ОТЧЕТ

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Кафедра биофизики
ОТЧЕТ
по радиобиологической практике
«Исследование цитотоксического действия квантовых
точек на суспензию клеток E.Coli pXen7 при облучении
ультрафиолетом»
Выполнил:
Проверил:
Москва, 2013 г.
Гвоздев Д.
.
Байжуманов А.А.
Введение
Сегодня наиболее агрессивными и устойчивыми к антибактериальным препаратам
являются такие широко распространенные патогены, как E. coli, S. аureus и стрептококки
[1, 2], причем всё больший ряд бактерий очень быстро теряет чувствительность к
антибиотикам. Вследствие этого падающая эффективность современных видов борьбы с
микроорганизмами (например, химической терапии) уже недостаточна для достижения
желаемого эффекта.
Одним из наиболее интенсивно развивающихся в настоящее время методов
лечения рака и инактивации микроорганизмов является фотодинамическая терапия (ФДТ)
[3, 4]. Данный метод основан на деструктивном действии фотосенсибилизаторов (ФС),
которые под действием света вступают в фотодинамические реакции, продуцируя
активные формы кислорода (АФК) и свободные радикалы. В качестве ФС могут
выступать как эндогенные природные клеточные метаболиты (НАДН, порфирины,
флавины), так и различные экзогенные красители [5].
Во многих исследованиях было показано, что увеличить эффективность действия
фотосенсибилизаторов можно с помощью квантовых точек (КТ). Однако сведения о
наличии у КТ собственного цитотоксического
эффекта крайне противоречивы.
Следовательно, нельзя сказать наверняка, что КТ оказывают действие на клетки
опосредованно через ФС. Данная работа ставит целью пролить свет на истинный ход
развития событий в системе КТ-ФС-бактерия.
Цель и задачи исследования
Целью работы являлось изучение деструктивного действия квантовых точек и
фотосенсибилизаторов (на примере замещенного фталоцианина цинка (ФЦ)) на бактерии
при действии УФ-А излучения.
Для осуществления цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать динамику инактивации бактерий под действием гибридной системы
КТ-ФЦ, а также КТ и ФЦ, взятых по отдельности;
2. Оценить влияние длительности облучения ближним УФ в вышеописанных
системах.
2
Литературный обзор
1. Действие ультрафиолетового излучения на живые объекты
Известно, что биологические объекты обладают фоточувствительностью. Свет не
только обеспечивает протекание различных фотобиологических реакций (первичные
этапы фотосинтеза, механизмы зрения, фоторегуляции и др.), но и обладает способностью
вызывать деградацию биологических объектов от отдельных молекул до целых клеток.
Ещё в 1877 г. Даунс и Блант обнаружили, что ультрафиолетовое излучение
инактивирует бактерии. В 1928 г. Ф. Л. Гейтс показал, что спектр действия гибели
бактерий
соответствует
спектру
поглощения
нуклеиновых
кислот,
с
которым
коррелировал и спектр действия мутаций у кукурузы (Л. Дж. Стадлер, Ф. М. Угер, 1942
[6]). Таким образом, было доказано, что основной мишенью при летальном и мутагенном
действии УФ лучей служат нуклеиновые кислоты.
Тем не менее, еще долгое время спустя механизмы фотохимии нуклеиновых кислот
оставались неизвестными. Лишь в 60-х гг. Р. Бейкерс и В. Берендс открыли реакцию
фотохимической димеризации тимина в ДНК. С тех пор было обнаружено еще несколько
важных фотореакций – фотогидратация, образование сшивок ДНК-белок и (6-4)
пиримидиновых аддуктов [6, 7]. В белках под действием ультрафиолета происходит
фотоионизация ароматических аминокислот, а также фотолиз цистинов (погл. при 254
нм). Следует отметить, что данные виды повреждений вызываются коротковолновым
(200-290
нм)
и
средневолновым
(290-320
нм)
УФ.
Повреждающее
действие
длинноволнового УФ (320-380 нм) и видимого (380-750 нм) света на живые организмы
обусловлено протеканием сенсибилизированных реакций. На это указывает тот факт, что
длинноволновая граница поглощения, например, ДНК, лежит при 300-310 нм, поэтому она
не может выступать в роли первичного хромофора при облучении светом с длиной волны
более 320 нм.
Фотосенсибилизированные реакции можно разделить на два класса: нуждающиеся в
присутствии кислорода и не нуждающиеся в нем.
Примером
кислороднезависимых
реакций
является
фотолиз
цистеина
в
макромолекулах белков за счет взаимодействия с сольватированными электронами,
выбитыми из ароматического кольца триптофана или тирозина (Л. Гроссвайнер и др.,
1970 [6]). За летальное и мутагенное действие длинноволнового УФ (ПУФА-терапия) на
микроорганизмы ответственна реакция фотоприсоединения псораленов к пиримидиновым
3
основаниям ДНК с образованием моноаддуктов (с одной молекулой тимина) и диаддуктов
(сшивки в ДНК; как правило, летальны).
Однако основная часть фотосенсибилизированных процессов протекает в присутствии
кислорода. Явление, для которого требуется участие трех составляющих – света,
красителя и кислорода, Г. Таппейнер назвал фотодинамическим действием. Было
показано, что спектр действия фотодинамического эффекта соответствует спектру
поглощения красителя.
К. Фут предложил все фотосенсибилизированные окислительные реакции разделять
на два типа (рис. 1).
Рис. 1. Типы фотосенсибилизированных реакций. Sо, 1S*и 3S*– основная, возбужденные синглетная
и триплетная формы ФС соответственно.
К типу I относятся реакции, в которых ФС в триплетном возбужденном состоянии
первоначально взаимодействует с различными биологически важными молекулами,
участвуя в переносе электрона или атома водорода. В реакциях типа II взаимодействие на
первичных стадиях осуществляется с молекулой кислорода, причем образуется либо
супероксид-анион •О2– (сопряжено с генерацией окисленного радикала ФС •S+), что
происходит значительно редко, либо возбужденный синглетный кислород, который и
окисляет субстрат:
S + 3O2 → 1So + 1O2* ;
3 *
1
O2 + B → BO2
Фотосенсибилизаторы можно разделить на две группы: эндогенные и экзогенные.
Эндогенные ФС представлены в живых организмах НАДН, флавинами, порфиринами и
другими хромофорными молекулами. Хотя они способны генерировать синглетный
кислород (например, к этому приводит возбуждение тетрапиррольных интермедиатов),
основной механизм их действия – образование супероксидного анион-радикала и его
4
производных АФК, обычно в результате перегрузки электронтранспортных цепей
фотосинтеза и аэробного дыхания. При этом деструкции подвергаются все компоненты
клетки. Экзогенные ФС различной природы, как правило, продуцируют синглетный
кислород;
проникнув
внутрь
клетки
(если
это
возможно),
они
специфически
распределяются в клеточных компартментах [3].
2. Полупроводниковые нанокристаллы
Полупроводниковые
нанокристаллы,
или
квантовые
точки
–
фрагменты
полупроводника, ограниченные по трем пространственным измерениям и содержащие
электроны проводимости.
Квантовые точки имеют характерный размер порядка 1 – 30 нм, а как известно [8],
при уменьшении размеров объекта начинают проявляться квантово-механические
эффекты из-за пространственного ограничения движения носителей заряда. Это приводит
к квантованию уровней энергии электронов в полупроводнике, которые оказываются в
трехмерной потенциальной яме:
𝑬̅̅̅̅
𝒆𝒏 =
𝝅 𝟐 𝒉𝟐
𝟐𝒎𝒅𝟐
𝒏𝟐 ,
(1)
где m – эффективная масса электрона, d – ширина потенциальной ямы, n – номер
энергетического уровня. Видно, что характерное расстояние между уровнями энергии
равно 𝜋 2 ℎ2 ⁄2𝑚𝑑2 (точное выражение зависит от формы точки). Аналогично переходу
между уровнями энергии атома, при переходе между энергетическими уровнями
квантовой точки может излучаться квант света [9]. При этом, в отличие от настоящих
атомов, частотами переходов легко управлять, меняя размеры кристалла.
Перенос энергии возбужденного состояния по полупроводниковому кристаллу (так
же, как и в диэлектрике) осуществляется посредством экситона (Френкель, 1931). Экситон
представляет собой квазичастицу (совокупность электрона и дырки), миграция которой не
связана с переносом заряда и массы. Электрон перемещается в зоне проводимости, а
дырка – в валентной зоне. Таким образом, поглощение фотона рождает электрондырочные (e–h) пары, а рекомбинация электронов и дырок вызывает флуоресценцию.
Исторически первыми квантовыми точками были нанокристаллы селенида кадмия
CdSe [10]. Квантовый выход этих КТ не превышал 10%. Проблема заключалась в
поверхностных дефектах, играющих роль безызлучательных центров рекомбинации или
«ловушек» для возбужденных e–h пар. Для преодоления этих проблем квантовые точки
5
заключают в оболочку, состоящую из нескольких слоев широкозонного материала, как
правило, сульфида или селенида цинка. Это позволяет изолировать e–h пару в ядре,
увеличить время ее жизни, уменьшить безызлучательную рекомбинацию, а значит –
увеличить фотостабильность и квантовый выход флуоресценции (до 70% при комнатной
температуре) [11].
Рис. 2. Схема синтеза CdSe/ZnSe квантовых точек.
Современные нанотехнологии позволяют синтезировать полупроводниковые
CdSe/ZnS квантовые точки, которые поглощают свет в широком оптическом диапазоне от
ультрафиолетовой до ближней инфракрасной области. Это обеспечивает возможность
возбуждать нанокристаллы разных цветов одним источником излучения. Спектр
флуоресценции КТ достаточно узок (полуширина спектра составляет 20–25 нм) и
идеально симметричен (в отличие от органических красителей, для которых характерно
наличие длинноволнового «хвоста»), а положение максимума испускания флуоресценции
определяется диаметром нанокристалла [8]. Квантовый выход флуоресценции КТ
достигает 70–80%. По этому параметру КТ несколько уступают лучшим органическим
флуоресцентным красителям, однако квантовые точки превосходят их на несколько
порядков по величине сечения поглощения света, которое достигает 250–300 Å2 при
диаметре 350 нм [12]. Яркость свечения КТ поразительно высока, а уникальная
фотостабильность значительно замедляет процесс выцветания.
Синтезируемые CdSe/ZnS нанокристаллы растворимы только в органических
растворителях (хлороформ, толуол, гептан и т.п.). Их использование в водных растворах
требует наличия на поверхности частиц гидрофильных групп [11]. В связи с этим КТ
покрывают дополнительной оболочкой из полифункциональных полимеров, жирных
кислот и других соединений, что открывает дополнительные возможности применения
нанокристаллов, в частности, делает их биосовместимыми.
6
Рис. 3. Характерные спектры поглощения и флуоресценции квантовой точки КТ 530 с ядром из
CdSe/ZnS. Спектры нормированы на соответствующие значения интенсивностей максимумов
поглощения/флуоресценции.
Таким
образом,
благодаря
своим
свойствам
квантовые
точки
являются
многообещающими объектами для использования в фотодинамической терапии [13, 14].
Стоит отметить, что, судя по последним данным, токсичность КТ в отсутствие света так и
не обнаружена [15], хотя при высоких концентрациях они способны накапливаться в
некоторых органах (как правило, с высокой метаболической активностью) [16]. Считается,
что тяжелые металлы (например, кадмий), которые в ионной форме очень токсичны,
могут покидать кристаллическую решетку КТ и выходить в раствор. Однако покрытие
ядра дополнительными оболочками сводит на нет цитотоксичность этого рода КТ [17].
Оболочки, вероятно, нейтрализуют и другой эффект – самостоятельную генерацию
квантовой точкой синглетного кислорода – вследствие увеличения расстояния для
переноса энергии [18]. В гидрофобной среде ядра CdSe генерируют синглетный кислород
с выходом менее 5% [19].
7
Материалы и методы
В
нашей
работе
мы
использовали
отрицательно
заряженный
октакарбоксифталоцианин ZnPCCOONa8 (или ZnPc8-) в качестве фотосенсибилизатора.
Молярный коэффициент экстинции равен 180000 л/моль*см.
Рис. 4. Структуры и обозначения фталоцианинов. n – средняя степень включения заместителей R.
Таблица: тушение флуоресценции ((F0–F)/F0) фталоцианинов в присутствии E. coli pXen7 (3 × 107
КОЕ/мл в H2Oдист), фотоинактивация E. coli pXen7 по тесту подавления биолюминесценции ((B0 –
B)/B0) белым светом в дозе 6 Дж/см2 и квантовые выходы генерации синглетного кислорода (ФΔ)
фталоцианинов с различными ионными заместителями.
Примечание. Измерения интенсивности флуоресценции и биолюминесценции проводили через 10
мин после добавления 1 мкМ красителей и инкубирования при 20–22°С.
* В скобках приведены данные по тушению флуоресценции фталоцианинов клетками
клинического изолята E. coli штамм 2 (108 КОЕ/мл в 0,9% NaCl) [3].
В качестве донора энергии была выбрана положительно заряженная (за счет
полимерной оболочки «poly T-APS») квантовая точка с ядром CdSeCdTe/ZnS (далее
КТ600+) производства ООО НТИЦ «Нанотех-Дубна», Россия. Пик флуоресценции имеет
максимум при 640 нм, что обеспечивает хорошее перекрывание спектров флуоресценции
КТ и поглощения ФЦ. Положительный заряд КТ и отрицательный заряд ФС способствуют
формированию между ними гибридного комплекса с высокоэффективной миграцией
энергии от квантовой точки на фталоцианин. Во всех экспериментах использовали
дистиллированную воду.
Для определения фотобактерицидной активности использовали бактериальную
биолюминесцентную тест-систему «Эколюм-08» на основе генно-инженерного штамма E.
8
coli (pXen7), биолюминесценция которого обусловлена клонированным полным luxопероном
из
светящихся
почвенных
энтомопатогенных
бактерий
Photorhabdus
luminescens [20]. Ранее была выявлена корреляция между фотосенсибилизированным
тушением биолюминесценции тест-культур E. coli pXen7 и их инактивацией, а также
инактивацией эталонного штамма бактерий E. coli ATCC 25922 в единицах КОЕ, на
основании чего рутинный способ определения КОЕ может быть заменен экспрессметодом измерения интенсивности биолюминесценции [5, 21]. Измерение интенсивности
биолюминесценции бактерий проводили с помощью люминометра «Биотокс» (Россия)
при комнатной температуре.
Облучение осуществляли лампой Вуда (40 Вт) с максимумом эмиссии 370 нм.
Спектр излучения источника показан на рис. 5.
4000
B (Излучение, отн. ед.)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
200
300
400
500
600
A (Длина волны, нм)
Рис. 5. Спектр излучения УФ-лампы.
9
700
800
Результаты и обсуждение
Мы приготовили четыре образца для исследования: в пробирки, содержащие 2 мл
суспензии бактерий E. Coli, добавляли
1. 5 мкл раствора КТ640+;
2. 150 мкл раствора ZnPc8-;
3. 5 мкл раствора КТ640+ и 150 мкл раствора ZnPc8-.
Четвертый (контрольный) образец представлял собой просто суспензию бактерий.
Соотношение
концентраций
квантовой
точки
и
фталоцианина
цинка
являлось
оптимальным для эффективного переноса энергии в этой системе.
Сразу после приготовления образцов измеряли их биолюминесценцию. Затем
пробирки
помещали
в
темноту
на
1
минуту,
после
чего
снова
измеряли
биолюминесценцию. Еще через одну минуту осуществляли облучение исследуемых
образцов ультрафиолетом в течение 120 секунд, причем с промежутком в 20 секунд
регистрировали свечение бактерий. Полученные данные показаны на рис. 6.
Биолюминесценция (нормирована
на начальный уровень)
1,0
0,8
0,6
1
2
3
4
0,4
0,2
0,0
-100
-50
0
50
100
A (Время, с)
Рис. 6. Биолюминесценция исследуемых образцов в ходе эксперимента. Номера кривых
соответствуют номерам образцов. Под начальным уровнем понимается свечение суспензий
бактерий в отсутствие каких-либо добавок. Время 0 секунд соответствует началу облучения.
10
В первую очередь стоит отметить, что постоянная скорость инактивации бактерий,
приобретаемая после примерно 40 секунд облучения, для контрольного 4 образца выше,
чем для первых трех, т.е. без добавок бактерии гибнут под ультрафиолетом эффективнее.
Очевидно, это явление можно объяснить неспецифическим протективным действием КТ и
ФЦ, которые акцептируют энергию УФ-излучения. Действительно, данные соединения
обладают значительной поглощающей способностью в ультрафиолетовой области (рис. 7)
Рис. 7. Спектры поглощения и флуоресценции КТ600+ и ZnPc8-. Нормированные
спектры КТ600+ и КТ640+ отличаются лишь поглощением максимумов, но их различия в
УФ-области несущественны.
Тем не менее, бактерии оказались очень устойчивыми к облучению. Возможно, это
связано с малой мощностью излучения источника.
Практически полное отсутствие выраженного действия фталоцианина цинка
связано с тем, что его отрицательный заряд препятствует образованию связи ФС с
клеточной стенкой бактерии, которая также заряжена отрицательно. Поскольку
фотодинамическое действие ФС зачастую (как и в нашем случае) осуществляется через
синглетный кислород, радиус воздействия которого составляет не более 40 нм, клеточные
стенки оказываются неповрежденными. Поэтому фталоцианин цинка, не связанный с
клеточной
стенкой
и
неспособный
повредить
клетку,
но
поглощающий
весь
ультрафиолет, защищает бактерии от инактивации.
Что касается квантовой точки, то видно, что она способствует значительной
деструкции бактерий еще до начала облучения. Сомнительно, что этот эффект связан с
оптическими свойствами КТ, т.к. деструкция идет с равной скоростью как в отсутствие,
так и в присутствие света. В то же время можно предположить, что КТ, электростатически
11
взаимодействуя с клеточной стенкой бактерии, способна к передаче энергии на
внутренние (эндогенные) фотосенсибилизаторы, которые и вызывают инактивацию.
Смесь КТ и ФЦ, в свою очередь, вызывает практически полную инактивацию
микроорганизмов. Так как их заряды при взаимодействии нейтрализуются (хотя возможно
наличие неполной экранировки заряда КТ), то в среднем комплексы располагаются близко
к
поверхности
фотодинамическое
бактерий.
Поэтому
действие
таких
здесь
можно
гибридных
предполагать
комплексов,
и
и
усиленное
самостоятельное
цитотоксическое действие КТ, хотя эффект не носит аддитивного характера. Кроме того,
трудно установить роль УФ-излучения. Нормировка биолюминесценции на ее уровень в
момент начала облучения (рис. 8) говорит о том, что скорость инактивации бактерий в
случае использования гибридных комплексов КТ и ФЦ значительно превосходит таковую
для отдельных КТ и ФЦ, а также для УФ-излучения в первые 40 секунд облучения.
1,0
Биолюминесценция
0,8
1
2
3
4
0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
80
100
120
Время облучения, с
Рис. 8. Биолюминесценция исследуемых образцов в ходе облучения. Обозначения те же
что на рис. 6.
Выводы
1. Использование квантовых точек и фталоцианинов цинка (по отдельности) в
контексте УФ-терапии снижает ее эффективность;
2. Гибридные комплексы КТ-ФЦ, наоборот, усиливают деструктивное действие
УФ излучения, однако механизм воздействия неизвестен;
3. Существует большая вероятность наличия у КТ640+ самостоятельного
цитотоксического действия.
12
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1] Amyles S. // JAMA. - 2001. - Vol. 285, № 18. - P. 2317-2318.
[2] Stephenson J. // JAMA. - 2001. - Vol. 285, № 18. - P. 2318-2319.
[3] Соболев А.С., Розенкранц А.А., Гилязова Д.Г. (2004) Подходы к направленной
внутриклеточной доставке фотосенсибилизаторов для увеличения их эффективности и
придания клеточной специфичности. Биофизика, Т. 49 вып. 2.
[4] Akhlynina T.V., Jans D.A., Rosenkranz A.A., Statsyuk N.V., Balashova I.Y., Toth. G.,
Pavo I., Rubin A.B., and Sobolev A.S. (1997) Nuclear targeting of chlorin e6 enhances its
photosensitizing activity. J. Biol. Chem. 272, 20328–20331.
[5] Страховская М.Г., Антоненко Ю.Н., Пашковская А.А., Котова Е.А., Киреев В.,
Жуховицкий В.Г., Кузнецова Н.А., Южакова О.А., Негримовский В.М., Рубин А.Б.
(2009) Электростатическое связывание замещенных металлофталоцианинов с клетками
энтеробактерий: роль в фотодинамической инактивации. Биохимия. Т. 74, вып. 12, с.
1603–1614.
[6] Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. (2006) Физико-химические основы фотобиологических процессов. – М.: Дрофа, 285 c.
[7] Рубин А.Б. (2004) Биофизика, в 2-х тт.: Учебник для вузов. - М.: «Книжный дом
«Университет»,. 917 c.
[8] Олейников В.А., Суханова А.В., Набиев И.Р. (2007) Флуоресцентные
полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине. Российские нанотехнологии,
т. 2. №1-2, 160-173.
[9] Achermann M., Petruska M.A., Kos S., Smith D.L., Koleske D.D. and Klimov V. I.
(2004) Energy-transfer pumping of semiconductor QDs using an epitaxial quantum well. Nature,
429, 642–646.
[10] Murray C.B., Norris D.J. and Bawendi M.G. (1993) J. Am. Chem. Soc., 115, 8706.
[11] Hines M.A., Guyot-Sionnest P. (1996) // J. Phys. Chem. B, 100, 468-472.
[12] Leatherdale C. A., Woo W.-K., Mikulec F. V. and Bawendi M. G., (2002) On the
absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots. The Journal of physical chemistry B
106 (31), 7619-7622.
[13] Narband N., Mubarak M., Ready D., Parkin I. P., Nair S. P., Green M. A., Beeby A.
and Wilson M. (2008) Quantum dots as enhancers of the efficacy of bacterial lethal
photosensitization. Nanotechnology, 19, 445102.
[14] Samia A. C. S., Dayal S. and Burda C. (2006) Quantum dot-based energy transfer:
perspectives and potential for applications in photodynamic therapy Photochemistry and
Photobiology, 82, 617–625.
[15] Shiohara, A., Hoshino A., Hanaki K., Suzuki K. and Yamamoto K. (2004) On the
cytotoxicity caused by quantum dots. Microbiol. Immunol., 48, 669–675.
13
[16] Pietropaoli, A.P., Frampton M.W., Hyde R.W., Morrow P.E., Oberdorster G., Cox C.,
Speers D.M., Frasier L.M., Chalupa D.C., Huang L.S. and Utell M.J. (2004) Pulmonary
function, diffusing capacity, and inflammation in healthy and asthmatic subjects exposed to
ultrafine particles. Inhal. Toxicol., 16, 59–72.
[17] Derfus A.M., Chan W.C.W. and Bhatia S.N. (2004) Probing the cytotoxicity of
semiconductor quantum dots. Nano Lett., 4, 11–18.
[18] Bakalova R., Ohba H., Zhelev Z., Ishikawa M. & Baba Y. (2004) Quantum dots as
photosensitizers? Nature biotechnology, V. 22, P. 1360–1361.
[19] Samia, A.C.S., Chen X. and Burda C. (2003) Semiconductor quantum dots for
photodynamic therapy. J. Am. Chem. Soc., 125, 15736–15737.
[20] Данилов B.C., Зарубина А.П., Ерошников Г.Е. и др. (2002) Сенсорные
биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных
бактерий // Вестник МГУ, №3. С.20-24.
[21] Пархоменко И.М., Зарубина А.П., Лукашев Е.П., Странадко Е.Ф., Тимофеев
К.Н., Рубин А.Б. (2005) О механизмах фотодинамического действия сенсибилизаторов и
усовершенствовании методов их первичного отбора для фотодинамической
антимикробной терапии. Доклады Академии наук, т. 404, №6, с. 821–825.
14