Влияние этилметилгидроксипиридина малата на

Влияние этилметилгидроксипиридина малата на активность CYP3A4:
комплексный подход к оценке влияния на систему биотрансформации
лекарственных средств
В. А. Отделёнов, В. В. Смирнов, А. В. Дмитриев, В. В. Поройков, В. В.
Шумянцева, Л. М. Красных, Д. А. Сычев, В. Г. Кукес
Актуальность
Важнейшим
этапом
фармакокинетических
исследований
новых
лекарственных средств (ЛС) является изучение их элиминации из организма,
позволяющее
разрабатывать
эффективные
и
безопасные
схемы
фармакотерапии. Элиминация происходит путем биотрансформации (чаще
всего в печени) и/или экскреции. Система биотрансформации, основным
компонентом которой считают изоферменты цитохрома P450 (CYP),
занимает центральное место в элиминации ЛС. Под действием ферментов
биотрансформации происходит изменение фармакологической активности,
снижение липофильности и повышение гидрофильности ЛС. При этом для
большинства ЛС фармакологически активное вещество превращается в
фармакологически
неактивное.
Изоферменты
цитохрома
Р450
(CYP)
проявляют субстратную специфичность, кроме того у них имеются
определенные регуляторы активности (ингибиторы и индукторы), что
является основой межлекарственного взаимодействия, которое может
приобретать
клиническое
значение
при
комбинированной
фармакотерапии[1]. Кроме того, активность цитохрома Р450 может меняться
(чаще всего снижаться) при различных заболеваниях, что может являться
причиной развития нежелательных лекарственных реакций (НЛР) или
неэффективности применяемых ЛС. Поэтому актуальным также является
поиск модулирующих по отношению к данной системе свойств новых ЛС.
CYP3A4, основной изофермент семейства CYP3A, метаболизирует около 60
% всех известных ЛС, в том числе блокаторы медленных кальциевых
каналов, макролидные антибиотики, некоторые антиаритмики, статины
(ловастатин,
симвастатин,
аторвастатин),
блокаторы
Н1-гистаминовых
рецепторов, силденафил, циклоспорин А, бензодиазепины (алпразолам,
диазепам, мидазолам) и другие ЛС, активно применяемые в клинической
практике [2]. Как и другие изоферменты цитохрома P450, CYP3A4 имеет
индукторы и ингибиторы своей активности, при применении которых может
изменяться
фармакологическое
действие
ЛС-субстратов
CYP3A4.
Активность CYP3A4 может снижаться при ряде заболеваний печени
(гепатиты,
цирроз)
[3,4],
а
также
при
хронической
сердечной
недостаточности.
Изучение путей элиминации и биотрансформации новых ЛС важно для
разработки безопасных схем применения ЛС, исключающих возможные
межлекарственные взаимодействия на уровне биотрансформации, и, как
следствие, развитие нежелательных лекарственных реакций и/или снижение
эффективности при совместном применении с другими ЛС. Проведение
подобных исследований регламентировано в США [5] и в России [6], однако
в нашей стране данная норма имеет рекомендательный характер.
При разработке и пострегистрационном изучении нового ЛС фармкомпании
проводят цикл фармакокинетических и фармакодинамических исследований
in vitro и in vivo, позволяющих определить спектр биологической активности
препарата, механизм действия, особенности его всасывания, распределения,
метаболизма и экскреции.
Для оценки активности CYP3A4 in vivo могут быть использованы MEGXтест, определение соотношения 6β-гидроксикортизола к кортизолу в моче [6]
и тест с мидазоламом [7]. MEGX-тест и тест с мидазоламом заключаются в
введении в организм исследуемого пациента ЛС, метаболизируемого
CYP3A4 и последующем определении концентраций метаболита и ЛСсубстрата, что может быть сопряжено с НЛР на фоне введения лидокаина
(MEGX-тест) или мидазолама. Проба с определением концентрации
кортизола и его метаболита 6β-гидроксикортизола в моче лишена такого
недостатка, так как используется эндогенный кортизол. Кроме того, методика
получения пробы достаточно проста и не требует присутствия медицинского
персонала, поэтому может быть выполнена в домашних условиях. Ввиду
простоты,
неинвазивной
техники
проведения
и
хорошего
профиля
безопасности, данный тест широко используется для оценки динамики
активности CYP3A4 в фармакокинетических исследованиях новых ЛС [8,9].
При проведении фармакокинетических исследований новых ЛС необходимо
изучать влияние на основные ферменты биотрансформации и транспортных
систем (гликопротеин P), однако перед исследователями стоит непростая
задача выбора ферментов биотрансформации, в отношении которых следует
изучать действие препарата в первую очередь.Для решения этой задачи
может быть использован подход к проведению фармакокинетических
исследований с применением методов in silico, in vitro и in vivo (Таблица 1).
Таблица 1: Дизайн фармакокинетического исследования нового
ЛС:
Эта Описание
Ожидаемый результат
п
I
in silico
Выдвижение гипотезы о возможном
Компьютерное
влиянии на ферменты
прогнозирование спектра
биотрансформации
биологической активности
II
in vitro
Подтверждение гипотезы о
Исследования in vitro, могут
возможном влиянии изучаемого
служить скрининговым
препарата in vitro
механизмом для исключения
ингибирующих/индуцирующи
х свойств ЛС по отношению к
ферментам
биотрансформации.
1. Подтверждение гипотезы о
III in vivo
Клиническое исследование
возможном влиянии изучаемого
препарата в терапевтических
препарата in vivo.
дозах с использованием
2. Разработка рекомендаций по
методов оценки активности
совместному применению
изучаемых изоферментов в
исследуемого препарата с ЛС-
динамике.
субстратами изучаемого фермента
биотрансформации.
Материалы и методы
Исследование проводилось в 3 этапа:
I этап – компьютерное прогнозирование спектра биологической активности
изучаемого препарата в отношении основных ферментов биотрансформации
проводилось в Лаборатории структурно-функционального конструирования
лекарств НИИ биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН к.б.н. А.
В. Дмитриевым и проф., д.б.н, к.ф.-м.н. В. В. Поройковым.
II
этап
–
электрохимическое
исследование
изучаемого
препарата
проводилось в Лаборатории биоэлектрохимии НИИ биомедицинской химии
им. В. Н. Ореховича РАМН д.б.н. В. В. Шумянцевой.
III этап – клиническое исследование препарата с использованием методов
оценки
активности
изучаемых
изоферментов
в
динамике.
Дизайн
клинического исследования, получение проб мочи, статистическая обработка
результатов проводилась аспирантом ФГБУ Научного центра экспертизы
средств медицинского применения В. А. Отделёновым и проф., д. м. н. Д. А.
Сычевым. Пробоподготовка и анализ проб проведены на Кафедре
фармацевтической и токсикологической химии ПМГМУ им. И. М. Сеченова
к.фарм.н. В. В. Смирновым.
В качестве изучаемого препарата для нашего исследования мы выбрали
новый, не изученный в отношении влияния на CYP3A4 антиоксидант
этилметилгидроксипиридина малат (Этоксидол, ОАО Синтез, далее –
ЭМГПМ),
обладающий
мембранопротекторным,
антигипоксическим,
ноотропным и анксиолитическим действием [10]. Препарат показан для
лечения некоторых форм церебро-васкулярной болезни (ЦВБ): острые
нарушения мозгового кровообращения, дисциркуляторная энцефалопатия
[11].
Для выдвижения гипотезы о возможном изменении активности ферментов
биотрансформации под действием нового ЛС может быть проведено
исследование in silico (от лат. silicium – кремний), представляющее собой
компьютерное прогнозирование спектра биологической активности вещества
на основании анализа его химической структуры. Компьютерная система
PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances), разработанная в Научноисследовательском институте биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича
Российской академии медицинских наук, в частности, предназначена для
прогнозирования того, с какими изоферментами цитохрома Р450 могут
взаимодействовать новые, еще не изученные в этом отношении in vitro и in
vivo
фармакологические
вещества.
Система
основана
на
анализе
взаимосвязей «структура вещества – активность» с использованием
обучающей
выборки,
содержащей
большое
количество
химических
соединений с различными видами биологической активности [12].
Электрохимические исследования ЭМГПМ in vitro проводили с помощью
потенциостата с использованием трехконтактных электродов, полученных
методом трафаретной печати с графитовыми рабочим и вспомогательным
электродами, и хлорсеребряным электродом сравнения. Электрохимические
подходы
перспективны
взаимодействий
вследствие
электрохимических
использование
для
сенсоров
исследования
высокой
на
фермент-субстратных
чувствительности.
основе
наноструктурированных
цитохромов
электродов
Особенностью
Р450
для
является
повышения
чувствительности анализа.
Клиническое исследование динамики активности CYP3A4 проводилось на
базе
терапевтического
отделения
ГКБ
№23
им.
«Медсантруд».
В
исследование были включены пациенты с различными формами ЦВБ:
хроническая ишемия головного мозга, гипертензивная энцефалопатия,
последствия перенесенного ОНМК. У пациентов отбирались пробы утренней
мочи в исходе и после курсового применения ЭМГПМ 100 мг × 3 раза в день
внутривенно струйно в течение 7 дней (Рисунок 1). Для оценки активности
CYP3A4 in vivo в динамике определялась концентрация кортизола и его
метаболита 6β-гидроксикортизола в моче методом высоко-эффективной
жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. По
отношению 6β-гидроксикортизола к кортизолу можно судить об активности
изофермента CYP3A4, так как 6β-гидроксикортизол образуется из кортизола
исключительно под действием CYP3A4.
Рисунок 1: Дизайн клинического исследования
Назначение курса изучаемого ЛС
Мониторинг НЛР
Определение кортизола и
его метаболита для оценки
исходной активности
CYP3A4
Определение кортизола и
его метаболита для
оценки активности
CYP3A4 на фоне приема
изучаемого препарата
Результаты и обсуждение
Компьютерное прогнозирование in silico
ЭМГПМ
по
химическому
этилметилгидроксипиридина,
строению
является
яблочной
поэтому
результаты
солью
компьютерного
прогнозирования в системе PASS даны для каждого компонента данного
химического соединения (Таблица 2). Всего исследовалось 14 биологических
активностей в отношении основных ферментов биотрансформации. Система
прогнозирует
возможное
изменение
применения изучаемого препарата.
активности
CYP3A4
на
фоне
Таблица 2: Результаты компьютерного прогнозирования спектра
биологической активности ЭМГПМ в системе PASS
Этилметилгидроксипиридин
6 из 14 возможных
биологических активностей,
при которых Pa>Pi1
Pa
Pi
Биологическая
активность
0.4
0.19 Ингибирование
79
6
0.3
0.21 Ингибирование
66
9
0.3
0.28 Индукция
85
0
0.3
0.28 Индукция CYP2C9
74
3
0.3
0.28 Субстрат CYP1A2
18
1
0.3
0.29 Ингибирование
11
5
CYP3A4
CYP2C9
CYP2C19
CYP1A2
Яблочная кислота
5 из 14 возможных
биологических активностей,
при которых Pa>Pi
0.5
0.11 Ингибирование
20
9
0.4
0.15 Индукция CYP2C9
61
6
0.3
0.16 Индукция CYP1A2
CYP2C9
1
02
7
0.3
0.28 Ингибирование
20
0
0.3
0.34 Индукция
52
0
CYP1A2
CYP2C19
Pa – вероятность, что вещество с данной химической структурой будет
иметь биологическую активность; Pi – вероятность, что вещество с данной
химической структурой не будет иметь биологическую активность.
Электрохимическое исследование in vitro
Проведено исследование по взаимодействию ЭМГПМ и итраконазола, как
препарата
являющегося
ингибитором
CYP3A4.
Результаты
экспериментального изучения влияния итраконазола на электрохимическую
активность CYP3A4 показали, что при добавлении итраконазола к CYP3A4
электроду наблюдается снижение катодного каталитического тока (Рисунок
2), что характерно для электрохимического поведения ингибиторов этого
класса гемопротеинов. При прибавлении к CYP3A4 электроду итраконазола
не наблюдается увеличение катодного каталитического тока, последующее
прибавление диклофенака также не приводит к регистрации электрокатализа.
Однако, если вместо субстрата диклофенака прибавлять ЭМГПМ (90 мкМ),
катодный ток растет, что свидетельствует протекании восстановительных
процессов, что может свидетельствовать об индуцирующем влиянии
изучаемого препарата на CYP3A4. Целесообразно провести клиническое
исследование для оценки активности CYP3A4 in vivo.
Рисунок 2: Интенсивность пиков квадратно-волновых
вольтамперограмм электродов: CYP3A4; CYP3A4+ITR (10 мкМ);
CYP3A4+ITR(10 мкМ)+ET (90 мкМ). Приведены средние значения пяти
экспериментов.
Примечание: ITR – итроконазол; Et – ЭТМГПМ.
Результаты клинического исследования
В исследование были включены 11 пациентов (5 мужчин, 6 женщин) с
различными
формами
ЦВБ,
проходивших
стационарное
лечение
в
терапевтическом отделении ГКБ №23 им. «Медсантруд». Средний возраст
пациентов, включенных в исследование составил 72,3±11,7 лет (выборочное
среднее ± стандартное отклонение, далее СР±СО). Результаты клинического
исследования представлены в Таблица 3.
Таблица 3: Результаты клинического исследования: отношение 6βгидроксикортизола к кортизолу в исходе и на фоне курсового
применения ЭМГПМ у пациентов с ЦВБ.
№ п/п
В исходе
На фоне
курсового
применения
ЭМГПМ
1
3,9407
3,3984
2
2,6564
4,6873
3
3,6207
4,7082
4
4,8989
3,4818
5
5,2383
5,6122
6
2,5965
5,1042
7
4,2088
5,6131
8
4,8643
4,8433
9
4,4126
5,3276
10
3,6786
4,6100
11
3,3197
6,7838
3,95
4,92
Стандартное 0,88
0,96
Выборочное
среднее:
отклонение:
Отношение 6β-гидроксикортизола к кортизолу статистически значимо
(p=0,042) возрастает на фоне курсового применения ЭМГПМ (4,92±0,96) в
дозе 100 мг 3 раза в день внутривенно, что свидетельствует о повышении
активности CYP3A4 у пациентов с ЦВБ при применении изучаемого
препарата. Критерий Колмогорова-Смирнова для выборки в исходе равен
0,1234, на фоне применения исследуемого препарата – 0,1898, что
свидетельствует о нормальности распределения в выборке, поэтому для
оценки
статистической
значимости
результатов
применялся
парный
критерий Стьюдента.
Полученные
результаты
позволяют
рассматривать
ЭМГПМ
как
потенциальный индуктор CYP3A4, поэтому препарат может найти свое
применение в клинических ситуациях, при которых наблюдается подавление
активности CYP3A4. С другой стороны, выявленные индуцирующие
свойства ЭМГПМ позволяют предположить возможные межлекарственные
взаимодействия с ЛС-субстратами CYP3A4 с узким терапевтическим
диапазоном
требует
(иммуносупрессивные,
большего
внимания
со
антиаритмические
стороны
врача
препараты),
(лабораторные
что
и
инструментальные тесты). Следовательно, полученный результат важен для
обеспечения максимальной эффективности и безопасности комбинированной
фармакотерапии при применении которой возможны межлекарственные
взаимодействия.
Подход к проведению фармакокинетических исследований, использованный
в нашей работе, позволяет выбрать правильную тактику планирования
исследования, что позволяет своевременно выявить влияние нового ЛС на
основные ферменты биотрансформации и обеспечить безопасное применение
нового препарата.
Список использованной литературы:
1.Кукес В.Г., Грачев С.В., Сычев Д.А., Раменская Г.В. Метаболизм
лекарственных средств: научные основы персонализированной медицины. //
М.- ГЭОТАР-Медиа, 2008.- 304 с.
2.David A. Flockhart. P450 Drug Interaction Table.
URL:
http://medicine.iupui.edu/clinpharm/ddis/main-table/
Access date: 10.11.2013
3.Eldesoky ES, Kamel SI, Farghaly AM, Bakheet MY, Hedaya MA, Siest JP.
Study of the Urinary Ratio of 6 beta-Hydroxycortisol/Cortisol as a Biomarker of
CYP3A4 Activity in Egyptian Patients with Chronic Liver Diseases. Biomark
Insights. 2007 Feb 7;1:157-64. PubMed PMID: 19690646; PubMed Central
PMCID: PMC2716776.
4.Vuppalanchi R, Liang T, Goswami CP, Nalamasu R, Li L, Jones D, Wei R, Liu
W, Sarasani V, Janga SC, Chalasani N. Relationship between Differential Hepatic
microRNA Expression and Decreased Hepatic Cytochrome P450 3A Activity in
Cirrhosis.
PLoS
One.
2013
Sep
13;8(9):e74471.
doi:
10.1371/journal.pone.0074471. PubMed PMID: 24058572; PubMed Central
PMCID: PMC3772944.
5.Drug Interaction Studies — Study Design, Data Analysis, Implications for
Dosing,
and
Labeling
URL:
Recommendations
http://www.fda.gov/downloads/
Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM292362.pdf
Access date: 10.11.2013
6.Сычев Д. А., Кукес В. Г. Рекомендации для фармацевтических компаний по
изучению биотрансформации и трансортеров новых лекарственных средств:
дизайн исследований, анализ данных и внесение информации в инструкции
по
URL:
применению.
—
М.
2009.
http://www.regmed.ru/Content/Doc.aspx?id=26a9128c-ee32-4469-9c64-
5c666339049e
Access date: 10.11.2013
7.EMA/CHMP/EWP/125211/2010: Guideline on the Investigation of Drug
Interactions. Date for coming into effect: 1 January 2013
8.Imamura Y, Murayama N, Okudaira N, Kurihara A, Inoue K, Yuasa H, Izumi T,
Kusuhara H, Sugiyama Y. Effect of the fluoroquinolone antibacterial agent DX619 on the apparent formation and renal clearances of 6β-hydroxycortisol, an
endogenous probe for CYP3A4 inhibition, in healthy subjects. Pharm Res. 2013
Feb;30(2):447-57. doi: 10.1007/s11095-012-0890-6. Epub 2012 Oct 17. PubMed
PMID: 23073666.
9.Peng CC, Templeton I, Thummel KE, Davis C, Kunze KL, Isoherranen N.
Evaluation of 6β-hydroxycortisol, 6β-hydroxycortisone, and a combination of the
two as endogenous probes for inhibition of CYP3A4 in vivo. Clin Pharmacol Ther.
2011 Jun;89(6):888-95. doi: 10.1038/clpt.2011.53. Epub 2011 Apr 13. PubMed
PMID: 21490593; PubMed Central PMCID: PMC3481835.
10.Сернов
Л.
Н.
Исследование
по
созданию
оригинального
кардиопротективного средства этоксидол / Л. Н. Сернов, О. Г. Кесарев, С. Я.
Скачилова и др. // Материалы XV Российского национального конгресса
«Человек и лекарство». Москва. - 2008. - С. 700.
11.Инструкция по медицинскому применению этилметилгидроксипиридина
малата (Этоксидол).
Номер
регистрационного
удостоверения
в
Государственном реестре лекарственных средств: ЛСР-008593/10. Дата
регистрации: 23.08.2010
12.Poroikov V., Filimonov D. PASS: Prediction of Biological Activity Spectra for
Substances. // Predictive Toxicology. Ed. by Christoph Helma. // Taylor & Francis.
— 2005. P. 459-478.