ЛИПИДНЫЙ ОБМЕН ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ И ЕГО
advertisement
1 ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н.И. ПИРОГОВА» МИНЗДРАВА РОССИИ На правах рукописи НГУЕН ЗАНЬ ХАНЬ ЛИПИДНЫЙ ОБМЕН ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ И ЕГО ОСЛОЖНЕНИЯХ ( экспериментально – клиническое исследование ) 03. 01.04– биологическая химия 14.03.03 – патологическая физиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д.м.н., член-корреспондент РАН, проф. Терентьев А.А. д.б.н., гл. научный сотрудник НИЛ сердечно - сосудистой системы, Микаелян Н.П. МОСКВА- 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5 ВВЕДЕНИЕ 8 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15 1.1. Этиология и патогенез сахарного диабета и сосудистых осложнений 15 1.1.1. Этиология сахарного диабета 15 1.1.2. Патогенез сахарного диабета 16 1.1.3. Патогенез диабетических ангиопатий 19 1.2. Нарушение обмена веществ при СД 22 1.2.1. Нарушение обмена липидов при сахарном диабете 27 1.2.2. Патогенез нарушений липидного обмена при СД 2 типа 28 1.3. Нарушение обмена жирных кислот при сахарном диабете 30 1.4. Механизмы образования свободных радикалов 31 1.5. Система антиоксидантной защиты организма 36 1.5.1. Ферментативное звено антиоксидантной системы 37 1.5.2 Неферментативное звено антиоксидантной системы 46 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 50 2.1. Объект исследований 50 2.2. Характеристика групп больных 50 2.3. Приготовление проб для исследования 52 2.4. Методы исследований 53 2.4.1. Продукты ПОЛ 53 2.4.1.1 Определение содержания малонового диальдегида (МДА) игидроперекисей (ГП). 53 2.4.1.2. Определение количества диеновых конъюгатов (ДК) в эритроцитах. 2.4.1.3. Определение ТБК - активных продуктов в сыворотке крови 2.4.2. Показатели энергетического обмена 54 55 55 3 2.4.2.1. Определение концентрации глюкозы крови. 55 2.4.2.2. Определение концентрации гликозилированного гемоглобина (HbA1c). 55 2.4.2.3. Определение степени утилизации глюкозы эритроцитами 2.4.3. крови 56 Антиоксидантная система 57 2.4.3.1. Определение общей антиоксидантной защиты организма 57 ` 2.4.3.2. Определение активности глутатионпероксидазы (ГПО) 57 2.4.3.3. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) 57 2.4.3.4. Определение активности каталазы (КТ). 58 Показатели липидного спектра крови 58 2.4.4.1. Определение холестерина в сыворотке крови. 58 2.4.4.2. Определение триацилглицеридов в сыворотке крови. 59 2.4.4. 2.4.4.3. Определение конценрации липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови (ЛПВП) 59 2.4.4.4. Определение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) в сыворотке крови 59 2.4.4.5. Коэффициент атерогенности (КА) крови 60 2.4.4.6. Условия анализа жирных кислот 60 2.5. Экспериментальные методы исследования и моделирование стрептозоцинового диабета у крыс ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЙ 3.1. 61 63 Оценка процессов пероксидации липидов, антиоксидантной системы и состава жирных кислот крови у больных сахарным диабетом 1 типа и его осложнениях 3.1.1. 3.1.2. 63 Изменение липидного и липопротеидного состава крови при СД 1 типа и его осложнениях. 64 Оценка процессов перекисного окисления липидов у больных 67 4 СД 1 типа и его осложнениях 3.1.3. Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах и общий антиоксидантный статус сыворотки крови больных СД 1 типа и его осложнениях. 3.1.4. 68 Сравнительная характеристика показателей жирных кислот в плазме крови и эритроцитах у больных сахарнымдиабетом 1 типа ГЛАВА 4. 74 ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ КРОВИ ПРИ ОЖИРЕНИИ И САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 2 ТИПА У ЖЕНЩИН С ИНСУЛИНРЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА 4.1 77 Клинико-метаболические параметры у пациентов с ожирением и сахарным диабетом 2 типа 4.2. 78 Состояние метаболизма жирных кислот у различных групп женщин 4.3. 80 Сравнительная характеристика показателей жирных кислот в плазме крови и эритроцитах у больных сахарным диабетом 2 типа ГЛАВА 5. МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ 84 НАРУШЕНИЯ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ И ГОМОГЕНАТАХ ПЕЧЕНОЧНОЙ ТКАНИ, СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ И КОЖИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ Заключение 90 114 ВЫВОДЫ 127 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 129 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3-ОП 3-оксипиридин GSH Восстановленный глутатион GSSG Окисленный глутатион HbAlc Гликированный гемоглобин АД Артериальное давление АДА Американская Диабетическая Ассоциация АДФ Аденозиндифосфат АКМ Активные кислородные метаболиты АОА Антиокислительной активности АОЗ Антиоксидантная защита АОС Антиоксидантная система АТФ Аденозинтрифосфат АФК Активные формы кислорода Г6ФДГ Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Г-SH Глутатион ГИ Гиперинсулинемия ГП Гидроперекиси ГПО Глутатионпероксидаза ГПП-1 Глюкагоноподобный пептид-1 ГР Глутатионредуктаза ГТ Глутатионтрансфераза ДАГ Диацилглицерол ДГК Докозагексаеновой кислоты ДК Диеновые конъюгаты ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота ДПН Диабетическая полиневропатия ДТНБК 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислота 6 ДЦ-КоА Длинноцепочечный ацил-КоА ЕАИД Европейской Ассоциации по изучению диабета ЖК Жирные кислоты ИБС Ишемическая болезнь сердца ИЗСД Инсулинзависимый сахарный диабет ИМТ Индекс массы тела ИНСД Инсулиннезависимый сахарный диабет ИР Инсулинорезистентность ИСА Инсулинсвязывающая активность КА Коэффициент атерогенности КМ Клеточная мембрана КПГ Конечные продукты гликирования КТ Каталаза ЛАЧ Лейкоцитарные антигены человека ЛП Липопротеин ЛПВП Липопротеины высокой плотности ЛПНП Липопротеины низкой плотности ЛПОНП Липопротеины очень низкой плотности МДА Малоновый диальдегид МННЖК Мононенасыщенные жирные кислоты НАДФ+ Никотинамиддинуклеозидфосфат НЖК Насыщенные жирные кислоты ННЖК Ненасыщенные жирные кислоты НЭЖК Неэстерифицированные жирные кислоты О Ожирение ОС Оксидативный стресс ОХ Общий холестерин ПКС Протеинкиназы С ПННЖК Полиненасыщенные жирные кислоты 7 ПОЛ Перекисное окисление липидов ПФП Пентозофосфатный путь РНК Рибонуклеиновая кислота СД Сахарный диабет СДГ Сукцинатдегидрогеназы СЖК Свободные жирные кислоты СОД Супероксиддисмутаза СРО Свободно-радикальное окисление ТАГ Триацилглицеролы ТБК Тиобарбитуровая кислота ТГ Триацилглицериды ТХУ Трихлоруксусная кислота УГ Утилизация глюкозы ФОН–α Фактор некроза опухоли-альфа ХДНБ 1-хлор-2,4-динитробензол ХС Холестерин цГМФ Циклический гуанозинмонофосфат ЦТК Цикл трикарбоновых кислот ЦХО Цитохромоксидаза ЭДТА Этилендиаминтетрауксусная кислота ЭПК Эйкозапентаеновой кислоты Эр Эритроцит ЭФЛ Эссенциальные фосфолипиды 8 ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Сахарный диабет (СД) является одной из самых важнейших не только медицинских, но и социальных проблем. Это обусловлено широкой распространенностью заболевания, самой ранней из всех хронических заболеваний инвалидизацией больных и высокой их смертностью (третье место после сердечно – сосудистой патологии и злокачественных новообразований), ранним выходом на инвалидность лиц молодого, трудоспособного возраста, а также большими экономическими затратами, связанными с заболеванием высококачественных препаратов Широкое [13,57,194]. инсулина и других применение сахароснижающих препаратов, существенно продлевающих жизнь больных, не обеспечивает полной компенсации нарушенного обмена веществ, и не предотвращает развитие многочисленных осложнений, среди которых основное место занимают поражения сердечно – сосудистой системы. Показано, что диабетические ангиопатии во многом определяют клиническое течение заболевания, его прогноз, являются основной причиной инвалидизации и смертности в промышленно- развитых странах. Большое число публикаций по вопросам патогенеза cосудистых поражений у больных СД до настоящего времени не дает целостного представления об этой сложной проблеме. На основании исследований отечественных и зарубежных диабетологов сформировалось представление о значительности роли нарушений обмена липидов в патогенезе диабета, в частности, диабетических осложнений. Поскольку основной причиной инвалидизации больных и летальности являются сосудистые осложнения СД, то усилия многочисленных научных лабораторий и учёных направлены на выяснение механизмов патогенеза этих нарушений [13]. Многочисленные исследования в этой области свидетельствуют о том, что повреждающее действие гипергликемии на сосудистую стенку опосредуется свободными радикалами. В связи с этим, в настоящее время широко ведутся исследования по изучению процессов свободнорадикального 9 окисления (СРО) при СД. При этом установлено, что в механизмах повышения окислительного стресса (ОС) при диабете участвует не только гипергликемия, но и гипоинсулинемия. Доказано, что хроническая гипергликемия через повышение скорости аутоокисления глюкозы увеличивает образование свободных радикалов, увеличивая процессы гликозилирования, приводит к избыточному образованию окисленных белков, а повышенная активность полиолового пути обмена глюкозы способствует истощению запасов НАДФН. Гиперинсулинемия активирует симпатическую нервную систему и опосредованное катехоламинами образование свободных радикалов, а через вызванное катехоламинами повышение уровня ненасыщенных жирных кислот дополнительно увеличивает образование свободных радикалов, и снижает уровень глутатиона (одного из важных водорастворимых антиоксидантов) [7,13,30,127,138,150, 190]. Таким образом, основной причиной повышенной смертности являются сосудистые осложнения СД. Однако патофизиологические механизмы, определяющие взаимосвязь между дислипидемией и развитием диабетических ангиопатий, окончательно не ясны. Хроническая гипергликемия через повышения скорости аутоокисления глюкозы увеличивает образование свободных радикалов, усиливая процессы гликозилирования, повышает уровни насыщенных жирных кислот, эти вопросы не до конца изучены. Имеющиеся литературные данные, посвященные изучению состояния перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) у больных с диабетом очень противоречивы и касаются лишь некоторых показателей системы «ПОЛ - АОС». Однако, несмотря на многочисленные исследования в области изучения обменных процессов при сахарном диабете, многие вопросы, связанные с особенностями нарушения липидного обмена, в том числе,обмена жирных кислот в эритроцитах, печени, сердечной мышце и коже у диабетических больных, остаются нерешенными. Целью исследования являлось исследование патогенетических механизмов нарушения липидного обмена при сахарном диабете и его 10 осложнениях в эксперименте (на модели стрептозотоцинового диабета) и клинике (при ишемической болезни сердца и других диабетических ангиопатиях). Для реализации цели поставлены следующие задачи: 1. Провести комплексное изучение углеводного и липидного статуса в эритроцитах, печени и коже у крыс на модели стрептозотоцинового диабета. 2. Изучить структурно - функциональные изменения в мембранах эритроцитов и гомогенатах сердечной мышцы, кожи и печени в разные сроки после введения стрептозотоцина в эксперименте. 3. Выявить особенности нарушения липидного обмена у диабетических больных с ангиопатиями по спектру жирных кислот крови и по изменению активности липопероксидации и антиокислительной защиты клеток. 4. Выявить взаимосвязи между нарушением обмена углеводов, изменением соотношения ПОЛ – АОЗ и развитием дислипидемии у больных с ангиопатиями, а также у пациентов без нарушений углеводного обмена, входящих группу риска по сахарному диабету (н.п. при ожирении). СТЕПЕНЬ НАУЧНОЙ НОВИЗНЫ. Проведен анализ клинических, лабораторных и экспериментальных данных с целью выявления взаимосвязи развития диабетических осложнений от степени развития окислительного стресса, от дислипидемии и нарушения обмена жирных кислот. Впервые проведено комплексное изучение углеводного и липидного статуса в эритроцитах, сердечной мышце, печени и коже у крыс на модели стрептозотоцинового диабета. Впервые проведено исследование параметров ПОЛ и системы антиоксидантной защиты в эритроцитах, гомогенатах кожи, печени и сердечной мышцы при экспериментальном стрептозотоциновом сахарном диабете и дана оценка роли жирных кислот в развитии перекисного окисления липидов. Впервые показано, что по мере нарастания степени гипергликемии при стрептозотоциновом диабете в эксперименте и снижения транспорта глюкозы в 11 клетки, гиперлипосинтетическая направленность метаболизма липидов играет важную роль в патогенезе формирования диабетических осложнений. Впервые проведено комплексное исследование процессов перекисного окисления липидов и антиокислительной системы у больных СД, включающих определение первичных и вторичных продуктов липидной пероксидации, изучение различных звеньев АОС, обладающих как внутриклеточной, так и внеклеточной направленностью действия. При этом обнаружено, что не только СД протекает с активацией процессов ПОЛ и нарушениями в системе антиоксидантной защиты, но отмечаются аналогичные нарушения и у пациентов с ожирением. Впервые проведено определение спектра жирных кислот у здоровых пациентов, пациентов с ожирением, больных сахарным диабетом типа 1 и СД типа 2 и дана развернутая хроматограмма жирных кислот. Впервые проведен анализ взаимосвязи нарушений спектра жирных кислот, процессов перекисного окисления липидов и утилизации глюкозы эритроцитами в зависимости от степени развития окислительного стресса у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов и у пациентов с ожирением, сопровождающимся инсулинрезистентностью. Установлено, что нарушения в спектре жирных кислот может привести к увеличению концентрации метаболитов ПОЛ и снижению утилизации глюкозы тканями и эти нарушения особенно выражены при СД 1 типа с осложнениями. Впервые установлено, что у больных женщин с ожирением сопровождающимся инсулинорезистентностью, а так же, как и при СД2 отмечаются качественно однотипные нарушения липидного, липопротеидного и углеводного обменов (повышение уровня ОХ, ТГ, ЛПНП, холестерина ЛПОНП, постпрандиальной глюкозы и др.). Дислипидемия при ожирении и СД2 имеет атерогенный характер. СД 2 обусловленный дисбалансом ПОЛ-АОА сопровождается более высокой концентрацией переокисленных липопродуктов, снижением параметров антиоксидантных систем и утилизации глюкозы клетками. Ожирение и СД 2 сопровождаются модификацией состава 12 свободных и эcтерифицированных ЖК плазмы крови, что может привести к изменению функциональной активности мембран клеток, следовательно, и понижению функциональной активности инсулин - зависимых транспортеров глюкозы. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Полученные данные могут иметь научно–практическое значение, так как дислипидемия и нарушения в обмене жирных кислот и антиоксидантной защитыв эритроцитах могут отражать метаболическую ситуацию во всем организме, что может быть использовано с целью своевременной диагностики и предупреждении диабетических осложнений. Полученные результаты исследования убедительно свидетельствуют о важной роли ЖК и их метаболитов в развитии окислительного стресса при СД 2, что необходимо учитывать при разработке и выборе соответствующих профилактических и терапевтических мероприятий, направленных на предотвращение или устранение выявленных нарушений. Изучение механизмов нарушения липидного обмена, модификации состава жирных кислот и дисбаланса в процессах перекисного окисления липидови АОС при СД повышает возможности профилактики осложнений заболевания и позволяет предложить новый подход к коррекции нарушений липидного обмена у больных. Выявленные изменения позволят выделить группу больных высокого риска по развитию сахарного диабета и сосудистых осложнений, в которой необходимо проводить профилактические мероприятия для предупреждения развития данных осложнений (нормализация веса, снижение активности свободнорадикальных процессов и др.), что может способствовать снижению затрат на лечение осложнений сахарного диабета. ОСНОВНЫЕ НАУЧНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 1. В экспериментев динамике показано, что метаболические нарушения, усиление процессов ПОЛ, изменения структурно-функциональных свойств 13 эритроцитарных мембрани других тканей, а также нарушения в системе антиоксидантной защиты, происходят уже в дебюте стрептозотоцинового диабета и остаются таковыми на протяжении всего периода исследования. 2. При СД 2 типа наблюдается более выраженное нарушение в липидном спектре крови и обмене жирных кислот, увеличение уровня первичных продуктов ПОЛ, снижение содержания активности всех исследуемых ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы, кроме глутатионпероксидазы) и в результате этого снижение утилизации глюкозы клетками, по сравнению с группой с ожирением и контролем. Развитие осложнений при СД 1 и СД 2 сопровождается более выраженным нарушением в обмене жирных кислот с повышением суммарного содержания НЖК, плазменного уровня МДА и снижением активности СОД, по сравнению с соответствующими показателями без осложнений. 3. Ожирение и СД 2 сопровождаются модификацией состава свободных и эстерифицированных ЖК плазмы крови, что может привести к изменению функциональной активности мембран клеток, следовательно, и понижению функциональной активности инсулиновых рецепторов и других инсулин – зависимых транспортеров глюкозы. Полученные результаты исследования убедительно свидетельствуют о важной роли ЖК и их метаболитов в развитии окислительного стресса при ожирении СД 1 типа и СД 2 типа, что необходимо учитывать при разработке и выборе соответствующих профилактических и терапевтических мероприятий, направленных на предотвращение или устранение выявленных нарушений. АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ Основные положения работы доложены и обсуждены на конференции "Научная молодежь на пороге XXI века", Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных “Научная молодежь на пороге XXI века”. ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации опубликованы в 8 печатных работах, из которых 5 по перечню ВАК. 14 ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 150 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, изложения и обсуждения результатов исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы (228 источников, в том числе 112 иностранных). Работа содержит хроматограммами. 15 таблиц и проиллюстрирована 21 рисунками и 15 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Этиология и патогенез сахарного диабета и сосудистых осложнений 1.1.1. Этиология сахарного диабета Сахарный диабет - заболевание, обусловленное относительным или абсолютным дефицитом гормона поджелудочной железы - инсулина в организме. Различают генетически и не генетически обусловленные формы сахарного диабета. Наследственный диабет в зависимости от патогенеза может быть разделен условно на две группы: инсулинзависимый (типа 1) и инсулиннезависимый (типа 2). При СД типа 1 существует главная генетическая система, называемая лейкоцитарным антигеном человека (ЛАЧ) (В8, В18, ВW15, DW3, DW4, DRW3 и т.д.)[220]. Генетическая предрасположенность бета - клеток к повреждению реализуется с участием факторов внешней среды. Под влиянием некоторых вирусов (краснухи, эпидемического паротита, коксаки) может происходить избирательное повреждение бета - клеток островков Лангерганса. Существует мнение, что вирусы поражают носителей определенных ЛАЧ-антигенов, находящихся на мембране органов-мишеней, или в результате сходства структур их молекул, или вследствие того, что ЛАЧ выступают в роли рецепторов для вирусов [68,101]. У большинства больных СД типа 1 на ранних этапах его развития (до 1 года) обнаруживают изменения в островках Лангерганса - "инсулиты" (инфильтрация лимфоцитами). Предполагают, что "инсулиты" обусловлены предшествующей вирусной инфекцией + аутоиммунным процесом в железе. СД типа 1 развивается наиболее часто в критические периоды максимального роста, гормональной, иммунологической и других видов перестройки организма, которые соответствуют возрастным периодам жизни. Основной пик заболевания приходится на 11 лет, несколько меньше пики в 5-7 лет и 21-23 года [114]. В отличие от СД типа 1 при инсулиннезависимом сахарном диабете (СД типа 2) более отчетлива генетическая предрасположенность. При СД типа 2 все 16 монозиготные близнецы являются конкордантными. На повышенный риск развития СД типа 2 указывают следующие факторы:наличие СД типа 2 у родителей; рождение ребенка с массой более 4 кг; ожирение; подверженность стрессам и вирусным инфекциям [114]. Наблюдения показывают, что далеко не всегда генетическая предрасположенность трансформируется в клиническую форму сахарного диабета. Благоприятные социальные условия могут предотвратить заболевание даже при отягощенной по диабету наследственности. Сахарный диабет возникает также вследствие заболеваний поджелудочной железы: острые и хронические панкреатиты, опухоли, кистовидное перерождение, кальцинирующий фиброз, панкреатоэктомии и т.д. У лиц, предрасположенных к сахарному диабету, его развитию могут способствовать эндокринные заболевания (диффузный токсический зоб, болезнь Иценко-Кушинга, стероидный сахарный диабет); длительный прием лекарственных препаратов, влияющих на углеводный обмен (диуретики, кортикостероиды, пероральные контрацептивы и др.); употребление продуктов, содержащих токсические вещества, непосредственно поражающие бета клетки поджелудочной железы (алкоголь), а также белковое голодание [114]. 1.1.2. Патогенез сахарного диабета 1.1.2.1. Патогенез сахарного диабета типа 1 Отправным моментом в развитии СД типа 1 является массивное разрушение эндокринных клеток поджелудочной железы (островков Лангерганса) и, как следствие, критическое снижение уровня инсулина в крови[80]. Массовая гибель эндокринных клеток поджелудочной железы может иметь место в случае вирусных инфекций, онкологических заболеваний, панкреатита, токсических поражений поджелудочной железы, стрессовых состояний, различных аутоиммунных заболеваний, при которых клетки иммунной системы вырабатывают антитела против β - клеток поджелудочной железы, разрушая их. Этот тип диабета, в подавляющем большинстве случаев, характерен для детей и лиц молодого возраста (до 40 лет). 17 У человека это заболевание зачастую является генетически детерминированным и обусловленным дефектами ряда генов, расположенных в 6-й хромосоме. Эти дефекты формируют предрасположенность к аутоиммунной агрессии организма к клеткам поджелудочной железы и отрицательно сказываются на регенерационной способности β- клеток [80]. В основе аутоиммунного поражения клеток лежит их повреждение любыми цитотоксическими агентами. Данное поражение вызывает выделение аутоантигенов, которые стимулируют активность макрофагов и Т- киллеров, что в свою очередь, приводит к образованию и выделению в кровь интерлейкинов в концентрациях, оказывающих токсическое действие на клетки поджелудочной железы. Также клетки повреждаются находящимися в тканях железы макрофагами. Также провоцирующими факторами могут являться длительная гипоксия клеток поджелудочной железы и высокоуглеводистая, богатая жирами и бедная белками диета, что приводит к снижению секреторной активности островковых клеток и в перспективе к их гибели. После начала массивной гибели клеток запускается механизм их аутоиммунного поражения[80]. 1.1.2.2. Патогенез сахарного диабета 2-го типа Самым важным пусковым внешним фактором (триггером), который реализует генетическую склонность к СД 2-го типа, является нарушение пищевого поведения с избыточным употреблением насыщенных жиров, преимущественно класса омега-6 и омега-9 свободных жирных кислот (СЖК). По своей сути СД 2-го типа - болезнь, развивающаяся вследствие неправильного питания предрасположенности. (образажизни) Известно огромное на фоне количество генетической генов, которые кодируют СД 2-го типа (например, HNFs (hepatocyte nuclear factor), PPARG (Peroxisome proliferator activated receptor gamma), IPF-1, IB1 (islet-brain-1), TIEG2/KLF11 (transforming growth factor-beta-inducible early gene/Krueppel-like factor 11) и предопределяют склонность и к дислипидемиям [149]. Так, HHEX (hematopoietically expressed homeobox) контролирует деятельность 18 панкреатических структур [187], SLC30A8 (solute carrier family 30, member 8) — транспорт цинка в островковых β - клетках; активация FSADS1 и PPARG приводит к изменению метаболизма жиров, IGF2BP2 (insulinlike growth factor 2 mRNA binding protein 2) и FTO (fat mass and obesity associated) - к ожирению и инсулинрезистентности [218], TCF7L2 (transcription factor 7 like 2) - к общему снижению секреторного ответа; DGKB (Diacylglycerol kinase beta), FADS1 (Fatty Acid Desaturase 1), ГКК (Глюкокиназа), MTNR1B (Melatonin receptor 1B) мешают осуществлению 1-й фазы секреции инсулина; WFS1(Wolfram syndrome 1) отвечает за апоптоз β – клеток [210]. По утверждению Американской диабетической ассоциации (АДА) и Европейской ассоциации по изучению диабета (ЕАИД) по стратегии лечения СД 2-го типа, увеличение уровня гликемии обусловлено преобладанием поступления глюкозы в плазму крови над ее высвобождением [173]. При этом гипергликемия натощак, особенно утренняя, обусловлена избыточным образованием глюкозы в печени, а постпрандиальная гипергликемия - преимущественно недостаточным угнетением образования глюкозы и слабым секреторным ответом, т.е. дисфункцией панкреатических бета-клеток. Таким образом, в основе СД 2-го типа лежат несколько важных нарушений, главными из которых являются: 1) Избыточное образование глюкозы в печени. 2) Дефект секреции инсулина (базальная компенсаторная гиперинсулинемия и снижение выброса инсулина после приема пищи). 3) Инсулинорезистентность на фоне гипертриглицеридемии. Известными механизмами нарушения утилизации глюкозы являются: 1) Увеличение уровня глюкагона. 2) Повышение уровня глюкозозависимого инсулинотропного полипептида. 3) Постпрандиальный дефицит глюкагоноподобного пептида 1 (ГПП-1), которые также требуют медикаментозной коррекции. Продукция глюкозы печенью (глюконеогенез) преимущественно происходит в ночное время суток за счет съеденных за день жиров - свободных 19 жирных кислот, их накопления и окисления в печени. В самом начале развития СД 2-го типа СЖК активируют глюконеогенез, затем стимулируют позднюю секрецию инсулина, которая ингибирует эндогенную продукцию глюкозы. Компенсаторными механизмами, которые сдерживают влияние повышенных уровней СЖК, являются гиперинсулинемия и, сама гипергликемия, направленные на поддержание утилизации глюкозы в чувствительных к инсулину тканях (мышцы, печень, жировая ткань). Однако длительное существование избытка СЖК приводит к усилению инсулинорезистентности, истощению инсулярного ответа и, в конечном счете, к стойкой гипергликемии. Еще одним эффектом, опосредованным СЖК, является ингибирование окисления углеводов, т.е. снижение утилизации глюкозы и увеличение ее концентрации в крови [163]. На ранних стадиях заболевания образование проинсулина, образующихся из него инсулина и С-пептида не нарушено или даже увеличено. Одновременно наблюдается два процесса - базальная гиперинсулинемия (за счет избытка СЖК) и слабый инсулярный ответ на пищевые стимуляторы, нарушены как первая (быстрая) фаза секреции инсулина, так и вторая (поздняя). Появились данные о том, что в основе β-клеточной дисфункции также лежит исходный генетический дефект [163]. Секреторный инсулиновый дефект усиливается как из-за токсического воздействия свободных жирных кислот (липотоксичности) на панкреатические β-клетки, так и из-за развития гипергликемии (глюкозотоксичности), поэтому коррекция таких нарушений способствует эффективному восстановлению или сохранению эндокринной функции поджелудочной железы [164]. 1.1.3. Патогенез диабетических ангиопатий Распространенность заболеваемости сахарным диабетом (СД) прогрессивно увеличивается во всех странах мира. По данным ВОЗ, на январь 2010 г. насчитывалось 285 млн пациентов с СД, и, к 2030 г. это число достигнет 438 млн, при этом более 90% составят лица с СД 2 типа [172]. В России в 2010 г., по данным регистра, зарегистрировано 2 822634 пациента с СД 2 типа. В 20 настоящее время СД занимает третье место среди непосредственных причин смерти после сердечно – сосудистых и онкологических заболеваний. Основной причиной летальности у этих пациентов является развитие макрососудистых осложнений (поражение коронарных, церебральных и периферических артерий в результате развития атеросклеротических процессов) [35]. Одним из главных веществ, синтезируемых эндотелием, является оксид азота (NO), который является основным фактором, определяющим сосудистый тонус [192] за счет стимуляции гуанилатциклазы и увеличения внутриклеточной концентрации циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), и снижения внутриклеточной концентрации Ca2+, и тем самым вызывая вазодилатацию [206]. При СД гипергликемия, инсулинорезистентность, окислительный стресс, дислипидемия приводят к развитию эндотелиальной дисфункции и прогрессированию атеросклероза [179]. Усиленное разрушение оксида азота свободными радикалами кислорода в эндотелии сосудов, нарушение реологических свойств крови, гемостаза, приводят к повышению функции вазоконстрикторов [174]. При СД происходит процесс гликозилирования белков – это способность глюкозы взаимодействовать с аминогруппами с образованием веществ, которые, вступая в химические реакции, образуют необратимые соединения. Количество конечных продуктов гликирования (КПГ) прямо пропорционально уровню глюкозы в крови, и даже умеренное повышение гликемии (7–8 ммоль/л) приводит к достоверному их увеличению. КПГ взаимодействуют с белками базальной мембраны, что приводит к ее утолщению и нарушению функции (снижению эластичности сосудистой стенки, уменьшению ответа на действие оксида азота). Накапливаясь в тканях, КПГ приводят к образованию свободных радикалов кислорода и увеличивают окислительный стресс. КПГ в плазме способствуют формированию окисленных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), которые с легкостью проходят в субэндотелий и участвуют в атерогенезе [126,167]. Взаимодействие КПГ со своими рецепторами ведет к увеличению тромбомодулина и также активирует рецепторы для 21 интерлейкина–1, фактора некроза опухоли альфа (ФОН–α) и ростовых факторов, что приводит к миграции и пролиферации гладкомышечных клеток [167]. Еще одним механизмом формирования сосудистых осложнений на фоне гипергликемии является активация полиолового пути окисления глюкозы под воздействием фермента альдозоредуктазы. В норме этот фермент инактивирует токсические альдегиды алкоголя. В результате этого глюкоза под воздействием альдозоредуктазы превращается в сорбитол, что приводит к истощению NADPH. NADPH – коэнзим, который играет важную роль в регенерации антиоксидантных молекул (глутатиона, токоферола) и, кроме того, является необходимым компонентом NO–синтазы, образующейся в эндотелиальных клетках и необходимой для синтеза NO [5]. Истощение NADPH приводит к ослаблению антиоксидантной защиты, образовавшийся сорбитол, в свою очередь, медленно метаболизируется, накапливается в клетке и приводит к дисбалансу в клеточном гомеостазе [5]. Увеличение превращения сорбитола во фруктозу под действием сорбитолдегидрогеназы приводит к повышению синтеза диацилглицерола (ДАГ). В настоящее время многие авторы рассматривают окислительный стресс, индуцированный гипергликемией, основным механизмом повреждения βклеток ипрогрессированием СД [135,199,201]. Окисление глюкозы при этом приводит к образованию частиц активного кислорода (ROS): супероксида (•O2-), гидропероксила (•HRO2-), гидроксил радикала (•OH), пероксид радикала(•RO2). Также образуются частицы активного азота: окись азота (•NO), нитроген диоксид (•NO2-), пероксинитрит (ONOO-) [11]. В условиях СД образование активных форм кислорода происходит за счет множества процессов: 1. Активация полиолового пути окисления глюкозы приводит к истощению NADPH, что, в свою очередь, снижает активность глутатиона – важного антиоксиданта [186]. 22 2. Повышенное количество диацилглицерола [203]. 3. Образование конечных продуктов гликирования (КПГ) приводит к продукции активных форм кислорода продукции (АФК) [166]. 4. Активация NADFH оксидазы в эндотелиальных и гладкомышечных клетках, как известно, является одним из самых важных источников АФК. Избыточное образование супероксидных и гидроксильных радикалов инициирует окисление ЛПНП, которые приобретают более высокий атерогенный потенциал. При постоянной гипергликемии более губительными являются колебания уровня глюкозы, отмечаемые у пациентов с СД [202]. Наличие при сахарном диабете 2–го типа артериальной гипертензии, гиперхолестеринемии, дислипидемии, инсулинорезистентности и гиперинсулинемия в конечном итоге приводят к ишемической болезни сердца [216]. 1.2. Нарушение обмена веществ при СД Инсулин - самый мощный сахароснижающий анаболический гормон, принимающий участие в процессе обмена веществ и обеспечивающий жизнедеятельность организма. Это гормон немедленного действия, быстро синтезируется и секретируется. Весь процесс синтеза занимает около 1 часа. Общее количество накопленного в островках инсулина составляет приблизительно 200 ЕД, скорость синтеза у взрослого человека - 30 ЕД в сутки. Инсулин и С-пептид выделяются в систему воротной вены и поступают в печень. Биологическое действие инсулина заключается в регуляции метаболических реакции (обмен углеводов, жиров и белков) и митогенных процессов (процессов роста, дифференцировки тканей, синтеза ДНК, транскрипции генов) [154]. Инсулин стимулирует белоксинтезирующую активность клеток путем увеличения образования всех типов РНК и активирования связывания аминокислот с т-РНК. Клинические проявления СД обусловлены нарушениями различных видов метаболизма: углеводного, 23 липидного, белкового и водно-солевого, что связано с функциональными изменениями в геноме и белок - синтезирующем аппарате клеток [10]. Основная причина большинства проявлений СД – абсолютный дефицит инсулина в случае СД 1 типа или недостаточное его действие и/или неадекватная секреция, а также недостаточное действие гормона на периферии. Основой нарушений метаболизма углеводов, жиров, белков при диабете является недостаточность действия инсулина в тканях-мишенях [130]. Возникающая гипергликемия, блокирует углеводный обмен. В жировой ткани, скелетных мышцах, миокарде затрудняется активный транспорт глюкозы из крови и внеклеточной жидкости внутрь клеток. Замедление поглощения глюкозы этими тканями, депонирующих ее в нормальных условиях жизнедеятельности в мышцах в форме гликогена или в жировой ткани в виде липидов, существенно отражается на энергетическом обеспечении всего организма [71]. В норме клетки печени свободно проницаемы для глюкозы, а скорость ее поступления в клетку фосфорилирования, зависит которое от скорости осуществляется ее внутриклеточного высокоспецифичной глюкокиназой. При недостатке инсулина в первую очередь тормозится глюкокиназная реакция (гексокиназа) и тем самым затрудняется первый этап усвоения молекулы глюкозы - её фосфорилирование. Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ. Глюкокиназа обеспечивает утилизацию глюкозы при более высоких концентрациях в клетках. Торможение биосинтеза этих ферментов, вовлекающих глюкозу в энергетический обмен клеток, приводит к нарушению дальнейших этапов метаболизма [81]. Инсулиновая недостаточность приводит к нарушению всех видов обмена веществ. Не достаток инсулина проявляется в нарушении транспорта глюкозы из периферического сосудистого русла в клетки инсулинзависимых тканей. В результате в организме развивается состояние недостатка энергии, в силу чего активируются все катаболические процессы. Это приводит к существенному повышению концентрации глюкагона в крови - антагониста инсулина. 24 Поскольку инсулин больше не сдерживает процессы, которые глюкагон стимулирует в печени, продукция глюкозы (в результате распада гликогена и глюконеогенеза) резко усиливается. В то же время утилизация глюкозы печенью, мышцами и жировой тканью снижается. Гипергликемия нарастает также и из-за повышения уровней других контринсулярных гормонов кортизола, адреналина и гормона роста. Увеличение содержания глюкозы в крови выше почечного порога (7-9 ммоль/л) вызывает глюкозурию, которая сопровождается полиурией, так как избыток глюкозы при выведении с мочой по законам осмоса увлекает за собой большое количество жидкости. Дефицит глюкозы в клетках приводит к более интенсивному использованию в качестве источника энергии липидов. Всё количество образующегося при этом ацетилКоА не способно использоваться в ЦТК, к тому же скорость потребления ацетил-КоА в данном цикле падает в связи с уменьшением количества промежуточных продуктов обмена углеводов, которые в норме активируют начальные процессы ЦТК. При этом часть ацетил-КоА встраивается в цикл Кребса, где происходит его окисление до ацетоацетата и β-оксибутирата [29]. Накопление кетоновых тел в организме приводит к метаболическому кетоацидозу. Компенсаторно организм пытается снизить содержание в крови продуктов, вызвавших закисление внутренней среды, и выводит их с мочой (кетонурия) и выдыхаемым воздухом. Поскольку органические анионы ацетоуксусной и β-гидроксимасляной кислот связаны с ионами Na+ и К+, происходит их выведение с мочой, а почечные канальца пытаются заменить утраченные ионы катионами и реабсорбируют Н+ и ионы NH4. Нарастающий ацидоз компенсируется за счет буферных систем, в частности гидрокарбоната Na. По мере нарастания ацидоза и истощения емкости буферных систем развивается некомпенсированный метаболический ацидоз, приводящий к компенсаторной гипервентиляции легких, что способствует дополнительной потери жидкости через легкие [29,72]. Недостаток инсулина усиливает также катаболизм белков организма. Включение образовавшихся, при этом аминокислот в глюконеогенез ведёт, во- 25 первых, к усугублению гипергликемии, во-вторых, к потере аминокислот и нарушению синтеза белка и, в-третьих, к росту синтеза мочевины и, как следствие, к отрицательному азотистому балансу. Наиболее опасным последствием описанных нарушений может быть наступление диабетической комы. Её возникновение связано с развитием гиперосмотической дегидратации в связи с выделением с мочой большого количества растворимых веществ глюкозы, кетоновых тел, азотсодержащих соединений и натрия. Клеточная дегидратация с поражением функций мозга ведёт к развитию диабетической комы [71,81]. При диабете наблюдается усиление процесса неферментативного гликозилирования. Это весьма распространенный вид посттрансляционной модификации белков, который может протекать в тканях здоровых людей, но с большей скоростью происходит у "гипергликемических" лиц. При этом глюкоза (или другой моносахарид) связывается ковалентно с NH2-группами некоторых аминокислот. Такая модификация отмечается для многих белков, включая гемоглобин (Нb), белки мембраны эритроцитов, белки хрусталика глаза, коллаген, альбумин, фибриноген, инсулин, трансферрин, глобулины, миелины, а также все классы липопротеинов. Важно отметить, что гликозилированный гемоглобин связывает необратимо кислород, ухудшая его доставку тканям. Неферментативное гликозилирование может изменять некоторые физические и функциональные свойства белков и таким образом играть существенную роль в развитии диабетических осложнений [97]. Основной механизм повреждения тканей гликозилирование белков, т.е. не ферментативная реакция глюкозы со свободными аминогруппами белковой молекулы (Лиз, Арг, N-концевая аминокислота). Вначале образуется нестабильная альдиминовая группировка, которая может превращаться в ряд других, более стабильных соединений («ранние продукты гликозилирования»). При этомфункции белканарушается в результате изменения заряда белковой молекулы, ее конформации или блокирования активного центра. Гликозилирование - медленная реакция, в 26 тканях здоровых людей обнаруживаются лишь небольшие количества гликозилированных белков. При гипергликемии реакция существенно ускоряется. Например, у больных диабетом в состоянии гипергликемии содержание одного из гликозилированных гемоглобинов - HbAlc - в течение 2 3 нед увеличивается в 2 - 3 раза. Степень гликозилирования разных белков неодинакова; в основном она зависит от скорости обновления данного белка. Вследствие недостатка инсулина происходит недостаточное использование глюкозы инсулинозависимыми тканями, в первую очередь печенью, мышечной и жировой. А в инсулиннезависимых тканях (эндотелии сосудов глаз и почек, нервной ткани) усиливается превращение глюкозы по полиоловому пути утилизации глюкозы - сорбитоловому, в котором глюкоза восстанавливается до многоатомного спирта сорбитола с последующим его окислением во фруктозу. Ферменты, регулирующие эти реакции, не чувствительны к инсулину и поэтому их активность полностью определяется доступностью субстратов. Следовательно, при увеличении концентрации глюкозы возрастает и скорость продукции сорбитола и фруктозы. Ферментом, лимитирующим скорость этих двух последовательных реакций, служит сорбитолдегидрогеназа, в связи с чем, сорбитол накапливается в тканях в больших количествах, чем фруктоза. В физиологических условиях скорость функционирования сорбитолового пути незначительна (до 1%). Однако при диабете интенсивность этого пути значительно возрастает (до 10%).Так как сорбитол является активным осмотическим веществом, то развивается выраженный гиперосмолярный отек [145]. В результате происходит гидратация клеток с накоплением ионов Na + и одновременной потерей ионов К+. Накопление сорбитола в клетках сопровождается уменьшением в них уровня миоинозитола - важнейшего предшественника фосфолипидных компонентов клеточных мембран. Активность гликозилирования белков и сорбитолового пути не регулируется гормонами и зависит только от уровня глюкозы в крови. Доказано накопление в высоких концентрациях сорбитола и фруктозы при сахарном диабете у человека в эритроцитах, хрусталике, спинномозговой жидкости, нервах, т.е. 27 именно в тех тканях, в которых развиваются диабетические осложнения. Эти соединения не способны диффундировать через клеточную мембрану, что является биохимической основой развития таких осложнений СД как ретинопатии, полинейропатии и нефропатии [36,162]. Таким образом, при СД нарушаются все виды обмена веществ. Особенно страдает углеводный обмен, что характеризуется гипергликемией (отмечается усиление гликогенолиза и глюконеогенеза, торможение пентозофосфатного пути). Изменение липидного обмена проявляется стимуляцией липолиза, усилением β - окисления жирных кислот и образования ацетил-КоА, повышением биосинтеза кетоновых тел и холестерина. Изменения в белковом обмене проявляется увеличением распада белков, увеличением синтеза мочевины и нарушением биосинтеза гликопротеинов. 1.2.1. Нарушение обмена липидов при сахарном диабете Одной из наиболее характерных особенностей дефицит инсулина является быстрой мобилизации жирных кислот из жировой ткани. При СД типа 1 повышенный уровень липолиза при инсулиновой недостаточности является совместным результатом отсутствия инсулина и резистентности клеток и тканей к инсулину. Одним из последствий чрезмерной мобилизации жирных кислот при СД типа 1 является производство кетоновых тел (ацетоуксусной, 3оксибутират и ацетон) в печени. Жирные кислоты в митохондриях гепатоцитов преобразовываются либо в их КоА- эфиры, либо этерифицируются в глицеролипидыили окисляется до ацетил-КоА. Значительная часть ацетил КоА может преобразоваться в ацетоуксусную кислоты и 3- гидроксибутират. Скорость переноса жирных ацильных группв митохондрии регулируется активностью карнитин-пальмитоилтрансферазы I (EC 2.3.1.21), которая во внутренней митохондриальной мембраны митохондриального окисления катализирует первую стадию жирных кислот. Карнитин- пальмитоилтрансферазы I регулируется малонилом - КоА (промежуточный продукт в синтезе жирных кислот), и она также регулируется механизмом фосфорилирования. При недостаточности инсулина, скорость синтеза жирных 28 кислот в печени снижается и, следовательно, концентрацию малонил-КоА также уменьшается, и сродство карнитин - пальмитоилтрансферазы для малонил-КоА также уменьшается [40,136]. Повышение уровня триглицеридов плазмы у больных сахарным диабетом, как правило, связаны с ЛПОНП, и в меньшей степени ЛПНП и ЛПВП [136,214]. 1.2.2. Патогенез нарушений липидного обмена при СД 2 типа Основными характеристиками дислипидемии при СД 2 типа являются повышение уровня триглицеридов в составе липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и снижение уровня холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП). Концентрация холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП) у больных СД практически не отличается от таковой у лиц без данного заболевания, однако у пациентов с СД 2 типа преобладает фракция мелких плотных ЛПНП, обладающих повышенной атерогенностью вследствие высокой способности к окислению. Количественные изменения липидного спектра могут встречаться изолированно, но чаще они сочетаются и носят название липидной триады или атерогенной дислипидемии. Основной причиной гипертриглицеридемии при СД 2 типа является низкая чувствительность висцеральной жировой ткани к антилиполитическому действию инсулина, что ведет к повышенному липолизу, поступлению большого количества свободных жирных кислот в портальный кровоток и, в сочетании с гиперинсулинемией, повышению синтеза триглицеридов и ЛПОНП печенью. Кроме этого, у больных СД 2 типа при гипергликемии снижена активность эндотелиальной липопротеинлипазы, ответственной за катаболизм. Помимо количественных, при СД 2 типа имеют место также качественные изменения липидного спектра: при гипергликемии возрастает доля гликированных ЛПНП, в том числе мелких плотных ЛПНП, обладающих повышенной атерогенностью в связи с высокой способностью к окислению и накоплению в артериальной стенке, а также к замедленному клиренсу и длительному нахождению в плазме. В свою очередь, гликирование и окисление 29 ЛПВП также ведет к снижению их антиатерогенных свойств [121,123]. При диабете 2 типа, ткани не в состоянии адекватно реагировать на инсулин, что приводит к накоплению избыточной энергии глюкозы в жировой ткани,а также в таких областях, как печень, скелетные мышцы и др.. Особенностью липидного спектра при СД-2 является развитие «липидной триады», что включает увеличение концентрации триглицеридов, снижение уровня холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и преобладание в крови мелких плотных частиц липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) фенотипа В припограничных значениях ХС ЛПНП [169]. Такое состояние является следствием следующих событий: в результате инсулинорезистентности и недостаточной секреции инсулина нарушается постпрандиальная регуляция липидов, повышается уровень свободных жирных кислот (СЖК) в крови, увеличивается выработка липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) печенью и снижается их гидролиз липопротеинлипазой, что приводит к росту количества богатых триглицеридами циркулирующих липопротеидных частиц [117]. Вторично снижается концентрация ХС ЛПВП из-за повышенного переноса эфиров ХС из ЛПВП в ЛПОНП и хиломикроны в обмен на триглицериды. Мелкие плотные ЛПНП характеризуются повышенной окисляемостью, в условиях окислительного стресса, характерного для СД-2, эта способность выражена еще ярче. Активизируемые мелкими плотными ЛПНП, макрофаги захватывают окисленные мелкие плотные ЛПНП и превращаются в обогащенные холестерином «пенистые» клетки [3,118]. Кроме того, некоторые исследователи также обнаружили эффекты липидного обмена на уровень глюкозы в крови. Установлено, что при диабете у лиц с нормальным весом введение инсулина приводит к увеличению концентрации глюкозы в чувствительных тканях к инсулину, ингибированию липолиза и снижению уровней свободных жирных кислот в сыворотке. Показано также, что в организме человека свободные жирные кислоты ухудшают инсулин – опосредованное поглощение глюкозы [215]. Например, при увеличении количества свободных жирных кислот происходит их 30 этерификация в триглицериды и фосфолипиды, возрастает концентрация липопротеинов низкой плотности (ЛПОНП) и кетоновых тел. ЛПОНП являются эндогенно основными переносчиками триглицеридов. Существует корреляция стимулируемым инсулином усвоении глюкозы и концентрации ЛПОНП в плазме, а также между скоростью секреции триглицеридов в печении триглицеридов в плазме крови [158,159]. 1.3. Нарушение обмена жирных кислот при сахарном диабете Нарушение липолитических процессов с образованием жирных кислот играет важную роль в этиологии ожирения и сахарного диабета 2 типа. Существует доказательство, что катехоламин - опосредованный липолитических ответ играет определенную роль в развитии и поддержании жирных кислот в жировой ткани. Кроме того, нарушение поглощения НЭЖК жировой тканью после приема пищи также является важнейшим фактором, определяющим концентрацию в плазме НЭЖК. Кроме того, есть данные свидетельствующие о резистентности к инсулину мышц с пониженной способностью к окислению жирных кислот [4]. Дисбаланс между поглощением жирных кислот и окислением их в свою очередь может быть фактором, способствующим накоплению липидов и триглицеридов в скелетных мышцах [129]. Ожирение и сахарный диабет 2 типа часто встречаются вместе, что свидетельствует об общих патогенетических механизмах этих патологии. Оба эти состояния характеризуются резистентностью к инсулину, нарушением промежуточного метаболизма углеводов и жиров, увеличением массы жировой ткани и резерва триацилглицеридов в жировой и мышечной тканях [129]. Было высказано предположение, что длинноцепочечный ацил-КоА (ДЦКоА) может непосредственно модулировать активность ферментов, таких как протеинкиназы С (ПКС) [157,175]. Активация ПКС стимулирует индуцированную глюкозой секрецию инсулина в клетках, продуцирующих инсулин [143]. Кроме того, ДЦ- КоА модулируют активность определенных 31 ионных каналов,ингибируют секрецию инсулина,тем самым предотвращая закрытие калиевых каналов АТФ [224], предотвращают деполяризацию мембраны, которая необходима для запуска экзоцитоза инсулина. Кроме глюкозы, свободные жирные кислоты (СЖК) также являются стимуляторами секреции инсулина.Известно, что в большей частью СЖК индуцированная секреция инсулина опосредовано через ДЦ - КоА [209]. Высокий уровень плазменных СЖК при ожирении, приводят к развитию диабета. Это подтверждается экспериментальными исследованиями указывающими нанарушении толерантности к глюкозе и сахарному диабету 2 типа вследствии повышения уровней СЖК [219]. Установлено также, что СЖК стимулируют секрецию инсулина [180], но хроническое повышение уровней этих кислот может привести к уменьшению количества и функции β-клеток, т.е. они становятся липотоксичными [219]. Панкреатический β - клетки имеют низкую антиоксидантную защиту и, таким образом, подвержены к токсическому воздействию активных форм кислорода (АФК) [189,197]. Окислительный стресс приводит к нарушению секреции инсулина из-за глюкозотоксичности, который во многом аналогична липотоксичности [199]. 1.4. Механизмы образования свободных радикалов Кислород является необходимым элементом для поддержания жизни любого организма и нормального обмена веществ. Однако кислород может быть источником свободных радикалов - молекул с неспаренными электронами, что придает таким молекулам повышенную реакционную способность. Свободные радикалы могут возникать в организме в избыточном количестве вследствие курения, под воздействием различных внешних химических веществ, гипероксии, избыточного потребления жиров и углеводов, а также при недостаточном их расходовании, при гиподинамии с низким уровнем биологического ферментативного окисления и сопровождаться снижением восстановления пиридиннуклеотидов и тд. [25]. 32 Свободные радикалы или супероксиды образуются с участием клеточных оксидазных систем, ксантиноксидазы и НАД/НАДФ оксидазы в организме при обмене веществ, в процессе которого происходит их генерация. Окислительные процессы в организме связаны с использованием кислорода по двум путям: оксидазному и оксигеназному. Оксидазный или основной путь сопряжен с образованием и ресинтезом АТФ, который и является главным источником энергии. При этом не происходит включение кислорода в молекулу окисляемого субстрата, а присоединение к молекулярному кислороду (О2) 4-х электронов приводит к образованию воды. Окисление энергетических субстратов реализуется конечным звеном дыхательной цепи - цитохромоксидазой. Оксигеназный путь характеризуется включением 1 или 2-х атомов кислорода в молекулу окисляемого субстрата, что, в основном, происходит в системе микросомального окисления, содержащей цитохром Р-450 [100]. Генерация свободнорадикальных частиц биологическими системами играет существенную роль в ходе важных физиологических и патологических процессов [54]. Свободные радикалы участвуют в переносе электрона флавиновыми элементами, обновлении состава липидов биомембран, окислительного фосфорилирования в митохондриях, митогенезе, проведении нервного импульса и тд. В таких случаях, активные формы кислорода влияют на важные метаболические звенья и процессы, в том числе на окислительное фосфолирирование, моделируют метаболизм кальция и выполняют другие не менее важные функции [55,166,227]. В любой клетке, осуществляющей аэробный метаболизм, имеются условия, необходимые для протекания реакций ПОЛ. Это обусловлено тем, что субстратами ПОЛ являются полиеновые липиды, которые в свою очередь входят в состав плазматических и внутриклеточных мембран. В процесс, в первую очередь, вовлекаются фосфолипиды мембран клеток, богатые полиненасыщенными жирными кислотами [131,207]. 33 Таким образом, мембраны клеток богатые полиненасыщенными жирными кислотами и являются основными субстратами для ПОЛ [207]. Из ненасыщенных жирных кислот у человека встречаются пальмитолеиновая, олеиновая, линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты [216]. Процессы ПОЛ в основном связаны с окислением молекулярным кислородом полиненасыщенных жирнокислотных остатков фосфолипидов биологических мембран [207]. Клеточным мембранам принадлежит ведущая роль в обеспечении жизнедеятельности клеток, а также при выполнении клетками специфических функций, важных для всего организма. Важную роль в ингибировании ПОЛ играет структурная организация мембран [78]. На основании экспериментальных и клинических работ было установлено, что при СД изменяются процессы липопероксидации [48,63,65,82]. Инициирование цепи: Радикал гидроксила, будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом в липидном слое мембран образуются липидные радикалы: НО• + LH → Н2О + L• Липидный радикал (L•) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом; при этом образуется новый свободный радикал радикал липоперекиси (LOO): L• + O2 → LOO• Продолжение цепи: Радикал LOO• атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L•: LOO• + LH → LOOH + L • Чередование двух последних реакций как раз и представляет собой цепную реакцию перекисного окисления липидов. 34 Разветвление цепи: Существенное ускорение пероксидации липидов наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в результате взаимодействия Fe2+ c гидроперекисями липидов: Fe2+ + LOOH → Fe3+ + HO- + LO• Образующиеся радикалы LO инициируют новые цепи окисления липидов: LO• + LH → LOH + L• L• + O2 → LOO• → и т.д. Обрыв цепей: В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности (например, теми же Fe2+) (10,138) или друг с другом: LOO• + Fe2+ + H+ → LOOH + Fe3+ LOO• + InH → In• + LOOH LOO• + LOO• → молекулярныепродукты + фотон Диеновые конъюгаты, являющиеся первичными продуктами ПОЛ, относятся к токсическим метаболитам, которые оказывают повреждающее действие на липопротеиды, белки, ферменты и нуклеиновые кислоты. Дальнейшими продуктами ПОЛ являются альдегиды и кетоны (малоновый диальдегид и др.), простагландинов, которым прогестерона принадлежит и других важная стероидов. роль в синтезе Взаимодействие диальдегидов со свободными группами мембранных соединений образуются конечные продукты ПОЛ (основание Шиффа и др.), непрерывное накопление которых дестабилизирует мембраны и способствует деструкции клеток [37]. Липоперекиси - неустойчивые соединения, которые легко подвергаются дальнейшим превращениям с образованием более устойчивых, но токсичных, вторичных продуктов окисления, в том числе малонового диальдегида (МДА) [50,51,152,213,222]. 35 По концентрации данного вещества судят об интенсивности перекисного окисления в биологических жидкостях. Избыточное образование продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) проявляется повреждением мембран эритроцитов, лизосом. При этом изменяется структура мембран клеток, вплоть до их разрыва, ингибируется активность цитохромоксидазы. Наряду с повреждением липидного слоя при активации ПОЛ происходит модификация мембранных белков. В первую очередь поражаются сульфгидрильные группы, что способствует появлению катионной и анионной проницаемости мембран митохондрий и их набуханию. При этом может происходить трансформация эритроцитов, которая и будет сопровождаться всплеском H+ и выбросом K+. В эритроцитах в условиях длительной гипергликемии при СД установлено изменение активности ключевых эритроцитарных энзимов пентозного цикла и гликолиза [33,100]. Интенсификация процессов ПОЛ может приводить к модификации мембранных липидов, следствием чего является уменьшение текучести мембраны, мембранного потенциала, увеличение проницаемости мембраны для различных ионов. В отдельных случаях может происходить нарушение целостности мембраны, приводящее к таким нежелательным последствиям, как выход внутриклеточных компонентов, например гидролитических ферментов лизосом, в окружающую среду. Кроме того, в результате ПОЛ образуются цитотоксичные представляют соединения, карбонильные среди которых продукты, легко наибольшую образующие опасность аддукты с нуклеиновыми кислотами и многими белками (в том числе с ферментами АОС, вызывая их инактивацию) [53,168,228]. Кроме ненасыщенных жирных кислот в составе липидов, интенсивной модификации под действием АФК могут подвергаться функционально значимые белки, в том числе и ферменты. Превалирующими становятся процессы нерегулируемой модификации белков, приводящие, в конечном счёте, к утрате их биологической активности (ферментативной активности, рецепторной и транспортной функции и т.д.). Окислительная модификация 36 белков генерирует новые антигены и провоцирует иммунный ответ. Продукты такой модификации могут служить причиной вторичного повреждения других биомолекул [141,160,181]. АФК способны также повреждать нуклеиновые кислоты [128,147,165]. Основные формы АФК исходно являются нормальными компонентами клеточного метаболизма и выполняют одновременно и позитивные функции. Особо следует подчеркнуть их защитное действие, поскольку они являются компонентами фагоцитарных реакций. АФК обеспечивают антибластомную резистентность и участвуют в метаболизме арахидоновой кислоты, в результате чего образуются простагландины и тромбоксаны. АФК усиливают процессы энергизации в митохондриях, а также ускоряют регенеративные и репаративные процессы, контролируют деление клеток в тканях и органах [104,113,146,153]. Имеются определённые экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что действие ряда первичных мессенджеров осуществляется либо через активацию процессов генерации АФК и повышение их уровня в тканях, либо через ингибирование компонентов АОС. Это позволяет рассматривать АФК в качестве вторичных мессенджеров, участвующих в передаче сигналов в физиологических условиях за счёт регуляции обмена Са2+, стимуляции фосфорилирования белков, активации факторов транскрипции. Более того, свободные радикалы прямо или опосредованно участвуют в механизмах некроза и апоптоза, т.е. процессах, регулирующих длительность существования тканей, органов и систем организма, в процессах старения организма и, в конечном счёте в контроле длительности жизни организма [42,148]. 1.5. Система антиоксидантной защиты организма Связывание и модификация АФК, предупреждение образования и разрушения липоперекисей осуществляется антиоксидантной системой, которая может функционировать как внутри клетки, так и вне её. Клеточная АОС представлена семейством оксидоредуктаз и трансфераз, найденных в 37 цитоплазме, митохондриях и ядре клетки. Состав низкомолекулярных клеточных антиоксидантов достаточно обширен: восстановленный глутатион и аскорбиновая кислота находятся в водной фазе клетки, защищая компоненты цитозоля и матрикса митохондрий, токоферолы и каротиноиды - плазматическую и внутриклеточные мембраны. Защита ферментов и белков, в частности липопротеинов, присутствующих в плазме крови, осуществляется внеклеточной АОС. Эта антиоксидантная система, как и клеточная, характеризуется наличием антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных биоантиоксидантов и присутствует не только в плазме крови, но и в других биологических жидкостях организма [15,21,49]. 1.5.1. Ферментативное звено антиоксидантной системы Ферментативные антиоксиданты характеризуются:высокой специфичностью действия, направленного против определённых форм АФК; специфичностью клеточной и органной локализации, а также использованием в качестве катализаторов ионов металлов, к которым относятся Сu, Zn, Mn, Fe, Ni, Se. В нормальных условиях у человека содержание ферментативных антиоксидантов постоянно и мало зависит от пола, возраста, массы тела и других физиологических параметров, в то же время ряд патологических состояний сопровождается изменением их концентрации и активности в клетках [45,74,88,104]. Супероксидисмутаза (КФ 1.15.1.1, супероксид: супероксид оксидоредуктаза, СОД) является основным ферментом специфической антиоксидантной защиты в организме, субстратом для которой служит свободнорадикальное соединение. Величина активности СОД во многих случаях зависит от уровня О2- в тканях, который выступает по отношению к ферменту в качестве индуцирующего и активирующего фактора [91,185]. Хотя дезактивация О2- может достигаться путём спонтанной дисмутации, спонтанная реакция физиологическое протекает значение. слишком СОД дисмутации супероксидных радикалов: медленно, эффективно чтобы катализирует иметь реакцию 38 О2- + О2- + 2Н+ → Н2О2 + О2 В присутствии этого фермента константа скорости реакции достигает диффузно-лимитирующих значений « 109М"'с [116,205]. К настоящему времени идентифицированы несколько изоферментных форм СОД. Основная форма фермента - Сu/Zn-СОД - локализована преимущественно в цитозоле, но обнаруживается также в ядерной фракции клеток. Cu/Zn-СОД - металл опротеин с мол. массой 32-33 кДа, состоит из двух субъединиц, каждая из которых связывает 1 атом Сu и 1 атом Zn. Механизм действия активного центра СОД включает 2 типа реакций: Е-Сu2+ + О2- → E-Cu+ + O2; Е-Сu+ + О2- → Е-Сu2+ + Н2O2. Атом Zn не участвует непосредственно в реакции, но он, вероятно, оказывает стабилизирующее действие, так как без него фермент неактивен. Мn содержащая форма СОД локализована в основном в митохондриях клеток человека, состоит из 4 субъединиц с молекулярной массой 20 кДа каждая [140,200,205]. Синергистом СОД в клетке является каталаза, препятствующая накоплению продукта накоплению продукта супероксиддисмутазной реакции перекиси водорода, ингибитора СОД. Экспериментально показано, что в очень многих системах комбинация СОД + каталаза снижает уровень продуктов пероксидации липидов и предотвращает другие последствия действия свободных радикалов [21]. Каталаза (КФ 1.11.1.6,Н2O2: Н2O2 оксидоредуктаза, КТ), хромопротеин с мол. массой около 240 кДа, состоит из 4 субъединиц, каждая из которых в качестве простетической группы содержит гем. КТ может катализировать каталазную и пероксидазную реакции: Н2O2 + Н2O2 → 2Н2O + O2; Н2O2 + АН2 → 2 Н2O + А; Константа скорости каталазной реакции составляет - 107 M~V. 39 Субстратами (АН2) в пероксидазной реакции могут быть этанол, метанол, формиат, формальдегид и другие доноры водорода [115]. КТ имеет чётко выраженную тканевую специфичность и у человека в наибольших количествах обнаруживается в печени и эритроцитах. В клетке локализуется, в основном в пероксисомах, но вероятно, находится также в микросомах и меньше в цитозоле [88,156,161]. KT имеет низкое сродство к перекиси, поэтому эффективно работает только при высоких её концентрациях. Высоким сродством к Н2O2 обладает глутатионпероксидаза, поэтому именно этот фермент защищает клетку от чаще возникающих низких концентраций перекиси [49,181]. Глутатионпероксидаза (КФ1.11.1.9 пероксид водорода: восстановленный глутатион оксидоредуктаза, ГПО) -Se-содержащий белок с мол. массой 84-88 кДа, состоящий из 4 идентичных субъединиц, каждая из которых включает 1 атом Se. ГПО катализирует реакцию восстановления гидроперекиси или Н2О2 с помощью глутатиона (TSH) по реакции: ROOH + 2GSH → ROH + Н2O + GSSG; либо Н2O2 + 2GSH → 2Н2O + GSSG; На цитозоль клеток приходится около 2/3 активности ГПО, на митохондрии - лишь 1/3. Se в активном центре фермента изменяет степень своего окисления в ходе катализа. Одной из функций ГПО является восстановление гидроперекисей ПНЖК ROOH в гидрокси жирные ROH кислоты, чтобы не допустить дальнейшей цепной реакции СРО. Другой функцией ГПО является восстановление Н2О2, чтобыне допустить образования с её участием радикала гидроксила [66,89,181]. В клетках млекопитающих выявлено целое семейство мультифункциональных белков - глутатионтрансфераз (КФ 2.5.1.18, донор: глутатион трансфераза, GST), использующих GST для коньюгации с гидрофобными соединениями и восстановления органических пероксидов. GST локализованы преимущественно в цитозоле и ядре клеток. Все ГТ - гомо- или гетеродимеры с молекулярной массой 57 кДа. Субъединицы состоят из 211 - 254 аминокислот. 40 В каждой субъединице имеется по одному независимому активному центру, в гетеродимере субъединцы сохраняют свои основные физические и каталитические свойства, характерные для каждой из них. Основная функция ГТ - защита клеток от ксенобиотиков и продуктов ПОЛ посредством их восстановления, присоединения к субстрату молекулы GST или нуклеофильного замещения гидрофобных групп. ROOH + 2GSН → ROH + GSSG + H2O R + GSH → HRSG RX + GSH → RSG + HX В отличие от селен-содержащей ГПО, для которой лучшими субстратами являются гидрофильные гидропероксиды с малым размером молекулы, GST не взаимодействует с Н2O2, в то же время эффективно восстанавливает гидрофобные гидропероксиды с большим объёмом молекулы, гидроперекиси ПНЖК - линоленовой и арахидоновой фосфолипидов; а также гидропероксиды мононуклеотидов и ДНК, участвуя тем самым в их репарации. Кроме того, GST коньюгируют с GSH и тем способствуют выведению из организма токсичных продуктов ПОЛ (ноненали, децинали, холестерин-а-оксид). Таким образом, GST являются важными компонентом антиоксидантной защиты, особенно от эндогенных метаболитов, образующихся при окислительном стрессе [49,61,200]. Функционирование ГПО тесно сопряжено с глутатионредуктазой, регенерирующей GSH из GSSG. Они образуют единую глутатионовую антипероксидную систему, осуществляющую глутатионовый редокс-цикл [67]. Результаты многочисленных исследований указывают на активацию свободнорадикального перекисного окисления липидов на разных стадиях и при разных клинических вариантах СД. Так обнаруживается усиление генерации прооксидантов и связанное с этим накопление продуктов окислительной модификации липидов, белков, нуклеиновых кислот. В исследованиях Хоробрых О.Ю. выявлено, что у длительно болеющих СД-2 типа интенсивность хемилюминесценции увеличивается в 2 раза, а у больных с 41 впервые выявленным СД в 4 раза по сравнению с эритроцитами здоровых людей. При СД-1 типа интенсивность хемилюминесценции повышается в 3,2 раза. Интенсификация хемилюминесценции свидетельствует об усилении ПОЛ в эритроцитах [109]. Высокое содержание ДК и МДА у больных СД могут свидетельствовать о быстром образовании и накоплении высоко реакционных радикалов, обладающих способностью вступать в реакцию цепного окисления липидов мембранных структур и способствующих накоплению продуктов пероксидации [59]. Таким образом, при СД оксидативный стресс становится одним из ключевых звеньев развития осложнений. На фоне оксидативного стресса изменяется функция многих генов, ответственных за синтез белков, являющихся компонентами сосудистой стенки и других тканей организма. Также происходит накопление токсических продуктов с деструкцией белков и нуклеотидов, наблюдается повреждение клеточных компонентов, апоптоз, нарушение синтеза простаноидов [13]. Как известно, повреждение белков в результате гликозилирования может служить фактором риска развития неблагоприятных последствий при СД. На фоне активации процессов липидной пероксидации с накоплением высокотоксичных продуктов ПОЛ и нарушениями в системе АОЗ, у больных СД наблюдается выраженный дисбаланс в липопротеиновом спектре крови. Диабетическая дислипидемия имеет особенности и представляет особый вариант атерогенной дислипопротеинемии. Атерогенные дислипидемии - это преобладание фракций липопротеинов, трансформирующих холестерин в периферические клетки над липопротеинами, акцептирующих холестерин с клеточных мембран и транспортирующих его в печень, где происходит катаболизм холестерина [69]. Диабетическая дислипидемия характеризуется гипертриглицеридемией (ТГ), увеличением содержания липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), снижением концентрации липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Гипертриглицеридемия способствует увеличению ЛПОНП, снижению ЛПВП, постпрандиальной гиперлипидемии, нарушению 42 свертываемости крови и увеличению малых, плотных ЛПНП [39]. При СД преобладают мелкие и плотные гранулы ЛПВП, поскольку они легче проникают через стенки сосудов, кроме того, они более чувствительны к окисляющим соединениям, а сродство их связывания с рецепторами ЛПВП ниже чем у промежуточных или легких форм ЛПВП [93]. Коррекция гиперлипопротеидемии при СД давно привлекает внимание исследователей и клиницистов. Из немногочисленных препаратов, оказывающих гиполипидемическое действие, изучению подверглись препараты эссенциальных фосфолипидов (ЭФЛ) (эссенциале, липостабил) у больных СД1 и 2 типов, осложненными ангиопатией. В здоровой клетке работают хорошо сбалансированные механизмы системы ПОЛ-антиоксиданты по принципу обратной связи. Увеличение уровня антиоксидантов приводит к торможению ПОЛ, что, в свою очередь, вызывает изменение самих липидов. В липидах появляются легко окисляемые фракции, что ускоряет процессы ПОЛ. На этом фоне активируются ферментативное звено антиоксидантов, а также повышается расход неферментативных антиоксидантов, что способствует сбалансированности процессов [16]. Существование сложной многоуровневой системы защиты в нормальных физиологических условиях сводят к минимуму опасность бесконтрольного протекания СР процессов в клетке. Про- и антиоксидантная системы находясь у человека в состоянии динамического равновесия, поддерживается определенной организацией плазменных и клеточных липидов, динамической системой обмена мембранных фосфолипидов и холестерина, определяющих исходный уровень жесткости и окисляемости клеточных мембран. Соотношение антиоксидантной и прооксидантной систем в тканях может меняться в зависимости от состояния организма, влияния различных факторов внешней среды [75]. Вредному воздействию на клетки и организм в целом АФК препятствуют ферментативные и неферментативные компоненты антиоксидантной системы (АОС). Клетки используют несколько уровней ферментативной защиты от 43 активных форм кислорода, которые включают в себя СОД, каталазу, ГПО, ГТ. Первый уровень защиты предусматривает возможность детоксикации потенциально опасных АФК с участием супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, что позволяет предотвратить образование гидроксильного радикала при протекании реакций Фентон и Хабера - Вайса. СОД представляет первое звено антиоксидантной защиты. Она катализирует реакцию дисмутации двух супероксид ион радикалов с образованием свободного кислорода и перекиси водорода (Н2О2). Перекись водорода выводится благодаря активности каталазы и пероксидаз, а именно ГПО и ГТ. Каталаза является металлоферментом, локализуется в пероксисомах клетки и выполняет детоксикационную функцию, разлагая образующуюся в процессе биологического окисления перекись водорода на воду и молекулярный кислород (2H2O2 → 2H2O + O2). Супероксидный радикал и Н2О2 крайне реакционноспособны и могут быстро окислять любые биологические молекулы. Участвуя в инактивации активных форм кислорода, супероксиддисмутаза и каталаза выполняют антиоксидантную роль [47]. В норме СОД эффективно утилизирует супероксидные радикалы. Снижение активности СОД более чем на 50% приводит к неконтролируемому развитию свободнорадикальных реакций и гибели клетки [60]. Дальнейшему прерыванию цепи СР окисления способствуют глутатион-зависимые ферменты – глутатионпероксидаза (ГПО) и глутатионтрансфераза (ГТ), а также ферментными системами биорегенерации окисленного глутатиона. Глутатионпероксидаза катализирует реакцию восстановления глутатионом нестойких органических Биорегенерация гидропероксидов окисленного глутатиона, в стабильные образующегося соединения. в глютатион пероксидазной реакции, осуществляется с участием глютатионредуктазы и систем восстановления никотинамиддинуклеотидфосфат (НАДФ+) [183]. Таким образом, ключевым внутриклеточным антиоксидантом является глутатион. Глутатион (у-глутамилцистеинилглицин) представляет собой трипептид, который состоит из остатков глутаминовой кислоты, цистеина и глицина и составляет около 90-95% всех небелковых тиолов [1]. К 44 антиоксидантам непрямого действия можно отнести и предшественников глютатиона (глютаминовая кислота, цистеин, метионин), пиридиннуклеотиды (никотиновая кислота), индукторы протеаз (селенит натрия) [221]. Следовательно, глутатион в организме выполняет очень важные функции: обеспечивает функциональную активность белков, в том числе и ферментов, защищает клетки от активных кислородных соединений, сохраняет активность мембран, участвует в обмене эйкозаноидов. Он также является резервом цистеина, влияет на синтез нуклеиновых кислот, участвует в метаболизме ксенобиотиков, повышает резистентность к вредным факторам, влияет на пролиферативные процессы [111]. Наряду с избыточным образованием АФК при СД, имеют место различные нарушения антиоксидантной системы. Есть данные о снижении активности каталазы и СОД [39,161], а также глутатионпероксидазы [208], истощении внутриклеточного и плазменного глутатиона [122]. Механизм этого неоднозначен. С одной стороны, антиоксидантные ферменты могут повреждаться в результате гликирования или окисления, а с другой стороны, согласованное функционирование антиоксидантов может нарушаться при истощении одного из них [120]. Расходование НАДФН в полиоловом пути оборачивается ограничением перехода GSSG в GSH. Это лишает глутатионпероксидазу субстрата для связывания пероксида, который активно генерируется в реакции дисмутации с участием СОД. На уровень антиоксидантов может также влиять отсутствие регулирующего действия инсулина. Таким образом, данные многочисленных работ, в которых изучалось состояние АОС, довольно неоднозначны и зачастую противоречивы. Так при СД 1типа в эритроцитах содержание СОД может быть снижено [139], либо не изменено [170], другие авторы показывают увеличение активности СОД при СД [184,193,211]. Такая же неоднозначность изменений ферментативного звена антиоксидантной системы наблюдается и при СД 2 типа. У 60 женщин с СД 2 типа не обнаружено изменений в СОД-активности в эритроцитах по сравнению с 71 здоровыми женщинами из контрольной группы [176]. В то же время в 45 другом исследовании показано, что даже при хорошем гликемическом контроле и при отсутствии диабетических осложнений активность СОД повышена при СД 2 типа на 60% [182]. Это может говорить о способности систем компенсации противостоять СРО, но с другой стороны может привести к повышению концентрации перекиси водорода и, учитывая у этих пациентов снижение концентрации каталазы, спровоцирует дальнейшую деструкцию. СД осложняется многими метаболическими расстройствами, что усугубляет процесс свободнорадикального повреждения. При наличии гиперлипидемии у больных СД 2 типа выявлено значительное уменьшение содержания СОД, КТ и ГПО в эритроцитах [177]. При ангиопатиях наблюдалось двукратное увеличение активности СОД, а концентрация КТ у них снижалась [182]. В работе Bono et al. обнаружено повышение активности ГПО при СД 2 типа [133], хотя в других исследованиях обращают на себя внимание данные об отсутствии изменений [211], или о понижении данного показателя относительно контрольной группы [182]. Отмечено также при СД 1 типа снижение активности каталазы [41,59,139]. В одних работах показано снижение активности ГПО в клетках красной крови при СД 1 типа [193], то по результатам других исследований она не изменена [139,170], либо повышена [188]. Аналогично и концентрация ГР в эритроцитах может возрастать, причем, как в стадию субкомпенсации, так и в условиях декомпенсации [30,139], не изменяться [170] или падать [226]. При этом можно утверждать, что при диабете обоих типов клетки страдают от дефицита GSH, поставщика восстановительных эквивалентов в катализируемых ГПО реакциях и продукта глутатионредуктазной реакции [193,226], а также в целом от падения количества тиоловых групп белков [193]. В исследованиях Хоробрых О.Ю. активность каталазы и пероксидазы в эритроцитах больных СД достоверно увеличивалась примерно в 1,5 раза. Активность глутатионредуктазы снижалась в 3 раза по сравнению с контролем. Активность СОД в эритроцитах у больных СД 1 и 2 типов снижалась в 1,4 раза, лишь у больных с впервые выявленным СД 2 типа активность фермента в 46 эритроцитах практически не отличалась от группы контроля. Степень изменения активности фермента зависит от степени тяжести заболевания. Падение активности ГР, СОД при СД свидетельствует о снижение антиоксидантной защиты в организме. Повышение активности КТ, ГПО, вероятно, является компенсаторным в ответ на повышение СРО при СД [109]. 1.5.2. Неферментативное звено антиоксидантной системы Какова бы ни была причина усиления ПОЛ, изменение скорости окисления липидов находится в тесной взаимосвязи со снижением концентрации биоантиоксидантов. Такая ситуация приводит к изменению состава липидов клеточных мембран, в частности повышению процента насыщенных жирных кислот, увеличению содержания холестерина и снижению фосфолипидов, а следовательно, уменьшению текучести липидной фазы мембраны, которая становится более жесткой [75]. В результате снижения активности мембранных ферментов которых являются эффекторами (в том легко числе аденилатциклазы), окисляющиеся липиды (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит), изменяется чувствительность клетки к гормональной и нервной регуляции. Антиоксиданты синтетического могут быть происхождения. природного (биоантиоксиданты) Жирорастворимые и биоантиоксиданты (фосфолипиды, токоферолы, витамин А, каротиноиды, убихинон, витамины группы К, стероидные гормоны) осуществляют свою защитную функцию в биологических мембранах, водорастворимые (аскорбиновая кислота, лимонная, никотиновая, серосодержащие соединения - цистеин, гомоцистеин, липоевая кислота, бензойная, церулоплазмин, фенольные соединения - полифенолы, флавоноиды, трансферрин, лактоферрин, альбумин, мочевина, мочевая кислота) - в цитозоле клеток, межклеточной жидкости, плазме крови, лимфе [125]. Хорошо изученными компонентами неферментативной АОС являются низкомолекулярные, жирорастворимые, природные антиоксиданты, к которым относятся альфа-токоферол (витамин Е), β - каротин (провитамин А) и убихинон Q [51,190]. Накопленные к настоящему времени данные позволяют 47 рассматривать антиоксиданты как весьма перспективные препараты, способные оказывать протективное действие как на функцию β-клеток и секрецию инсулина, так и на механизмы развития ангио-, нейропатий и других осложнений диабета [17]. Скорость окислительных реакций в липидах мембран связана с изменением состава липидов, структуры мембраны, ее чувствительности к действию сигнальных веществ и повреждающих воздействий и, наконец, ее функциональной активности. Использование антиоксидантов при интенсификации ПОЛ приводит к нормализации ПОЛ, а также состава, структуры и функции биомембран. Антиоксиданты являются универсальными мембранотропными препаратами, защищающими мембраны от действия повреждающих факторов. Вспомогательная терапия антиоксидантами может существенно увеличить эффективность традиционного лечения сахароснижающими препаратами. Антиоксидантным действием обладают ряд других природных веществ: каротин, мочевая кислота, трипептид-глутатион, дипептид карнозин, таурин и т.д. [22,23]. Таким образом, накопленные к настоящему времени данные позволяют рассматривать антиоксиданты как весьма перспективные препараты, способные оказывать протективное действие как на функцию β-клеток и секрецию инсулина, так и на механизмы развития ангио-, нейропатий и других осложнений диабета [17]. В последние годы внимание исследователей привлечено к α-липоевой (тиоктовой) кислоте метаболической - физиологическому активностью. α-липоевая антиоксиданту кислота является с высокой коэнзимом мультиферментных комплексов митохондрий, осуществляющих окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты и α-кетокислот, и играет важную роль в процессе образования энергии АТФ. Необычным свойством тиоктовой кислоты является ее способность повышать утилизацию глюкозы тканями и предотвращать образование конечных продуктов гликирования. В клинических исследованиях имеются данные о том, что трехнедельный курс 48 внутривенной терапии тиоктовой кислотой способствует коррекции показателей свободнорадикального окисления липидов, белков и сывороточной активности лизосомальных ферментов у больных СД типа 1 с полинейропатией [96]. Известно, что α-липоевая кислота в окисленной форме способна оказывать инсулин потенцирующее оксидативного стресса действие развитию и препятствовать зависимому инсулинрезистентности в от своей восстановленной форме [24]. Никотинамид также является одним из часто используемых препаратов с антиоксидантными своиствами. Его действие основано на снижении уровня НАД+ в β-клетках, что важно для синтеза инсулина и контроля аутоиммунных процессов. Применения никотинамида в начальной стадии СД типа 1 способствует сохранению остаточной функции βклеток и замедлению их апоптоза [38]. В лечении диабетической ангиопатии в настоящее время широко используются различные формы витаминов группы В. Жирорастворимые формы тиамина, особенно бенфотиамин, отличаются высокой биодоступностью и потенциальным нейротропным действием. В последнее время накоплены данные, свидетельствующие о способности бенфотиамина подавлять образование конечных продуктов гликирования, что может иметь определенное значение как в развитии диабетической нейропатии, так и в его лечении [108]. Скорость окислительных реакций в липидах мембран связана с изменением состава липидов, структуры мембраны, ее чувствительности к действию сигнальных веществ и повреждающих воздействий и, наконец, ее функциональной активности. Использование антиоксидантов при интенсификации ПОЛ приводит к нормализации ПОЛ, а также состава, структуры и функции биомембран. Антиоксиданты являются универсальными мембранотропными препаратами, защищающими мембраны от действия повреждающих факторов [22,23]. Как видно из анализа имеющиеся экспериментальные и клинические исследования в области диагностики и терапии СД разноречивы и не имеют 49 комплексного подхода к патогенезу этого заболевания, диагностике и лечению данной патологии. В связи с этим, исследование уровня ПОЛ, различных звеньев АОС, зависимость этих нарушении от состояния липидного обмена, особенно от состояния обмена жирных кислот, может иметь важное прогностическое значение для больных СД и способствовать познанию патогенетических процессов заболевания. Это расширит возможности использования антиоксидантов и мембраностабилизирующих препаратов с целью защиты клеток организма, и, в частности, β-клеток (имеющих слабую АОС), от токсического воздействия продуктов липопероксидации и самих АФК. Такого рода вспомогательная терапия может существенно увеличить эффективность гипогликемического лечения и способствовать профилактики сосудистых осложнений при СД 1 и 2 типов. Таким образом, по современным представлениям, важная роль в патогенезе СД принадлежит активации процессов СРО: дисбалансу между прооксидантами и антиокислителями, приводящему к избытку свободных радикалов и накоплению высокотоксичных продуктов СРО («окислительный стресс»). Однако, даже учитывая высокую значимость участия СРО в патогенезе СД, до настоящего времени не было проведено комплексной оценки состояния системы «ПОЛ-АОС», которая в норме сбалансирована и функционирует по принципу обратной связи. Не проводилось исследование зависимости нарушения баланса ПОЛ-АОС от состояния обмена жирных кислот при СД у больных. В связи с этим, исследование уровня ПОЛ, жирных кислот и различных звеньев АОС может иметь важное прогностическое значение для больных СД, будет способствовать познанию патогенетических процессов заболевания и развитию использования антиоксидантов и мембраностабилизирующих препаратов с целью защиты клеток организма, и в частности - β-клеток (имеющих слабую АОС), от токсического воздействия продуктов липопероксидации и самих АФК, а также для профилактики сосудистых осложнений [86]. 50 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Объект исследований В условиях эндокринологических отделений Городских Клинических больниц № 52 и № 68 г. Москвы было обследовано 163 больных обоего пола, страдающих сахарным диабетом. Больные поступили в стационар в связи с ухудшением общего состояния, а также для коррекции доз применяемых препаратов. Все пациенты в течение 10 дней находились на диете № 9, получали пероральные гипогликемические препараты групп бигуанидов и сульфонилмочевины, человеческий инсулин длительной, короткой и средней продолжительности действия для подкожного введения, антиоксидантную инфузионную терапию тиоктовой (α-липоевой) кислотой. Материалом для исследования послужила кровь больных СД. Забор материала для исследования проводили дважды в условиях стационара при поступлении больного в отделение и перед выпиской после соответствующей терапии спустя 10 дней. Кровь для исследования брали из локтевой вены натощак. В соответствии с методиками в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА или гепарин. 2.2. Характеристика групп больных Все пациенты были разделены на 3 группы, согласно диагнозу. 1-ую группу больных составили 55 человек, с диагнозом сахарный диабет 2 тип, впервые выявленный. Средний возраст пациентов составил 52 года. Больные поступили в стационар в декомпенсированном состоянии, течение заболевания было осложнено ИБС, другими ангиопатиями. 2-я группа включала в себя 48 человек в возрасте 23-35 лет с сахарным диабетом 1 типа. Все больные находились в фазе декомпенсации. Данную группу разделили на 2 подгруппы: с осложнениямии без осложнений. 51 3-я группа включала 30 пациентов с ожирением. Группу контроля составили 30 человек без эндокринной патологии. Причем, контрольная группа для сравнения с СД 1 типа состояла из 15 человек того же возраста – призывников, для СД 2 типа – 15 человек 40 - 65 лет, средний возраст 52 года. У женщин сахарным диабетом 2 типа (СД2), а также у пациентов с ожирением (О), проводили комплексное исследование липидного и жирнокислотного состава плазмы крови и, процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ)и состояния системы антиоксидантной защиты(АОЗ), а также чувствительности клеток к инсулину. Длительность диабета у пациентов варьировала от 1 года до 5 лет, при этом 19 женщин страдали СД 2 менее 3 лет, а 16 – более 3 лет. К моменту исследования диабетические нарушения у больных c СД 2 были компенсированы диетой и сахароснижающими препаратами. Общеклиническое и биохимическое обследование включало расчет индекса массы тела (ИМТ), оценку систолического и диастолического артериального давления (АД), пульса, исследование углеводного и липидного обменов, спектра жирных кислот, состояние инсулиновых рецепторов и баланс ПОЛ - АОА. Определяли у пациентов наличие абдоминально- висцерального ожирения, артериальной гипертензии и ИР/ГИ. Для характеристики ИР/ГИ использовали показатели базального инсулина и соотношения глюкоза/инсулин натощак. Уровень базального инсулина > 25,0 мкед/мл, в обследованных группах, свидетельствовал о гиперинсулинемии. Для выявления ИР рассчитывали индекс Caro- соотношение глюкоза мг%/инсулин натощак. Показатель глюкоза/ инсулин натощак < 6 усл.ед. свидетельствовал о наличии ИР. Значение ОТ > 88 см, свидетельствующие об избыточном накоплении жира в абдоминальной (подкожной и висцеральной) области выявлены у большинства женщин с О и СД2 типа. Степень компенсации СД оценивали по уровню гликемии натощак до и более 7,5 ммоль/л и концентрации гликированного гемоглобина (HbA1с). 52 Декомпенсацию углеводного обмена у больных считали при показателе HbA1с более 6,5 %. HbA1с имеет прямую корреляцию с уровнем глюкозы в крови и является интегрированным показателем компенсации углеводного обмена на протяжении последних 60-90 дней. Скорость образования НbА1с зависит от величины гипергликемии, а нормализация его уровня в крови происходит через 4-6 недель после достижения эугликемии [13]. Ценность определения HbA1с заключается в том, что уровень его не зависит от времени суток, физических нагрузок, приёма пищи, назначенных лекарств и эмоционального состояния больного [96]. В группу компенсированного СД 2 типа вошли 29 больных (средний уровень HbA1c - 6,41 %, суточная гликемия - 9,23 ммоль/л, принимали препараты сульфонилмочевины (диабетон МВ) в суточной дозе 30 мг, бигуаниды (глюкофаж) 1000 мг, средняя доза инсулина составила 0,27 Ед/кг.). В группу декомпенсированного СД 2 типа вошли 26 больных (средний уровень HbA1c - 9,65 %, суточная гликемия - 14,72 ммоль/л, диабетон МВ в суточной дозе 60 мг, глюкофаж 2000 мг, доза инсулина 0,56-1 Ед/кг). СД 2 типа в обеих группах был осложнен диабетической ангиопатией. Всем обследуемым брали кровь из локтевой вены после 10-12 часов голодания в 8-9 часов утра для определения уровней глюкозы, и показателей липидного спектра крови, жирнокислотный состав крови, параметров ПОЛ, и антиоксидантной защиты. Вторично брали кровь через 10 (перед выпиской) после проведения терапии: сахароснижающими препаратами групп сульфонилмочевины в суточной дозе 30-60 мг, бигуанидов 1000 - 2000 мг, препаратами человеческого инсулина короткой продолжительности действия 12-40 Ед/сут., средней продолжительности в суточной дозе 6-42 Ед, и длительного действия 12-40 Ед/сут, а также антиоксидантом липоевой кислотой 300 мг/сут. 53 2.3. Приготовление проб для исследования Для проведения лабораторных исследований использовали цельную кровь больных. Забор материала производили в две биохимические пробирки: с ЭДТА и с гранулами. В соответствии с методиками определения материалом для исследования служила сыворотка и плазма крови, а также лизат эритроцитов. Для подготовки пробы к исследованию цельную кровь центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 10 мин., после чего отделяли плазму. Затем эритроциты отмывали троекратным центрифугированием с использованием изотонического раствора хлорида натрия 0,9 % при 3 000 об/мин в течение 15 минут. Полученную эритроцитарную массу доводили до исходного объема 0,9%-м раствором NaCl, соблюдая гематокрит. Затем в соотношении 1:10 разводили кровь холодной дистиллированной водой, лизируя эритроциты, и замораживали приготовленый лизат. 2.4. Методы исследований 2.4.1. Продукты ПОЛ 2.4.1.1. Определение содержания малонового диальдегида (МДА) и гидроперекисей (ГП) В липидных системах в результате процессов перекисного окисления липидов образуется МДА, взаимодействие которого с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) приводит к образованию хромогена с максимумом поглощения в красной области видимого спектра при длине волны 532 нм. Количественное содержание МДА определяли по методу Yagi Y. et al.[223]. В плазме крови и в гемолизате эритроцитов МДА определяли спектрофотометрически по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в условиях инициации перекисного окисления двухвалентным железом Fe2+. На спектрофотометре Specoll 400 регистрировали спектр поглощения образцов при 532 нм или 515 нм. Расчёт содержания МДА производили с учётом 54 коэффициента молярной экстинкции образовавшегося хромогена и выражали в ммоль на 1 мл эритроцитов (плазмы) (ммоль/мл). Для определения концентрации МДА в экстрактах эритроцитов использовали заранее приготовленный лизат, который разливали в количестве 1,5 мл в 2 конические пробирки. К нему в пробирку А добавляли 0,5 мл дистиллированной воды, в пробирку В - Fe2+, через 4 минуты в каждую добавляли 20% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), центрифугировали в течение 10 минут при 3 000 об/мин. Затем отбирали 2 мл супернатанта из каждой пробирки и проводили реакцию с 0,5% раствором ТБК, перемешивали и инкубировали 15 минут на кипящей бане. После охлаждения на спектрофотометре Specoll 400 при длине волны 532 нм в кюветах с толщиной слоя 1,0 см регистрировали спектр поглощения. По пробе А определяли количество МДА в эритроцитах, а проба В содержала суммарное количество МДА и гидроперекисей (ГП), где разница между А и В пропорциональна количеству ГП. Полученные результаты в единицах оптической плотности переводили в ммоль/мл (умножив полученные значения на коэффициент экстинкции для МДА, равный 6,41 и на 3 (так как в процессе приготовления образца происходит его разбавление в 3 раза). 2.4.1.2. Определение количества диеновых конъюгатов (ДК) в эритроцитах Количество ДК определали спектрофотометрически по методу В.Б. Гаврилов [27]. Методика гептанизопропаноловой определения смесью. Для основана на разделения экстракции ДК гептановой и водноизопропанольной фаз использовали раствор соляной кислоты pH 2,0. В гептановом экстракте измеряли на спектрофотометре Biochrom Ltd., Cambridge, England при длине волны 233 нм. содержание сопряженных диенов в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против гептана. Расчёт количества ДК 55 производили, используя молярный коэффициент экстинкции при длине волны 233 нм, равный 27000 Мхсм' [87] и выражали в ммолях на мл клеток. 2.4.1.3. Определение ТБК - активных продуктов в сыворотке крови Продукты перекисного окисления липидов образуют с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) окрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом. В пробирку вносят реактивы: 3 мл ортофосфорной кислоты, 0,25 мл сыворотки крови, 1 мл раствора ТБК и 4 мл бутанола. Пробу интенсивно встряхивают до образования однородной белой суспензии и центрифугируют 10 мин. при 3000 об/мин. Затем отбирают 3 мл супернатанта и измеряют оптическую плотность при двух длинах волн: 535 и 570 нм. Расчет производят по формуле, количество ТБКактивных продуктов измеряют в нмоль/мг белка. 2.4.2. Показатели энергетического обмена 2.4.2.1. Определение концентрации глюкозы крови Глюкозу крови определяли с помощью наборов фирмы Analyticon℗Biotechnologies AG/ Germani. Принцип метода заключается в ферментативном колориметрическом тесте на основе глюкозооксидазной реакции Триндера: Глюкоза + О2 + Н2О2 → глюконат + Н2О2 и пероксидазной; Н2О2 + фенол → Красный Хинонимин + 4-аминоантипирин + 4Н2О. Концентрацию глюкозы в плазме измеряли в ммоль/л. 2.4.2.2. Определение концентрации гликозилированного гемоглобина (HbA1c) Для определения количества HbA1c в эритроцитах калориметрическим методом [34] использовали гемолизат эритроцитов. Забор крови производили в биохимическую пробирку с гепарином. Гемолизат эритроцитов подвергали кислотному гидролизу с образованием 5-оксиметилфурфурола, который 56 определяли спектрофотометрически по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Экстинцию раствора измеряли при длине волны 443 нм в кювете 1см. Концетрацию HbA1c рассчитывали исходя из того, что 1% гемоглобина равен оптической плотности 0,029. % HbA1c= (экстинция раствора / 0,029). 2.4.2.3. Определение степени утилизации глюкозы эритроцитами крови Для определения утилизации глюкозы эритроцитами использовали цельную кровь с ЭДТА. Для подготовки пробы к исследованию цельную кровь центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 10 мин., после чего удаляли плазму. Затем эритроциты отмывали троекратным центрифугированием с использованием изотонического раствора хлорида натрия 0,9 % при 3 000 об/мин в течение 15 минут. Полученную эритроцитарную массу доводили до исходного объема 0,9%-м раствором NaCl, соблюдая гематокрит. Количество эритроцитов определяли на эритрогемометре, предварительно смешав 0,02 мл полученной пробы с 10 мл 3,5%-ым раствором NaCl и хорошо перемешав. Затем в 2 пробирки разливали по 0,1 мл полученной пробы, добавляли к ней такое же количество раствора глюкозы (с разной концентрацией: 5,7 и 10г.) 1-ю пробу доводили до объема 0,2 мл 0,9%-м раствором NaCl, во 2-ю добавляли 0,1 мл инсулина человеческого генно-инженерного (актрапид НМ 100МЕ/мл). Опытные пробы помещали в вибротерм на 1 час при 37°С. Далее использовали набор реагентов ГЛЮКОЗА АГАТ для определения концентрации глюкозы глюкозооксидазным методом с использованием рабочего раствора (разбавленный буфер с фенолом и субстратно-ферментная смесь). Параллельно ставили контрольную и калибровочную пробы. После окончания инкубации при t = 37°С в течение 15 мин измеряли величину оптической плотности калибровочной и опытных проб против контрольной при 57 длине волны 510 нм. Концентрацию глюкозы рассчитывали по формуле и измеряли в ммоль/л. Затем производили перерасчет количества глюкозы в мкмоль/кл. час. 2.4.3. Антиоксидантная система 2.4.3.1. Определение общей антиоксидантной защиты организма Для количественного определения in vitro концентрации общих антиоксидантов в плазме крови на биохимическом анализаторе SAPPHIRE 400 использовали стандартный набор фирмы RANDOX. Принцип метода заключается в следующем: 2,2-азидо-ди-[3-этилбензотиазолин сульфонат] инкубировали с пероксидазой (метмиоглобином) и H2O2 с образованием одноименного радикала. Полученный раствор имел относительно стабильный зелено-голубой цвет, который измеряли при 600 нм. Антиоксиданты, содержащиеся в тестируемой пробе, подавляли развитие окраски пропорционально их концентрации в образце. Полученую концентрацию общих антиоксидантов измеряли в ммоль/л. 2.4.3.2. Определение активности глутатионпероксидазы (ГПО) Концентрацию ГПО определяли в лизатах эритроцитов больных с помощью стандартных наборов фирмы BioVision, USA на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 3200. Принцип метода основан на способности ГПО превращать восстановленный глутатион (GSH) в окисленный глутатион (GSSG). При этом снижение концентрации НАДФН + прямо пропорционально активности ГПО, концентрацию которой определяют спектрофотометрически при 340 нм и выражают в ЕД/мл. 2.4.3.3. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) Количественное определение in vitro СОД в цельной крови определяли с помощью стандартного набора фирмы RANDOX на биохимическом 58 анализаторе SAPPHIRE 400. Метод основан на использовании ксантина и ксантиноксидазы для генерирования кислородных радикалов, которые, вступая в реакцию с 2 - (4 - иодофенил) - 3 - (4-нитрофенол) – 5 фенилтетразолиумхлорид, образуют окрашенное в красный цвет соединение формазан. Активность СОД определялась как величина ингибирования этой реакции и измерялась в Ед/мл. 2.4.3.4. Определение активности каталазы (КТ) Концентрацию КТ определяли в лизатах эритроцитов больных с помощью стандартных наборов фирмы BioVision, USA на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 3200. Принцип калориметрического метода данного набора основан на способности КТ разлагать перекись водорода до воды и кислорода в необходимых условиях при температуре 25°С и pH среды 4,5. Измерение оптической плотности конечного продукта в пробе производят при длине волны равной 570 нм. Активность КТ определяют по формуле в мЕД/мл. 2.4.4. Показатели липидного спектра крови 2.4.4.1. Определение холестерина в сыворотке крови. Концентрацию холестерина в сыворотке крови определяли с помощью набора реактивов фирмы Analyticon℗Biotechnologies AG/ Germani. Метод определения колориметричесий тест. представляет Холестерин собой определяется ферментативный ферментативно с применением холестеринэстеразы и холестериноксидазы. Эфир холестерина расщепляется под влиянием холинэстеразы, образуя свободный холестерин и жирные кислоты. Холестерин превращается в ∆4-холестенон и перекись водорода под влиянием кислорода в присутствии холестериноксидазы. Образовавшаяся перекись водорода даёт красное окрашивание в реакции с 4 –аминоантипирином и фенолом в результате каталитического воздействия пероксидазы. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна 59 концентрации холестерина и может быть измерена фотометрически в ммоль/л. Значения нормы для ХС 3-5,4 ммоль/л. 2.4.4.2. Определение триацилглицеридов в сыворотке крови Производили с помощью стандартных наборов реактивов фирмы BioSystems S.A. Costa Brava 30, Barselona (Spain). В результате сопряжённых реакций под действием ряда ферментов: липазы, глицеролкиназы, оксидазы и пероксидазы образуется цветной комплекс. Концентрацию триглицеридов определяли спектрометрически и измеряли в ммоль/л. Норма ТГ колеблется в пределах 0,8-1,8 ммоль/л. 2.4.4.3. Определение концентрации липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови (ЛПВП) Определение концентрации липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови (ЛПВП) проводили стандартным набором реагентов фирмы BioSystems S.A. Costa Brava 30, Barselona (Spain). Принцип данного метода основан на том, что специфичный детергент гидролизует холестерин из липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и хиломикрона. Холестерин окисляется холестерол оксидазой с образованием неокрашенных продуктов реакции. Второй детергент переводит холестерин образца из липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) в растворимую форму. ЛПВП измеряют спектрофотометрически и концентрацию выражают в ммоль/л. Референтные значения ЛПВП составляют 0,7-1,9 ммоль/л. 2.4.4.4. Определение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) в сыворотке крови Определение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) в сыворотке крови оценивали по расчетной формуле Friedewald W. [155]. Значения нормы для ЛПНП составляют 2,6-3,6 ммоль/л. Концентрация ЛПОНП не должна превышать 0,9 ммоль/л. 60 2.4.4.5. Коэффициент атерогенности (КА) Коэффициент атерогенности (КА) крови определяли по формуле А.Н. Климова, 1977. В норме значение КА не должно превышать 3,0. 2.4.4.6. Условия анализа жирных кислот Гидролиз и метилирование жирных кислот производили методом Kenichi Ichihara и Yumeto Fukubayashi [178]. 1). Cтандарты. Стандартный FAMEMix 37 метиловый эфир кислота, supelco, каталог No.47885-U 2).Газовая хроматография масс - спектрометрия: Газовая хроматография-масс спектрометрия (ГХ/МС) Trace GC UltraITQ 900 (Thermo Scientific, США, 2009). 3). Капиллярная колонка: TR-FAME капиллярная колонка (Thermo; 30м х 0,25 мм; фильм: 0,25 мкм; 70% Cyanopropylpolysilphenylene – siloxane). 4). Газ-носитель: гелий (He). 5). Аналитические условия. - Газ-носитель: He + Расхода газа; 1 мл / мин + Режиме разделения (Сплит). + Сплит соотношение: 50:1 - Пример камеры впрыска температура: 240oC - Процесс увеличения температуры.: 110°C - 230°C. при 110° С выдержка 5 мин, затем увеличилась на 5 ° C / мин, выдерживали 10 минут при 230° С. - Детектор: Масс-спектрометрия - Температура ионного камеры: 200 ° С. - Полная проверка (fullscan) (50 - 600 m/z). 6). Результаты расчета. - Сигнала к шуму больше или равно 2,5 действительны. 61 - Результаты рассчитывали по площади пика метилового эфира жирной кислоты. - Программное обеспечение для обработки данных использовали: Xcalibur (Thermo); спектральные библиотеки: Mainlib; Microsoft Excel 2010. Материалом для исследования жирных кислот служила венозная кровь и плазма крови, гомогенаты печени, мышц сердца и кожи. Экстракцию липидов из сыворотки крови проводили по методу J.Folch и соавт.[151], после чего осуществляли метилирование ЖК по методу (см. выше). Прибор калибровали стандартными смесями метиловых эфиров ЖК фирмы «Sigma» (США). Обсчёт и идентификацию пиков проводили с помощью программно-аппаратного комплекса « Analytica for Windows» с использованием IBM Pentium IV 1800. Определяли концентрации следующих высших ЖК: миристиновой (С14:0), пальмитиновой (С16:0), стеариновой (С18:0), пальмитоолейновой (С16:1), олеиновой (С18:1), линолевой (С18:2ω6), а– линоленовой (С18:3ω3), γлиноленовой (С18:3ω6), дигомо–γ- линоленовой (С20:3ω6), арахидоновой (С20:4ω6), эйкозапентаеновой (ЭПК; С20:5ω3) и докозагексаеновой кислоты (ДГК; C22:6ω3). 2.5. Экспериментальные методы исследования и моделирование стрептозоцинового диабета у крыс Эксперименты проведены на 70 крысах-самцах и не рожавших самках линии Вистар одной возрастной группы (10-14 месяцев), массой 180-250. 10 крыс составиликонтрольную группу. Экспериментальный сахарный диабет вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения 2,5% раствора стрептозотоцина (производство фирмы «Sigma») в дозе 60 мг/ кг массы животного на фоне 24 - 48 часового голодания. Взятие крови у животных проводили до эксперимента, через 3, 7, 14, 21, 28 и 35 дней после введения стрептозотоцина. Контрольным животным вводили эквивалентное количество физиологического раствора. 62 Животных выводили из опыта путем передозировки анестезирующих препаратов (рометаром). Производили забор крови из сердца. На проведение исследований получено разрешение Этического комитета ГБОУ ВПО РГМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России (протокол от 9 ноября 2009 г. № 93). ( Международный стандарт ISO10993-2:2006 (Е), часть II «Регулирование обращения с животными», 2006). Содержание животных и постановка экспериментов будут проводиться в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10 1983 г. и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Статистическую обработку материала осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по t – критерию Стьюдента. При изучении характера взаимоотношений исследуемых параметров использовали коэффициент корреляции Спирмена. Различия считались достоверными при р < 0,05. Все средние значения в таблицах представлены в виде M ± SD. 63 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Оценка процессов пероксидации липидов, антиоксидантной системы и состава жирных кислот крови у больных сахарным диабетом 1 типа и его осложнениях Процессы процесс. Через ПОЛ представляют стадию собой образования нормальный перекисей биохимический липидов в клетках осуществляется синтез простагландинов, стероидных гормонов, образование желчных кислот из холестерина. Процессы ПОЛ необходимы для нормальной работы цепи переноса электронов при микросомальном окислении [6,32,105,112]. Нарушения структуры и функций клеточных мембран, происходящие при пероксидации, сопровождаются вымыванием из мембран окисленных липидов и заменой их новыми, более насыщенными липидами. Это облегчает процесс самообновления мембранных структур и за счёт изменения гидрофобности слоя влияет на проницаемость мембран, на активность мембраносвязанных ферментов и ионный транспорт. Таким образом, СРО - физиологический процесс, который обеспечивает регуляцию клеточной активности. Однако, при избыточном появлении свободнорадикальных форм самоускоряющийся процесс ПОЛ приводит к полному разрушению ненасыщенных липидов, нарушению структуры и функции белков, нуклеиновых кислот и других молекул и, в конечном счёте, к гибели клетки [13,19,191]. Известно, что токсическое действие гипергликемии обусловлено при СД накоплением в тканях продуктов неферментативного гликозилирования и образованием крайне реакционноспособных свободных радикалов, ослаблением антиоксидантной защиты (АОЗ) и развитием окислительного стресса (ОС). Развивающиеся ацидоз на фоне гипергликемии, при этом нарушает течение многих ферментативных процессов в организме, активирует некоторые фосфолипазы и протеазы, что ведет к усилению распада 64 фосфолипидов и белков и к повышению концентрации ненасыщенных жирных кислот (ННЖК) и усилению их перекисного окисления [28,73,124,212]. Известно, что полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) играют важную роль в процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ) и АОЗ организма. Роль ПНЖК в процессах ПОЛ связывается с их функцией как субстратов ПОЛ [64,77]. Вместе с тем имеются единичные указания на их возможное антиоксидантное действие [64,76]. В связи с тем, что во время острой инсулиновой недостаточности происходит массивный липолиз, в сыворотке крови может значительно увеличиваться содержание свободных жирных кислот [84,99,103,106], поэтому возникает вопрос о возможной роли ПНЖК в формировании АОЗ крови. Представляет важным при этом параллельная клинико-биохимическая оценка показателей ПОЛ, АОА и жирнокислотного состава плазмы крови у больных СД 1. При этом особого внимания заслуживает выявление возможной корреляции между уровнем ПОЛ/АОЗ и ПНЖК, так как ПНЖК входят в состав фосфолипидов клеточных мембран (КМ) и в значительной мере определяют их структурные и функциональные свойства [94,217]. Между тем имеются лишь единичные работы посвященные изучению жирно-кислотного состава крови при декомпенсации сахарного диабета [26,84,99]. В связи с этим представляется целесообразным изучение состояние жирнокислотного обмена у пациентов при СД и его осложнениях. 3.1.1. Изменение липидного и липопротеидного состава крови при СД 1 типа и его осложнениях Результаты исследований липидного и липопротеидного состава крови свидетельствуют, что у больных СД типа 1 отмечается повышение показателей ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП, а также КА по сравнению с контрольными значениями независимо от наличия осложнений (табл.1). Эти изменения позволяют утверждать, что развитие СД I у пациентов сопровождается существенными изменениями атерогенного характера. При этом у больных с 65 СД с осложнениями имеет место более выраженные изменения количественного состава липидов крови. КА повышался у этих больных в 2 раза (p < 0,05), по сравнению с контролем на фоне увеличения концентраций ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП. Повышение содержания общего ХС и ТГ в плазме крови сопровождалось снижением уровня холестерина ЛПВП. Снижение содержания ХС в ЛПВП свидетельствует о нарушении метаболизма ХС, т.к. ЛПВП участвуют в акцепции ХС из тканей. Увеличение содержания ТГ предполагает увеличение преимущественно содержания ЛПОНП. 66 Таблица 1. Изменение некоторых показателей липидного и липопротеидного состава плазмекрови у больных сахарным диабетом типа 1 с осложнениями и без осложнений (M ± SD) Показатель Контрольная Группа (n=15) ЛПВП, ммоль/л 7,55 ±0,29 ЛПНП, ммоль/л 11,83 ± 0,41 ЛПОНП, ммоль/л 1,38 ± 0,11 Общий холестерин, ммоль/л Общие триглицериды, ммоль/л 4,39 ± 0,29 1,72 ± 0,11 ХС/ФЛ 0,911 ±0,26 ХС ЛПВП, ммоль/л 1,49 ± 0,12 ХС ЛПНП, ммоль/л 2,6± 0,2 Больные сахарным диабетом типа 1 без осложнений (n = 25) 6,13 ± 0,25 Больные сахарным диабетом типа 1 с осложнениями (n = 23) 7,72 ±0,32 p1<0,05 p1>0,05; p2<0,05 11,28 ± 0,32 13,75 ± 0,55 p1>0,05 p1<0,05; p2<0,05 1,38 ± 0,12 3,33 ± 0,29 p1>0,05 p1<0,01; p2<0,01 6,68 ± 0,24 8,37 ± 0,26 p1<0,05 p1<0,001;p2<0,01 1,36 ± 0,09 2,44 ± 0,13 p1<0,05 p1<0,001; p2<0,01 0,960 ±0,03 0,960 ±0,09 p1<0,01 p1<0,01; p2>0,05 1,13 ± 0,18 1,19 ± 0,18 p1<0,05 p1<0,05; p2>0,05 3,38±0,18 3,38±0,06 p1<0,05 p1<0,05; p2>0,05 Примечание: P-достоверность по отношению к контрольной группы;p1 –уровень значимости различий по сравнению со значениями в контрольной группе; p2 – уровень значимости различий по сравнению со значениями у пациентов сахарным диабетом типа 1. ЛПНП – липопротеины низкой плотности, ЛПОНПлипопротеины очень низкой плотности, ЛПВП – липопротеины высокой плотности, ХС ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности. 67 3.1.2. Оценка процессов перекисного окисления липидов у больных СД 1 типа и его осложнениях Для оценки степени переокисления липидов у больных СД 1 типа были определены следующие показатели: содержание МДА в эритроцитах и плазме крови, а также содержание ДК в эритроцитах. Результаты исследования данных показателей в крови больных CД 1 при развитии осложнений (хайропатия, нефропатия, ретинопатия, нейропатия, кардиопатия и синдром Мориака) представлены в табл.2. В обеих группах (как без осложнений, так и при их наличии) уровень эритроцитарного и плазменного МДА, а также содержание ДК повышены в сравнении с контрольными величинами. Также показано достоверное повышение уровня плазменного МДА при развитии осложнений по сравнению с группой больных, не имеющих осложнений. По содержанию эритроцитарного МДА и ДК различий между группами не найдено. Таблица 2. Содержание МДА и ДК в эритроцитах и плазме крови при СД I с осложнениями и без осложнений (M ± SD) Показатели Здоровые лица СД I типа без осложнений с осложнениями 0,53 ± 0,02 n = 28 0,92 ± 0,01 p < 0,001 n = 25 0,95 ± 0,02 p < 0,001 n = 17 МДА в плазме, мкмоль/мл 0,75 ± 0,03 n = 28 1,16 ± 0,01 p < 0,001 n = 25 1,21 ± 0,02 p < 0,001 p2 < 0,05 n = 17 ДК в эритроцитах, ммоль/мл 0,57 ± 0,03 n = 28 0,97 ± 0,05 p < 0,001 n = 23 0,96 ± 0,07 p < 0,001 n = 18 МДА в эритроцитах, мкмоль/мл Примечания: p- статистически достоверные различия с показателями здоровых пациентов, p2 - статистически достоверные показателями больных не имеющих осложнений СД типа 1. различия с 68 Развитие кетоацидоза у больных с осложнениями сопровождалось снижением уровня эритроцитарного МДА в сравнении с соответствующим показателем в группе больных без кетоза, но оставалось значительно выше контрольной величины. При этом в общей группе больных СД 1 между уровнем кетоновых тел в крови и содержанием эритроцитарного МДА имелась отрицательная корреляционная связь с тенденцией к достоверности (г = - 0,29; 0,1 > p > 0,05). 3.1.3. Активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах и общий антиоксидантный статус сыворотки крови больных СД 1 типа и его осложнениях Постоянство антирадикального и антиперекисного потенциалов клеток в организме обеспечивает антиоксидантная система защиты. У больных СД 1 типа активация процессов ПОЛ сопровождается достоверным снижением концентрации СОД и повышением активности КТ и ГПО по сравнению с контрольной группой, при этом достоверно снижается и активность Г6ФДГ 1,75 раза (табл.3) Количество общих антиоксидантов повышено в 0,5 раза, по-видимому, за счет КТ и ГПО. 69 Таблица 3. Активность ферментов антиоксидантной защиты у больных с осложнениями СД 1 и без осложнений СД (M ± SD) Показатели СОД, Ед/гНb СД1 Здоровые лица 1113,55 ± 51,76 n = 20 без осложнений с осложнениями 955,69 ± 55,94 0,1 > p > 0,05 n = 20 765,80 ± 130,87 p < 0,01 n=8 КТ, Едх 104/гНb 8,71 ± 0,18 n = 23 9,46 ± 0,14 p < 0,01 n = 19 9,08 ± 0,32 p > 0,05 n = 10 ГПО, Ед/гНb 89,69 ± 2,01 n = 10 56,60 ± 4,79 p < 0,001 n = 10 53,38 ± 2,76 p < 0,001 n = 10 Г6ФДГ, Ед/гНb 7,71 ± 0,12 n=14 4,40 ± 0,18 p < 0,001 n = 14 4,49 ± 0,08 p < 0,001 n = 14 Примечания: p- статистически достоверные различия с показателями в контроле. Исходя из того, что основным субстратом ПОЛ являются ПНЖК, можно ожидать увеличения жёсткости мембран, а, следовательно, нарушения проницаемости и функций данной клетки. Увеличение жёсткости связано с изменением соотношения содержания ННЖК/НЖК в сторону увеличения насыщенности жирных кислот, так как прямые углеводородные цепи легче взаимодействуют между собой. Все эти изменения липидного состава являются результатом активации ПОЛ и служат причиной нарушения структуры и функций клеточных мембран. Особенно важно при данной патологии усиление ПОЛ в β-клетках островков Лангерганса, поскольку они имеют слабую антиоксидантную защиту [94] и полиненасыщенных жирных кислот (ПННЖК) в процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты мало изучен, несмотря на то,что роль ПННЖК в процессах ПОЛ в течение 70 многих лет обоснованно связывалось с их функцией как субстратов [28,107]. Вместе с тем в литературе имеются единичные указания на их возможное антиоксидантное действие [18,90]. В связи с этим возникает вопрос о возможной роли ПННЖК в антиоксидантной защиты крови. Наши исследования показали, что у пациентов с СД I отмечались увеличение суммарного содержания насыщенных жирных кислот (НЖК) и уменьшение суммарного содержания ненасыщенных жирных кислот (ННЖК) по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе; наиболее выраженные в группе больных с СД I с осложнениями(на 12,1 и 10,1% соответственно) (табл.4, рис.1 и рис.2). При подсчете коэффициента НЖК/ННЖК выявлено его повышение в группе больных с осложнениями (на 13,7%). Таблица 4. Уровень жирных кислот в плазме крови у больных с СД I с осложнениями и без осложнений, по сравнению с их уровнем у контрольной группы (% от суммы жирных кислот, M ± SD) Контрольная группа (n = 15) Сахарный диабет 1 c осложнениями ( n= 20) Сахарный диабет 1 без осложнений ( n = 22) 0,6 ± 0,12 2,2 ± 0,8 24,0 ± 3,5 0,3 ± 0,03 * 1,0 ± 0,23 * 39,3 ± 5,4 * 0,5 ± 0,08 * 1,2 ± 0,2 * 36,0 ± 7,9 * 0,3 ± 0,05 0,6 ± 0,2 * 0,4 ± 0,01 4,3 ± 1,9 5,7 ± 2,1 * 5,3 ± 1,8 𝛴𝜔3- ПННЖК 2,8 ± 0,1 1,3 ± 0,2 1.7 ± 0,1 𝛴𝜔6- ПННЖК 28,6 ± 3,1 45,6 ± 4,2 41,7 ± 6,3 𝜔3-ПННЖК /𝜔 6-ПННЖК, ед. 0,097 0,028 0,040 Σ НЖК 31,87 ± 3,01 38,60 ± 2,90 * 35,32 ± 2,35 * Σ ННЖК 68,13 ± 2,35 61,4 ± 2,7* 64,68 ± 3,21 НЖК/ ННЖК, ед 0,46 ± 0,05 0,63 ± 0,02 * 0,55 ± 0,01* Семейство ПНЖК 𝜔 3-ПННЖК 𝜔6-ПННЖК Жирные кислоты 20:5 (ЭПК) 22:6 (ДГК) 18:2(линолевая кислота 20:3(дигомо -γ линоленовая кислота) 20:4(арахидоновая кислота) Примечания:*- отличия достоверны по сравнению с контрольной группой (p< 0,05), Σ- сумма. 71 А Б Рис. 1: Хроматограммы жирных кислот в плазме А – контрольная группа; Б - пациенты с СД 1 типа 72 А Б Рис. 2: Хроматограммы жирных кислот в эритроцитах А – контрольная группа; Б – пациенты с СД 1 типа. В пуле НЖК максимальное повышение отдельных фракций отмечается также у больных СД с осложнениямив начале госпитализации: миристиновой (С14:0) кислоты -на 76%, пальмитиновой (С16:0) – на 35,8%, стеариновой (С18:0) – 24,8% по отношению к контрольной группе. Через 2 недели, то есть в 73 конце исследования, изменения во фракционном составе НЖК имели разнонаправленный характер: повышение уровня миристиновой кислоты на 77%, а пальмитиновой кислоты на 19,4% по отношению к контрольным значениям. У пациентов 2-ой группы, т.е. с осложнениями СД 1, в течение всего периода наблюдения отмечалось умеренное снижение суммы полиеновых жирных кислот (ПННЖК) на 9,3% по сравнению с её значениями в контроле. Анализ концентрации отдельных ПННЖК показал, что уровень a- линоленовой (С18:3𝜔3) кислоты снизился на 63,7% по сравнению с контролем, а также повысилось содержание арахидоновой (С20:4𝜔6) кислоты на 32% по отношению к контролю. Таким образом, суммарный уровень 𝜔6 −ПННЖК был повышен при СД1 в, а уменьшение коэффициента 𝜔3 − ПННЖК/𝜔6-ПННЖК (за счет низкой концентрации a-линоленовой кислоты на 17,3%, ЭПК - на 50% и ДГК на 52% от контрольных значений) отмечалось в течение всего периода наблюдения и было особенно выраженным через две недели наблюдения. Изменения в ПННЖК характеризовались снижением уровня 𝛴𝜔3- ПННЖК по сравнению с контролем; соотношение 𝛴𝜔3-ПННЖК/𝛴𝜔6-ПННЖК достоверно снизилось у диабетических больных без осложнений более чем в 2 раза (p < 0,05) c осложнениями − ~ 3,5 раза (p < 0,01). Отмечались прямые корреляционные взаимосвязи между активностью СОД и a-линоленовой кислотой (r = + 0,53; p < 0,05), уровнем ДГК и ферментативной активностью ГПО (r = + 0,47; p < 0,05). Прямая корреляционная связь существовала и между концентрациями МДА и линолевой кислотой (r = + 0,67; p < 0,05). Увеличение соотношения омега-6/омега-3 ПННЖК в крови больных с СД 1 сопровождается повышением активности и интенсивности ПОЛ, наиболее выраженные (p < 0,05) при наличии осложнений болезни. Суммарное соотношение омега6/омега-3 (p < 0,05) снижается за счет повышения суммарной активности СОД+КТ (r = -0,763; p < 0,05; n=19). Приведенные результаты свидетельствуют, что у пациентов с СД1-го типа с осложнениями установлены более выраженные нарушения жирнокислотного состава сыворотки крови за счет группы ЖК омега-3 и омега-6, сохранявшиеся в течение всего периода наблюдения. При 74 этом отмечено увеличение коэффициента НЖК/ННЖК, максимально выраженные в начале исследования. Эти изменения связаны, по-видимому, с тем, что при липолизе в первую очередь мобилизуются ННЖК, которые и окисляются первыми [26,95]. Можно предположить, что этим объясняется активация процессов перекисного окисления липидов у больных при СД типа 1 [28,73,124,142,212]. У больных СД типа 1 отмечается повышение показателей ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП, а также КА по сравнению с контрольными значениями независимо от наличия осложнений. Эти изменения позволяют утверждать, что развитие СД1 у пациентов сопровождается дислипидемией атерогенного характера. При этом у больных с СД с осложнениями имеет место более выраженные изменения количественного состава липидов, в том числе жирнокислотного состава крови, нарастание концентрации свободных радикалов, и снижение активности ферментов антиоксидантной защиты. 3.1.4. Сравнительная характеристика показателей жирных кислот в плазме крови и эритроцитах у больных сахарным диабетом 1 типа При сравнении результатов анализов семейств жирных кислот в контрольной группе ипри СД 1, в плазме крови и эритроцитах, показало следующую картину (рис.1, рис.2): если в плазме крови уровень альфа – линолевой кислоты достоверно возрастает – 1,6 раза, в эритроцитах, при этом, концентрация альфа-линолевой кислоты снижается более чем в 4,28 раза (p < 0,001, см. табл.5). 75 Таблица 5. Сравнительная характеристика показателей жирных кислот в плазме крови и эритроцитах у больных сахарным диабетом 1 типа. (% от суммы жирных кислот, M ± SD) ЭПК C20:5 1,73 ± 0,15 Эритроциты при СД 1 типа (n= 30) 1,84 ± 0,052 ДГК C22:6 3,86 ± 0,39 3,81 ± 0,20 2,59 ± 0,23 2,590 ± 0,352 Линолевая C18:2 14,84 ± 0,66 14,30 ± 0,94 13,36 ± 1,43 15,729 ± 0,336* C18:3 0,196 ± 0,018 0,046 ± 0,01**** 0,55 ± 0,14 0,89 ± 0,11* C20:3 0,143 ± 0,014 0,165 ± 0,01 0,53 ± 0,023 0,500 ± 0,01(+) C20:4 13,95 ± 0,21 0,309 ± 0,099 0,542 ± 0,122(+) 63,43 ± 1,64 58,68 ± 0,82* 36,57 ± 1,64 41,319 ± 0,817* 1,74 ± 0,12 1,421 ± 0,048* 4,198 ± 0,48 3,869 ± 0,361 Жирные кислоты Альфалиноленовая Дигомо -γ линоленовая Арахидонов —ая Эритроциты (контроль) (n= 15) 12,19 ± 0,09*** 44,95 ± Плазма крови (контроль) (n= 15) 1,05 ± 0,26 Плазма крови при СД 1 типа (n= 30) 0,392 ± 0,001* ∑НЖК 41,05 ± 0,66 ∑ННЖК 58,94 ± 0,66 ∑НЖК / ∑ННЖК 0,69 ± 0,019 ∑ω3 5,79 ± 0,53 55,05 ± 0,16*** 0,81 ± 0,012*** 5,69 ± 0,14(+) ∑ω6 28,95 ± 0,44 26,65 ± 1,03* 14,21 ± 1,4 16,77 ± 0,22* ∑ω7 0,65 ± 0,09 0,25 ±0,02* 2,401 ± 0,173 2,440 ± 0,053 ∑ω9 23,52 ± 0,74 22,38 ±1,09 15,67 ± 0,37 17,87 ± 0,67* 0,27** Примечание: *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,005; ****: p < 0,001 ; (+);0,1 > p > 0,05;p - достоверность различий с показателями в контроле Если в плазме крови содержание эйкозапентаеновой кислоты у больных с СД снижается более чем в 2,5 раза р = 0,04, в эритроцитах, напротив, имеет тенденцию к возрастанию; суммарное соотношение НЖК/ННЖК, в плазме снижается (р = 0,04), за счет стеариновой и арахиновой жирных кислот; возрастания же суммарного соотношения НЖК/ННЖК в эритроцитах обусловлено высоким содержанием концентрации альфа-линоленовой кислоты 76 в эритроцитах. Такие разноречивые данные отмечаются по всем параметрам жирнокислотного состава крови (см. табл.5, рис.1 и рис.2). И так, сравнительный анализ содержания жирных кислот в плазме крови и эритроцитов крови показал, что полученные данные отличаются друг от друга, поэтому экстраполяция данных полученных на плазме крови нельзя переносить также и на эритроциты. Следовательно, как об этом свидетельствуют наши полученные результаты, повидимому, истинную картину изменений спектра крови при сахарном диабете предпочтительнее оценить по данным полученным на отмытых эритроцитах. Таким образом, СД типа 1 у пациентов сопровождается с дислипидемией атерогенного характера, с активацией процессов липидной пероксидации, проявляющейся увеличением содержания как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ, а также нарушениями в системе антиоксидантной защиты. У пациентов с СД 1 отмечались увеличение суммарного содержания насыщенных жирных кислот (НЖК) в основном за счет миристиновой кислоты, уменьшение суммарного содержания ненасыщенных жирных кислот (ННЖК) по сравнению с контролем: наиболее выраженные в группе больных с СД 1 c осложнениями. Отмечались прямые корреляционные взаимосвязи между активностью СОД и a-линоленовой кислотой (r = + 0,53; p < 0,05), уровнем ДГК и ферментативной активностью ГПО(r = +0,47; p < 0,05). Прямая корреляционная связь существовала и между концентрациями МДА и линолевой кислотой (r = + 0,67; p < 0,05). Увеличение соотношения омега-6/омега-3 ПНЖК в крови больных с СД 1 сопровождалось повышением активности и интенсивности ПОЛ, наиболее выраженные (p < 0,05) c осложнениями диабета. Суммарное соотношение омега-6/омега-3 снижалось (p < 0,05) за счет повышения активности СОД+КТ (r = -0,763; p < 0,05, n = 23). Таким образом, у больных с СД 1 с осложнениями, на фоне дислипидемии выявлены существенные изменения как уровня, так и состава жирных кислот в крови, нарастание концентрации свободных радикалов и снижение активности ферментов антиоксидантной защиты, что может привестик нарушению функциональной активности цитомембран. 77 ГЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ КРОВИ ПРИ ОЖИРЕНИИ И САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 2 ТИПА У ЖЕНЩИН С ИНСУЛИНРЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА Известно, что в основе развития сахарного диабета 2 типа лежат инсулинорезистентность периферических тканей и недостаточная секреция инсулина. Многочисленные проспективные исследования подтверждают тесную связь между ожирением и сахарным диабетом 2 типа. Инсулинорезистентность часто выявляется у лиц с ожирением [9,144]. По мнению ряда авторов, формированию резистентности к инсулину предшествует дефицит в клетках эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот (ПННЖК). Эндогенный недостаток в клетках (ПННЖК) приводит к изменению жирно-кислотного состава фосфолипидов и физико - химических свойств плазматических мембран, понижению их жидкостности, нарушению функционирования рецепторов к инсулину и транспортных систем поступления в клетку глюкозы. Вследствие блокады поглощения жирных кислот (ЖК) усиливается компенсаторное увеличение пассивного поглощения клетками неэстерифицированных свободных жирных кислот (СЖК) [26,73,217], что активизирует липолиз, гиперинсулинемии (ГИ) рецепторов при ГИ усиливает секрецию инсулина и развитию [106]. Нарушение ауторегуляции инсулиновых еще больше усиливает периферическую инсулинрезистентность (ИР). Однако, патогенетическая роль ЖК вследствие нарушения их транспорта связанное с дисфункцией инсулиновых рецепторов недостаточно изучено. В связи с этим в данной подглаве мы приводим наши данные по изменению некоторых метаболических параметров в плазме крови у женщин с ожирениеми СД типа 2, страдающих дислипидемией, и связь этих показателей с инсулинсвязывающей активностью клеток. 78 4.1. Клинико-метаболические параметры у пациентов с ожирением и сахарным диабетом 2 типа Полученные результаты свидетельствуют, что при СД 2 происходят более значительные изменения в липидном составе крови по сравнению с группой больных с ожирением; повышение уровня общего ОХ, ТГ, ЛПНП и ЛПОНП, коррелирующими эритроцитами (r со = снижением 0,7). При показателями этом потребления снижается глюкозы уровень ЛПВП. Гипертриглицеридемия сопряжена с повышением содержания ЛПОНП и увеличенному поступлению ЖК, по-видимому, вследствие отсутствия ингибирующего влияния инсулина на продукцию и формирование ЛПОНП. Также отмечалось снижение как базального, так и стимулируемого потребления глюкозы эритроцитами по сравнению с контролем (p < 0,05). При О отмечалось увеличение концентрации всех продуктов ПОЛ в плазме крови, которые имели наибольшие значения у больных с СД типа 2 (табл.6). При этом установлено, что определяется взаимосвязь между соотношением глюкоза/ инсулин натощак и систолическим АД (r = 0,71; p < 0,05). 79 Таблица 6. Изменение некоторых клинико-метаболических показателей у женщин с инсулинрезистентностью при ожирении и СД 2 типа (M ± SD) ОХС,ммоль/л Контроль (n = 30) 4,53 ± 0,21 Ожирение (n = 15) 5,80 ± 0,55 СД тип 2 (n= 35) 5,82 ± 0,29 ТГ, ммоль/л 0,68 ± 0,05 1,71 ± 0,23* 2,93 ± 0,37* ХС ЛПВП, ммоль/л 1,43 ± 0,12 1,19 ± 0,07 1,05 ± 0,08* ХС ЛПНП, ммоль/л 2,76 ± 0,23 3,82 ± 0,44 4,30 ± 0,57* МДА в ЛПНП, нмоль/мл Гидроперекиси в ЛПНП, ммоль/мл Глюкоза/инсулинусл.ед. 3,09 ± 0,12 4,83 ± 0,485 5,98 ± 0,58* 3,22 ± 0,59 6,11 ± 1,96 * 8,41 ± 1,16* 0,54 ± 0,09 4,2 ± 0,3 ИМТ,кг/м ² 21,89 ± 0,61 26,97 ± 0.84 34,37 ± 1,07 ОТ,см 72,34 ± 1,35 91,05 ± 2,34 97,34 ± 1,87 ОБ, см 98,34 ± 1,53 108,46 ± 1,92 110,38 ± 1,47* ОТ/ОБ,усл.ед Систолическое АД, мм рт.ст. Диастолическое АД,мм рт.ст Пульс, уд / мин 0,73 ± 0,01 0,84 ± 0,02 0,88 ± 0,08 Показатель 105 ± 2,0 117,0 ± 4,9* 65 ± 2,1 73,1 ± 2,6 70 ± 0,63 76,70 ± 1,01 * 7,3 ± 0,4* 156,0 ± 3,1* 87,2 ± 2,3 81,20 ± 0,87 Примечание-* достоверно по сравнению с контрольной группой (p < 0,05). Отмеченная на табл. 6 дислипидемия сопровождалось активацией свободнорадикальных реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) у больных с ожирением и СД2, что привело к снижению утилизации глюкозы (УГ) в цитомембранах Эр (p < 0,05). Например, содержание МДА возрастает в мембранах Эр у больных СД2 1,8 раза, гидроперекиси в - 1,5 раза, утилизация глюкозы эритроцитами снижается на 1,93 раза, значительно снижается активность ферментов- антиоксидантов, например, активность CuZn-COD снижается 1,83 раза (p < 0,05)(табл.7). 80 Таблица 7. Изменение некоторых показателей антиоксидантной защиты и утилизации глюкозы эритроцитами у различных групп больных женщин (M ± SD) Утилизация Группа АОЗ, CuZn-COD, Каталаза, ммоль/л ед/мг Hb ед/мг Hb Глутатион- глюкозы пероксидаз, Эр, ед/мгHb мкмоль(2х1 0 9) кл/час Контроль ( n = 25) Ожирение (n = 15) СД2 (n= 25) 56,7 ± 2,3 1380 ± 31 622 ± 2,8 48,6 ± 0,6 1,68 ± 0,05 41,7 ± 2,4* 923 ± 29* 510 ± 4,3* 46,0 ± 0,6 0,93 ± 0,04* 39,9 ± 1,1* 752 ± 23* 490 ± 3,9* 40,3 ± 0,57 0,87 ± 0,03* Примечание: *- достоверно по сравнению с контролем (p< 0,05). Достоверное снижение инсулинсвязывающей активности (ИСА) и утилизации глюкозы (УГ) в этих группах свидетельствует также о наличии инсулинрезистентности (ИР). Резко выраженная гипергликемия, т.е. значительное снижение степени утилизации глюкозы, а также активности ферментов антиоксидантной защиты при высокой степени пероксидации липидов, отмечается особенно в группе больных с СД 2. 4.2. Состояние метаболизма жирных кислот у различных групп женщин В пуле НЖК максимальное повышение отдельных фракций отмечается также у больных СД 2 (рис.3, рис.4, рис.5): миристиновой (С14:0) кислоты - на 76%, пальмитиновой (С16:0) – на 35,8%, стеариновой (С18:0) – 24,8% по отношению к контрольной группе. Через 2 недели наблюдения в, изменения во фракционном составе НЖК имели разнонаправленный характер: повышение уровня миристиновой кислоты на 77%, а пальмитиновой кислоты на 19,4% по 81 отношению к контрольным значениям. Анализ концентрации отдельных ПННЖК показал, что уровень a- линоленовой (С18:3𝜔3) кислоты при СД2 снижается на 63%, при О - напротив, повышается на 38% (p < 0,05). При СД 2 по сравнению с контролем, повышается суммарное содержание 𝜔6-ПННЖК более чем в 2 раза (табл.8, рис.3). Таблица 8. Уровень жирных кислот в плазме крови у больных с ожирением и сахарным диабетом типа 2,по сравнению с их уровнем у контрольной группы (% от суммы жирных кислот, M ± SD) Сахарный Контрольная Семейство Жирные кислоты ПНЖК группа (n = 28) Ожирение (n = 15) диабет 2типа (впервые выявленный) (n = 30) 𝜔 3-ПННЖК 20:5(ЭПК) 0,6 ± 0,12 0,45 ± 0,07 0,36 ± 0,03* 22:6 (ДГК) 2,2 ± 0,8 2,18 ± 0,09 1,23 ± 0,23 * 18:2(линолевая 14,0 ± 3,5 11,98 ± 0,28* 39,3 ± 4,1 * 0,3 ± 0,05 0,88 ± 0,12 0,7 ± 0,2 * 8,3 ± 1,9 6,14 ± 0,98 5,01 ± 1,1 * 𝛴𝜔3- ПННЖК 2,9 ± 0,1 2,73 ± 0,12 1,6 ± 0,4* 𝛴𝜔6- ПННЖК 23,6 ± 3,1 19,5 ± 3,4 48,6 ± 3,2* 𝜔3-ПННЖК /𝜔 6-ПННЖК, ед. 0,097 0,14 0,028 Σ НЖК 31,87 ± 3,01 35,00 ± 2,05 38,60 ± 2,20 * Σ ННЖК 68,13 ± 2,35 65, 00 ± 3,21 61,2 ± 2,3* НЖК / ННЖК, ед 0,46 ± 0,05 0,54 ± 0,01 0,63 ± 0,02 * 𝜔6-ПННЖК кислота 20:3(дигомо-γ линоленовая кислота) 20:4(арахидоновая кислота) Примечание: *- отличия достоверны по сравнению с контрольной группой (p< 0,05), Σ- сумма. 82 Возрастание суммарного уровня 𝜔6 −ПННЖК имеющее место при СД2, сопровождается уменьшением коэффициента 𝜔3ПННЖК/ 𝜔6-ПННЖК, что было обусловлено низкой концентрацией a-линоленовой кислоты, а также ЭПК и ДГК (30% и 52% соответственно). При этом соотношение 𝛴𝜔3-ПННЖК/𝛴𝜔6ПННЖК снизилось у диабетических больных более чем в 3 раза (p < 0,05). Изменения во фракционном составе ЖК у пациентов с О по сравнению с контрольной группой имели такое же направление, как и у больных СД2, но были менее выражены. Отмечались прямые корреляционные взаимосвязи между активностью СОД и a-линоленовой кислотой (r = + 0,53; p < 0,05), уровнем ДГК и ферментативной активностью ГПО (r = + 0,47; p < 0,05). Прямая корреляционная связь существовала и между концентрациями МДА и линолевой кислотой (r = + 0,67; p < 0,05). Увеличение соотношения омега6/омега-3 ПННЖК в крови больных с СД 2 сопровождалось повышением активности и интенсивности ПОЛ (p < 0,05). Суммарное соотношение омега-3/омега-6 (p < 0,05) снижалось за счет повышения суммарной активности СОД+КТ (r = -0,763; p < 0,05; n=19). Приведенные результаты свидетельствуют, что у пациентов с СД 2 типа по сравнению с пациентами с О установлены более выраженные нарушения жирнокислотного состава сыворотки крови за счет группы ЖК омега-3 и омега6, сохранявшиеся в течение всего периода наблюдения. Также отмечено увеличение коэффициента НЖК/ННЖК. Эти изменения связаны, по-видимому, с тем, что при липолизе в первую очередь мобилизуются ННЖК, которые и окисляются первыми [77,151]. Можно предположить, что этим объясняется активация процессов перекисного окисления липидов у больных при О и СД типа 2 [73]. 83 А Б В Рис. 3: Хроматограммы жирных кислот в плазме: А - контрольная группа; Б -пациенты с ожирением, В -пациенты с СД2 типа. 84 4.3. Сравнительная характеристика показателей жирных кислот в плазме крови и эритроцитах у больных сахарным диабетом 2 типа Представленные результаты в таблице 9, свидетельствуют, что сравнительная картина семейств жирных кислот у больных СД 2 типа также подтверждают, что изменения исследуемых параметров в плазме и эритроцитах значительно отличаются. Суммарное соотношение НЖК/ННЖК в эритроцитах повышается 1,5 раза, в то время как в плазме это соотношение снижается 1,2 раза(p < 0,005). При сравнении результатов анализов семейств жирных кислот в контрольной группе и при СД 2 типа, в плазме крови и эритроцитах, показало следующую картину (табл.9, рис.4, рис.5): если в плазме крови уровень альфалинолевой кислоты достоверно возрастает – 1,6 раза, в эритроцитах, при этом, концентрация альфа-линолевой кислоты снижается более чем в 4,28 раза (p< 0,001) (см. табл.9). 85 Таблица 9. Сравнительная характеристика уровней жирных кислот в эритроцитах иплазме крови у больных при СД 2 типа (% от суммы жирных кислот, M±SD) Эритроциты Эритроцитыпр Плазма крови Плазма крови (контроль) и СД 2 типа (контроль) при СД 2 типа (n= 15) (n= 32) (n= 15) (n= 32) C20:5 (ЭПК) 1,73 ± 0,15 3,363 ± 1,126* 1,05 ± 0,26 0,766 ± 0,173* C22:6 (ДГК) 3,86 ± 0,39 2,198 ± 1,058* 2,59 ± 0,23 3,365 ± 0,521* C18:3 (Альфа- 0,196 ± 0,018 0,124 ± 0,045** 0,55 ± 0,14 0,858± 0,058**** 14,84 ± 0,66 13,715 ± 1,013* 13,36 ± 1,43 15,489 ± 1,637* 0,143 ± 0,014 0,288 ± 0,099* 0,53 ± 0,023 0,217± 0,091**** 13,95 ± 0,21 12,537 ± 0,989* 0,309 ± 0,099 0,650± 0,124**** ∑НЖК 41,05 ± 0,66 50,519±4,51*** 63,43 ± 1,64 57,054 ± 3.513** ∑ННЖК 58,94 ± 0,66 49,481±4,51*** 36,57 ± 1,64 42,946 ± 3,513** ∑НЖК / ∑ННЖК 0,69 ± 0,019 1,036±0,171*** 1,74 ± 0,12 1,344 ± 0,197*** ∑ω3 5,79 ± 0,53 5,685 ± 1,519 4,198 ± 0,48 4,989 ± 0,577* ∑ω6 28,95 ± 0,44 26,492 ± 1,647* 14,21 ± 1,4 16,357 ± 1,632* ∑ω7 0,65 ± 0,09 0,38±0,098**** 2,401 ± 0,173 2,512 ± 0,213 ∑ω9 23,52 ± 0,74 16,82 ± 1,79*** 15,67 ± 0,37 18,74 ± 2,15* Жирные кислоты ω3- ПННЖК линоленовая) ω6- ПННЖК C18:2 (Линолевая) C20:3 (Дигомо γ- линоленовая) C20:4 (Арахидоновая) Примечание:*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,005; ****: p < 0,001. p - достоверность различий с показателями в контроле 86 А Б В Рис. 4: Хроматограммы жирных кислот в плазме А – контрольная группа; Б - пациенты с ожирением, В – пациенты с СД2 типа. 87 А Б В Рис. 5: Хроматограммы жирных кислот в эритроцитах А – контрольная группа; Б - пациенты с ожирением, В – пациенты с СД2 типа. 88 Отрицательные корреляционные взаимоотношения отмечаются во всех исследуемых параметрах (см. табл.9): если уровень ЭПК в эритроцитах при СД2 возрастает в 1,9 раза (p < 0,05), в плазме крови - напротив - снижается в 1,35 раза (p < 0,05). Противоположные изменения отмечаются в значениях ДГК жирной кислоты (p < 0,05) в эритроцитах и в плазме. Содержание альфалиноленовая ЖК достоверно возрастает в эритроцитах и – снижается в плазме крови. Аналогичные сдвиги отмечаются во всех изучаемых показателях, которые представлены на хроматограммах 3 и 4 и на табл.9. Таким образом, сравнительная характеристика изучаемых параметров при СД 2 в эритроцитах и плазме, так как и в предыдущей главе показывает, что прямой корреляции в плазме крови и в эритроцитах не отмечается. Еще раз необходимо подчеркнуть тезис, что данные полученные в плазме крови нельзя переносить и на эритроциты. Что же касается эритроцитов: многочисленные исследования свидетельствуют о высоких корреляциях между изменениями свойств мембран эритроцитов и клеточных мембран внутренних органов, что позволяет использовать эритроцитарные мембраны в качестве естественной модели для исследования общих характеристик всех биомембран и общих характеристик особенностей метаболизма мембранных липидов [52,56,62,110]. Повидимому, истинную картину изменений спектра крови при сахарном диабете предпочтительнее оценить по данным полученным на отмытых эритроцитах. Следовательно, анализ полученных данных свидетельствует, что у больных СД 2 типа и у пациентов с О отмечается повышение показателей ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП, а также КА по сравнению с контрольной группой. Эти изменения позволяют утверждать, что развитие СД 2 у женщин, также, как и при О сопровождается дислипидемией атерогенного характера. При этом у больных с СД 2 типа имеет место более выраженные изменения количественного состава липидов,в том числе жирнокислотного состава крови. О и СД 2 сопровождаются модификацией состава свободных и эстерифицированных ЖК эритроцитов и плазмы крови, что может привести к 89 изменению функциональной активности мембран, к нарушению инсулинсвязывающей активности цитомембран. Нарушение метаболизма жирных кислот сопровождающиеся нарастанием концентрации свободных радикалов и снижением активности ферментов антиоксидантной защиты сопровождается снижением инсулинсвязывающей нарушением процессов утилизации глюкозы. активности клеток и 90 ГЛАВА 5. МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ И ГОМОГЕНАТАХ ПЕЧЕНОЧНОЙ ТКАНИ, СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ И КОЖИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ В предыдущих главах исследования нами было изучено изменения в липидном, липопротеидном и жирнокислотном обмене веществ при ожирении,СД 1 типа, СД 2 типа, а также баланс ПОЛ- АОА при этих состояниях. В данной главе мы представляем результаты, исследования посвященные состоянию обмена жирных кислот и других метаболических нарушениях в разные сроки развития сахарного диабета в эксперименте на крысах. Известно, что гипергликемия при сахарном диабете сопровождается также нарушением липидного обмена с возрастанием уровня свободных жирных кислот (СЖК) [132,195]. Патологические последствия при СД связывают с накоплением и нарушением метаболизма ЖК [9,119]. Длительное существование избытка СЖК приводит к усилению инсулинрезистентности, истощению инсулярного ответа и, в конечном счете, к стойкой гипергликемии. Еще одним эффектом, опосредованным СЖК, является ингибирование окисления углеводов, т.е. снижение утилизации глюкозы и ещё более высокой гипергликемии [204]. В результате усиливается секреторный инсулиновый дефект как из-за токсического воздействия СЖК (липотоксичности) на панкреатические β-клетки, так и из-за развития гипергликемии (глюкозотоксичности), поэтому дальнейшее изучение механизмов развития таких нарушений может способствовать эффективному восстановлению или сохранению эндокринной функции поджелудочной железы [196]. Однако, несмотря на многочисленные исследования в этой области, многие вопросы, связанные с особенностями нарушений липидного обмена, в частности, обмена жирных кислот у диабетических больных, остаются нерешенными. В связи с этим мы в эксперименте на крысах изучали состояние обмена жирных кислот в динамике после введения животным стрептозотоцина 91 в разных тканях: в крови (эритроцитах), в гомогенатах печени, сердца и кожи. При этом исследовали такжев разные сроки развития диабета в эксперименте состояние системы АОА, перекисное окисление липидов и утилизацию глюкозы эритроцитами. Эксперименты проводили на 70-ти половозрелых белых крысах-самцах линии Wistar, массой 180 - 210 г., которые содержались в условиях вивария РНИМУ с естественным сбалансированной по световым содержанию режимом питательных на полнорационной веществ диете для лабораторных животных, согласно ГОСТ Р502580092 (см.главу 2). СД вызывали, после 24 - 48 часового голодания, однократным внутрибрюшинным введением 2,5% раствора стрептозотоцина («Sigma», США) приготовленного на 0,1 М растворе цитрата натрия (pH-4,5) в дозе 60 мг/кг [8]. Количественное определение глюкозы в крови проводили на 3, 7, 14, 21, 28, 35 сутки после введения стрептозотоцина. Определение массы тела производили исходно (за 7 дней до введения препарата), а также на 3, 7, 14, 28, 35 сутки после введения стрептозотоцина. Контрольным физиологического методическим животным раствора. руководствам вводили Эксперименты и эквивалентное были нормативным выполнены документам, количество согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96). У крыс с индуцированным СД верификацию осуществляли по увеличению концентрации глюкозы в крови крыс в 3 - 4,5 раза, снижения массы тела, развития полиурии и полидипсии [43]. Уровень глюкозы в крови у крыс на третьи сутки после введения стрептозотоцина достоверно увеличился в 3,2 раза, а в моче - в 5,7 раз, по сравнению с контрольной группой животных. В течение последующих дней наблюдений количество глюкозы в крови крыс этой группы животных также оставалось стабильно высоким (рис.6). 92 Рис. 6: Динамика концентрации глюкозы после введения стрептозотоцина крысам При этом максимального значения уровень гликемии натощак достиг к 28-му дню исследования (24,52 ± 1,82 ммоль/л). Декомпенсация у таких крыс подтверждалась снижением содержания С-пептида в плазме крови, на 21 день эксперимента, в группе крыс с диабетом на - 39,6% (p < 0,05); потребление воды увеличивалось в среднем в 2,5 раза и отмечалась полиурия; резко снизилась масса тела (на 7-ой день - 28%, к 14-му дню - 26%, а к 21-му дню 39%). О наличии дисбаланса в углеводном обмене у диабетических крыс свидетельствует присутствие глюкозы в моче, количество которой было не стабильно и варьировало в пределах от 3,8 до 1,9 ммоль/л. Изменение некоторых метаболических параметров на 7-ие сутки после введения стрептозотоцина представлены на табл.10. 93 Таблица 10. Метаболические изменения в крови крыс на 7-е сутки введения стрептозотоцина (М±SD) Показатели Контроль(n=10) Диабет(n=10) Глюкоза, ммоль/л 5,66 ± 0,15 19,95 ± 1,1* Hb1Ac, % 3,42 ± 0,07 6,69 ± 0,25* Холестерин, ммоль/л 2,55 ± 0,11 3,91 ± 0,16* Триглицериды,ммоль/л 0,91 ± 0,05 2,27 ± 0,09 * ЛПНП, ммоль/л 3,30 ± 0,15 5,97 ± 0,28 * ЛПОНП, ммоль/л 0,72± 0,04 0,89 ± 0,04 ЛПВП, ммоль/л 1,57 ± 0,07 1,12 ± 0,05 * 0,78 ± 0,05 0,92 ± 0,03 * Каталаза, мкат/л 6,04 ± 0,19 4,48 ± 0,21 * ИСА, % в эритроцитах 18,38 ± 0,74 10,72 ± 0,76* ТБК-активные продукты, мкмоль/л Утилизация глюкозы эритроцитами, мкмоль/ 2,75±0,15 (50%) (2х109кл)/ч 0,78±0,03* (28,6%) Примечание:* - отмечены статистически достоверные значения по сравнению с контролем. Как видно из представленных в табл.10 данных, у животных в группе СД отмечено статистически достоверное увеличение концентрации глюкозы на 7 сутки после введения препарата в плазме крови в 3,52 раза и гликозилированного гемоглобина - в 1,95 раза. Значительные изменения претерпели показатели липидного обмена, в частности уровень общего холестерина возрос на 53 % ( p < 0,01), триглицеридов - на 16 %, ЛПНП - на 77% (p < 0,001), ЛПОНП- на 24 %; одновременно уровень ЛПВП снизился на 29,9% (p < 0,05). Установлено также увеличение у этих животных содержания ТБК-активных продуктов (на 25 %), мочевины (на 42 %, p < 0,05), снижалась 94 активность каталазы, расщепляющего пероксид водорода -на 35% (p < 0,05). На фоне снижения инсулинсвязывающей активности (ИСА) мембран эритроцитов (табл.10), в 3,5 раза снизились показатели утилизация глюкозы эритроцитами. Отмечались значительные нарушения метаболических процессов и в печени, результаты этих исследовании представлены на табл.11. Таблица 11. Метаболические изменения в печеночной ткани крыс на 7-е сутки введения стрептозотоцина (М ± SD) Контроль Диабет (n=10) (n=10) ГПЛ, усл. Ед./г 4,10± 0,09 5,50 ± 0,09* Каталаза, мкат/кг 13,76 ± 0,45 8,46 ± 0,26* СОД, усл. ед./кг 2,67 ± 0,05 1,87 ± 0,09* Г- SH, моль/кг 6,05 ± 0,22 4,29 ± 0,05* ЦХО, моль/(мин.кг) 6,75 ± 0,09 5,72 ± 0,12* СДГ, моль/(мин.кг) 8,79 ± 0,24 7,04 ± 0,19* 2,07 ± 0,11 3, 87 ± 0,23 28,92±0,71 20,55± 0,95* Показатели МДА, нмоль/ мг белка ИСА,% Примечание:*- статистически достоверные значения по отношению к контролю Результаты исследования, представленные на табл.11, свидетельствуют о том, что в гомогенатах печени также отмечается статистически достоверное возрастание ТБК - активных продуктов при диабете у крыс (43%; p<0,01); гидроперекисей липидов на 34% (p < 0,05), при этом также достоверно снижается активность ферментов антиоксидантной защиты: каталазы на 35%, СОД - на 30%,количество восстановленного глутатиона снижается- на 29%. В гомогенатах печени понижалась активность фермента цикла трикарбоновых 95 кислот – сукцинатдегидрогеназы (СДГ) – на 19% и одного из компонентов цепи транспорта электронов- цитохромоксидазы (ЦХО) – на 15% по сравнению с группой контрольных животных, что свидетельствует о выраженности гипоксии в печёночной ткани. Кроме того, имело место снижение инсулинсвязывающей активности у диабетических крыс в гомогенатах печени в 1,4 раза (p < 0,001), что свидетельствует о значительном снижении чувствительности гепатоцитов на инсулин. При этом снижается ИСА также в мембранах эритроцитов (Эр)(p < 0,05) (табл.10). О нарушении процессов утилизации глюкозы в изучаемых тканях свидетельствует также отрицательная корреляционная взаимосвязь между уровнем глюкозы крови и процессами утилизации глюкозы Эр (r = - 0,62; p < 0,05), и гомогенатами печени (r = - 0,52; p< 0,05). Анализ литературных данных свидетельствует, что после введения стрептозотоцина у крыс на 7-10 сутки наступают клинико - биохимические изменения характерные сахарному диабету человека [171]. После введения стрептозотоцина крысам клинико-метаболические изменения в крови у крыс,в наших экспериментах, показаны на табл.10 и 11 и на рис.6. Результаты наших исследований свидетельствуют, что гипергликемия развивалась с самого начала введения стрептозотоцина: на 3 сутки уровень глюкозы достоверно повысилась в крови более чем в 2 раза (рис.6) на 7 сутки более чем в 3,5 раза, через 28 дней после введения препарата уровень гликемии составила 27,88 ммоль/л, при уровне 5,77 ммоль в контроле. Дальше отмечалось тенденция к снижение уровня гликемии. Параллельно к гипергликемии в зависимости от длительности времени после введения стрептозотоцина,возрастала и концентрация МДА и других ТБК-активных продуктов, во всех изучаемых нами тканях достигая высоких значении на 28 сутки после введения стрептозотоцина (рис.7, рис.8-10). 96 Рис. 7: Концентрация МДА в эритроцитах крыс (мкмоль/литр, M ± SD) Повышение было особенно значительным в гомогенатах кожи и печени на 28 сутки после введения стрептозотоцина (p < 0,05). Как видно из представленных рис. 11 и 12, концентрация ТБК активных веществ в гомогенатах кожи и печени на 28 сутки введения стрептозотоцина возрастает более чем в 2 раза (до 0,254 ± 0,012 при 0,123 ± 0,001 в контроле – в печени и до 0,141 ± 0,002 по сравнению с контрольным уровнем 0,062 ± 0,003 нмоль /мг ткани кожи). Рис. 8: Концентрация МДА в ткани кожи крыс (нмоль/мг ткани, M ± SD) 97 Рис. 9: Концентрация МДА в ткани печени крыс (нмоль/мг ткани, M ± SD) Рис. 10: Концентрация ТБК- ап. в эритроцитах крыс (мкмоль.10-12/эритр., M ± SD) 98 Рис. 11: Концентрация ТБК-ап. в ткани кожи крыс (нмоль/мг ткани, M ± SD) Рис. 12: Концентрация ТБК-ап. в ткани кожи, печени и сердечной мышцы (нмоль/мг ткани, M ± SD) Приведенные на рис.7-12 и в таблицах 10 и 11 данные по изучению уровня липидной пероксидации в общей группе больных показали увеличение 99 содержания, как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ по сравнению с контрольной группой. Накопление продуктов пероксидации липидов может вести к появлению в мембранах своеобразных пор за счёт увеличения содержания гидрофильных углеводородных хвостов, а также к увеличению её жёсткости за счёт снижения содержания ненасыщенных жирных кислот и, таким образом, влиять на состояние инсулиновых рецепторов, снизить их гормонсвязывающую активность и привести к снижению потребления глюкозы клетками, что подверждено результатами нашего экспериментального исследования. Аналогичные данные были получены также другими авторами [77]. Кроме того, обнаруженное нами повышение концентрации МДА в плазме крови может свидетельствовать об усилении перекисных процессов в липопротеиновых комплексах, что может стать дополнительной причиной нарушения сродства липопротеинов к их рецепторам и, таким образом, способствовать образованию холестериновых бляшек на стенках сосудов [85,137]. Наряду с увеличением интенсивности СРО липидов и нарушением структуры и свойств эритроцитарной мембраны при стрептозотоциновом диабете наблюдается изменения в системе антиоксидантной защиты. Так показано, что в крови у крыс имеет место повышение активности КТ. Возрастание активности КТ в эритроцитах больных диабетом можно назвать компенсаторной реакцией на увеличение интенсивности СРО СД, в то время когда другие компоненты АОС оказываются значительно чувствительнее к усилению окислительных процессов в клетке, что было показано в главе 3 и 4 нашего исследования, и это проявляется снижением активности других ферментов антиоксидантов (СОД, ГПО). 100 Рис. 13: Значение активности каталазы в крови у крыс (мкат/литр, M ± SD) При изучении корреляционных взаимоотношении оказалось, что концентрация глюкозы коррелировала с концентрацией МДА (r = 0,896) в эритроцитах; то же самое (r = 0,614) - в коже; то же самое (r =0,356) в гомогенатах сердца; то же самое (r = 0,686) и в гомогенатах печени. Отмечались прямые корреляционные взаимоотношения глюкозы в крови с каталазной активностью в крови (r = 0,586). На табл.12 и 13, рис.14, рис.15, приводятся данные изменения жирнокислотного состава в изучаемых тканях на 7-10 сутки после введения стрептозотоцина. 101 Таблица 12. Уровень жирных кислот в эритроцитах и гомогенатах печеночной ткани у крыс на 7-10 день после введения стрептозотоцина (% от суммы жирных кислот, M±SD) Гомогенаты Гомогенаты печени печени (контроль) (опыт) (n = 10) (n = 10) 1,32±0,03 * 0,270±0,047 0,532±0,44* 4,436±0,511 4,75±0,23 * 4,84±0,83 5,950±0,080* 14,221±0,140 13,81±0,49 * 20,46±0,25 21,26±0,27* 0,30±0,02 0,75 ±0,21 * 0,38±0,01 0,43±0,09 13,746±0,479 11,09±0,091 * 19,27±1,08 17,51±0,96 Σ НЖК 43,116 ± 1,916 54,354 ± 0,70* 36,691 ± 0,087 39,944 ± 0,548* ΣННЖК 56,884 ± 1,916 45,646 ± 0,70 * 63,309 ± 0,087 60,056 ± 0,548* НЖК/ ННЖК Σ 𝜔3 0,759 ± 0,059 1,191 ± 0,034* 0,580 ± 0,002 0,665 ± 0,015* 5,67±0,41 6,28±0,53 * 5,49± 0,95 6,91±0,05* Σ 𝜔6 28,68±1,35 25,94±0,79* 34,88±0,91 38,92±0,66* Σ 𝜔7 1,69±0,05 1,23±0,08 * 1,85±0,01 0,81±0,06* Σ 𝜔9 20,983±1,330 12,19±0,45 16,31±0,93 13,38±0,06 Эритроциты Эритроциты (контроль) (опыт) (n = 10) (n = 10) 20:5(ЭПК) 1,003 ±0,020 22:6 (ДГК) 18:2(линолевая Жирные кислоты кислота) 20:3(дигомо -γ линоленовая кислота) 20:4(арахидоновая кислота) Примечание: * -отличия достоверны по сравнению с контрольной группой (p< 0,05), Σ- сумма. Как видно из табл.12, рис.14, в пуле НЖК максимальное повышение уровня отдельных фракций в Эр отмечается, в опытной группе крыс, на 7-е сутки после введения стрептозотоцина: миристиновой (С14:0) кислоты - на 56%, пальмитиновой (С16:0) – на 45,8%, стеариновой (С18:0) – 24,8% по отношению к контрольной группе. Содержание мононенасыщенных жирных кислот (ЖК) пальмитоолейновой и миристоолейновой было низким. 102 Образование мононасыщенных кислот из насыщенных жирных кислот катализируется 9- десатуразой. При гиперэкспрессии 9-десатуразы происходит возрастание уровня пальмитиновой кислоты относительно стеариновой. А Б Рис. 14: Хроматограммы жирных кислот в эритроцитах А – контрольная группа; Б – через 7 дней после введения стрептозотоцина. 103 В Г Рис.15. Хроматограммы жирных кислот в гомогенатах печени: Рис. 15: Хроматограмма жирных кислот в гомогенатах печени В – контрольная группа; Г – через 7 дней после введения стрептозотоцина. Свидетельством повышенной активности синтазы ЖК в Эр в опытной группе может являться тот факт, что в опытной группе крыс уровень пальмитиновой кислоты снижен на 15,7 % (p < 0,05) в сравнении с контролем, а 104 суммарное содержание стеариновой и арахиновой на 38,30% (p < 0,05). В отличие от других насыщенных ЖК уровень миристиновой кислоты в эритроцитах опытной группы не снижается, а наоборот имеет тенденцию к росту (р = 0,2), по-видимому в связи с тем, что миристиновая ЖК в основном включается в клеточные ТГ [2], что приводит к гипертриглицеридемии (табл.10). Уровень олейновой ЖК в Эр и гомогенатах печени (ГП) снижается в 1,72 ± 0,09 и 1,2 ± 0,03 раза соответственно (p < 0,05, табл.12, рис.14). Между тем, как в Эр, так и в ГП крыс достоверно повышается уровень насыщенной пальмитиновой ЖК, и, снижаются уровни МННЖК (за счёт олеиновой кислоты, омега-9). В спектре ЖК, в семействе ПННЖК, отмечается умеренное снижение полиеновых ЖК в Эр на 11,2%, по сравнению со значениями в контроле. Несмотря на то, что концентрация ЭПК и ДГК достоверно повышается, при этом значительно снижается суммарное содержание омега-3 ЖК, за счет альфа - линолевой кислоты. 𝛴𝜔6 жирных кислот достоверно снижается не только в эритроцитах, но и в гомогенатах печени. Суммарное содержание ЖК в семействе 𝜔9 ЖК в Эр на 7 сутки после введения стрептозотоцина достоверно снижается. Таким образом, при экспериментальном СД изменения в жирнокислотном составе крови имеют существенное отличие от соответствующего спектра жирных кислот у больных СД (см. табл.8 и 9, табл.12 и 13, а также рис.14 и 15). В основном, это касается относительно уровня мононенасыщенных жирных кислот, препятствующих холестериновым бляшкам оседать на стенках сосудов. Таким образом, результаты наших экспериментальных исследования свидетельствуют о том, что уже в ранних стадиях развития СД в эксперименте у крыс изменения в липидном и жирнокислотном составе эритроцитов и гомогенатов печени имеют атеросклеротическую направленность. 105 Таблица 13. Уровень жирных кислот в гомогенатах сердечной мышцы и кожи у крыс на 7-10 день после введения стрептозотоцина (% от суммы жирных кислот, M ± SD) Жирные кислоты Гомогенаты Гомогенаты Гомогенаты Гомогенаты Сердца сердца кожи кожи (контроль) (опыт) (контроль) (опыт) (n = 10) (n = 10) (n = 10) (n = 10) 20:5(ЭПК) 0,150±0,068 0,250±0,016 0,170±0,020 0,219±0,001 22:6(ДГК) 2,716±0,176 2,874±0,292 0,853±0,111 0,620±0,010 18:2(линолевая 16,354±0,237 20,890±1,057 * 34,742±0,040 34,926±0,680 0,162±0,026 0,155±0,001 0,118±0,001 0,462±0,021 0,206±0,004 кислота 20:3(дигомо -γ 0,195 ±0,009 линоленоваякислота) 20:4(арахидоновая кислота) 17,980±0,320 11,734±0,891 * Σ НЖК 42,172 ± 0,61 46,145 ± 1,166 28,918 ± 0,996 32,898 ± 2,030 ΣННЖК 57,828 ± 0,61 53,855 ± 1,166 71,082 ± 0,996 67,102 ± 2,030 НЖК/ ННЖК Σ 𝜔3 0,730 ± 0,018 3,279±0,362 0,858 ± 0,042 3,447±0,123 * 0,407 ± 0,020 1,600± 0,025 0,491 ± 0,045 1,427±0,203 Σ 𝜔6 34,496±0,110 32,818±2,916 35,358±0,051 35,250±0,667 Σ 𝜔7 1,385±0,305 1,213±0,021 4,191±0,005 3,099±0,106* Σ 𝜔9 18,507±0,330 16,232±1,045 29,804±0,293 27,238±1,065 Примечание:* - отличия достоверны по сравнению с контрольнойгруппой (p < 0,05), Σ- сумма. Как видно из представленной табл.13, и рис.16 - 17, на 7-10 сутки после введения стрептозотоцина в сердечной мышце и коже возрастает суммарное содержание НЖК, за счет пальмитиновой, стеариновой и арахиновой ЖК, несмотря на то, что суммарный уровень ПННЖК увеличивается; например, концентрация ЭПК возрастает 1,66 раза- в гомогенатах сердца и 1,28 раза- в гомогенатах кожной ткани. Последующие дни наблюдения суммарное 106 соотношение НЖК/ННЖК в сердечной мышце еще больше увеличивается (см. рис.17). А Б Рис. 16: Хроматограммы жирных кислот в гомогенатах кожи А – контрольная группа; Б – через 7 дней после введения стрептозотоцина. 107 В Г Рис. 17: Хроматограммы жирных кислот в гомогенатах сердечной мышцы В – контрольная группа; Г – через 7 дней после введения стрептозотоцина. Суммарное соотношение НЖК/ННЖК особенно значительно возрастает через 28 дней после введения препарата (табл.14 и табл.15). При этом через 28 суток наблюдения достоверно повышается также уровни ДГК и ЭПК жирных кислот. В течение всего периода наблюдения имеет место снижение уровней омега-7 и омега-9 жирных кислот. Снижение уровня омега-7 (пальмитиновая и пальмитолеиновая кислоты) свидетельствует, что возрастает, при этом, уровень ТГ, что и приводит к возрастанию степени гликемии. Между пальмитиновой кислотой и ТГ отмечается прямая корреляция (r = +0,87), между уровнем глюкозы в крови и пальмитиновой кислоты отмечается также прямая корреляция (r = +0,63). Возрастание омега-9 связано с увеличением 108 концентрации олейновой кислоты. Аналогичная картина отмечается и в коже: на 28 день наблюдения после введения препарата достоверно повышаются уровени всех насыщенных жирных кислот, особенно значительно за счет миристиновой и пальмитиновой кислот. При этом отмечается снижение ПННЖК омега-3 и омега-7 (табл.15, рис.18 и рис.20). Между уровнем омега-3 и утилизацией глюкозы корреляционные в гомогенатах взаимосвязи т.е. кожи снижение имеется уровня также прямые ПННЖК омега-3 сопровождается снижением концентрации утилизированной глюкозы (r = + 0,53). Отмечаются отрицательные корреляции между уровнем ХС и семейством ПННЖК омега-3 (r = - 0,56) и ТГ и ПННЖК омега -3 (r = - 0,61). A Б Рис. 18: Хроматограмма жирных кислот в эритроцитах крыс A-контрольная группа, Б- Через 28 дней после введения стрептозотоцина. 109 Таблица 14. Уровень жирных кислот в эритроцитах и гомогенатах печени у крыс на 28-е сутки после введения стрептозотоцина (% от суммы жирных кислот, M ± SD) Эритроциты Жирные кислоты (контроль) (n = 10) Эритроциты Гомогенаты Гомогенаты (диабет-28 печени печени дней) (контроль) (диабет-28 дней) (n = 10) (n = 10) (n = 10) ω3- ПННЖК C20:5 (ЭПК) 1,003 ± 0,106 1,492 ± 0,031* 0,270 ± 0,047 0,594 ± 0,01* C22:6 (ДГК) 4,436 ± 0,599 5,055 ± 0,01** 4,847 ± 0,268 6,228 ± 0,077* C18:3(Альфа- 0,240 ± 0,021 0,181 ± 0,012* 0,382 ± 0,01 0,447 ± 0,018* C18:2 (Линолевая) 14,221±0,140 12,815 ± 0,206* 20,458±0,250 22,182 ± 0,511(+) C20:3 (Дигомо -γ- 0,514 ± 0,013 1,117 ± 0,076** 0,125 ± 0,005 0,209 ± 0,002*** 13,746±0,847 9,734 ± 0,013* 19,274±0,263 15,530 ± 0,747* ∑НЖК 43,116±1,916 57,602±1,459** 36,691±0,087 45,429± 0,11**** ∑ННЖК 56,884±1,916 42,398±1,459** 63,309±0,087 54,571± 0,11**** ∑НЖК / ∑ННЖК 0,759 ± 0,059 1,360 ± 0,081* 0,580 ± 0,002 0,832± 0,004**** ∑ω3 5,680 ± 0,079 6,728±0,034*** 5,498 ± 0,305 7,269 ± 0,087* ∑ω6 28,481±1,001 23,666 ± 0,269* 39,857±0,507 37,922 ± 0,238* ∑ω7 1,695 ± 0,055 1,111 ± 0,052** 1,820 ± 0,03 0,503± 0,017**** ∑ω9 20,986±1,332 10,813 ± 1,707* 16,086±0,747 8,878 ± 0,187** линоленовая) ω6- ПННЖК линоленовая) C20:4 (Арахидоновая) Примечание: *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,005; ****: p < 0,001 ; (+): 0,1 > p > 0,05; p - достоверность различий с показателями в контроле. 110 В Г Рис. 19: Хроматограмма жирных кислот в гомогенатах печени крыс В- контрольная группа, Г- через 28 дней после введения стрептозотоцина. 111 Таблица 15. Уровень жирных кислот в гомогенатах кожи и сердца у крыс на 28-е сутки после введения стрептозотоцина (% от суммы жирных кислот, M ± SD) Гомогенаты Жирные кислоты кожи (контроль) (n = 10) Гомогенаты кожи (диабет-28 дней) (n = 10) Гомогенаты Гомогенаты сердца сердца (контроль) (диабет-28 дней) (n = 10) (n = 10) ω3- ПННЖК C20:5 (ЭПК) 0,170±0,013 0,240 ± 0,013** 0,150 ± 0,003 0,277±0,07*** C22:6 (ДГК) 0,853 ± 0,055 0,417 ± 0,051* 2,716 ± 0,035 3,104± 0,083* C18:3(Альфа- 0,577 ± 0,015 0,670 ± 0,077* 0,413 ± 0,023 0,233 ± 0,020** 34,742±0,041 35,002 ± 0,370* 16,354±0,237 23,548 ± 1,842* C20:3 (Дигомо -γ- 0,155 ± 0,010 0,081 ± 0,001** 0,162 ± 0,026 0,252 ± 0,021* 0,462 ± 0,022 0,168 ± 0,02** 17,980±0,320 8,247± 0,119**** ∑НЖК 28,918±0,996 34,319 ± 1,216* 42,172±0,605 51,854 ± 0,22*** ∑ННЖК 71,082±0,996 65,681 ± 1,216* 57,828±0,605 48,146± 0,220*** ∑НЖК / ∑ННЖК 0,407 ± 0,02 0,523 ± 0,028* 0,730±0,0181 1,077 ± 0,01*** ∑ω3 1,600 ± 0,042 1,327 ± 0,029* 3,279 ± 0,055 3,615 ± 0,07* ∑ω6 35,358 ± 0,53 35,251 ± 0,390 34,496±0,110 32,047 ± 0,526* ∑ω7 4,191 ± 0,055 2,776±0,086*** 1,385 ± 0,039 0,989 ± 0,082* ∑ω9 29,804±0,836 26,257 ± 0,881* 18,507 ± 2,04 11,373± 1,14**** линоленовая) ω6- ПННЖК C18:2 (Линолевая) линоленовая) C20:4 (Арахидоновая) Примечание: *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,005; ****: p < 0,001 ; p - достоверность различий с показателями в контроле 112 А Б Рис. 20: Хроматограмма жирных кислот в гомогенатах ткани кожи крыс А- контрольная группа, Б- диабетическая группа 28 дней после стрептозотоцина инъекций 113 В Г Рис. 21: Хроматограмма жирных кислот в гомогенатах сердечной мышцы В- контрольная группа; Г-диабетическая группа через 28 дней после введения стрептозотоцина. Таким образом, при изучении особенностей липидного и жирнокислотного метаболизма при стрептозотоциновом сахарном диабете у 70 крыс линии «Вистар» установлено, что уже в ранние сроки развития диабета отмечаются значительные изменения в липидном и липопротеидном составе крови сопровождающиеся гипертриглицеридемией и гиперхолестеринемией, повышением уровней ЛПОНП и ЛПНП со снижением концентрации ЛПВП и утилизацией глюкозы эритроцитами. Повышение уровня насыщенной пальмитиновой жирной кислоты сопровождается снижением уровней МНЖК 114 (за счет олеиновой ЖК), что существенно отличается от соответствующего спектра у больных СД. Результаты исследования свидетельствуют о том, что уже на ранних стадиях развития СД изменения в липидном составе и пуле жирных кислот изучаемых тканей (эритроцитов, гомогенатов печени, кожи и сердечной мышце) имеет атеросклеротическую направленность. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время проблема заболеваемости СД у больных - одна из наиболее актуальных в современной эндокринологии. Особая её значимость определяется угрозой ранней инвалидизации пациентов и снижением общей продолжительности жизни в связи с развитием тяжелых сосудистых осложнений. В России ежегодно регистрируется от 4 до 10 новых случаев СД на 100 000 человек ,рост заболеваемости беспрерывно увеличивается в среднем на 5% [5,58]. Несмотря на увеличение заболеваемости СД, все возрастающий интерес к изучению развития патогенетические и течения механизмы данного этого заболевания, процесса остаются этиология до и конца невыясненными. По мнению ряда исследователей, важная роль в патогенезе СД принадлежит активации процессов СРО: дисбалансу между прооксидантами и антиокислителями, приводящему к избытку свободных радикалов и накоплению высокотоксичных продуктов СРО (окислительный стресс). Однако, даже учитывая высокую значимость участия СРО в патогенезе СД, до настоящего времени не было проведено комплексной оценки состояния системы «ПОЛ-АОС», которая в норме сбалансирована и функционирует по принципу обратной связи. В большинстве работ, характеризующих уровень СРО и состояния АОС больных с СД, изучены только отдельные компоненты данной системы, к тому же имеющиеся в литературе данные о характере изменения содержания и активности определяемых компонентов у больных с диабетом очень противоречивы [31,44,79,82,134,152]. 115 Несмотря на многочисленные исследования в области изучения обменных процессов при сахарном диабете, многие вопросы, связанные с особенностями нарушения липидного обмена, в том числе, обмена жирных кислот в эритроцитах, печени, сердечной мышце и коже у диабетических больных, остаются неизученными. Для выявления особенностей липидного обмена и взаимосвязи между нарушением гомеостаза глюкозы и обменом жирных кислот при сахарном диабете и его осложнениях в клинике и эксперименте нами проведено исследование, целью которого явилось изучение патогенетических механизмов нарушения липидного обмена при сахарном диабете и его осложнениях в клинике (при ишемической болезни сердца и других диабетических ангиопатиях ) и в эксперименте (на модели стрептозотоцинового диабета). В ходе работы обследовано 163 человека в возрасте от 25 до 65 лет с СД из них СД 1 48 человек с впервые выявленным СД. Исследования проводились в период ремиссии сопутствующих заболеваний. В качестве контрольной группы обследовано 30 человек (обоего пола) того же возраста, без эндокринной патологии. Результаты исследования представлены в зависимости от наличия осложнений основного заболевания. Изучение уровня липидной пероксидации в общей группе больных показало увеличение содержания, как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ по сравнению с контрольной группой. Накопление продуктов пероксидации может вести к появлению в мембранах своеобразных пор за счёт увеличения содержания гидрофильных углеводородных хвостов, а также к увеличению её жёсткости за счёт снижения содержания ненасыщенных жирных кислот и, таким образом, влиять на состояние инсулиновых рецепторов, снизить их гормон связывающую активность и привести к снижению потребления глюкозы клетками. Подтверждением этому являются полученные нами данные по определению утилизации глюкозы эритроцитами у пациентов с ожирением, больных СД 1 типа и СД 2 типа, которые свидетельствуют о том, что в эритроцитах у больных с СД снижается как базальное, так и 116 стимулируемое потребление глюкозы клетками, особенно значительно при СД 2 типа осложнённого ангиопатиями. У пациентов с ожирением базальное потребление глюкозы эритроцитами также снижается, но в меньшей степени. Но поскольку стимулируемое инсулином потребление глюкозы у этих больных угнетается в большей степени, то можно предполагать, что имеется тенденция к развитию инсулинрезистентности. Таким образом, полученные нами результаты по снижению степени потребления глюкозы эритроцитами позволяют считать, что клеточные мембраны при СД претерпевают существенные структурные и функциональные изменения, сопровождающиеся снижением энергообеспечением клеток. У больных СД 1 типа с осложнениями наблюдается повышение эндогенного уровня общих липидов сыворотки крови за счет увеличения концентрации ХС (в основном его этерифицированной формы) и тенденции к увеличению содержания ТГ. Нестабильность фракции НЭЖК и ТГ проявляется увеличением их соотношения НЭЖК/ТГ, что свидетельствует о дисбалансе в системе «Липолиз–липогенез». Кроме того, концентрация ХС ЛПВП в плазме крови у больных СД 1 в зависимости от наличия осложнений заболевания достоверно уменьшается (p < 0,01), при этом возрастает уровень ХС ЛПНП (p<0,01) и индекса атерогенности, особенно - у диабетических больных с осложнениями до 7,1 ед. (при норме 1,97 ± 0,08). У больных с гипертриглицеридемией отмеченный пониженный уровень ХС ЛПВП, повидимому, можно объяснить усиленным катаболизмом апо – липопротеидов. Установлено наличие количественных и качественных изменений спектра ЛП особенно значимых при СД 1 типа и СД 2 в зависимости от наличия осложнений. В целом, средние показатели ЛПВП были ниже таковых по сравнению с контролем (p < 0,05), уровень ЛПНП повышен (p < 0,05), коэффициент ЛПВП/ЛПНП понижен (p < 0,01). В результате проведенного исследования получены новые данные фундаментального характера о состоянии мембран эритроцитов при дислипопротеинемиях у больных сахарным диабетом типа 1 и 2. Выявленные 117 закономерности позволяют говорить о прямой связи утилизации глюкозы с составом жирных кислот крови. Полученные данные исследования свидетельствуют о том, что СД типа 1 у пациентов сопровождается увеличеним суммарного содержания насыщенных жирных кислот (НЖК), в основном за счет миристиновой кислоты и уменьшение суммарного содержания ненасыщенных жирных кислот (ННЖК) по сравнению с контролем: наиболее выраженные в группе больных с СД 1 c осложнениями. Отмечались прямые корреляционные взаимосвязи между активностью СОД и a-линоленовой кислотой (r = +0,53; p < 0,05), уровнем ДГК и ферментативной активностью ГПО (r = +0,47; p< 0,05). Прямая корреляционная связь существовала и между концентрациями МДА и линолевой кислотой (r = +0,67; p < 0,05). Увеличение соотношения омега-6/омега-3 ПНЖК в крови больных с СД 1 сопровождалось повышением активности и интенсивности ПОЛ, наиболее выраженные (p < 0,05) c осложнениями диабета. Суммарное соотношение омега-6/омега-3 снижалось (p < 0,05) за счет повышения активности СОД+КТ (r = -0,763; p < 0,05; n = 23). Таким образом, у больных с СД 1 с осложнениями, на фоне дислипидемии выявлены существенные изменения, как уровня, так и состава жирных кислот, нарастание концентрации свободных радикалов и снижение активности ферментов антиоксидантной защиты, сопровождающиеся снижением степени утилизации глюкозы эритроцитами. Сравнительный анализ содержания жирных кислот в плазме крови и эритроцитов крови показал, что полученные данные значительно отличаются друг от друга, поэтому экстраполяция данных полученных на плазме крови неправомерно переносить также и на эритроциты. Следовательно, как об этом свидетельствуют полученные нами результаты и анализ этих данных повидимому, истинную картину, об изменений спектра крови при сахарном диабете предпочтительнее оценить по данным полученным на отмытых эритроцитах. 118 Результаты исследования у пациентов с СД 2 типа по сравнению с пациентами с ожирением, сопровождающимися инсулинрезистентностью, свидетельствуют о более выраженности нарушений жирнокислотного состава плазмы и эритроцитов крови за счет группы ЖК омега-3 и омега-6, сохранявшиеся в течение всего периода наблюдения. Также отмечено увеличение коэффициента НЖК/ННЖК. Эти изменения связаны, по-видимому, с тем, что при липолизе в первую очередь мобилизуются ННЖК, которые и окисляются первыми [83,99]. Можно предположить, что этим объясняется активация процессов перекисного окисления липидов у больных при О и СД типа 2 [100,102]. Таким образом, у больных СД 2 типа и у пациентов с О также отмечается повышение показателей ХС, ТГ, ЛПНП, ЛПОНП, а также КА по сравнению с контрольной группой. Эти изменения позволяют утверждать, что развитие СД 2 у женщин также, как и при О сопровождается дислипидемией атерогенного характера. При этом у больных с СД 2 типа имеет место более выраженные изменения количественного состава липидов, в том числе жирнокислотного состава крови. О и СД 2 сопровождаются модификацией состава свободных и эстерифицированных ЖК плазмы крови, что может привести к изменению функциональной активности мембран, к нарушению инсулинсвязывающей активности цитомембран. Нарастание концентрации свободных радикалов, и снижение активности ферментов антиоксидантной защиты сопровождается нарушением процессов утилизации глюкозы клетками. У больных женщин с ожирением сопровождающимся инсулинорезистентностью, а также, как при СД 2 отмечаются качественно однотипные нарушения липидного, липопротеидного и углеводного обменов (повышение уровня ОХ, ТГ, ЛПНП, холестерина ЛПОНП, постпрандиальной глюкозы и др). Дислипидемия при О и СД 2 имеет атерогенный характер. При СД 2 развивается дисбаланс ПОЛ-АОА сопровождающиеся более высокой концентрацией переокисленных липопродуктов, снижением параметров антиоксидантных системи утилизации глюкозы клетками. О и СД 2 119 сопровождается модификацией состава свободных и эстерифицированных ЖК плазмы крови, что может привести к изменению функциональной активности мембран клеток, следовательно, и понижению функциональной активности инсулин - зависимых транспортеров глюкозы. Полученные результаты исследования убедительно свидетельствуют о важной роли ЖК и их метаболитов в патогенезе ожирения и СД 2, что необходимо учитывать при разработке и выборе соответствующих профилактических и терапевтических мероприятий, направленных на предотвращении или устранений выявленных нарушений. Аналогичные изменения нами отмечались также в группе больных СД 1. Развитие осложнений при СД 1 сопровождается более значимым снижением активности фермента СОД по сравнению с контрольной величиной (табл.4). Активность КТ в группе больных без осложнений повышена по сравнению с контролем, тогда как при развитии осложнений (кетоза) достоверных различий с группой здоровых по данному показателю не имеется. Избыточное образование продуктов ПОЛ, повидимому, оказывает повреждающее действие на уровне клеток, их цитотоксичность, связана с накоплением перекисей липидов [12]. У больных СД 1 типа активность ПОЛ и система АОЗ, по результатам данного исследования, находятся в нарушенном равновесии, и скорость ПОЛ превышает способность антиоксидантной системы «гасить» избыточное количество свободных радикалов. У больных СД 2 типа, на фоне дислипидемии, усилен синтез концентрации ГП, ДК и МДА относительно контрольной группы. При этом более выраженное увеличение концентрации вторичных продуктов свободнорадикального окисления - МДА отмечается при СД 2 с ангиопатиями, что свидетельствует о развитии более выраженного системного окислительного стресса. Выявленная нами корреляционная связь между уровнем МДА, ГП, ДК и уровнем общего ХС (r = 0,57), ХС ЛПНП (r = 0,45), ТГ (r = 0,38), КА (r = 0,47), глюкозы (r = 0,47), инсулина (r = 0,41) свидетельствует о взаимосвязи процессов ПОЛ с СД 120 2. Значительное увеличение содержания МДА в эритроцитах у больных с СД 2 с осложнениями, по сравнению с СД 2 без осложнений подтверждает полученные данные. У больных независимо от наличия осложнений, концентрация всех, изученных нами, продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах достоверно снижалась, на фоне уменьшения гликемии натощак до 6,54 ммоль/л при этом улучшалось и усвоение глюкозы эритроцитами (r = 0,57). Кроме того, образующиеся в результате ПОЛ цитотоксичные соединения, среди которых наибольшую опасность представляют карбонильные продукты, легко образуют аддукты с нуклеиновыми кислотами и многими белками (в том числе с ферментами АОС, вызывая их инактивацию [42,46]. В связи с этим, при усиленном ПОЛ можно ожидать изменений во взаимодействии инсулина с его рецепторами. Это может вести к нарушению интернализации инсулиновых рецепторов и уменьшению числа инсулинсвязывающих участков и, таким образом, служить одной из причин возникновения инсулинрезистентности. Обнаруженное нами повышение концентрации МДА в плазме крови может свидетельствовать об усилении перекисных процессов в липопротеиновых комплексах, что может стать дополнительной причиной нарушения сродства липопротеинов к их рецепторам и, таким образом, способствовать образованию холестериновых бляшек на стенках сосудов [85,137]. Наряду с увеличением интенсивности СРО липидов и нарушением структуры и свойств эритроцитарной мембраны при СД типа1 и СД типа 2 наблюдаются разнонаправленные изменения в системе антиоксидантной защиты. Так показано, что в крови у больных СД 1 имеет место снижение активности ГПО, Г6ФДГ, СОД и повышение активности КТ. Снижение активности фермента СОД может быть связано, главным образом, с действием АФК, способных оказывать модифицирующее действие на ферментативные белки как непосредственно, так и по опосредованным механизмам, то есть через их первичное взаимодействие с другими 121 биомолекулами. При этом, наличие в структуре активных центров, рассматриваемых нами ферментов наиболее чувствительных к действию АФК аминокислотных остатков, свободных SH-групп и дисульфидных мостиков усугубляет процесс негативного воздействия кислородных радикалов на ферментативные молекулы [50]. Влияние АФК на активность КТ, по-видимому, также имеет место, но оно несколько нивелируется за счёт того, что суммарная ёмкость КТ в эритроцитах в тысячи раз превышает потребности организма, необходимые для защиты липидов и других биомолекул от негативного действия кислородных радикалов [104]. К тому же КТ относится к ферментам, которые наиболее долго сохраняют свою высокую активность, почти не требуют энергии активации, скорость реакции этого энзима лимитирует лишь скорость диффузии субстрата к активному центру [49]. Таким образом, повышение активности КТ в эритроцитах больных диабетом можно назвать компенсаторной реакцией на увеличение интенсивности СРО при СД, в то время когда другие компоненты АОС оказываются значительно чувствительнее к усилению окислительных процессов в клетке, что проявляется снижением их ферментативной активности. Дополнительным фактором, способным повлиять на работу каталазы может быть введение инсулина, обладающего способностью увеличивать активность данного фермента [70]. Кроме модифицирующего действия АФК на структуру молекул рассматриваемых ферментов в условиях in vivo можно ожидать дополнительного влияния нарастающей концентрации кислородных радикалов на активность СОД и КТ, поскольку данные белки являются ферментами специфической антиоксидантной защиты в организме, субстратами для которых служат непосредственно АФК. В частности, увеличение содержания Н2О2, которая является ингибитором СОД и субстратом для КТ может служить причиной снижения активности СОД и увеличения активности КТ [20,21,198]. Наличие отрицательной корреляционной зависимости между активностью ГПО и активностью КТ, также обладающей пероксидазной 122 активностью, даёт возможность предположить, что нарастание концентрации Н2О2 в клетке и как следствие - повышение активности каталазы, может повлиять на снижение активности ГПО, так как ГПО эффективна только при низких концентрациях Н2О2 [14]. Значительную роль в изменении активности рассматриваемых ферментов может играть усиление их гликозилирования. На фоне усиления гликозилирования можно ожидать не только изменения химической структуры, но и функции ферментов, то есть снижения их каталитической активности. В частности есть работы, в которых сообщается, что гликозилирование СОД и КТ сопровождается снижением их активности [92,225]. На изменение активности фермента глутатионпероксидазы in vivo может влиять и недостаток инсулина, имеющий место у всех больных СД 1 и СД 2. При этом происходит снижение активности Г-6ФДГ и в целом скорости утилизации глюкозы по пентозофосфатному пути (ПФП). Это в свою очередь ведёт к дефициту НАДФН, являющегося основным поставщиком восстановительных эквивалентов в эритроците и таким образом влияет на снижение активности ГПО. И при снижении активности данного фермента, имеющего место при СД, особенно при СД 1, возникает недостаток НАДФ+, что также ограничивает скорость начальной реакции ПФП. Нужно отметить, что при проведении корреляционного анализа найдена прямая зависимость между активностью Г6ФДГ с одной и активностью ГПО с другой стороны, что подтверждает взаимосвязь исследуемых показателей. ГПО эффективно восстанавливает гидрофильные гидропероксиды с малым размером молекулы. Именно с увеличением таких гидрофильных углеводородных хвостов связано появление в мембране своеобразных пор и таким образом - изменение проницаемости. В ходе работы обнаружено, что такие клинические характеристики, как длительность течения и наличие осложнений СД 2 оказывают влияние на уровень изучаемых показателей. Так показано, что содержание ДК, МДА, и активность ГПО, Г6ФДГ в крови больных изменяются в зависимости от 123 осложнений заболевания и остаются таковыми на протяжении всего исследуемого периода больных СД в стационаре. При наличии осложнений диабета, не зависимо от типа СД наблюдается тенденция к повышению как эритроцитарного так и плазменного уровня МДА. Развитие осложнений у больных СД 2 типа в целом усугубляет возникшие изменения исследуемых показателей: наблюдается более выраженное увеличение уровня первичных продуктов ПОЛ, снижение активности всех исследуемых ферментов (кроме ГПО) по сравнению с группой контроля и группой пациентов с ожирением. Повышение концентрации содержания инсулина и ДК, вероятно, других связано со сахароснижающих снижением препаратов. Например,инсулин, как известно, является ингибитором чувствительной к гормонам липазы и при снижении его концентрации липолиз активируется. В результате этого СЖК, образующиеся при гидролизе ТАГ, поступают одновременно с глицеролом в кровь и, таким образом, происходит увеличение их концентрации. Поскольку СЖК являются основным субстратом окисления, то при увеличении их содержания можно ожидать усиления в целом интенсивности СРО и в первую очередь - увеличения первичных продуктов ПОЛ - ДК. К тому же в общей группе больных СД между содержанием ДК и уровнем НbА1c имеется прямая корреляционная зависимость с тенденцией к достоверности, что подтверждает влияние также и углеводного обмена на уровень продуктов ПОЛ. Более выраженное снижение активности всех исследуемых ферментов при развитии декомпенсации подтверждает немаловажную роль гипергликемии в изменении активности ферментативных белков при СД. При этом, проведение корреляционного анализа обнаружило наличие обратной зависимости между уровнем НbА1c с одной стороны и активностью Г6ФДГ, СОД и KT с другой. В отличие от остальных ферментов, активность ГПО не коррелирует с уровнем НbА1c. По всей видимости, данный фермент является более лабильным и функционально подвижным, быстрее реагирует на 124 изменение внутриклеточных процессов, чем гликозилированный гемоглобин. В частности, показано наличие положительной высокодостоверной корреляционной зависимости между ГПО и уровнем гликемии (r = 0,69). Повидимому, активность данного фермента более других зависит от постоянных колебаний уровня глюкозы в крови больных сахарным диабетом. При сравнении всех исследуемых показателей в группах с осложнениями и без таковых показано, что наличие поздних осложнений сопровождается повышением плазменного уровня МДА и снижением активности СОД. В то же время в эритроцитах, при наличии осложнений, содержание МДА возрастает недостоверно. Это может быть обусловлено тем, что осложнения СД обычно развиваются через годы течения основного заболевания, когда в целом происходит утяжеление патологического процесса. В литературе имеются сведения о том, что тяжесть патологического процесса влияет на количество МДА, способного ковалентно связываться с белками и липидами клеточных мембран [85,137]. Возможно поэтому, в группе больных СД 2 с осложнениями не наблюдается повышения уровня эритроцитарного МДА, тогда как содержание плазменного МДА достоверно повышается относительно группы без осложнений. По данным многих авторов развитие поздних осложнений (повреждение эндотелия) при диабете обусловлено в основном воздействием супероксидного радикала [15,98]. Найденное нами снижение активности СОД можно рассматривать как фактор, определяющий развитие ряда осложнений СД 2 и это позволяет рекомендовать использование антиоксидантной терапии, направленной на обезвреживание в первую очередь O2. При изучении у пациентов с СД I взаимосвязи между изучаемыми параметрами и составом жирных кислот отмечались увеличение суммарного содержания насыщенных жирных кислот (НЖК) в основном за счет миристиновой кислоты, уменьшение суммарного содержания ненасыщенных жирных кислот (ННЖК) по сравнению с контролем: наиболее выраженные в группе больных с СД 1 c осложнениями. Отмечались прямые корреляционные 125 взаимосвязи между активностью СОД и a-линоленовой кислотой (r = +0,53; p<0,05), уровнем ДГК и ферментативной активностью ГПО( r = + 0,47; p<0,05). Прямая корреляционная связь существовала и между концентрациями МДА и линолевой кислотой (r = + 0,67; p < 0,05). Увеличение соотношения омега-6/омега-3 ПННЖК в крови больных с СД 1 сопровождалось повышением активности и интенсивности ПОЛ, наиболее выраженные (p < 0,05) c осложнениями диабета. Суммарное соотношение омега-6/омега-3 снижалось (p<0,05) за счет повышения активности СОД+КТ (r = -0,763; p < 0,05; n = 23). Таким образом, у больных с СД 1 с осложнениями, на фоне дислипидемии выявлены существенные изменения как уровня, так и состава жирных кислот в крови, нарастание концентрации свободных радикалов и снижение активности ферментов антиоксидантной защиты,а также тесная взаимосвязь между ННЖК и процессами СРО, что может привести к нарушению функциональной активности цитомембран и утилизации глюкозы клетками. У больных женщин с ожирением сопровождающимся инсулинорезистентностью, а также, как и при СД 2 отмечаются качественно однотипные нарушения липидного, липопротеидного и углеводного обменов (повышение уровня ОХ, ТГ, ЛПНП, холестерина ЛПОНП, постпрандиальной глюкозы и др.). Дислипидемия при О и СД 2 имеет атерогенный характер. При СД 2 развивается дисбаланс ПОЛ-АОА сопровождающиеся более высокой концентрацией переокисленных липопродуктов, снижением параметров антиоксидантных систем и утилизации глюкозы клетками. О и СД 2 сопровождается модификацией состава свободных и эстерифицированных ЖК плазмы крови, что может привести к изменению функциональной активности мембран клеток, следовательно, и понижению функциональной активности инсулин-зависимых транспортеров глюкозы. Полученные результаты исследования убедительно свидетельствуют о важной роли ЖК и их метаболитов в патогенезе ожирения и СД 2, что необходимо учитывать при разработке и выборе соответствующих профилактических и терапевтических 126 мероприятий, направленных на предотвращении или устранений выявленных нарушений. При изучении особенностей липидного и жирнокислотного метаболизма при стрептозотоциновом сахарном диабете у 70 крыс линии «Вистар» установлено,что уже в ранние сроки развития диабета отмечаются значительные изменения в липидном и липопротеидном составе крови сопровождающиеся гипертриглицеридемией и гиперхолестеринемией, повышением уровней ЛПОНП и ЛПНП со снижением концентрации ЛПВП и утилизации глюкозы эритроцитами. Повышение уровня насыщенной пальмитиновой жирной кислоты сопровождается снижением уровней МННЖК (за счет олейновой ЖК), что существенно отличается от соответствующего спектра у больных СД. Результаты исследования свидетельствуют о том, что уже на ранних стадиях развития СД изменения в липидном составе и пуле жирных кислот эритроцитов и гомогенатов печени, кожи и сердечной мышце аналогичные (с небольшими отличиями) и свидетельствуют о том, что во всех изучаемых тканях дислипидемия имеет атеросклеротическую направленность. Результаты исследования могут иметь научно-практическое значение, так как выявленные изменения в липидном обмене и антиоксидантной защите в эритроцитах больных СД могут отражать метаболическую ситуацию во всем организме, что может быть использовано с целью своевременной диагностики и предупреждении диабетических осложнений. Полученные результаты указывают на целесообразность добавления к традиционной инсулинотерапии антиоксидантов и мембраностабилизирующих препаратов уже на ранней стадии заболевания с целью защиты клеток организма от токсического воздействия метаболитов липопероксидации и активных форм кислорода, а также для профилактики сосудистых осложнений сахарного диабета. 127 ВЫВОДЫ 1. Нарушения липопротеинового обмена более выражены у пациентов с сахарным диабетом типа 2 по сравнению с таковыми у больных сахарным диабетом типа 1 и характеризуются значительным увеличением содержания в крови липопротеинов очень низкой плотности, триглицеридов и общего холестерина. Выраженность указанных изменений при сахарном диабете зависит от длительности заболевания, наличия декомпенсации углеводного обмена и сосудистых осложнений. 2. СД у больных протекает с активацией процессов липидной пероксидации, проявляющейся увеличением содержания как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ, изменениями структурно-функциональных свойств эритроцитарных мембран, а также нарушениями в системе антиоксидантной защиты, которые имеют разнонаправленные изменения. Содержание ДК и МДА в крови больных СД 2 увеличивается уже в ранние сроки заболевания. При увеличении срока заболевания наблюдается тенденция к повышению как эритроцитарного, так и плазменного уровня МДА, тогда как содержание ДК возрастает более поздние сроки заболевания. 3. У больных с осложнениями СД 2 относительно пациентов без осложнений выявляется более выраженное повышение плазменного уровня МДА и снижение активности СОД. 4. Развитие декомпенсации сопровождается более выраженным увеличением содержания ДК, а также снижением степени утилизации глюкозы эритроцитами и активности ферментов тиосульфидного обмена, СОД, КТ и Г6ФДГ, по сравнению с соответствующими показателями в группе компенсированного диабета. 5. При изучении особенностей липидного и жирнокислотного метаболизма при стрептозотоциновом сахарном диабете у крыс установлено, что уже в ранние сроки развития диабета отмечаются значительные изменения в липидном и липопротеидном гипертриглицеридемией и составе крови гиперхолестеринемией, сопровождающиеся повышением уровней 128 ЛПОНП и ЛПНП со снижением концентрации ЛПВП и утилизации глюкозы эритроцитами и изменения в липидном составе и пуле жирных кислот эритроцитов и гомогенатов печени, кожи и сердечной мышце аналогичные и свидетельствуют о том, что во всех изучаемых тканях дислипидемия имеет атеросклеротическую направленность. 129 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Агарков А.А., Попова Т.Н., Шульгин К.К., Сущенко Е.А. Исследование влияние некоторых органических кислот на активность глутатионредуктазы при введении тиоктовой кислоты и сстановленного глутатиона при токсическом гепатите у крыс. BioScience Blog – Научный Биологический блог. 10 ноября 2009. 2. Акимов М.Г., Безуглов В.В., Бобров М.Ю. и др. Липиды и рак. Очерки липидологии онкологического процесса. СПб., 2009. 3. Александров А.А.. Статины и сахарный диабет: стабилизация «распадающихся» бляшек. Consilium medicum. 2003;9:515-519. 4. Аметов А.С., Сокарева Е.В. Нарушения липидного обмена при сахарном диабете 2–го типа и их коррекция. Русский Медицинский Журнал. 2009; 24: с1586. 5. Аметов А.С., Соловьева О.Л..Окислительный стресс при сахарном диабете 2-го типа и пути его коррекции. Проблемы эндокринологии. 2011; 6: 52-56. 6. Антонеева И. И., Система перекисное окисление липидов- антиоксиданты в норме и патологии – 2008. 7. Антонова К.В., Недосугова Л.В., Балаболкин М.И., и др. Влияние компенсации углеводного обмена на свободнорадикальное окисление липопротеинов низкой плотности и активность ферментативной антиоксидантной системы при сахарном диабете типа 2. Проблемы эндокринологии. 2003; 49(2): 51 – 54. 8. Афанасьев С.А., Кондратьева Д.С., Попов С.В. Разработка модели сочетанной патологии сердечной недостаточности и сахарного диабета 1го типа в эксперименте. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012; 153(4): 523–526. 9. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Роль инсулинрезистентности в патогенезе сахарного диабета типа 2.Тер. архив. 2003;1: 72-77. 10. Балаболкин М.И., Чернышова Т.Е. Диабетическая нейропатия. Учебное пособие. М., 2003. 130 11. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений (руководство для врачей). М.: Медицина. 2005; с. 512. 12. Балаболкин М.И. Роль гликирования белков, окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений при сахарном диабете. Сахарный диабет. 2002; 4: 8-16. 13. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений диабета. Проблемы эндокринологии. 2000; 46(6): 29 -34. 14. Балаболкин М. И., Клебанова Е. М. Патогенез и механизмы развития ангиопатий при сахарном диабете – 2000. Кардиология. 2000; 40(10): 74-87. 15. Бизунок Н.А., Дубовик Б.В. Влияние адренергических средств на НАДФ-оксидазную продукцию активных форм кислорода в макрофагах. Экспериментальная и клиническая фармакология.2008;71(1):43-46. 16. Бизенкова М.Н., Романцов М.Г., Чеснокова Н.П. Метаболические эффекты антиоксидантов в условиях острой гипоксической гипоксии. Фундаментальные исследования. 2006; №1: 17-22. 17. Болдырев А.А. Окислительный стресс и мозг. Соросовский образовательный журнал. 2001; 4(7): 21-28. 18. Бондарь И.А., Климентов В.В. Антиоксиданты в лечении и профилактике сахарного диабета. Сахарный диабет. 2001;1: 46-49. 19. Ботова С.Н. Диагностика кардиоваскулярной диабетом 2-го автономной типа в и прогностическое нейропатии сочетании с у больных хронической значение сахарных сердечной недостаточностью. автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. мед. наук. код спец. 14.00.05 – 2009. 20. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. Екатеринбург: Уральский рабочий. 1994; 384 с. 21. Вартанян Л.С.. Супероксиддисмутаза. Белки и пептиды: В 2-х т. М.:Наука. 1995; T.1: 89-95. 131 22. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты. Вестн. РАМН. 1998; 7: 43 - 51. 23. Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и азота: диагностическое, превентивное и терапевтическое значения. Биохимия. 2004; 69(1): 1-3. 24. Владимиров Ю.А, Арчаков А.И.. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. Издательство: Наука. 1972 25. Волчегорский И.А., Рассохина Инсулинпотенцирующее экспериментальном Л.М., действие сахарном Мирошниченко антиоксидантов диабете. И.Ю. при Экспериментальная эндокринология. 2010; 2: 27-35. 26. Галиева О.Р., Джанашия П.Х., Мирина Е.Ю. Лечение диабетической нейропатии. Русский медицинский журнал. 2005; 10: 648-654. 27. Галеев И. В. Роль метаболических нарушений в развитии дистальной диабетической полинейропатии при инсулинзависимом сахарном диабете. дис. на соиск. учен. степ. канд. мед. наук. код спец. 14.00.03 – 2003. 28. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови. Лабораторное дело. 1983; 3: 33-35. 29. Гаврилов, В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль М.М. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой. Вопр. мед. химии. 1987; 1: 118-21 30. Гарднер Д., Шобек Д. Базисная и клиническая эндокринология. Издательство: Бином. 2010. 31. Гершкорон Ф.А. Особенности состояния системы глутатиона, перекисного окисления липидов и метаболизма лимфоцитов крови в патогенезе инсулинзависимого сахарного диабета. Иркутск. 2005. 32. Горбенко Н.И. Полторак В.В., Гладких А.И., Иванова О.В. Влияние сочетанного применения витаминов Е и С на липидный профиль и активность параоксоназы в сыворотке крови кроликов с дитизоновым диабетом. Вопр. Биол., мед. И фарм. Химии. 2002; 4: 41-44. 132 33. Горожанская Э.Г., Свободнорадикальное окисление и основные механизмы антиоксидантной защиты в норме и при злокачественной патологии. Клиническая лабораторная диагностика. 2010; 6: 28-44. 34. Гузенко В.Е., Макарова Л.М., Погорелый В.Е. Окислительный стресс при сахарном диабете и его фармакологическая коррекция. Российский педиатрический журнал. 2010; 5: 42-50. 35. Данилова Л.А., Лопатина Н.И. Колориметрический метод определения гликозилированных гемоглобинов. Лаб. Дело. 1986; 5: 281-283. 36. Дедов И.И. Сахарный диабет: развитие технологий в диагностике, лечении и профилактике (пленарная лекция). Сахарный диабет. 2010; 3 (48): 6-13. 37. Дедов И.И., Шестакова М.В. Сахарный диабет. Диагностика, лечение, профилактика. Медицинское информационное агентство. 2011; С.808. 38. Дедов И.И., Балаболкин М.И., Мамаева Г.Г. и др. Роль окислительного стресса, апоптоза, инсулиновой резистентности и нарушении липидного обмена в патогенезе сахарного диабета и его сосудистых осложнений: Пособие для врачей. М: ГУ ЭНЦ. 2005; 73 с 39. Дедов И.И. Сахарный диабет: ангиопатии и окислительный стресс (пособие для врачей) – М.: МЗРФ, ГУ Эндокринологический научный центр РАМН. 2003; 86с. 40. Деримедведь Л. В., Антиоксиданты в терапии сахарного диабета. Провизор. 2007; 24: 40-43. 41. Джанашия П.Х., Мирина Е.Ю. Нарушение липидного обмена при сахарном диабете 2 типа и варианты его коррекции. РМЖ. 2008; 16(11): 1561-66. 42. Добрынина И. Ю., Перекисное окисление липидов и состояние системы антиоксидантной защиты в мембранах тромбоцитов у больных инсулиннезависимым сахарным диабетом в сочетании с САГ 1. 2000; Секция 1-3. Ч. 1. C. 242-244. 133 43. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса. Вопросы медицинской химии. 2001; 47(6): 561-581. 44. Егорова М.В., Афанасьев С.А., Попов С.В. Cостояние митохондрий и гипертрофия сердца при развитии стрептозотоцин-индуцированного диабета на фоне экспериментального инфаркта. Сибирский медицинский журнал (Томск). 2011; 26(3): 119–124. 45. Жукова О.Ю. Патогенетическая значимость активации свободнорадикальных процессов в печени при алкоголизации на фоне сахарного диабета. Дис. к.м.н. г. Омск. 2008 46. Зайцев В.Г., Закревский В.И. Роль глутатионпероксидазы в системе защиты эритроцитов от повреждающего действия экзогенных прооксидантов. Научн. наследие акад. П.К.Анохина и его развитие в трудах волгоградск. ученых. Мат. областн. научно-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения акад. П.К.Анохина. Т.1. Волгоград: ВМА. 1998; 45-46. 47. Зайцев В.Г., Закревский В.И. Методологические аспекты исследований свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. Вестник Волгоградской медицинской академии (ВМА; Тр., т.54, вып.4)– Волгоград, 1998; 49-53. 48. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы патохимии. Издательство. ЭЛБИСПб. 2001; 688с. 49. Занозина О.В. Роль окислительного стресса в развитии и прогрессировании поздних осложнений сахарного диабета 2 типа. Возможности антиоксидантной терапии. Дис. На соисконие уч.ст. доктора мед. Наук. По спец. 14.01.04. Нижний Новгород. 2010 50. Занозина О.В., Рунов Г.П., Беляков К. М.. Роль свободнорадикально опосредованного окислительного стресса в развитии диабетической полинейропатии. Сахарный диабет. 2004; №3: 22-26. 134 51. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологические аспекты. М.: МАИК «Наука / Интерпериодика». 2001; 343с. 52. Зенков Н.К., Кандалинцева Н.В., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б., Просенко А.Е. Фенольные биоантиоксиданты. Новосибирск: СО РАМН. 2003. С. 328. 53. Иванов В.В., Шахристова Е.В., Степова Е.А. и др. Адипоциты Сахарный диабет. Окислительный стрес. Томск. 2003; 110 с. 54. Каган В.Е., Орлов С. Н., Прилипко Л. Л.. Проблемы анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов. М.: 1986; 238с. 55. Казимирко В. К. и др. Aнтиоксидантная система и ее функционирование в организме человека. Здоровье Украины. 2004; 98c. 56. Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин В.Ю., Горобец Н.И.. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия. Киев: Морион. 2004; 160 с. 57. Карлова Н.Г. Генетические механизмы клиническая картина сахарного диабета I типа у больных бурятской популяции. Автореферат диссертации на соискание уч. ст. к.м.н. по спец. 14.00.16-патологическая физиология, 14.00.03-эндокринология. Иркутск. 2005; 21 с. 58. Касаткина Э.П., Сичинава И.Г. Профилактика поздних осложнений сахарного диабета у детей и подростков. Пути оптимизации диспансерной службы. Сахарный диабет. 1999; 1: 18-22. 59. Касаткина Э.П., Одуд Е.А., Сивоус Г.И., Сичинава И.Г. Современные подходы к ранней диагностике и лечению специфических осложнений сахарного диабета у детей и подростков. Клиническая диабетология. 1999; 2: 16-20. 60. Киреев Р.А., Курмачева Н.А., Игнатов В.В. Перекисное окисление липидов, антиоксидантная защита и содержание 2,3-дифосфоглицерата у детей, больныхсахарным диабетом 1 типа. Сахарный диабет. 2001; 1: 6-9. 135 61. Киреев Р.А., Курмачева Н.А., Марьяновский А.А.. Эффективность влияния комплексных антигомотоксических препаратов на состояние перекисного окисления липидов, антиоксидантную защиту и углеводный обмен у детей с инсулинозависимым сахарным диабетом. Рос. педиатр., журн. 2002; №2: 52 - 55. 62. Клебанова Е.М. Инсулинорезистентность:ее роль в патогенезе сахарного диабета 2 типа и возможности коррекции. Лечащий врач. 2005; 5: 16-20. 63. Колосова М.В., Кудряшов A.M., Титова Н.М. Изменение активности глутатион-8-трансферазы эритроцитов, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза. Сборник научных работ: Актуальные проблемы биологии. Томск. 2004; c.81-82. 64. Кондратьева Е.И., Косянкова Т.В.. Гены синтаз оксида азота (NOS) в патогенезе сахарного диабета и его осложнений. Проблемы эндокринологии. 2002; 48(2): 33 - 37. 65. Конь И.Я., Шилина Н.Н.М., Вольфсон С.Б. Омега-3 жирные кислоты в профилактике и лечении болезней детей и взрослых. Лечащий врач. 2006; 6: 55-9. 66. Корчин В.И. Перекисное окисление липидов и его роль в патогенезе сахарного диабета. Материалы Всерос. науч. - практ. конф. Сургут. 2000; С.251. 67. Кулинский В.И., Леонова З.А., Колиснеченко Л. С и др. Система глутатиона в эритроцитах и плазме при вирусном гепатите. Биомедицинская химия. 2007; 53(1): 91-98. 68. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы. Успехи соврем биол. 1993; 113(1): 107-123. 69. Леонкин Владислав Владимирович- Книга: "Кулинарная книга диабетика". 2006; 34c. 70. Лилли Л. Патофизиология заболеваний сердечно-сосудистой системы: Пер. с англ.Отв. ред. Л.Лилли. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2003; 598с. 136 71. Мамедова И.Н. Коррекция окислительного стресса в течении диабетической автономной нейропатии при сахарном диабете 2 типа. 2003. с.19. 72. Матвеева И. В. Патобиохимия. Учебное. пособие для мед. Вузов. 2002; 215c. 73. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. 2009; Т.2: С.415. 74. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. М.:Медицина; 2008; 284c. 75. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов. Успехи современной биологии. 1993; 113 (3): 286-96. 76. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и оксиданты. М.: Слово. 2006; 553с. 77. Микаелян Н.П., Потёмкин В.В., Францева Е.Ю., Кулаева И.О. Функциональное состояние мембранорецепторного аппарата клеток крови при впервые выявленном сахарном диабете типа 2. Проблемы эндокринол. 2012; 4(2):40-41. 78. Микаелян Н.П., Терентьев А.А.,Гурина А.Е., Смирнов В.В. Нарушений функций мембрано - мембранорецепторного аппарата клеток крови детей, больных сахарным диабетом. Биомедицинская химия. 2012; 57(6): 642-649 79. Микаелян Н.П., Князев Ю.А., Петрухин В.А. и др. Состояние системы «ПОЛ - антиоксиданты» у беременных, больных сахарным диабетом типа 1, и их плодов. Сахарный диабет. 2002; 2: 30 – 34. 80. Микаелян Н.П., Максина А.Г., Петрухин В.А. и др. Окислительный стресс у беременных, больных сахарным диабетом. Проблемы эндокринологии. 2002; 48(5): 33-36. 81. Михайлов В. В., Сагалович Б. М.. Основы патологической физиологии: Руководство для врачей. Медицина. 2001; С. 120-121. 704 с. 137 82. Мкртумян А.М.. Инсулин - в норме и при патологии. Актуальные вопросы медицины. Издательство: ГЭОТАР-Медиа. 2008; с.64. 83. Нелаева А.А., Александрова Е.А., Нелаева Ю.В.. Состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах тромбоцитов у больных СД 1 типа, осложненного диабетической нефропатией (ДН). Сахарный диабет и его осложнения: Материалы IV Всерос. конгр. эндокринологов 1-5 июня 2001г. СПб., 2001; С. 145. 84. Нелаева А.А., Александрова Е.А., Нелаева Ю.В. Состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах тромбоцитов у больных СД1 типа, осложненного диабетической нефропатией (ДН). Сахарный диабет и его осложнения: Материалы IV Всерос. конгр. эндокринологов 1-5 июня 2001г. - СПб., 2001; С. 145. 85. Новицкий В.В., Кравец Е.Б.,Колосова М.В. и др. Липидный спектр мембран эритроцитов при сахарном диабете у детей. Пробл. эндокринологии. 2006;4:3-6 86. Панкин В.З.,Беленков Ю.Н.,Тихазе А.К.. Антиоксиданты в комплексной терапии атеросклероза: pro et contra. Кардиология.2004; 2: 72-81. 87. Панкин процессы В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н..Свободнорадикальные при заболеваниях сердечно - сосудистой системы. Кардиология. 2000; 7: 45 - 50. 88. Паранич Л.И., Паранич А.В., Василенко Н.М., Бугай Е.В. Действие нитробензола и его хлорпроизводных на некоторые показатели антиокислительного гомеостаза в тканях крыс. Бюлл. эксперим.биол. и мед. 1993; 10: 402-405. 89. Пасечник И.Н. Механизмы повреждающего действия активированных форм кислорода на биологические структуры у больных в критических состояниях. Вестник интенсивной терапии. 2001; 4: 3-9. 90. Пекарева Е.В., Никонова Т.В., Горелышева В.А. и др. Маркеры апоптоза у больных сахарным диатетом 1 типа в дебюте заболевания. Сахарный диабет.2009; 4: 86-89. 138 91. Погожева А.В. Сердечно-сосудистые заболевания, диета и ПНЖК со-3. М.: Институт питания РАМН, 2000; 320 с. 92. Подберезкина Н.Б., Осинская Л.Ф. Активность супер- оксиддисмутазы в сыворотке крови и тканях человека. Ук- раин. биохим. журн. 1989; 61: 14–27. 93. Рахимова Г. Н., Акбаров З.С., Туракулов Я.Х. Значение исследования гликированного фибриногена при сахарном диабете. Клин. лаб. Диагностика. 1999; 2: 18- 21. 94. Родбард Х.Е. Нарушения липидного обмена при сахарном диабете: современные концепции и лечение. Сахарный диабет. 2004; 2: 14-20. 95. Северин Е.С.. Биологическая химия. М.: Медицина; 2005. 96. Серебрякова О.В., Говорин А.В., Просяник В.И., Бакшеева Е.В. Жирнокислотный состав крови и липидов мембран эритроцитов у больных гипотиреозом с диастолической дисфункцией левого желудочка. Клин. Медицина. 2008; 2: 40-43. 97. Сидорова Л.Д., Бондарь И.А., Климонтов В.В., Пупышев А.Б., Поршенников И.А. Окислительный стресс при сахарном диабете и его коррекция тиоктовой кислотой. Бюллетень СО РАМН. 2000; 1(95): 94-98. 98. Смирнова О.М. Никонова Т.В.. Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита при сахарном диабете. Пособие для врачей. Под ред. И.И. Дедов. М.: Медицина. 2003; 40 с. 99. Смирнова О.М., Горелышева В.А.. Показатели перкисного окисления липидов и активность антиоксидантных ферментов в лимфоцитах периферической крови в дебюте ИЗСД. Сахарный диабет. 1999; 2: 22-28. 100. Соколов Е.И., Метельская В.А., Перова Н.В. и др. Взаимосвязь агрегации тромбоцитов с дислипидемиями и полиненасыщенными жирными кислотами. Кардиоваск. тер. и проф. 2006; 5: 87-93. 101. Соколов Е.И. Патология сердечно - сосудистой системы при сахарном диабете. В кн.: Соколов Е.И. Диабетическое сердце. М.: Медицина; 2002. 102. Старкова Н.Т.. Клиническая эндокринология. Руководство. издание 3-е, переработанное и дополненное. Санкт-Петербург: Питер, 2002; С. 213-16. 139 103. Стаценко М. Е., Винникова А. А., Ронская А. М., Шилина Н. Н.Таурин в терапии хронической сердечной недостаточности и сахарного диабета 2 типа: влияние на микроциркуляцию и эластические свойства магистральных сосудов. Журнал Сердечная Недостаточность. 2013; Том 14, № 6 (80): 347-353. 104. Старостина Е.Г. Острая декомпенсация обмена веществ при сахарном диабете (лекция). Пробл. эндокринологии. 1998; 6: 32-39. 105. Сторожук П.Г., Ферменты прямой и косвенной антирадикальной защиты эритроцитов и их роль в инициации процессов оксигенации гемоглобина, антибактериальной защите и делении клеток. Вестн. интенсив. терапии. 2000; 3: 8-13; 4: 39-43. 106. Суханова Г. А., Серебров В. Ю. Биохимия клетки. Издательство. Томск, Чародей. 2000. C.184. 107. Титов В.Н., Лисицын Д.М. Иные представления об образовании кетоновых тел, кинетике ß - окисления жирных кислот и патогенезе кетоацидоза. Клин. Лаб. диагн. 2005; 3: 3-9. 108. Тутельян В.А., Батурин А.К., Конь И.Я., Коростелева М.М., Шилина Н.М. и др. Методические рекомендации «Оптимизация жирнокислотного состава рационов питания дошкольных образовательных учреждений г. Москвы (МР 2.4.5.015-09, М., 2009 г.) Утв. Главным государственным санитарным врачом по г. Москве, август, 2009. 109. Хавинсон В.Х. и др.. Свободнорадикальное окисление и старениеСПб:Наука, 2003.-327с. 110. Хвойницкая Л. Г., Дубинина Гормонально-метаболические изменения у лиц с нарушенной толерантностью к глюкозе. Общая патология. 2001 C. 211-213. 111. Храмилин, В., Демидова И., Игнатова О. Распространенность диабетической полинейропатии при впервые выявленном сахарном диабете типа 2. Врач: Ежемесячный публицистический журнал. 2009; 5: 40-44. научно-практический и 140 112. Черницкий Е.А., Воробей A.B. Структура и функции эритроцитарных мембран. Минск: Наука и техника. 1981; 215с. 113. Шахристова Е.В., Иванов В.В., Степная Е.А., Новицкий В.В.. Влияние суперосидного анион-раикала и глутатиона на липолиз в адипоцитах крыс при окислительом стрессе, индуцированом аллоксаном. Вестник науки Сибири. 2012; 4 (5): 269-277. 114. Шепелев А.П. Шовкун Л.А. Перекисное окисление липидов и система антиоксидантов в норме и при патологии. Ростов-на-Дону: РостГМУ. 2012; 363 с. 115. Шепелев А.П. и др. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болезней. Вопросы медицинской химии. 2000; 2: 110-116. 116. Сайт http://www.medicinae.ru/230/ “Этиология сахарного диабета” 117. Abdul Salam A. Al-Abrash, Faizeh A. Al-Quobaili, Ghada N. Al-Akhras. Catalase evaluation in different human diseases associated with oxidative stress. Saudi Medical Journal. 2000; 21 (9): 826-830. 118. Abiaka C, Al-Awadi F., Olusi S. Effect of storage on the activities of superoxide dismutase, glutathione reductase and glutathione peroxidase. Clin Chem. 2000; 46: 566-567. 119. Adiels M, Olofsson SO, Taskinen MR, Boren J. Overproductionof very lowdensity lipoproteins is the hallmark of the dyslipidemia in the metabolic syndrome. Arterioscler Thomb Vasc Biol. 2008; 28: 1225-36. 120. Adiels M, Taskinen MR, Packard C, Caslake MJ, Soro-Paavonen A, Westerbacka J, et al. Overproduction of large VLDL particles is driven by increased liver fat content in man. Diabetologia. 2006; 49: 755-65. 121. Adilson Guilherme, Joseph V. Virbasius, Vishwajeet Puri, and Michael P. Czech. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008; 9(5): 367–377. 141 122. American Diabetes Association Nutrition Recommendations and Interventions for Diabetes: A position statement of the American Diabetes Association. Diabetes Care. 2007; 30(1): 48 – 65. 123. American Diabetes Association. Management of dyslipidemia in adults with diabetes (position statement). Diabetes Саrе. 2002; 25: 74-77. 124. Arnalich F. et al. Intracellular glutathione deficiency is associated with enhanced nuclear factor-kappa B activation in older non-insulin dependent diabetic patients. Free Radic Res. 2001; 35(6): 873-884. 125. Anderson M.E. Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples. Methods in Enzymology. 1985; 113: 548–555. 126. Asakava T., Matsushita E. Tiobarbiture Heid Test for Detecting Lipid Peroxides. Lipids. 1979; 14: 401-406. 127. Augustyniak A, Bartosz G, Cipak A, Duburs G, Horáková L, Luczaj W, Majekova M, Odysseos AD, Rackova L, Skrzydlewska E, Stefek M, Strosová M, Tirzitis G, Venskutonis PR, Viskupicova J, Vraka PS, Zarković N. Natural and synthetic antioxidants: an updated overview. Free Radic Res. 2010; 44(10): 1216-62. 128. Basta G., Schmidt A. M., De Caterina R. Advanced glycation endproducts: implications for accelerated atherosclerosis in diabetes. Cardiovasc Res. 2004; 63 (4): 582-592. 129. Baynes JW, Thorpe SR. Role of oxidative stress in diabetic complications: a new perspective on an old paradigm. Diabetes. 1999; 48(1): 1-9. 130. Beckman, K. B. and Ames, B.N. Oxidants, Antioxidants, and Aging. In: Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses, J. Scandalios, ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 1997; 201-246. 131. Blaak EE; Fatty acid metabolism in obesity and type 2 diabetes mellitus. Proceedings of the Nutrition Society. 2003; 62: 753–760. 132. Belfiore F, Mogensen CE: New Concepts in Diabetes and Its Treatment. 2000; Chapter I: P.3-19. 142 133. Boden G, Chen X, Iqbal N. Acute lo wering of plasma fatty acids lowers basal insulin secretion in diabetic and nondiabetic subjects. Diabetes.1998; 47(11): 1609-1612. 134. Boden G, Shulman GI. Free fatty acids in obesity and type 2 diabetes: defining their role in the development of insulin resistance and beta-cell dysfunction. Eur J Clin Invest. 2002; 32(3):14-23. 135. Bono A., Caimi G., Catania A. et al. Red cell peroxide metabolism in diabetes mellitus. Horm.Metab.Res. 1987; 19: 264-266. 136. Bonnefont-Rousselot D., Bastard J.P., Jaudon M.C. Conseguences of the diabetic status on the oxidant/antioxidant balance. Diabetic. Metab. 2000; 26(3):163 - 176. 137. Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature. 2001; 414: 813– 820. 138. Bruno Vergès. Type 1 Diabetes - Complications, Pathogenesis, and Alternative Treatments. Chapter 3: Lipid Disorders in Type 1 Diabetes. Edited by Chih-Pin Liu, ISBN 978-953-307-756-7, 470 pages, Publisher: InTech, Chapters published November 2011. 139. Cavalca V. et al. Oxidative Stress and Homocysteine in Coronary. Clinical Chemistry. 2001; 47(5): 887-892. 140. Ceriello A. Oxidative stress and glycemic regulation. Metabolism. 2000;49: 27-29. 141. Choudhuri S, Dutta D, Chowdhury IH, Mitra B, Sen A, Mandal LK, Mukhopadhyay S, Bhattacharya B. Association of hyperglycemia mediated increased advanced glycation and erythrocyte antioxidant enzyme activity in different stages of diabetic retinopathy. Diabetes Res Clin Pract. 2013; 100(3):376-84. 142. Cuzzocrea S., Riley D.P., Caputi A.P. Salvemini D. Antioxidant therapy: a new pharmacological approach in shock, inflammation, and ischemia/reperfusion injury. Pharmacol. Rev. 2001; 53: 135-159. 143. Davies K.J.A, Delsignor M.E. Protein damage and degradation by oxygen radicals: III. Modification of secondary and tertiary structure. J Biol Chem. 1987; 262(20): 9908-13. 143 144. Davison G.W., George L., Jackson S.K. et al. Exercise, free radicals, and lipid peroxidation in type 1 diabetes mellitus. Free Radic. Biol. Med.2002; 33(11):1543-51. 145. Deeney JT, Gromada J, Hoy M, Olsen HL, Rhodes CJ, Prentki M, Berggren PO, Corkey BE: Acute stimulation with long chain acyl-CoA enhances exocytosis in insulin-secreting cells (HIT T-15 and NMRI beta-cells). J Biol Chem. 2000; 275: 9363- 9368. 146. Despres I.P. – The insulin resistance-dislipidemic syndrome of visceral obesity effect on patients risk. Obes.Res.1998; 6(1): 8S-17S. 147. Durrington PN, Newton RS & Weinstein DB. Effects of Insulin and Glucose on Very Low Density Lipoprotein Triglyceride Secretion by Cultured Rat Hepatocytes. J Clin Invest. 1982; 70(1): 63-73. 148. Dierckx N., Horvath G., Van Gils C.. Oxidative stress status in patients with diabetes mellitus: relationship to diet. Eur J Clin Nutr. 2003; 57(8): 999 –1008. 149. Donath M.Y. et al. Inflammatory mediators and islet beta-cell failure: a link between type 1 and type 2 diabetes. J. Mol. Med. 2003; 81: 455-470. 150. Dhalla NS, Temsah RM and Netticadan T. Role of oxidative stress in cardiovascular diseases. J Hypertens. 2000; 18(6): 655-673. 151. Dizdaroglu M, Jaruga P, Birincioglu M, et al. Free-radical-induced damage to DNA: mechanisms and measurement. Free Rad Bio Med. 2002; 32: 1102–15. 152. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological Reviews.2002; 82: 47 - 95. 153. Eleanor Wheeler and Inês Barroso. Genome-wide association studies and type 2 diabetes. Brief Funct. Genomics. 2011; 10(2): 52-60. 154. Engelen W. Effects of long-term supplementation with moderate pharmacologic doses of vitamin E are saturable and reversible in patients with type 1 diabetes. Am J Clin Nutr. 2000; 72: 1142-1149. 155. Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 1957; 226(1): 497-509. 144 156. Folden D.V. Gupta A., Sharma A.C. Malondialdegyde inhibits cardiac contractile function in ventricular myocytes via a p38 mitogen-activated protein kinase-dependent mechanism. British J. Pharmacol. 2003; 139: 1310 -16. 157. Forman HJ, Torres M. Redox signaling in macrophages. Mol Aspects Med. 2001; 22(4-5): 189-216. 158. Freidovich I. Fundamental aspects of reactive oxygen species, or what’s the matter with oxygen. Ann NY Acad Sci.1999; 893: 13-18. 159. Furukawa S., Fujita T., Shimabucuro M. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. Clin. Invest. 2004; 114 (12). 1752-1761. 160. Goth L., Lenkey A., Bigler W.N. Blood catalase deficiency and diabetes in Hungary. Diabetes Care. 2001; 24: 1839-1840. 161. Green K., Brand M.D., Murphy M.P. Prevention of mitochondrial oxidative damage as a therapeutic strategy in diabetes. Diabetes. 2004; 53(1): 110-118. 162. Ginsberg HN. Insulin resistance and cardiovascular disease. J. Clin. Invest. 2000; 106: 453-458. 163. Ginsberg HN, Zhang YL, Hernandez-Ono A. Regulation of plasma triglycerides in insulin resistance and diabetes. Arch. Med. Res.2005; 36: 232-40. 164. Grune T., Davies K.J.A. Breakdown of oxidized proteins as a part of secondary antioxidant defenses in mammalian cells. BioFactors.1997; 6: 165- 72. 165. Goth L., Lenkey A., Bigler W.N. Blood catalase deficiency and diabetes in Hungary. Diabetes Care. 2001; 24: 1839-1840. 166. Haber EP, Ximenes HM, Procopio J, Carvalho CR, Curi R, Carpinelli AR. Pleiotropic effects of fatty acids on pancreatic beta-cells. J Cell Physiol. 2003; 194: 1-12. 167. Halimi S., Schweizer A., Minic B. et al.. Combination treatment in the management of type 2 diabetes: focus on vildagliptin and metformin as a single tablet. Vascular Health and Risk Management. 2008; 4(3): 481-492. 168. Harrison L.B., B. Adams-Huet, Ph. Raskin, I. Lingvay. b-Cell Function Preservation After 3.5 Years of Intensive Diabetes Therapy. Diabetes Care. 2012; 35(7): 1406-1412. 145 169. Helbock H.J., Beckman K.B., Ames B.N. 8-Hydroxydeoxyguanosine and 8hydroxyguanine as biomarkers of oxidative DNA damage. Methods Enzymol. 1999; 300: 156-166. 170. Hi Bahl Lee, Hunjoo Ha and George L. King. Reactive Oxygen Species and Diabetic Nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003; 14: 209 –210. 171. Hink U., Tsilimingas N., Wendt M. et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus: therapeutic implications. Endocrinol. 2003; 2(5): 293–304. 172. Hoidal J.R. Reactive oxyden specils and cell signaling. Am.J.Respir. Cell. Mol. Biol. 2001; 25(6): 661 -663. 173. Ho J.E., Paultre F., Mosca L. Is diabetes mellitus a cardiovascular disease risk equivalent for fatal stroke in women? Data from the Women’s Pooling Project. Stroke. 2003; 34: 2812-2816. 174. Hsu W.T., Tsai L.Y., Lin S.K. et al. Effects of diabetes duration and glycemic control on free radicals in children with type 1 diabetes mellitus. Ann.Clin.Lab.Sci. 2006; 36: 174-178. 175. Іванов А. В. Вікова динаміка концентрації глюкозі в крові щурів при діабеті, індукованому стрептозотоцином. Загальна патологія та патологічна фізіологія. 2011; 4: 66 – 69. 176. IDF Diabetes Atlas, 4th Edition. 2009. 177. Inzucchi S.E., Bergenstal R.M., Buse J.B. et al. Management of Hyperglycemia in Type 2 Diabetes: A Patient-Centered Approach Position Statement of the American Diabetes Association (ADA) and the European Association for the Study of Diabetes (EASD). Diabetes Care. 2012; 35(6):1364-1379. 178. Jeng-Jiann Chiu and Shu Chien. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol Rev. 2011; 91(1): 327-87. 179. Kahn SE. The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes. Diabetologia. 2003; 46: 3-19. 146 180. Kaji H., Kurasaki M., Ito K. et al. Increased lipoperoxide value and glutathione peroxidase activity in blood of type 2 diabetic women. Klin Wochenschr. 1985; 63(16): 765-8. 181. Kaviarasan R., Arjunan M.M., Pugalendi K.V. Lipid profile, oxidantantioxidant status and glycoprotein components in hyperlipedemic patients with/without diabetes. Clin.Chim.Acta.2005; 362: 49-56. 182. Ken'ichi Ichihara and Yumeto Fukubayashi. Preparation of fatty acid methyl esters for gas-liquid chromatography. J. Lipid Res. 2010; 51(3): 635-640. 183. Kinlay S., Libby P., Ganz P. Endothelial function and coronary artery disease. Curr Opin Lipidol. 2001; 12(4): 383-389. 184. Klein-Platat C, Drai J, Oujaa M, Schlienger JL, Simon C. Plasma fatty acid composition is associated with the metabolic syndrome and low-grade inflammation in overweight adolescents. Am J Clin Nutr. 2005; 82(6): 1178-84. 185. Kohen R, Nyska A. Oxidation of biological systems: oxidative stress phenomena, antioxidants, redox reactions and methods for their quantification. Toxicol Pathol. 2002; 30(6):58-62. 186. Komosinska-Vassev K., Olczyk P., Winsz-Szczotka K. Effects of metabolic contol and vascular complications on indices of oxidative stress in type 2 diabetic patients. Diabetes Res. Clin. Pract.2005; 68: 207-216. 187. Kocić R, Cirić V. New aspects about the impact of oxidative stress on development of chronic diabetic complications. Med Pregl. 2009; 62(3):70-4. 188. Lankin VZ, Konovalova GG, Tikhaze AK, Nedosugova LV. The influence of natural dicarbonils on the antioxidant enzymes activity in vitro and in vivo. Biomed Khim. 2012; 58(6): 727-36. 189. Lankin V. The enzymatic systems in the regulation of free redical lipid peroxidation. In: Free Radicals, Nitric Oxide, and mflanjmation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspects / V. Lankin. - Amsterdam: IOS Press. 2003; 23p. 190. Lee A.Y., Chung S.S. Contributions of polyol pathway to oxidative stress in diabetic cataract. The FASEB J. 1999; 13(1): 23–30. 147 191. Lindgren C.M., McCarthy M.I. Mechanisms of disease: genetic insights into the etiology of type 2 diabetes and obesity. Nature Reviews Endocrinology. 2008; 4(3): 156-163. 192. Liu LL, Yan L, Chen YH, Zeng GH, Zhou Y, Chen HP, Peng WJ, He M, Huang QR. A role for diallyl trisulfide in mitochondrial antioxidative stress contributes to its protective effects against vascular endothelial impairment. Eur J Pharmacol. 2014; 725: 23-31. 193. Majchrzak A., Zozulinska D.,Wierasz –Wysocka B.. Evaluation of selected components in antioxidant systems of blood in patients with diabetes. Pol Merkuriusz Lek. 2001; 10(57): 150 -152. 194. Mandrup-Poulsen T. Apoptotic signal transduction pathways in diabetes. Biochem Pharmacol. 2003; 66: 1433-1440. 195. Mark A. Creager M.D., et al; Review: Clinical Cardiology: New Frontiers; Diabetes and Vascular Disease Pathophysiology, Clinical Consequences, and Medical Therapy: Part I. 2003; 108: 1527-1532. 196. Martin-Gallan P., Carrascosa A., Gussinye M., Dominguez C. Biomarkers of diabetes-associated oxidative stress and antioxidant status in young diabetic patients with or without subclinical complications. Free Radic. Biol. Med.2003; 34: 1563-1574. 197. Matteucci E., Giampietro O.. Oxidative stress in families of type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 2000; 23(8): 1182-1186. 198. McGarry JD. Banting lecture 2001: dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 2002; 51(1):7-18. 199. Miriam Cnop, Nils Welsh, Jean-Christophe Jonas, et al. Mechanisms of pancreatic beta-cell death in type 1 and type 2 diabetes: many differences, few similarities. Diabetes. 2005; 54(2): S97-107. 200. Moriscot C, Richard MJ, Favrot M C, Benhamou PY. Protection of insulinsecreting INS-1 cells against oxidativ e stress through adenoviral-mediated glutathione peroxidase overexpression. Diabetes Metab. 2003; 29: 145-51. 148 201. Mylona-Karayanni C., Gourgiotis D., Bossions A., Kamper E. Oxidative stress and abhesion molecules in children with type I diabetes mellitus: a possibl link. Pediatr. Diabetes. 2006; 7: 52-59. 202. Poitout V, Robertson RP. Minireview: Secondary beta-cell failure in type 2 diabetes-a convergence of glucotoxicity and lipotoxicity. Endocrinology. 2002; 143(2): 339-342. 203. Praveen Krishnamurthy and Ashish Wadhwani. Chapter 1: Antioxidant Enzymes and Human Health; Antioxidant Enzyme: Edited by Mohammed Amr El-Missiry. 2012; 3-18. 204. Prentki M., Nolan C.J. Islet β cell failure in type 2 diabetes. The Journal of Clinical Investigation. 2006; 116(7): 1802–1812. 205. Quagliaro L., Piconi L., Assaloni R. Constant and intermittent high glucose enhances endothelial cell apoptosis through mitochondrial superoxide overproduction. Diabete Metab Res Rev. 2006; 22: 198–203. 206. Ramana K.V., Friedrich B., Tammali R., West M.B., Bhatnagar A.,Srivastava S.K. Requirement of aldose reductase for the hyperglycemic activation of protein kinase C and formation of diacylglycerol in vascular smooth muscle cells. Diabetes. 2005; 54(3): 818–29. 207. Randle, P. J., Garland P. B., Hales C. N., and Newsholme E. A.. The glucosefatty acid cycle: its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet : 1963; 1(7285): 785-789. 208. Rosen P., Nawroth P.P., King G. et al. The role of oxidative stress in the onset and its complications: a summary of a Congress Series sponsored by UNESCOMCBN, the American Diabetes Association and the Germam Diabetes Society. Deabetes Metab. Res. Rev. 2001;17(3): 189-212. 209. Rodríguez-Carrizalez AD, Castellanos-González JA, Martínez-Romero EC, Miller-Arrevillaga G, Villa-Hernández D, Hernández-Godínez PP, Ortiz GG, Pacheco-Moisés FP, Cardona-Muñoz EG, Miranda-Díaz AG. Oxidants, antioxidants and mitochondrial function in non-proliferative diabetic retinopathy. J Diabetes. 2014; 6(2): 167-75. 149 210. Rorsman P, Renstrom E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 2003; 46: 1029-1045. 211. Sandhu M.S., Weedon M.N., Fawcett K.A. et al. Common variants in WFS1 confer risk of type 2 diabetes. Nat. Genet. 2007; 39(8): 951-953. 212. Seghrouchni I., Drai J., Bannier E et al. Oxidative stress parameters in type I, type II and insulin-treated type II diabetes mellitus; insulin treatment efficiency. Clin.Chim.Acta.2002; 321: H.89-96. 213. Slatter DA, Bolton CH, Bailey AJ. The importance of lipid-derived malondialdehyde in diabetes mellitus. Diabetologia.2000; 43(5): 550–7. 214. Singh B.M., Holland M.R., Bascar V.. Is microalbuminuria a reliable indicator of underlying renal reserve in diabetes. Diabetologia. 2004; 47: 393. 215. S. O. Olofsson, P. Stillemark, et al. Intracellular assembly of VLDL: two major steps in separate cell compartments. Trends Cardiovasc Med. 2000; 10: 338- 45. 216. Steinberg HO, Paradisi G, Hook G, Crowder K, Cronin J, Baron AD. Free fatty acid elevation impairs insulin-mediated vasodilation and nitric oxide production. Diabetes. 2000; 49(7): 1231-8. 217. Stevens R.J., Kothari V., Adler A.I., Stratton IM. The UKPDS risk engine: a model for the risk of coronary heart disease in type II diabetes (UKPDS 56). Clin Sci (Lond). 2001; 101: 671- 679. 218. Uauy R. Dietary fat quality for optimal health and well-being: overview of recommendations. Ann Nutr Metab. 2009;54(1): 2-7. 219. Ukkola O., Sun G., Bouchard C.. Insulin-like growth factor 2 (IGF2) and IGFbinding protein 1 (IGFBP1) gene variants are associated with overfeedinginduced metabolic changes. Diabetologia. 2001; 44(12):2231-6. 220. Unger RH, Zhou YT. Lipotoxicity of beta-cells in obesity and in other causes of fatty acid spillover. Diabetes. 2001; 50(1): S118-S121. 221. Vaxillaire M, Froguel P. Monogenic diabetes in the young, pharmacogenetics and relevance to multifactorial forms of type 2 diabetes. Endocr. Rev.2008; 29(3): 254–64. 150 222. Winiarska K., Drozak J.. Glutathione in therapy Article in Polish. Postepy Hig Med Dosw. 2002; 56(4):521 - 536. 223. Wood L.G. Improved antioxidant and fatty acid status of patients with cystic fibrosis after antioxidant supplementation in linked to improved lung function. Am. J. Clinical Nutrition. 2003; 77: 150 - 159. 224. Yagi K. A simple fluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma. Biochem Med. 1976; 15(2): 212-216. 225. Yaney GC, Korchak HM, Corkey BE. Long-chain acyl CoA regulation of protein kinase C and fatty acid potentiation of glucose-stimulated insulin secretion in clonal beta-cells. Endocrinology. 2000; 141: 1989-1998. 226. Yessoufou A., Moutairou K., Girard A. et. al. Antioxidant status in alcoholrelated diabetes mellitus in Beninese subjects. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2005; 51 Suppl:OL849-58. 227. Yun - Zhong Fang, Sheng Yang, and Guoyao Wu, PhD. Free Radicals, Antioxidants, and Nutrition. Nutrition. 2002; 18(10): 872– 879. 228. Zieglci D. Painful diabetic neuropathy: treatment and future aspects. Diabetes Metab Res Rev. 2008; 24(1): 52-57.
