Слайд 1 - Пущинский государственный естественно
advertisement
Результаты научно-исследовательских работ, полученные при выполнении Государственного контракта № П609 от 18 мая 2010 года Исполнитель: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пущинский государственный естественно-научный институт» Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.1 Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук Проект: «Новый фундаментальный подход к созданию остеоиндуктивных материалов нового поколения для травматологии и ортопедии на основе применения рекомбинантного морфогенетического белка BMP-2» Заместительное восстановление тканевых участков в пораженной области организма является одним из важных направлений современной медицины. Использующиеся до настоящего времени ауто-, алло- и ксеногенные трансплантаты костной ткани помимо известных преимуществ, обладают рядом недостатков. АУТОТРАНСПЛАНТАТЫ КОСТНОЙ ТКАНИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТЫ КОСТНОЙ ТКАНИ КСОНОТРАНСПЛАНТАТЫ КОСТНОЙ ТКАНИ ДОСТОИНСТВА Остеокондуктивность; остеоиндуктивность; остеогенность Устранение необходимости извлечения здоровой костной ткани у пациента Снятие этических проблем использования аутопсийного материала; доступность; НЕДОСТАТКИ Высокий риск резорбции здоровой ткани; ограниченность объема материала; нанесения дополнительной травмы пациенту при заборе гомографта Гистонесовместимость; не обладают гарантированным остеогенным потенциалом; острая нехватка аллогенной ткани Выраженные иммунологические проблемы; инфицированность вирусами животных Высокая потребность в остеоиндуктивных материалах стимулировала в медицине в последние 10-15 лет создание нового направления, основанного на применении морфогенетических белков кости (bone morphogenetic proteins, BMP). BMP – это группа белков (ВМР-2, ВМР-3… - ВМР-15), входящих в суперсемейство ростовых факторов TGF-β. Белки BMP содержатся в костях, хрящах и в некоторых других соединительных тканях. Известно, что белки ВМР определяют физиологическое ремоделирование и регенерацию костной и хрящевой ткани. Существующие результаты, не позволяют создать полное представление о регуляторных событиях при восстановлении костной ткани, однако они четко показывают, что важным инициирующим фактором регенерации кости является белок ВМР-2. Именно поэтому на основе белков ВМР-2 предпринимаются попытки создать остеоиндуктивные материалы нового поколения. К настоящему времени за рубежом выполнено большое количество работ, направленных на изучение механизма остеогенной дифференцировки клеток под действием морфогенетических белков, а также на применение рекомбинантных человеческих белков ВМР при травмах позвоночника, для срастания сложных переломов и заживления врожденных дефектов костной ткани. СТРУКТУРА ВМР-2 ВМР-2 – представляет собой гомодимер, два мономера которого (массой по 14 кДа) связаны -S-Sмостиками (а) Локализация эпитопов связывания ВМР-2 (слева, серая – мономер1, зеленая цепь – мономер2) с рецептором ActR-IIBECD (справа). (b) Поверхностные связывающие лиганд-рецептор эпитопы ВМР-2 (слева) и рецептора ActR-IIBECD (справа )отмеченные как: гидрофобные аминокислоты (A,F,G,I,L,M,P,V,W,Y) показаны как бело-серые, полярные остатки – как ярко-темно зеленые (H,N,Q,S,T), кислые остатки как оранжевые и красные (D,E) и положительно-заряженные остатки (K,R) – циановые и голубые. Темным цветом отмечены поверхности контакта (Weber et al, 2007). ВМР-2 связывается с комплексом из 4 рецепторов на плазматической мембране клеток ВМР-2 запускает внутриклеточный сигнальный путь, который приводит стволовые и прогениторные мезенхимальные клетки к дифференцировке в остеобласты BMP сигнальный путь: схематичное представление Smad-зависимого и независимого путей их основные механизмы модуляции (Bessa Р.С. et al., 2008) Потребности рынка $ миллиард Продажи костных имплантов и заменителей костных имплантов* в США Orthopedic Network News 2010 *Костный заменитель - аллогенный, ксеногенный, синтетический или полусинтетический материал, применяемый для восполнения недостатка кости в области будущей имплантации Высокая скорость роста рынков потребления продукции ВМР-2, ВМР-4, ВМР-7, ВМР-9 способны полностью индуцировать морфогенез кости ВМР-2 один из основных инициирующих белков остеогенеза; ВМР-2 может быть использован как моноостеоиндуктор (без сочетания с другими факторами); В 2002 году FDA дало разрешение на применение в клинике материала (коллагеновая губка), включающего рекомбинантный человеческий белок BMP-2 (rhBMP-2) для лечения спондилеза и устранения длительного несращивания костей (InfuseТМ) Однако все существующие коммерческие материалы, включающие белки ВМР, обладают рядом существенных недостатков, основным из которых является отсутствие фиксации белка на используемом носителе. Это вызывает необходимость использовать большие количества рекомбинантного белка, что делает лечение пациентов труднодоступным и дорогостоящим. Кроме того, отсутствие фиксации белка, его значительное проникновение в близлежащие ткани вызывает в них нежелательную кальцификацию, т.е. осложняет лечение. Кроме этого для получения белка rhBMP-2 для этих метериалов используется система экспрессии животных клеток, что значительно увеличивает стоимость белка и, в конечном счете, лечения пациентов. МОЖНО ВЫДЕЛИТЬ ТРИ ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ, РЕШЕНИЕ КОТОРЫХ ПОЗВОЛИТ СОЗДАТЬ ТЕХНОЛОГИЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ОСТЕОИНДУКТИВНЫХ МАТЕРИАЛОВ Создание высокоэффективной технологии получения rhBMP-2 в бактериальной системе экспрессии (снижение стоимости, увеличение выхода белка в активной форме и т.д.); Создание новых остеоиндуктивных материалов на основе биоматриц естественного и искусственного происхождения и рекомбинантного морфогенетического белка rhBMP-2 (разработка способов фиксации белка на матрице-носителе, согласование времени биодеградации материала имплантата и формирования новой костной ткани); Исследование остеоиндуктивности разработанных материалов в моделях эктопической и ортотопической имплантации экспериментальным животным. Целью выполнения НИР является создание материалов нового поколения для травматологии, ортопедии и челюстно-лицевой хирургии, обладающих высоким остеоиндуктивным потенциалом за счет применения рекомбинантных морфогенетических остеогенных белков семейства ВМР, а также подготовка научных кадров, работающих в области фундаментальной медицины и тканевой инженерии. При проведении работ по Государственному контракту №П609 от 18.05.2010 г. были получены следующие результаты: 1. Наработана партия рекомбинантного белка rhBMP-2 в бактериальной системе экспрессии (E. coli) 2. Разработаны протоколы хранения активного белка rhBMP-2 Рекомбинантный белок BMP-2 нарабатывался в бактериальном штамме E.coli BL21(DE3) Codon Plus с рекомбинантного плазмидного вектора pET28a содержащего вставку синтетического гена человеческого ростового фактора BMP-2. После культивирования бактериальные клетки содержали рекомбинантный белок BMP-2 в «тельцах включения» Электрофореграмма белка ВМР-2, выделенного из телец включения, очищенного и рефолдированного. А – димер ВМР-2, 28 кДа; Б-мономер ВМР2, 14 кДа; 1, 2 – различные нагрузки белка, 3 – после обработки меркаптэтанолом весь белок переходит в мономерную форму. 4 – белковые маркеры 1 Карта плазмидного вектора рЕТ-28а (EMD Biosciences) 2 3 4 После выделения из телец включения и очистки рекомбинантного белка BMP-2 было показано, что около 80% белка находилось в димерной форме, а около 20% - в мономерной форме. При оценке сохранения белка при 4ºС обнаружено, что содержание димерной формы белка после 6 месяцев хранения в 10мМ растворе уксусной кислоты остается неизменным. 3. Поставлена методика изучения активности рекомбинантного человеческого белка BMP-2 в культуре клеток (оценка активности щелочной фосфатазы и продукции коллагена под действием rhВМР-2 и при добавлении аскорбиновой кислоты, бета-глицерофосфата и дексаметазона); 4. На модели клеток линии С3Н10Т1/2 изучена биологическая активность полученных рекомбинантных белков rhВМР-2 in vitro. Установлено, что производенный нами рекомбинантный белок rhBMP-2 имеет остеоиндуктивную активность совпадающую с активностью белков ВМР-2, производимых в эукариотических клетках, 5. Проведен патентный поиск по ГОСТ Р 15.011-96 согласно предметной области проекта. Патентная чистота результатов НИР подтверждена патентными исследованиями, подана заявка на изобретение в РФ. 6. Разработаны методы иммобилизации rhBMP-2 в гелеообразном композиционном материале. 7. Разработаны методы иммобилизации rhBMP-2 в активной форме в деминерализованном костном матриксе. 8. Разработаны методы и протоколы модификации костной ткани белком rhВМР-2 и цитокинами хемоатрактантами; 9. Разработан подход к изучению биологической активности полученного белка rhВМР-2 in vivo. Выбрана модель гетеротопической подкожной имплантации крысам (создание полости имплантации «тупым» способом, без повреждения кровеносных сосудов области имплантации) и модель ортотопической имплантации (создание дефекта костной ткани диаметром 5-6 мм середины свода черепа крыс с помощью круговой стоматологической фрезы). Срок 6 недель. Условия содержания – ad libitum. Модель гетеротопической имплантации крысам Модель ортотопической имплантации крысам 9. Изучена биологическая активность белков rhВМР-2 in vivo в модели подкожной имплантации крысам а в Сопоставление гистологических препаратов материалов после имплантации, содержащего (а,б) и не содержащего (в,г) rhBMP-2 1 – «новый» коллаген; 2 – «старый» коллаген; * - альгинатный гель; # – трабекулы ДКМ. Окраска: трихром по Касону б г Показано, что введение rhBMP–2 в составе альгинатного геля во фрагмент деминерализованного костного матрикса, оказывает выраженный остеоиндуктивный эффект в модели подкожной имплантации крысам. 10. Изучена степень минерализации разработанных материалов в модели подкожной имплантации крысам а б Минерализация кальция в имплантатах, содержащих rhBMP-2 (а), и отсутствие минерализации в имплантатах, не содержащих rhBMP-2 (б) Окраска препаратов Ализариновым красным S. Красная окраска – минерализованные депозиты кальция. Показано, что введение rhBMP–2 в составе альгинатного геля во фрагмент деминерализованного костного матрикса радикально (в 20 и более раз) увеличивает минерализацию имплантов в модели подкожной имплантации крысам. Количество минерализованного кальция после 6 недель имплантации во фрагментах деминерализованного костного матрикса, заполненных до имплантации альгинатным гелем, содержащем rhBMP-2 (ДКМ +rhBMP-2), и не содержащем (ДКМ, ДКМ – rhBMP-1) В образцах ДКМ – rhBMP-1 предварительно удалены гуанидин хлоридом собственные белки rhBMP-2. 11. Определены морфологические особенности и динамика остеогенеза в материалах, модифицированных белком rhВМР-2, при подкожной имплантации крысам Гистологические препараты образцов материала ДКМ, содержащего и не содержащего rhBMP-2 до и после 6 недель подкожной имплантации крысам а,г,ж – окраска Ализариновым красным S/толуидиновым синим (отложения кальция – от яркокрасного до пурпурного; волокна матрикса – голубые; ядра клеток – синие; б,д,з – окраска: трихром по Касону (волокна матрикса – темно-голубые: ядра клеток – темно-синие); в,е,и – окраска: пикросирус красный (остаточный матрикс – красно-оранжевый; новообразованный коллаген – темно-зеленый; тонкие волокна зрелого коллагена – оранжевые) В результате 6-недельной подкожной имплантации биоматериалов крысам показано, что в материалах, содержащих rhBMP-2 наблюдалась активная резорбция «старого» коллагенового костного матрикса и формирование структурированного созревающего неоколлагена вблизи носителя rhBMP-2, а также формирование участков активной минерализации и неоостеогенеза четко ассоциированных с мигрировавшими в имплантат клетками реципиента. Гистологический препарат образца материала, содержащего rhBMP-2 Увеличенное изображение части препарата. А – окраска: трихром по Кассону (волокна матрикса – темноголубые: ядра клеток – темносиние); Б – окраска: ализариновый красный S/толуидиновый синий (волокна матрикса – голубые; ядра клеток – синие; отложения кальция – яркокрасные). Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение rhBMP-2 обеспечивает увеличение выработки структурированного коллагенового матрикса (формирование нового костного матрикса) и увеличивает степень минерализации костного матрикса остеобластами (увеличение дифференцировки клето-предшественников), что в целом значительно увеличивает срок регенерации костной ткани в организме реципиента по сравнению с материалами без rhBMP-2. 12. Изучена минерализация разработанных материалов в модели ортотопической имплантации крысам Показано, что при ортотопической имплантации в материалах содержащих rhBMP-2, происходит активная минерализация новообразованного матрикса, в то время, как в материале, не содержащем rhBMP-2, минерализации матрикса практически не наблюдается. При этом, при большем увеличении наиболее наглядно видно строго ассоциированный с остеобластоподобными клетками процесс кальцификации материала в образцах, модифицированных rhВМР-2. Минерализация матрикса в имплантатах, содержащих rhBMP-2 Увеличенный фрагмент препарата х40 (А), и х60 (Б); окраска: ализариновый красный S/толуидиновый синий (волокна матрикса – голубые; ядра клеток – синие; отложения кальция – яркокрасные) 13. Изучена эффективность минерализации материалов, включающих rhВМР-2, PDGF (тромбоцитарного ростового фактора) и VEGF (фактора роста эндотелия сосудов), в модели подкожной имплантации крысам Гистологические препараты образцов деминерализованного костного матрикса, включающих rhBMP-2 и PDGF в– стрелкой указана новообразованная костная ткань, созревающий коллаген а– окраска гематоксилин Карацци/Эозин Y, световая микроскопия; б– окраска Ализариновый красный S/толуидиновый синий, световая микроскопия (стрелкой указано образование новых костных трабекул); в– окраска ядерным красителем Этидиум бромидом, конфокальная микроскопия; 1– старый коллаген, 2– новообразованный фиброзный матрикс; 3– новообразованная костная ткань. Гистологические препараты образцов деминерализованного костного матрикса, включающих PDGF б– стрелкой указаны очаги начальной минерализации новообразованного матрикса Гистологические препараты образцов деминерализованного костного матрикса, включающих PDGF Стрелкой показано врастание структурирование новообразованного матрикса в зоне соприкосновения со матриксом ДКМ Гистологические препараты образцов деминерализованного костного матрикса, включающих rhBMP-2 и PDGF Стрелкой показано образование структурированной новообразованной костной ткани (трабекул) в зоне соприкосновения со матриксом ДКМ а– окраска гематоксилин Карацци/Эозин Y, световая микроскопия; б– окраска ядерным красителем Этидиум бромидом, конфокальная микроскопия. 1– старый коллаген, 2– новообразованный фиброзный матрикс, 3– новообразованная костная ткань. Полученные результаты указывают на возможность использования производимого нами белка rhBMP-2 как в качестве моноиндуктора остеогенеза в разрабатываемых остеоиндуктивных материалах, так и в сочетании с рекомбинантным фактором роста тромбоцитов. Полученные результаты указывают на необходимость разработки способа получения рекомбинантного ростового фактора PDGF в бактериальной системе экспрессии E. Coli. Данные разработки позволят значительно повысить эффективность остеоиндуктивного потенциала создаваемых материалов, а также повысят доступность и позволят снизить себестоимость разрабатываемых материалов для травматологии, ортопедии, стоматологии, и челюстно-лицевой хирургии. Новые данные, полученные за время проведения работ по проекту являются крайне важными для разработки способов фиксации rhBMP-2 и цитокинов – хемоаттрактантов мезенхимальных клеток реципиента в натуральных гелеобразных носителях и деминерализованном костном матриксе и могут быть рекомендованы для разработки способов создания остеоиндуктивных материалов нового поколения. Получены четкие данные, указывающие на качественное увеличение остеоиндуктивности в моделях подкожной и ортотопической имплантации за счет использования полученного в проекте рекомбинантного морфогенетического белка rhBMP-2, а также выбранных сочетаний и концентраций цитокинов (GF). Полученные результаты рекомендованы к патентованию в соответствии с законодательством Российской Федерации об интеллектуальной собственности. В соответствии с законодательством Российской Федерации об интеллектуальной собственности, по полученным результатам заполнена Форма 1 (РНТД), сформирован пакет документов (Заявка) на выдачу патента «Композитный остеоиндуктивный материал». На основании полученных результатов экспериментальных исследований сформированы представления об особенностях процесса оссификации в имплантируемых материалах, модифицированных морфогенетическим белком кости rhВМР в отдельности или в сочетании с цитокинами PDGF и VEGF. Установлено, что при использовании стандартных кондуктивных материалов (ДКМ, гидроксиапатит, коллаген и т.п.), модифицированных rhBMP-2 и PDGF наблюдается выраженное усиление процессов регенерации и ремоделирования костной ткани в модели ортотпической имплантации. При этом регенерация кости в данном случае обходила, считавшуюся до недавнего времени обязательной, стадию резорбции костной ткани. При проведении исследований показано, что при использовании правильно фиксированных на материале–носителе рекомбинантных белков rhBMP-2 и PDGF BB (с заданным периодом выхода) наблюдается ремоделирование костной ткани, аналогично таковой при стабильном остеосинтезе (ремоделирование без резорбции некротической кости), что свидетельствует о выраженном остеоиндуктивном действии разрабатываемых материалов. МОДЕЛИ, МЕТОДЫ, ПОЗВОЛЯЮЩИЕ УВЕЛИЧИТЬ ОБЪЕМ ЗНАНИЙ ДЛЯ БОЛЕЕ ГЛУБОКОГО ПОНИМАНИЯ ИЗУЧАЕМОГО ПРЕДМЕТА ИССЛЕДОВАНИЯ НОВЫХ ЯВЛЕНИЙ, МЕХАНИЗМОВ ИЛИ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ Разрабатываемые подходы по созданию остеоиндуктивных материалов на основе рекомбинантного белка ВМР–2 напрямую соответствуют направлениям технологического развития (исследований и разработок), поддерживаемых в рамках Технологической платформы «Медицина будущего». Также необходимо отметить, что проведенный теоретический анализ и оценка научно-технического уровня выполненных исследований показали соответствие результатов НИР лучшим достижениям в данной области, а в сфере комплексного решения ключевых проблем тканевой инженерии костных материалов (доступность/фиксация/остеоиндуктивность) показали превосходство предложенных подходов и методов. Цель и задачи работы были достигнуты посредством полной реализации поставленных задач, заключающихся в систематизации и предварительной оценке полученных результатов; оценке полноты решения задач и достижения поставленных целей; сопоставлении и обобщении результатов анализа научноинформационных источников (открытых публикаций) и теоретических исследований; оценке эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем; разработке рекомендаций по возможности использования результатов проведенных НИР в доклинических исследованиях и реальном секторе экономики. По результатам анализа выполнения требований технического задания на НИР и оценки полноты решения задач и достижения поставленных целей НИР можно заключить, что все решаемые в рамках НИР задачи выполнены полностью, все индикаторы и показатели программы достигнуты и превышены. Патентная чистота результатов НИР подтверждена патентными исследованиями, подана заявка на изобретение в РФ. Результаты НИР полностью соответствуют требованиям Задания на выполнение поисковых научно– исследовательских работ по Госконтракту. Цель проекта достигнута.
