Эвгенол и тимол по отдельности и в сочетании вызывают

Braga P.C., Dal Sasso M., Culici M., Alfieri M.
Кафедра фармакологии, медицинская школа Университета Милана, Виа Ванвителли 32,
20129, Милан, Италия
Эвгенол и тимол по отдельности
и в сочетании вызывают
морфологические изменения
оболочки Candida albicans
(Опубликовано в «Фитотерапия», 2007. – Том 78. – № 6. – Сентябрь)
В статье «Эвгенол и тимол по отдельности и в сочетании вызывают морфологические изменения оболочки Candida albicans», представленной коллективом авторов итальянского
университета, обобщены результаты исследований по изучению антикандидозной активности гвоздичного и тимьянового масла, в частности, их составляющих – эвгенола и тимола. Доказано, что клеточная стенка грибов – это не только обычная внешняя оболочка гриба, но и
важнейшая биологическая структура, ключевая роль которой заключается в нарушении соотношения физико-химических взаимодействий между клеточной стенкой гриба и клеточной
мембраной организма хозяина-человека, что, вероятно, и способствует развитию кандидозной инфекции.
Изучая влияние эвгенола и тимола на морфологические свойства оболочки Candida
albicans, авторами было установлено, что действие тимола в 2 раза активнее эвгенола с учетом количества поврежденных оболочек. Однако наиболее выраженный антикандидозный
эффект был отмечен при сочетанном действии этих двух препаратов. Синергизм действия тимола и эвгенола при одновременном их использовании авторы объясняют различными молекулярными свойствами и механизмом действия этих двух препаратов.
Выявленное потенцирование противогрибкового действия при назначении эвгенола и тимола, входящих в состав гвоздичного и тимьянового масел, следует учитывать практическим
врачам при рекомендации средств интимной гигиены лицам с кандидозной инфекцией.
__________________________________________________________
Председатель БелНПООААГН, зав. кафедрой акушерства
и гинекологии БГМУ, д.м.н., профессор Можейко Л.Ф.
38
Акушерство и гинекология
Реферат
Оболочка Candida albicans, содержащая наиболее удаленные от ядра микроорганизма
макромолекулы, направленные в окружающую среду, играет ключевую роль в экспрессии
основных факторов вирулентности, например, факторов адгезивности, и в морфологической
трансформации в гифовую форму.
Мы изучали антикандидозную активность эвгенола, основного компонента гвоздичного
масла, и тимола, основного компонента тимьянового масла, как по отдельности, так и в сочетании, путем определения их способности влиять на архитектонику оболочки C. albicans. Обе
молекулы изменяли морфогенез оболочки, но влияние тимола, по сравнению с эвгенолом,
было более выраженным.
Определенные сочетания этих двух молекул обеспечивали синергическое действие, что
представляет интерес с точки зрения возможности потенцирования их подавляющего действия на колонизацию и инфекционные свойства C. albicans.
© 2007 Elsevier B.V. Все права защищены.
Ключевые слова: эвгенол; тимол; сочетание; изменения оболочки; Candida albicans.
1. Введение
Гвоздичное и тимьяновое масла имеют ряд полезных фармакологических свойств. Их противогрибковое и, особенно, противокандидозное действие хорошо изучено [1-3], и оказалось связано с рядом типичных замещенных ароматических молекул, например, с эвгенолом, тимолом, карвакролом [4-6]. К настоящему времени убедительно показано, что клеточную стенку грибов не следует представлять как простую
инертную внешнюю структуру, обеспечивающую только жесткость и
защиту протопласта, но как весьма важную для почти всех аспектов
биологического функционирования и патогенности гриба [2]. Например, функциональная архитектоника оболочки рода Candida, содержащая наиболее удаленные от ядра микроорганизма макромолекулы, направленные в окружающую среду, играет ключевую роль в реализации
начальных физико-химических взаимодействий гриба с окружающей
средой, включая и организм человека-хозяина [7, 8].
Зеленым цветом окрашены клетки с нормальной оболочкой, округлой и имеющей гладкую поверхность, а розовым цветом – клетки с измененной оболочкой.
А) Культура Candida albicans после 4 ч. инкубации при нормальных
условиях; В) после 4 ч. инкубации с 1 МПК эвгенола; С) после 4 ч. инкубации с 1 МПК тимола; D) после 4 ч. инкубации с 1 МПК тимола плюс
1 МПК эвгенола (сканирующая электронная микроскопия. Раскрашены
не препараты, а только изображения, 1550Ч).
Целью нашего исследования было изучить, оказывают ли эвгенол
и тимол, по отдельности или в сочетании, влияние на формирование
оболочки Candida albicans, и таким образом реализуют их противокандидозное действие.
«Репродуктивное здоровье в Беларуси» № 5 (05), 2009
Развитие кандидозной
инфекции обусловлено
нарушением
соотношения
физико-химических
взаимодействий
клеточной стенки
гриба и клеточной
мембраны клеток
организма-хозяина,
что может приводить
к формированию
паразитических
отношений [9].
39
Эвгенол и тимол по отдельности и в сочетании вызывают морфологические изменения
оболочки Candida albicans
2. Экспериментальная часть
2.1. Грибы и условия культивирования
Два штамма C. albicans были выделены на глюкозный агар Сабуро
(Difco, Италия) из материала, полученного при осторожном соскобе с
помощью стерильных шпателей со слизистой влагалища больных, страдающих клинически выраженным кандидозом. Микроорганизмы идентифицировали в соответствии со стандартными процедурами по формированию зародышевых трубок, образованию хламидиоспор, ферментированию сахара. Маточную взвесь клеток гриба подготавливали
путем инокуляции трех или четырех колоний, выделенных на плашках
с агаром, в 6 мл 2% глюкозного бульона Сабуро, с последующей инкубацией взвеси в течение 24 ч. при температуре 32° C. МПК для штаммов
C. albicans определяли методом макроразведения бульона. Вкратце,
на бульоне Сабуро подготавливали серийные двукратные разведения
эвгенола (Difco, Италия), предварительно растворенного в ДМСО, и тимола (Difco, Италия), предварительно растворенного в Этаноле – EtOH.
Затем взвесь, содержавшую противогрибковый препарат, инокулировали с взвесью клеток в количестве 1Ч106 клеток/мл, и инкубировали
на воздухе при температуре 32° C в течение 24 ч. МПК определяли как
первое разведение, при котором при осмотре роста микроорганизма
не выявляли.
2.2. Инкубация с эвгенолом и тимолом in vitro
Взвесь почкующихся бластоконидий в виде инокулята доводили до
концентрации 5Ч106 клеток/мл путем прямого подсчета при микроскопии (микроскопия по методу интерференционного контраста по Номарски в камере Беркера). Полученный инокулят Candida использовали для
всех экспериментов.
Рисунок 1
Общий вид случайно отобранных полей культуры Candida albicans
40
Акушерство и гинекология
Эвгенол и тимол растворяли, как описано выше, а культуры C.
albicans на бульоне Сабуро инкубировали с 1/2, 1/4 и 1/8 МПК эвгенола
и тимола по отдельности, а также с сочетаниями 1+1, 1/2+1/2, 1/4+1/4 и
1/8 + 1/8 МПК; в качестве контроля для инкубации использовали культуры, содержащие равные количества наполнителя. Образцы извлекали
через один, два и четыре часа инкубации, после чего подготавливали
для сканирующей электронной микроскопии.
2.3. Подготовка образцов Candida для морфологического исследования
Для каждой из отдельных концентраций эвгенола и тимола, а также
их сочетаний и для каждого из сроков инкубации проводили промывание образцов взвесей клеток каждого из штаммов Candida дистиллированной водой, распределение по округлому покровному стеклу
микроскопа, фиксацию 2,5% глутаральдегидом в 0,1 моль/мл какодиловом буфере, рН = 7,2, при температуре 4° C в течение 4 часов. После
обезвоживания в наборе спиртов повышающейся концентрации покровные стекла окончательно обезвоживали и разбрызгивали на них
слой золота толщиной 200 ангстрем после установки на подложку, после чего образцы подвергали сканирующей электронной микроскопии
(микроскоп Philips 505).
Для каждых штамма, концентрации, срока инкубации в каждом из
пяти случайным образом отобранных полей исследовали оболочки 100
клеток и общее количество клеток с измененной оболочкой (например,
уплощенных клеток со складчатой или перфорированной оболочкой,
коллабированных клеток, «теней» клеток) сравнивали с количеством
нормальных, округлых клеток с гладкой поверхностью оболочки.
2.4. Статистический анализ
Эксперименты повторяли для каждого из двух клинически выделенных штаммов, каждой из концентраций и каждой серии экспериментов.
Различия от контроля (средние значения ± стандартная ошибка среднего) рассчитывали по критерию Стьюдента и считали статистически
значимыми при P≤0,05.
3. Результаты и обсуждение
Оба исследованных штамма были чувствительны к тимолу и эвгенолу в концентрациях, соответствующих МПК, и равных, соответственно,
125 мкг/мл и 500 мкг/мл. Хотя все клетки Candida, не подвергавшиеся
воздействию препаратов, были округлыми или овальными, а их поверхность оставалась гладкой (рис. 1), воздействие 1 МПК эвгенола или тимола по отдельности вызывало значительное изменение морфологии
оболочки.
Количество нормальных округлых и гладких клеток значимо снижалось, причем это снижение зависело от продолжительности инкубации, сопровождаясь прогрессирующим увеличением количества
поврежденных клеток с шероховатой и морщинистой поверхностью,
уплощенных клеток со складчатой оболочкой, клеток с перфорированной оболочкой, коллабированных клеток, клеток-«теней» (рис. 1). Тимол
оказался на 40-50% активнее эвгенола (рис. 2). Аналогичные, но менее
«Репродуктивное здоровье в Беларуси» № 5 (05), 2009
41
Контроль
% измененных клеток
100
1 МПК
% измененных клеток
100
1/2 МПК
% измененных клеток
100
1/4 МПК
% измененных клеток
100
1/8 МПК
% измененных клеток
Эвгенол и тимол по отдельности и в сочетании вызывают морфологические изменения
оболочки Candida albicans
100
эвг.
тим
эвг. + тим.
80
60
40
20
0
0
1
2
4
часы
0
1
2
4
часы
0
1
2
4
часы
0
1
2
4
часы
0
1
2
4
часы
80
без клеток
60
40
20
0
80
60
40
20
0
80
60
40
20
0
80
60
40
20
0
Рисунок 2
Кинетика морфоструктурных изменений Candida albicans, вызванных различными
концентрациями тимола и эвгенола, а также их сочетаниями (** p < 0,01, * = p < 0,005 по
сравнению с контролем; 1 по сравнению с отдельной молекулой)
42
Акушерство и гинекология
выраженные изменения наблюдались при инкубации клеток Candida
1/2 и 1/4 МПК этих двух препаратов по отдельности (рис. 2), но инкубация с 1/8 МПК эвгенола или тимола не вызывала каких-либо значимых
изменений по сравнению с контролем.
Сочетание 1 МПК эвгенола с 1 МПК тимола вызывало статистически
значимое повышение количества поврежденных клеток по сравнению
с соответствующими концентрациями этих препаратов по отдельности.
Влияние воздействия только эвгенола (+8,80±1,48%), которое можно
было наблюдать после первого часа инкубации, не отличалось от значений для контроля (+7,80±2,48%), и соответствующее действие тимола
оказалось равным всего 14,00±4,18%, но действие сочетания препаратов (31,40±5,27% поврежденных клеток) было более значительным, чем
сумма влияний при инкубации с двумя исследованными препаратами по
отдельности (рис. 2). Такой характер изменений, наблюдавшийся также
через 2 часа, обеспечивал настолько большее и неожиданное кандидацидное действие через 4 часа, что количество клеток снижалось более
чем в 10 раз по сравнению с действием отдельных препаратов, так что
определить достаточное количество клеток для проведения расчета
оказалось невозможно. В любом случае, оставшиеся клетки были значительно повреждены, а какие-либо нормальные клетки вряд ли сохранялись (рис. 2). Эти данные свидетельствуют о наличии синергического
действия сочетания двух этих препаратов, причем этот вывод оказался
верным также через 4 часа инкубации сочетания Ѕ МПК эвгенола плюс Ѕ
МПК тимола (рис. 2). Сочетания менее высоких концентраций (1/4 МПК
+ 1/4 МПК и 1/8 МПК + 1/8 МПК) оказывали постепенно снижавшееся
действие, как и следовало ожидать, но через 2 часа инкубации при
этом вновь наблюдалось статистически значимое повышение количества поврежденных клеток, в то время как аналогичные концентрации
отдельных препаратов по отдельности действия не оказывали (рис. 2).
Эти данные также свидетельствуют о наличии синергизма в действии
сочетания этих двух препаратов.
Недавно получены результаты, свидетельствующие, что такое действие на грибы, особенно на C. albicans, влияет на регуляцию и функции
важных мембрано-связанных ферментов, катализирующих синтез ряда
основных полисахаридных компонентов клеточной стенки, в том числе
бета-гликаны, хитин, маннан, и тем самым нарушает рост клеток и морфогенез оболочки [3, 12-14].
Наши данные о нарушении морфогенеза оболочки C. albicans под
действием тимола и эвгенола, полученные методом сканирующей
электронной микроскопии, соответствуют результатам, полученным
для Saccharomyces cerevisiae [15]. Кроме того, нами выявлено, что монотерапия тимолом оказывает на морфологию оболочки C. albicans более
выраженное разрушающее действие, чем монотерапия эвгенолом, что
может быть связано с различиями проникающей способности монотерпенов через клеточную стенку грибов и структуры клеточной мембраны [16, 17].
Тимол и эвгенол различаются по молекулярным свойствам, в частности, по объему молекулы, площади ее поверхности, соотношению
гидрофильных и липофильных фрагментов, полярности, способности
связывать водород, доли поверхности, обладающей гидрофильными
«Репродуктивное здоровье в Беларуси» № 5 (05), 2009
Известно, что тимол
и эвгенол являются
липофильными
молекулами,
и совместно с
карвакролом могут
проникать между
ацильными цепями
жирных кислот,
образующих липидный
двойной слой
мембран, тем самым
нарушая текучесть
и проницаемость
клеточных мембран [3,
10-12].
43
Эвгенол и тимол по отдельности и в сочетании вызывают морфологические изменения
оболочки Candida albicans
свойствами, способности образовывать водородные связи, а также способности донировать водородные связи [8].
Следовательно, они могут различаться не только по мощности, но
также и, по крайней мере частично, по механизму действия, и этим может объясняться выявленный синергизм действия тимола и эвгенола
при их одновременном назначении.
Потенцирование противомикробного действия при сочетании этих
препаратов ранее было подтверждено выявлением их синергического
действия в исследовании на семи различных штаммах бактерий [19, 20],
а также выявлением потенцирования противогрибкового действия тимола при его сочетании с амфотерицином В (16).
Влияние на морфологию оболочки C. albicans представляется практически значимым, поскольку означает возможность воздействия на
важный фактор вирулентности, связанный с адгезивностью [21-24] и
морфологической трансформацией в гифовую форму, что обеспечивает уменьшение способности гриба колонизировать ткани организмахозяина и увеличения его инфекционности [25-27].
„ ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
Gayoso C.W., Lima E.O., Oliveira V.T., Pereira F.O., Souza E.L., Lima I.O., et al. Fitoterapia. – 2005;76:247.
Pina-Vaz C., Rodrigues A.C., Pinto E. Mycoses. – 2001;44(SupplI):59.
Pina-Vaz C., Rodrigues A.C., Pinto E., Costa-de-Oliveira S., Tavares C., Salgueiro L., et al. J. Eur. Acad. Derm.
Vener. – 2004;18:73.
Boonchird C., Flegel T.W. Can. J. Microbiol. – 1982;28:1235.
Chami N., Bennis S., Chami F., Aboussekhra A., Remmal A. Oral. Microbiol. Immunol. – 2005;20:106.
Chami F., Chami N., Bennis S., Trouillas J., Remmal A. J. Antimicrob. Chemother. – 2004;54:909.
Manhoar V., Ingram C., Gray J., Nadeem A., Talpur N.A., Echard B.W., et al. Mol. Cell. Biochem. – 2001;228:111.
Cassone A. Curr. Top. Med. Mycol. – 1989;3:248.
La Jean Chaffin W., Lopez-Ribot J.L., Casanova M., Gozalbo D., Martinez J.P. Microb. Mol. Biol. Rev. –
1998;62:130.
Sanchez M.E., Turina A., Garcia D.A., Veronica Nolan M., Perillo M.A. Colloid. Surf. B. – 2004;34:77.
Hammer K.A., Carson C.F., Riley T.V. J. Antimicrob. Chemother. – 2004;53:1081.
Sikkema J., de Bont J.A.M., Poolman B. Microbiol. Rev. – 1995;59:201.
Bard M., Albrecht M.R., Gupta N. Lipids. – 1988; 23:534.
Uribe S., Ramirez J., Pena A. J. Bacteriol. – 1985;161:1195.
Bennis S., Chami F., Chami N., Bouchiki T., Remmal A. Lett. Appl. Microbiol. – 2004;38:454.
Giordani R., Regli P., Kaloustian J., Mikail C., Abour L., Portugal. H. Phytother. Res. – 2004;18:99.
Cox S.D., Mann C.M., Markahm J. J. Appl. Microbiol. – 2000;88:170.
Griffin S.G., Wyllie S.G., Markham J.L., Leach D.N. Flavour Fragrance J. – 1999;14:322.
Didry N., Dubreuil L., Pinkas M. Pharmazie. – 1993;48:301.
Didry N., Dubreuil L., Pinkas M. Pharm. Acta. Helv. – 1994;69:25.
Culici M., Capretti V., Dal Sasso M., Guffanti E.E., Mucci M., Braga P.C. GIMMOC. – 2005;9:107.
Fukazawa Y., Kagaya A. J. Med. Vet. Mycol. – 1997;35:87.
Hostetter M.K. Clin. Microbiol. Rev. – 1994;7:29.
Pendrak M.L , Klotz S.A. FEMS Microbiol. Lett. – 1995;129:103.
Sobel J.D., Muller G., Buckley H.D. Infect. Immun. – 1984;44:576.
Demirezen S., Beksac M.S. New Microbiol. – 2004;27:173.
Domer J.E. Crit. Rev. Microbiol. – 1989;17:33.
44