На правах рукописи Тагабилев Дмитрий Геннатулович Изучение возможности использования ксеноперикарда и
advertisement
На правах рукописи Тагабилев Дмитрий Геннатулович Изучение возможности использования ксеноперикарда и ацеллюлярного кожного матрикса в качестве основы тканевых эквивалентов слизистых оболочек 14.01.17 - хирургия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук МОСКВА 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском научном центре хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Николай Олегович Миланов Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Александр Васильевич Гавриленко доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Игорь Владимирович Решетов Ведущая организация: Федеральное Государственное Учреждение Институт Хирургии им. А.В. Вишневского Минздравсоцразвития России Защита диссертации состоится « 21 » июня 2011 г. в 15:00 часов на заседании Диссертационного совета (Д 001.027.02) Учреждения Российской академии медицинских наук РНЦХ им. академика Б.В. Петровского РАМН Адрес: 119991, г. Москва, ГСП-2, Абрикосовский пер., д.2 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНЦХ им. академика Б.В. Петровского РАМН Автореферат разослан « 20 » мая 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Э.А. Годжелло 3 Актуальность проблемы При реконструктивных операциях в анатомических зонах содержащих слизистые оболочки, из-за отсутствия достаточного количества местных тканей, хирурги вынуждены использовать ткани, не предназначенные природой для функционирования в условиях данной реципиентной области. Несмотря на то, что огромное количество всевозможных методов широко применяется в клинике, единого подхода к пластике анатомических областей со слизистыми оболочками до сих пор нет (Миланов Н.О., 1999; Абдуллаев И.А., 2000; Жуманов А.Р., 2006; Amirzargar M.A., 2007). Это объясняется осложнениями, присущими всем методикам, а также не всегда удовлетворительными функциональными и косметическими результатами. Так, для пластики уретры при различных патологиях используются различные варианты кожно-фасциальных лоскутов на сосудистой ножке. Методика является одной из наиболее современных и дает хорошие результаты. Ее основными недостатками являются: риск декомпенсации кровообращения в лоскуте, рост волос в просвет сформированной неоуретры, хроническая воспалительная реакция кожи при длительном контакте с мочой, формирование конкрементов и послеоперационных свищей (Миланов Н.О., 2007). Многих проблем позволяет избежать применение аналогов слизистой оболочки, которые могут быть получены in vitro с применением клеточных технологий, при этом свойства пластического материала максимально приближены к свойствам нормальной ткани реципиентной области (Aala A., 2011). Большинство важных для хирургов характеристик тканевого эквивалента, помимо клеточного Идеального материала, определяет тип носителя клеток (подложки). материала, способного служить основой любого тканевого эквивалента, на сегодняшний день не существует (Heck E.L., 1985; Hafemann B., 1999; Lee K.H., 2000; Nakamura T., 2003; Ng K.W., 2005). Подложка подбирается индивидуально для каждого эквивалента с учетом особенностей клеток, а также с учетом характеристик необходимых для функционирования в каждой конкретной области реконструкции. Вопрос выбора материала подложки тканевого 4 эквивалента для реконструкции слизистых остается актуальным, поскольку предложенные в мировой литературе материалы имеют ряд недостатков, среди которых: недостаточная прочность, отсутствие эластичности, неудовлетворительные показатели биодеградации, недостаточная пористость, сложность транспортировки и хранения, неудобство в работе и высокая стоимость (M. Moharamzadeh K., 2007). Отсутствие оптимального материала для создания тканевого эквивалента слизистых оболочек, отсутствие в доступной литературе общепризнанных хирургических критериев выбора материалов подложки, а также отсутствие экспериментальной модели для исследования свойств таких материалов явились основаниями для проведения данного исследования. Цель исследования Изучение в эксперименте возможности использования ксеноперикарда и ацеллюлярного кожного матрикса в качестве носителей клеточных трансплантатов для устранения протяженных дефектов слизистых оболочек (в том числе мочеиспускательного канала) с позиции хирургии. Задачи исследования 1. Разработать экспериментальную биологическую модель для исследования свойств материалов подложек тканевых эквивалентов слизистых оболочек. 2. Разработать хирургические критерии выбора материалов для использования в качестве подложек тканевых эквивалентов слизистых оболочек. 3. Определить возможности применения методики ферментативно- химической обработки ксеноперикарда для получения ацеллюлярного кожного матрикса из полнослойной кожи. 4. Изучить в эксперименте особенности тканевой реакции на ацеллюлярный ксеноперикард и ацеллюлярный кожный матрикс. 5 5. Изучить способность культур клеток фиксироваться на поверхности ацеллюлярного кожного матрикса и ксеноперикарда. 6. Исходя из сформулированных критериев, провести сравнительную оценку ацеллюлярного кожного матрикса и ксеноперикарда для использования в качестве подложки клеточных трансплантатов, дать практические рекомендации. Научная новизна Сформулированы хирургические критерии выбора материала подложки тканевого эквивалента для реконструкции слизистой оболочки уретры. В эксперименте изучена возможность применения ксеноперикарда в качестве материала подложки тканевого эквивалента слизистой. Предложена методика увеличения темпов васкуляризации ксеноперикарда с помощью нанесения лазерных микроперфораций. Практическая значимость Разработана экспериментальная модель для исследования свойств материалов подложек тканевых эквивалентов. Показана возможность использования ксеноперикарда в качестве материала основы при создании тканевых эквивалентов для реконструкции слизистых оболочек. Обоснована необходимость увеличения порозности ксеноперикарда при использовании его для создания тканевых эквивалентов слизистых оболочек. Предложена методика лазерного микроперфорирования ксеноперикарда. Апробация работы Результаты исследования доложены на V-VIII конференциях молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», международном форуме по нанотехнологиям 6 Rusnanotech 2010, втором (VII) съезде Российского общества пластических, реконструктивных и эстетических хирургов. Апробация работы проведена 29.04.2011 года на совместной научной конференции отделения восстановительной микрохирургии и отделения пластической и челюстно-лицевой хирургии Российского научного центра хирургии им. академика Б.В. Петровского РАМН (директор – д.м.н., профессор С.Л. Дземешкевич). Публикации По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Структура диссертации Диссертация написана на русском языке, объѐм еѐ составляет 123 страницы компьютерного набора. Работа состоит из оглавления, введения, 3 глав (в том числе обзора литературы), заключения, выводов, практических рекомендаций. Список использованной литературы включает 20 работ отечественных и 148 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками, 5 таблицами. Содержание работы Материалы и методы исследования Работа выполнена в Российском научном центре хирургии им. акад. Б.В.Петровского РАМН (директор - проф.С.Л. Дземешкевич) на базе отдела экспериментальных исследований в хирургии РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН (зав. отделом - к.м.н. И.Л. Жидков). Эксперименты на животных (крысах линии Wistar) выполнены с соблюдением всех правил асептики, в соответствии с международными и Российскими принципами и нормами, регламентированными приказами МЗ СССР № 176 от 12.08.1977, № 1179 от 10.10.1983, № 267 МЗ РФ от 19.06.2003, Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации о 7 гуманном отношении к животным (1964), Европейской конвенцией по биоэтике (1996), основами законодательства РФ (1993). Исходя из литературных данных, а также опыта проведенных ранее исследований тканевого эквивалента на основе коллагенового геля (Липский К.Б., 2010), мы сформулировали следующие хирургические критерии пригодности материалов для использования в качестве подложек тканевых эквивалентов слизистых оболочек: 1) биосовместимость; 2) достаточная порозность; 3) механическая прочность достаточная для проведения хирургических манипуляций; 4) эластичность достаточная для сворачивания в трубку на катетере (для тканевого эквивалента слизистой оболочки уретры); 5) ригидность (для тканевого эквивалента слизистой оболочки уретры). На соответствие данным критериям исследованы следующие материалы: 1) ацеллюлярный ксеноперикард; 2) ацеллюлярный микроперфорированный ксеноперикард; 3) ацеллюлярный кожный матрикс. Ацеллюлярный кожный матрикс был выбран в качестве материала сравнения, поскольку в литературе описано несколько удачных примеров применения тканевых эквивалентов слизистой оболочки на его основе (Cho K.H., 2000; Ophof R., 2002). К преимуществам этого материала относятся: прочность, низкая иммуногенность, способность сохранять характеристики после криоконсервации. Недостатками являются: необходимость предварительного обследования донора, высокие требования к условиям хранения и транспортировки, крайне высокая стоимость коммерчески-доступных продуктов. Ацеллюлярный ксеноперикард обладает сравнимой прочностью, низкой иммуногенностью, при этом он значительно более доступен. Недостатком данного материала является отсутствие естественных пор, а, следовательно, предположительно низкая динамика 8 интеграции тканевого эквивалента на его основе. Данный недостаток устранен нанесением лазерных микроперфораций, что позволило получить материал с принципиально новыми свойствами. Ацеллюлярный ксеноперикард получали путем ферментативно-химической обработки перикарда быков и телят. Производили механическую очистку перикарда от серозной оболочки и жировой ткани. Обработку кожи для получения ацеллюлярного кожного матрикса проводили по той же методике, без предварительной деэпидермизации. После обработки проводили гистологическое исследование образцов материалов для контроля децеллюляризации. Гистологическое исследование образцов ксеноперикарда и кожи, прошедших обработку, показало, что методика позволяет практически полностью удалить клеточные элементы из состава материала. После ферментативно-химической обработки материалы представляли собой однородную плотную ткань из продольно ориентированных коллагеновых и эластиновых волокон. В образцах кожи после обработки наблюдали отдельные скопления клеток, главным образом жировой и железистых тканей, а также эпидермиса. В образцах кожи обнаруживались каналы сосудов и выводных протоков желез, определяющие порозность материала. В образцах перикарда поры не выявлялись. Клеточная составляющая в образцах перикарда после обработки отсутствовала, это было обусловлено тем, что нативный перикард изначально содержал значительно меньшее количество клеток в сравнении с кожей. Для увеличения порозности выполняли микроперфорирование ацеллюлярного ксеноперикарда с помощью твердотельного Nd-YAG лазера с ламповой накачкой и модуляцией добротности (длина волны 1,064 мкм) на лазерном гравирующем комплексе JET-SPOT (ЭКВИПЛЮС, Россия). Режим работы лазера подбирали индивидуально в зависимости от толщины, плотности и влажности каждого образца. Данная методика позволила получить равномерно распределенные по площади материала, сквозные поры диаметром от 0,04 до 0,2мм и плотностью до 20 на мм2 (в зависимости от технологического режима), с 9 минимальными признаками повреждения прилегающих зон материала. Данные показатели сопоставимы с величиной и плотностью капилляров дермы (рис. 1, 2). Рис. 1. Ацеллюлярный микроперфорированный ксеноперикард. Рис. 2. Ацеллюлярный микроперфорированный ксеноперикард, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 100х Оценку соответствия свойств материалов предложенным хирургическим критериям проводили путем сворачивания образцов в трубку на катетере Фолея Ch16 и наложения фиксирующих узловых швов нитью PROLENE 6-0 (ETHICON, USA). Образцы всех материалов оказались достаточно прочными и эластичными для сворачивания в трубку на катетере без каких-либо технических трудностей. Фиксирующие узловые швы не прорезывалмсь, надежно удерживали сопоставляемые края материалов. Полученные трубчатые структуры оказались 10 достаточно ригидными для сохранения просвета без катетера (рис. 3). Механические свойства образцов позволяли достаточно комфортно работать с ними в условиях операционной раны. Таким образом, данные материалы полностью соответствуют хирургическим критериям, предложенным нами для материалов подложек тканевых эквивалентов слизистых. Рис. 3. Трубка сформирована из микроперфорированного ксеноперикарда. Культуры клеток для изучения возможности клеточной адгезии на поверхности материалов выделяли из кожного лоскута размером 1х1см. Лоскут тщательно промывали в растворе Хэнкса с антибиотиками, измельчали и подвергали ферментативной обработке (Диспаза 0,2%). Суспензию эпидермальных кератиноцитов, осаждали центрифугированием и высевали в пластиковые культуральные флаконы («Costar») на полную питательную среду: DMEM: F-12 1:1 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 10нг\мл эпидермального фактора роста (ЭФР), 5мкг/мл инсулина («Sigma»), 106М изопротеринола («Sigma»), 5мкг/мл трансферрина («Sigma»). Пластиковые культуральные флаконы предварительно сорбировали коллагеном. После формирования во флаконах многослойного эпителиального пласта проводили дестратификацию путем перевода культуры кератиноцитов на культуральную среду без ионов Са2+ (CNT 07 , «CELLnTEC») на 1 сутки. Клетки снимали трипсином с поверхности культуральных флаконов, затем трипсин ингибировали небольшим количеством ЭТС. Суспензию эпидермальных кератиноцитов высевали на поверхность образцов испытуемых материалов 11 размером 4х5 см и заливали полной питательной средой для культивирования. Через 7 суток, после формирования на поверхности материала многослойного эпителиального пласта образцы фиксировали 4% нейтральным раствором формалина и проводили гистологическое исследование. Данные гистологического исследования подтвердили наличие клеток на поверхности всех материалов через 14 суток после высевания культуры. Установлено, что клетки способны проникать в поры микроперфорированного материала и образовывать тонкий слой межклеточного матрикса, перекрывающий поры небольших размеров (рис. 4-6). Существенных различий в характере роста клеток на поверхности исследованных материалов выявлено не было. Рис. 4. Кокультура кератиноцитов и фибробластов на поверхности ксеноперикарда, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х. Рис. 5. Кокультура кератиноцитов и фибробластов на поверхности ацеллюлярноко кожного матрикса, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х. 12 . Рис. 6. Кокультура кератиноцитов и фибробластов на поверхности микроперфорированного ксеноперикарда, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х. Для создания экспериментальной модели и исследования тканевой реакции на материалы подложек тканевых эквивалентов проведены эксперименты на 65 самцах крыс, породы Wistar, массой 220-260г. Животные были разделены на 3 группы по 20 особей в каждой: животным первой группы имплантировали образцы ксеноперикарда, животным второй группы – образцы перфорированного ксеноперикарда, животным третьей группы – образцы ацеллюлярного кожного матрикса. Последние 5 животных составили группу сравнения. Распределение животных по группам представлено в таблице №1. Таблица 1. Распределение животных по группам (n=65). Группы Перикард Сроки Кожный Перфорированный матрикс перикард Контроль 3 суток 4 4 4 1 7 суток 4 4 4 1 14 суток 4 4 4 1 30 суток 4 4 4 1 180 суток 4 4 4 1 Всего 20 20 20 5 13 Для имплантации образцов материалов была выбрана область межлопаточного пространства. При выборе руководствовались критерием минимальной доступности области для самого животного, отсутствием важных анатомических образований, минимальной подвижностью подлежащих тканей. Образцы испытуемых материалов нарезали на фрагменты размером 1х1см и отмывали от раствора консерванта (глутарового альдегида) в 400мл дистиллированной воды в течение полутора часов с 3-х кратной сменой раствора. После выполнения общего обезболивания путем внутрибрюшинного введения Тиопентала натрия, шерсть в проекции операционного поля выбривали, кожные покровы четырехкратно обрабатывали раствором йодоната, операционное поле обкладывали стерильным материалом. Выполняли кожный разрез длиной 2см, тупым способом формировали подкожный карман достаточного размера для свободного расположения образца, имплантировали образец исследуемого материала, осуществляли фиксацию образца к подлежащим тканям четырьмя отдельными узловыми швами, нитью PROLENE 6-0 (ETHICON, Belgium), рану ушивали непрерывным швом, шелковой нитью на режущей игле MERSILK 4-0 (ETHICON, Belgium) (рис. 7). Рис. 7. Образец материала фиксирован в сформированном подкожном кармане. 14 Кроме наблюдения за общим состоянием животных, динамического осмотра области экспериментальных ран, исследований макропрепаратов, выполняли гистоморфологическое исследование ткани из области имплантации. Животных выводили из эксперимента на 3, 7, 14, 30 и 180 сутки с момента имплантации, путем внутрибрюшинного введения 0,5% раствора тиопентала натрия из расчета 120мг/кг. После прекращения сердечной деятельности выполняли забор тканей в межлопаточном пространстве в проекции образца, размерами 2,5х2,5 см. Ткани фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин по стандартной методике. Материал обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей фирмы «Pool Scientific Instruments» (Швейцария) и заливали в парафин. Затем готовили серийные парафиновые срезы (не менее 10 серийных срезов с каждого макропрепарата), толщиной 4 микрона. Срезы фиксировали на предметные стекла, покрытые адгезивом (полилизин, APES) и инкубировали в термостате при 370С в течение 12 часов. Далее срезы депарафинировали и обезвоживали в батарее из 3-х ксилолов, 2-х абсолютных спиртов, 2-х 95% спиртов, 80% и 70% спирта и дистилированной воды. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Гистопрепараты исследовали с помощью микроскопа «Axioplan-2» фирмы Цейсс, фотосъемку проводили цифровой камерой «Hitachi». Исследовано 58 макропрепаратов, из которых выполнено 620 серийных срезов. На ранних сроках после имплантации исследованных материалов наблюдалась картина умеренно выраженного экссудативного воспаления. Клеточная инфильтрация, выявленная вокруг образцов всех материалов (фибробласты, макрофаги, небольшое количество лимфоцитов), была более выражена вокруг эпителиальной образцов поверхности); кожного были матрикса (особенно обнаружены со стороны единичные клетки, мигрировавшие в толщу образцов кожи и перфорированного ксеноперикарда через поры, по каналам сосудов и придатков кожи. На 7-е сутки сохранялась после имплантации вокруг образцов ксеноперикарда умеренная клеточная инфильтрация, наблюдали образование 15 грануляционной ткани с единичными новообразованными сосудами. Похожую картину наблюдали вокруг образцов кожи с добавлением краевой инфильтрации дермальной поверхности. Клеточная инфильтрация тканей со стороны эпителиальной поверхности оставалась более выраженной по сравнению с дермальной поверхностью, а также по сравнению с тканями, окружавшими образцы ксеноперикарда. Наблюдали активную миграцию клеток в толщу образцов перфорированного ксеноперикарда. В отличие от краевой инфильтрации, наблюдавшейся в образцах ацеллюлярного кожного матрикса на данном сроке, мигрировавшие через поры клетки проникали достаточно глубоко в толщу материала. В краевых участках пор наблюдалось формирование рыхлой грануляционной ткани с единичными новообразованными сосудами, что соответствовало гистоморфологической картине изменений наблюдавшихся в контрольной группе (рис. 8). Рис. 8. Образец перфорированного ксеноперикарда в тканях, 7 сутки после имплантации, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 400х. На 14-е сутки после имплантации выявлена слабая краевая инфильтрация перикарда, в образцах кожи наблюдали миграцию клеток в толщу трансплантата, на всех препаратах обнаруживали единичные сосуды в тканях вокруг образцов. Клеточная инфильтрация окружающих тканей несколько снижалась. Вокруг образцов перфорированного ксеноперикарда наблюдали формирование рыхлой грануляционной ткани с отдельными новообразованными кровеносными 16 сосудами, полностью заполнявшей поры перфорированного ксеноперикарда. Состав и строение грануляционной ткани не отличались от наблюдавшихся в группе сравнения. В просвете пор обнаруживались отдельные новообразованные сосуды (рис. 9). Рис. 9. Образец перфорированного ксеноперикарда в тканях, 14 сутки после имплантации, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х. К окончанию первого месяца наблюдали признаки ремоделирования всех материалов, клеточные включения определялись до трети толщины перикарда. Трансплантаты были окружены рыхлой соединительной тканью со сформированной сосудистой сетью, которая проникала до трети толщины кожного лоскута со стороны дермальной поверхности, и не проникала в толщу перикарда. Наблюдалось разрыхление краевых волокон коллагена материалов, наиболее выраженное с дермальной поверхности ацеллюлярного кожного матрикса, при этом со стороны эпителиальной поверхности наблюдали уплотнение соединительной ткани, признаки формирования соединительнотканной капсулы. Наблюдали формирование сосудистой сети, пронизывающей перфорированный ксеноперикард сквозь поры, краевые волокна коллагена были разрежены, выявлялись признаки постепенного ремоделирование материала. Процесс ремоделирования перфорированного ксеноперикарда на данном сроке наблюдения протекал значительно активнее, чем в остальных 17 испытуемых материалах. Состав и строение соединительной ткани вокруг образца не отличался от таковых в контрольной группе (рис. 10). Рис. 10. Образец перфорированного ксеноперикарда в тканях, 14 сутки после имплантации, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х. Таким образом, образцы ацеллюлярной кожи показали значительно лучшую динамику процессов интеграции и ремоделирования по сравнению с образцами неперфорированного ксеноперикарда. В образцах ксеноперикарда затруднены быстрая миграция клеток в толщу материала за счет высокой плотности материала и практически полного отсутствия пор. Можно предположить, что низкая пористость, медленные интеграция и ремоделирование материала подложки значительно осложнят процессы адаптации и приживления тканевого эквивалентана основе ксеноперикарда, особенно на ранних сроках. С другой стороны, наличие остаточных клеток в образцах кожного матрикса увеличивает вероятность возникновения иммунных реакций на материал при имплантации его пациентам. Поэтому использование ксеноперикарда при условии повышения его порозности выглядит более предпочтительным. Повышение порозности ксеноперикарда за счет нанесения лазерных микроперфораций значительно облегчило миграцию клеток в толщу материала, ускорило динамику процессов интеграции в окружающие ткани и ремоделирования материала. К окончанию перфорированного 6-го месяца ксеноперикарда. наблюдали значительную Определялись отдельные резорбцию островки 18 упорядоченных коллагеновых волокон материала, окруженные соединительной тканью с разветвленной сосудистой сетью (рис. 11). Выявлена продолжавшаяся краевая резорбция образцов неперфорированного ксеноперикарда, пограничные коллагеновые волокна были разрежены, включены в структуру окружающей соединительной ткани, при этом коллагеновые волокна в толще образца сохраняли упорядоченность и плотность. По границе эпителиальной поверхности образцов ацеллюлярного кожного матрикса было выявлено образование нежной соединительнотканной капсулы, при этом со стороны дермальной поверхности наблюдаются признаки ремоделирования схожие с таковыми в образцах ксеноперикарда, но выраженные в большей степени. Рис. 11. Образец перфорированного ксеноперикарда в тканях, 14 сутки после имплантации, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х. Таким образом, по результатам гистоморфологического исследования испытуемые материалы не вызывают выраженной острой или хронической воспалительной реакции. Степень и характер гистоморфологических изменений в тканях вокруг образцов на всех сроках наблюдения соответствует таковым, наблюдаемым в группе сравнения. Исключение составляет более выраженная клеточная инфильтрация тканей прилегающих к эпителиальной поверхности образцов кожного матрикса. В клеточном составе инфильтрата выявляется большее количество лейкоцитов, лимфоцитов и эозинофилов по сравнению с контрольной группой и образцами остальных испытуемых материалов. Данная 19 особенность, по всей видимости, объясняется наличием в составе кожного матрикса остаточных клеток, поскольку в состав кожи входит многослойный плоский ороговевающий эпителий, который не удается полностью удалить в процессе предварительной обработки материала. Остатки разрушенных клеток, сохраняющиеся на эпителиальной поверхности кожного матрикса, содержат иммуногенные компоненты, такие как антигены клеточных мембран и фрагменты ДНК. В связи с этим, наблюдается более активная воспалительная реакция, которая на ранних сроках проявляется выраженной клеточной инфильтрацией окружающих тканей, а на более поздних сроках сменяется формированием капсулы. Тканевая реакция на образцы ацеллюлярного ксеноперикарда на всех сроках наблюдения значительно не отличается от изменений происходящих в тканях животных контрольной группы. В процессе обработки перикарда, изначально содержащего очень небольшое количество клеток, происходит почти полная децеллюляризация материала. Кроме того, отщепляются концевые телопептиды коллагена обладающие высокой иммуногенностью. Таким образом, материал становится иммунологически инертным, чем и объясняется отсутствие выраженных иммунных реакций со стороны организма животного. При создании тканевых эквивалентов слизистых оболочек предпочтительно использовать в качестве подложек иммунологически инертные материалы, так как в процессе адоптации и интеграции клеточного трансплантата дополнительный стресс (иммунная реакция со стороны реципиента) может пагубно сказаться на его приживлении. Если предположить, что эпителиальная поверхность кожного матрикса будет использоваться в качестве несущей поверхности для клеточного трансплантата и длительное время не будет контактировать с иммунокомпетентными клетками реципиента, то, возможно, удастся добиться соблюдения оптимальных условий для приживления трансплантата. Однако со временем такой контакт неизбежен, так как материал будет прорастать тканями реципиента, и иммунокомпетентные 20 клетки достигнут его эпителиальной поверхности. На основании данных нашего исследования результат такого взаимодействия прогнозировать невозможно. Необходимо отметить, что предварительная механическая деэпидермизация, а также применение методики более полной децеллюляризации кожи могла бы решить проблемы, возникающие при использовании кожного матрикса с остаточными скоплениями клеток. Уже на ранних сроках исследований было выявлено, что крайне низкая порозность перикарда, как и ожидалось, затрудняет процессы его интеграции и ремоделирования. Клетки ответственные за этот процесс (фибробласты, макрофаги) не могут проникать в толщу материала и воздействуют только на краевые участки материала. Следует ожидать, что при имплантации тканевого эквивалента на основе ксеноперикарда, клетки на его поверхности будут страдать, так как они окажутся практически изолированными от организма реципиента, а значит, не будут увлажняться и получать питательные вещества. Сохранение поверхностной влажности и адекватного снабжения клеточного трансплантата питательными веществами и кислородом особенно важны на ранних сроках после имплантации, когда клетки переживают стресс при переносе их из лабораторных условий в условия живого организма. Предложенная нами методика нанесения лазерных микроперфораций на ацеллюлярный ксеноперикард, позволяет получать сквозные отверстия заданного диаметра с необходимой плотностью. Данные гистоморфологического исследования подтвердили, что получаемые отверстия служат входными воротами для миграции клеток в толщу материала. Быстрая миграция клеток уже в первые дни после трансплантации обеспечивает прорастание пор грануляционной тканью и кровеносными сосудами, что, возможно, будет играть ключевую роль в процессе интеграции материала подложки тканевого эквивалента. Кроме того, наличие пор должно обеспечить поступление внеклеточной жидкости из раны в зоне реконструкции к клеткам поверхности 21 непосредственно после трансплантации, что создаст более благоприятные условия для приживления эквивалента. На поздних сроках наличие пор обеспечивает выгодные условия для более полного и быстрого исследования, к ремоделирования окончанию 6-го материала. месяца после Как показали имплантации наши образцы перфорированного ксеноперикарда практически полностью интегрируются в собственную соединительную ткань реципиента, сохраняются небольшие фрагменты, имеющие исходную конфигурацию коллагеновых волокон. С практической точки зрения эта особенность может быть очень важна. При реконструкции слизистых у детей, например реконструкции мочеиспускательного канала, необходимо, чтобы пластический материал “рос” вместе с ребенком. Очевидно, что материал не являющийся частью организма не будет расти вместе с ним, а, следовательно, может нарушать нормальное формирование органа. С другой стороны, материал, который полностью интегрируется в окружающие ткани, волокна которого большей частью замещаются коллагеном организма и окружены активными клетками, возможно, не будет мешать правильному формированию мочеиспускательного канала. Способность клеток (кератиноцитов и фибробластов) фиксироваться на поверхности всех исследованных материалов была подтверждена результатами нашего исследования. Поверхность ацеллюлярного кожного матрикса и ксеноперикарда представлена коллагеновыми и эластиновыми волокнами, к которым кератиноциты и фибробласты имеют выраженную тропность, что подтверждается и литературными данными. ВЫВОДЫ 1. Экспериментальная модель для исследования материалов подложек тканевых эквивалентов создается путем имплантации образца исследуемого материала лабораторным животным межлопаточного пространства. (крысам) под кожу в области 22 2. При выборе материала подложки тканевого эквивалента для закрытия дефектов слизистых оболочек необходимо руководствоваться не только биологическими, но и хирургическими критериями, включающими прочностные характеристики, эластичность, ригидность, биосовместимость, пористость. 3. Использованная в работе методика ферментативно-химической обработки ксеноперикарда не позволяет добиться адекватной децеллюляризации при обработке кожи. 4. Ацеллюлярный кожный матрикс, по сравнению с ксеноперикардом, активнее интегрируется в ткани и васкуляризируется за счет наличия естественных пор. 5. При увеличении порозности ксеноперикарда за счет нанесения лазерных микроперфораций, динамика интеграции в ткани и васкуляризации значительно возрастает. 6. Ксеноперикард и ацеллюлярный кожный матрикс являются хорошими поверхностями для фиксации культур фибробластов и кератиноцитов. 7. Наиболее подходящим для использования в качестве подложки является перфорированный ацеллюлярный ксеноперикард, что обусловлено быстрым прорастанием пор материала грануляционной тканью с последующим формированием сосудистой сети. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕДАЦИИ 1. При исследовании свойств материалов подложек тканевых эквивалентов целесообразно проводить имплантацию материалов подкожно в область межлопаточного пространства мелким лабораторным животным. 2. При создании тканевого эквивалента слизистой оболочки для реконструкции уретры рекомендуем использовать эластичные и пористые биосовместимые материалы. достаточно прочные, 23 3. Для получения ацеллюлярного кожного матрикса по методике ферментативно-химической обработки ксеноперикарда необходимо проводить предварительную механическую деэпидермизацию кожи. 4. При использовании ацеллюлярного ксеноперикарда в качестве основы тканевых эквивалентов для реконструкции слизистых оболочек рекомендуем повышение порозности материала путем нанесения микроперфораций. 5. Микроперфорирование ксеноперикарда рекомендуем осуществлять с помощью твердотельного Nd-YAG лазера с ламповой накачкой и модуляцией добротности (длина волны 1,064 мкм). 6. Плотность микроперфораций должна быть максимальной, при условии сохранения структурной целостности материала. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Новые технологии в хирургии XXI века: перспективы применения стволовых клеток // Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии. - 2004. - № 3. - С. 45-53 (Соавт.: Старцева О.И.). 2. Клеточные технологии в реконструкции уретры // Материалы V конференции молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». – Москва. – 2006. – С. 56. (Соавт.: Миланов Н.О., Старцева О.И., Жуманов А.Р.). 3. Тканевой эквивалент для закрытия протяженных дефектов уретры // Материалы VI конференции молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». – Москва. – 2007. – С. 71. (Соавт.: Миланов Н.О., Старцева О.И., Жуманов А.Р.). 4. Возможности использования клеточных технологий в реконструкции мочеиспускательного канала // Материалы VII конференции молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». – Москва. – 2008. – С. 65. (Соавт.: Миланов Н.О., Липский К.Б., Гуляев И.В.). 24 5. Создание тканевых эквивалентов слизистых оболочек // Материалы VIII конференции молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». – Москва. – 2009. – С. 10. (Соавт.: Липский К.Б., Гуляев И.В.). 6. Тканевой эквивалент слизистой оболочки для устранения протяженных дефектов уретры // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. – 2010. №3 (34). – С. 65. (Соавт.: Липский К.Б., Гуляев И.В.). 7. Tissue equivalent for urethra reconstruction (Тканевой эквивалент для реконструкции уретры) // Nanotechnology in medicine (Нанотехнологии в медицине). (Материалы Международного форума по нанотехнологиям Rusnanotech 2010). – Москва 1-3 ноября 2010г. – С. 197. (Соавт.: Липский К.Б., Гуляев И.В.). 8. Тканевой эквивалент слизистой оболочки для устранения протяженных дефектов уретры // Тезисы второго (VII) съезда Российского общества пластических, реконструктивных и эстетических хирургов 1-2 декабря 2010. Москва. – С. 87-88. (Соавт.: Миланов Н.О., Липский К.Б., Гуляев И.В.). 9. Клеточные технологии и тканевая инженерия в реконструкции слизистых оболочек (обзор литературы) // Хирург. - 2010. - №2. - С. 27-33.. (Соавт.: Липский К.Б., Гуляев И.В.). Типография РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН Зак. №236 Тираж 100 экз.
