50 оСобенноСти раСпроСтранения В организме урогенитального хламидиоза и детекция Возбудителя В СыВоротке кроВи
advertisement
50 УДК 579.61 Особенности распространения в организме Chlamydia trachomatis при хроническом течении урогенитального хламидиоза и детекция возбудителя в сыворотке крови Пашко Ю. П., Зигангирова Н. А., Капотина Л. Н., Моргунова Е. Ю. Колкова Н. И., Диденко Л. В. НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва Впервые получены экспериментальные данные о возможности циркуляции C. trachomatis в крови больных. У 92,5 % больных с подтвержденной хламидийной инфекцией в крови была выявлена C. trachomatis при использовании двух тестов: культурального метода и ПЦР. Изучение диагностической значимости детекции возбудителя в сыворотке крови показало, что при хронических заболеваниях урогенитального тракта, а также при экстрагенитальной патологии частота обнаружения C. trachomatis в сыворотке крови в 2‑3,5 раза чаще, чем в соскобном материале. Возможность выявления C. trachomatis в сыворотке в случае хронических и осложненных форм хламидиоза обеспечивает принципиально новый подход для прямого определения возбудителя вне зависимости от локализации очага инфекции. Ключевые слова: Chlamydia trachomatis, урогенитальный хламидиоз, персистенция, гематогенный путь распространения инфекции. Features of distribution in organism of Chlamydia trachomatis at a chronic current genital chlamydial infection and detection of the pathogen in serum. Pashko Y. P, Zigangirova N. A., Kapotina L. N., Morgunova E. U., Kolkova N. I., Didenko L. V. Institute of Epidemiology and Microbiology N. F. Gamaleya, Moscow For the first time experimental data about possibility of C. trachomatis circulation in blood of patients are received. At 92,5 % of patients with confirmed chlamydial infection in blood has been revealed C. trachomatis by using 2 tests: culture method and PCR. Studying of the diagnostic importance detection of the pathogen in serum has shown that in case of chronic genital infections, and also at extragenital pathologies frequency of C. trachomatis detection in serum in 2‑3,5 times more often, than in swarb material. Possibility of revealing C. trachomatis in serum in case of the chronic and complicated forms of a chlamydiosis provides essentially new approach for direct definition of the pathogen without dependence from localisation of the centre of infection. фундаментальные исследования №7, 2010 51 Keywords: Chlamydia trachomatis, genital Chlamydia infection, persistence, hematogenous spread of infection. C. trachomatis — один из самых распро- методы лабораторной диагностики имеют бактериальных первостепенное значение [1]. К настояще- инфекций, передаваемых половым путем му времени проблема диагностики хро- (ИППП). По данным ВОЗ, заболеваемость нической формы хламидийной инфекции урогенитальным хламидиозом (УГХ) за пери- определяется несколькими факторами. Во- од с 2000 по 2006 гг. в развитых странах имеет первых, персистирующие формы хламидий, тенденцию к возрастанию. Эпидемиологи- ответственные за развитие хронических ин- ческая ситуация в России неблагоприятная: фекций, с трудом выявляются с помощью в период с 2000 по 2006 гг. регистрируется бо- классических микробиологических и имму- лее 90 случаев УГХ на 100 тысяч населения, нологических методов вследствие наруше- что составляет около 20 % в структуре всех ния метаболизма и антигенной структуры ИППП. Официальная статистика не отражает [5]. Во-вторых, при осложненных формах, истинной ситуации о распространении УГХ, связанных с восходящей и экстрагениталь- т. к. не полностью учитываются случаи хро- ной инфекцией, возбудитель мало доступен нического течения болезни. для анализа. При этом постановка диагно- страненных возбудителей Хроническая урогенитальная хламидий- за урогенитального хламидиоза возмож- ная инфекция вызывает весьма широкий на только при обнаружении C. trachomatis спектр осложнений, связанных с диссеми- прямыми методами. В-третьих, иммунный нацией C. trachomatis из первичного очага ответ при хронической хламидийной ин- инфекции в отдаленные органы. На дан- фекции подавлен, что ограничивает возмож- ный момент достаточно хорошо изучены ность использования вспомогательных ме- интраканаликулярный, лимфогенный пути тодов серологической диагностики. В связи распространения патогена, а также интра- с этим разработка новых методов детекции натальный, при прохождении плода через ро- возбудителя на основе понимания механиз- довые пути матери [3]. Экстрагенитальную мов распространения C. trachomatis в орга- патологию и внутриутробное инфицирова- низме при хроническом течении инфекции ние плода, обусловленные C. trachomatis, приобретает особую актуальность. рассматривают как следствие диссеминации Цель работы патогена гематогенным путем [2]. Однако Изучение гематогенного пути распростра- на сегодняшний день практически отсут- нения Chlamydia trachomatis и разработка ствуют микробиологические исследования, метода диагностики хронических форм хла- доказывающие ключевую роль данного мидиоза экстрагенитальной локализации. пути в развитии экстрагенитальных патоло- Материалы и методы гий хламидийной этиологии. Материалом для исследования служили При хламидиозе отсутствуют специфи- клинические образцы, взятые у пациентов ческие клинические симптомы, поэтому (сыворотка крови, соскобный материал). фундаментальные исследования №7, 2010 52 Из сыворотки крови хламидии выявляли в одной пробирке одновременно. Первая культуральным тестом [4]. Детекцию резуль- реакция позволяет обнаружить и опреде- татов теста проводили одновременно двумя лить количество специфического фрагмента методами: РИФ и ПЦР с ДНК, выделен- 16S рРНК C. trachomatis вторая — детекти- ной из монослоя зараженных клеток. ДНК ровать специфический фрагмент криптиче- из сыворотки выделяли из объема 200 мкл ской плазмиды C. trachomatis. Две другие после предварительного концентрирования реакции направлены на определение эффек- материала, объемом 1 мл, путем центри- тивности выделения ДНК путем детекции фугирования при 13 000 об / мин в течение гена b-актина человека и внутреннего поло- 45 минут при t+4 ºC. Выделение проводили жительного контроля (ВПК). набором QIAamp DNA Blood Mini Extraction Для электронно-микроскопической ха- Kit (Qiagen, Inc). Выявление ДНК проводи- рактеристики циркулирующих в крови хла- ли методом количественной детекции ДНК мидий сыворотки больных в объеме 15‑20 с помощью тест-системы «C. trachomatis- мл центрифугировали при 14 000 об / мин количество» (ЗАО «Синтол») на основе Real- в течение 1 часа. Осадок сыворотки фикси- time PCR с использованием TaqMan зондов ровали по методу Ито-Карновски. Ультра- на приборе «АНК-32» (Институт аналитиче- тонкие срезы получали на ультратоме LKB ского приборостроения, Санкт-Петербург). 3, толщина срезов 200–300Аº, помещали В данном наборе используются четыре не- на никелевые сетки с формваровой подлож- зависимые реакции, которые проводятся кой. Срезы окрашивали по методу Рейноль- Последовательности праймеров, выбранных для анализа экспрессии генов C. trachomatis Ген Белок 16 S rRNA - groEL HSP60 omp1 MOMP omcA OMP3 omcB OmcB pmpA PmpA pmpB PmpB pmpC PmpC pmpD PmpD pmpE PmpE Праймеры forward 5’-GGCGTATTTGGGCATCCGAGTAACG-3’ reverse 5’-TCAAATCCAGCGGGTATTAACCGCCT-3’ forward 5’- TCTGCGAACGAAGGATATGA -3’ reverse 5’- ATAGTCCATTCCTGCGCCAGG -3’ forward 5’-CGTTCGTTGCAGACTTACCA-3’ reverse 5’-GTTCCTCGCATACCGAATGT-3’ forward 5’ — GTTGCTTCGAAGATCCATGC-3’ reverse 5’- GGGCCATGTTTAGCATCTTG-3’ forward 5’- CTGCAACAGTATGCGCTTGT-3’ reverse 5’ –CACGCTGTCCAGAAGAATGA-3’ forward 5’- GCATTTAGCGGCAATACCAT-3’ reverse 5’- TGACAATGCCATGACAGGAT-3’ forward 5’-GAAGGCGGTGCTATCTTCTCTC-3’ reverse 5’- TCGCTTGCTGTTTGAGCTTTAG-3’ forward 5’- CACCTACGACAACACCAACG-3’ reverse 5’- GGAGCAATATCACCCGTCAG-3’ forward 5’- GTTAGACCAAATTCGAGATC-3’ reverse 5’- AAGATTCTCCGTCACGAGGA -3’ forward 5’-CTAACTGCTATCTCGATAACC-3’ reverse 5’- TCACGAATCTCCACGGTAGG-3’ фундаментальные исследования №7, 2010 53 дса и анализировали в электронном микро- Результаты исследований скопе JEM-100B. Для выявления C. trachomatis в сыворотдетек- ке крови объектом нашего исследования ции ретикулярных и элементарных телец служила группа больных из 40 человек ак- в препаратах сыворотки крови больных тивного репродуктивного возраста с уста- процедура проводилась новленным диагнозом УГХ (18 мужчин и 22 по стандартному протоколу [7] в режиме женщины). Критерием включения в иссле- post embedding (LR White embedding media) дуемую группу явилось выявление ДНК C. на ультратонких срезах с использованием trachomatis с помощью ПЦР в соскобном ма- моноклональных видоспецифических анти- териале из уретры и цервикального канала. При иммуноцитохимической иммуномечения C. trachomatis из образцов сыворотки кро- тел к C. trachomatis. Выделение РНК из культуры клеток про- ви выявляли культуральным методом. Ре- водили с использованием реагента Trizol зультаты культивирования оценивали двумя (Invitrogen). Для постановки реакции об- методами: прямой иммунофлуоресценции ратной транскрипции использовали набор (ПИФ) и ПЦР-РВ. «Reverse Transcription System» (Promega, Методом ПИФ в 77,5 % сывороток выявляли единичные внутриклеточные хлами- США). ПЦР с полученной кДНК проводили с вы- дийные включения мелких и средних раз- бранными праймерами на следующие гены меров, характерные для персистирующих (таблица). форм (рис. 1). Для выявления иммуноглобулинов видоспецифических классов G / M /A ис- пользовали тест-системы «ХламиБест-C. При выделении ДНК из культуры клеток методом ПЦР-РВ C. trachomatis была выявлена в 92,5 % случаев. trachomatis» и «ХламиБест cHSP60‑IgG» Видовая принадлежность выделяемых для определения IgG к HSP60 производства из сыворотки крови C. trachomatis была под- ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). тверждена: а б Рис 1. Выделение C. trachomatis из сыворотки крови культуральным методом: а- атипичные хламидийные включения, выделямые из сыворотки крови, 72 часов п. и. б- типичные хламидийные включения, C. trachomatis Bu-434, 48 часов п. и. Линейка 10 µm. фундаментальные исследования №7, 2010 54 — секвенированием ампликонов области в ПЦР сывороток. Во всех образцах были 16S рРНК, показавшим 100 %-ную гомоло- выявлены бактериальные клетки размером гию с референс-штаммами; от 0,2 до 0,3 мкм, имеющие характерную — положительными результатами ам- для элементарных телец хламидий структу- плификации с праймерами к различным об- ру, а именно: двухслойную мембрану кле- ластям генома C. trachomatis: генам ompA, точной стенки и электронно-плотную цито- omcB, groEL. плазму (рис. 2). Для морфологической характеристики Методом непрямой реакции иммуномече- C. trachomatis, выделенной из сыворотки ния с использованием моноклональных ан- крови у исследуемой группы больных с под- тител к Chlamydia trachomatis (1 антитела) твержденной хламидийной инфекцией, было и антимышиных антител, конъюгирован- проведено ных с коллоидным золотом размером 10 нм электронно-микроскопическое исследование осадков положительных (Invitrogen USA) (2 антитела), в препаратах Рис. 2. Электронная микрофотография ультратонкого среза препарата элементарных телец C. trachomatis L2 / 434 / Bu и элементарных телец, выделенных из сыворотки крови больного: а — элементарные тельца, выявленные в сыворотке больного — общий вид. Ув. 32 000; б — элементарные тельца, выявленные в сыворотке больного. Ув. 60 000; в — элементарные тельца, выявленные методом непрямой реакции иммуномечения в сыворотке больного. Ув. 240 000; г — C. trachomatis L2 / 434 / Bu — общий вид. Ув. 35 000; д — C. trachomatis L2 / 434 / Bu. Ув. 60 000 фундаментальные исследования №7, 2010 55 сыворотки крови больных были визуализи- систирующих форм. Экспрессия этого гена рованы элементарные тельца хламидий. отсутствовала также у индуцированных дей- Изоляты C. trachomatis, выделенные ствием IFN-γ персистирующих форм. из сыворотки, были культивируемыми, Отработка метода выделения и детекции что было подтверждено при их пассиро- ДНК C. trachomatis и изучение диагностиче- вании на клеточной культуре. Включения, ской значимости определения возбудителя образующиеся на 1‑м и 2‑м пассажах, со- в сыворотке крови больных с различными храняли измененную морфологию и плохо формами урогенитальной и экстрагениталь- выявлялись при окрашивании препаратов ной патологии. анти-МОМР моноклональными антителами. На основании полученных данных стано- Применение количественного метода ПЦР вится очевидной необходимость разработки показало, что в процеcсе культивирования метода диагностики хронических форм УГХ образцов сывороток происходит увеличе- с использованием сыворотки крови в каче- ние количества возбудителя на два порядка стве материала для выделения возбудителя. по сравнению с содержанием патогена в ис- Это особенно актуально в случае развития ходном образце. осложнений экстрагенитальной локализации, Для изолятов C. trachomatis 1 пассажа когда использование соскобного материала через 48 час. после инфицирования (п. и.) является неинформативным в силу перехода была выполнена качественная оценка экс- возбудителя в верхние отделы УГТ либо в ор- прессии конститутивных генов (16 S rRNA ганы, удаленные от первичного очага инфек- и groEL), генов, кодирующих белки наруж- ции. С этой целью нами была проведена срав- ной мембраны, средней фазы жизненного нительная оценка выявления C. trachomatis цикла (omp1, omcA, pmpA, pmpB, pmpC, в соскобах и сыворотке крови методом ПЦР pmpD, pmpE) и позднего гена, кодирующего у больных с различными формами урогени- цистеин богатый белок OmcB [6]. Контро- тальной и экстрагенитальной патологии. лем служили лабораторный штамм Bu-434 через 48 час. п. и. и персистирующие формы хламидий, индуцированные IFN-γ, через 48 час п. и. При оценке экспрессии генов у референсштамма была выявлена активность всех анализирумых генов, за исключением гена pmpA, для которого характерно снижение Были выбраны следующие группы больных: — 36 человек с хроническими заболеваниями урогенитального тракта и осложненными формами восходящей инфекции; — 33 человека с артрологической патологией; — 20 человек (контрольная группа) экспрессии на 48 час п. и. У выделенных изо- без жалоб на заболевания мочеполовой си- лятов не выявляли экспрессию 2‑х генов, ко- стемы. дирующих белки наружной мембраны (pmpA У этих групп больных были исследо- и pmpC), а также гена, детерминирующего ваны соскобы из УГТ и сыворотка крови синтез позднего белка OmcB, подавление с помощью ПЦР-РВ, а также проведен ана- экспрессии которого является маркером пер- лиз сыворотки крови на наличие специфифундаментальные исследования №7, 2010 56 ческих антител классов IgG / M /A к основ- турального выделения инфекционных форм ному белку наружной мембраны (МОМР) патогена в сыворотке крови больных с диа- C. trachomatis и к белку теплового шока гнозом УГХ. Оценка экспрессии генов свидетельствует БТШ 60. В группе больных с хроническими за- о метаболической активности выделяемых болеваниями УГТ методом ПЦР-РВ ДНК из сыворотки крови форм C. trachomatis. C. trachomatis была обнаружена в 16,7 % Кроме того, отсутствие экспрессии гена (6 человек) материале средней фазы (pmpC) и гена поздней фазы и в 61,1 % (22 человека) в сыворотке крови. (omcB) может указывать на более медлен- У всех пациентов, положительных по со- ный цикл развития таких изолятов по срав- скобному материалу, ДНК C. trachomatis нению с референс-штаммом, что характер- выявляли также в сыворотке. При выявле- но для атипичных персистирующих форм нии специфических антител к МОМР C. C. -trachomatis. в соскобном trachomatis диагностически значимые ти- Исходя из полученных данных, наша тры антител класса IgG детектировались гипотеза циркуляции C. trachomatis в кро- в 19,5 %. Антитела к белку теплового шока ви сводится к следующему. C. trachomatis 60 были выявлены у 13,8 % пациентов (5 из слизистой оболочки УГТ вследствие на- человек). рушения проницаемости эндотелия сосудов В группе с артрологической патологией попадает в кровь и там захватывается моно- в соскобе ДНК C. trachomatis была обнару- цитами. Однако патоген не элиминируется жена в 33 % случаев (11 человек), в то вре- клетками иммунной системы, а переходит мя как в сыворотке — в 63,5 % (21 человек). в персистирующее состояние и заверша- При этом у 9 человек, имеющих ДНК C. ет свой жизненный цикл с формированием trachomatis в соскобе, патоген был также атипичных ЭТ и выходом их в сыворотку детектирован в сыворотке крови. В 30 % крови. Циркуляция инфекционных форм случаев в сыворотке крови данной группы C.-trachomatis в крови является условием ге- больных были определены диагностиче- нерализации инфекции и диссеминации па- ские титры антител класса IgG. У одного тогена в органы и ткани, удаленные от пер- пациента выявляли также антитела класса вичного очага инфекции. IgA. Антитела к БТШ60 не был выявлены ни у одного пациента. В ходе параллельного выявления C.trachomatis в соскобах и сыворотке крови В контрольной группе (20 человек) у па- методом ПЦР у больных с различными фор- циентов в соскобе методом ПЦР-РВ ДНК мами урогенитальной и экстрагениталь- C. trachomatis выявляли только в 5 % случа- ной патологии впервые было обнаружено, ев, а в сыворотке — в 10 %. что у пациентов с хроническими и осложнен- Обсуждение ными формами заболеваний УГТ и артроло- Таким образом, в ходе работы впервые гической патологией ДНК хламидий обна- был доказан гематогенный путь распро- руживаются в сыворотке крови в 2‑3,5 раза странения C. trachomatis на основании куль- чаще, чем в соскобном материале. Это связа- фундаментальные исследования №7, 2010 57 но с тем, что возбудитель не всегда доступен 3. Савичева А. М. Генитальный хлами- для анализа в очаге инфекции. Тем самым диоз: исходы беременности и проявление выявление ДНК C. trachomatis в сыворотке инфекции у доношенных новорожденных крови больных, особенно в случае ослож- Актуальные микробиологические и кли- ненных и восходящих форм хламидиоза, нические проблемы хламидийных инфек- имеет важное диагностическое значение. ций / А. М. Савичева, М. А. Башмакова // Применение данного принципиально ново- Науч. труды. — М., 1990. — С. 52–55. го подхода позволяет выявлять возбудитель 4. Шаткин А. А. Урогенитальные хла- вне зависимости от локализации очага ин- мидиозы / А. А. Шаткин., И. И. Мавров // фекции. Кроме того, применение количе- Здоров’я. — Київ, 1983. — 200 с. ственного формата ПЦР дает возможность 5. Belland R. J. Transcriptome analysis of определять бактериальную нагрузку и про- chlamydial growth during IFN-γ-mediated водить оценку эффективности антимикроб- persistence and reactivation // Proc. Natl. ной терапии. Acad. Sci. USA. — 2003; 100:15971‑15976. Список литературы 1. Инфекции, передаваемые половым путем. Клиника, диагностика, лечение / под ред. В. А. Молочкова. — М.: Медицина, 2006. 2. Мавров Г. И. Chlamydia trachomatis 6. Hogan RJ,. Chlamydial persistence: beyond the biphasic paradigm // Infect Immun. 2004; 72: 1843‑55. 7. Zollinger M. Localization of nuclear subunits of cyclic AMP-dependent protein в просвете капилляров маточных труб: воз- kinase by the immunocolloidal gold можность гематогенного распространения method / M. Zollinger, M. Bendayan // J Cell инфекции // Журн. АМН України, 1996. — Biol. — 1982, Jan; 30 (1):81‑85. 4. — 704‑711. фундаментальные исследования №7, 2010
