Нанополимеры улучшают доставку олигонуклеатидов для пропуска экзона и

Нанополимеры улучшают доставку олигонуклеатидов для пропуска экзона и
следовательно экспрессию дистрофина в скелетных мышцах mdx мышей
Jason H Williams1, Rebecca C Schray1, Shashank R Sirsi2 and Gordon J Lutz1*
Corresponding author: Gordon J Lutz glutz@drexelmed.edu
Author Affiliations
1 Drexel University College of Medicine, Department of Pharmacology and Physiology, Philadelphia, Pennsylvania 19102, USA
2 Drexel University, Department of Biomedical Engineering, Philadelphia, Pennsylvania 19104, USA
For all author emails, please log on.
BMC Biotechnology 2008, 8:35 doi:10.1186/1472-6750-8-35
The electronic version of this article is the complete one and can be found online at: http://www.biomedcentral.com/1472-6750/8/35
Received:
15 October 2007
Accepted:
2 April 2008
Published:
2 April 2008
© 2008 Williams et al; licensee BioMed Central Ltd.
Введение.
Стерический блок олигомеров, такой как 2'O-метил (2'OMe) и фосфородиамидат морфолино (PMO) обладают
высоким сродством к комплементарной преМРНК и можгут создавать альтернативное соединение, вызвать пропуск
или включение определенных экзонов. Такие модулирующие сплайсинг олигонуклеатиды(SMO), представляют
сильный класс составов с возможностью широкого использования в качестве фармацевтических препаратов.
Однако, использование в естественных условиях SMO показало необходимость разработки носителей для доставки
к ядрам клеток. Действительно, неэффективная поставка SMO остается главным ограничением их полноценности
как фармацевтических препаратов.
Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) - смертельная x-сцепленная болезнь, вызванная мутациями в гене в 427
килодальтонов связанного с мембраной белка дистрофина, заканчивающаяся прогрессивным ослаблением мышц во
всем теле и смертью обычно в середине третьего десятилетия жизни. Мутации при МДД чаще всего состоят из
вставок и делеций, которые изменяют рамку считывания или вызывают преждевременную остановку кодона [3].
Эти типы мутаций приводят к производству обрезанного и нефункционального дистрофина.
Стерический блок олигонуклеатидов, пропускающих экзон(ESOs), исследовался в культурах клеток мыши, собак и
клеток человека, чтобы вызвать пропуск экзонов, заканчивающийся производством мРНК дистрофина во всю длину
(минус только пропущенные экзоны), и восстановление рамки считывания [4-10]. У животных -классической
модели МДД- mdx мыши, есть точечная мутация в экзоне 23 гена дистрофина, которая производит к
преждевременной остановке кодона. ESO, как показывали, вызвал пропуск экзона 23 и сопутствующее экспрессию
дистрофина в скелетных мышцах mdx мышей и после местной и после системной поставки [8,11-17], и эта
технология была недавно рассмотрена в контексте терапии для МДД [18,19]. Однако, эффективность 2'OMe
поставки ESO и уровень сопутствующего экспрессии дистрофина у mdx мышей остается относительно низкой
[11,13,16]. Несмотря на то, что ESO без носителя прошли до клинических испытаний фазы I, носители должны быть
найдены прежде, чем этот подход можно рассмотреть как терапию для пациентов с МДД.
Богатый амином катионный полимер поли-(этиленовый имин) (PEI) является хорошо изученным составом, который
эффективен при сжатии большой ДНК плазмиды и позволяет улучшить клеточное поглощение [20-25]. Хотя это
относится не только к поставке плазмиды, недавние исследования также зарегистрировали PEI-расширенную
поставку маленьких нуклеиновых кислот, таких как олигонуклеатиды и siРНК [26-33]. Положительный
поверхностный заряд PEI-нуклеиновой-кислоты взаимодействует с отрицательно заряженными элементами на
клеточной мембране, стимулируя поглощение путем эндоцитоза[20,21,24,25,34,35]. После того как PEI проникает в
клетку происходит разрывание эндосомальной мембраны из-за осмотического лизиса [34,36-38]. В то время как
внутриклеточное передвижение комплексов PEI-нуклеотида, однажды вышедших из эндосомы, неизвестны,
олигонуклеатид должен отделиться от PEI, чтобы достигнуть ядра, поскольку ядерная оболочка, вероятно,
непроницаема для PEI. Используя двойной флюоресцентный метод мы недавно показали, что кополимеры PEG-PEI
увеличивали поставку SMO к ядру культивируемых mdx мышечных волокон, в то время как кополимеры, главным
образом, не поступали в ядра [39].
Функциональность и биологическая совместимость PEI улучшены инкорпорацией неионогенного линейного
полимера поли-(этиленовый гликоль) (PEG) в кополимеры PEG -PEI [23,24]. Макромолекулярные свойства PEGPEI-oлигонуклеатида находятся под влиянием молекулярной массы PEI и природы PEGylation, который
обуславливает способность трансфекции [22,23,40]. Мы недавно показали, что кополимеры PEG -PEI сделанные из
MW PEI2K значительно улучшают поставку ESO к мышечным волокнам mdx мышей после внутримышечных
инъекций по сравнению с MW PEI25K кополимером [13]. Мы приписывали превосходящую эффективность
основанных на PEI2K кополимеров к низкому поверхностному заряду и высокой стабильности наночастиц,
сформированных во время комплексообразования с ESO [41]. Хотя внутримышечная инъекция этих PEG -PEI-ESO
комплексов произвела значительно больше дистрофин-положительных волокон, чем один ESO, уровень экспрессии
дистрофина при Вестерн-блотт анализе достиг только 2-5% нормального уровня в ПББМ( передняя большеберцовая
мышца). Поэтому, в этом отчете мы оценили, могли ли бы новые режимы инъекций кополимеров PEG -PEI
улучшить экспрессию. дистрофина Наши результаты показывают, что повторные инъекции небольших количеств
PEG-PEI-ESO очень эффективны при преобразовании экспрессии дистрофина, достигая до 20% нормальных
уровней при самом благоприятном составе и режиме инъекции.
Результаты
Индукция экспрессии дистрофина внутримышечной инъекцией PEG-PEI-ESО
Цель этого исследования состояла в том, чтобы определить эффективный состав PEG-PEI-ESO и схемы инъекции
для увеличения экспрессии дистрофина после внутримышечной инъекции в ПББМ 6–8 недельных mdx мышей
мужского пола. ESO для всех экспериментов содержал 2'OMe олигонуклеатид, который, как ранее показывали,
обладал способностью пропускать экзон 23, таким образом удаляя точечную мутацию, которая приводит к
преждевременной остановке кодонов. Мыши получили три еженедельных внутримышечных инъекции 5 нг ESO
комплекса или PEI2K (PEG550)10, NG-PEI2K (PEG550)10, или CG-PEI2K (PEG5K)10 кополимеров и были
проанализированы на наличие экспрессии дистрофина через одну неделю после третьей инъекции.
Иммуногистохимия поперечных секций показала, что все три кополимерных формы произвели существенно
большее количество дистрофин-положительных волокон по сравнению с мышцами нелеченных mdx мышей
(рисунок 1). Окрашивание гематоксилином-эозином показало морфологическую целостность без явных симптомов
некроза мышцы или цитотоксического повреждения (рисунок 1). Количественная оценка целых поперечных
сечений мышцы показала, что инъекции PEI2K (PEG550) 10-ESO форма произвела 594 ± 120 дистрофинположительных волокон (рисунок 2), которые соответствует примерно 30% или приблизительно 2000 волокон в
ПББМ [11,43].
В соответствии с предыдущими исследованиями, показывая улучшил биологическую совместимость и увеличенное
клеточное поглощение наночастицконъюгированных с золотом [44,45], мы выдвинули гипотезу, что конъюгация
или адсорбция нанозолота (NG) или коллоидного золота (CG) улучшает свойства PEG -PEI кополимеров, как
носителей. Удивительно, что инъекции NG-PEI2K (PEG550) 10-ESO и CG-PEI2K 10-ESO (PEG5K) заканчивались
обнаружением только 380 ± 36 и 322 ± 24 дистрофин-положительных волокон, соответственно, оба из которых были
значительно меьше, чем с неконъюгированными PEI2K (PEG550) 10 кополимерами (рисунок 2A; P <0.05).
Чтобы определить количественно экспрессию дистрофина был выполнен Вестерн-блоттинг на поперечной секции
целой мышцы, непосредственно на которых было проведено исследование количества волокон. Экспрессия
дистрофина после трех еженедельных инъекций PEI2K (PEG550) 10-ESO (5 нг ESO на инъекцию) достигла 11.2 +/2.4% уровня, найденного в нормальных мышцах (рисунок 2B-C). Как ожидалось, экспрессия дистрофина в
контрольной группе mdx мышц не обнаружена, и была, вероятно, меньше чем 1% от нормы. Введение NG-PEI2K
(PEG550) 10-ESO и CG-PEI2K (PEG5K), 10-ESO формы заканчивались экспрессией дистрофина 7.6 ± 1.0% и 9.8 ±
2.1% нормального уровня, ни один из которых статистически не отличался от неконъюгированого кополимера
(рисунок 2B-C). Хотя мы не выполняли инъекции ESO без полимеров в этом исследовании, мы показали в других
исследованиях, что инъекции 2'OMe ESO при подобном дозировании и режимах инъекции как использовалось
здесь, произвели очень низкое число дистрофин-положительных волокон и не показал наличие дистрофина при
Вестерн-блоттинге ([13] и Sirsi и др.). Точно так же предыдущее исследование, используя ESO, поставленный без
носителя, не показало увеличения числа дистрофин-положительных волокон по сравнению с мышцами контроля
mdx [43]. Неуместность поставки 2'OMe ESO без носителя у mdx мыши привела к исключению одного только ESO в
других исследованиях по индукций синтеза дистрофина после местной и системной поставки [11,16].
Профиль дозы PEG-PEI-ESO
Используя тот же самый режим тройной инъекции как описано выше, свойства дозы CG-PEI2K (PEG5K) 10-ESO
были оценены в диапазоне от 3 до 60 нг ESO. Дистрофин-положительные волокна были
обнаружены при всех дозах (рисунок 3), но в мышцах с самой маленькой дозой ESO (1 нг × 3 инъекции) выражены
значительно меньше, чем при введении дозы 15, 30, или 60 нг (рисунок 4A; P <0.05). Вестерн блот анализ
показал, что высший уровень индукции синтеза дистрофина был достигнут, используя 5 нг ESO за инъекцию, что
закончилось экспрессий 14.2 ± 1.6% на 1.6% дистрофина (рисунок 4B-C).
Долгосрочные повторные инъекции ESO увеличивают экспрессию дистрофина.
В попытке далее улучшить экспрессию дистрофина, мы выполнили долгосрочные повторные эксперименты по
введению NG-PEI2K (PEG550) 10-ESO. Мыши получили 10 последовательных
внутримышечных инъекций NG-PEI2K (PEG550) 10-ESO (1 или 5 нг ESO за инъекцию), с промежутком в 4 дня
между инъекциями, образцы тканей были собраны через 6 недель после первой инъекции. Иммуногистохимия
целых поперечных секций показала, что эта схема лечения приводила к увеличению поставки ESO к мышечным
волокнам, производя обширные области дистрофин-положительных волокон (рисунок 5). В среднем мышцы,
получившие дозу 1 и 5 нг ESO за инъекцию (10 и 50 нг ESO более чем 6 недель), содержали 832 ± 167 и 1225 ± 343
дистрофин-положительных волокон, соответственно (рисунок 6B). Число дистрофин-положительных волокон после
поставки 10 нг ESO в течение 6 недель было 2.2-кратно больше, чем после 15 нг ESO в течение 3 недель, используя
тот же самый NG-PEI2K (PEG550) 10. Окрашивание Г-Э подтвердило, что увеличенная экспрессия дистрофина
после повторных инъекций, не была связана с явными признаками цитотоксичности (рисунок 6A).
Вестерн-блоттинг установил возможность режима инъекций с 10 повторениями (NG-PEI2K (PEG550) 10-ESO
(рисунок 6C-D). В среднем мышцы, получившие 50 нг ESO, имели 19.1 ± 1.8% нормального количества
дистрофина, уровень, который, как ранее показывали, был достаточен для выздоровления механических свойств
mdx мышцы [43,46,47]. Экспрессия дистрофина после 50 нг ESO была значительно больше, чем 8.1 ± 2.8%,
произведенные при 10 нг ESO (P <0.05). Однако, была исключительно высокая вариабельность экспрессии
дистрофина в пределах группы 10 нг, самые низкие и самые высокие показатели колебались от 4 до 23%. Пиковый
уровень 23% экспрессии дистрофина наблюдался только после введения 10 нг ESO более чем 6 недель,
демонстрировал эффективность нанополимер-ESO формы.
Экспрессия nNOS в mdx мышцах, леченных PEG-PEI-ESOs
Мышцы от леченных mdx мышей были проанализированы на экспрессию nNOS как признак экспрессии
функционального дистрофина с интактной N-терминальной областью. Было ранее показано,
что nNOS экспрессия отсутствует в мышцах mdx мышей [48] и может регулироваться положительно после пропуска
экзона и восстановления экспрессии дистрофина[11]. Поэтому, мы задались вопросом: увеличила ли текущая
стратегия восстановления экспрессии дистрофина уровень nNOS, Исследование последовательных секций на
наличие дистрофина и nNOS показали очень высокую корреляцию между дистрофином и nNOS-положительными
волокнами (рисунок 7). Специфично, связанный с мембраной nNOS, казалось, был выражен только в mdx
мышечных клетках, которые также показали увеличенную экспрессию дистрофина, указывая, что ESO-выраженный
дистрофин был функционально интактен. Как ожидалось, nNOS экспрессия отсутствовало в mdx мышцах группы
контроля.
Обсуждение
Растущее мнение, что ESO находятся на пути к становлению жизнеспособной терапевтической возможности для
лечения МДД, хорошо подтверждается данными исследований клеточных культур и животных, показывая
возможность пропуска различных экзонов и проистекающую индукцию синтеза дистрофина почти во всю длину
[4,6,7,9,11-16,49,50]. Однако, есть некоторые дебаты, относительно состава ESO, который может работать лучше
всего, и какой состав носителя обеспечит соответствующую поставку. ESO фосфоротиоат
2'OMe и PMO были лучшим, изученным у моделей животных, и оба в настоящее время участвуют в Фазе I
клинического испытания [51]. И 2'OMe и PMO ESO функционируют, блокируя целевые последовательности
преМРНК, и считается, что они могут использоваться попеременно, как только оптимальная последовательность
(для единственного состава) была эмпирически определена [52]. Однако, принципиальные различия в 2'OMe и PMO
устраняют использование универсального носителя для эффективной поставки. Специфично, PMO - синтетические
составы, которые чрезвычайно устойчивы к химической деградации, но они - также имеют нейтральный заряд,
который ограничивает взаимодействие с поверхностью клеток и клеточное поглощение. Недеградирующая природа
PMO также ставит вопросы о их безопасности. Напротив, 2'OMe, ESO - анионная РНК, и несмотря на улучшенную
стабильность из-за их фосфоротиоат структуры, остаются несколько восприимчивыми к деградации, в то время как
отрицательный заряд препятствует биораспределению и клеточному поглощению.
В этом исследовании мы показали, что кополимеры PEG -PEI с низким MW PEI2K выполняют функцию
эффективных носителей для поставки 2'OMe ESO к мышечным волокнам mdx мышей после внутримышечных
инъекций, заканчивающихся улучшенными уровнями экспрессии дистрофина. Три еженедельных внутримышечных
инъекции только 5 нг ESO с PEI2K (PEG550) 10 заканчивались образованием приблизительно 600 дистрофинположительных волокон и экспрессией дистрофина на уровне приблизительно 11% нормального уровня через 3
недели после начальной инъекции. Еще более высокие уровни экспрессии дистрофина были достигнуты, используя
режим инъекции два раза в неделю, в течение н6 недель. 10 последовательных инъекций NG-PEI2K (PEG550) 10 с 5
нг ESO произвели к образованию более чем 1200 дистрофин положительных волокон и уровню экспрессии
дистрофина 20% нормального уровня. В областях с наибольшей концентрацией препарата мы наблюдали
сопутствующее увеличение связанного с мембраной nNOS, специфично дистрофин-положительных волокон, в
соответствии с предыдущими докладами [11].
Хотя уровни экспрессии дистрофина, показанные в этом отчете, демонстрируют полезность PEG -PEI
нанополимеров для поставки ESO, эти составы, кажется, несколько менее эффективны, чем PMO. Alter и др. [14],
недавно показал, что единственная внутримышечная инъекци 10 нг PMO заканчивались образованием максимум
60% нормального уровня дистрофина, хотя этот отчет, казалось, обеспечил только оценку эффективности и
испытывал недостаток в статистическом анализе достоверности. Другие недавние исследования PMO сопряженным
с специфичными пептидами для проникновения в клетки показали внушительные числа дистрофин-положительных
волокон, но не обеспечивали полную оценку экспрессии дистрофина вестерн-блотт анализом [12].
PEI2K (PEG550) 10 и PEI2K (PEG5K) 10 кополимеры, используемые в этом исследовании, как ранее показывали,
сформировали исключительно устойчивые комплексы с отрицательно заряженным ESO, и поверхностный заряд
наночастиц был относительно низок [41]. Мы предлагаем, что высокая стабильность и низкий заряд этих частиц две существенных особенности, которые делают их более применимыми в естественных условиях для поставки
ESO, чем основанные на MW PEI25K кополимеры. Специфично, низкий заряд поверхности частиц улучшает
биораспределение и уменьшает цитотоксичность, в то время как высокая стабильность позволяет оставаться
связанным во время внеклеточного транспорта.
Наночастицы, содержащие золото, такие как NG и CG, как показывали, улучшили биологическую совместимость и
увеличило клеточное поглощение различных типов лекарственных средств [44,45,53,54]. В частности NG,
сопряженный с низким MW PEI2K, показал, по крайней мере, на порядок большую эффективность, чем PEI25K и
был в 12 раз более мощным, чем немодифицированный PEI2K для поставки ДНК плазмиды в клеточной культуре
[44]. Неожиданно, что наши результаты показали, что никакое ковалентное сопряжение NG или CG кополимеров
PEG -PEI не улучшило поставку ESO. Пробы стабильности Polyplex в PBS показали , что CG и NG вызвал только
умеренное ослабление стабильности (данные, не показаны), делая это маловероятным объяснением из-за отсутствия
улучшенной поставки. Возможное объяснение состоит в том, что покрытие CG не было достаточно устойчиво,
чтобы прилегать к кополимеру во время поставки. С другой стороны, NG был ковалентно спрягаемым PEG -PEI, и
мы постулируем, что его неэффективность происходила более вероятно из-за 1:10 нг отношению к PEI2K, которое,
возможно, было слишком низко, чтобы улучшить функциональность.
Экспрессия дистрофина, достигнутая в данном исследовании, была достигнута с носителями PEG -PEI, которые,
казалось, не выявляли явных признаков цитотоксичности. Это в отличие от предыдущих исследований с
использованием non-PEGylated PEI25K как носителя 2'OMe ESO, который был неэффективен и привел к
значительным поврежденииям после очень ограниченного числа инъекций [55,56]. Основываясь на этих
результатах, мы пришли к заключению, что катионные полимеры неподходят для естественных условий поставки
АО в скелетные мышцы [11,57]. Однако, у частиц PEI-нуклеотида, используемых в этих предыдущих исследованиях
несомненно, были очень высокие положительные поверхностные заряды, потому что они не содержали PEG,
который, как известно, обеспечивает стерическое ограждение заряда на поверхности PEI. Кроме того, дисперсии
чрезвычайно-заряженных-частиц после внутримышечной инъекции, вероятно, препятствуют взаимодействию
заряда между PEI и отрицательно заряжеными элементами в пределах внеклеточной среды. Поэтому, не
удивительно, что эти предыдущие исследования трансфекции мышцы
non-PEGylated PEI приводили к
неудовлетворительным результатам. Мы предполагаем, что комбинация MW PEI и PEGylation, используемого
теперь, обеспечила благоприятную форму, которая была и эффективна и нетоксична. Однако, нехватка
наблюдаемой цитотоксичности не устраняет возможность, что некоторое повреждение мышцы может встречается
после инъекции, заканчивающейся некоторым уровнем регенерации дегенерации. Этот процесс может лежать в
основе до некоторой степени высокого числа дистрофин-положительных волокон,
наблюдаемых в нашем 6-недельном (10 инъекций) испытания. Хотя не было систематически
оценки, мы заметили, что кратковременное механическое повреждение встречается в mdx мышцах после
внутримышечных инъекций различных составов (даже солевой раствор), который не встречается в нормальной
мышце. Из-за нехватки дистрофина mdx мышцы более восприимчивы к механическому повреждению, чем
нормальная мышца. Этот эффект может быть усилен до некоторой степени катионными частицами, или в этом
отношении, любым типом состава носителя.
Мы предполагаем, что главное ограничение форм носитель-ESO, описанных в этом отчете, было в
несоответствующей функциональностьи носителя, и свойственной силой ESO. ESO, используемый в данном
исследовании (определяемый в литературе как M23D (+02–18)), как показывали, in vitro преобладающе производил
пропуск экзона 23, хотя некоторый пропуск экзонов 22–23 действительно встречается [42]. Кроме того в этом
исследовании мы показали, что при самом эффективном условии, приблизительно 50% волокон были дистрофинположительны, что соответствовало 20% нормальной экспрессии дистрофина. Это указывает, что в средних
дистрофин-положительных волокнах содержалось приблизительно 40% нормального уровня дистрофина. Подобное
вычисление, основанное на данных, о которых сообщает Lu и др. [11], и наше недавнее исследование с, TAT сопряженными кополимерами (Sirsi и др.,) предполагают, что уровень дистрофина может достигнуть 75%
нормальных уровней.
Таким образом главное ограничение катионных носителей, как кажется, их плохое диффузионное распределение,
как обнаружено, большими областями в мышцах без очевидной трансфекции. Таким образом дальнейшее
совершенствование функциональности носителя, вероятно, потребуется, чтобы позволить использование в
клинические условия для лечения МДД. Наша группа недавно показала, что сопряжение множественного HIV-TAT
эпитопа с PEI2K (PEG5K)10 очень улучшили поставку ESO, используя подобное дозирование и подобный режим
внутримышечных инъекций, заканчиваясь максимум 30% экспрессии дистрофина (Sirsi и др.,). Различные другие
типы нацеленных на клетку лигандов, пептидов проникновения клетки могут также связываться с PEI, чтобы
улучшить функциональность. Значительно, что этот тип сопряженного пептида-PEI может, вероятно, быть
синтезирован для улучшения системной поставки, которая потребуется, чтобы достигать значительного
терапевтического эффекта. PMO, как показывали исследования, ограничили эффективность после системной
поставки. Например, интраперитонеальные инъекции у новорожденных mdx мышей 5 мг/кг/нед. PMO-пептида
произвели широко распространенную экспрессию дистрофина в мышце диафрагмы с низкими уровнями экспрессии,
наблюдаемыми в мышцах конечности [12,58].
Методы
Животные
Мdx мыши мужского пола (C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J) и нормальные мыши в возрасте 6–9 недель(C57BL/10SnJ)
приобретены в Лаборатории Джэксона (Bar Harbor, ME). Все животные использовались в соответствии с NIH и
университетскими правилами (Drexel University College of Medicine, ULAR facility, Philadelphia, PA).
Синтез нанополимера
Синтез и физико-химическая характеристика PEI2K (PEG550) 10 и PEI2K (PEG5K) 10 кополимеров были ранее
описаны [41,59]. Кополимеры определяются, используя спецификацию, где приписка указывает число цепей PEG ,
трансплантированных на молекулу PEI. Например, PEI2K (PEG550) 10 указывает 10 цепей PEG 550 дальтон,
трансплантированных каждой молекуле PEI на 2 килодальтона. Частицы нанозолота(NG) спрягались с основными
группами амина PEI на PEI2K (PEG550) 10 с использованием Сульфо-N-гидрокси-сукцинимидо нанозолота
(Nanoprobes, Yaphank, Нью-Йорк). В этой реакции 75 нмолей PEI2K (PEG550) 10 были смешаны с 6 нмолями NHS
нанозолота в 780 мкл стерилизованной воды (pH фактор = 8.0). Результат заморожен в течение 24 часов на льду и
впоследствии высушен сублимацией и сохранялся при -20°C. Адсорбция коллоидного золота (CG) PEI2K (PEG5K)
10 была выполнена, смешивая 300 мкл частиц CG 5 нм (Sigma-Aldrich) с 30 мг PEI2K (PEG5K) 10 (в 1 мл DI H20)
при 4°C быстро. Раствор полимера впоследствии сушился сублимацией и хранился при -20°C. NG и маркированные
кополимеры CG определяются как NG-PEI2K (PEG550) 10 и CG-PEI2K (PEG5K) 10, соответственно.
Подготовка PEG-PEI-ESO
ESO,
используемый
во
всех
экспериментах,
содержал
20-mer
олигонуклеатидов
(5
'GGCCAAACCUCGGCUUACCU-3'), пропускал экзон 23 из гена дистрофина у mdx мышей [11,16,42]. Во время
синтеза (Trilink, Сан-Диего, Калифорния) каждое основание было соединено с фосфоротиоатом и содержало
метокси группу у 2' углерода. PEG-PEI-ESO были подготовлены в азоте для соединения с фосфатом 5 (N:P = 5); где
N представляет заносы амина на PEI, и P представляет заносы фосфата на ESO. Комплексы были сформированы
добавлением кополимерного PEG -PEI к ESO (в стерильном солевом растворе).
Внутримышечные инъекции PEG-PEI-ESO
Мdx мыши мужского пола (6–9 недель возраста) были анестезированы и сбривалась шерсть для визуализации мышц
задней конечности. 15 мкл объемов PEG-PEI-ESO раствора в различных концентрациях были введены с двух
сторон в середину части брюшка ПББМ, используя 31 инсулиновый шприц . После восстановления после анестезии
мыши были возвращены к нормальной активности.
Мы использовали и 3 и 6 недельный график инъекций следующим образом. Для групп с 3 недельным графиком
мыши получили инъекции в 0, 7, и 14 дни; и образцы были собраны на 21. В одной серии экспериментов в мышцы
были введены 5 нг ESO (15 нг общих количеств) или PEI2K (PEG550) 10, NG-PEI2K (PEG550) 10, или CG-PEI2K
(PEG5K) 10 кополимеры. Для анализа реакции на единственную дозу в мышцы были
введены 1, 5, 10, или 20 нг ESO (3, 15, 30, и 60 нг общих количеств) CG-PEI2K (PEG5K) 10
кополимеров. Для групп с 6 недельным графиком в мышцы был введен препарат в 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, и 36
день; и образцы были собраны на 42. Для этого эксперимента в мышцы были введены или 1 или 5 нг ESO за
инъекцию (10 и 50 нг общих количеств) с NG-PEI2K (PEG550) 10 кополимеров. Для всех групп были
проанализированы 2 мыши (N = 4 мышцы).
Иммуногистохимия, гистология и количество волокон.
В определяемых моментах времени были убиты мыши, и удалены ПББМ, заморожены жидким азотом в
изопентане, так сохранились при -80°C. Мышцы контроля были собраны от нелеченных подобранных по возрасту
mdx и нормальных мышей. Поперечные замороженные секции (10 мкм) были вырезаны из брюшка каждой мышцы
используя криостат (Leica CM 3050 S, Бэннокберн, Иллинойс) и оттаяны для иммуногистохимии и гистохимии.
Толстые (60 μm) поперечные секции, немедленно смежные с тонкими срезами, были разрезаны в криостате и
помещены в трубки для центрифуги на 1.5 мл на сухом льду и сохранились при -80°C для последующего западного
анализа.
Для иммунного анализа секции мышцы были обработанны 10%-ой нормальной сывороткой козы в 1%-ом BSA/PBS
в течение 1 ч и затем в течение 1 ч поликлональными антидистрофиновыми антителами кролика (1:200; Abcam,
Кембридж, Массачусетс) или анти-nNOS (1:125; Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Вторичное антитело было IgG
Cy3-Anti-Rabbit (1:500; Jackson Immunoresearch, Западная Роща, Пенсильвания). Слайды были помещены в
заливочную среду Vectashield с DAPI (Векторные Лаборатории, Берлингейм, Калифорния) и получены изображения
(4/10/20×; Олимп, AX70, Мелвилл, Нью-Йорк).
Вестерн блот анализ экспрессии дистрофина.
Из секции замороженных ПББМ (60 μm) проведена экстракция путем добавления 1.5 мл к 50 мк белкового буфера,
содержащего 125 мм Tris (pH фактор 6. 8), 4%-ого SDS, Экстракт был заморожен на льду (15 минут), кипел (5
минут) и центрифугирован (4000 × g в течение 5 минут). Белковая концентрация была измерена в экстрактах,
используя пробу Coomassie (Проникните, Рокфорд, Иллинойс) и равный объем буфера SDS-PAGE (125 мм Tris (pH
фактор 6. 8), 4%-ый SDS, 5%-ый 2-mercaptoethanol, 10%-ый глицерин и 0.05% бромфенола синего), был добавлен к
экстракту. Образцы, содержащие 25 нг общего количества белка, были помещены в гели SDS (3% stacking: 7.5%
resolving; Bio-Rad, Hercules, CA) и после 16 ч, окрашивались Ponceau S (Сигма, Сент-Луис, Миссури), чтобы
визуализировать результат. Мембраны были в течение 1 ч обработанны моноклональными антидистрофиновыми
антителами (MANDYS8; Сигма, Сент-Луис, Миссури) в разведениях 1:400 и 1:2000. Вторичные антитела осла
против мыши IRDye, 800 (Биологические науки ЛИТИЯ БОЖЕ МОЙ, Lincoln, Небраска) были применены в течение
1 ч и мембрана была просмотрена с помощью Системы Отображения после многократного мытья TBS-T/TBS.
Статистический анализ
Все данные представлены в виде значение± SEM. Статистическия анализ выполнен методом ANOVA (Statview; SAS
Institute, Cary, NC).
Оригинал статьи: http://www.biomedcentral.com/1472-6750/8/35
Переведено проектом МОЙМИО http://www.mymio.org/