Метод изменения экзонов для восстановления транскриптов дистрофина. Введение

Метод изменения экзонов для восстановления транскриптов дистрофина.
Введение
Мутации в гене дистрофина вызывают мышечную дистрофию Дюшенна (МДД), наиболее распространенную
тяжелую мышечную патологию. Недавно стратегия пропуска экзонов доказала свою эффективность в
восстановлении экспрессии функционального дистрофина в моделях мышечной дистрофии, включая MDX
мышей, GRMD собак и мышечные стволовые клетки пациентов с МДД и у пациентов с МДД при местных
внутримышечных инъекциях. Действительно, модульная структура дистрофина, с его центральным стержнемдоменом, изготовленным из 24 повторов спектрина, который выдерживает большие внутренние делеции [7] [8]. Тем не менее, стратегия пропуска экзонов касается только пациентов, для которых вынужденый
сплайсинг будет генерировать более короткий, но все еще функциональный белок. К счастью, стратегии
ремонта РНК на основе транс-сплайсинга могут решить эту проблему. Транс-сплайсинг или сплайсосомопосредованный РНК транс-сплайсинг (Smart; Intronn фирменная технология) [9] используют молекулы РНК,
которые мешают естественному сплайсингу целевых мРНК для ремонта мутированых генных продуктов.
Главным образом, исследования транс-сплайсинга относятся к разработанным терапевтическим РНК,
заменяющим часть транскрипта при ремонте. Они были применены для исправления ряда мутаций с
использованием минигенов или эндогенных транскриптов при генетических заболеваниях таких, как
гемофилия А [10], спинальная мышечная атрофия [11], Х-хромосомый иммунодефицит [12] и кистозный
фиброз, при котором была исправлена широко распрастраненная мутация CFTRΔF508 [13]. С другой стороны,
только несколько попыток для 5 'замены, как сообщается, будут успешны при использовании минигенов [14] [15]. И наоборот, транс-сплайсинг может обратить расстройства, вызванные доминантными мутациями.
Обмен экзонами с использованием двойного транс-сплайсинга на обеих сторонах целевого экзона не был
достигнут, но интерес его реализации уже был подчеркнут [16] - [18]. Это будет иметь дополнительные
преимущества: минимизация экзогенного материала, а также сохранение полных регуляторных элементов,
которые могут присутствовать в 5`и / или 3` нетранслированных доменов мРНК. Исследование представленое
здесь относится к оптимизации обмена (обмен) экзонами, предназначенными для спасения мутировавшей
мРНК из очень больших генов, таких как ген дистрофина. Мышиная модель для мутаций дистрофина у MDX
мышей, несет мутацию в экзоне 23 гена дистрофина [19]. Для того чтобы проверить доказательство
концепции, что дважды транс-сплайсинг был возможным, мы разработали миниген сделанный из фрагмента
мышиного дистрофина, содержащего мутацию MDX; начиная с экзона 22 и заканчивая экзоном 24 под
контролем конститутивного промотора. Это миниген котрансфицировали с различными конструкциями для
обмена. Здесь мы показываем, впервые, что обмен возможен. В самом деле, мы показываем точную и
эффективную замену экзона 23 в мРНК-мишени. Этот новый подход открывает разнообразные пути
модифицирования последовательности РНК "меню" путем обмена мутировавших экзонов, внедрения новых
экзонов или даже правильные мутации дублирования.
Результаты
Дизайн молекул транс-сплайсинга.
В молекулах заменили экзон в окружении искусственных интронных последовательностей с сильными
акцепторными и донорскими сайтами сплайсинга, которые подключены к антисмысловым
последовательностям, предназначенным для отжига целевой мРНК. Отжиг имеет решающее значение, чтобы
обеспечить реакцию транс-сплайсинга, хотя этого не достаточно. В идеале сайт связывания должен нарушать
определение целевого экзона в родительской предварительной последовательности при одновременном
повышении кросс-сплайсинга между двумя независимыми мРНК. В случае обмена имеется больше
ограничений, так как две реакции транс-сплайсинга должны быть синхронизированы в обоих краях целевого
экзона. Мышиная модель для мутаций дистрофина, MDX мыши, несет носенс мутацию в экзоне 23 (E23m)
гена дистрофина. Для того, чтобы найти лучший сайт отжига в интроне 22, вверх по течению мутировавшего
экзона, мы разработали первые три молекулы для транс-сплайсинга(TS): молекулы для 3 'замены на одном
конце участка транс-сплайсинга, только различающихся по своим связывающим доменам (рис. 1А).
Антисмысловые последовательности в 150 нуклеотидов (AS1, AS2 и AS3) были выбраны в соответствии либо
с 5 'концом или 3' конецом интрона 22. Идея в том, чтобы проверить, являются ли полученые молекулы
близкими к своей цели, 5' сайту сплайсинга (5'SS) интрона 22, или наоборот, маскируя 3' акцептор сайта
сплайсинга (3'SS), что будет способствовать транс-сплайсингу. В трех молекулах искусственный интрон
включал спейсерную [20], сильно консервативную последовательности точки ответвления (BP),
полипиримидиновый тракт (PPT) и канонический 3' акцептор сайта сплайсинга (3'SS) [21]. Для облегчения
считывания в последующих экспериментах обмена экзон обмена, мы также решили использовать экзон 24
(E24) в молекуле TS вместо обычной версии экзона 23 (E23). Действительно, E24 меньше E23 (114 против
213bp), однозначное различие позволяет определить ОТ-ПЦР отремонтированной мРНК (E22-E24-E24) от неремонтироваого родительского транскрипта (E22-E23m-E24). В качестве контроля использовали молекулу
транс-сплайсинга, не связывающего домен (AS-).
Для облегчения анализа сплайсинга дистрофина в культуре ткани, мы создали миниген дистрофина,
сделанный из мышиного геномного фрагмента 3993bp включающего E22 в E24 с полнометражными
природными интронами. Цис-и транс-одиночные узоры-сплайсинга показаны на рис.1В.Стратегия ОТ-ПЦР
была разработана специально для обнаружения РНК в результате цис-и транс-сплайсинга с помощью прямого
праймера E22-F (стрелка А на фиг. 1b), специфичного для E22, и обратного праймера pSMD2-R1 (стрелка В ),
характерный для последовательности в минигене дистрофина и молекуле TS. Важно, что эти праймеры
позволили нам различать E22-E24 ампликоны в результате либо транс-сплайсинга или пропуска экзона.
Транс-сплайсинг подход
Дистрофин миниген и TS плазмиды котрансфицировали в мышиные эмбриональные фибробласты NIH3T3
клеточной линии. Клетки собирали через 72 ч после трансфекции и выделили общую РНК. Образцы, которые
получили только после мутации, несущие миниген дистрофина, которые отображают единый 633bp ампликон
соответствующий транскрипту цис-сплайсинга E22-E23m-E24 (полоса 1, Ctrl на рис. 1С). Кроме того, кДНК
из клеток, трансфицированных как минигеном дистрофина, так и конструкциями транс-сплайсинга (AS2E24), не дала продуктов ПЦР при обратной транскрипции (дорожка 7, RT-AS2), обеспечивая нам специфику
нашего анализа. В присутствии U7-SD23-BP22 (дорожка 2, U7) плазмиды, которая вызвала пропуск E23 [1],
были обнаружены 420bp полосы, соответствующие E22-E24 транскрипту из цис-сплайсинга. В образцах,
которые получили миниген дистрофина и TS плазмиды (дорожки 4, 5 и 6 на рис. 1С), продукт 304bp был
сгенерирован, специально для транс-сплайсинга в E22-E24 варианте, как показано на рисунке 1D
последовательности E22 -E24, а не к продуктам пропуска экзонов, как это было получено с U7. В присутствии
либо AS1-E24 (полоса 4), либо AS2-E24 (дорожка 5), ампликона E22-E24-E23m, соответствующий
родительский транскрипт дистрофина значительно снизилась, таким образом подтвердив полезное действие
транс-сплайсинга. Эффективность кажется настолько высока, что родительский транскрипт почти исчез. Мы
не можем исключить, что этот беспрецедентный эффективный транс-сплайсинг был расширен за счет уклона
ПЦР небольших транс-сплайсинг ампликонов, а не естественных шаблонов. AS1-E24 и AS2-E24 молекулы
(дорожки 4 и 5) были более эффективными, чем AS3-E24 (дорожка 6), и вариации
не могут быть отнесены к более высоким уровням экспрессии этих конструкций,
как показано на рис. S1B. Важно отметить, что транс-сплайсинг не происходит, если AS был удален (дорожка
3, AS-) от TS конструкций демонстрируя, что эта реакция требует тесного взаимодействия между двумя
нитями мРНК для комбинирования. Молекула AS3-E24 TS (дорожка 6) оказалась менее эффективной.
Удивительно, но расширение AS3 для того, чтобы покрыть 3 'акцепторный сайт E23m не улучшает реакцию
транс-сплайсинга (не показан). Эти эксперименты показывают, что транс-сплайсинг не может быть вызван без
последовательностей, хотя совмещение двух мРНК не является достаточным.
Двойной транс-сплайсинг подход.
Чтобы проверить возможность ремонта мРНК, мы разработали несколько EXCH молекул AS-E24-AS 'на
основе эффективных молекул TS, упомянутых выше, модифицированных связать оба интрона 22 и 23
минигена дистрофина (рис. 2A ). Молекулы EXCH содержат те же элементы, как описано выше у AS1-E24 и
молекул AS2-E24 TS, содержащих сайт сплайсинга 5 'доноров (5'SS) [15], и второй 150 нт антисмысловой
интрон таргетинга 23. Пять антисмысловых последовательностей AS5 для AS8 были выбраны в интроне 23,
который охватывает более 2607bp. Как описано ранее, оби конструкции и миниген дистрофина были
трансфицированы в NIH3T3 клеточную линию. Клетки собирали через 72 ч после трансфекции, и суммарную
РНК экстрагировали. Для обнаружения РНК в результате цис-сплайсинга, мы использовали прямой праймер
E22-F (стрелка на рис. 2A-B) специфика E22, и обратный праймер pSMD2-R5 (стрелка С).
RT-PCR продукт 408bp был обнаружен в пробах c трансфекцированными плазмидами AS2-E24-AS '(дорожки
8-13, рис. 2в). Прямая секвенирования подтвердила, что этот продукт соответствует сменной мРНК, варианту
E22-E24-E24 (рис. 2D). Этот продукт отсутствовал, когда недоставало одной из двух антисмысловым
последовательностей (дорожки 3 и 4, AS1 и AS2), показывая, что ко-таргетинг интрона 22 и 23 имеет
решающее значение для обмена. Среди комбинаций антисмысловых последовательностей, которые мы
испытывали, уровни 408bp были сильнее у AS2-E24-2XAS4 (дорожка 11), -AS7 (дорожка 12) и -AS8 (дорожка
13). Интересно, что AS2-E24-2XAS4 молекула, которая проводит два AS4, был более эффективным (дорожка
5). В AS2-E24-AS7 образце (дорожка 12) дополнительная полоса 294bp была обнаружена, что соответствует
E22-E24 транскрипта, порожденного пропуском экзона 23(см рис 1, U7). И это не удивительно, учитывая, что
AS7 связывает 5 'донорской сайт сплайсинга интрона 23. Вполне вероятно, что АС4, AS7 и AS8 принес
молекулы EXCH ближе к E23, чем AS5 и AS6 предполагая, что плотное обрамление целевого экзона имеет
важное значение для эффективного обмена.
Оптимизация эффективности путем суммирования интронных усилителей сплайсинга.
В целях повышения реакции G-богатый усилитель интронного сращивания (ISE) человеческого GH-1 гена
(GeneID: 2688) был добавлен перед акцепторным сайтом 3 'AS2-E24-AS4 и AS2-E24-AS8 [22], а
последовательность DISE от гена крысы FGFR2 (GeneID: 25022) сайт 5 'донора [14], [23] (рис 3А.). Как
показано на рисунке 3В, анализ ОТ-ПЦР показал, что введение последовательности DISE в AS2-E24-AS4 и
AS2-E24-AS8 (полосы 8 и 12) существенно повысило 408bp группу, соответствующую E22-E24-E24 варианту
мРНК, в то время как добавление последовательности (дорожки 7 и 11) не увеличивают эффективность
обмена. Как и ожидалось, никакого обмена не наблюдалось с контрольными векторами, не обладающими
AS2-E24, AS2-ИНО-E24 и AS2-E24-DISE (дорожки 3, 4 и 5). Рисунок 4
показывает число родительских (PCR1) и транскриптов после обмена (pCR2), данные полученны абсолютно
количественным ОТ-ПЦР (панель С). Молекула AS2-DISE-E24-АС4 позволила получить 45% экзона. Его
эффективность была улучшена примерно в 9 раз по сравнению с его коллегой AS2-E24-AS4 лишенным DISE.
Интересно, что введение двух излишних AS "(здесь AS4) улучшило эффективность обмена, который был
около 30%. Тем не менее, AS2-E24-DISE-2XAS4 не был более эффективен, чем AS2-DISE-E24-AS4 (данные
не показаны)..
Далее мы провели исследование дозирования лучшей EXCH молекулы AS2-E24-DISE-AS4 при
котрансфекции (рис. 5), поддерживая постоянный объем минигена дистрофина при увеличении количества
молекул. Хотя мы использовали сравнимые количества плазмиды при всех трансфекциях, абсолютно
количественный ПЦР последующих образцов показал некоторые расхождения в уровнях транскриптов, как
показано на рисунке 5B (PCR1 + pCR2). Таким образом, анализ на агарозном геле используется только для
подтверждения отсутствия неожиданных продуктов ПЦР (рис. 5А), в то время как эффективность обмена
оценивали по абсолютной количественной ОТ-ПЦР путем расчета отношения между уровнями, полученными
для восстановленных транскриптов (pCR2) и всех транскриптов минигена дистрофина (PCR1 + pCR2) (рис.
5C). Эффективность обмена улучшалась с увеличением количеством EXCH молекулы линейным образом и
достигала восстановления 50% с минигеном дистрофина (250 нг) и тремя молекулами EXCH (750 нг).
Восстановление экзона 23 путем замены экзона
Выявив лучшие цели для антисмысловых последовательностей внутри интронов 22 и 23 гена дистрофина, и
настроив фланговые акцепторные и донорские сайты сплайсинга, мы остановились на новой молекуле,
предназначенной для замены мутантного MDX экзона 23, его дикого типа (рис. 6А). Так как оба транскрипта:
родительский и миниген, породили аналогичные продукты при ОТ-ПЦР (507bp) E22-F и pSMD2-R5
(стрелками А и С на рис. 6В), мы включили в HindIII сайт рестрикции в Е23 дикого типа. 507bp ПЦР-продукт,
полученный в образцах трансфекцированных AS2-E23-DISE-As4 плазмидой (дорожка 2 на рис. 6С, E23), был
клонирован в pCR®-2.1-TOPO®. Были получены 30 клонов, которые проанализированы EcoRI на
присутствие E22-E23-E24 вставки и HindIII ампликона. Среди этих 30 клонов, 21
содержит вставку E22-E23-E24. Среди них, 5 отображал HindIII сайт, атрибут отремонтированного продукта
минигена дистрофина, а это означает, что около 25% из транскриптов минигена были восстановлены (рис. 6d
и фиг. S3). Наличие экзона 23 дикого типа и экзона 23 обмена в этих клонах было подтверждено с помощью
прямого секвенирования.
Обсуждение
Это исследование демонстрирует возможность восстановления мутировавших транскриптов на специальный
экзон обычной версии в ходе реакции сплайсинга. Мы расскажем об оптимизации и дополнениях к
классическому молекулярному транс-сплайсингу (3 'запасных), необходимых для эффективного обмена
экзонами ( сопутствующие 3' и 5 'транс-сплайсинг реакции). Для достижения этой цели, мы создали
экспериментальную модель обнаружения восстановленного и не восстановленного транскрипта, что
позволяет точно оценить мРНК восстановление. Эффективность обмена достигла уровня 45% (при
использовании экзона 24, как обменного репортера) и 25% (при использовании дикого типа экзона 23)
ремонтируемых транскриптов с молекулой EXCH содержащей DISE с минигеном дистрофина в качестве
целевого. Для того чтобы показать, что восстановление происходило на уровне мРНК в результате двойного
транс-сплайсинга, а не с помощью плазмиды рекомбинации, две независимых мутации были включены в
pSMD2-AS2-E24-DISE-AS4 конструкции. Во-первых, CMV промотор был удален, чтобы предотвратить
экспрессию молекулы AS2-E24-DISE-АС4 EXCH. Во-вторых, 5 'сайт сплайсинга GT молекулы AS2-E24DISE-As4 был заменен на КТ с дефицитом молекулы AS2-E24-DISE-AS4-Δ5'SS. Отсутствие плазмиды
рекомбинации также проверяется после восстановления ДНК из котрансфицированных клеток с минигеном
дистрофина и pSMD2-AS2-E24-DISE-AS4. В трех эксперементах мы не смогли обнаружить полосы,
соответствующие продукту минигена при ОТ-ПЦР (рис. S4), подтвердив тем самым, что обмен действительно
требует полнофункциональной молекулы мРНК, и не приходит на уровне рекомбинации плазмиды ДНК.
Важно отметить, что мы не находили аномальные или не ожидаемые конечные продукты, предполагая, что
выбранные последовательности не связываются с загадочными сайтами сплайсинга, ни препятствуют другим
событиям в мРНК-мишени. Вероятно, это связано с использованием длинных антисмысловых
последовательностей (150 NT) [24], которые не были выбраны в определении целевых экзонов. Тем не менее,
можно было бы предположить, что "внешние цели" могут вызвать неожиданные реакции транс-сплайсинга в
присутствии антисмысловых доменов в конечной конструкции. Наконец, мы провели классический
эксперимент для оценки неспецифического транс-сплайсинга с помощью котрансфекции с неактуальным
геном-мишенью, в данном случае с ACTA1 экзогенным геном. Нет неспецифических реакций транссплайсинга (данные не показаны). Технология транс-сплайсинга использует молекулу транс-сплайсинга,
"прием" сплайсосома в использовании его в качестве субстрата для сращивания. В подходе использован
более "хитрый"способ, так как сплайсосома должна выполнять двойной транс-сплайсинг между
предварительным мессенджером транскрипта и молекулой EXCH. Постулируя что длина молекулы EXCH
имеет решающее значение для его эффективности, объясняет необходимость тесного обрамления экзона
замены. Кроме того, переходные участки, конечно, важные элементы молекулы обмена, и это может
представлять интерес для изучения влияния их длины и состава на эффективность обмена. В случае замены 5 '
разделительный элемент может быть удален без снижения эффективности транс-сплайсинга[15]. И наоборот,
при 3 'замене спейсерная область имеет решающее значение, так как содержит
интронные последовательности, необходимые для дополнительных факторов,
участвующих в обработке распознавания акцепторного сайта и экзона. Для обмена, в идеале, обе 5 'и 3'
реакции должны быть синхронизированы. В этом случае, вполне вероятно, что длина переходной зоны
должна соответствовать конформационным ограничениям, диктуемым расстоянием между двумя
антисмысловыми последовательностями-мишенями. С другой стороны, обмен может также возникать при
помощи двух независимых мРНК мишеней, которые будут участвовать последовательно. Это требует
сохранения первого промежуточного продукта транс-сплайсинга в ядре, так что вторая реакция может
происходить с разными мРНК-мишенями. Таким образом, сохранение первого промежуточного продукта в
отсеке для сращивания может быть достигнуто путем введения интронных элементов, которые могут
связываться с элементами сплайсинга, такими как DISE, таким образом, сообщая, что сплайсинг
сигнализация еще не достигнута. С этой точки зрения, длина и состав промежуточных зон может иметь
решающее значение для сохранения промежуточной мРНК химеры.
В качестве стратегии восстановления РНК, наш подход будет производить исправленный белок. Это имеет
дополнительные преимущества по сравнению с другими РНК стратегиями корректировки дефекта
последовательности, не изменяя остальную часть матричной последовательности. Таким образом,
регуляторные последовательности, присутствующие в 5 'и 3' НТО сохраняются, что никогда не происходит в
классической генной терапии. Эти регионы, как известно, имеют важное значение для стабильности мРНК и
регуляции трансляции; в частности, они являются мишенями для микроРНК, которые играют важную роль в
различных заболеваний [25]. Кроме того, стратегия обмена может позволить существование нескольких
изоформ. В частности, эта новая технология может позволить терапевтическое решение для сложных генов,
таких как ген дистрофина с различными мутациями и несколькими изоформами. В заключение, инструменты
и правила, предусмотренные в данном исследовании, открывают новые возможности в области исследования
транс-сплайсинга. Кроме того, стратегия обмена позволяет своего рода операции молекулы мРНК для
терапевтических целей, а также для проведения фундаментальных исследований.
Ссылки.
1. Goyenvalle A, Vulin A, Fougerousse F, Leturcq F, Kaplan JC, et al. (2004) Rescue of dystrophic muscle through U7
snRNA-mediated exon skipping. Science 306: 1796–1799.
2. Denti MA, Rosa A, D'Antona G, Sthandier O, De Angelis FG, et al. (2006) Body-wide gene therapy of Duchenne
muscular dystrophy in the mdx mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 3758–3763.
3. Yokota T, Lu QL, Partridge T, Kobayashi M, Nakamura A, et al. (2009) Efficacy of systemic morpholino exonskipping in Duchenne dystrophy dogs. Ann Neurol 65: 667–676.
4. Benchaouir R, Meregalli M, Farini A, D'Antona G, Belicchi M, et al. (2007) Restoration of human dystrophin
following transplantation of exon-skipping-engineered DMD patient stem cells into dystrophic mice. Cell Stem Cell 1:
646–657.
5. van Deutekom JC, Janson AA, Ginjaar IB, Frankhuizen WS, Aartsma-Rus A, et al. (2007) Local dystrophin restoration
with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med 357: 2677–2686.
6. Kinali M, Arechavala-Gomeza V, Feng L, Cirak S, Hunt D, et al. (2009) Local restoration of dystrophin expression
with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, doseescalation, proof-of-concept study. Lancet Neurol 8: 918–928.
7. Beroud C, Tuffery-Giraud S, Matsuo M, Hamroun D, Humbertclaude V, et al. (2007) Multiexon skipping leading to
an artificial DMD protein lacking amino acids from exons 45 through 55 could rescue up to 63% of patients with
Duchenne muscular dystrophy. Hum Mutat 28: 196–202.
8. Deburgrave N, Daoud F, Llense S, Barbot JC, Recan D, et al. (2007) Protein- and mRNA-based phenotype-genotype
correlations in DMD/BMD with point mutations and molecular basis for BMD with nonsense and frameshift
mutations in the DMD gene. Hum Mutat 28: 183–195.
9. Puttaraju M, Jamison SF, Mansfield SG, Garcia-Blanco MA, Mitchell LG (1999) Spliceosome-mediated RNA transsplicing as a tool for gene therapy. Nat Biotechnol 17: 246–252.
10. Chao H, Mansfield SG, Bartel RC, Hiriyanna S, Mitchell LG, et al. (2003) Phenotype correction of hemophilia A
mice by spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Nat Med 9: 1015–1019.
11. Coady TH, Baughan TD, Shababi M, Passini MA, Lorson CL (2008) Development of a single vector system that
enhances trans-splicing of SMN2 transcripts. PLoS ONE 3: e3468.
12. Tahara M, Pergolizzi RG, Kobayashi H, Krause A, Luettich K, et al. (2004) Trans-splicing repair of CD40 ligand
deficiency results in naturally regulated correction of a mouse model of hyper-IgM X-linked immunodeficiency. Nat
Med 10: 835–841.
13. Liu X, Luo M, Zhang LN, Yan Z, Zak R, et al. (2005) Spliceosome-mediated RNA trans-splicing with recombinant
adeno-associated virus partially restores cystic fibrosis transmembrane conductance regulator function to polarized
human cystic fibrosis airway epithelial cells. Hum Gene Ther 16: 1116–1123.
14. Kierlin-Duncan MN, Sullenger BA (2007) Using 5′-PTMs to repair mutant beta-globin transcripts. Rna 13: 1317–
1327.
15. Mansfield SG, Clark RH, Puttaraju M, Kole J, Cohn JA, et al. (2003) 5′ exon replacement and repair by
spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Rna 9: 1290–1297.
16. Garcia-Blanco MA (2003) Messenger RNA reprogramming by spliceosome-mediated RNA trans-splicing. J Clin
Invest 112: 474–480.
17. Mansfield SG, Chao H, Walsh CE (2004) RNA repair using spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Trends Mol
Med 10: 263–268.
18. Mitchell LG, McGarrity GJ (2005) Gene therapy progress and prospects: reprograming gene expression by transsplicing. Gene Ther 12: 1477–1485.
19. Sicinski P, Geng Y, Ryder-Cook AS, Barnard EA, Darlison MG, et al. (1989) The molecular basis of muscular
dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science 244: 1578–1580.
20. Rodriguez-Martin T, Garcia-Blanco MA, Mansfield SG, Grover AC, Hutton M, et al. (2005) Reprogramming of tau
alternative splicing by spliceosome-mediated RNA trans-splicing: implications for tauopathies. Proc Natl Acad Sci U S
A 102: 15659–15664.
21. Mansfield SG, Kole J, Puttaraju M, Yang CC, Garcia-Blanco MA, et al. (2000) Repair of CFTR mRNA by spliceosomemediated RNA trans-splicing. Gene Ther 7: 1885–1895.
22. McCarthy EM, Phillips JA 3rd (1998) Characterization of an intron splice enhancer that regulates alternative
splicing of human GH pre-mRNA. Hum Mol Genet 7: 1491–1496.
23. Seth P, Miller HB, Lasda EL, Pearson JL, Garcia-Blanco MA (2008) Identification of an intronic splicing enhancer
essential for the inclusion of FGFR2 exon IIIc. J Biol Chem 283: 10058–10067.
24. Puttaraju M, DiPasquale J, Baker CC, Mitchell LG, Garcia-Blanco MA (2001) Messenger RNA repair and restoration
of protein function by spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Mol Ther 4: 105–114.
25. Zhang B, Farwell MA (2008) microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene
therapy. J Cell Mol Med 12: 3–21.
26. Snyder RO, Spratt SK, Lagarde C, Bohl D, Kaspar B, et al. (1997) Efficient and stable adeno-associated virusmediated transduction in the skeletal muscle of adult immunocompetent mice. Hum Gene Ther 8: 1891–1900.
Оригинал статьи: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0010894
Переведено проектом МОЙМИО: http://mymio.org