified human monocytes. / Olsnes C., Olofsson J., Aarstad H.J. // Scand J Immunol. – 2011. – Vol. 74(2). – p.114-125. 119. Opitz B. Innate Immune Recognition in Infectious and Noninfectious Diseases of the Lung / Opitz B., van Laak V., Eitel J., Suttorp N. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2010. – Vol. 181. – p. 1294-1309. 120. Orino E. IL-4 up-regulates IL-1 receptor antagonist gene expression and its production in human blood monocytes / Orino E., Sone S., Nii A., Ogura T. // J. Immunol. – 1992. – Vol. 149 (3). – P. 925-931. 121. Osterud B. Role of monocytes in atherogenesis / Osterud B., Bjorklid E. // Physiological Reviews. – 2003. – Vol. 83 (4). – P. 1069–1112. 122. Ozinsky A. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors / Ozinsky A., Underhill D. M., Fontenot J. D. et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2000. – Vol. 97 (25). – P. 13766–13771. 123. Påhlman L. I. M protein from Streptococcus pyogenes induces tissue factor expression and pro-coagulant activity in human monocytes / Påhlman L. I., Malmström E., Mörgelin M., Herwald H. // Microbiology. – 2007. – Vol. 153 (8). – P. 2458–2464. 124. Påhlman L. I. Streptococcal M protein: a multipotent and powerful inducer of inflammation / Påhlman L. I., Mörgelin M., Eckert J. et al. // Journal of Immunology. – 2006. – Vol. 177 (2). – P. 1221–1228. 125. Parish C. R. The Role of Heparan Sulphate in Inflammation / Parish C. R. // Nature Rewiews. Immunology. – 2006. – Vol. 6. – P. 633-642. 126. Patterson M. J. Streptococcus / Patterson M. J. // Medical Microbiology. – 1996. 127. Penela P., Nogués L., Mayor F. Role of G protein-coupled receptor kinases in cell migration / Penela P., Nogués L., Mayor F. // Current Opinion in Cell Biology. – 2014. – Vol. 27. – P. 10– 17. – 110 – 128. Perera P. Y. The Role of Interleukin-15 in Inflammation and Immune Responses to Infection: Implications for Its Therapeutic Use / Perera P. Y., Lichy J. H., Waldmann T. A., Perera L. P. // Microbes Infect. – 2012. – Vol. 14 (3). – p. 247-261. 129. Petri B. The Physiology of Leukocyte Recruitment: An In Vivo Perspective / Petri B., Phillipson M., Kubes P. // The Journal of Immunology. – 2008. – Vol. 180 (10). – P. 6439– 6446. 130. Romano M. Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines and leukocyte recruitment / Romano M., Sironi M., Toniatti C. et al. // Immunity. – 1997. – Vol. 6 (3). – P. 315–325. 131. Ronald J. A. Differential regulation of transendothelial migration of THP-1 cells by ICAM1/LFA-1 and VCAM-1/VLA-4 / Ronald J. A., Ionescu C. V., Rogers K. A., Sandig M. // Journal of Leukocyte Biology. – 2001. – Vol. 7. – P. 601-609. 132. Sahni S. K. Endothelial cell infection and hemostasis / Sahni S. K. // Thrombosis Research. – 2007. – Vol. 119 (5). – P. 531–549. 133. Santos-Sierra S., Golenbock D. T., Henneke P. Toll-like receptor-dependent discrimination of streptococci / Santos-Sierra S., Golenbock D. T., Henneke P. // Journal of Endotoxin Research. – 2006. – Vol. 12 (5). – P. 307–312. 134. Schwarz-Linek U. High affinity streptococcal binding to human fibronectin requires specific recognition of sequential F1 modules. / Schwarz-Linek U., Pilka E. S., Pickford A. R. et al. // J Biol Chem. – 2004. – Vol. 279 (37). – p. 39017-39025. 135. Schwiebert L.M. Extracellular ATP signaling and P2X nucleotide receptors in monolayer of primary human vascular endothelial cells / Schwiebert L.M., Rice W.C., Kudlow B.A. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2002. – Vol.282 (2). – P. 289-301. 136. Sriskandan S. Bacterial superantigen-induced human lymphocyte responses are nitric oxide dependent and mediated by IL-12 and IFN-gamma. / Sriskandan S., Evans T.J., Cohen J. // J Immunol. – 1996. – Vol. 156 (7). – P. 2430-2435. – 111 – 137. Stadtmann A. Rap1a activation by CalDAG-GEFI and p38 MAPK is involved in E-selectindependent slow leukocyte rolling / Stadtmann A., Brinkhaus L., Mueller H. et al. //Eur. J. Immunol. – 2011. – Vol. 41 (7). – P. 2074–2085. 138. Stark G. How cells respond to interferons / Stark G., Kerr I. M., Williams B. R. G. et al. // Annu.Rev.Biochem.-1998.- Vol.67.- P.227-64. 139. Stockbauer K. E. A natural variant of the cysteine protease virulence factor of group A Streptococcus with an arginine-glycine-aspartic acid (RGD) motif preferentially binds human integrins alphavbeta3 and alphaIIbbeta3. / Stockbauer K. E., Magoun L., Liu M. et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1999. – Vol. 96 (1). – p. 242-247. 140. Stocker C. TNF-a, IL-4, and IFN-g regulate differential expression of P- and E-selectin expression by porcine aortic endothelial cells / Stocker C., Sugars K. L., Harari O. A. et al. // The Journal of Immunology.- 2000.- Vol.164.-P.3309-3315. 141. Strasly M. IL-12 inhibition of endothelial cell functions and angiogenesis depends on lymphocyte-endothelial cell cross-talk / Strasly M., Cavallo F., Geuna M. et al. // J. Immunol. – 2001. – Vol. 166 (6). – P. 3890–3899. 142. Strazynski M. Interleukin (IL)-6 and IL-10 induce decorin mRNA in endothelial cells, but interaction with fibrillar collagen is essential for its translation / Strazynski M., Eble J. A, Kresse H., Schönherr E. // The Journal of Biological Chemistry. – 2004. – Vol. 279 (20). – P. 21266–70. 143. Sumagin R. LFA-1 and Mac-1 define characteristically different intraluminal crawling and emigration patterns for monocytes and neutrophils in situ / Sumagin R., Prizant H., Lomakina E. et al. // J. Immunol. – 2010. – Vol. 185 (11). – P.7057-7066. 144. Sun H. The interaction between pathogens and the host coagulation system / Sun H. // Physiology. – 2006. – Vol. 21. – P. 281–288. 145. Takahashi T. Activation of human neutrophil by cytokine-activated endothelial cells. / Takahashi T., Hato F., Yamane T. et al. // Circ. Res. – 2001. – Vol. 88. – P. 422-429. 146. Tart A. H. New understanding of the group A Streptococcus pathogenesis cycle / Tart A. H., Walker M. J., Musser J. M. // Trends in Microbiology. – 2007. – Vol. 15 (7). – P. 318–325. – 112 – 147. Taylor A. L. Induction of contact-dependent CD8+ regulatory T-cells through stimulation with staphylococcal and streptococcal antigens. / Taylor A.L., Cross E.L.A., Llewelyn M.J. // Immunology. – 2011. – Vol. 135. – P.158-167. 148. Tedgui A. Anti-Inflammatory Mechanisms in the Vascular Wall / Tedgui A., Mallat. Z. // Circ. Res. – 2001. – Vol. 88. – P. 877-887. 149. Tharp W. G. Neutrophil chemorepulsion in defined interleukin-8 gradients in vitro and in vivo / Tharp W. G., Yadav R., Irimia D. et al. // J. Leukoc. Biol. – 2006. – Vol. 79. – P. 539-554 150. Thern A. Expression of two different antiphagocytic M proteins by Streptococcus pyogenes of OF+ lineage / Thern A., Wästfelt M., Lindahl G. // J. Immunol. – 1998. – Vol.160. – P.1–10. 151. Thomas C. A. Protection from lethal gram-positive infection by macrophage scavenger receptor-dependent phagocytosis / Thomas C. A., Li Y., Kodama T. et al. // The Journal of Experimental Medicine. – 2000. – Vol. 191 (1). – P. 147–156. 152. Tsai P.-J. Group A Streptococcus Induces Apoptosis in Human Epithelial Cells / Tsai P.-J., Lin Y.-S., Kuo C.-F. et al. // Infection and Immunity. – 1999. – Vol. 67 (9). – P. 4334-4339. 153. Umehara H. Fractalkine, a CX3C chemokine, functions predominantly as an adhesion molecule in monocytic cell line THP-1 / Umehara H., Bloom E. T., Okazaki T. et al. // Immunology and cell biology.- 2001.- Vol.79.- P.298-302. 154. Weber C. The Role of Junctional Adhesion Molecules in Vascular Inflammation / Weber C., Fraemohs L., Dejana E. // Nature Reviews. Immunology. – 2007. – Vol. 7. – P. 467-477. 155. Weber K. S. Monocyte arrest and transmigration on inflamed endothelium in shear flow is inhibited by adenovirus-mediated gene transfer of IkappaB-alpha / Weber K. S., Draude G., Erl W. et al. // Blood. - 1999. - Vol. 93 (11). - P. 3685–93. 156. Weerasinghe D. A role for the alphavbeta3 integrin in the transmigration of monocytes / Weerasinghe D., McHugh K. P., Ross F. P.// J. Cell Biol. – 1998. – Vol. 142 (2). – P. 595–607. 157. de Winther M. P. J. Macrophage scavenger receptor class A: a multifunctional receptor in atherosclerosis / de Winther M. P. J., van Dijk K. W., Havekes L. M., Hofker M. H. // Arteriosclerosis, Trombosis and Vascular Biology. – 2000. – Vol.20. – P.290–297. – 113 – 158. Wong C. H. Y. Molecular Regulators of Leukocyte Chemotaxis during Inflammation / Wong C. H. Y., Heit B., Kubes P. // Cardiovasc. Research. – 2010. – Vol. 86. – P. 183-191. 159. Yamaguchi M. Pleiotropic virulence factor - Streptococcus pyogenes fibronectin-binding proteins. / Yamaguchi M., Terao Y., Kawabata S. // Cell Microbiol. – 2013. – Vol. 15 (4). – p. 503-511. 160. Yang C.-R. Decoy Receptor 3 Increases Monocyte Adhesion to Endothelial Cells via NF- BDependent Up-Regulation of Intercellular Adhesion Molecule-1, VCAM-1, and IL-8 Expression / Yang C.-R., Hsieh S.-L., Ho F.-M., Lin W.-W. // J. Immunol. – 2005. – Vol. 174 (3). – P. 1647–1656. 161. Yu T. Amlodipine modulates THP-1 cell adhesion to vascular endothelium via inhibition of protein kinase C signal transduction / Yu T., Morita I., Shimokado K. et al. // Hypertension. -2003. - Vol. 42 (3). - P. 329–334. 162. Yuan S. Y. Neutrophil transmigration, focal adhesion kinase and endothelial barrier function / Yuan S. Y., Shen Q., Rigor R. R., Wu M. H. // Microvascular Research. - 2013. - Vol. 83 (1). - P. 82–88.
