На правах рукописи Гончарук Сергей Александрович
advertisement
На правах рукописи Гончарук Сергей Александрович МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА KCNE: СОЗДАНИЕ ЭФФЕКТИВНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВПРОДУЦЕНТОВ, ОЧИСТКА И ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ Специальность: 03.00.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2008 Работа выполнена в ИБХ РАН, на Кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ(ГУ). Научный руководитель: доктор биологических наук, академик Кирпичников Михаил Петрович Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, Ефремов Роман Гербертович профессор доктор биологических наук Равин Николай Викторович Ведущая организация: Институт Молекулярной Генетики РАН Защита состоится “ ” 2008 г. в часов минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 по адресу: 119991, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, «Новая» аудитория. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан “ ” 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологическиз наук, профессор __________________ Т.Е. Кренделева 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Мембранные белки (МБ) составляют более четверти всех белков, кодируемых геномом человека. Они представляют собой существенную часть биологической мембраны и участвуют во многих процессах жизнедеятельности клетки. Установление взаимосвязи между структурой МБ и их функцией является одной из актуальных задач структурной биологии, решение которой имеет большое практическое значение. Так, МБ являются исключительно привлекательными мишенями разного рода терапевтических стратегий и в настоящее время действие примерно половины лекарственных препаратов направлено именно на них. Получение данных, касающихся пространственной структуры МБ, а также механизмов их функционирования, способствует более глубокому пониманию биологических процессов и является ключевым моментом, лежащем в основе рационального дизайна лекарственных препаратов нового поколения. Белки семейства KCNE являются регуляторами свойств потенциал-зависимых калиевых каналов. Несмотря на то, что мутации в регуляторных субъединицах приводят к различным заболеваниям, таким как аритмия, глухота, семейный периодический паралич, структурные особенности, лежащие в основе функционирования белков семейства KCNE до сих пор еще не изучены. Главным образом это связано с отсутствием достаточного количества белкового препарата для проведения структурных исследований. Основные проблемы, возникающие при получении всех МБ, связаны с гидрофобностью их трансмембранных участков. До сих пор получение каждого нового МБ, пригодного для проведения структурно-функциональных исследований, остается сложной, а зачастую и вовсе неразрешимой задачей. Цель и задачи исследования Целью данной диссертационной работы является создание эффективных систем экспрессии и очистки dKCNE1, KCNE1, KCNE2 и KCNE3 в клетках E. coli, а также изучение структурных особенностей, присущих белкам семейства KCNE. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи: • Создание эффективных систем экспрессии генов dKCNE1, KCNE1, KCNE2, KCNE3. • Разработка эффективных методик очистки белков dKCNE1, KCNE1, KCNE2 и KCNE3. • Определение структурных характеристик, присущих белкам семейства KCNE на основании данных, полученных методами КД-спектроскопии, динамического светорассеяния и ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Объекты и методы исследования В работе использовали традиционные методы генной инженерии и белковой химии: полимеразную цепную реакцию (ПЦР), рестрикцию, лигирование, электрофорез ДНК, 3 выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей, выделение плазмидной ДНК из E. coli, трансформацию клеток E. coli плазмидной ДНК, денатурирующий электрофорез белков, различные типы хроматографии; методы спектроскопии кругового дихроизма; динамического светорассеяния; ЯМР-спектроскопии. В качестве объектов исследования были выбраны белки семейства KCNE – KCNE1, KCNE2, KCNE3 и dKCNE1, укороченный вариант KCNE1. Научная новизна и практическая значимость работы В данной диссертационной работе предложены оригинальные стратегии получения МБ в клетках E. coli, позволяющие получать миллиграммовые количества чистых белков, а также их изотопно-меченых производных (15N, 13C, 2H), достаточные для проведения структурно-функциональных исследований. Эффективность представленных методов подтверждается высокими выходами белковых продуктов – dKCNE1, KCNE1, KCNE2 и KCNE3. Показано, что белки семейства KCNE имеют характерные α-спиральные участки в Nи C- концевых доменах, α-спиральный трансмембранный регион и прилегающий к мембране заряженный «квадруплет». Выдвинута гипотеза об опосредованном влиянии N- и Сконцевых участков белков семейства KCNE на функционирование калиевых потенциал-зависимых каналов. Выявлены «гликофориновые мотивы» в трансмембранных участках всех представителей семейства KCNE, а также S5/S6 доменах каналов KCNQ1 и HERG. Предполагается, что эти мотивы ответственны за образование функционально активных комплексов калиевых каналов. Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции NMRCM (Санкт Петербург 2007); L юбилейной научной конференции МФТИ (ГУ) (Москва 2007); ХVI зимней международной молодёжной научной школе (Москва 2004); XLVII научной конференции МФТИ (ГУ) (Москва 2004). Публикации По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них в рецензируемых журналах – 1; в российских и иностранных журналах, входящих в перечень ВАК – 1; тезисы докладов на международных конференциях и семинарах – 1; тезисы докладов на российских научных конференциях – 2. Объем и структура работы Диссертация состоит из Введения, трех глав, Заключения, Выводов и Списка цитируемой литературы. Общий объем работы составляет 103 страницы текста, включая 17 рисунков, 7 таблиц и 1 схему. Список цитируемой литературы содержит 110 источников. 4 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Мембранные белки семейства KCNE представляют собой вспомогательные (или β-) субъединицы, которые модулируют свойства потенциал-зависимых калиевых каналов, изменяя ряд присущих им характерных параметров, таких как проводимость, селективность, скорость потока ионов, чувствительность к лекарственным препаратам. Взаимодействие α- и β– субъединиц каналов приводит к формированию стабильных комплексов, которые характеризуются повторением свойств нативных токов в экспериментальных системах. На данный момент обнаружено пять представителей семейства KCNE, однако, наиболее полно охарактеризованы только три из них - KCNE1, KCNE2 и KCNE3. Длина этих субъединиц варьирует от 103 до 177 аминокислотных остатков, и для каждой из них были выявлены порообразующие партнеры. Так, стабильные комплексы KCNE1 с α-субъединицей потенциал-зависимого калиевого канала KCNQ1 обнаружены в клетках слухового эпителия, причем мутации в KCNE1 связывают с болезнью, известной как синдром Джервелла–Ланге–Нильсена (глухота). Интересно, что укороченный вариант KCNE1 (dKCNE1), имеющий достаточно протяженные делеции как в N- так и в C-концевых областях молекулы, сохраняет в экспериментальных системах функциональную активность, свойственную полноразмерному KCNE1. Белок KCNE2 взаимодействует с потенциал-зависимым калиевым каналом HERG, а мутации в KCNE2 ответственны за такое заболевание, как сердечная аритмия. Комплексы KCNE3 с α-субъединицей потенциал-зависимого калиевого канала Kv3.4 представлены на поверхности клеток скелетной мышцы. Неправильное их функционирование связывают с семейным периодическим параличом. Имеющиеся на сегодня данные электрофизиологических исследований не позволяют выявить структурные особенности регуляторных субъединиц калиевых каналов. Для проведения структурных исследований необходимы миллиграммовые количества белка. Данная работа посвящена разработке эффективных стратегий получения белков семейства KCNE, позволяющих при помощи оптических методов и спектроскопии ЯМР выявить структурные особенности, характерные для представителей данного семейства. Создание эффективных систем экспрессии генов dKCNE1, KCNE1, KCNE2 и KCNE3 Выбор системы экспрессии. Для достижения высокого уровня экспрессии генов МБ в бактериальных клетках такие подходы, как прямая и секреторная экспрессии чаще всего оказываются неприменимыми. МБ, в силу наличия у них гидрофобных трансмембранных участков, имеют тенденцию встраиваться в клеточную мембрану. В условиях суперэкспрессии это приводит к нарушению целостности мембраны, и, как следствие, к лизису клеток. Клетка может избежать гибели, если инициирует такие механизмы, как накопление белка в составе телец включения или же его деградация. Так, при помощи прямой экспрессии из всех выбранных объектов успешно удалось экспрессировать лишь KCNE1 вследствие его накопления в составе телец включения. В случае KCNE2 мы 5 наблюдали высокую токсичность, даже когда ген KCNE2 был транскрипционно неактивен. В случае KCNE3 детектировать белок не удалось, что, по-видимому, связано с его внутриклеточной деградацией. Для создания эффективных систем экспрессии генов dKCNE1, KCNE2, KCNE3 мы прибегли к созданию гибридных конструкций. Для dKCNE1 и KCNE3 в качестве белка–партнера был выбран тиоредоксин E. coli (Trx), небольшой белок с молекулярной массой 12 кДа, содержащийся во многих животных, растительных и бактериальных клетках. Ряд свойств Trx делают его весьма привлекательным партнером для коэкспрессии, в частности, высокая растворимость (он может накапливаться в клетке до 40 % от общей белковой массы E. coli, при этом полностью оставаясь в растворимой форме), а также доступность расположенных на поверхности белковой глобулы С– и N– концов молекулы. Так как тиоредоксин - сравнительно небольшой белок, его доля в гибридной конструкции невелика и обычно сравнима с долей целевого белка. Использование Trx в качестве белка-партнера позволило эффективно экспрессировать оба объекта (dKCNE1 и KCNE3). В случае KCNE2 использование тиоредоксина отчасти решало проблему цитотоксичности (по сравнению с результатами прямой экспрессии KCNE2). Однако же, эффективность экспрессии оказалась крайне низкой. В связи с этим, для гибридной экспрессии KCNE2 был выбран другой белок-партнер – мистик (Mistic). Это необычный интегральный мембранный белок из Bacillus subtilis, имеющий массу 13 кДа. Известно, что при гетерологичной экспрессии в E. coli мистик взаимодействует с бактериальной мембраной, что особенно интересно, так как он является гидрофильным белком. На сегодняшний день существует ряд статей, в которых применение мистика в качестве белка-партнера обеспечивает высокий уровень экспрессии мембранных белков в E. coli. В нашем случае использование мистика также позволило существенно повысить уровень экспрессии гена KCNE2 по сравнению с эффективностью продукции этого белка в составе с тиоредоксином. Сборка экспрессионных конструкций. Гены dKCNE1, KCNE1 и KCNE2 были любезно предоставлены с.н.с. Лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН, к.х.н. Корольковой Ю.В. Для сборки экспрессионной конструкции в случае KCNE1 использовали плазмидный вектор pGEMEX-1, в котором ген целевого белка находится под контролем T7 промотора. При помощи ПЦР модифицировали концы гена, а именно добавляли рестрикционные сайты Nde I и Hind III. Кроме того, присоединяли к 3′-концу гена KCNE1 нуклеотидную последовательность, кодирующую шесть гистидинов (H6) (гистидиновый таг). Модифицированный ген клонировали по сайтам Nde I и Hind III в pGEMEX-1. Результирующий вектор, получивший название pGEMEX-1/KCNE1-Н6 (рисунок 1А), направлял синтез белкового продукта KCNE1-H6 (рисунок 1Б). Наличие гистидинового тага позволяло использовать металл-хелатную аффинную хроматографию (МХАХ) при очистке белка. 6 Ген dKCNE1 экспрессировали в составе вектора pGEMEX-1/Thio-EK, который был получен ранее в нашей лаборатории. При помощи ПЦР добавляли к 3'-концу гена dKCNE1 рестрикционный сайт BamH I. Клонирование в вектор проводили по тупому 5'-концу гена dKCNE1 и сайту BamH I. Результирующий вектор, получивший название pGEMEX-1/Thio-EK-dKCNE1 (рисунок 1А), направлял синтез белкового продукта Trx-GS-H6-GS-EK-dKCNE1 (рисунок 1Б), где Trx – тиоредоксин, GS – гибкий линкер Gly-Ser-Gly-Ser-Gly, H6 – гистидиновый таг, EK – сайт узнавания энтерокиназой (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). Последний сайт вставляли для того, чтобы иметь возможность отделения целевого белка от белка-носителя. Для краткости последовательность Trx-GS-H6-GS-EK названа Thio-EK, а для гибридного белка введено обозначение Thio-EK-dKCNE1. Сборку экспрессионной конструкции для KCNE3 проводили с использованием вектора pGEMEX-1/Thio-EK-dKCNE1. При помощи ПЦР заменяли нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт узнавания энтерокиназы, на последовательность, кодирующую сайт узнавания тромбином (TR) с образованием Thio-TR. KCNE3 собирали из десяти синтетических олигонуклеотидов при помощи ПЦР с введением на 5′ конец гена KCNE3 последовательности, комплементарной 3′ концу Thio-TR. С целью повышения эффективности экспрессии ген KCNE3 составляли с учетом частоты встречаемости кодонов в E. coli. При помощи ПЦР рекомбинировали последовательности Thio-TR и KCNE3 с добавлением на концы гена Thio-TR-KCNE3 сайтов рестрикции Nde I и Hind III. Клонирование Thio-TR-KCNE3 в вектор pGEMEX-1 проводили по этим же сайтам. Результирующий вектор, получивший название pGEMEX-1/Thio-TR-KCNE3 (рисунок 1А), направлял синтез белкового продукта Trx-GS-H6-GS-TR-KCNE3 (рисунок 1Б), где Trx – тиоредоксин, GS – гибкий линкер, H6 –гистидиновый таг, TR – сайт узнавания тромбина (Lys-Val-Pro-Arg-Gly-Ser). Последний сайт использовался для отделения целевого белка от белка-носителя. Для краткости последовательность Trx-GS-H6-GS-TR названа Thio-TR, а для гибридного белка введено обозначение Thio-TR-KCNE3. Сборку экспрессионной конструкции для KCNE2 проводили с использованием плазмидного вектора pET32/Mistic-TR, полученного ранее в нашей лаборатории. В этом векторе целевой ген находится под контролем Т7 промотора, сопряженного с lac-оператором, что обеспечивает более строгий контроль генной экспрессии. При помощи ПЦР к 3′-концу гена KCNE2 присоединяли нуклеотидную последовательность, кодирующую гистидиновый таг H6. Одновременно, добавляли рестрикционные сайты Nde I и Hind III, по которым проводилось клонирование гена KCNE2-H6 в экспрессионный вектор. Результирующий вектор, получивший название pET32/Mist-TR-KCNE2-H6 (рисунок 1А), направлял синтез белкового продукта Mistic-GS-TR-KCNE2-H6 (рисунок 1Б), где Mistic – мистик, GS – гибкий линкер, TR – сайт узнавания тромбином, H6 – гистидиновый таг. Для краткости последовательность Mistic-GS названа Mist, а для гибридного белка введено обозначение Mist-TR-KCNE2-H6. 7 Рисунок 1. Схематическое представление экспрессионных векторов (А) и соответствующих им белковых продуктов (Б). Условные обозначения: T7 pr – T7 промотор; ter – T7 терминатор; T7/lac pr – T7 промотор, за которым следует lac-оператор; Trx – тиоредоксин; Mistic – мистик; ЕК - сайт узнавания энтерокиназы; TR - сайт узнавания тромбина; H6 - гистидиновый таг; GS - гибкий линкер. 8 Получение меченых белков. Для проведения структурных исследований методом ЯМР-спектроскопии необходимы миллиграммовые количества белка, а также его изотопно-меченые производные (15N-, 15N/13С-, 2H/15N-, 2H/15N/13C-). В результате введения меток удается решить различные проблемы, возникающие в процессе анализа спектров ЯМР. Так, использование только 15N- меченого белка не всегда позволяет разрешить сигналы от нескольких атомов в силу малой дисперсии химических сдвигов. Использование дважды меченого белка (15N/13С-) чаще всего решает эту проблему за счет разложения спектра ЯМР по нескольким направлениям. В ряде случаев, для уменьшения ширины линий в спектрах ЯМР, необходимо получение дейтерированных вариантов меченых белков. Изотопно-меченые белки обычно получают путем культивирования бактерий на среде определенного состава, где в качестве единственного источника азота используются соли аммония, а в качестве единственного источника углерода – глюкоза или глицерин. Замена соответствующих химических реагентов на 15N- и/или 13С- меченые производные позволяет получать белки с введением изотопной метки по азоту и/или углероду. Иногда, из-за особенностей метаболизма бактерий, это приводит к снижению уровня экспрессии целевого белка. Оптимизация условий культивирования. Для экспрессии всех генов нами был выбран штамм E. coli BL21(DE3)pLysS, широко используемый для получения токсичных белков. Клетки этого штамма содержат хромосомную копию гена РНК–полимеразы фага Т7, а также плазмиду pLysS с геном лизоцима фага Т7. Лизоцим эффективно ингибирует Т7 РНК-полимеразу, в результате чего фоновый уровень индукции в клетках существенно снижен. С целью получения максимального выхода белка в растворимой форме, осуществляли подбор температуры выращивания бактерий и поиск оптимальной концентрации химического индуктора. Культивирование рекомбинантных штаммов на минимальной солевой среде М9 проводили при различных температурах после индукции (37°С, 25°С, 13°С) в присутствии различных концентраций индуктора изопропил–β–D– тиогалактозида (ИПТГ) (0, 0.01, 0.05, 0.25, 1 мМ). Результаты подбора условий культивирования для Thio-EK-dKCNE1 представлены на рисунке 2А. Экспрессия Thio-EK-dKCNE1 наблюдалась при всех исследуемых температурах и концентрациях индуктора. Максимальные выходы гибридного белка достигались в результате культивирования рекомбинантного штамма при 25 °С и концентрации индуктора 0.05 мМ ИПТГ. Практически весь гибридный белок растворялся в 1 % Triton X-100 (рисунок 2Б). Выход Thio-EK-dKCNE1 составил приблизительно 60 мг с литра минимальной среды М9. Использование 13С-глюкозы и 15N-хлорида аммония, для получения 15N-, 15N/13Cмеченых производных dKCNE1, никак не повлияло на выходы гибридного белка. Для дейтеро-меченых производных dKCNE1, выход гибридного белка падал приблизительно в 1.5 раза и составил 40 мг с литра культуры. KCNE1-Н6, напротив, накапливался преимущественно в тельцах включения. Такой вывод был сделан на основании того, что при солюбилизации 1 % Triton X-100 удавалось 9 Рисунок 2. Оптимизация условий культивирования Thio-ЕК–dKCNE1. A. Зависимость уровня экспрессии гибридного гена Thio-ЕК–dKCNE1 от концентрации индуктора. Температура культивирования после индукции: 25 °С. Б. Анализ внутриклеточной растворимости гибридного белка Thio-ЕК-dKCNE1, при различных температурах культивирования рекомбинантного штамма (концентрация ИПТГ 0.05 мМ). А Б Клеточный лизат Растворимый белок растворить лишь небольшое количество белка. Понижение температуры культивирования никак не способствовало увеличению его растворимости. Накопление максимального количества белка (приблизительно 40 мг с литра минимальной среды М9), а также изотопно-меченых производных, наблюдалось в присутствии 0.01 мМ ИПТГ. Стоит отметить, что введение 15N-, 15N/13C- меток не повлияло на эффективность экспрессии, в то время как культивирование рекомбинантного штамма в присутствии 80 % D2O привело к снижению уровня внутриклеточного синтеза дейтерированных производных в 2 раза. Максимальный выход гибридного белка Mist-TR-KCNE2-H6 (приблизительно 20 мг с литра минимальной среды М9) наблюдался при температуре клеточного роста 37 °С и концентрации индуктора 0.25 мМ ИПТГ. При этом белок накапливался в тельцах включения. Понижение температуры выращивания рекомбинантного штамма приводило к значительному падению выхода белка. Гибридный белок Thio-TR-KCNE3 при всех температурах клеточного роста накапливался исключительно в тельцах включения. Максимальные выходы гибрида, а также 15 N-, 15N/13C- меченых производных (примерно 100 мг с литра минимальной среды М9), достигались культивированием рекомбинантного штамма при 37 °С, и концентрации индуктора 0.01 мМ ИПТГ. Разработка эффективных методов очистки Основные этапы получения целевых белков dKCNE1, KCNE1-H6, KCNE2-H6, KCNE3 представлены на схеме 1. Отмывка телец включения (схема 1, А). Накопление белка в составе телец включения позволяет значительно упростить процедуру его очистки. Для этого клеточную биомассу разрушают в буфере, не содержащем детергент, после чего тельца включения осаждают центрифугированием при низких скоростях (от 500 g). При этом большинство белков E. coli 10 Схема 1. Основные стадии выделения исследуемых белков. МХАХ - металл-хелатная аффинная хроматография на сорбенте Ni2+-Сhelating Sepharose FF; гидрофоб. хромат. – гидрофобная хроматография на сорбенте С4 Диасорб; ионообмен. хромат. – ионообменная хроматография на сорбенте Q-Sepharose FF. остаются в растворе. Для повышения эффективности очистки, осадок телец включения можно промывать растворами, содержащими высокие концентрации (до 1 %) Triton X-100. Однако целесообразность использования детергента в значительной степени определяется особенностями, связанными с растворимостью целевого белка. Так, в случае KCNE1-H6, Mist-TR-KCNE2-H6 и Thio-TR-KCNE3 отмывка телец включения растворами, содержащими 1 % Triton X-100, способствовала получению более чистых белковых препаратов. Однако для KCNE1-H6 процедура отмывки телец включения оказалась непригодной, поскольку приводила к большим потерям белка из-за его частичного перехода в раствор. МХАХ (схема 1, Б). Для очистки всех белков проводили МХАХ на сефарозе (Сhelating Sepharose FF) с иммобилизованными на ней ионами никеля. Наличие Н6 тага обеспечивало 11 сродство к ионам двухвалентных металлов. В результате уже на этой стадии получали высокоочищенные препараты белка. Для солюбилизации KCNE1-H6, Mist-TR-KCNE2-H6 и Thio-TR-KCNE3, а также поддержания белков в растворимом виде на протяжении всех стадий очистки (если не оговорено иначе) использовали ионный детергент лаурилсаркозин. В случае Thio-EK-dKCNE1 для солюбилизации и растворимости белка использовали 1 % Triton X-100. Расщепление гибридных белков (схема 1, В). Отделение dKCNE1 от белка-носителя проводили при помощи гидролиза энтерокиназой. Легкая цепь энтерокиназы человека была получена ранее в нашей лаборатории. Фермент, молекулярный вес которого равен примерно 26 кДа, селективно гидролизует пептидную связь после последовательности DDDDK. Это позволяет получить целевой белок с нативным N–концом, не содержащим лишних аминокислот. Вероятность неспецифического гидролиза мала и зависит от конформации белкового субстрата и состава реакционной смеси. Для подбора оптимальных условий гидролиза проверяли эффективность и специфичность расщепления Thio-EK-dKCNE1 при различных соотношениях фермент/субстрат, а также различных концентрациях белка, соли и имидазола. Было установлено, что оптимальным является соотношение 1 единица (ед.) энтерокиназы на 1 мг гибридного белка (рисунок 3). При этом концентрация белка, соли и имидазола в реакционной смеси не оказывают влияния на эффективность и специфичность гидролиза. Как было показано, в присутствии ионного детергента лаурилсаркозина специфичность и эффективность расщепления энтерокиназой снижается. По этой причине, для остальных гибридных конструкций (Mist-TR-KCNE2-H6 и Thio-TR-KCNE3) был предусмотрен сайт расщепления тромбином. Данный фермент, масса которого составляет Рисунок 3. Подбор условий расщепления Thio–EK-dKCNE1 энтерокиназой. Расщепление проводилось при различных соотношениях гибридный белок (мг) / энтерокиназа (единицы, u) в буфере, в котором находился белок после металл-хелатной аффинной хроматографии, а также в трех- и пятикратно разбавленных буферах. Без разбавления Разбавление x3 12 Разбавление x5 40 кДа, узнает последовательность LVPRGS и селективно гидролизует пептидную связь, находящуюся непосредственно после аргинина. Экспериментальным путем было показано, что лаурилсаркозин не влияет на работу тромбина. В результате подбора условий гидролиза было установлено, что оптимальными являются соотношения 0.2 и 0.3 ед. тромбина на 1 мг Mist-TR-KCNE2-H6 и Thio-TR-KCNE3, соответственно. Разделение продуктов гидролиза (схема 1, Г). После расщепления гибридных белков, повторно проводили МХАХ. Белки dKCNE1 и KCNE3 не имели сродства к ионам никеля, в то время как продукты гидролиза (недощепленный гибридный белок и белок-носитель) эффективно связывались с сорбентом в силу наличия в их составе H6-тага. Использование гистидинового тага, расположенного на С-конце молекулы KCNE2-H6, при разделении продуктов гидролиза также позволило эффективно отделить целевой белок от белка-партнера. Данная стадия была заключительной при очистке KCNE2-H6. Выходы KCNE2-H6 составили приблизительно 5 мг с литра минимальной солевой среды M9 (таблица 1). Дополнительная очистка (схема 1, Д). Дополнительную очистку dKCNE1, а также его концентрирование проводили при помощи ионообменной хроматографии. На основании физико-химических свойств dKCNE1 была выбрана сильная анионообменная смола (Q Sepharose FF). Выход целевого белка, а также 15N-, 15N/13C- изотопно-меченых производных, составил примерно 8 мг с литра минимальной солевой среды М9. Выход дейтеро-меченого белка (15N/13C/2H- или 15N/2H-) составил не менее 6 мг с литра культуры (таблица 1). Для KCNE1-H6 и KCNE3 дополнительную очистку и концентрирование осуществляли при помощи гидрофобной хроматографии. Выбор данной стадии основывался на наличии в составе белков протяженных гидрофобных участков. Колонку (Tricorn) набивали вручную гидрофобной смолой Диасорб-C4. Хроматографию проводили в два Рисунок 4. Результаты последовательных стадий очистки KCNE1-H6. Рисунок 5. Результаты последовательных стадий очистки KCNE3. 13 Таблица 1. Выходы чистых белков и их изотопно-меченых производных, а также суммарные количества белковых препаратов, выделенных в ходе диссертационной работы. Кол-во выделенного белка, мг Белок Выход, мг/л Немеченый 15 N 15 N/2H 15 N/13C 15 N/13C/2H dKCNE1 8 (5*) 10 10 10 4 3 KCNE1-H6 16 (8*) 20 5 17 3 22 KCNE2-H6 4 5 - - - - KCNE3 10 10 5 - 15 - * - Выходы белка при выращивании на 80 % D2O этапа. На первом этапе отмывали смолу со связанным белком при помощи линейного градиента ацетонитрила в ацетатном буфере. На втором этапе проводили элюцию белка при помощи линейного градиента ацетонитрила, но уже в 0.1 % трифторуксусной кислоте для поддержания белка в растворимом виде. При такой концентрации кислоты через сравнительно небольшой промежуток времени (несколько часов) наблюдался кислотный гидролиз. В связи с этим, ТФУ немедленно выпаривали из белкового раствора под вакуумом. Затем проводили лиофилизацию. Выходы целевых белков, а также их изотопно-меченых (15N- и 15N/13C-) производных составили примерно 16 мг и 10 мг с литра минимальной солевой среды М9 для KCNE1-H6 и KCNE3, соответственно. Выход дейтеро-меченого KCNE1-H6 (15N/2H-, 15N/13C/2H-) составил не менее 8 мг с литра культуры (таблица 1). На рисунках 4 и 5 изображены последовательные стадии получения KCNE1-H6 и KCNE3. В процессе выполнения диссертационной работы были выделены dKCNE1, KCNE1-H6 и KCNE3, а также их изотопно-меченые производные в количествах, достаточных для проведения структурных исследований (таблица 1). Структурные исследования Исключение детергента. Использование детергентов (Triton X-100 или лаурилсаркозина) при очистке всех исследуемых объектов необходимо для поддержания белков в растворимом виде. Однако для возможности структурного исследования белков при помощи спектроскопии ЯМР высокого разрешения, требуется полностью исключить эти детергенты, так как их присутствие даже в малых количествах препятствует интерпретации спектров ЯМР. В случае KCNE2-H6 исключение детергента не проводили. В случаях KCNE1-H6 и KCNE3 лаурилсаркозин удаляли на стадии гидрофобной хроматографии. Для dKCNE1 исключение детергента проводили в два этапа: осаждение белка с Triton X-100 при помощи трихлоруксусной кислоты и отмывка белка от детергента при помощи ацетона. Первый этап необязателен, однако его применение существенно упрощает процедуру в техническом плане. Второй этап является ключевым. Triton X-100 растворяется в ацетоне, 14 тогда как белок выпадает в осадок. Это позволяет эффективно отмыть белок от детергента. Ацетон также создает определенные трудности при анализе ЯМР спектров, однако тщательное высушивание белкового осадка решает эту проблему. На этом заключительном этапе потери целевого белка напрямую зависели от того, насколько высокую концентрацию белка удавалось получить в элюате с ионообменной колонки. Чем меньше была концентрация белка, тем бóльшие потери наблюдались на стадии исключения детергента. Выбор окружения, имитирующего мембрану. Важным этапом подготовки образцов к проведению структурных исследований является выбор мембраноподобного окружения, в котором белок будет принимать конформацию, близкую к нативной. Одним из важных факторов, оказывающим непосредственное влияние на качество спектров ЯМР, является размер изучаемого молекулярного комплекса, увеличение которого может приводить к значительному уширению сигналов в спектре. Поскольку суммарная масса комплекса складывается из масс исследуемого белка и молекул детергента, то желательно использовать детергент с низким агрегационным числом, и, что немаловажно, способный к формированию мицеллы малого размера. В свою очередь, размер и форма мицелл также зависят от многих факторов, и, прежде всего, от соотношения размеров полярной гидрофильной и гидрофобной частей молекулы. Кроме этого, на эффективность встраивания МБ может оказывать влияние поверхностный потенциал мицелл. В качестве исследуемых систем были выбраны детергенты с различной длиной цепи и различными полярными головками: додецилфосфохолин (ДФХ), лаурилдиметиламиноксид (ЛДАО), лизомиристаилфосфатидилхолин (ЛМФХ), лизомиристаилфосфатидилглицерол (ЛМФГ), лизопальмитоилфосфатидилглицерол (ЛПФГ). Поведение данных детергентов в воде было охарактеризовано методом динамического светорассеяния (таблица 2) совместно с сотрудниками Лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН. На основании полученных данных можно отметить, что детергент ЛМФГ не формирует мицеллярных структур в воде, однако, при увеличении ионной силы раствора в результате добавления соли происходит формирование мицелл с радиусом 1,4 нм. Это объясняется тем фактом, что в водном растворе ЛМФГ не может сформировать мицеллы из-за слишком сильного отталкивания полярных частей, а при увеличении ионной силы раствора, силы отталкивания уменьшаются и гораздо меньше препятствуют формированию мицелл. На размер мицелл цвиттерионного детергента ЛМФХ изменение ионной силы раствора никак не повлияло, что объясняется тем, что, в целом, молекула детергента электронейтральна. Все использованные детергенты образуют относительно небольшие Таблица 2. Радиус мицелл детергентов ДФХ, ЛМФХ, ЛДАО, ЛМФГ, ЛПФГ в буфере 10 мМ Трис pH 7,4 в отсутствие и присутствии 100 мМ NaCl. Радиус, нм Детергент 10 мМ Трис 10 мМ Трис + 100 мМ NaCl ЛМФХ 2,4 2,4 ЛМФГ Нет мицелл 1,4 ЛПФГ 1,0 1,8 ЛДАО 2,1 1,9 ДФХ 1,9 1,8 15 Таблица 3. Радиус мицелл ДФХ/ЛДАО cо встроенными белками KCNE1-H6 или KCNE3 и различным соотношением белок/детергент. Радиус, нм Детергент KCNE1-H6 KCNE3 1:50 2,9 2,7 1:120 2,4 2,4 мицеллы (радуис < 3 нм) и могут быть использованы для солюбилизации мембранных белков. Методом динамического светорассеяния были охарактеризованы размеры мицелл ЛМФХ, ЛМФГ, ЛДАО, ДФХ с двумя представителями семейства KCNE: KCNE1-H6 и KCNE3. Наблюдаемый радиус мицелл с белком был несколько больше, чем радиус «пустых» мицелл. Это соответствует образованию комплексов из молекул детергента со встроенным в них белком. Полученные результаты показали, что, по-видимому, ДФХ наилучшим образом подходит для структурных исследований МБ методом ЯМР-спектроскопии: образуются достаточно маленькие мицеллы и образец получается монодисперсный. Необходимо отметить, что детергент ЛДАО не подходит для ЯМР исследований. Результаты динамического светорассеяния в мицеллах ЛДАО говорят о том, что солюбилизация МБ происходит, но лишь частично – в основном, наблюдалось образование солюбилизированных олигомерных белковых комплексов, что, как правило, приводит к уширению сигналов в спектрах ЯМР. Однако добавление небольших количеств ЛДАО (до 10%) к мицеллам ДФХ, как было показано в результате предварительных ЯМР исследований, приводит к улучшению качества ЯМР-спектров. Так как на размер и форму мицелл, помимо типа детергента, может влиять и его концентрация, были охарактеризованы детергентные мицеллы ДФХ/ЛДАО (в соотношении 9/1) с белками KCNE1-H6 и KCNE3 с различным соотношением белок/детергент (таблица 3). Было показано, что при соотношении белок/детергент 1:120 (моль/моль) белки солюбилизируются преимущественно в форме мономеров. При меньших концентрациях детергента наблюдалось образование крупных мицелл, содержащих белки в виде олигомеров. Кроме того, вторичную структуру белков KCNE1-H6 и KCNE3 исследовали методом спектроскопии кругового дихроизма (КД) совместно с сотрудниками Лаборатории оптической спектроскопии и микроскопии биомолекул ИБХ РАН. Было показано, что КД-спектры белков в мицеллах ДФХ/ЛДАО имеют вид, характерный для спектров полипептидной цепи, находящейся в конформации α-спирали, что хорошо согласуется с предположением о наличии α-спиральных областей в N- и C- концевых участках, а также в трансмембранных сегментах KCNE1-H6 и KCNE3 (рисунок 6). Таким образом, наилучшими условиями солюбилизации для KCNE1-H6 и KCNE3 являются мицеллы ДФХ/ЛДАО (соотношение 9/1), при соотношении белок/детергент 1/120 (моль/моль). Выбранные условия, как было показано, также подходят и для структурного изучения dKCNE1. 16 молярная эллиптичность град*м^2/дмоль молярная эллиптичность град*м^2/дмоль Рисунок 6. КД спектр KCNE1-H6 в мицеллах ДФХ/ЛДАО (слева) и ЛДАО (справа). длина волны, нм длина волны, нм Итоговая проверка качества образцов осуществлялась с помощью 1H-15N ЯМР-спектроскопии для 15N–меченых белков dKCNE1, KCNE1-H6 и KCNE3. Наличие на соответствующих спектрах сигналов всех 4 глицинов dKCNE1, 8 глицинов KCNE1-H6 и 7 глицинов KCNE3 подтвердили результаты, полученные ранее при выборе окружения, имитирующего мембрану (рисунок 7). ЯМР-спектроскопия. Дальнейшее исследование было направлено на выявление структурных особенностей KCNE3, как наименее изученного белка из всех исследуемых объектов. Все спектры ЯМР были получены на спектрометре AVANCE 700 (Bruker) с рабочей частотой на протонах 700 МГц. Получение спектров, их обработка и установление вторичной структуры белка были проведены совместно с сотрудниками Лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии. Для отнесения 1H, 13С и 15N резонансов, расчета вторичной структуры и описания внутримолекулярной динамики белка KCNE3, солюбилизированного в детергентных Рисунок 7. 15N-HSQC-спектры KCNE1-H6 в различном мембраноподобном окружении. А. KCNE1 1.5 мМ, детергент ДСН, отношение белок/детергент 1:80, pH 5.0, T = 45 °C. Б. KCNE1 0.4 мМ, детергент ДФХ/ЛДАО (90 %/10 %), отношение белок/детергент 1:120, pH 4.5, T = 45 °C. Наблюдается разница в количестве различимых на спектре остатков глицинов. Характерные области обведены пунктиром. Б А 17 Рисунок 8. 15N-HSQC-спектр KCNE3. KCNE3 0.4 мМ, детергент ДФХ/ЛДАО (9/1), отношение белок/детергент 1/120, pH 4.5, T = 45 °C. мицеллах, были получены и обработаны серии гетероядерных ЯМР-спектров, с применением современных методик спектроскопии ЯМР. Двумерный корреляционный спектр 15N-HSQC KCNE3 в ДФХ/ЛДАО представлен на рисунке 8. Последовательное отнесение было проведено на 92 %. Некоторые остатки отнести не удалось из-за уширенных сигналов и низкой дисперсии химических сдвигов в основном в α-спиральных участках. Отнесение боковых цепей было выполнено на 85 %. Неполное отнесение боковых цепей обусловлено теми же причинами, что и при последовательном отнесении. Используя данные отнесения сигналов полученных спектров, с помощью программы PREDITOR, которая предсказывает значения углов φ, ψ, ω и χ1 цепи белка по химическим сдвигам атомов 1H, 15N и 13C (Chemical Shifts Indexes), были найдены элементы вторичной структуры KCNE3. Результаты были схожи с данными программы NNPREDICT, предсказывающей вторичную структуру белка по его аминокислотной последовательности. Анализируя полученные результаты, а также данные по релаксации и NOE-контактам, удалось выделить структурированные участки белка KCNE3: • N-концевая α-спираль (остатки 9-24); • трансмембранная α-спираль (остатки 56-80); • небольшая структурированная область, состоящая из двух основных и одного полярного аминокислотных остатков (RSR) в С-концевом примембранном регионе; 18 • две С-концевые α-спирали (остатки 86-90 и 92-100), разделенные пролином; • участки вторичной структуры разделены подвижными и петлевыми областями. Если сравнить результаты, полученные для KCNE3, с данными, представленными в статье Tian С и соавт., посвященной структурному изучению KCNE1, можно заметить, что: • оба белка имеют N-концевые (остатки 9-23 в KCNE1 и 9-24 в KCNE3) и трансмембранные α-спиральные участки (остатки 44-66 в KCNE1 и 56-80 в KCNE3); • оба белка имеют α-спиральный участок в С-концевом домене, однако α-спиральный участок KCNE3 разделен пролином. При этом С-концевая область KCNE3, в целом, является более структурированной и менее подвижной. По-видимому, это связано с тем, что она на 40 аминокислотных остатков короче соответствующего участка KCNE1; • у обоих белков N-концевой и трансмембранный α-спиральные участки разделены подвижными областями, состоящими из аминокислотных остатков глицинов, серинов и пролинов; • у обоих белков в С-концевом примембранном регионе имеется «квадруплет» из трех основных и одного полярного аминокислотных остатков (R67SKK у KCNE1 и R81SRK у KCNE3). Интересно заметить, что мутация в KCNE3 V17M, связанная с мерцательной аритмией, находится в N-концевом α-спиральном участке. Несмотря на то, что на данный момент нет прямых доказательств взаимодействия N-концевого домена KCNE3 c α-субъединицей калиевого канала, мы предполагаем, что расположение мутации в α-спиральной области не случайно. Во-первых, не исключается возможность контакта N-концевого участка KCNE3 с калиевым каналом. Во-вторых, α-спиральная область, состоящая преимущественно из гидрофобных и полярных аминокислотных остатков, может взаимодействовать с мембраной, особенно, если учесть подвижность участка, связывающего ее с трансмембранным сегментом (PGPGLGP). В-третьих, вполне возможно, что внемембранные структурированные участки могут взаимодействовать с другими белками, опосредованно влияя на работу канала. В пользу последней гипотезы свидетельствуют несколько работ. Gage SD и Kobertz WR показали, что делеции во внемембранных областях KCNE3 не приводят к существенным изменениям в функции канала KCNQ1/KCNE3. Такой же вывод был сделан и относительно KCNE1. В работе Takumi T и соавт. было показано, что комплексы KCNQ1/dKCNE1 обладают такими же свойствами, что и KCNQ1/KCNE1. Сравнительно недавно Furukawa и соавт. обнаружили, что для KCNE1, помимо взаимодействия с субъединицей канала, характерно связывание с белком телетонином в цитоплазме. Таким образом, наиболее вероятно, что N- и C-концевые домены белков семейства KCNE опосредованно участвуют в функционировании каналов. При анализе литературных данных, четко прослеживается ключевая роль трансмембранных участков β-субъединиц в регуляции свойств калиевых 19 Таблица 4. Аминокислотные последовательности трансмембранных сегментов белков семейства KCNE. Серым цветом выделены остатки составляющие «гликофориновый мотив». Жирным шрифтом выделены «активационные триплеты» KCNE1 и KCNE3. Курсивом выделены примембранные заряженные «квадруплеты». Транс-мембранные области подчеркнуты. KCNE1 K41LEALYVLMVLGFFGFFTLGIMLSYIRSKK KCNE2 N45FYYVILYLMVMIGMFSFIIVAILVSTVKSKR KCNE3 R53DDNSYMYILFVMFLFAVTVGSLILGYTRSRK KCNE4 G33NEYFYILVVMSFYGIFLIGIMLGYMKSKR KCNE5 G56DDAYLYILLIMIFYACLAGGLILAYTRSRK потенциал-зависимых каналов. Так, в работах Melman YF и соавт., в KCNE1 и KCNE3 были выявлены «активационные триплеты», которые важны для правильного функционирования каналов KCNQ1/KCNE1 и KCNQ1/KCNE3, соответственно. При помощи сайт-направленного мутагенеза было показано, что существенный вклад в работу KCNE1 и KCNE3 вносят триплеты FTL и TVG, соответственно, а центральные аминокислотные остатки (T58 в KCNE1 и V72 в KCNE3) являются ключевыми. Замены T58V в KCNE1 и V72Т в KCNE3 практически полностью меняют свойства каналов. Кроме того, авторы предложили наиболее вероятные сайты в S6 (остатки 338-340) и S5 (остаток 273) KCNQ1, взаимодействующие с центральными остатками «активационных триплетов». При анализе аминокислотных последовательностей всех белков семейства KCNE, в их трансмембранных областях были обнаружены так называемые «гликофориновые мотивы», присутствие которых, предположительно, достаточно для олигомеризации (таблица 4). Подобные мотивы были обнаружены и в S5/S6 доменах KCNQ1 и HERG. Мы полагаем, что «гликофориновые мотивы» могут быть вовлечены во взаимодействие α- и βсубъединиц калиевых каналов в мембране. В этом случае, например, при взаимодействии KCNE с S5 сегментом канала, активационный триплет может находиться в контакте с S6 сегментом KCNQ1 (и наоборот), поскольку эти элементы β-субъединицы канала пространственно разнесены и располагаются по разные стороны его трансмембранной α-спирали. Подтверждением или опровержением предложенной гипотезы об участии «гликофоринового мотива» в функционировании канального комплекса могут служить работы по введению мутаций, направленных на изменение предположительного интерфейса олигомеризации α- и β- субъединиц каналов. На данный момент только некоторые из подобных мутаций описаны в литературе. Так, замены G60A и S64A в KCNE1 не повлияли на свойства KCNQ1/KCNE1, что хорошо согласуется с нашим предположением, в связи с тем, что подобные замены не являются критичными для формирования олигомерного комплекса. Наконец, заряженная примембранная область, по-видимому, также служит важным элементом в регуляции свойств канала. В пользу этого свидетельствует тот факт, что мутация R83H в KCNE3 (RSRK) приводит к удлиненному QT интервалу и к заболеванию, известному как семейный периодический паралич. Исследования данной мутации, а также 20 ее аналогов в двух других представителях - K69H в KCNE1 (RSKK) и K75H в KCNE2 (KSKR), показали, что все эти замены приводят к изменению ряда параметров, характерных для канальных комплексов, таких как проводимость, скорость активации и деактивации и др. Кроме того, серин, второй аминокислотный остаток «квадруплетов» всех членов семейства KCNE, образует сайт фосфорилирования, что, как было показано, необходимо для правильного функционирования канального комплекса. Суммируя все вышесказанное, для всех членов семейства KCNE, можно четко выделить следующие характерные структурные особенности и, предположительно, связанные с ними функции: • наличие N- и С-концевых α-спиральных участков (за исключением N-концевого домена KCNE4, что, вероятно, связано с его небольшой длиной: 35 аминокислотных остатков), которые, по-видимому, взаимодействуют с мембраной или другими белками, тем самым вызывая опосредованное влияние на свойства канала; • наличие трансмембранных α-спиралей, которые играют ключевую роль как в связывании с α-субъединицей канала, так и функционировании канального комплекса. В этом случае связывание, по-видимому, обеспечивают имеющиеся олигомеризационные мотивы, а за функционирование отвечает активационный триплет; • наличие заряженных примембранных «квадруплетов»: RSKK у KCNE1, KSKR у KCNE2 и KCNE4, RSRK у KCNE3 и KCNE5, содержащих сайты фосфорилирования, что важно для функционирования канального комплекса. ВЫВОДЫ 1. Разработаны эффективные системы бактериальной экспрессии dKCNE1, KCNE1, KCNE2 и KCNE3. 2. Разработаны эффективные методики очистки и выделены мембранные белки dKCNE1, KCNE1, KCNE2 и KCNE3, а также изотопно–меченые 15N-, 15N/13С-, 15 N/13С/2H-, 15N/2H- производные в количествах, необходимых для проведения структурных исследований. 3. Получена информация по вторичной структуре KCNE3 и охарактеризованы структурные особенности dKCNE1, KCNE1-H6 и KCNE3 в мембраноподобном окружении методами КД-спектроскопии, динамического светорассеяния и ЯМРспектроскопии. 21 4. Выявлены основные структурные особенности, присущие белкам семейства KCNE: N- и С-концевые α-спиральные участки, трансмембранные α-спирали и примембранные заряженные «квадруплеты». 5. На основании анализа структурной организации KCNE1-H6 и KCNE3 была выдвинута гипотеза об опосредованном влиянии N- и С-концевых участков белков семейства KCNE на функционирование калиевых потенциал-зависимых каналов. 6. Наличие «гликофориновых мотивов» в трансмембранных участках всех представителей семейства KCNE, а также S5/S6 доменах α-субъединиц калиевых потенциал-зависимых каналов, по-видимому, свидетельствует об их участии в образовании функционально активных комплексов. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Investigation of structure and dynamics of KCNE family proteins. Sobol V.A., Mayzel M.L., Bocharov E.V., Goncharuk S.A., Shenkarev Z.O., Chupin V.V., Arseniev A.S. NMRCM 2007, 123-4. Исследование структуры и динамики мембранного белка KCNE3. Соболь В.А., Гончарук С.А., Майзель М.Л., Бочаров Э.В., Чупин В.В., Арсеньев А.С. Научная конференция МФТИ 2007, секция физико–химической биологии. Структурная биология мембранных пептидов. Кирпичников М.П., Гончарук М.В., Ермолюк Я.С., Гончарук С.А., Шульга А.А., Масленников И.В., Арсеньев А.С. Технология живых систем 2005, 2(1–2):20–7. Бактериальный синтез трансмембранных сегментов SK, BNIP3, miniK, KCNE1. Гончарук М.В., Гончарук С.А., Ермолюк Я.С., Шульга А.А., Масленников И.В., Арсеньев А.С., Кирпичников М.П. Научная конференция МФТИ 2004, секция физико–химической биологии:135–6. 22 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ: Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltagegated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome. Tian C, Vanoye CG, Kang C, Welch RC, Kim HJ, George AL Jr, Sanders CR. Biochemistry 2007 Oct 16;46(41):11459-72. KCNE3 truncation mutants reveal a bipartite modulation of KCNQ1 K+ channels. Gage SD, Kobertz WR. J Gen Physiol 2004 Dec;124(6):759-71. Alteration of channel activities and gating by mutations of slow ISK potassium channel. Takumi T, Moriyoshi K, Aramori I, Ishii T, Oiki S, Okada Y, Ohkubo H, Nakanishi S. J Biol Chem 1991 Nov 25;266(33):22192-8. KCNE regulation of KvLQT1 channels: structure-function correlates. Melman YF, Krummerman A, McDonald TV. Trends Cardiovasc Med 2002 May;12(4):182-187. A single transmembrane site in the KCNE-encoded proteins controls the specificity of KvLQT1 channel gating. Melman YF, Krumerman A, McDonald TV. J Biol Chem 2002 Jul 12;277(28):25187-94. Specific interaction of the potassium channel beta-subunit minK with the sarcomeric protein T-cap suggests a T-tubule-myofibril linking system. Furukawa T, Ono Y, Tsuchiya H, Katayama Y, Bang ML, Labeit D, Labeit S, Inagaki N, Gregorio CC. J Mol Biol 2001 Nov 2;313(4):775-84. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ: ИПТГ – изопропил-β-D-тиогалактозид; КД – круговой дихроизм; МБ – мембранный белок; МХАХ – металл-хелатная аффинная хроматография; ПЦР – полимеразная цепная реакция; ЯМР – ядерный магнитный резонанс; H6 – гистидиновый таг; Mistic – мистик; ДФХ – додецилфосфохолин; ЛДАО – лаурилдиметиламиноксид; ЛМФХ – лизомиристаилфосфатидилхолин; ЛМФГ –лизомиристаилфосфатидилглицерол; ЛПФГ лизопальмитоилфосфатидилглицерол; ДСН – додецил сульфат натрия; Trx – тиоредоксин. 23
