На правах рукописи ЛУКЬЯНОВ Александр Андреевич
advertisement
На правах рукописи УДК 621.371 ЛУКЬЯНОВ Александр Андреевич ВЛИЯНИЕ СВЧ- И КВЧ-ИЗЛУЧЕНИЯ НА ГЕТЕРОТРОФНЫХ И ФОТОТРОФНЫХ ПАРТНЕРОВ СМЕШАННЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ 03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Тамбиев Александр Хапачевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук Степанов Алексей Львович доктор биологических наук Никитин Денис Иванович Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет – МСХА им. К.А. Тимирязева Защита диссертации состоится « 20 » марта 2007 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.052 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, ауд. М-1, тел./факс (095) 939-18-27. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке биологического факультета Московского государственного университета. Автореферат разослан «____» _____________2007 г. Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направить по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет. Ученый секретарь Диссертационного совета Д.501.001.052 при МГУ им. М.В.Ломоносова кандидат биологических наук Е.Н.Калистратова 3 ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Электромагнитное излучение (ЭМИ) является физическим фактором среды, который оказывает существенное влияние на различные живые организмы. Естественных источников электромагнитного излучения в СВЧ- и КВЧ-диапазонах на Земле не существует, однако, техногенные источники, количество и мощности которых постоянно растут, уже сейчас позволяют говорить о ЭМИ в этих диапазонах, как о важном техногенном факторе окружающей среды, влияющим на стабильность экосистем. Миллиметровое излучение активно используется в медицине, биологии и химии. К настоящему времени известно много исследований влияния ЭМИ миллиметрового диапазона низкой (нетепловой) интенсивности (КВЧ-излучение) на микроорганизмы [Исаева, 1991; Реброва, 1992; Ли и др., 2003]. Описано влияние на различные физиологические процессы и свойства у микроорганизмов: клеточное деление, морфологические признаки, скорость роста, выход биомассы, ферментативную активность и др. Исследования, проведенные в нашей лаборатории в течение ряда лет по влиянию КВЧ-излучения на метаболизм фотосинтезирующих организмов, выявили его стимулирующее действие на ряд физиологических процессов [Тамбиев и др., 1998; Tambiev et al., 2000; Тамбиев и др., 2003]. Необходимо отметить, что КВЧизлучение можно отнести к сверхслабым воздействиям, так как количество поглощаемой объектом энергии ничтожно мало, но его влияние на живые объекты бывает впечатляющим, например, стимуляция выхода биомассы у цианобактерии Spirulina platensis может быть выше в два и более раза. Влияние КВЧ-излучения на биологические объекты имеет, как правило, резонансный характер, то есть частотную, временную и мощностную зависимость [Тамбиев и др., 2003]. ЭМИ сантиметрового диапазона (СВЧ-излучение) находит применение в медицине и микробиологии [Wu, 1994]. Многие исследователи использовали СВЧизлучение для подавления роста микроорганизмов при стерилизации всевозможных объектов [Shin et al, 1997; Rosaspina et al, 1994]. Есть сведения о стимулирующем действии этого излучения на некоторые микроорганизмы в случаях, когда нагревание объектов не происходило или сводилось к минимуму [Булина и др., 1997; Rai et al, 1999]. 4 Цианобактерии и эукариотные зеленые микроводоросли являются широко распространенными объектами научных исследований, по физиологии которых существует обширная литература [Кондратьева и др., 1989; Гусев, Минеева, 2003]. Ряд их представителей являются перспективными объектами фотобиотехнологии благодаря значительному содержанию в клетках белка, полиненасыщенных жирных кислот, β – каротина, витаминов и др. соединений, а также минеральному составу [Vonshak et al., 1987; Henrikson, 1994; Borowitzka et al., 1999]. Пластичность метаболизма цианобактерий позволяет получать биомассу, обогащенную отдельными микроэлементами, путем направленного изменения условий культивирования, что используется, например, при создании биологически активных добавок [Минюк, 1999; Блинкова, 2001; Пронина и др., 2002; Тамбиев и др., 2006]. Актиномицеты относятся к грамположительным бактериям и являются составной частью наземных экосистем. Среди микроорганизмов они отличаются непревзойденной способностью к образованию биологически активных соединений разнообразного химического строения и биологического действия [Зенова, 1992]. В последнее десятилетие наряду с изучением чистых культур микроорганизмов возник большой интерес к исследованию микробных сообществ и ассоциаций [Заварзин, 1990; Заварзин, Колотилова, 2001]. Как известно, в большинстве естественных экосистем микроорганизмы сосуществуют в микробных сообществах и нередко образуют ассоциативные комплексы. Актиномицеты, как и немицелиальные бактерии, способны формировать ассоциации с другими микроорганизмами в природных условиях. Достаточно интересными бывают ассоциации актиномицетов и микроводорослей или цианобактерий, которые встречаются на выходах карбонатных пород и в почвах [Калакуцкая, Зенова, 1993; Звягинцев, Зенова, 2001; Зенова, 2002]. Некоторые виды цианобактерий входят в состав циано-бактериальных сообществ – матов [Звягинцева и др., 1995; Заварзин, 2004], многие участвуют в формировании симбиозов с эукариотами в природе [Schenk, 1992], и модельных ассоциаций с растительными партнерами в экспериментальных условиях [Gusev et al, 2002], а также являются частью почвенных микробных сообществ [Бабьева, Зенова, 1989; Добровольская, 2002]. В связи с этим являются актуальными проблемы получения микробных ассоциаций в лабораторных условиях, поиск критериев при подборе ассоциативных 5 пар, а также изучение внешних факторов (ЭМИ), способных регулировать метаболизм клеток у партнеров смешанных культур при раздельном и совместном культивировании. Цель работы. Целью исследования явилось изучение действия СВЧ- и КВЧизлучений на гетеротрофных и фототрофных микроорганизмов, способных показывать устойчивый рост в смешанных культурах. Задачи исследования: 1. Изучение возможности обработки воздушно-сухих образцов почвы СВЧизлучением для выделения культур актиномицетов, в том числе их редких родов. 2. Изучение действия СВЧ- и КВЧ-излучения на некоторые физиологические характеристики актиномицетов. 3. Подбор условий совместного культивирования актиномицета, как гетеротрофного, и цианобактерии либо зеленой микроводоросли как фототрофного партнеров. 4. Определение возможного критерия при подборе пар микроорганизмов для создания устойчивых смешанных культур. 5. Выявление активных режимов облучения в КВЧ-диапазоне для стимуляции роста фототрофных партнеров смешанных культур. 6. Изучение действия КВЧ-излучения на полученные смешанные культуры. Научная новизна. Выделение культур актиномицетов из почв показало применимость обработки воздушно-сухих почвенных образцов СВЧ-излучением для увеличения количества выделяемых актиномицетов и их редких родов. Предлагаемая методика позволяет более полно оценивать почвенный актиномицетный комплекс. Установлен резонансный стимулирующий эффект действия на исследуемые культуры при изучении действия СВЧ- и КВЧ-излучения на физиологические характеристики актиномицетов. Выявлены активные длины волн и экспозиции облучения для актиномицетов видов Streptomyces xanthochromogenes шт.№8 и Streptomyces cinereorectus шт.№10. Впервые отмечена различная реакция на действие СВЧ-излучения у покоящихся спор и растущего мицелия актиномицетов. Подобраны условия для совместного культивирования актиномицета Str. xanthochromogenes шт.№8 и цианобактерии Anabaena variabilis шт. ATCC 29413. Впервые зафиксировано в смешанной культуре формирование устойчивых 6 новообразований – «конгломератов», состоящих из переплетенных гифов актиномицета и трихом цианобактерии. Впервые установлена возможность использования значений реакционной способности (РС) экскретируемых в среду нативных экзометаболитов у микроорганизмов, как «экспресс» критерия при подборе смешанных культур или ассоциативных пар. Отмечена наибольшая совместимость партнеров при значениях РС среды в противоположных областях активности – окислительной (ОА) и антиокислительной (АОА) у изученных культур микроорганизмов. Установлены оптимальные режимы КВЧ-облучения цианобактерии A. variabilis и зеленой микроводоросли Scenedesmus quadricauda (Turp.) Bréb. для стимуляции роста и выхода биомассы. Впервые отмечена различная реакция на КВЧ-облучение у смешанной культуры и раздельно культивируемых партнеров. Практическое значение. Модифицированный метод предварительной обработки почвенных образцов СВЧ-излучением для выделения актиномицетов позволяет более полно оценивать почвенный актиномицетный комплекс, а также выделять больше редких родов актиномицетов. Установленные активные режимы СВЧ-облучения для актиномицетных культур позволяют регулировать их физиологическую активность, что может использоваться для стимулирования синтеза антибиотиков и протеолитических ферментов в биотехнологии. Предлагаемый критерий при подборе партнеров смешанных культур микроорганизмов позволяет быстро оценить возможности их совместного роста. Полученные данные возможно использовать при оценке действия ЭМИ, как техногенного фактора, на естественные микробные популяции и лабораторные культуры, а также при изучении механизмов его действия на клетки микроорганизмов. Апробация работы. Основные положения работы доложены на VII, XI, XIII, XIV Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 1999, 2003, 2005, 2006); на конференции «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов» (Москва, 2000); на Международной конференции «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2000); на Международной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие» (Пущино, 2001), на I, II, III Международных конгрессах 7 «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005); на Международном симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 2004), на III Международной конференция «Электромагнитные излучения в биологии» (Калуга, 2005), на I Международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных экосистемах» (Москва, 2006). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на …… страницах и включают ……. рисунков и …… таблицы. Список литературы содержит ссылки на ……. источника из которых …… - зарубежных. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Объектами исследования служили выделенные нами из почвы актиномицеты видов Streptomyces xanthochromogenes шт.№8 и Streptomyces cinereorectus шт.№10; полученные из коллекции кафедры генетики биологического ф-та МГУ им. М.В.Ломоносова цианобактерия Anabaena variabilis Kütz. ATCC 29413 (штамм д-ра С.П. Волка, США) и из коллекции кафедры гидробиологии биологического ф-та МГУ им. М.В.Ломоносова зеленая микроводоросль Scenedesmus quadricauda (Turp.) Bréb., а также полученные из коллекции кафедры биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова бактерии – Pseudomonas sp., Bacillus sp., Micrococcus sp. Условия культивирования. Актиномицеты культивировали на средах – минеральный агар Гаузе №1 и жидкой минеральной среде Гаузе №1, цианобактерии и зеленые микроводоросли – на минеральной среде Громова №6. Смешанную культуру выращивали на модифицированной среде Громова №6 (добавление крахмала 8 г/л). Культуры фототрофных микроорганизмов выращивали при постоянном освещении (16,4 μmol ⋅ m-2⋅ s-1), температуре 28° С в накопительной культуре в течение 21 суток. Актиномицеты инкубировали на поверхности агаризованной среды в чашках Петри в течение 14 суток при 28° С и в погруженной культуре при постоянном качании 180 об/мин в течении 4 суток. При высеве микроорганизмов из суспензий для определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ) использовали следующие твердые среды: 8 минеральный агар 1 Гаузе; органический агар 2 Гаузе; среда Чапека бактериальная; среда „Rich” [Гаузе и др., 1983; Методы…, 1983]. Для определения физиологических характеристик отбирали пробы на 6, 18, 38, 60 и 80 часах роста культур актиномицетов [Прокофьева-Бельговская, 1963]. Получение споровой и мицелиальной суспензий актиномицетов. При облучении ЭМИ актиномицетов Str. xanthochromogenes и Str. cinereorectus использовали их споровую и мицелиальную суспензии. Количество спор в суспензии подсчитывали в камере Горяева. Для получения мицелиальной суспензии актиномицеты инкубировались в жидкой среде Гаузе № 2 в течение 3-х суток, затем отфильтрованную биомассу суспензировали в воде [Зенова, 1992]. Перед облучением суспензии обрабатывали ультразвуком при частоте 22 кГц, силе тока 0,4 А в течение 2-х минут [Звягинцев и др., 1984]. КВЧ-облучение. КВЧ-облучение проводили оригинальным прибором «Аквастим» при λ = 4,9; 5,6; 7,1 мм, времени облучения – 15; 30; 45; 60 мин., Р (плотность падающей мощности) = 1,5 мВт/см2. [Тамбиев и др., 2003] При изучении влияния КВЧ-излучения на физиологические характеристики культур микроорганизмов облучение проводили в случае фототрофных микроорганизмов сразу после посева, на 7-е сутки роста культуры и комбинируя эти два режима облучения, а в случае гетеротрофных микроорганизмов облучение проводили сразу после посева культуры. При изучении возможной «памяти среды» КВЧ-облучению подвергалась чистая среда непосредственно перед посевом культуры. СВЧ-облучение. Обработку СВЧ-излучением суспензий чистых микроорганизмов и воздушно-сухих образцов почвы проводили при частоте 2450 МГц, длине волны 12,5 см, мощности 80 Вт и времени облучения 15, 30, 45, 60 и 90 секунд. При проверке одной из гипотез возможного механизма действия ЭМИ на клетку перед облучением создавали бескислородную среду, вытесняя кислород аргоном в пенициллиновом флаконе со споровой суспензией культуры актиномицета. Определение биомассы. Биомассу цианобактерий и зеленых микроводорослей определяли нефелометрическим методом (ФЭК-М). Для пересчета показаний ФЭКа были построены стандартные кривые зависимости веса сухой биомассы от величины экстинкции Е. Биомассу актиномицетов определяли весовым методом. 9 Определение уровня дыхания. Для оценки уровня дыхания актиномицетных культур, измеряли эмиссию СО2 на газовом хроматографе Хром 3700 с детектором по теплопроводности после инкубации 5 мл суспензии в течении часа при температуре 28° С [Звягинцев, 1991]. Расчёты производили по формуле: D = S*K*Vг./Vп.*t*Vж.ф., где D – эмиссия СО2 (мкг С− СО2 / мл*час); S – площадь пика; K – коэффициент пересчёта K = 1,29*10-11; Vг. – объём газовой фазы (мл),Vг.=10; Vп. – объём пробы (мл),Vп.= 0,5; t – время инкубации (часы), t = 1; Vж.ф. – объём жидкой фазы (мл), Vж.ф. = 5. Определение реакционной способности (РС). Реакционную способность (РС, окислительную − ОА и антиокислительную − АОА активность) определяли методом химических моделей [Тамбиев, 1974; 1984], в качестве модели использовали 3,4−диоксифенилаланин (ДОФА). ОА и АОА определяли соответственно по повышению или понижению скорости реакции окисления ДОФА в контроле (чистая среда) и при добавлении экзометаболиты. культуральной Ускорение или жидкости, торможение содержащей реакции нативные окисления ДОФА культуральной жидкостью по сравнению с чистой средой определялось тангенсом угла наклона кривой нарастания оптической плотности во времени при постоянной температуре 45° С на приборе ″Аквакон-4″. Раствор ДОФА готовится в следующих отношениях: на 25 мл дистиллированной Н2О вносится 10 мг реактива ДОФА. Мультисубстратное тестирование. Изменение усвоения различных субстратов актиномицетами после действия СВЧ-излучения определяли методом мультисубстратного тестирования (МСТ). Он основан на инкубации микроорганизмов в присутствии 47 различных субстратов при 28˚C и определении степени их усвоения по интенсивности окраски, обусловленной трифенилформазаном – продуктом восстановления бромистого трифенилтетразолия (индикатора метаболизма) дыхательными ферментными системами актиномицетов, который добавлялся в каждую пробу в составе фосфатного буфера [Горленко, Кожевин, 1994; Зенова и др., 2001]. Определение размера актиномицетных колоний. Размер актиномицетных колоний определяли после точечного посева инокулята на твердую питательную среду с последующем измерением диаметра колоний в процессе роста культуры. 10 Изучение таксономического положения выделенных культур актиномицетов. Для идентификации культур актиномицетов использовали их морфологические признаки [Гаузе и др.,1983]. Описание проводили на следующих диагностических средах: минеральный агар 1 Гаузе; органический агар 2 Гаузе; овсяный агар; глицерин-нитратный агар; пептонно-дрожжевой агар с железом. Условия культивирования смешанной культуры актиномицета Str. xanthochromogenes и цианобактерии A. variabilis. Для культивирования смешанной культуры нами впервые подобрана модифицированная среда, которая представляет аналог минеральной среды Громова №6 с добавлением растворимого крахмала в количестве 8 г/л. В качестве инокулята использовалась споровая суспензия актиномицета, концентрация спор в суспензии составляла 106 клеток на мл. Концентрация клеток цианобактерии составляла 104 клеток на мл. Соотношение аликвот каждого компонента на 200 мл среды составляет 2:1 актиномицетной и цианобактериальной части соответственно. Оптимальными условиями культивирования является первоначальное качание в течение 2 суток в темноте при 180 об/мин и температуре 28° С, что требуется для прорастания спор и начала логарифмической фазы роста актиномицета. Дальнейшее совместное культивирование проводилось при постоянном качании (60 об/мин) и освещении (16,4 μmol ⋅ m-2⋅ s-1) при той же температуре. Изучение морфологических особенностей культур микроорганизмов. Изучение морфологических особенностей микроорганизмов проводилось при помощи оптического микроскопа Axiophot, фирмы Carl Zeiss. Статистическая обработка. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента [Лакин, 1968]. При статистической обработке данных использовался доверительный интервал [Дмитриев, 1995]. В случае невозможности аппроксимации изучаемого распределения нормальным законом применялись непараметрические методы анализа, в частности критерий Вилкоксона [Благовещенский, 1985]. Статистическая обработка данных и математический анализ осуществлен с использованием программ Excel 2003, Statistica 6. 11 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Применение обработки СВЧ-излучением воздушно-сухих образцов для выделения редких родов актиномицетов. В результате исследований было установлено, что СВЧ-излучение подавляет жизнеспособность широко распространенных в почве видов бактерий Micrococcus sp., Bacillus sp. и Pseudomonas sp., начиная с 30 секундной обработки суспензий, при этом значительного нагревания объектов не происходит. СВЧ-облучение воздушно-сухих образцов почвы позволило заметно увеличить (на 10%) долю выделяемых из почвы редких родов актиномицетов при 45 секундной экспозиции (рис. 1). Из полученных нами результатов можно предположить, что доля редких родов актиномицетов возрастает не за счёт угнетения широко распространённых в почве стрептомицетов, а в связи с подавлением конкурирующих с актиномицетами немицелиальных бактерий и возможной стимуляции роста некоторых видов актиномицетов. 26,23% редкие необлучённая почва 73,77% Streptomyces Обработка СВЧ-излучением в течение 45 секунд 36,2% редкие 63,8% Streptomyces Рис. 1. Доля редких родов актиномицетов при выделении их из почвы с использованием СВЧ-облучения и без него 12 Данный метод предварительной обработки почвы является быстрым и лёгким в исполнении, не мешает дальнейшей работе с почвенными образцами, позволяет более полно оценивать актиномицетный комплекс в почвах, а также облегчает задачи при изыскании редких родов и видов актиномицетов, столь важных для актиномицетов под биотехнологической и фармакологической промышленности. Изменения физиологических характеристик у действием СВЧ- и КВЧ-излучения. Изучение действия СВЧ-излучения на физиологические параметры актиномицетов проводилось на споровых суспензиях культур Str. xanthochromogenes и Str. cinereorectus, так как актиномицеты представлены в почве в значительной степени в форме покоящихся спор. В качестве основных физиологических характеристик рассматривались: сохранение жизнеспособности (по КОЕ/мл), накопление биомассы, уровень дыхания, РС культуральной среды и мультисубстратное тестирование. Впервые для актиномицетов, в частности для Str. xanthochromogenes было установлено стимулирующее действие СВЧ-излучения при 30 секундной экспозиции, заключающееся в увеличении накопления биомассы на 21%, уровня дыхания на 20% и РС на 15% (ОА) с максимумом у 38-часовой культуры (рис.2,3). 0,4 30 0,35 К биомасса, г/100мл 0,3 45 0,25 60 15 0,2 90 0,15 0,1 0,05 0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 время роста, ч 15, 30, 45, 60, 90 - время облучения (секунды) К - необлученная культура Рис. 2. Накопление биомассы у актиномицета Str. xanthochromogenes после СВЧоблучения споровой суспензии 13 200 180 160 ОА % 15 30 140 45 60 120 90 АОА % К 100 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 время роста, ч 80 15, 30, 45, 60, 90 - время облучения (секунды) ОА, АОА в % к чистой среде, (контролю) К - необлученная культура Рис. 3. Изменение РС у актиномицета Str. xanthochromogenes после СВЧоблучения споровой суспензии Исследования с актиномицетом Str. cinereorectus показали схожую картину действия СВЧ-излучения, однако стимуляция физиологических характеристик была менее выражена. Учитывая, что актиномицеты являются микроорганизмами со сложным жизненным циклом, представляло интерес выяснить, как будет вести себя культура при посеве облучённым СВЧ-излучением мицелием. В результате, для актиномицета Str. xanthochromogenes показано, что, в отличие от спор, действие излучения начинается при более длительных экспозициях – 60 и 90 секунд, при этом происходит ускорение развития культуры с кульминацией к 38 часам роста, как по накоплению биомассы, так и по изменению РС (рис. 4, 5). Можно предположить, что в спорах находится меньшее количество антиокислителей, чем в растущем мицелии, которые могут влиять на развитие первичных механизмов действия СВЧ-излучения [Тамбиев и др., 2003]. Несмотря на большую устойчивость спор к внешним воздействиям, нами установлена необходимость более длительного СВЧ-облучения мицелия актиномицета по сравнению со споровой суспензией для достижения схожего эффекта стимуляции роста культуры. 14 0,4 0,35 биомасса, г/100мл 0,3 0,25 К 0,2 15 0,15 30 0,1 45 0,05 60 90 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 время роста, ч Рис. 4. Накопление биомассы у актиномицета Str. xanthochromogenes после СВЧоблучения суспензии мицелиальных клеток 200 180 160 ОА% 15 30 140 45 60 120 90 К АОА% 100 0 6 80 12 18 24 30 36 42 48 54 60 время роста,ч Рис. 5. Изменение РС у актиномицета Str. xanthochromogenes после СВЧоблучения суспензии мицелиальных клеток Методом мультисубстратного тестирования (МСТ) изучено возможное изменение метаболической активности по отношению к субстратам при действии СВЧ-излучения на споровую суспензию актиномицета Str. xanthochromogenes, что приводит к сокращению спектра усваиваемых веществ. В необлученном варианте происходит усвоение 7 субстратов: L-глутамина, аспарагина, мочевины, аспартата, 15 гистидина, серина, лактата. После облучения прекращается усвоение лактата, что может говорить об угнетении синтеза лактозы. В то же время, возрастание метаболической активности по отношению к ряду субстратов, например к аспарагину, более всего изменяется после 30 секундного облучения, что подтвердил проведенный кластерный анализ. Одна из гипотез механизма действия ЭМИ на клетки микроорганизмов говорит о значимости присутствия О2 в среде [Тамбиев и др., 2003]. Мы облучали СВЧизлучением суспензию спор Str. xanthochromogenes в воде, где кислород вытеснялся аргоном. В результате наблюдалось снижение действия СВЧ-излучения, что проявлялось в уменьшении стимулирующего эффекта на этом штамме. Следующим этапом нашей работы стало изучение действия КВЧ-излучения на актиномицеты. В ходе экспериментов были исследованы следующие характеристики: сохранение жизнеспособности спор (по КОЕ/мл), накопление биомассы и радиальная скорость роста колоний. После КВЧ-облучения (длина волны 7,1 мм, длительность 15, 30 минут) наблюдалось увеличение диаметра колоний приблизительно на 40%, начиная с 4 суток роста по сравнению с необлученной культурой (рис. 6). 25 диаметр колонии, мм 20 15 15 30 1530 15 30 К К 45 45 15 10 К 30 45 45 К 5 1530 45 К 0 2 сутки 3 сутки 4 сутки 7 сутки 10 сутки время роста, сутки Рис. 6. Действие КВЧ-излучения при длине волны 7,1 мм на размер колоний актиномицета Str. xanthochromogenes 16 Изучение смешанных культур. Для создания смешанных культур были использованы актиномицеты Str. xanthochromogenes и Str. cinereorectus (гетеротрофный), а также цианобактерия A. variabilis и зеленая микроводоросль Sc. quadricauda (фототрофный компонент). В ходе исследований было апробировано большое количество сред для совместного культивирования этих микроорганизмов. Установлено, что наиболее удачной является модифицированная нами минеральная среда Громова №6 с добавлением крахмала из расчета 8 г/л. Оптимальные условия культивирования состояли в первоначальном качании в темноте при температуре 28°С (2 суток, 180 об/мин.), что требуется для прорастания спор и начала логарифмической фазы роста актиномицета, и дальнейшем качании при постоянном освещении культуры (16,4 μmol ⋅ m-2⋅ s-1). В этих условиях нам удалось получить устойчивый и наиболее активный рост смешанной культуры актиномицета Str. xanthochromogenes и цианобактерии A. variabilis. Другие три смешанные культуры: Str. cinereorectus + A. variabilis; Str. xanthochromogenes + Sc. quadricauda; Str. cinereorectus + Sc. quadricauda по характеру роста и накоплению биомассы можно отнести к менее подходящим сочетаниям. У двух пар мы наблюдали угнетение роста. Критерий при подборе пар для смешанных культур микроорганизмов. Как возможный критерий при подборе пар для смешанных культур нами было предложено рассмотреть РС нативных экзометаболитов, выделяемых в среду микроорганизмами, что описано для ряда объектов [Тамбиев, 1974; 1984]. При культивировании A. variabilis на модифицированной среде Громова №6 наблюдается увеличение антиокислительной активности (АОА) среды до 7 суток роста, затем снижение и переход в окислительную активность (ОА) на 14 сутки роста. Для актиномицета Str. xanthochromogenes на той же среде РС имеет ОА на всем протяжении роста культуры (рис. 7), с максимумом на 3 сутки роста, когда увеличение ОА составляет около 180% к контролю. Для смешанной культуры этих микроорганизмов мы наблюдали зависимость результирующей кривой РС до 3-4 суток роста от быстрорастущего гетеротрофного партнера, которая на 4-5 сутки сменялась зависимостью от экзометаболитов медленно растущего фототрофного партнера. 17 200 180 160 ОА% 140 120 АОА% 100 0 3 6 9 12 15 80 18 21 сутки роста 60 40 20 0 Streptomyces xanthochromogenes шт.№8 Anabaena variabilis Смешанная культура Рис. 7. Изменение РС в процессе роста смешанной xanthochromogenes и A. variabilis, и отдельно у её партнеров культуры Str. Для Sc. quadricauda выявлена ОА экзометаболитов в процессе роста культуры на модифицированной среде Громова №6 и увеличение происходит до 12 суток роста. Аналогичный ход кривой в ОА наблюдаем и для актиномицета Str. cinereorectus, с максимумом около 155% у 3 суточной культуры. В смешанной культуре этих микроорганизмов наблюдался ход кривой РС, как результирующий от двух кривых отдельно взятых партнеров (рис. 8). Полученные данные показали, что наиболее подходящие пары изученных микроорганизмов при культивировании на одинаковой среде обладают противоположной РС культуральной жидкости, то есть ОА и АОА, и чем значительней разница между ними, тем более совместимыми партнеры оказываются в смешанной культуре. Таким образом, определение РС нативных экзометаболитов культуральной жидкости у отдельных культур – предполагаемых партнеров для ассоциативных пар и смешанных культур, возможно использовать как экспресскритерий при их создании. 18 170 160 150 ОА% 140 130 120 110 100 АОА% 0 3 6 90 9 12 15 18 21 сутки роста 80 Streptomyces cinereorectus шт. №10 Scenedesmus quadriсauda Смешанная культура Рис. 8. Изменение РС в процессе роста смешанной культуры Str. cinereorectus и Sc. quadricauda, и отдельно у её партнеров Действие КВЧ-излучения на фототрофные компоненты смешанных культур. Для зелёной микроводоросли Sc. quadricauda установлено стимулирующее действие однократного облучения при длине волны 7,1 мм в течение 30 минут, которое выражается в увеличении накопления биомассы на 7 сутки роста на 40% по сравнению с контролем. Изучение действия КВЧ-излучения на рост культуры цианобактерии A.. variabilis показало, что наиболее активной длиной волны является 7,1 мм. При однократном облучении культуры в течение 45 минут наблюдается увеличение накопления биомассы, равное 25%, при 60 минутном облучении стимулирующий эффект немного больше и накопление биомассы увеличивается на 34% по сравнению с контролем. Мы получили наибольший стимулирующий эффект после облучения культуры в течение 45 минут сразу после посева и повторного облучения на 7 сутки роста культуры, когда прирост биомассы на 20 сутки роста составил 58,8% по сравнению с контролем. Таким образом, для фототрофных партнеров смешанных культур зафиксирована выраженная стимуляция роста при действии КВЧ-излучения, а также выявлены оптимальные для этого условия опыта. 19 «Память воды (среды)». В последнее время в литературе активно обсуждается так называемая «память воды», которая по мнению ряда авторов заключается в изменении структуры (свойств) воды после какого-либо внешнего воздействия и сохранении этого изменения во времени. В связи с этим, нами изучено действие предварительного КВЧ-облучения чистой среды (как водного раствора), с последующим внесением в неё инокулята, на рост культуры цианобактерии A. variabilis. Уровень стимуляции по накоплению биомассы у A. variabilis после 60 минутного облучения чистой среды перед посевом культуры сопоставим с таковым у облученной, уже посеянной, культуры (рис. 9). Это подтверждает возможность существования «памяти воды» или «памяти среды». 0,9 0,7 60 К 60 0,6 60 К 0,4 К ср ед а 0,5 OD ср ед а ср ед а 60 0,8 60 60 0,3 0,2 0,1 0 7 14 21 сутки роста К – необлученная культура; 60 – КВЧ-облучение посеянной культуры в течение 60 минут; среда 60 – КВЧ-облучение чистой среды в течение 60 минут перед посевом культуры Рис. 9. Изменение накопления биомассы после КВЧ-облучения среды в течение 60 минут до и после посева культуры A. variabilis Формирование устойчивых новообразований - «конгломератов» в смешанной культуре актиномицета Str. xanthochromogenes и цианобактерии A. variabilis. Изучение некоторых морфофизиологических характеристик и условий культивирования смешанной культуры актиномицета Str. xanthochromogenes и цианобактерии A. variabilis впервые выявило формирование шарообразных новообразований – «конгломератов», которые состоят из плотно переплетенных 20 гифов актиномицета с трихомными нитями цианобактерии, достаточно устойчивых к механическим воздействиям и не разрушающихся при отмывании водой (рис. 10). Изучая формирование «конгломератов» мы показали их появление на 5-е сутки роста культуры, а при дальнейшем культивировании их доля от общей биомассы возрастает и может составлять 8-9%. 2 2 1 100 µm 1 Рис. 10. Формирование шарообразных «конгломератов» в смешанной культуре актиномицета Str. xanthochromogenes (1) и цианобактерии A. variabilis (2) Действие КВЧ-излучения на смешанную культуру актиномицета и цианобактерии. При изучении характера роста смешанной культуры Str. xanthochromogenes и A. variabilis, мы оценивали действие КВЧ-излучения с использованием тех же параметров облучения, что и для раздельно культивируемых партнеров этой культуры. Мы предположили, что на схожие воздействия ответ у смешанной культуры, возможно, будет отличаться, поэтому на первом этапе облучение проводили, используя 4 экспозиции облучения, но с фиксированной длиной волны 7,1 мм. В качестве оценки физиологического состояния культуры использовали общее накопление биомассы и её морфологические особенности. В результате исследований, после КВЧ-облучения смешанной культуры установлено, что не происходит достоверно значимого увеличения общего накопления биомассы у смешанной культуры, в отличие от отдельно взятых 21 партнеров. Однако, нами было зафиксировано более раннее формирование шарообразных новообразований – “конгломератов” уже на 3-е сутки роста культуры, по сравнению с аналогичным на 5-е сутки у необлученной культуры. Также было установлено, что доля этих новообразований в облученной культуре возрастает и доходит до 15% (рис. 11) (в необлученной культуре – 8-9%). 16 % конгл от общей биомассы 14 12 10 8 6 4 2 0 0 1 3 5 7 9 12 15 18 21 сутки роста Необлученая культура Облученная культура Рис. 11. Изменение времени формирования и доли «конгломератов» в смешанной культуре A. variabilis и Str. xanthochromogenes под действием КВЧоблучения Таким образом, действие КВЧ-излучения на смешанную культуру показывает неоднозначную реакцию микроорганизмов на внешний фактор в данных условиях, поэтому изучение взаимного влияния партнеров смешанной культуры требует продолжения. Это представляет интерес для перспективного использования смешанных культур в биотехнологии, а также для понимания закономерностей взаимной регуляции и возможных способах коммуникации в случае ассоциативного роста микроорганизмов в естественных биогеоценозах и лабораторных культурах. В перспективе ЭМИ в СВЧ- и КВЧ-диапазонах, являющееся техногенным фактором, можно рассматривать, как новое средство физиологической регуляции метаболизма клеток микроорганизмов, повышающее их продуктивность, которое займет в будущем свое место при разработке экологически чистых производств. 22 ВЫВОДЫ 1. Выявлен оптимальный режим обработки воздушно-сухих почвенных образцов СВЧ-излучением для выделения редких родов актиномицетов из почвы. 2. Впервые показано стимулирующее действие СВЧ- и КВЧ-излучения на споры и мицелий почвенных актиномицетов Streptomyces xanthochromogenes и Streptomyces cinereorectus. Установлен резонансный эффект действия этих видов излучения. 3. Выявлена различная реакция спор и мицелиальных клеток актиномицетов на действие СВЧ-излучения. 4. Из исследованных пар микроорганизмов, наилучший рост обнаружен у смешанной культуры актиномицета Streptomyces xanthochromogenes и цианобактерии Anabaena variabilis. 5. Впервые установлена возможность использования реакционной способности (РС) нативных экзометаболитов в качестве одного из критериев при подборе партнеров для смешанных культур микроорганизмов. 6. Выявлено стимулирующее действие КВЧ-излучения на культуры цианобактерии Anabaena variabilis и зеленой микроводоросли Scenedesmus quadricauda. Показано, что при КВЧ-облучении чистой среды с последующим посевом инокулята цианобактерии Anabaena variabilis стимуляция роста сохраняется на близком уровне, что, видимо, подтверждает существование «памяти воды» («памяти среды»). 7. Впервые показано, что при совместном культивировании актиномицета Streptomyces xanthochromogenes и цианобактерии Anabaena variabilis происходит образование устойчивых переплетенных гифов шарообразных актиномицета и «конгломератов», трихомных нитей состоящих из цианобактерии, количество которых возрастает при КВЧ-облучении смешанной культуры. 23 СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Зенова Г.М., Лихачёва А.А., Лукьянов А.А., Тамбиев А.Х. Влияние электромагнитных волн СВЧ-диапазона на физиологические параметры культур актиномицетов // Труды VII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии». Украина, Ялта-Гурзуф, 1999, с. 129-130. 2. Лихачёва А.А., Лукьянов А.А., Тамбиев А.Х., Зенова Г.М. Влияние электромагнитных волн СВЧ-диапазона на некоторые виды актиномицетов // Труды конференции: «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов». М., 2000, с. 70. 3. Лихачёва А.А., Лукьянов А.А., Зенова Г.М., Тамбиев А.Х. Влияние СВЧизлучения на физиологические характеристики культур актиномицетов и бактерий // Биотехнология. М., 2000, №5, с. 31-35. 4. Лихачёва А.А., Лукьянов А.А., Зенова Г.М. Воздействие СВЧ-излучения на клетки микроорганизмов и некоторые предположения о его механизме // Материалы международной конференции «Автотрофные микроорганизмы». М.: МАКС Пресс, 2000, с. 115-116. 5. Тамбиев А.Х., Кирикова Н.Н., Маркарова Е.Н., Лукьянов А.А. Возможность стимуляции роста цианобактерий, микроводорослей и актиномицетов с помощью КВЧ-излучения // Материалы международной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие». Пущино, 2001, с. 212-213. 6. Тамбиев А.Х., Кирикова Н.Н., Лукьянов А.А. Применение активных частот электромагнитного излучения миллиметрового и сантиметрового диапазона в микробиологии // Наукоемкие технологии. М., 2002, №1, т. 3, с. 34-53. 7. Лукьянов А.А., Тамбиев А.Х., Лихачева А.А., Зенова Г.М. Изменение физиологической активности актиномицетов под действием электромагнитного излучения // Материалы I международного конгресса «Биотехнология – состояние и перспективы развития». М., 2002, с. 251-252. 8. Лукьянов А.А., Котов В.Д., Тамбиев А.Х. Действие КВЧ излучения и лазера на культуру цианобактерий Anabaena variabilis // Материалы XI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Украина, Ялта-Гурзуф, 2003, с. 239-240. 9. Лябушева О.А., Лукьянов А.А., Тамбиев А.Х., Кирикова Н.Н. Стимулирующее действие электромагнитного излучение ММ диапазона (КВЧ-излучение) на цианобактерии // Материалы II международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М., 2003, ч.2, с.102-103. 24 10. Лукьянов А.А., Тамбиев А.Х. Изменение реакционной способности культуральной жидкости микроорганизмов как важный фактор при подборе ассоциативных пар // Тезисы докладов всероссийского симпозиума с международным участием «Биотехнология микробов». М., 2004, с. 59. 11. Лукьянов А.А., Тамбиев А.Х. Образование конгломератов в смешанной культуре актиномицета Streptomyces xanthochromogenes и цианобактерии Anabaena variabilis // Труды Мордовского отделения общероссийского общественного объединения "Общество биотехнологов России". Выпуск 1, Саранск: Мордовский университет, 2004, с. 95-97. 12. Лукьянов А.А., Лябушева О.А., Тамбиев А.Х. Смешанные культуры актиномицетов и цианобактерий – перспективных объектов биотехнологии // Материалы III международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М., 2005, ч. 2, с. 127-128. 13. Лукьянов А.А., Тамбиев А.Х. Действие КВЧ-излучения на рост смешанной культуры актиномицета Streptomyces xanthochromogenes и цианобактерии Anabaena variabilis // Материалы XIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Украина, Ялта-Гурзуф, 2005, с. 169-170. 14. Лукьянов А.А., Лябушева О.А., Тамбиев А.Х. Действие электромагнитного излучения (КВЧ- и СВЧ-диапазонов) на фототрофные и гетеротрофные микроорганизмы, а также смешанные культуры // Труды III международной конференции «Электромагнитные излучения в биологии (БИО-ЭМИ-2005)». Калуга, 2005, с. 190-194. 15. Лукьянов А.А., Тамбиев А.Х. Проявление «памяти среды» при КВЧ-облучении культуры цианобактерии Anabaena variabilis // Материалы XIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Украина, Ялта-Гурзуф, 2006, с. 133. 16. Тамбиев А.Х., Кирикова Н.Н., Лукьянов А.А. Использование электромагнитного излучения миллиметрового и сантиметрового диапазонов низкой интенсивности в микробиологии // Материалы международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» памяти проф. М.В. Гусева. М., 2006, с. 106-107. 17. Лихачева А.А., Комарова А.С., Лукьянов А.А., Горленко М.В., Терехов А.С. Влияние СВЧ-излучения на почвенные стрептомицеты // Почвоведение, М., 2006, №8, с. 951-955.
