основы экспериментальной микробиологии
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени Р.Е. Алексеева» Кафедра «Биотехнология, физическая и аналитическая химия» ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ Методические указания к лабораторным занятиям по дисциплине «Общая биология и микробиология» для студентов, обучающихся по направлению «Биотехнология» и «Техносферная безопасность» дневной формы обучения Нижний Новгород 2013 Составители: О.В. Кузина, О.Н. Смирнова УДК 576(076.5) Основы экспериментальной микробиологии. Методические указания к лабораторным занятиям по дисциплине «Общая биология и микробиология» для студентов, обучающихся по направлению «Биотехнология» и «Техносферная безопасность» дневной формы обучения / НГТУ; Сост.: О.В. Кузина, О.Н. Смирнова.– Н. Новгород, 2013.– 32 с. Лабораторный практикум содержит основные правила выполнения работ в микробиологической лаборатории. Основное внимание уделено освоению студентами методов посева и пересева микроорганизмов, способов подготовки препаратов для светопольной микроскопии, а также изучению культуральных признаков микроорганизмов. Редактор Э.Б. Абросимова Подписано в печать Печать офсетная. Усл. п. л. . Формат 60801/16. Бумага газетная. . Уч.-изд. л. . Тираж 80 экз. Заказ . Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева. Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24. Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева, 2013 ВВЕДЕНИЕ Одной из важнейших задач микробиологии является выделение определенных физиологических групп или определенных видов микроорганизмов из природных экологических ниш, где они вегетируют в сообществе с другими микро- и макроорганизмами. Решение этой задачи требует знания физиологических особенностей микроорганизмов, на основе которых в процессе многолетней микробиологической практики разработаны технические приемы целенаправленного выделения нужных микробных форм из различных объектов внешней среды. Эти приемы включают в себя использование накопительных или элективных (избирательных) питательных сред и условий культивирования для преимущественного накопления в культуре нужных форм микробов, методы выделения чистых культур из отдельных колоний или клеток микроорганизмов. Чистые культуры микробов для распознавания (идентификации) до рода или вида изучаются с помощью комплекса культуральных, морфологических и физиолого-биохимических методов исследования. В лабораторный практикум включены задания, цель которых привить студентам навыки работы в лаборатории с микроорганизмами, изучить их морфологию и физиологические свойства, а также освоить методы микробиологического исследования объектов окружающей среды, техногенных потоков и продуктов. В качестве объектов исследования при выполнении работ используются культуры микроорганизмов, широко распространенных в природных средах, участвующих в биогеохимических циклах превращения веществ в биосфере, используемых в биотехнологических процессах. ОХРАНА ТРУДА К лабораторным работам допускаются студенты, в белых халатах, шапочках и ватно-марлевых повязках, прошедшие инструктаж по технике безопасности в лаборатории микробиологии кафедры «Биотехнология, физическая и аналитическая химия» и изучившие инструкцию к выполняемой работе. При работе с микроскопом используются специальные электроосветители или настольные электролампы, при работе с которыми необходимо соблюдать следующие правила: - прежде чем приступать к выполнению работы, необходимо убедиться в исправности электрооборудования; - нельзя работать в случае повреждения изоляции, штепсельной вилки, розеток и т.д., о неисправности электрооборудования немедленно сообщить лаборанту или преподавателю; - нельзя прикасаться руками или металлическими предметами к корпусу осветителя, включенного в сеть; - в случае перерыва в подаче электроэнергии лампу или осветитель необходимо выключить и доложить об этом лаборанту или преподавателю; - в случае воспламенения электроприборов или проводов необходимо их обесточить. Тушить электроприборы и провода необходимо песком или углекислотным огнетушителем. Запрещается при этом применять воду или пенные огнетушители. После окончания работы обязательно выключить используемые электроприборы. При приготовлении препаратов живых и фиксированных клеток необходимо выполнять следующие требования: - при работе с горелками и спиртовками соблюдать требования, обеспечивающие пожарную и личную безопасность; - при работе с препаратами соблюдать правила санитарной гигиены; - культуры отбирать только специальными инструментами, с целью исключения личного контакта с микроорганизмами. После работы сдать лаборанту рабочее место, инструменты, материалы для стерилизации и обработки. ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Работа в микробиологической лаборатории требует строгого соблюдения специальных правил, что определяется двумя основными положениями. Первое: в микробиологической практике используют, главным образом, чистые культуры микроорганизмов, т.е. популяции микроорганизмов одного вида, являющихся потомством одной клетки. Поскольку в воздухе, на поверхности окружающих нас предметов, на одежде, руках, волосах всегда имеется большое количество разнообразной микрофлоры, то для обеспечения стерильности исследований и избежания загрязнения культур работа должна проводиться с соблюдением правил асептики. Второе: при исследованиях с неидентифицированными микроорганизмами, при их выделении из объектов окружающей среды и техногенных потоков могут быть выделены патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. Кроме того, клетки как сапротрофных, так и патогенных микроорганизмов могут являться аллергенами для определенных индивидуумов. Таким образом, для получения достоверных результатов исследований, для обеспечения личной безопасности и безопасности окружающих необходимо соблюдение определенных правил. Подготовка помещения для проведения микробиологических работ включает мокрую уборку и тщательную вентиляцию с последующим облучением ультрафиолетовыми лучами бактерицидных ламп. Поверхность стола, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, следует дезинфицировать путем протирания 3% раствором хлорамина, 70% раствором изопропилового или этилового спирта или 5% раствором Н2О2. Подготовку лаборатории к занятиям проводит лаборант. Студенты, выполняя задание, должны соблюдать следующие правила: 1. Каждый студент в микробиологической лаборатории работает на постоянном месте, выполняя задание индивидуально. 2. На рабочем месте не должно быть посторонних предметов (в том числе портфелей и сумок). 3. Студент должен работать только в чистом халате, волосы должны быть подобраны, не падать на плечи. 4. При работе с культурами микроорганизмов необходимо строго соблюдать все правила микробиологической техники. На пробирках, колбах, чашках Петри, матрицах должна быть сделана надпись, содержащая родовые и видовые названия культур, дату засева, фамилию студента и номер группы. 5. Все предметы, использованные при работе с живыми культурами, должны быть обеззаражены либо обжиганием в пламени горелки (петли, иглы), либо погружены в дезинфицирующий раствор (предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели). 6. Все засеянные пробирки, чашки помещаются в термостат или сдаются лаборанту. Отработанный материал (пробирки, чашки Петри) также помещается в определенные емкости по указанию лаборанта для их дальнейшего обеззараживания. 7. В лаборатории запрещается курение, прием пищи, лишнее хождение по лаборатории. 8. В конце занятия студент должен привести в порядок рабочее место, вымыть руки. Необходимо иметь индивидуальное полотенце, салфетки для вытирания рук. Каждый студент ведет журнал лабораторных работ, являющийся документом, позволяющим контролировать правильность полученных данных. Записи проводятся в определенной последовательности и должны содержать следующее: 1) Номер работы. Ее название. Дата постановки и окончания опыта. 2) Объект исследования. 3) Условия проведения опыта, включая методы анализов. 4) Полученные результаты и выводы из них. При изучении морфологии культур делаются их зарисовки при определенных увеличениях микроскопа, что указывается в тетради; цифровые данные обобщают в таблицах, графиках, диаграммах. Лабораторная работа № 1 ПОДГОТОВКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ПОСУДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Цель работы: освоение основных методов культивирования микроорганизмов, а также способов подготовки питательных сред и посуды для их культивирования. В лабораториях микроорганизмы культивируют in vitro, т.е. в стеклянных колбах, пробирках или других сосудах. Для их культивирования необходимы субстраты, которые микроорганизмы используют в качестве питательных веществ. Микроорганизмы, выращенные на питательных средах в условиях лаборатории, называют микробными культурами. Посевы микроорганизмов выращивают, или культивируют, как при доступе кислорода воздуха (аэробы), так и в бескислородной среде (анаэробы). В зависимости от отношения микроорганизмов к температуре их посевы культивируют при различных температурных режимах. Мезофильные бактерии выращивают в термостатах при оптимальной для них температуре 30-370С в течение 1-2 суток. Теплолюбивые бактерии (термофилы) культивируют в термостате при температуре 54-560С в течение 2-3 суток. Дрожжи и микроскопические грибы выращивают при температуре 25-300С в течение 7-10 суток. Психофилы (холодолюбивые микроорганизмы) выращивают в холодильниках или термостатах при низких положительных температурах (260С) в течение 10-15 суток. Основной прибор, для культивирования микроорганизмов - воздушный термостат. Он представляет собой шкаф с двойными стенками, между которыми находится воздух. В верхней стенке термостата имеется отверстие для термометра. Воздух в термостате разогревается с помощью электронагревателей, температурный режим поддерживается автоматически. Снаружи термостат покрывают плохо проводящим тепло материалом (асбестопластик, линолеум и др.). Внутренняя стенка – металлическая, хорошо проводящая тепло. Внутренние стеклянные створки позволяют вести наблюдение за препаратами, не изменяя температурного режима. ХАРАКТЕРИСТИКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД В бактериологической практике нельзя обойтись без питательных сред. Для определения вида микроорганизма, обнаружения возбудителя инфекционной болезни, т.е. установления диагноза заболевания, производства специфических препаратов (вакцин и сывороток), для лечения и профилактики инфекционных болезней, получения антибиотиков, санитарномикробиологических исследований объектов внешней среды, пищевых продуктов и других объектов прибегают к искусственному выращиванию микроорганизмов на питательных средах. К питательным средам предъявляют следующим требованиям: 1. Они должны содержать источники азота и углерода, неорганические соединения, микроэлементы, а также факторы роста, витамины, в основном группы В. В качестве универсального источника азота используют пептоны – продукты гидролизного расщепления мяса или казеина. В них содержатся полипептиды, аминокислоты и основные минеральные вещества. В качестве универсального источника углерода в питательные среды добавляют углеводы (сахара) – глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу и др.; органические кислоты (молочную, лимонную и др.); многоатомные спирты и др. 2. Питательные среды должны иметь определенную реакцию среды. Так, для большинства кокковых, гнилостных и патогенных микроорганизмов оптимум рН 7,0-7,4, а плесневые грибы, дрожжи, молочнокислые микроорганизмы лучше развиваются при рН 6,0. 3. Питательные среды должны быть стерильными, т.е. не содержать микроорганизмов. 4. Питательные среды должны быть влажными, так как питание микроорганизмов осуществляется по законам диффузии и осмоса. Многие среды должны быть прозрачными, для того чтобы можно было различить на них рост микроорганизмов и наблюдать за физиологическими изменениями, происходящими в результате их жизнедеятельности. По консистенции питательные среды бывают жидкими, полужидкими и плотными. Для приготовления плотной питательной среды добавляют агар-агар 2-3%-ной концентрации, для полужидкой – агар-агар 0,2-0,3%-ной концентрации. Агар-агар представляет собой продукт переработки высушенных морских водорослей, состоящих в основном из полисахаридов. Из агар-агара готовят сухой бактоагар. Как питательное вещество агар-агар микробами не усваивается, он служит для придания плотности среды. Агар-агар плавится при температуре 1000С и затвердевает при температуре около 40-430С. По происхождению различают естественные и искусственные среды. Естественные питательные среды – это продукты животного (кровь, сыворотка крови, молоко, желчь и др.) или растительного (овощи, фрукты, злаковые) происхождения, которые используют для культивирования микроорганизмов без специальной обработки с полным сохранением их естественных свойств. Искусственные питательные среды готовят из продуктов переработки растений, мяса, молока, печени и др. часто с добавлением к ним углеводов, витаминов, хлорида натрия, красок и пр. Среди искусственных сред выделяют синтетические среды, т.е. среды с точно известным химическим составом. Рецептов приготовления питательных сред для различных групп бактерий, плесневых грибов и актиномицетов очень много. Но наиболее часто в микробиологии употребляют мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный желатин (МПЖ), бобово-пептонный агар (БПА) и многие другие. Основой для приготовления многих сред служит мясная вода, а также бобовый бульон и неохмеленное пивное сусло. Мясная вода готовится просто. Берут 1 кг свежего мяса, освобождают от жира, костей и сухожилий, измельчают в мясорубке, заливаю 3 литрами воды и кипятят в течение часа. Когда мясная вода охладится, ее фильтруют, доливают до первоначального объема дистиллированной водой, разливают по колбам и стерилизуют 30-40 минут при 1200С. Мясо-пептонный бульон (МПБ). К мясной воде добавляют 1% пептона, 0,5% хлорида натрия и 10% воды (на выкипание). Кипятят до растворения пептона, затем еще в горячем бульоне устанавливают (насыщенным раствором едкого натра) рН 7,3-7,5. После добавления щелочи бульон еще раз кипятят в течение 15-20 минут и фильтруют через бумажный фильтр. Бульон разливают по колбам и стерилизуют при 1200С в течение 15-20 минут (после стерилизации рН, как правило, дает сдвиг на 0,2-0,3 в сторону кислой реакции). Мясо-пептонный агар (МПА). К мясной воде добавляют 1% пептона, 0,5% хлорида натрия, варят в течение 30 минут, устанавливают рН, фильтруют, добавляют 3% агар-агара, нагревают до полного растворения. Затем среду разливают по колбам и стерилизуют при 1200С в течение 15-20 минут. При выделении гнилостных и других микроорганизмов из почвы, а также при микробиологическом анализе воды и воздуха применяют питательные среды, приготовленные на бобовом бульоне или бобовом отваре. Для его приготовления берут 250 г семян бобов (можно использовать семена фасоли или гороха), заливают 1 л воды и варят 1 ч. Затем отвар сливают, дополняют водой до 1 л, определяют и устанавливают необходимый рН, прибавляют 1% сахара, разливают по колбам и стерилизуют при 1200С. Дрожжевой автолизат используют для приготовления основного питательного субстрата в плотных агаровых средах. Хлебные и пивные дрожжи содержат 40-60% азотистых веществ, а также ряд ферментов, способствующих их самоперевариванию. Дрожжевые среды обеспечивают пышный рост, несмотря на низкое содержание общего азота и слабую степень его расщепления. Прессованные пекарские дрожжи нарезают небольшими кусочками и закладывают в бутыли с таким расчетом, чтобы автолизат занимал около 1/5 вместимости бутыли (4 кг дрожжей на 20-литровую бутыль). Бутыль с дрожжами ставят на 2 суток в термостат при температуре около 600С. По мере разжижения дрожжей бутыль встряхивают для равномерного прогревания содержимого (1-2 раза в сутки). Конец автолиза характеризуется полным разжижением дрожжей. Автолизат должен иметь коричневый оттенок и приятный запах. Качество автолизата ухудшается, если процесс протекает при температуре ниже 580С. По окончании автолиза в бутыль добавляют тройное (по исходной массе дрожжей) количество теплой водопроводной воды (на 4 кг дрожжей 16 л воды). Разведенный атолизат помещают в автоклав для стерилизации при 1-1,3 атм (120-1230С) на 30 минут. Оставляют на несколько дней (не менее 5-7 дней) для отстаивания. Пивное сусло-агар (для дрожжей и грибов). Неохмеленное пивное сусло разводят водопроводной водой до содержания сахара 7-8% по Баллингу (измеряют сахарометром) и стерилизуют при 1100С 10 минут. В таком виде сусло может сохраняться длительное время. Перед употреблением надосадочную жидкость осторожно сливают с осадка. В 1 л стерильного сусла добавляют 18 г агара, нагревают до растворения агара и разливают по колбам. Стерилизуют при 1100С 10 минут. Среда Чапека-Докса (для грибов) (г/л): NaNO3 –2,0; KCl – 0,5; KH2PO4 1,0; Fe2(SO4)3 7H2O – 0,01; MgSO47H2O – 0,5; агар-агар – 20,0. Стерилизуют при давлении 1 атм. в течение 1 часа. Затем добавляют в колбы источник углерода (30 г/л) и стерилизуют при давлении 0,5 атм. в течение 20 мин. рН среды 5,2. Среда для культивирования простейших (г/100 мл): глюкоза – 0,5; пептон – 0,2; морская соль – 0,1; дрожжевой экстракт – 0,1 мл. Среда для культивирования актиномицетов: 100 г овсяной муки кипятят на водяной бане в течение часа при 600С, фильтруют, добавляют 3% агар-агара, стерилизуют при 1 атм. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ Стерилизация – один из важных и необходимых приемов в микробиологической технике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского (sterrilis) означает обеспложивание. В микробиологии под стерилизацией понимают гибель всех живых микроорганизмов. В микробиологической практике стерилизуют питательные среды, посуду, инструменты и другие необходимые материалы, чтобы не допускать развития посторонней микрофлоры. Стерилизация питательных сред и посуды – обязательный момент в работе при выполнении всех задач практикума. Существуют различные методы стерилизации: физический, механический и химический. Целесообразность применения каждого из них определяется особенностями материала, подлежащего стерилизации, его физическими свойствами, химическим составом, целью исследования. 1. Физический метод стерилизации (стерилизация нагреванием) наиболее часто применяется в микробиологической практике. Стерилизация прокаливанием на пламени горелки. Этим способом стерилизуют мелкие лабораторные инструменты, препаровальные иглы, бактериологические петли, стеклянные палочки, пинцеты и т.д. (После прокаливания охлажденные предметы нельзя класть на стол; их следует держать так, чтобы они не касались других предметов). Можно стерилизацию мелких инструментов (иглы, шприцы и т.д.) проводить кипячением в стерилизаторах в течение 30 мин. Стерилизация сухим жаром производится в электросушильном шкафу. Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду – пипетки, чашки Петри, пробирки, шпатели и т.д., завернутые в бумажные салфетки. Стерилизация в сушильных шкафах осуществляется при 165-1800С в течение 2 ч. Выше 1800С температуру поднимать не следует, так как ватные пробки и бумага начинают обугливаться. При указанной температуре погибают все вегетативные клетки микроорганизмов и споры. Простерилизованную посуду вынимают из шкафа после того, как она остынет до 50-700С, так как при резком охлаждении может треснуть стекло и нарушиться стерильность материала. Стерилизация автоклавированием применяется, главным образом, для стерилизации питательных сред. Этот способ основан на прогревании насыщенным паром при давлении выше атмосферного, т.е. при температуре выше 1000С и осуществляется в специальных аппаратах – автоклавах. Совместное действие высокой температуры и насыщенного пара обеспечивает надежность стерилизации – гибель вегетативных клеток и спор микроорганизмов. Автоклавы бывают различной конструкции, но основанные на одном принципе действия. Это металлический двустенный котел, способный выдерживать высокое давление. Внутренняя часть котла – стерилизационная камера, в которую помещают стерилизуемый материал, окружена водопаровой камерой, имеющей кран для выхода воздуха и пара. При стерилизации в водопаровую камеру наливают воду (лучше дистиллированную) до необходимого уровня. Внутрь стерилизационной камеры на специальную подставку помещают стерилизуемый материал. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить между ними. Крышка автоклава герметически закрывается (рис.1). Рис. 1. Схема автоклава: 1 – стерилизационная камера; 2 – кран для выхода воздуха; 3 – манометр; 4 – предохранительный клапан; 5 – водопаровая камера; 6 – воронка для заполнения автоклава водой; 7 – отверстия для поступления пара в стерилизационную камеру; 8 – крышка автоклава; 9 – подставка для размещения стерилизуемых материалов Автоклав включается в электрическую сеть. Когда весь воздух будет вытеснен парами воды, пар выпускают еще 15-20 мин. За давлением следят по манометру. Большинство питательных сред, а также водопроводную воду стерилизуют в автоклаве при давлении 150 кПа в течение 20-30 мин; среды, содержащие сахара и витамины при 50 кПа в течение 20-30 мин; молоко, дрожжевой автолизат при 50 кПа в течение 15 мин. Пастеризация – неполная стерилизация производится нагреванием до 500 60 С 15-30 мин или до 70-800С 5-10 мин с последующим охлаждением до 10110С. Применяется для инактивации вегетативных клеток микроорганизмов, бактерий в жидкостях, не выдерживающих высокой температуры: (молоко, пиво, соки и т.п.). Так как при пастеризации споровые формы выживают, то для того чтобы споры не проросли, пастеризованные продукты хранятся на холоду. Тиндализация – дробная пастеризация, которая осуществляется несколько раз (6-7 дней) с промежутками в 24 ч, когда стерилизуемый материал выдерживают при 18-200С для прорастания спор в вегетативные клетки, которые уничтожаются при последующей пастеризации. Стерилизация лучистой энергией. Действие ультрафиолетовых лучей находит широкое использование для стерилизации воздуха в лабораторных помещениях, в цехах промышленных предприятий. Для обеззараживания воздуха используют бактерицидные лампы. Ввиду возможного неблагоприятного действия ультрафиолетовых лучей на организм человека бактерицидные лампы включают только при отсутствии людей в помещении. 2. Химический метод стерилизации применяется при дезинфекции. Дезинфекция – это способ уничтожения микроорганизмов при помощи сильнодействующих химических веществ или так называемых антисептиков. Гибель микроорганизмов при дезинфекции происходит в основном в результате гидролиза компонентов клетки, коагуляции белков, инактивации клеточных ферментов. К группе антисептиков относятся неорганические и органические вещества. Из неорганических антисептиков широко используются неорганические кислоты, щелочи и соли (0,1-0,2% растворы сулемы), хлорная известь 10-20%, йод, перекись водорода (5%); из органических веществ – этиловый и бутиловый спирты, альдегиды, органические кислоты и растворители (3-5% раствор фенола, 3% раствор хлорамина и 1-5% раствор формалина). В лабораторной практике химический метод дезинфекции применяют для обезвреживания рабочего стола, рук, камер для посевов. 3. Механический метод стерилизации применяется в тех случаях, когда субстраты не выдерживают нагревания и воздействия химических веществ (белки, сыворотки, антибиотики, витамины, летучие вещества и др.). Стерилизацию с помощью мембранных фильтров, изготовленных из коллодия, ацетата целлюлозы и др. материалов. Они представляют собой диски толщиной около 0,1 мм, диаметром 35 мм. В зависимости от размеров пор они обозначаются №№ 1, 2, 3, 4 и 5. Для стерилизации следует использовать фильтр № 1 (средний диаметр пор – 0,35 мкм). Стерилизация с помощью фильтра Зейтца. Фильтры Зейтца представляют плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой. Фильтр закрепляется в специальном держателе, который вставляется с помощью резиновой пробки в приемник фильтрата – колбу Бунзена. Фильтр Зейтца автоклавируют в собранном виде. Перед стерилизацией фильтр с держателем, резиновой пробкой и колбой-приемником заворачивают в бумагу. В отводную трубку, которая будет присоединена к вакуумному насосу, вставляют ватный тампон. ПОДГОТОВКА ПОСУДЫ И СРЕД К СТЕРИЛИЗАЦИИ Посуду перед стерилизацией тщательно моют, сушат и завертывают в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. Каждую пипетку заворачивают отдельно в длинные полоски бумаги, шириной 4-5 см. В концы пипеток, которые берут в рот, предварительно вставляют ватные тампоны. Обмотку начинают с противоположного конца постепенным движением бумаги по спирали и оканчивают у конца с тампоном. Бумага должна плотно охватывать пипетку. Завернутые пипетки, для предохранения бумаги от загрязнения и разрывов, заворачивают по несколько штук вместе или помещают в специальные металлические или картонные пеналы. Шпатели обертывают по отдельности аналогично пипеткам, используя для обмотки полоски бумаги большей ширины. Чашки Петри завертывают вместе по 2-4 штуки. Колбы, пробирки и др. сосуды закрывают ватно-марлевыми пробками, а сверху бумажными колпачками. Материалы, оборудование, реактивы: автоклав, сушильный шкаф, бактерицидная лампа, чашки Петри, колбы на 500 мл, бактериологическая петля, шпатель, пипетки, пробирки, вата, марля, среды: Чапека-Докса, МПА, сусло-агар. ЗАДАНИЕ К РАБОТЕ 1. Познакомиться с устройствами, используемыми для стерилизации посуды, сред, воздуха и т.д. (автоклав, сушильный шкаф, фильтры, бактерицидные лампы). 2. Подготовить для стерилизации чашки Петри, пипетки, шпатели, эрленмейеровские колбы. Колбы закрыть ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками. 3. Подготовить для стерилизации колбы с жидкой и твердой питательными средами, закрыть их ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками. 4. Подготовить для стерилизации пробирки с водопроводной водой (10 мл), закрыть их ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками. Лабораторная работа № 2 ТЕХНИКА ПОСЕВА И ПЕРЕСЕВА КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ Цель работы: приобретение навыков культивирования микроорганизмов методом посева-пересева на питательные среды. Для изучения свойств микробов необходимо получить чистую культуру микроорганизмов. Чистая культура – это потомство одной микробной клетки (без примесей других), выросшее на питательной среде. Выделение чистой культуры микроба является основой бактериологической работы, так как чаще всего исследуемый материал содержит смесь различных видов микробов. В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на твердых и жидких питательных средах в пробирках, колбах или чашках Петри. Посевом в микробиологии называют внесение клеток микроорганизмов (посевного материала - инокулята) в стерильные среды. Пересев – это перенос выращенной на питательной среде культуры микроорганизмов на другую свежую питательную среду. Посев (и пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении определенных правил стерильности, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов. 1. Пересев микроорганизмов, выращенных на твердой среде в пробирках, в другие пробирки со средой (рис. 1). - На пробирке со свежей питательной средой подписывают название микроорганизма и дату посева. - Зажигают спиртовку. Посевы проводят над пламенем горелки, чтобы теплый воздух препятствовал осаждению микроорганизмов из окружающего воздуха и отчасти их уничтожал. - Берут в правую руку бактериологическую петлю, с помощью которой осуществляют посев (петлю держат как карандаш). - Стерилизуют бактериологическую петлю в верхнем пламени горелки, прокаливая проволоку докрасна, и одновременно обжигают - - - примыкающую к петле часть держателя, который будет вводиться в пробирку с культурой микроорганизмов. При прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся проволока была раскалена докрасна. Берут в левую руку две пробирки – одну со стерильной средой (дальше от себя), другую – с культурой микроорганизмов (ближе к себе). Не выпуская бактериологической петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают наружные концы ватных пробок к ладони и вынимают пробки из пробирок. Класть пробки на стол нельзя. Слегка обжигают в пламени горелки края открытых пробирок. Вводят в пробирку с культурой микроорганизмов петлю. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого отбирают небольшое количество микробной массы. Вынимают петлю и вводят ее в пробирку со стерильной питательной средой, избегая прикосновения со стенками пробирки. Проводят петлей от дна вверх зигзагообразную или прямую чертуштрих, слегка касаясь поверхности агара. Обжигают ватные пробки и края пробирок одновременно в пламени и закрывают обе пробирки. Обжигают петлю в пламени докрасна. Рис.1. Пересев из одной пробирки в другую 2. Пересев культур микроорганизмов, выращенных в жидкой среде. - Из стерильной бумаги вынимают градуированную стерильную пипетку за верхний конец, берут пипетку средним и большим пальцами правой руки, не касаясь поверхности той части пипетки, которая будет вводиться в сосуд с жидкой средой. - Берут в левую руку пробирку (или колбу) с культурой микроорганизмов, выращенной в жидкой среде, и держат ее в вертикальном положении, чтобы не замочить пробку. - Открывают пробку, соблюдая все правила стерильности, описанные выше, и вводят пипетку в пробирку. - Набирают в пипетку суспензию микроорганизмов, закрывают пробкой пробирку (или колбу), вносят определенное количество суспензии в свежую стерильную питательную среду, соблюдая уже описанные правила предосторожности. - Пипетку помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором (3% водным раствором хлорамина или 3-5% водным раствором фенола), не касаясь ею окружающих предметов. 3. Посев на плотные среды в чашки Петри. Посев в чашки Петри проводится несколькими способами. Поверхностный способ посева: - Стерильную твердую питательную среду расплавляют на водяной бане в пробирке или колбе и охлаждают до 500С. - Вынимают чашки Петри из бумаги, в которой они стерилизовались, и ставят их на ровную горизонтальную поверхность. - Берут пробирку или колбу с охлажденной до 500С питательной средой, вынимают ватную пробку, обжигают на пламени горелки края колбы (пробирки) и держат ее в наклонном положении. - Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой, а правой рукой наливают среду на дно чашки Петри, заполняя всю ее поверхность (рис. 2). - Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды, затем ставят в термостат на 15-20 минут для подсушивания. - На твердую среду наносят петлей или пипеткой каплю посевного материала и затем равномерно распределяют его на поверхности, пользуясь стерильным шпателем (изогнутая стеклянная палочка) (рис. 3). - Шпатель вынимают из бумаги и берут в правую руку. - Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой и вносят в нее шпатель. - Размазывают каплю посевного материала шпателем вращательными движениями по поверхности агаровой пластинки (надавливать шпателем на твердую среду не следует, т. к. можно ее повредить). - Переносят шпатель в сосуд с дезинфицирующим раствором. Рис. 2. Розлив агара в чашки Петри Рис. 3. Посев на агар в чашки Петри Глубинный способ посева: - Приоткрывают стерильную чашку Петри и помещают петлей или пипеткой каплю посевного материала на дно чашки. - Расплавляют агаризованную питательную среду в пробирке или колбе и охлаждают ее до 45-480С. - Обжигают края пробирки или колбы в пламени горелки и выливают среду в чашку Петри с внесенным посевным материалом, соблюдая правила стерильной работы. - Распределяют равномерно посевной материал в питательной среде, для чего осторожно круговыми движениями перемещают чашку Петри по поверхности стола. - Оставляют чашку Петри до полного застывания среды. Делают надпись (число, название микроорганизма). - Все посевы, выполненные описанными способами, помещают в термостат для выращивания микроорганизмов при температуре, благоприятной для их роста. Материалы, оборудование, реактивы: термостат, плитка для разогрева питательной среды, спиртовка, чашки Петри, колбы на 500 мл, бактериологическая петля, шпатель, пипетки, пробирки, среды: Чапека-Докса, МПА, сусло-агар; различные штаммы микроорганизмов (грибов, дрожжей, бактерий); дезинфицирующий раствор (3% р-р хлорамина или 3-5% р-р фенола); 96%-ный этанол. ЗАДАНИЕ К РАБОТЕ 1. Подготовить скошенный агар (косяки) и чашки Петри с мясопептонным агаром (МПА), средой Чапека-Докса и сусло-агаром для культивирования микроорганизмов. 2. Провести посев культур микроорганизмов (бактерий, дрожжей и грибов) из пробирки в пробирку с помощью бактериологической петли. 3. Провести пересев культур бактерий и дрожжей, выращенных на жидких питательных средах, в стерильные питательные среды. 4. Провести посев культуры микроорганизмов (дрожжей и грибов) поверхностным способом в чашки Петри с сусло-агаром. 5. Провести посев бактериальных культур в чашках Петри с МПА глубинным способом. Лабораторная работа № 3 МИКРОСКОПИЯ В СВЕТЛОМ ПОЛЕ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЖИВЫХ КЛЕТОК Цель работы: изучение устройства микроскопа для микробиологических и морфологических исследований, приобретение навыков работы с микроскопом, изучение методов микроскопии и методов приготовления живых препаратов. УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА На практике широко распространены отечественные биологические микроскопы МБУ (упрощенный), серии «Биолам»: Р-11 – Р-17(рабочие), С-11 – С-13 (студенческие), Д-11 – Д-13 (дорожные) и микроскопы для морфологических исследований серии «МИКМЕД-1», «Laboval-2». Микроскопы биологические и серии «МИКМЕД-1», «Laboval-2» предназначены для наблюдения и морфологических исследований прозрачных препаратов (мельчайших частиц-объектов) в проходящем свете по методу светлого поля при учебных и лабораторных работах по микробиологии: пищевых продуктов, молока, мяса, яиц, различных областей медицины, зоологии и других наук при температуре воздуха от 10 до 350С. Дорожные микроскопы предназначены для эксплуатации, в том числе и на открытом воздухе, при температуре от 10 до 400С. Работать с иммерсионным объективом следует только в помещении и при температуре от 15 до 250С. Микроскопы обладают увеличением значительно большим, чем дает лупа и, соответственно, большей разрешающей способностью, что обеспечивается оптической системой с двумя ступенями увеличения (рис.1): первая осуществляется объективом 2, вторая – окуляром 3. Объектив 2 и окуляр 3 здесь условно показаны в виде одиночных линз, тогда как на самом деле они представляют собой более или менее сложные системы. Препарат 1 находится перед объективом на расстоянии несколько большем фокусного расстояния объектива. Объектив образует действительное увеличение и перевернутое изображение 1’ препарата в плоскости, лежащей вблизи переднего фокуса окуляра 3 на расстоянии немного меньше фокусного расстояния. Окуляр работает подобно лупе (промежуточное изображение 1’ является для него предметом) и образует вторично увеличенное мнимое и прямое изображение 1”, которое, как условно принято считать, расположено от глаза наблюдателя 4 на расстоянии наилучшего видения D=250 мм (или больше в зависимости от особенностей глаза и его аккомодации). В результате микроскоп дает возможность рассматривать изображение препарата под большим углом, чем в случае невооруженного глаза, но это изображение – перевернутое относительно препарата. Рис. 1. Принципиальная схема микроскопа (оптическая) Микроскоп «Laboval-2» показан на рис. 2. В микроскопе различают механическую, оптическую и осветительную части. Механическая часть включает штатив, предметный столик, тубус и систему винтов для передвижения элементов микроскопа. Штатив 1 состоит из основания и неподвижно привинченного тубусодержателя. В верхней части штатива расположены тубус 2, куда вставляется окуляр 3, и револьверное устройство 4, состоящее из двух пластин. Нижняя пластина вращается и имеет гнезда для объективов 5, верхняя закреплена неподвижно. Предметный столик 6 передвигается в вертикальном направлении с помощью макро- и микровинта 7. Следует отметить, что пользоваться этим винтом надо очень осторожно, поскольку в микроскопе «Laboval-2» макро- и микрофокусировки совмещены. На предметном столике имеется объектоводитель для предметного стекла 8. Рядом с макро-микровинтом расположен винт конденсора 9, обеспечивающий его расположение на нужной высоте. В микроскопе «Laboval-2» имеются объективы, дающие увеличение в 3,2, 10 и 40 раз, предназначенные для работы с сухими системами, и объектив с черной полоской для иммерсионной системы, дающей увеличение в 100 раз. При работе с иммерсионным объективом, после установки света, при малом увеличении выбирают участок на препарате, на выбранное место наносят каплю кедрового масла и осторожно погружают в нее фронтальную – линзу объектива 100х. По окончании работы остатки масла с этой линзы удаляют, тщательно протирая ее мягкой тканью. Осветительный аппарат находится под предметным столиком, яркость которого можно регулировать при помощи реостата 10, расположенного на задней панели, там же расположен тумблер включения микроскопа в сеть. Конденсор Аббе 11 состоит из двух линз, заключенных в металлическую оправу и предназначенных для собирания лучей света, идущих от зеркала. Апертуру конденсора можно регулировать, открывая и закрывая диафрагму конденсора при помощи рычажка 12. Отражающее зеркало можно увидеть в окошко 13. Количество лучей, попадающее в зеркало, можно регулировать при помощи диафрагмы светового поля. Рычажок диафрагмы обозначен позицией 14. Рис. 2. Микроскоп «Laboval-2» Подавляющая часть объектов исследований не обладает самосвечением, поэтому их необходимо освещать посторонним источником света. При микроскопировании прозрачных объектов применяется проходящий свет, для непрозрачных объектов – отраженный. В микроскопических исследованиях используют освещение по методу светлого и темного поля. При освещении объекта по методу светлого поля лучи из осветительной системы, пройдя через прозрачный предмет (проходящий свет) или отразившись от поверхности непрозрачного предмета (отраженный свет), поступают в объектив и создают изображение менее прозрачных участков объекта в виде темных участков на светлом фоне среды. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ Наилучшие результаты при работе с микроскопом могут быть получены лишь при условии правильного освещения объекта. Настройка освещения включает следующие основные приемы: а) получение резкого изображения источника света (спирали лампы на диафрагме конденсора); б) получение резкого изображения ирисовой диафрагмы осветителя в плоскости препарата. При работе с естественным светом установить микроскоп так, чтобы зеркало было обращено к окну и направляло в микроскоп свет от яркого участка неба или, что предпочтительнее, от светлого облака. Следует избегать попадания прямых солнечных лучей в микроскоп ввиду создания излишне яркого, ослепляющего освещения. Яркий боковой свет также мешает наблюдениям, особенно если используются сильные окуляры. Яркое и равномерное освещение поля микроскопа достигается наклоном зеркала. На пути пучка лучей не должны встречаться посторонние экранирующие предметы (например, оконные переплеты), иначе они будут видны в выходном зрачке объектива. При вынутом окуляре убедиться, что зеркало находится в центральном положении, проверить равномерность освещения задней линзы объектива – освещающий линзу кружок должен быть расположен по центру. Зеркало должно быть повернуто к свету плоской стороной. Фокусировку микроскопа производят следующим образом. Исследование объекта начинают с объектива малого увеличения. Это позволяет видеть на препарате при том же окуляре больший участок и выбрать интересующее место для детального наблюдения. Так, при работе с объективом 8х, механизмом грубой фокусировки опустить тубус на расстояние приблизительно 6-7 мм от покровного стекла до объектива. При работе с объективом 90х это расстояние должно быть равно 1 мм. Затем этим же механизмом медленно поднять тубус микроскопа до момента, когда в поле зрения появится искомая поверхность наблюдаемого объекта. Точную фокусировку произвести микрометрическим механизмом. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЖИВЫХ КЛЕТОК В зависимости от объекта и цели исследования живые клетки микроорганизмов наблюдают на препаратах «раздавленная капля» или «висячая капля». Препарат «раздавленная капля» готовится на обезжиренном спиртом, ацетоном предметном стекле, на которое наносят маленькую каплю водопроводной воды. С соблюдением правил асептики в воду вносят небольшое количество культуры микроорганизмов, размешивают и покрывают покровным стеклом. Не следует вносить много культуры, препарат будет густым и мало пригодным для наблюдения; нельзя допускать образования пузырьков воздуха под покровным стеклом, при избытке жидкости, выступающей из-под покровного стекла, ее удаляют фильтровальной бумагой. Микроскопирование проводят с сухой системой. Этот вид препарата позволяет установить форму клеток, их размер, способ спорообразования. Наносят каплю микробной суспензии стерильной пипеткой, реже бактериологической петлей. Для этого пипетку вынимают за верхний конец из бумаги, в которой она стерилизовалась, и берут средним и большим пальцами правой руки (рис. 3, а). В левую руку берут пробирку (колбу) с жидкой средой, открывают пробку, края открытой пробирки обжигают в пламени горелки (рис. 3, б), и вводят пипетку в сосуд (рис. 3, в). Отобрав часть среды, закрывают сосуд пробкой и используют взятую пробу для приготовления препарата или посева в свежую питательную среду (рис. 3, г). После этого пипетку помещают в дезинфицирующий раствор (3% раствор хлорамина или 3-5% водный раствор фенола), не касаясь ею окружающих предметов. При исследовании бактерий и дрожжей, выращенных на плотной среде, небольшая масса их берется бактериологической петлей или иглой. Бактериологическую петлю или иглу перед взятием клеток микроорганизмов стерилизуют. Для этого проволоку прокаливают докрасна в пламени горелки и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, которая будет вводиться внутрь сосуда, содержащего микроорганизмы. При прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся проволока была равномерно раскалена. Сразу же после стерилизации петлю (иглу) вводят в сосуд с микроорганизмами. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю (иглу) вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности сосуда или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого захватывают небольшое количество микробной массы. а в б г Рис. 3. Способ стерильного извлечения микроорганизмов из жидкой среды Отбор клеток микроорганизмов, выращенных на плотной среде в пробирке, осуществляется следующим образом. Пробирку с культурой берут в левую руку так, чтобы поверхность питательной среды с налетом выросших микроорганизмов была обращена кверху и хорошо видна. Пробирку держат в горизонтальном или несколько наклонном положении. В правую руку берут петлю и держат ее как карандаш, прокаливают в пламени горелки. Затем, не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцами правой руки прижимают наружный конец ватной пробки к ладони и вынимают пробку из пробирки. Края открытой пробирки слегка обжигают в пламени горелки, вводят в пробирку стерильную петлю и, отобрав небольшое количество микробной массы, вынимают петлю из пробирки. Горлышко пробирки снова обжигают в пламени горелки, затем обжигают внутренний конец ватной пробки и закрывают ею пробирку, которую ставят в штатив. Клетки микроорганизмов, оставшиеся на петле после приготовления препарата, сжигают в пламени горелки, только после этого петлю ставят на место (рис. 3). При исследовании грибов из их культур берется небольшой кусочек мицелия с помощью препаровальной иглы, переносится в каплю водопроводной воды или смеси спирта и глицерина. Мицелий на предметном стекле осторожно расщепляют иглами, стараясь как можно лучше разъединить гифы. Препарат «висячая капля» используют для выявления подвижности у микроорганизмов, изучения способов размножения, наблюдения за прорастанием спор и отношения клеток к химическим раздражителям. Для приготовления препарата «висячая капля» на покровное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизмов, переворачивают его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Если предстоят многодневные наблюдения, то края лунки смазывают вазелином и капля оказывается герметически заключенной во влажной камере. Препарат «отпечаток» используют для изучения естественного расположения клеток в колонии микроорганизмов и чаще всего для исследования спор, конидий и конидиеносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов. К поверхности агаризованной среды, на которой исследуемые микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом. Материалы, оборудование, реактивы: микроскоп, спиртовка, бактериологическая петля, пипетки, штаммы микроорганизмов (грибов, дрожжей, бактерий); дезинфицирующий раствор (3% р-р хлорамина или 3-5% р-р фенола); 96%-ный этанол, предметные стекла, покровные стекла. ЗАДАНИЕ К РАБОТЕ 1. Ознакомиться с устройством различных микроскопов. 2. Приготовить препараты «раздавленная капля» дрожжей, грибов, бактерий. Промикроскопировать с объективами 40х и 100х, зарисовать. 3. Приготовить препарат «висячая капля» культуры бактерий. Промикроскопировать, зарисовать. Лабораторная работа № 4 ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ПРИЗНАКОВ МИКРООРГАНИЗМОВ Цель работы: изучение морфологических и культуральных признаков микроорганизмов, изучение методов приготовления препаратов фиксированных клеток и методов их микроскопии. К культуральным признакам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. Рост на плотных питательных средах. На поверхности плотных питательных сред материал нужно посеять таким образом, чтобы можно было наблюдать отдельные изолированные колонии. Колонией называют скопление клеток одного вида, выросшее в большинстве случаев из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на дне сосуда), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием и являются наиболее существенной особенностью роста микроорганизмов на плотном субстрате. При их описании учитывают следующие признаки: - форму колонии – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т.д.; - размер (диаметр) колонии измеряют в мм; если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называют точечными; - поверхность колонии – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная; - профиль колонии – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т.д.; - блеск и прозрачность – блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная; - цвет колонии – бесцветная (грязно-белые колонии относятся к бесцветным) или пигментированная – белая, желтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, черная. Особо выделяют секрецию пигмента в субстрат. При описании колоний актиномицетов отмечают пигментацию воздушного и субстратного мицелия, а также выделение пигментов в среду; - край колонии – ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.; - структура колонии – однородная, мелко или крупнозернистая, струйчатая и т.д. Край и структуру колонии определяют с помощью лупы или при малом увеличении микроскопа. Для этого чашку помещают на столик микроскопа крышкой вниз; консистенция колонии – определяют, прикасаясь к ее поверхности петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей, пленчатой (снимается целиком), хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей). Микроорганизмы, образующие споры, за исключением Bac. mycoides имеют неправильную форму с изрезанным краем и шероховатой поверхностью. Bac. mycoides дают ризоидные колонии. Колонии микобактерий напоминают форму розочек. Для миксобактерий характерно образование вегетативных колоний, называемых швармом (роем) или псевдоплазмодием, имеющих своеобразный вид из-за образования слизи и скользящего движения клеток. Нередко агар под колонией эрозирован, иногда насквозь. Для миксобактерий также характерно образование плодовых тел, состоящих из слизи и клеток, часто бывают ярко окрашены и имеют макроскопические размеры. Точечные размеры характерны для колоний зеленящего стрептококка, гемофилов, нейсерий. Как правило, круглая форма колоний сочетается с гладкой поверхностью разной степени выпуклости над поверхностью среды, а бактерии в Р-форме и бациллы имеют неправильную форму с шероховатой, бороздчатой, складчатой поверхностью. Профиль колонии нередко является одним из дифференциальных признаков, так, например, для паратифа В таким признаком является образование валика по краю колонии, что придает ей кратерообразный профиль. Консистенция колоний, как и блеск, и пигмент, может быть одним из дифференциальных признаков при идентификации бактерий. Так для Azotobacter chroococcum характерна слизистая консистенция, для сарцин – маслянистая, для бацилл – пленчатая, актиномицетов – плотная и врастающая в агар. Глубинные колонии, напротив, довольно однообразны. Чаще всего они по виду похожи на более или менее сплющенные чечевички, в проекции имеющие форму овалов с заостренными концами. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если развивающиеся микроорганизмы выделяют углекислоту или другие газы. Донные колонии самых разнообразных микроорганизмов имеют вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну. Размеры и некоторые другие особенности колоний изменяются с возрастом и зависят от состава среды, поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды и температуру культивирования. Рост на жидких питательных средах. Рост микроорганизмов в жидких средах более однообразен и сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Характеризуя рост в жидкой среде, отмечают степень помутнения – слабая, умеренная или сильная; особенности пленки – тонкая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая, а при образовании осадка указывают – скудный он или обильный, плотный, рыхлый, слизистый или хлопьевидный. Нередко рост микроорганизмов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Для описания характера роста в жидких средах микроорганизмы выращивают на МПБ или на другой среде, обеспечивающей хороший рост. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ Форму и соединение клеток определяют при микроскопировании препаратов живых или окрашенных клеток; первые просматривают с фазовоконтрастным устройством, вторые с иммерсионной системой. Поскольку форма клеток некоторых микроорганизмов, например, микобактерий, изменяется по ходу работы, необходимо наряду с микроскопированием суточной культуры просматривать клетки 10-12 часовых и 3-5 – суточных культур. Размеры клетки определяют под микроскопом с помощью окулярной линейки (микрометра) или окулярного винтового микрометра. У кокков измеряют диаметр, у других форм – длину и ширину клетки. Результаты измерений выражают в микрометрах (мкм). Для измерения лучше использовать живые, нефиксированные клетки, т.к. фиксация и окраска могут несколько изменить их размеры. Если клетки подвижны, препарат слегка подогревают или к капле исследуемой суспензии добавляют каплю 0,1%-ного водного раствора агар-агара. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФИКСИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ В процессе приготовления фиксированного препарата микроорганизмов можно выделить три этапа: 1) приготовление мазка, 2) фиксация, 3) окраска препарата. Приготовление мазка. Пробирку с чистой культурой берут в левую руку таким образом, чтобы была хорошо видна поверхность питательной среды с выросшей на ней культурой. В правую руку берут бактериологическую петлю так, как держат карандаш, и прокаливают ее в пламени горелки докрасна (рис. 1, а). Затем, не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают ватную пробку к ладони и держат так во время последующих манипуляций (рис. 1, б). Края открытой пробирки обжигают в пламени горелки, вводят в нее остуженную петлю и берут небольшое количество микробной массы (рис. 1, в). Горлышко пробирки снова обжигают, слегка обжигают пробку и закрывают ею пробирку, а микробную массу переносят в каплю воды на обезжиренном предметном стекле (рис. 1, г). Не следует вносить много культуры, капля должна стать слегка мутной. Остаток микробной массы на петле сразу же сжигают в пламени горелки (рис. 1, д). Из капли с внесенной культурой готовят мазок, равномерно размазывая ее петлей или краем покровного стекла на площади 2-4 см2. Мазок просушивают на воздухе или, слегка нагревая в струе теплого воздуха, высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Нельзя перегревать мазок: клетки микроорганизмов могут деформироваться! Хороший мазок после сушки должен давать на предметном стекле еле заметный налет. Фиксация препарата. После высушивания приступают к фиксации препарата. Фиксация имеет целью: 1) убить микроорганизмы, 2) обеспечить их лучшее прилипание к стеклу и, тем самым, предохранить препарат от смывания, 3) сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки лучше красятся, чем живые. а б д в г Рис. 1. Способ стерильного извлечения микроорганизмов из плотной среды Для фиксации чаще всего используется высокая температура. С этой целью захватывают предметное стекло мазком вверх пинцетом и 3 раза проводят через верхнее пламя горелки. Перед окраской препарат охлаждают (!). Для исследования тонкого строения клетки применяют фиксацию различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наносят на мазок, или препарат погружают в фиксатор. При фиксации этиловым спиртом время фиксации 15-20 минут, метиловым спиртом – 3-5 минут, ацетоном – 5 минут. По окончании фиксации препарат осторожно промывают водопроводной водой. Окраска препарата. Существуют позитивный и негативный способы окраски. При позитивном способе окраски окрашиваются клетки микроорганизмов. При негативном контрастировании краситель заполняет пространство, окружающее клетки, в результате чего микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно окрашенном поле. Для простого позитивного окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются анилиновыми красителями: фуксином, генцианвиолетом, метиленовым синим. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, лежащие на стенках кюветы, и наносят на стекло из пипетки раствор выбранного красителя. Сроки окрашивания указанными красителями колеблются от 1 до 3 минут. В этот период краситель должен покрывать весь мазок. Затем его смывают легкой струей воды. При этом со стекла смоется только лишний краситель, не адсорбированный микроорганизмами. Потом препарат высушивают, осторожно промокая его фильтровальной бумагой. Для негативного окрашивания чаще всего пользуются жидкой тушью или конго красным. Окрашивание негативными красителями можно вести двумя путями: либо раствор наносят на сухой мазок, дают ему высохнуть и сухой препарат рассматривают с иммерсией, либо каплю исследуемой суспензии бактерий смешивают с красителем непосредственно на предметном стекле, покрывают ее покровным стеклом и изучают с сухой системой. Окраска клеток по Граму. Метод дифференциального окрашивания, имеющий большое практическое значение для идентификации бактерий, был эмпирически разработан в 1884г. датским врачем Кристианом Грамом и получил название окраски по Граму. При окраске по Граму все бактерии делятся на две группы: грамположительные (Гр+) и грамотрицательные (Гр–). У грамположительных бактерий толщина клеточной стенки составляет 1580 нм, состоит из пептидогликана (от 60-90%), расположенных в несколько слоев белка (около 1%) и липидов (около 1%). Обнаружены полимеры особого типа – тейхоевые кислоты, ковалентно связанные с пептидогликаном. Большое содержание пептидогликана обеспечивает при окраске по Граму образование комплекса с генциановым фиолетовым и йодом, устойчивого к спирту, вследствие чего они окрашены в сине-фиолетовый цвет. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий 10-15 нм, но структура ее значительно сложнее, чем у грамположительных бактерий. Основу ее составляют ориентированные внутренние липиды (10-20%), которые с поверхностно расположенными полисахаридами образуют липополисахаридный слой. На поверхности клеточной стенки мозаично расположены белки и полисахариды. Пептидогликан представлен одним слоем толщиной всего 2-3 нм (около 5-10%), лежит под липополисахаридным слоем и плотно покрывает протопласт. Из-за большого содержания липидов клеточная стенка грамотрицательных бактерий при окраске по Граму образует с генцианвиолетом и йодом комплекс, разрушаемый при обработке спиртом, вследствие чего клетки обесцвечиваются. Неодинаковое отношение микроорганизмов к окраске по Граму связано с различиями в структуре и химическом составе клеточной стенки бактерий. К грамположительным микрорганизмам относятся кокки, бациллы (спорообразующие палочки), актиномицеты, микобактерии, клостридиальные бактерии, дрожжи. К грамотрицательным микроорганизмам относятся: бактерии (неспорообразующие палочки), спириллы, сальмонеллы, E. coli, псевдомонады, азотобактер, вибрионы. Имеются грамвариабельные микроорганизмы, отношение которых к окраске по Граму меняются на определенных этапах их жизненного цикла. Так как способность клеток окрашиваться по Граму зависит от их возраста, для окраски по Граму используют клетки молодой культуры, чаще всего односуточной. Для сравнения одновременно с определяемым объектом целесообразно окрашивать клетки микроорганизмов, отношение которых к окраске по Граму известно (контроль). Окраску по Граму осуществляют следующим образом: 1. Готовят на предметном стекле три мазка культуры микроорганизмов: в центре – мазок исследуемой культуры, слева и справа – мазки контрольных микроорганизмов. Мазки должны быть тонкими, чтобы клетки были равномерно распределены по поверхности стекла и не образовывали скоплений, так как от толщины мазка могут зависеть результаты окрашивания. Высушивают мазки на воздухе, фиксируют над пламенем горелки. 2. Окрашивают мазки карболовым генциановым фиолетовым. На мазки наносят достаточное количество красителя, выдерживают 1-2 минуты, краситель сливают и, не смывая водой, мазки обрабатывают раствором Люголя до почернения (приблизительно 1-2 минуты). 3. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат 0,5-1 мин (строго!) 96% этиловым спиртом или путем погружения в стаканчик со спиртом, или путем нанесения спирта на мазки (от времени обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработке все бактерии сохраняют окрашивание, при чрезмерной - обесцвечиваются). 4. Препарат немедленно промывают водой и окрашивают его 1-2 минуты водным фуксином. Сливают краситель, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. 5. Микроскопируют препарат с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный или розовый цвет фуксина (цвет дополнительного красителя). Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов (по Крегенсену) Метод основан на разрушении клеток грамотрицательных бактерий в щелочной среде и определении свободной ДНК. На предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора КОН, в которую вносят бактериальной петлей исследуемые бактерии (24-часовая культура со скошенного агара) и хорошо перемешивают петлей. Через 5-10 с при передвижении петли по стеклу при положительной реакции в результате тестирования грамотрицательных бактерий образуется слизистый след длиной 1-2 см. Если слизь не образуется, то реакция отрицательная, тогда тестируется грамположительная культура. Окраска спор по методу Циля: При неблагоприятных условиях для роста, при лимитировании роста питательными веществами некоторые бактерии образуют покоящиеся клетки особого рода – споры (эндоспоры). К образованию эндоспор способна только небольшая группа бактерий, это в основном палочковидные грамположительные бактерии (р. Bacillus, p. Clostridium, p. Desulfotomaculum). Споры не являются обязательной стадией жизненного цикла этих бактерий. Спорообразование (споруляция) – один из сложнейших процессов дифференцировки бактериальной клетки и сопровождается сложными метаболическими процессами. При автолизе материнской клетки споры освобождаются. Зрелые споры не проявляют никакой метаболической активности, но в течение многих лет сохраняют потенциальную способность к прорастанию и развитию в вегетативные клетки. Они чрезвычайно устойчивы к воздействию высокой температуры, что обусловлено низким содержанием воды (около 15%), а также к разного рода излучений и химических веществ, что, с одной стороны, определяет их повсеместное распространение в различных природных средах, а с другой стороны, затрудняет борьбу со спорообразующими патогенными бактериями. При микроскопическом исследовании споры видны благодаря своему высокому показателю преломления, характерному для обезвоженного белка, поэтому их легко отличить от вегетативных клеток при просмотре в микроскоп. При светопольной микроскопии споры выявляются в виде темных включений. При наблюдении с фазово-контрастным устройством споры имеют вид светлых включений на фоне темных клеток. Более надежный способ обнаружения спор заключается в дифференциальной окраске клеток и спор, основанной на их различной способности окрашиваться красителем и удерживать его при обработке водой или кислотой. Окраску спор по методу Циля осуществляют следующим способом: 1. Подготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, обрабатывают 5%-ным раствором хромовой кислоты в течение 5-10 минут и промывают водой. 2. Окрашивают карболовым фуксином Циля при одновременном осторожном нагревании в течение 2-3 минут. Для этого предметное стекло с одного конца берут пинцетом и нагревают над пламенем горелки до появления паров (но не до кипения). По мере испарения красителя необходимо доливать его по каплям, не допуская подсыхания. Промывают препарат водой. Микробные клетки остаются окрашенными в красный цвет. 3. Обесцвечивают препарат 1%-ным раствором серной кислоты в течение 10-15 с, немедленно промывают препарат водой (споры остаются окрашенными в красный цвет, а микробные клетки обесцвечиваются). 4. Дополнительно окрашивают препарат метиленовым синим около 20 минут. Промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. При правильном окрашивании микробные клетки должны быть синими, споры красными, фон – бесцветный. Выявление живых и мертвых клеток дрожжей и грибов Метод выявления живых и мертвых клеток дрожжей и грибов основан на различной проницаемости красителя в клетки, характеризующиеся различным физиологическим состоянием. Выявление живых и мертвых клеток грибов проводят на витальных (прижизненных) препаратах с помощью метиленового синего. Для этого на предметное стекло в каплю микробной суспензии вносят каплю красителя метиленового синего, выдерживают не более одной минуты, накрывают покровным стеклом, оттягивают избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют в проходящем свете. Живые клетки, не пропускающие краситель, не окрашены, мертвые клетки синего цвета. Материалы, оборудование, реактивы: микроскоп, иммерсионное масло, спиртовка, чашки Петри, пробирки, бактериологическая петля, пипетки, пинцет, штаммы микроорганизмов (грибов, дрожжей, бактерий); дезинфицирующий раствор (3% р-р хлорамина или 3-5% р-р фенола); 96%-ный этанол, предметные стекла, покровные стекла, карболовый генцианвиолет, р-р Люголя, водный фуксин, карболовый фуксин Циля, метиленовый синий, 5% р-р хромовой кислоты, 1% р-р серной кислоты. ЗАДАНИЕ К РАБОТЕ 1. Провести окраску по Граму бактерий Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus lactis, Proteus vulgaris (по указанию преподавателя), используя в качестве контроля грамотрицательные бактерии Escherichia coli и грамположительные бактерии Sarcina flava. 2. Провести окраску спор различных бактерий, аскоспор дрожжей по методу Циля. Промикроскопировать. Объектив 100х. Зарисовать. 3. Провести выявление живых и мертвых клеток пятисуточной культуры дрожжей с помощью метиленового синего. Промикроскопировать. Объектив 40х. Зарисовать. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Асонов Н.Р. Микробиология. – М.: Колос, 2001. – 352с. 2. Шлегель Г. Общая микробиология. – М.: Мир, 1987. – 567с. 3. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б., Гусарова Н.А. Лабораторный практикум по общей микробиологии. - М.: ДеЛи принт, 2001. – 131с. 4. Сидоров М.А., Нецепляев С.В., Корнелаева Р.П. Лабораторный практикум по микробиологии мяса и мясопродуктов. – М.: Колос, 1997. – 352с. 5. Степаненко П.П. Микробиология мяса и молочных продуктов. – М.: Колос, 1996. – 271с. 6. Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова. – М.: МГУ, 1976. – 307 с.
