Krylovax
advertisement
1 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ Г.П. СОМОВА» СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК На правах рукописи Крылова Наталья Владимировна Клеточные и молекулярные механизмы противовирусной защиты при клещевом энцефалите 14.03.09. – Клиническая иммунология, аллергология 03.02.02. - Вирусология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты: Доктор медицинских наук, профессор, Г.Н. Леонова Академик РАМН, доктор медицинских наук, Н.Н. Беседнова Москва - 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение………………………………………………………………………... Обзор литературы Глава 1. Клинико-патогенетическая характеристика клещевого энцефалита 1.1. Краткая молекулярно-генетическая характеристика флавивирусов…... 1.2.Клинико-патогенетические особенности клещевого энцефалита............ Глава 2. Современные представления о врожденных и адаптивных факторах иммунитета при флавивирусных инфекциях 2.1. Роль факторов врожденного иммунитета при флавивирусных инфекциях………………………………………………………………………. 2.2. Роль факторов адаптивного иммунитета при флавивирусных инфекциях………………………………………………………………………. 2.3. Формирование врожденного и адаптивного иммунного ответа под влиянием флавивирусных вакцин…………………………………………….. Глава 3. Современные средства этиотропной терапии при флавивирусных инфекциях 3.1. Противовирусные препараты, обладающие прямым этиотропным действием (химиопрепараты и интерфероны)………………………………... 3.2.Препараты, обладающие иммуномодулирующими и противовирусными свойствами……………………………………………….. 3.3.Иммуномодуляторы природного происхождения……………………….. Собственные исследования Глава 4. Материалы и методы 4.1. Материалы исследования…………………………………………………. 4.2. Методы исследования……………………………………………………... Глава 5. Комплексная оценка состояния иммунной системы пациентов с антигенемией вируса клещевого энцефалита 5.1. Характеристика уровня антигенемии у пациентов с антигенемией вируса КЭ……………………………………………………………………….. 5.2. Оценка состояния иммунной системы пациентов с разным уровнем антигенемии вируса КЭ 5.2.1 Характеристика состояния клеточного иммунитета у пациентов с антигенемией ВКЭ……………………………………………………………... 5.2.2 Характеристика состояния гуморального иммунитета у пациентов с антигенемией ВКЭ……………………………………………………………... 5.2.3 Цитокиновый статус у пациентов с антигенемией ВКЭ………………. Глава 6. Комплексная оценка состояния иммунной системы пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде заболевания 6.1 Характеристика состояния клеточного иммунитета у пациентов с манифестными формами КЭ …………….......................................................... 6.2 Характеристика состояния гуморального иммунитета у пациентов с манифестными формами КЭ ………….............................................................. 6 17 18 25 45 55 65 69 72 78 84 100 105 110 116 123 126 3 6.3 Цитокиновый статус у пациентов с манифестными формами КЭ……… Глава 7. Особенности взаимодействия дальневосточных штаммов вируса клещевого энцефалита с клетками иммунной системы ex vivo, in vitro и in vivo 7.1 Динамика экспрессии адгезионных и активационных маркеров на клетках крови ex vivo под влиянием штаммов вируса КЭ…………………... 7.1.1 Динамика накопления штаммов вируса КЭ в пробах цельной крови доноров………………………………………………………………………….. 7.1.2 Влияние штаммов вируса КЭ на экспрессию молекул адгезии и активационного маркера CD69 клетками врожденного иммунитета………. 7.1.3 Влияние штаммов вируса КЭ на экспрессию активационных молекул Т-лимфоцитами и NK-клетками периферической крови человека.. 7.2 Динамика продукции цитокинов лейкоцитами крови in vitro под влиянием штаммов вируса КЭ с разной биологической характеристикой… 7.2.1 Динамика накопления штаммов вируса КЭ в супернатантах культуры мононуклеарных клеток человека…………………………………………….. 7.2.2 Влияние штаммов ВКЭ на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками крови in vitro………………………. 7.2.3 Влияние штаммов ВКЭ на продукцию интерферонов I и II типов мононуклеарными клетками крови in vitro…………………………………… 7.3 Продукция цитокинов у мышей линии BALB/c, инфицированных разными штаммами вируса КЭ………………………………………………... 7.3.1 Сравнение биологических свойств штаммов вируса КЭ при инфицировании мышей линии BALB/c (вирулентность, репродукция в крови и мозге)…………………………………………………………………... 7.3.2 Динамика продукции цитокинов (TNF-α, IL-6, IL-10, IFN-γ) в крови и мозге мышей BALB/с, инфицированных штаммами вируса КЭ…………… Глава 8. Изучение противовирусной активности биологически активных веществ морских гидробионтов при экспериментальном клещевом энцефалите 8.1 Изучение активности люромарина и тинростима in vitro в отношении вируса клещевого энцефалита…………………………………………………. 8.2 Изучение активности люромарина и тинростима при экспериментальном клещевом энцефалите…………………………………... Заключение…………………………………………………………………….. Выводы…………………………………………………………………………. Список литературы…………………………………………………………… 132 139 140 141 146 150 151 153 156 159 160 163 172 177 184 219 222 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ГЭБ – гематоэнцефалический барьер ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ КонА - конканавалин А КЭ - клещевой энцефалит Мн - моноциты Мф – макрофаги МКБ-10 – Международная классификация болезней Десятого пересмотра МКБ-10 рубрика А84.0 – Дальневосточный клещевой энцефалит Нф – нейтрофилы РНК - рибонуклеиновая кислота СПЭВ - перевиваемая культура клеток почек эмбриона свиньи СГТ (СГТА) - средняя геометрических титров антител ТЦД50 – 50% тканевая цитопатическая доза ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы ЦНС – центральная нервная система ЦПД - цитопатическое действие CD - антигены кластеров дифференцировки клеток CR - рецептор для компонентов комплемента CTL - цитотоксические лимфоциты С1, -3, -4, -5 – компоненты комплемента DCs – дендритные клетки FcR -рецептор для Fc-фрагмента молекулы иммуноглобулина IL - интерлейкин IgA-, M, -G – иммуноглобулины соответствующих классов ICAM - молекулы межклеточной адгезии IFN - интерферон LD50 – 50% летальная доза 5 МНС - главный комплекс гистосовместимости NK - естественные киллеры NKT - клетки — натуральные киллеры-Т-лимфоциты PAMP - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (структуры) PRRs - паттерн-распознающие рецепторы TCR - T- клеточный рецептор Thl, Th2 - субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов (хелперов) TLR - Toll- подобный рецептор TNF- фактор некроза опухоли Название вирусов: ВКЭ, TBEV - вирус клещевого энцефалита, tick-borne encephalitis virus; DENV - Dengue virus, вирус Денге; JEV — Japanese encephalitis virus, вирус Японского энцефалита; WNV - West Nile virus, вирус лихорадки Западного Нила; YFV - yellow fever virus, вирус Жёлтой лихорадки HCV - вирус гепатита С. 6 Введение Актуальность проблемы. Многолетнее изучение клещевого энцефалита (КЭ) позволило решить целый ряд фундаментальных вопросов этой патологии. Установлены этиология, основы патогенеза, описаны клинические проявления заболевания, разработаны методы диагностики и лечения, внедрен ряд профилактических мероприятий. Однако до сих пор эта нейроинфекция остается одной из самых актуальных природно-очаговых вирусных инфекций на Евразийском континенте [44, 100, 116, 175, 286, 361, 410]. Несмотря на (профилактические) проводимые мероприятия и санитарно-противоэпидемические снижение уровня заболеваемости, наблюдаемое с начала XXI века, количество ежегодно регистрируемых заболеваний КЭ в Российской Федерации (РФ) остается достаточно высоким, расширяется нозоареал инфицированности инфекции, городского что населения, способствует высоким увеличению остается процент инвалидизации переболевших и число летальных исходов [97]. В целом по РФ последние пять лет (2008 – 2012 гг.) уровень заболеваемости КЭ находился в пределах: в 2008 г. – 1,9; 2009 г. - 2,6; 2010 г. - 2,2; 2011 г. – 2,5; 2012 г. – 1,9 на 100 тыс. населения [97]. В Приморском крае показатели заболеваемости КЭ в эти годы были: в 2008г. - 1,3; 2009 г. - 2,3; 2010 г. - 2,9; 2011 г. – 1,5; 2012 г. – 1,5 на 100 тыс. населения [98]. При этом показатели летальности по Приморскому краю в 2012г. (3,4%) в 2,4 раза превышали таковые по РФ (1,4%). Случаи смерти от КЭ в Приморском крае регистрируются ежегодно и составляют от 3,4% до 15,9% [98]. Анализ мер специфической профилактики КЭ свидетельствует о том, что в период 2008-2012 гг. произошло увеличение охвата населения профилактическими прививками против КЭ (в 2008г. было вакцинировано и ревакцинировано против КЭ 2718000чел., в 2012г. – 3242222 чел.) [97]. В Приморском крае за последние 5 лет вакцинация населения против КЭ, с учетом ранее сделанных прививок, увеличилась с 3,7% в 2008г. до 14,4% в 7 2012г. Необходимо отметить наличие заболеваемости КЭ у лиц, ранее привитых от этой инфекции: в общем, по РФ уровень заболеваемости населения, вакцинированного от КЭ, в 2012 г. составлял 3,9%, в Приморском крае – 3,4 % [98]. В последнее десятилетие в Приморском крае, как и в целом по РФ, наблюдается изменение клинической картины КЭ, связанной с преобладанием лихорадочных и инаппарантных форм этой инфекции. В 2012 г. число заболеваний с лихорадочной формой КЭ в крае составило 58,6%, инаппарантной - 17,2%, менингеальной – 13,8%, очаговой – 10,3% [98]. Кроме того, следует отметить чёткую тенденцию к увеличению случаев длительной персистенции антигена вируса КЭ, выраженность клинических проявлений, которой варьирует от бессимптомного носительства до манифестации процесса [43, 89, 150]. Известно, что иммуноопосредованные механизмы играют существенную роль в патогенезе КЭ, обусловливая клинический полиморфизм заболевания и исход патологического процесса [130, 237, 423, 456]. Однако, несмотря на проводимые исследования, функциональное состояние иммунной системы организма на начальном этапе развития различных вариантов инфекционного процесса, вызванного вирусом КЭ, остается недостаточно изученным. Между тем, использование прогнозирования иммунологических характера течения показателей, заболевания, что, как факторов прежде всего, необходимо, для дифференцированного подхода к терапии на ранних стадиях КЭ, является одним из перспективных направлений исследований. Установлено, применение даже что неудачи современных вакцинопрофилактики вакцин. При этом сопровождают особенности функционирования иммунной системы вакцинированных пациентов при инфицировании ВКЭ, и даже заболевании КЭ, практически не изучены. В то же время изучение случаев заболевания вакцинированных лиц важно для оценки 8 эффективности вакцинации и для решения вопроса о необходимости изменения рекомендаций по схемам ревакцинации. Большинство авторов, описывающих явление клинического полиморфизма КЭ, связывают его с генотипической и фенотипической вариабельностью региональных популяций вируса КЭ [63, 88, 167]. На протяжении двух последних десятилетий в НИИЭМ СО РАМН и Лимнологическом институте СО РАН под руководством Г.Н. Леоновой и С.И.Беликова проводятся исследования по изучению биологических и молекулярно-генетических свойств разных штаммов вируса КЭ дальневосточной популяции [5, 13, 19, 69]. К началу нашей работы отсутствовали данные о взаимодействии штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа с рецепторным аппаратом клеток врожденного и адаптивного иммунитета, не было сведений о влиянии этих штаммов на динамику продукции цитокинов. Это обусловило необходимость изучения способности штаммов вируса КЭ к модуляции иммунокомпетентных клеток на начальных этапах инфицирования и ее влияния на последующее развитие инфекционного процесса. Основными нерешенными проблемами этиотропной терапии КЭ в современных условиях являются её недостаточная эффективность и вероятность развития побочных эффектов [40, 47, 72, 121, 150]. В этой связи, поиск препаратов, которые бы не только ингибировали репликацию вируса и элиминировали его из организма, но и корригировали индуцированное вирусом иммунодефицитное состояние, остается актуальным. В настоящее время интерес ученых направлен на освоение и изучение морских гидробионтов в качестве источников получения новых биологически активных веществ. В России изучением биологически активных веществ морских гидробионтов интенсивно занимаются в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН (ТИБОХ), Тихоокеанском научно- исследовательском рыбохозяйственном центре (ТИНРО-центре) и НИИ 9 эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Среди природных морских биополимеров несомненный интерес представляют тинростим - комплекс пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister, и люромарин – полифенольный комплекс, выделенный из морских трав семейства Zosteraceae. Эти биополимеры обладают широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами [11, 24, 42, 74, 106, 127], что явилось основанием для изучения эффективности люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ для обоснования возможности их применения в комплексной терапии КЭ. Вышеизложенное определяет актуальность и необходимость изучения иммунных механизмов начального этапа инфекционного процесса, обусловленного штаммами вируса КЭ, что создает предпосылки для разработки иммунологических подходов к ранней диагностике, прогнозу, лечению и профилактике заболевания. Цель исследования: изучить клеточные и молекулярные иммуноопосредованные механизмы начального этапа инфекционного процесса, индуцированного установить роль штаммами этих дальневосточного механизмов в субтипа последующем вируса КЭ и формировании противовирусной защиты. Задачи исследования: 1. Определить варианты развития инфекционного процесса у пациентов с КЭ на эндемичной территории Приморского края Дальнего Востока. 2. Дать комплексную оценку состояния врожденного и адаптивного иммунитета у вакцинированных и невакцинированных пациентов на ранней стадии инфицирования вирусом КЭ и установить иммунологические маркеры риска, предопределяющие длительную персистенцию возбудителя в организме; 3. Провести сравнительное изучение факторов клеточной и гуморальной защиты у привитых и непривитых пациентов с манифестными формами КЭ в 10 остром периоде инфекционного процесса и определить иммунопатогенетические критерии тяжести течения и исхода заболевания; 4. Исследовать в экспериментах (ex vivo, in vitro и in vivo) процесс взаимодействия штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа с разной молекулярно-генетической характеристикой и биологическими свойствами с иммунокомпетентными клетками, используя в качестве критериев оценки экспрессию адгезивных и активационных молекул на поверхности клеток врожденного и адаптивного иммунитета; 5. Изучить на культуре мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров, а также в крови и мозге мышей линии BALB/c инфекционный потенциал и цитокин-индуцирующую способность разных штаммов ВКЭ; 6. Дать сравнительную оценку эффективности некоторых официнальных препаратов и новых биологически активных веществ из морских гидробионтов (люромарин, тинростим) по отношению к вирусу КЭ на экспериментальных моделях in vitro и in vivo. Основные положения, выносимые на защиту: 1. На ранней невакцинированных состояние стадии и инфекционного вакцинированных процесса против КЭ, у пациентов, охарактеризовано функциональной активности эффекторной фазы врожденного иммунитета в зависимости от уровня антигенемии ВКЭ. Невысокая антигенная нагрузка и активация клеточных и гуморальных факторов врожденного иммунитета способствует быстрой элиминации вируса, отсутствие их активации и высокий уровень антигенемии являются предикторами длительной персистенции вируса. 2. При манифестных формах КЭ в остром периоде заболевания умеренная активация клеточного, гуморального и цитокинового иммунного ответа у невакцинированных, предопределяет а также развитие вакцинированных более легкого против течения КЭ пациентов заболевания. Иммунопатогенетическими предикторами развития тяжелого течения КЭ 11 являются: снижение содержания CD3+-, CD4+-Т-лимфоцитов, NK-клеток, иммуноглобулинов (IgG1, IgG3) и повышение количества В-лимфоцитов, увеличение концентраций цитокинов (IL-4, IL-10) и высокий уровень вирусспецифических IgM. 3. Штаммы вируса КЭ, изолированные от больных с разными клиническими формами инфекции, в зависимости от молекулярно- генетической характеристики и биологических свойств разнонаправлено модулируют рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток и продукцию цитокинов. Высоковирулентный штамм ex vivo снижает экспрессию адгезивных (CD11b и ICAM-1) и активационных (CD69, CD25, CD95) молекул на клетках врожденного и адаптивного иммунитета и in vivo индуцирует высокий уровень системного и локального цитокинового ответа (TNFα, IL-6, IFNγ). Слабовирулентные штаммы ex vivo усиливают экспрессию молекул адгезии и активации и in vivo стимулируют высокий уровень продукции IL-10. 4. Биополимеры из морских гидробионтов - люромарин и тинростим с широким спектром биологического действия и иммуномодулирующими свойствами, проявляют in vitro и in vivo вирусингибирующую и протективную активность в отношении вируса КЭ. Экспериментально обоснована эффективность использования этих иммуномодуляторов в комплексной терапии КЭ. Научная новизна исследования На основе комплекса полученных данных существенно расширена концепция иммунопатогенеза КЭ. Представлены данные о роли клеточномолекулярных инфекционного иммуноопосредованных процесса, механизмов индуцированного начального штаммами вируса этапа КЭ дальневосточного субтипа, и последующего развития и исхода вирусной инфекции. На раннем этапе инфекционного процесса у пациентов с антигенемией ВКЭ выявлены различия в механизмах элиминации патогена, связанные с 12 величиной антигенной нагрузки и особенностями активации иммунной системы. Установлено, что у невакцинированных пациентов с невысоким уровнем антигенемии ВКЭ происходит активация ключевых эффекторов врожденного иммунитета (NK-, NKT-клеток, IFNα), обусловливающая быструю элиминацию патогена, тогда как отсутствие их активации и более высокий уровень антигенемии приводит к длительной персистенции возбудителя. В остром периоде заболевания у пациентов с манифестными формами КЭ (лихорадочная, очаговые) выявлены значимые различия в субпопуляционном составе лимфоцитов, степени активации гуморального иммунитета, изменениях цитокинового профиля. предопределяющие тяжелое Установлены течение КЭ: иммунологические критерии, доминирование гуморального иммунного ответа по Th2 типу и снижение количества Т- и NK-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности. Показано, что у лиц, ранее вакцинированных против КЭ, различное течение инфекционного процесса (быстрая или замедленная элиминация антигена ВКЭ, или легкое течение лихорадочной формы КЭ) определяется разной эффективностью поствакцинального вирусспецифического иммунного ответа и степенью активации эффекторной фазы адаптивного иммунитета, индуцированной вирусом. Установлено, что штаммы вируса КЭ, изолированные от пациентов с разными клиническими формами заболевания, в экспериментах ex vivo, in vitro, in vivo проявляют различные биологические свойства (вирулентность, скорость репродукции, нейроинвазивность). Способность штаммов разнонаправленно модулировать ранние этапы активации иммунокомпетентных клеток (экспрессию молекул CD11b, ICAM-1, CD69, CD25, CD95) и последующую продукцию цитокинов (IL-8, IFNα, TNFα, IFNγ, IL-6 и IL-10) оказывает существенное влияние на разнообразие течения и исходов инфекционного процесса. 13 В экспериментах установлена вирусингибирующая и протективная активность в отношении вируса КЭ биополимеров из морских гидробионтов люромарина и тинростима, обладающих широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами. Их комбинированное применение с официнальными препаратами (рибавирином и циклофероном) усиливает протективный эффект, что свидетельствует о перспективности использования такой терапии при КЭ. Практическая значимость работы Полученные данные о начальных этапах иммунной защиты против вируса КЭ позволяют расширить стратегию прогнозирования течения и исхода инфекционного процесса с целью своевременного проведения патогенетически обоснованной терапии иммунных нарушений. Выявлены иммунологические критерии, позволяющие прогнозировать: на ранней стадии инфекционного процесса у пациентов с антигенемией ВКЭ замедленную элиминацию возбудителя, а в острой фазе заболевания у пациентов с манифестными формами КЭ - тяжесть течения и исход вирусной инфекции. Показано, что наличие высокого уровня вирусспецифического иммунного ответа, обусловленного вакцинацией, является важным фактором, способным предотвратить заболевание КЭ, обеспечить быструю элиминацию вируса или легкое течение этой нейроинфекции. Полученные данные о различной способности штаммов ВКЭ модулировать рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток и продукцию этими клетками цитокинов не только расширяют знания о патогенезе при разных формах КЭ с учетом гетерогенности популяции, но и открывают перспективы для новых эффективных подходов в терапии данного заболевания. Моделирование ex vivo взаимодействия штаммов ВКЭ с рецепторным аппаратом иммунокомпетентных клеток может быть использовано как при изучении функциональной активности клеток, участвующих в инфекционном 14 процессе, так и для направленного поиска терапевтических средств, влияющих на инфицированные вирусом клетки-мишени. Возможность динамического мониторинга функционального состояния иммунокомпетентных клеток, инфицированных ex vivo, может быть использована и при других вирусных инфекциях. В экспериментах in vitro и in vivo показана перспективность использования в комбинированной терапии КЭ биополимеров из морских гидробионтов - люромарина и тинростима, обладающих противовирусной активностью в отношении ВКЭ, а также иммуномодулирующими свойствами, что позволяет сочетать этиотропное и патогенетическое лечение данной вирусной инфекции. Внедрение результатов исследования • патент РФ № 2439566 С1 «Способ прогнозирования длительности периода антигенемии вируса клещевого энцефалита» / Леонова Г.Н., Крылова Н.В.; заявитель и патентообладатель Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН; заявка № 2010138768 от 20.09.2010; опубл. 10.01.2012. Бюл. №1. – 8 с. • патент РФ № 2432959 С1 «Средство, обладающее антиоксидантным, кардиопротекторным, противодиабетическим, противовоспалительным, гепатопротекторным, противоопухолевым и противовирусным действием» / Попов А.М., Артюков А.А., Кривошапко О.Н., Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Козловская Э.П.; заявитель и патентообладатель Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (ТИБОХ ДВО РАН); заявка №2010141686/15 от 11.10.2010; опубл. 10.11.2011. Бюл. № 31. – 11 с. • патент РФ № 2466190 С1 «Способ определения степени цитопатогенности вирусов» / Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Ляпун И.Н.; заявитель и патентообладатель Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и 15 микробиологии Сибирского отделения РАМН; заявка № 2011112215 от 30.03.2011; опубл. 10.11.2012. Бюл. №11. – 7 с. Апробация работы Основные положения и результаты работы были представлены на межрегиональной конференции с международным участием «Вакцинопрофилактика: проблемы настоящего и будущего» (Владивосток, 2000), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс межгосударственной и проблемы» (Санкт-Петербург, научно-практической конференции 2003), 4-ой государств - участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), 6-ом конгрессе Северо-Балтийских стран по инфекционным болезням (Паланга, Литва, 2004), конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004), 4-ой научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 2004), международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (Таиланд, 2004), Всероссийской научно-практической конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХ1 веке» (Томск, 2006), X Международный симпозиум по клещевым заболеваниям (Вена, 2009), III Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2011), XV Международный конгресс по вирусологии (Саппоро, 2011), Всероссийские форумы с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (Санкт-Петербург, 2006, 2007, 2008, 2009), юбилейные конференции, посвященные 75-летию открытия клещевого энцефалита (Иркутск, 2012, Хабаровск, 2012, Москва, 2013). Апробация диссертации состоялась 22 октября 2013 г. на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» и 10 декабря на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН. 16 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, в том числе 29 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских диссертаций, 2 монографии, получено 3 патента на изобретение. Работа выполнена при поддержке гранта МНТЦ «Молекулярногенетическая, биологическая и патогенетическая характеристика популяции вируса клещевого энцефалита» (№ 4006 2010-2012гг.). Объем и структура диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 497 источников, из которых 175 работ отечественных и 322 - зарубежных авторов. Работа изложена на 271 странице машинописного текста и иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками. 17 Обзор литературы Глава 1. Клинико-патогенетическая характеристика клещевого энцефалита Согласно последней таксономической классификации, род Flavivirus семейства Flaviviridae включает более 70 вирусов. Большинство представителей данного рода относят к группе арбовирусов, т.е. их жизненный цикл включает стадию репликации в организме кровососущих членистоногих. Около 40 флавивирусов передаётся через укусы комаров, 16 - укусы клещей, а для оставшихся представителей рода переносчик неизвестен [369]. Все вирусы данного семейства имеют схожие антигенные характеристики, но на основании типирования поликлональными гипериммунными сыворотками, среди флавивирусов выделяют 4 главных серокомплекса: Денге, клещевой энцефалит, жёлтая лихорадка и японский энцефалит [299]. Данные возбудители вызывают у человека широкий спектр заболеваний, включающий лихорадку, лихорадку с геморрагическими проявлениями и энцефалит. На сегодняшний день флавивирусы продолжают оставаться самыми значимыми для мирового здравоохранения возбудителями эмерджентных инфекций. В первую очередь это касается возбудителей лихорадки Денге (DENV), японского энцефалита (JEV) и жёлтой лихорадки (YFV). Другие представители флавивирусов, такие как вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) и лихорадки Западного Нила (WNV), представляют проблему для эндемичных регионов. 1.1. Краткая молекулярно-генетическая характеристика флавивирусов Все флавивирусы имеют сходное строение вириона, организацию генома, стратегию репликации, но вызывают различную патологическую реакцию инфицированного организма [360]. Флавивирусы - небольшие оболочечные частицы сферической формы (40-60 нм), содержащие нуклеокапсид (25-30 нм). Нуклеокапсид состоит из 18 множества копий капсидного белка С и молекулы РНК, окружён липидной мембраной, в которую включены два вирусных белка: маленький мембранный белок М и большой белок оболочки Е [360]. Геном флавивирусов представляет собой одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности около 11 тыс. нуклеотидов [112, 371]. РНК содержит одну открытую рамку считывания, которую окружают с обеих сторон короткие нетранслируемые регионы: 5'- и 3' [454]. В геноме ближе к 5'концу закодированы структурные белки, С, ргМ и Е, ближе к 3'-концу расположены гены неструктурных белков: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5 [360]. Флавивирусы проникают в клетку-мишень после взаимодействия оболочечного белка Е c рецепторами клетки путем клатрин-опосредованного эндоцитоза [234]. Низкий уровень рН в эндосомах инициирует слияние вирусной и клеточной мембран, опосредованное структурной перестройкой белка Е, что приводит к выходу в цитоплазму нуклеокапсида с вирусной РНК [396]. В результате трансляции образуется полипротеин, который подвергается ко- и посттрансляционному процессингу, в котором участвуют вирусная NS2bNS3 протеаза, а также протеаза клетки – сигналаза. Процессинг приводит к образованию структурных и неструктурных вирусных белков [275]. Сборка вирусных частиц происходит в просвете эндоплазматического ретикулума и дальнейшее созревание этих вирусных частиц происходит в сети трансГольджи, где предшественник белка М (prM) расщепляется фурином до зрелого белка М, что приводит к конформационной перестройке Е белка [458]. После реорганизации поверхности вириона зрелый инфекционный вирус выходит из клетки [235]. 1.2.Клинико-патогенетические особенности клещевого энцефалита До сих пор молекулярные основы патогенеза флавивирусных энцефалитов, в том числе и КЭ, остаются не полностью понятными. Все еще продолжают исследовать многие невыясненные аспекты флавивирусной 19 репликации, инвазии этими вирусами центральной нервной системы (ЦНС) и характера иммунного ответа организма. В то же время многообразные клинические проявления и течение КЭ достаточно полно описаны в классических руководствах по данному заболеванию как отечественными, так и зарубежными авторами [47, 114, 165, 286, 292]. КЭ может протекать в трех формах: острой (лихорадочная, менингеальная и очаговые формы), хронической и бессимптомной (инаппарантной). Наряду с этим, в комплексных клинико-эпидемиологических исследованиях рядом авторов [40, 73, 79, 262, 436, 467] было установлено, что в различных природных очагах клиника КЭ имеет свои отличительные особенности. При сравнительном анализе клинической картины, характера течения и исходов КЭ [101] в 3-х эндемичных зонах РФ (Дальний Восток, Восточная Сибирь и Северо-Западный регион), где доминируют штаммы ВКЭ разных генотипов (дальневосточный, сибирский и западноевропейский соответственно), отмечены существенные различия. Так, на территории Восточно-Сибирского региона, по сравнению с Дальневосточным регионом, заболевание характеризуется более мягким течением, меньшим числом осложнений и низкой летальностью (2,4% - в Приангарье и 24,4% - на Дальнем Востоке). На Северо-Западе РФ (Ленинградская область) преобладает менингеальная форма (60%), очаговые формы встречаются также часто (19%). В то же время такое генетическое распределение штаммов ВКЭ является достаточно условным, так как на разных территориях одновременно циркулируют варианты одного генотипа вируса с разной степенью патогенности, способные вызывать заболевания различной тяжести [109, 115, 141]. Современные представления о патогенезе КЭ складываются из результатов клинических наблюдений, данных аутопсии погибших больных и исследований с использованием различных лабораторных животных. 20 Основным путем инфицирования человека вирусом КЭ в естественных условиях является трансмиссивный путь при укусе клеща. При присасывании инфицированного клеща вирус проникает через кожу и размножается в месте укуса, прежде всего, в дендритных клетках. Генерализация инфекции происходит гематогенным и лимфогенным путями, а инвазия центральной нервной системы возможна разными путями (гематогенным, лимфогенным или нейрональным) [47, 319, 383, 387, 472]. Вирусемия при КЭ имеет двухволновый характер: кратковременная первичная, а затем (в конце инкубационного периода) повторная вирусемия, совпадающая по времени с размножением и накоплением вируса во внутренних органах с последующим проникновением его в ЦНС. Первичную вирусемию у людей выявляют уже на 1-3 сутки после укуса клеща [20, 77]. Однако такая закончиться на вирусемия стадии носит кратковременный размножения вируса в характер месте и может укуса или кратковременной первичной вирусемией, что в клинике будет соответствовать инаппарантной форме КЭ. При лимфо- и гематогенном путях диссеминации вирус размножается в эндотелии кровеносных и лимфатических сосудов, лейкоцитах крови, клетках ретикулоэндотелиальной системы, печени, почек и селезёнки, что характеризует висцеральную фазу развития КЭ. Эта стадия является важным патогенетическим звеном КЭ, обеспечивающим широкую диссеминацию вируса в организме, с последующим проникновением его через гематоэнцефалический барьер в ЦНС и наступлением нейрональной фазы заболевания. Несмотря на то, что ВКЭ является нейротропным вирусом, механизмы, лежащие в основе того, как вирус получает доступ к ЦНС, не полностью поняты. Существует несколько различных гипотез проникновения ВКЭ через ГЭБ: а) цитокин-опосредованный вход в ЦНС; б) теория ''троянского коня''; в) вход вируса в сосудистые эндотелиальные клетки капилляров головного мозга, 21 трансцитоз, и освобождение вируса в паренхиму мозга [423, 465]. В случае цитокин-опосредованного входа вируса в ЦНС, цитокины TNFα и IL-6 усиливают проницаемость ГЭБ, что способствует проникновению вируса в ЦНС [252, 470]. Повышенные уровни TNFα в сыворотке крови больных КЭ наблюдаются уже с первой недели госпитализации [203]. В экспериментах на крысах и мышах было показано, что IL-6 усиливает проницаемость ГЭБ [392]. Так называемый механизм ''троянского коня'' основан на миграции клеток иммунной системы, инфицированных ВКЭ, (например, дендритные клетки, нейтрофилы, моноциты, макрофаги, Т-клетки) через ГЭБ в ЦНС, инициализации инфекции ВКЭ в тканях ЦНС [465]. Инфекция и репликация ВКЭ в эндотелиальных клетках или сосудистом сплетении и почкование вируса на паренхиматозной стороне представляют собой еще одно возможное объяснение. Кроме того, предполагается, что у пациентов с тяжелыми формами КЭ, проникновение через ГЭБ базируется на повышении в сыворотке крови уровня нейроспецифических белков, таких как α-1 мозговой глобулин или нейро-специфическая енолаза [73, 430]. Предполагается, что вторая волна вирусемии, сопровождающаяся поражением ЦНС, возникает только у 35% пациентов, у которых наблюдается экстраневральное размножение возбудителя [367]. Распространение вируса на этом этапе эффективно сдерживается развивающимся иммунным ответом: индукцией вирусспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов и антител, в первую очередь к белку Е. Однако, тропизм вируса КЭ к лимфоидным органам и клеткам иммунной системы способен изменять характер иммунных реакций. Было показано, что тяжесть клинического течения КЭ коррелируют с глубиной и продолжительностью вирусиндуцированной депрессии клеточного иммунитета [65, 149], с длительной персистенцией вирусспецифических IgM, указывающих на нарушение эффекторных функций Т-лимфоцитов [163], а также с дисфункцией цитокинового звена иммунного ответа [46, 150]. 22 Таким образом, для быстрого проникновения возбудителя в мозг и вовлечения в патологический процесс ЦНС с развитием очаговых форм КЭ основное значение имеют такие факторы, как вирулентность штаммов вируса, и вирус-индуцированный тип иммунного ответа организма. По последним данным Л.М. Сомовой (2010) выделено три клинико-морфологических варианта дальневосточного КЭ: 1) Остро протекающий КЭ, характеризующийся выраженными общемозговыми расстройствами, высокой летальностью в течение первой недели заболевания. Тяжелое быстрое повреждение нейронов имеет прямую связь с внутриклеточной репродукцией вируса и с преобладанием реакций ГНТ; 2) Наиболее типичным для очаговых форм КЭ, является замедленный темп развития изменений в ЦНС, характеризующийся иммунопатологической реакцией по типу ГЗТ; 3) лихорадочные и инаппарантные (бессимптомные) формы КЭ [109, 170]. Г.Н. Леонова с соавторами (2007) показали, что основную долю (до 70%) дальневосточной популяции вируса КЭ составляют ненейроинвазивные штаммы, большинство из которых обладают способностью к быстрой элиминации из организма, не вызывая манифестных форм инфекции. У большинства людей, из крови которых были выделены эти штаммы, регистрировали инаппарантную форму КЭ. В то же время, далеко не все ненейроинвазивные штаммы КЭ элиминировали, часть из них способна длительно сохраняться в организме и вызывать иммунопатологические состояния в условиях длительной антигенемии [15, 56]. Значительно меньшую долю вирусной популяции (до 30%) составляют нейроинвазивные штаммы. Такие штаммы, изолированные из крови людей, вызывают разные формы КЭ (инаппарантную, лихорадочную, очаговые). Г.Н. Леонова с соавторами (2007) полагают, что процентное соотношение нейроинвазивных и ненейроинвазивных штаммов на разных эндемичных территориях может различаться. 23 Следует отметить, что многолетние исследования в области молекулярной биологии флавивирусов, и в том числе вируса КЭ, показали связь между мутациями в геноме вирусов и тяжестью заболевания [360, 376]. На протяжении двух последних десятилетий в НИИЭМ СО РАМН и Лимнологическом институте СО РАН под руководством Г.Н. Леоновой и С.И.Беликова были проведены исследования нуклеотидных последовательностей полных геномов 35 штаммов дальневосточного субтипа вируса КЭ, обладающих разной вирулентностью для человека. При анализе полногеномных нуклеотидных последовательностей этих штаммов С.И. Беликов с соавт. (2007) сделали выводы о том, что существует связь между участками генома вируса КЭ и его вирулентностью. Таких потенциально важных участков предположительно четыре, и они локализованы в районах, кодирующих капсидный белок С, неструктурные белки NS1, NS3 и 3׳нетранслируемый участок вирусной РНК. Кроме того, дальневосточного филогенетический субтипа, анализ выделенных от штаммов людей с вируса КЭ различными клиническими формами заболевания на территории Приморского края, показал, что все они имели общего предка. При этом высокая вирулентность штаммов является предковым состоянием признака по отношению к штаммам с низкой вирулентностью [5, 13, 69]. Низковирулентные штаммы эволюционно появились позднее, чем высоковирулентные, и поэтому низкая вирулентность штаммов вируса КЭ является более прогрессивным признаком. Однако свойства штаммов вирусов являются лишь одним из факторов, влияющих на тяжесть течения заболевания. Другими факторами являются генетические и иммунологические особенности пациентов, влияющие на взаимодействие с возбудителем. Так, поражение органов иммунной системы при КЭ является ведущим звеном патогенеза, обусловливающим клинический полиморфизм заболевания и исход патологического процесса. 24 Таким образом, современный прогресс в молекулярной биологии и вирусологии позволяет изучать взаимодействие вируса КЭ с организмом на всех трех уровнях: организменном, клеточном и молекулярном. При этом инфекционный процесс, обусловленный дальневосточным субтипом вируса КЭ, и особенности взаимодействия высоко- и низковирулентных штаммов этого субтипа вируса КЭ с клетками иммунной системы организма практически не изучены. 25 Глава 2. Современные представления о врожденных и адаптивных факторах иммунитета при флавивирусных инфекциях 2.1 Роль факторов врожденного иммунитета при флавивирусных инфекциях К настоящему времени иммунная система позвоночных рассматривается во взаимосвязи двух систем – врожденного (естественного) и адаптивного (приобретенного) иммунитета [269], которые обеспечивают защиту организма от инфекции и способствуют элиминации трансформированных клеток хозяина [190]. Первой свои защитные реакции, реализует эволюционно более древняя система врожденного иммунитета. Индуктивная фаза этого иммунного ответа основана на распознавании различных, ассоциированных с патогенами молекулярных паттернов - PAMP (pathogen-associated molecular patterns). Распознавание PAMP с помощью наследственно закодированных рецепторов паттернраспознающих рецепторов - PRRs (pattern-recognition receptors) приводит к активации клеток врожденного иммунитета [90, 339, 348, 378, 450]. Содержанием эффекторной фазы является осуществление защитных функций клетками (фагоцитоз, контактный цитолиз) и гуморальными системами (цитокины, комплемент). Активация врожденного звена иммунитета происходит в течение первых минут после инвазии инфекционного патогена, а максимум эффекторных реакций развивается в течение нескольких часов после инфицирования [7, 52, 174]. 2.1.1 Взаимодействие флавивирусов с клетками врожденного иммунитета и модуляция их функций - Нейтрофилы Нейтрофилы (Нф) являются преобладающей популяцией лейкоцитов крови, относящихся к числу самых реактивных клеток организма. Они одними из первых отвечают на повреждающие факторы и антигенную агрессию [390]. Нф характеризуются экспрессией на своей поверхности ряда молекул: CD13; 26 CD14; β2-интегринов (CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18); Fc-рецепторов (CD32 и CD16) и разнообразных PRRs. Функция Нф тесно связана с воспалительными каскадными реакциями: образования цитокинов, активации систем комплемента, свертывания крови и фибринолиза [9]. Сочетание высокого эффекторного потенциала со способностью к быстрой его реализации делает эти клетки оптимально приспособленными для осуществления ранних этапов иммунной защиты организма. При флавивирусных инфекциях участие Нф в инфекционном процессе отмечалось многими авторами [47, 319, 346, 384]. Было показано, что разные флавивирусы (DENV, JEV, WNV, ВКЭ) на начальной стадии заболевания вызывают развитие лейкопении и нейтропении, впоследствии сменяющиеся лейкоцитозом и нейтрофилезом. При этом в экспериментах in vitro было установлено, что флавивирусы, в том числе и ВКЭ, не просто поглощаются лейкоцитами, но репродуцируются в них, накапливаются и выходят из клеток, что объясняет один из механизмов возникновения ранней вирусемии при этих инфекциях [77]. В то же время ряд авторов выявили, что Нф, инфицированные флавивирусами, продуцируют реактивные метаболиты кислорода («кислородный взрыв»), приводящие к апоптозу этих клеток [59, 248], что может быть одним из ранних защитных механизмов уничтожения вирусов. Наиболее ярко двухфазный ответ Нф при флавивирусных инфекциях был продемонстрирован в недавнем исследовании Bai F. et al. (2010) на примере инфекции, вызванной WNV. Авторами было показано, что истощение Нф (при введении антител к Нф) у мышей перед инфицированием WNV приводило к значительному снижению вирусной нагрузки и смертности животных. С другой стороны, снижение количества Нф после заражения приводило к более высокому уровню вирусемии и смертности. Следовательно, хотя Нф и служат резервуаром для репликации флавивирусов на ранних стадиях инфекции и, таким образом, усиливают ее, тем не менее, эти клетки проявляют высокую противовирусную активность на поздних стадиях инфекции, которая приводит 27 к элиминации вируса. В совокупности эти данные указывают на сложную и ранее недооцененную роль Нф при флавивирусных инфекциях, требующую дальнейших исследований участия этих клеток в патогенезе различных клинических форм КЭ. - Моноциты/макрофаги Моноциты (Мн) и макрофаги (Мф) образуют мононуклеарную фагоцитирующую систему, функциональные свойства которой настолько многообразны, что ее неполноценность, как следствие или причина патологического процесса, со временем неизбежно формирует системное поражение организма, сопровождающееся иммунологической недостаточностью [153]. Мн/Мф экспрессируют на плазматической мембране широкий спектр рецепторов, опосредующих их взаимодействие с другими клетками, внеклеточным матриксом и лигандами, различными патогенами. Для Мн/Мф характерна экспрессия CD14 – основного маркера этих клеток, разнообразие FcR (CD64, CD32 и CD16), молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II, молекул адгезии (β1-и β2-интегрины), PRRs. Основными PRRs для распознавания вирусов, в том числе и флавивирусов, являются, в первую очередь, мембранно-связанные TLR (TLR3, 7, 8 и 9), локализованные преимущественно в эндосомах клеток, а также цитоплазматические RIG-подобные рецепторы (RIG-1 и MDA-5) [31, 319, 348, 425]. В связи со значительными различиями свойств Мн/Мф и Нф физиологическая роль этих клеток практически не перекрывается, даже несмотря на то, что основная функция тех и других – фагоцитоз. Если Нф ответственны за самый ранний этап защиты, осуществляемый с помощью фагоцитоза (проходит интенсивно, но кратковременно), то Мн/Мф, помимо фагоцитоза (реализуется менее интенсивно и более продолжительно), выполняют многочисленные другие функции, в том числе, опосредованные секретируемыми ими различными биологически активными веществами. При 28 активации Мн/Мф секретируют все провоспалительные цитокины и хемокины, интерфероны (в наибольшей степени IFNα, в наименьшей – IFNγ), компоненты комплемента и другие продукты [153, 174]. С помощью репертуара мембранных рецепторов, белков плазмы и секреторных молекул Мн/Мф регулируют как врожденный, так и адаптивный иммунитет. В настоящее время различными исследователями определено, что многие вирусы способны инфицировать Мн/Мф. При использовании различных популяций Мн/Мф человека и животных еще в 80-е годы было доказано, что эти клетки являются мишенями для инфицирования флавивирусами [146, 295, 334]. Однако не все вирусы в одинаковой степени чувствительны к действию ферментных систем Мн/Мф. Одни легко инактивируются фагоцитами, а другие резистентны к действию Мф и способны к активной и нередко длительной персистенции в них. РНК-содержащие вирусы, в том числе и флавивирусы, преимущественно резистентны к действию Мф и способны к внутриклеточной репродукции в их цитоплазме [113]. Если размножающийся в Мф вирус обладает цитопатической активностью, то обычно развивается острая инфекция, которая может привести к летальному исходу. В тех случаях, когда вирус не вызывает деструкции Мф и других клеток хозяина, формируется персистентный тип инфекции. Однако персистенция вируса в Мф снижает функциональную активность клеток, что отмечалось у пациентов с хроническими формами КЭ [102]. Таким образом, Мн/Мф могут осуществлять защитную противовирусную функцию путем поглощения, обезвреживания и элиминации вирусов и инфицированных ими клеток. В то же время Мн/Мф могут выступать в роли своеобразного «троянского коня», так как при репродукции в них фагоцитированных вирусов происходит диссеминация вируса в различные органы [231, 386, 453]. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования для получения целостной картины, характеризующей изменения 29 функциональной активности Мн/Мф в течении и исходе флавивирусных инфекций, в том числе и при КЭ. - Естественные киллеры (NK-клетки) Основными эффекторами в системе врожденного иммунитета являются миелоидные клетки, однако в реализации ее функций участвуют также и лимфоидные клетки – естественные киллеры или NK – клетки (natural killer), имеющие морфологию больших гранулярных лимфоцитов. Характерной особенностью NK-клеток, связанной с их цитолитической функцией, является наличие цитоплазматических азурофильных гранул, содержащих перфорины, гранзимы, протеогликаны и другие вещества. Другой характерной чертой NKклеток является экспрессия на их поверхностной мембране молекул CD56 и CD16, с помощью которых в лабораторных условиях осуществляется идентификация NK-клеток. Кроме того, на NK-клетках также имеются молекулы адгезии (CD11a и CD11b) и целый ряд других рецепторов [157]. Наиболее важные функции NK-клеток – цитотоксическая активность в отношении трансформированных или инфицированных вирусами клеток организма, секреция цитокинов (в первую очередь IFNγ, а также TNFα и β, IL10 и других). Кроме того, NK-клетки являются основными медиаторами антителозависимой клеточной цитотоксичности [7, 111]. Для осуществления цитотоксической функции NK-клеткам необходим контакт с инфицированными клетками, приводящий их к быстрой активации и мобилизации цитолитического потенциала. Решающую роль на начальном этапе взаимодействия NK-клеток с клетками-мишенями со стороны естественных киллеров играют β2-интегрины, со стороны клетки-мишени CD54 (ICAM-1), а также костимуляторные молекулы CD80/86 [187, 358]. В месте контакта формируется прочный иммунный синапс, который ведет к активации различных сигнальных путей NK-клеток. Результат такой активации – секреция NK-клетками предназначенных для цитолиза молекул или экспрессия мембранных индукторов клеточной гибели [354, 368]. 30 Механизмы активации цитотоксической функции NK-клеток при вирусных инфекциях были изучены на примере цитомегаловирусной инфекции у мышей [258, 447]. Авторами было установлено, что в активации NK-клеток важная роль принадлежит цитокинам. В очаге инфекции содержащие вирус клетки, активированные Мф и дендритные клетки (DCs) синтезируют цитокины: IFNα/β, TNFα, IL-12, IL-15, активирующие NK-клетки. Главная роль в этом процессе принадлежит IFNα/β, который активирует STAT1-сигнальный путь, следствием чего является повышение цитотоксической активности естественных киллеров в отношении клеток, инфицированных различными вирусами. Кроме того, активация синтеза IL-15, являющегося ростовым фактором для NK-клеток, приводила к их быстрой пролиферации на ранней стадии инфекции [447]. Важность естественных киллеров в контроле над вирусной инфекцией лучше всего иллюстрирует огромное количество механизмов ингибирования вирусами активности NK-клеток. Эти механизмы включают: модулирование апоптоза, вмешательство в антителозависимую клеточную цитотоксичность, модуляцию продукции антигенпрезентирующих цитокинов клеток; и изменение хемокинов и функций экспрессии NK-клеточных рецепторов [315, 362, 483]. При флавивирусных инфекциях было показано [481], что на ранней стадии (2-4 сутки) после заражения мышей вирусами Лангат, WNV, ВКЭ наблюдалась стимуляция NK-клеточной цитотоксичности, а затем следовало подавление активности этих клеток. У пациентов с флавивирусными инфекциями, в том числе и при КЭ, было зарегистрировано раннее вовлечение в патологический процесс этого звена иммунной защиты [89, 265, 325]. Однако результаты, свидетельствующие об изменении активности естественных киллеров как в остром периоде КЭ, так и в условиях длительной вирусной антигенемии значительно варьируют у разных авторов [41, 149], что предполагает продолжение исследований в этом направлении. - NKT-клетки 31 NKT-клетки – субпопуляция Т-лимфоцитов, которой присущи фенотипические особенности как Т-клеток, так и NK-клеток. На своей поверхности NKT несут Т-клеточный рецептор (TCR-CD3) и маркеры NKклеток (CD16, CD56, CD161) [139]. Особенностью NKT является экспрессия инвариантного TCR (Vα24JαQ, Vβ11), который распознает гликолипидный антиген в комплексе с неклассической молекулой MHC I класса - CD1d [381]. Следствием активации NKT-клеток является синтез про- и противовоспалительных цитокинов (в первую очередь IFNγ) и осуществление цитотоксической функции, которая реализуется через перфорин/гранзимовый или FasL-опосредованный механизмы [211, 479]. Благодаря своей способности быстро продуцировать достаточные количества различных цитокинов, эти клетки обеспечивают связь между врожденными и адаптивными звеньями иммунитета и играют важнейшую, возможно, уникальную роль в регуляции иммунного ответа при различных патологических состояниях [139]. Распределение в тканях человека NKT-клеток еще неясно, известно только, что эти клетки созревают в тимусе, в печени эти клетки составляют до 4% от лимфоцитов, небольшое их количество встречается в периферической крови - <1% [283]. Фенотипический анализ NKT в крови затрудняется их малой представленностью на периферии, что увеличивает вероятность ошибки. В этой связи в клинико-лабораторной диагностике предлагается оценивать популяцию клеток, наиболее близкую по своему фенотипу к NKT - (CD3+CD16+CD56+), которая содержит NKT-клетки и Т-клетки, экспрессирующие CD56 [157, 158]. У здорового человека эта популяция составляет до 10% от общего количества лимфоцитов. В настоящее время накоплено мало данных о роли NKT-клеток при различных патологиях, в том числе и при флавивирусных инфекциях. Было показано, что при ХГС отмечается снижение NKT-клеток [189, 246], а повышение уровня CD3+CD16+56+ Т-киллеров в периферической крови у больных ХГС расценивается как неблагоприятный признак, отражающий 32 прогрессирование патологического процесса с переходом в компенсированный цирроз печени [96]. У мышей, инфицированных DENV, было показано, что увеличение в селезенке количества NK- и NKT-клеток, как главных продуцентов IFNγ на ранней стадии инфекции, повышает устойчивость животных к инфекции [314]. В то же время другие авторы выявили, что мыши, дефицитные по NKT- клеткам (Jα18-/-) и инфицированные DENV, были более устойчивы к летальной инфекции, чем животные дикого типа. Отсутствие NKT-клеток у Jα18-/-инфицированных мышей приводило к снижению системного воспаления, меньшему повреждению печени, а также к снижению активации NK-клеток и Нф [177]. Таким образом, учитывая большой спектр возможностей NKT-клеток, можно полагать, что эти клетки патологические функции в выполняют как защитные, так и патогенезе флавивирусных инфекций. Противоречивые данные, полученные авторами, указывают на необходимость дальнейших исследований. Кроме вышеуказанных клеток-мишеней для флавивирусов, в настоящее время активно изучаются и другие клетки врожденного иммунитета – DCs, эндотелиальные клетки [196, 319, 472]. Поскольку важной особенностью функционирования системы врожденного иммунитета является способность вовлекать в развитие реакций различные виды клеток, то, вероятно, репертуар предполагаемых клеток-мишеней для флавивирусов будет расширяться. 2.1.2 Рецепторная роль клеточных молекул для флавивирусов Первым этапом, определяющим возможность вирусной инфекции на уровне как клетки, так и ткани и организма в целом, является прикрепление (адсорбция) вирусных частиц к поверхности клеток-мишеней. Взаимодействие между молекулами, расположенными на поверхности вирионов и клеток, значительно различается по специфичности. Неспецифическая адсорбция обусловлена силами электростатического взаимодействия, возникающими между разнозаряженными группами молекул на поверхности клеток и вируса. 33 Специфическая фаза адсорбции определяется комплементарным взаимодействием поверхностных структур вириона со специфическими молекулами (рецепторами) на поверхности клетки-мишени. Большинство рецепторов представлены молекулами, мигрирующими в плазматической мембране, что позволяет им формировать группы (кластеры) после связывания с вирусными частицами. После прикрепления к рецепторам для реализации последующих этапов инфекции вирусы используют сигнальную систему клетки хозяина, а кластеризация рецепторов способствует более эффективному проведению сигналов через плазматическую мембрану [140, 201, 285]. Промежуточную роль между неспецифической и специфической адсорбцией играет связывание вирусных частиц с факторами прикрепления (attachment factors), которые представляют собой, в основном, полисахаридные цепи мембранных гликопротеинов и гликолипидов. Факторы прикрепления способствуют концентрированию на поверхности клетки вирусных частиц, адсорбирующихся за счет взаимодействия положительно заряженных поверхностных вирионных белков и отрицательно заряженных полисахаридов [380]. Прикрепление к клетке-мишени многих вирусов происходит в несколько стадий с участием нескольких типов молекул, при этом молекулы, участвующие во второй и последующих стадиях специфического связывания называются корецепторами. Эти молекулы связывают вирионы, поверхность которых конформационно изменена в результате начального связывания с первичным рецептором [372]. Установлено, что вирусы, обладающие лимитированным тканевым тропизмом и ограниченным числом организмов-хозяев (вирусы ЭпштейнБарра, кори, полиовирус), используют узкий спектр молекул клеточной мембраны в качестве рецепторов. Вирусы с широким спектром патогенности, включающим разные виды животных (орто- и парамиксовирусы, вирус 34 везикулярного стоматита, а также флавивирусы), могут прикрепляться к клеткам-мишеням, используя разнообразные молекулы [372, 494]. Поскольку представители рода Flavivirus, в основном, имеют нескольких хозяев - млекопитающих, птиц, членистоногих - то для прикрепления к клеткам-мишеням они должны использовать широко представленные и достаточно консервативные молекулы клеточной поверхности. К настоящему времени для этих вирусов были выявлены различные предполагаемые факторы прикрепления и/или рецепторы [274, 347]. - Гликозаминогликаны Гликозаминогликаны (ГАГ) - линейные полисахаридные молекулы, которые экспрессируются на поверхности почти всех клеток млекопитающих, а также у организмов различных типов, таких как хордовые и членистоногие. Эти молекулы играют важную роль во взаимодействии клетки с внеклеточным матриксом, межклеточном проведении сигнала как рецепторы и корецепторы. Рядом авторов было показано, что высоко сульфатированные, отрицательно заряженные ГАГ, такие как гепаран сульфат, используются флавивирусами, в том числе и вирусом КЭ, как низкоаффинные факторы прикрепления [63, 188, 280, 418]. Взаимодействия флавивирусов с ГАГ опосредуются через все три домена белка Е вирусов и служат для концентрации вируса на клеточной поверхности. Кроме того, предполагается, что молекулы ГАГ в качестве корецепторов, возможно, отвечают и за проникновение вируса [280]. - Интегрины Интегрины – это одно из наиболее важных и полифункциональных семейств молекул межклеточной адгезии. Эти молекулы являются высоко консервативными трансмембранными протеинами, экспрессирующимися практически на всех видах клеток [312]. Интегрины соединяют внутреннюю и внешнюю среду клетки, проводя сигналы как изнутри клетки на ее поверхность, так и извне внутрь клетки [210]. Семейство интегринов делят на три основные подсемейства по типу β-субъединицы (β1, β2 и β3). β2-Интегрины 35 (CD18, CD11a, CD11b, CD11c) участвуют в адгезии лейкоцитов к клеткам эндотелия. Интегрины могут быть рецепторами для целого ряда вирусов [212, 261], включая реовирусы (β1-интегрины), эховирусы (α2β1), вирусы ящура (αvβ1, αvβ3 и αvβ6), хантавирусы (β3), вирусы герпеса (α3β1), ротавирусы (α2β1, αvβ3), цитомегаловирусы (α2β1, α6β1, αvβ3). Рецепторной молекулой для вируса КЭ в человеческих клетках RH может являться α3β1-интегрин [128]. Другими авторами установлено участие интегрина αvβ3 для входа вирусов WNV, JEV, DNV в клетки позвоночных [159, 234]. Однако другая исследовательская группа показала, что связывание некоторых флавивирусов (JEV, Мюррей, WNV) с интегрином αvβ3 не играет важной роли для входа вируса в клетку [311, 427]. Из всего вышесказанного можно сделать вывод, что, вероятнее всего, интегрины являются одной из рецепторных молекул для флавивирусов на клетках млекопитающих. - Высокоаффинный ламининсвязывающий белок Ламининсвязывающий белок (ЛСБ) относится к неинтегриновым клеточным рецепторам для ламинина, одного из основных белков базальной мембраны. Этот рецептор найден в культурах клеток насекомых, птиц, млекопитающих, что хорошо согласуется с тем, что флавивирусы, в том числе и ВКЭ, способны реплицироваться в различных клетках. Была показана эффективность блокирования репликации ряда вирусов (DENV, WNV, ВКЭ, ВВЭЛ, Синдбис) антителами к этому рецептору [64, 128, 464]. Высокая специфичность взаимодействия вирусов и ЛСБ открывает новые возможности для создания антивирусных препаратов, направленно блокирующих это рецепторное взаимодействие. - Другие молекулы клеточной поверхности как возможные рецепторы для флавивирусов - CD14 Основной маркер Мн/Мф – молекула CD14 служит рецептором для бактериального липополисахарида (ЛПС). Участие CD14 в инфекции, 36 вызванной реcпираторным синцитиальным вирусом [401], дало возможность предположить, что эта молекула может быть более широко вовлечена в ответную реакцию организма, чем ранее считалось. Возможная роль CD14 была показана при инфицировании DENV человеческих Мн/Мф [232]. Добавление ЛПС перед заражением Мн/Мф ингибировало инфекцию, а введение человеческой сыворотки или анти-CD14 антител снимало супрессорный эффект ЛПС и инициировало вирусную инфекцию. Вероятно, CD14 сам по себе не управляет DENV инфекцией, но может быть вовлечен в ЛПС-опосредованное ингибирование проникновения вируса в эти клетки. Однако это утверждение достаточно спорно и требует дальнейших исследований. - Fc- и С3-рецепторы Было установлено, что ряд флавивирусов, в том числе и ВКЭ, способны использовать субнейтрализующие уровни вирусспецифических антител для прикрепления и входа в клетки, несущие рецепторы FcR и/или CR, с помощью процесса, известного как антитело-зависимое усиление (ADE) инфекции [169, 221, 296]. На сегодняшний день, как оказалось, DENV единственный из флавивирусов, для которого существуют убедительные доказательства ADE инфекции, как основного фактора этого тяжелого заболевания [289]. Было показано, что DENV проникает в Мн/Мф периферической крови в составе иммунного комплекса с существовавшими ранее не-нейтрализующими антителами (IgG), взаимодействуя с рецепторами Fcγ I, II и III типа, экспрессированными на этих клетках [327]. Установлено, что первичное инфицирование DENV повышает риск развития геморрагических симптомов при повторном заражении, по крайней мере, 15-кратно [415]. Также было показано, что презентированные на Мф рецепторы комплемента (CR3) отвечают за опосредованное IgM усиление репликации WNV [221]. Кроме того, были определены несколько других клеточных молекул, которые флавивирусы могут использовать в качестве рецепторов или факторов прикрепления [206, 274, 347]. К ним относятся белки теплового шока (HSP70 и 37 HSP90), лектиновые рецепторы C-типа, такие как DC-SIGN (dendritic cell specific ICAM-3 grabbing nonintegrin, CD209) и маннозный рецептор (CD206), а также другие молекулы. Таким образом, чувствительность клеток-мишеней к инфицированию флавивирусами характеризуется наличием на их поверхности, как специфических рецепторов, так и корецепторов и/или факторов прикрепления, что в конечном итоге, в значительной мере, определяет течение, многообразие клинических проявлений и исход заболевания. 2.1.3 Модуляция флавивирусами гуморальных механизмов врожденного иммунитета - Система комплемента Система комплемента – это семейство более чем 30 сывороточных белков и рецепторов клеточной поверхности, которые участвуют в распознавании патогенов и их клиренсе [76, 420]. Комплемент способствует защите организма через прямую опсонизацию и/или лизис клеток-мишеней, хемотаксис, клиренс иммунных комплексов и модуляцию В- и Т-клеточных функций [222]. Существуют три пути активации данной системы: альтернативный, классический и лектиновый, которые кардинально различаются особенностями начального этапа. Активация классического пути запускается связыванием C1q-компонента комплемента с комплексом антиген-антитело на поверхности патогенов. Лектиновый путь инициируется распознаванием маннан- связывающим лектином (MBL), принадлежащим к C-лектинам, углеводных структур на поверхности микробов или апоптотических клеток. Альтернативный путь является постоянно активным на низком уровне вследствие спонтанного гидролиза C3, и служит для усиления активации классического и лектинового путей. Общими признаками всех трех путей являются: а) активация С3 – самого важного и присутствующего в большом количестве компонента комплемента; б) каскадный тип протеолитической реакции, при котором активированные белки комплемента приобретают 38 свойства ферментов и расщепляют другие компоненты, сообщая ферментативные свойства и т.д. Этот комплекс им последовательных и упорядоченных реакций определяет нарастающий и поддерживаемый эффект каскадной активации системы комплемента. На заключительном этапе все пути активации конвергируют в общий терминальный или мембраноатакующий путь, который приводит к лизису клеток-мишеней [76, 420]. Различные семейства вирусов выработали несколько стратегий, позволяющих им свести к минимуму распознавание и/или уничтожение системой комплемента: а) использование рецепторов комплемента для усиления проникновения вируса или подавления адаптивного иммунного ответа; б) экспрессию вирусных белков, которые непосредственно ингибируют комплемент; в) модуляцию экспрессии регуляторов комплемента на клетках хозяина, чтобы предотвратить комплемент-зависимый лизис; г) экспрессию ложных вирусных белков, которые структурно и функционально имитируют регуляторные белки комплемента и другие [353, 417, 484, 485]. Вирус может использовать несколько независимых стратегий, позволяющих ему противодействовать системе комплемента и модулировать иммунный ответ, что может привести к персистенции возбудителя. Хотя многие вирусы подавляют активацию комплемента, при флавивирусной инфекции отмечается как защитная, так и патологическая роль комплемента в зависимости от конкретного вируса, фазы инфекции и иммунного статуса организма. Так, большинство исследований по изучению взаимодействия системы комплемента с флавивирусами было сосредоточено на роли комплемента в контексте патогенеза флавивирусных инфекций. Наблюдалось снижение активности системы комплемента в целом и отдельных ее компонентов (С3, С4, С5) в клинических исследованиях. При заболеваниях, вызванных разными флавивирусами, в том числе и ВКЭ [149, 461], чрезмерное накопление компонентов комплемента и анафилатоксинов (С3а, С5а) в крови пациентов коррелировало с тяжестью заболевания [370]. Высказано 39 предположение, что инфицированные клетки на своей поверхности экспрессируют вирусные антигены (E или NS1 белки), которые способствуют образованию иммунных комплексов, вызывающих патологическую активацию комплемента [213]. Последующее изучение выявило, что неструктурный белок NS1 DENV может активировать комплемент, и уровни NS1 и некоторых белков комплемента коррелирует с тяжестью заболевания [482]. Тем не менее, в последние годы исследователи начали рассматривать роль системы комплемента при флавивирусных инфекциях в контексте протективного иммунитета. Так, было установлено, что мыши, дефицитные по С3-компоненту комплемента, более восприимчивы к летальной инфекции WNV и демонстрируют большую вирусную нагрузку и снижение титров противовирусных антител по сравнению с иммунокомпетентными животными [239]. Показано, что в активации комплемента при WNV инфекции участвуют все три пути, поскольку мыши, лишенные C1q- компонента комплемента (классический путь), или фактора B (альтернативный путь), или MBL (лектиновый путь), становятся высокочувствительными к этой инфекции [240, 459]. Кроме того, известно, что комплемент усиливает опосредованную антителами нейтрализацию многих вирусов, в том числе и флавивирусов [204]. В исследованиях in vitro было показано, что некоторые белки комплемента сводит к минимуму ADE при WNV и DENV инфекциях. Это позволяет предположить, что комплемент может играть определенную роль в ограничении ADE-опосредованного заболевания [240, 491]. Однако механизмы взаимодействия флавивирусов с организмом хозяина, которые приводят либо к активации комплемента, либо к уклонению от его действия, до сих пор не выяснены. - Провоспалительные цитокины и интерфероны Цитокины являются самой многочисленной, наиболее универсальной группой гуморальных факторов иммунной системы, важной для реализации как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Они представляют собой 40 полипептидные молекулы, продуцируемые преимущественно активированными клетками кроветворной и иммунной систем, и участвующие в межклеточной передаче сигнала в ходе иммунного ответа. Цитокины имеют ряд общих биохимических и функциональных характеристик, отличающих их от других классов регуляторных молекул. Среди этих характеристик важнейшими считаются: плейотропность и взаимозаменяемость биологического действия, отсутствие антигенной специфичности, проведение сигнала путем взаимодействия со специфическими клеточными рецепторами, формирование цитокиновой сети [67]. Ключевыми гуморальными факторами воспаления, необходимыми для реализации защитных функций врожденного иммунитета, являются три группы цитокинов: хемокины, провоспалительные цитокины и интерфероны [174]. IL-8–один из самых важных провоспалительных цитокинов, относящийся к семейству CXC-хемокинов. Он обнаруживается в секрете клеток через 2-3 часа после активации. Основными клетками-продуцентами IL-8 являются Мн/Мф и эндотелиальные клетки, а мишенью для этого цитокина служат Нф. Главная функция IL-8 состоит в обеспечении экстравазации Нф и их направленной миграции в очаг воспаления [388, 497]. Основными представителями группы провоспалительных цитокинов являются IL-1, TNFα и IL-6. Эти цитокины продуцируются, в основном, активированными Мн/Мф, но могут вырабатываться также Нф, дендритными клетками, активированными NK-клетками и Т-лимфоцитами. Провоспалительные цитокины синтезируются и секретируются достаточно быстро, и их можно выявить во внеклеточной среде через 3-4 часа после активации. Основные функции этих цитокинов – усиление экспрессии молекул адгезии на эндотелиальных клетках и лейкоцитах, индукция кислородного метаболизма клеток, стимуляция выработки цитокинов и белков острой фазы. Попадание избыточно секретируемых провоспалительных цитокинов в циркуляцию способствует проявлению системных эффектов воспаления, а в 41 высоких дозах они приводят к развитию патологических эффектов, вплоть до шока [29, 344, 365]. Известно, что гиперпродукция провоспалительных цитокинов, включая TNFα и IL-6, повышает разрушение нейронов и увеличивает проницаемость ГЭБ [184, 457]. Необходимо отметить, что провоспалительная активность IL-6 слабее, чем у IL-1 и TNFα, кроме того, этот цитокин подавляет выработку IL-1, TNFα и хемокинов. Таким образом, IL-6 сочетает свойства про- и противовоспалительных цитокинов и участвует не только в развитии, но и в ограничении воспалительного процесса [173]. Интерфероны относятся к группе цитокинов, обладающих противовирусной и антипролиферативной активностью и участвующих в регуляции иммунных процессов, что делает их важнейшими составляющими врожденного и адаптивного иммунитета. Семейство IFN подразделяют на IFN I, II и III типов. В настоящее время у людей известно пять IFN I-го типа: IFNα, β, -ε, -κ, и -ω, один IFN II-го типа – IFNγ, и три IFN III-го типа - IFNλ1, -λ2, -λ3 [36]. Интерфероны I-го типа - IFNα/β–продуцируются многими типами клеток: дендритными клетками, Мн/Мф, эпителиальными клетками, фибробластами, а при вирусной инфекции – всеми инфицированными ядросодержащими клетками. Основными индукторами IFNα/β являются двуспиральная и односпиральная РНК вирусов, действующие через TLR3 и TLR7/8, а также бактериальная ДНК, действующая через TLR9. К настоящему времени во многом расшифрованы сигнальные пути, обеспечивающие передачу сигналов с рецепторов IFN в клеточное ядро и активацию семейства генов, необходимых для синтеза и секреции IFN [216, 363, 409]. Продукция IFNα/β регистрируется через 6-12 часов после индукции. Важнейшее свойство интерферонов – способность оказывать прямое противовирусное действие, наиболее выражено у IFN I-го типа. Ключевые механизмы противовирусного действия IFNα/β заключаются в индукции синтеза следующих ферментов: 42 - протеинкиназы R (PKR), которая при взаимодействии с двуспиральной РНК вирусов активируется и фосфорилирует фактор инициации белкового синтеза eIF-2α, что приводит к блокаде трансляции вирусной m-РНК [321]; - 2′,5′-олигоаденилат синтетазы (OAS), которая активирует рибонуклеазу L (RNase L), что приводит к деструкции односпиральной вирусной РНК [236]; - Mx-белков, подавляющих транскрипцию целого ряда РНК-вирусов [294]. Интерферон II-го типа - IFNγ – синтезируется активированными антигеном Т-лимфоцитами, NK- и NKT-клетками. Среди Т-лимфоцитов синтез и секреция IFN-γ осуществляется цитотоксическими CD8+Т-клетками и преимущественно Th1-клетками [313]. Максимальная продукция IFNγ регистрируется через 48-72 часа после стимуляции клеток. Биологические свойства IFNγ могут быть сведены к следующим основным функциям: а) активация Мф, б) активация NK-клеток, в) стимуляция экспрессии MHC класса II, г) стимуляция синтеза изотипов Ig В-лимфоцитами, д) прямая противовирусная активность, которая ниже, чем у IFN I-го типа [67]. Таким образом, IFNγ является иммунорегуляторным цитокином, и его функции проявляются в большей степени в контексте адаптивного, чем врожденного иммунитета. В настоящее время известно несколько стратегий, используемых вирусами для реализации контроля или уклонения от опосредованного провоспалительными цитокинами и IFN клеточного ответа, что необходимо для их успешной репликации и распространения: вирусное ингибирование PRRs сигналов; инактивация транскрипционных факторов; нарушение JAK-STAT передачи сигнала; ингибирование вирусами экспрессии генов клетки хозяина [26, 294]. Для флавивирусов было выявлено три независимых механизма, благодаря которым снижают продукцию IFN: задерживают их распознавание клеточными PRRs [277, 466, 468]; подавляют транскрипцию гена IFNβ [330]; блокируют JAK-STAT передачу сигнала [329]. Установлено, что все флавивирусы, включая WNV [288], JEV [214], DENV [251] и ВКЭ [331], могут 43 подавлять IFN-опосредованную JAK-STAT передачу сигнала путем ингибирования JAK-фосфорилирования. Показано, что не только белок NS5 флавивирусов, будучи антагонистом STAT-фосфорилирования [331, 488], является решающим в противодействии этих вирусов IFN, но и другие неструктурные белки флавивирусов также могут вносить свой вклад в противодействие IFN-ответу [329, 330]. К настоящему флавивирусные времени инфекции не вызывает характеризуются сомнения тот нарушением факт, что продукции провоспалительных цитокинов и интерферонов. Ранее было установлено, что избыточная продукция провоспалительных цитокинов приводит к развитию системного воспалительного ответа (SIRS - systemic inflammatory response syndrome) [215] и раннему летальному исходу при генерализованных инфекциях [162, 414]. Подобный феномен системной активации системы цитокинов встречается при ряде вирусных инфекций. В первую очередь это относится к вирусным геморрагическим лихорадкам, в том числе и к лихорадке, вызванной DENV [244, 373]. В отличие от лихорадки DENV, для КЭ нехарактерно развитие геморрагического синдрома и циркуляторной недостаточности, но генерализация инфекции сопровождается системной гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (TNFα, ИЛ-1β и ИЛ-6), что подтверждено экспериментальными [46, 53] и клиническими наблюдениями [50, 203, 471]. В то же время при персистентных флавивирусных инфекциях (хронический вирусный гепатит В, С, хроническая антигенемия ВКЭ) механизмы нарушения межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток были обусловлены выраженным дисбалансом продукции провоспалительных (TNFα, IFNγ, IL-12) и противовоспалительных (IL-4, IL-10) цитокинов [43, 94]. Авторы предполагают, что снижение продукции TNFα при одновременном повышении растворимых форм его рецептора, является одним из звеньев 44 иммунопатогенеза при длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae. Предполагается, что именно баланс между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами определяет исход заболевания или, по крайней мере, влияет на его продолжительность [162, 272, 414]. Однако неполноценный противовирусный иммунный ответ может быть генетически детерминирован, поскольку, с одной стороны, особенности формирования и течения инфекции обусловлены генетической гетерогенностью самого патогена, а с другой, – определяются иммуногенетическими особенностями организма. В последние годы установлено, что гены цитокинов и их рецепторов в популяции человека характеризуются аллельным полиморфизмом и наличием изоформ, что определяет их способность модулировать направление иммунного ответа и, соответственно, различные особенности течения и варианты исхода болезни [43, 71, 138, 176, 202]. Таким образом, к настоящему времени показано, что недостаточная или избыточная продукция цитокинов способствует неблагоприятному течению флавивирусных инфекций, и только оптимальная продукция цитокинов может привести к завершению инфекционного процесса [26]. Однако до сих пор не оценена роль изменений продукции цитокинов на ранних стадиях инфицирования вирусом КЭ – на 2-3 день после присасывания клеща. Это позволит, на наш взгляд, расширить представления о защитной и патологической роли цитокинов при различных клинических проявлениях КЭ, создав тем самым основу для решения практической задачи прогнозирования течения и исхода этой инфекции с профилактической и терапевтической стратегий. целью усовершенствования 45 2.2. Роль факторов адаптивного иммунитета при флавивирусных инфекциях Адаптивный иммунный ответ, также как и врожденный, состоит из двух фаз – индуктивной и эффекторной. В ранней, индуктивной фазе адаптивного иммунного ответа, длящейся 5-7 дней, происходит распознавание антигена Т- и В-лимфоцитами и их дифференцировка в клетки-эффекторы. В поздней, эффекторной фазе, реализация которой осуществляется в последующие 1-2 недели, лимфоциты координируют иммунный ответ, направленный на элиминацию данного антигена. В ходе иммунного ответа формируются Т- и Вклетки памяти [52, 174]. 2.2.1. Клеточный иммунный ответ при флавивирусных инфекциях Маркерами зрелых Т-клеток являются антигенраспознающие рецепторы TCR (T-cell receptor) и СD3. Т-клеточный рецептор (TCR) может быть двух типов – αβ и γδ. К настоящему времени выделяют две разновидности Т-клеток: основная популяция (>95%) Т-клеток, имеющая рецептор αβ-типа, и минорная (1-3%) – γδТ-клетки. αβТ-клетки («классические» Т-клетки) состоят из двух главных субпопуляций - Т-хелперов, маркером которых является рецептор CD4, и цитотоксических Т-лимфоцитов с маркером CD8 [158]. Презентация антигенов Т-лимфоцитам дендритными клетками служит пусковым механизмом адаптивного иммунного ответа на эти патогены. Известно, что антиген распознается Т-клеткой (через TCR) только при встраивании его небольшого пептидного фрагмента (эпитопа) в состав молекул MHC [185, 487]. Поскольку молекула CD8 обладает сродством к MHC-I, а молекула CD4 – к MHC-II, то антигенные эпитопы, презентируемые дендритными клетками в составе молекул MHC-I, распознаются CD8+Tклетками, а эпитопы в составе молекул MHC-II – CD4+T-клетками. Поэтому CD4+T-клетки распознают и отвечают на внеклеточные антигены (молекулы, локализованные вне клеток или в эндосомах), а CD8+T-клетки – на внутриклеточные антигены, локализованные в цитозоле [356, 391]. 46 Т-клетки, распознавшие антиген, активируются, что приводит к экспрессии большого числа генов, среди которых наиболее важными являются гены цитокина IL-2 и его рецептора (IL-2R). Кроме того, на поверхности клеток появляются CD69 - самый ранний активационный антиген, затем CD25 и позднее – CD71, которые служат фенотипическими маркерами активации Тклеток [224, 374]. Активация лимфоцитов приводит к пролиферации клеток и дифференцировке их в эффекторные клетки. CD4+T-клетки дифференцируются на две субпопуляции Т-хелперов Th1и Th2.Th1-клетки продуцируют цитокины – IFNγ, IL-2, TNFα, TNFβ, IL-3, GM-CSF, а Th2-клетки – IL-4, IL-13, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF. Однако ключевым цитокином для Th1-клеток является IFNγ, для Th2-клеток– IL-4. Предполагается, что различие спектра цитокинов, прежде всего ключевых цитокинов Th1- и Th2- клеток, определяет направленность иммунного ответа в сторону клеточной или гуморальной защиты [66, 438]. Th1-лимфоциты взаимодействуют с Мф, на поверхности которых находятся антигенные эпитопы в комплексе с молекулами MHC-II, что приводит к активации как Th1клеток, так и Мф. В результате этой повторной активации Тh1-лимфоциты усиливают выработку цитокинов (IFNγ и TNFα), а Мф – различных провоспалительных цитокинов и факторов бактерицидности (активные формы кислорода и азота, ферменты). При этом происходит лизис инфицированных клеток и развитие иммунного воспаления [52, 174]. Для дифференцировки CD8+Т-клеток в цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) необходима IL-2-зависимая пролиферация CD8+Т-клеток, аутокринная или индуцируемая CD4+T-лимфоцитами [223, 455]. Цитотоксические Тлимфоциты, в отличие от наивных CD8+Т-клеток, имеют в цитоплазме лизосомоподобные гранулы (в них содержатся перфорины и гранзимы) и экспрессируют Fas-лиганды, что обеспечивает реализацию их цитотоксической функции [287, 495]. Эти лимфоциты распознают инфицированные клетки, на поверхности которых имеется антигенные эпитопы в комплексе с молекулами 47 MHC-I, и с помощью перфоринзависимого и апоптотического механизмов осуществляют лизис этих клеток [495]. Таким образом, в зависимости от локализации патогенов в цитозоле или в гранулах реализуются два варианта клеточного иммунного ответа: цитотоксический, осуществляемый CTL, и воспалительный, опосредованный Th1-лимфоцитами. Роль Т-клеточного иммунитета в патогенезе флавивирусных инфекций, в том числе и при КЭ, изучалась многими исследователями [47, 65, 89, 146, 319, 384, 425]. В последние годы была продемонстрирована не только иммунопатологическая, но и защитная роль CD4+- и CD8+Т-клеток при флавивирусных инфекциях [217, 225, 317, 355]. Так, многогранность CD4 +Тлимфоцитов способствует контролю за инфекцией с помощью различных механизмов, в том числе продукции провоспалительных и противовирусных цитокинов, переключению класса антител, прямой цитотоксичности и поддержке CD8+Т-клеточной активности [225, 435, 496]. Показано, что у пациентов со спонтанным прекращением HCV-инфекции выявляют сильный и мультиспецифичный CD4+Т-клеточный ответ [218]. Однако, функциональное изменение HCV-специфических CD4+Т-клеток, характеризующееся снижением возможности к развитию устойчивого продолжительного Тh1 ответа, приводило к хронической персистенции HCV [94, 301]. Обследование пациентов с длительной антигенемией ВКЭ также выявило снижение численности CD4+-субпопуляции лимфоцитов, изменение пролиферативной активности этих клеток и снижение продукции провоспалительных цитокинов [43, 56, 94]. У пациентов с тяжелыми флавивирусными энцефалитами отмечался слабый Th1-клеточный иммунный ответ, сопровождавшийся как снижением содержания в крови CD4+Т-лимфоцитов [91, 149], так и функциональной неполноценностью этих клеток [323, 355]. Способность CD4+Т-клеток контролировать инфекцию, вызванную разными флавивирусами (WNV, JEV, ВКЭ), была изучена в экспериментах адаптивного переноса и на 48 генетически дефицитных мышах [225, 355, 435]. Было установлено, что отсутствие CD4+T-клеток у мышей с генетической или приобретенной недостаточностью приводило к повышению вирусной нагрузки в ЦНС на поздних стадиях инфекции и неизбежной гибели, а адаптивный перенос вирусспецифических CD4+T-клеток значительно повышал выживаемость этих животных при инфицировании [435, 355]. Полученные данные указывает на защитную роль CD4+Т-клеток при флавивирусных инфекциях, однако механизмы их действия пока недостаточно ясны. Противоречивая роль CD8+T-клеток при флавивирусных инфекциях была показана в целом ряде исследований [319, 373, 425, 472]. Так, у спонтанно выздоровевших пациентов с HCV-инфекцией вирусспецифические CD8+Tклетки содержали низкий уровень перфорина и не проявляли цитотоксическую активность в прямом ex vivo цитотоксическом анализе, но эти клетки показали быстрый ответ на стимуляцию пролиферацию, продукцию HCV-пептидами in включая vitro, IFNγ и генерацию дочерних высокотоксичных клеток [322, 395]. У пациентов с ХГС вирусспецифические CD8 +T-клетки содержали большое количество перфорина во внутриплазматических везикулах и усиливали HCV-специфическую цитотоксичность ex vivo без дополнительной стимуляции, что, по мнению авторов [322, 395], способствовало повреждению печени, где такие же клетки были обнаружены. У пациентов с длительной антигенемией ВКЭ, а также с очаговыми формами КЭ в крови зарегистрировано снижение количества CD8+Т-леток [91, 149]. Было сделано предположение, что иммунопатология при флавивирусных энцефалитах опосредована, прежде всего, CD8+T-клетками [225, 317, 435]. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов мозга мышей, инфицированных разными флавивирусами (WNV, JEV, ВКЭ), показало преобладание в них CD8+T-клеток [225, 317, 355]. Кроме того, данные гистопатологического исследования мозга при летальных случаях КЭ у людей поддерживают гипотезу об иммунопатологической роли CTL при КЭ [328]. D. Ruzek с соавт. 49 (2011) для непосредственной проверки роли CD8+T-клеток в усилении проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) при КЭ использовали экспериментальную модель мышей, у которых отсутствовала функциональная CD8α+Т-клеточная популяция. Значительный прорыв ГЭБ наблюдался в терминальной фазе КЭ у этих CD8α-/- мышей. Авторы предполагают, что индуцированный вирусом КЭ прорыв гематоэнцефалического барьера во многом не зависит от наличия CD8+Т-клеток, хотя не исключают возможный вклад этих клеток в инфекционный процесс [217]. Подобные результаты были получены при инфицировании мышей JEV: истощение CD8+Т-клеток незначительно увеличивает чувствительность мышей к вирусной инфекции и генетические недостатки цитолитического эффекторного пути Т-лимфоцитов не усугубляют патогенез JEV [355]. Это контрастирует с данными, полученными при инфицировании мышей WNV, где отсутствие CD8 +T-клеток привело к росту вирусной нагрузки в ЦНС и повышению смертности животных [432]. Полученные данные подчеркивают разницу в патогенезе флавивирусных инфекций, хотя противоречивые результаты наблюдаются, вероятно, еще и изза использования не только различных вирусов, но и доз, путей введения, линий мышей и их возраста. Вместе эти данные позволяют предположить, что существует двоякая роль CD8+Т-клеток как в избавлении от вирусной инфекции, так и опосредованной иммунопатологии в ЦНС. Таким образом, в исследовании роли Т-клеток (как CD4+, так и CD8+) при флавивирусных инфекциях остается ряд невыясненных вопросов, в том числе защитная и патологическая роль их при различных клинических формах КЭ. 2.2.2 Гуморальный иммунный ответ при флавивирусных инфекциях Маркерами зрелых В-клеток являются антигенраспознающие рецепторы BCR (B-cell receptor) в комплексе с несколькими мембранными молекулами, среди которых специфичной для В-лимфоцитов является только молекула СD19. В состав BCR входят мембранные иммуноглобулины, преобладающим классом которых на наивных В-клетках (не контактировавших с антигеном) 50 является IgM и IgD. В процессе иммунного ответа (после активации антигеном) происходит переключение классов иммуноглобулинов на IgG, IgA и IgE. Иммуноглобулины функционируют не только как мембраносвязанные рецепторы на поверхности В-клеток, но и как растворимые циркулирующие антитела, имеющие ту же антигенную специфичность, что и соответствующий рецептор В-лимфоцитов. К настоящему времени выделяют несколько субпопуляций В-клеток: В1, В2 – основная субпопуляция В-клеток, и В-клетки маргинальной зоны [52, 153]. В индуктивной фазе гуморального иммунного ответа происходит распознавание рецепторами В-клеток (BCR) внеклеточных патогенов в их нативной, нерасщепленной форме. Для активации В-клеток необходима дополнительная стимуляция со стороны Th2-клеток и секретируемых ими цитокинов. Активированные В-клетки пролиферируют и дифференцируются в плазматические (антителообразующие) клетки, секретирующие антитела, и Вклетки-памяти. Цитокины, помимо действия на пролиферацию и дифференцировку В-клеток, способны влиять на процесс переключения изотипа рецептора В-клетки с IgM на другие классы иммуноглобулинов. Так, IL-4 индуцирует экспрессию IgG4 и IgE; IFNγ отвечает за переключение изотипов на IgG1 и, возможно, на IgG3; IL-6 усиливает синтез IgM и IgG1; IL10 стимулирует запуск антител практически всех классов [66]. Гуморальный иммунный ответ важен для контролирования флавивирусных инфекций. Большая часть этого контроля обеспечивается нейтрализующими антителами, которые распознают антигенные детерминанты, расположенные преимущественно в вирусном гликопротеине E, основном иммуногене флавивирусов. Эти антитела нейтрализуют инфекционные свойства флавивирусов с высокой эффективностью, главным образом, вмешиваясь в ранние стадии проникновения вируса, в том числе, прикрепление, интернализацию и/или репликацию внутри клеток [163, 243, 445, 446]. Антитела образуются и против многих неструктурных белков 51 флавивирусов, но наибольший интерес представляет белок NS1, который не только продуцируется в инфицированных клетках в сравнительно больших количествах, но и секретируется за пределы зараженной клетки. Было показано, что высокое содержание NS1 в сыворотке крови пациентов, инфицированных DENV, коррелировало с тяжестью заболевания [303]. Установлено, что антитела против NS1 защищают от индуцированных флавивирусами заболеваний [163, 341, 425]. Предполагается, что анти-NS1 антитела могут осуществлять защиту, как через комплемент-опосредованный цитолиз, так и напрямую влиять на снижение титров вируса в инфицированных клетках [197, 351]. Быстрое нарастание нейтрализующего ответа антител представляет собой ключевой фактор выживания при инфекции острыми цитопатическими вирусами [297]. Поскольку для активации CD4+Т-хелперного ответа требуется несколько дней, то быстрая индукция раннего ответа нейтрализующими IgM антителами, независимая от помощи Т-клеток, заполняет этот промежуток. Было показано, что большинство цитопатических вирусов, в том числе и флавивирусы, могут индуцировать независимый от Т-клеток ответ нейтрализующими IgM антителами [65, 129, 319, 449]. Выявление этих вирусспецифических антител класса IgM в крови пациентов является основой для верификации диагноза заболевания. Клинические и экспериментальные данные показали, что быстрое переключение изотипа антител, зависимое от Тклеток, имеет огромное значение для поддержания высокого защитного уровня антител, необходимого для продолжительного контроля флавивирусных инфекций [163, 263, 319, 355]. Это обусловлено тем, что антитела класса IgG обладают большим сродством к соответствующим антигенным эпитопам, а также более действенны как эффекторные молекулы, чем IgM-антитела. Более высокая функциональная эффективность IgG-антител связана с тем, что к этим антителам на поверхности эффекторных клеток врожденного иммунитета есть рецепторы – FcγR, тогда как рецепторы для Fc-части молекулы IgM – 52 отсутствуют [153]. Взаимодействие подклассов IgG (IgG1 - IgG4) с рецепторами Fcγ запускает эффекторные механизмы иммунной защиты: фагоцитоз, эндоцитоз, опосредованную антителами клеточную цитотоксичность, высвобождение ряда медиаторов воспаления, а также удаление иммунных комплексов. В целом, считают, что противовирусные антитела у человека в основном принадлежат к IgG1 и IgG3 [103]. Однако известно, что нейтрализующие антитела не всегда полностью препятствуют распространению флавивирусов в организме [129, 205, 297]. Так, рядом авторов [65, 163] при КЭ была выявлена длительная циркуляция вирусспецифических IgM-антител и задержка переключения их на синтез IgGантител, что свидетельствовало о дефекте системы Т-лимфоцитов. Однако, при КЭ, также как и при других флавивирусных инфекциях, существуют, вероятно, и другие механизмы, реализующие уклонение флавивирусов от элиминирующего действия вируснейтрализующих антител и поддерживающие как репликативную, так и персистентную инфекции. Так, флавивирусы могут использовать мутацию вируснейтрализующих детерминант как стратегию, позволяющую избегать распознавания антителами [205, 297]. Наиболее яркий пример этого механизма уклонения демонстрирует HCV. Изменения в гипервариабельной области иммунодоминантного поверхностного вирусного белка E2 развиваются в течение HCV-инфекции и связаны с вирусной персистенцией и снижением эффективного ответа нейтрализующих антител [227, 437]. У других флавивирусов антигенные вариации в E белке также могут иметь отношение к уклонению от гуморального иммунного ответа, поскольку большинство нейтрализующих моноклональных антител связываются с эпитопами в этом регионе. Было показано, что флавивирусы (WNV, DNV, JEV, YFV, ВКЭ) с мутациями в домене III белка Е эффективно избегают нейтрализации антителами [181, 209, 226, 366, 389]. Различия флавивирусами, в гуморальных были выдвинуты ответах, на индуцированных первый план разными экспериментами, 53 использующими мышей с утратой функции B-клеток. У мышей с дефицитом В-клеток, инфицированных WNV и JEV, заболевание протекало более тяжело, чем у иммунокомпетентных животных. Эта ситуация предотвращалась пассивным переносом антител от иммунных мышей дикого типа [205, 355]. Однако, при DENV инфекции у мышей c дефицитом В-клеток, не установлено изменений в тяжести болезни или в увеличении вирусной нагрузки [337]. В то же время другие авторы сообщают об усилении нейровирулентности JEV у мышей при пассивном переносе вирусспецифических антител [341]. Считается, что такое усиление нейровирулентности опосредовано антитело-зависимым усилением (ADE) вирусной инфекции благодаря интернализации комплексов антиген-антитело в клетки через Fcγ-рецепторы или рецепторы комплемента [284]. Роль не-нейтрализующих антител в усилении инфекции через ADE до сих пор неясна, хотя считается, что ADE вносит свой вклад в иммунопатологическую активность анти-флавивирусных гуморальных ответов. Таким образом, изучение изменений гуморального звена иммунитета при флавивирусных инфекциях, которые носят как адаптационную, так и патологическую направленность, остается актуальным. Th2-цитокины (IL-4, IL-10), способствующие реализации гуморального иммунного ответа Основными продуцентами IL-4 являются Th2-лимфоциты, кроме того, его вырабатывают тучные клетки, базофилы, эозинофилы. Цитокин IL-4 служит основным ростовым переключение фактором изотипов для антител, B-лимфоцитов, тем самым ответственным способствуя за развитию гуморального иммунного ответа. Действуя на CD8+T-клетки, IL-4 индуцирует развитие CTL, секретирующих IL-4 и другие Th2-цитокины. Цитокин IL-4 является функциональным антагонистом IFNγ. Подавляя активность Мф и синтез ими IL-1, TNFα, IL-6 и других провоспалительных цитокинов, IL-4 выступает в роли противовоспалительного цитокина [66, 67, 154]. 54 IL-10 — противовоспалительный цитокин, продуцируемый Th2- лимфоцитами, Мн/Мф, дендритными и тучными клетками. Этот цитокин подавляет активность Тh1-лимфоцитов и Мф и синтез ими провоспалительных цитокинов. IL-10 является антагонистом IFNγ. В тоже время этот цитокин служит синергистом IL-4 при действии на В-клетки, усиливая их пролиферацию и дифференцировку, синтез ими IgM и IgA, способствуя развитию гуморальных иммунных реакций [67, 173]. У больных хроническими инфекциями, вызванными ВКЭ, HCV, DENV, было выявлено отчетливое снижение продукции мононуклеарами цитокинов Тh1-типа (IL-2 и IFNγ) на фоне повышенного синтеза IL-4 и IL-10 [43, 55, 56, 256]. Однако избыток противовоспалительных цитокинов может приводить к снижению противоинфекционной защиты и выступать в качестве одного из основных факторов хронизации инфекции [45]. С другой стороны, дефицит IL4 и IL-10, способных блокировать спонтанную и индуцированную продукцию провоспалительных цитокинов, может вызвать неограниченное развитие воспаления и присоединение аутоиммунного повреждения тканей [152]. Можно предположить, что именно так выглядит один из механизмов нарушения адекватного иммунологического реагирования при вирусных инфекциях. Таким образом, иммунная защита против флавивирусов формируется при участии многих механизмов врожденного и адаптивного иммунитета. Она реализуется с помощью следующих основных факторов: интерферонов I типа, киллерных механизмов цитотоксичности (NK-клетки и CTL), нейтрализующих антител. Совокупность данных защитных механизмов, выраженность которых зависит от реактивности макроорганизма и свойств инфицирующего вируса, в большинстве случаев обеспечивает клиническое выздоровление и последующее развитие специфической резистентности. В то же время флавивирусы обладают иммуномодулирующей активностью, вызывая иммунодефицитные состояния, степень выраженности которых связана непосредственно с характером и тяжестью инфекционного процесса и зависит от преморбидного фона пациента. 55 Изучение адаптационной или патологической направленности иммунного ответа при инфицировании флавивирусами, в том числе и ВКЭ, может послужить основанием для разработки иммунологических подходов при прогнозировании течения заболевания с целью оптимизации лечебных воздействий. 2.3. Формирование врожденного и адаптивного иммунного ответа под влиянием флавивирусных вакцин Основная цель вакцинации – создание протективного иммунитета и формирование иммунологической памяти к антигенам возбудителя. Поствакцинальный иммунитет отличается от естественного иммунитета, возникающего под влиянием перенесенной инфекции. В целом поствакцинальный иммунитет уступает по напряженности постинфекционному и зависит от вида вакцин. Иммуногенность вакцин уменьшается в следующем порядке: живые (аттенуированные) – инактивированные – субъединичные вакцины [84]. При введении живых вакцин иммунитет может быть слабее по сравнению с тем, который возникает под влиянием вирулентного возбудителя. При естественной иммунизации, введении живых и инактивированных вакцин организм отвечает на все виды антигенов, входящих в состав микроорганизмов. При иммунизации субъединичными вакцинами иммунитет менее полноценен, так как он формируется под влиянием только отдельных антигенных протективные детерминант. антигены, В идеале которые вакцина входят в должна состав содержать все микроорганизмов, вызывающих заболевание. Такая вакцина активирует большое количество иммунокомпетентных клеток различной специфичности, что обеспечивает формирование стойкого иммунитета [84]. В настоящее время при флавивирусных инфекциях у людей применяют в основном инактивированные и живые аттенуированные вакцины. Несмотря на большие успехи вакцинологии, сведений о том, как эти вакцины взаимодействуют с иммунной системой человека и стимулируют защитные 56 иммунные реакции, недостаточно. В качестве примера формирования поствакцинального иммунитета под влиянием флавивирусных вакцин рассмотрим живую аттенуированную вакцину против желтой лихорадки и инактивированную вакцину против КЭ. 2.3.1. Иммунный ответ на введение живой аттенуированной вакцины Вакцина против желтой лихорадки (YF-17D), созданная около 70 лет назад, является одной из наиболее эффективных и безопасных вакцин. За это время было успешно провакцинировано более 540 миллионов человек во всем мире [408]. Вакцина вводится однократно, подкожно, ревакцинацию проводят через 10 лет. Однако до недавнего времени о взаимодействии YF-17D с иммунной системой, и тем более с компонентами врожденного иммунитета, известно немного. - Врожденный иммунный ответ Известно, что вакцинация YF-17D приводит к острой вирусной инфекции, при которой имеет место кратковременная (только в течение 5-7 дней) репликация вируса [385]. Было установлено, что вакцина YF-17D инфицирует DCs, но реплицируется в этих клетках минимально [364]. Тем не менее, даже эта минимальная репликация оказывается достаточной для презентации Тклеткам эндогенных эпитопов вируса [364, 493]. Полагают, что вакцина YF17D опосредует свою иммунногенность, в частности, путем передачи сигналов через несколько TLRs (TLR2, 7, 8 и 9), экспрессирующихся на различных типах DCs, и это приводит к стимуляции смешанного профиля цитокинов Th1-и Th2типов [441, 493]. Кроме того, было показано, что у лиц, привитых вакциной YF-17D, отмечается индукция генов, кодирующих другие PRRs, такие как RIG-I и MDA5, а также транскрипционных факторов, которые регулируют экспрессию IFN I типа (IRF7 и STAT1) [408, 492]. Эти авторы полагают, что IRF7, STAT1 являются ключевыми регуляторами раннего врожденного иммунного ответа на YF-17D вакцину. Стойкое повышение активации этих факторов отмечалось в течение двух недель после вакцинации, что, вероятно, 57 отражало стимуляцию клеток врожденного иммунитета в ответ на вирусную репликацию, пик которой отмечался на 7 день [385]. Эти исследования подчеркивают сложность проявлений врожденного иммунного ответа на живую, хотя и аттенуированную вакцину, который требуется для индукции длительной иммунной защиты. - Адаптивный иммунный ответ К настоящему времени установлено, что вакцинация YF-17D вызывает поливалентный адаптивный иммунный ответ, включающий продукцию CTL, Th1- и Th2 клеток и нейтрализующих антител, которые могут сохраняться до 40 лет после вакцинации [207]. Считается, что уровень нейтрализующих антител в первую очередь коррелирует со степенью защиты против заражения вирусом YF [207, 385], а иммунизация предохраняет от инфекции вакцинированных лиц более чем в 90% случаев [207, 385]. Вакцина YF-17D индуцирует быструю продукцию вирусспецифических антител класса IgM в первые 7 дней после вакцинации с пиком на 2-ой неделе [207]. В первые 4-6 недель титры IgMантител выше, чем IgG-антител, и они сохраняются не менее 18 месяцев. Нейтрализующие антитела класса IgG появляются позже и могут сохраняться до 40 лет. Механизмы, которые стимулируют такую устойчивость иммунного ответа, неизвестны, так же как клеточные и молекулярные механизмы, которые приводят к длительному IgM ответу. Несмотря на то, что Т-клетки играют важную роль в адаптивном иммунном ответе, работ по изучению Т-клеточных реакций при вакцинации YF-17D немного. Было показано, что человеческие CD8+-Т-клетки, реагирующие на вакцину YF-17D, распознают эпитопы вирусных белков Е, NS1, NS2b и NS3 [307]. Другое исследование у людей, иммунизированных YF-17D вакциной, подтвердило увеличение популяции CD8+-Т-клеток путем мониторинга экспрессии активационных маркеров (CD38, HLA-DR) и подавления внутриклеточного Bcl-2 в Т-клетках [308]. Способность к ингибированию внутриклеточного Bcl-2, как известно, является признаком активированных эффекторных CD8+-T-клеток [308]. Пик CD8+-Т-клеточного 58 ответа наблюдался на 15-й день, возвращение к нормальному уровню - на 30-й день после иммунизации. Поскольку живая вакцина YF-17D вызывает активную вирусную инфекцию, то вполне вероятно, что и другие вирусы, которые стимулируют сильный иммунный ответ, протекают по тому же иммунологическому сценарию. Таким образом, вакцина YF-17D является самой успешной моделью для разработки новых вакцин, которые должны вызывать длительную защиту. 2.3.2. Иммунный ответ на ведение инактивированной вакцины В настоящее время зарегистрированы, разрешены к применению и широко используются, в том числе и на территории РФ, четыре вида вакцин против КЭ [17]. Две из них отечественного производства – вакцина Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (Москва) и вакцина «ЭнцеВир» НПО «Микроген» (Томск). Две вакцины зарубежного производства для взрослых и детей: вакцина «FSME-Immun» компании «Baxter Vaccin AG», Австрия, а также вакцина «Encepur» фирмы «Novartis Vaccine», Германия. Все эти вакцины приготовлены по сходной технологии, но из различных инактивированных формальдегидом штаммов вируса КЭ, принадлежащих к дальневосточному (Софьин и 205) и западноевропейскому (Найдорфл и К23) субтипам этого возбудителя. Инактивированные вакцины обладают в целом более низкой эффективностью по сравнению с живыми вакцинами, но при повторном введении создают достаточно стойкий иммунитет, предохраняя привитых от заболевания или уменьшая его тяжесть [84]. Преимуществом инактивированных вакцин является то, что они утратили риск реверсии вирулентности, для которой всегда есть возможность в случае живых аттенуированных инактивированных вакцин вакцин против [249]. КЭ Схема однотипна: вакцинации три дозы для вводят внутримышечно, первые две вводят с интервалом 1- 3 месяца и третья вводится через 1 год после второй. Последующие ревакцинации проводят каждые 3 года однократно [80, 352]. 59 Известно, что вакцины опосредуют защиту путем индукции антигенспецифических иммунных эффекторов и/или иммунных клеток памяти [84]. По существу, вакцин-индуцированными иммунными эффекторами являются антитела, продуцируемые В-лимфоцитами, и способные специфически связываться с патогеном [84]. Другими потенциальными эффекторами являются цитотоксические CD8+Т-лимфоциты, которые могут ограничить распространение инфекционных агентов, распознавая и уничтожая инфицированные клетки или секретируя цитокины. Долгое время считался бесспорным тот факт, что инактивированные вакцины индуцируют только продукцию вакцин-специфических антител, но в последние годы начали появляться отдельные исследования, демонстрирующие, что эти вакцины могут активировать и другие звенья иммунной системы. - Врожденный иммунный ответ Для индукции необходима антиген-специфичных активация B- антигенпрезентирующих и Т-клеточных клеток, в ответов основном, дендритных (DCs). Центральная роль зрелых DCs в индукции ответа на вакцину отражает их уникальную способность представлять как антигенспецифические, так и костимулирующие сигналы Т-клеткам, эти «сигналы опасности» необходимы для активации наивных Т- клеток [320]. Таким образом, первым требованием для запуска иммунного ответа на вакцинацию является обеспечение достаточно сильного «сигнала опасности», вызываемого вакцинальным антигеном и/или адъювантом, чтобы вызвать воспалительную реакцию, которая опосредуется клетками врожденной иммунной системы [304]. При отсутствии «сигналов опасности», DCs остаются незрелыми и Т-клетки не дифференцируются в иммунные эффекторы. Инактивированные вакцины все еще могут содержать патоген- ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), способные инициировать врожденный иммунный ответ [478]. Однако при отсутствии вирусной репликации вакцин-индуцированная активация становится более ограниченной, 60 как в пространстве, так и во времени [433]. Показано, что инактивированные вакцины существенно активируют врожденный иммунный ответ лишь в месте их инъекции, поэтому для этих вакцин место и способ их введения более важны, чем для живых вакцин [433]. Для большинства инактивированных вакцин, в том числе и для вакцин против КЭ, требуется, чтобы их изготавливали со специфическими адъювантами, включающими «сигналы опасности» и вызывающими достаточную активацию врожденной иммунной системы. Эффект адъювантов, вероятно, обусловлен двумя основными видами активности: концентрацией антигена в месте инъекции для привлечения большего количества DCs в реакцию (эффект «депо»); индукцией синтеза цитокинов, регулирующих функцию лимфоцитов [399]. В вакцинах против КЭ в качестве адъюванта используется гидроокись алюминия, способствующая формированию «депо», из которого антиген медленно освобождается, усиливая продолжительность B- и Т-клеточной активации, а также преимущественную индукцию IL-4 макрофагами, поглотившими гидроокись алюминия [194]. Однако ни один из настоящих адъювантов не вызывает ту степень активации врожденной иммунной системы, которую вызывают живые вакцины. - Адаптивный иммунный ответ Одним из важнейших показателей протективного поствакцинального иммунитета, хорошо изученного многими исследователями, является уровень нейтрализующих антител, индуцированных инактивированными вакцинами против КЭ [18, 273, 352]. ВОЗ (2011) были обобщены данные по сероконверсии вакцин: Encepur для детей, Encepur для взрослых и FSME-Immun нового состава. Так, при исследовании 5063 детей и взрослых, привитых этими вакцинами, методами ИФА, РТГА и РН была определена сероконверсия среди 92-100% вакцинированных [250]. В лаборатории КЭ НИИЭМ СО РАМН было проведено сравнительное исследование иммуногенности 4-х вакцин (КЭ-Москва, Энцевир, FSME-Immun, Encepur), которое включало 290 взрослых лиц [229]. Все вакцины 61 индуцировали нейтрализующие антитела против разных штаммов дальневосточного и сибирского субтипов вируса КЭ. В случае применения вакцины КЭ-Москва антитела выявлялись у 100% привитых через 2-5 месяцев и у 94% - через 2 года. При применении вакцины Энцевир - 88% и 84%, FSMEImmun - 88,2% и 78,1%, Encepur - 100% и 100% (соответственно через 2-5 месяцев и через 2 года). В то же время исследования роли Т-клеточного иммунного ответа, индуцированного инактивированными вакцинами, малочисленны. В опытах на животных ряд авторов показали, что инактивированные вакцины индуцируют только некоторые звенья иммунной системы. Так, в исследовании T.R. Kreil et al. (1998) мышей вначале иммунизировали вакциной FSME-Immune (по схеме, трижды) и затем заражали летальной дозой ВКЭ. Как и ожидалось, после иммунизации индуцировались высокие титры антител против белка E, что приводило к 100% выживаемости. Хотя инфицирование живым вирусом не выявляло виремии, но к неструктурному белку NS1 вырабатывался новый вид антител, который не продуцировался после вакцинации. Кроме того, ВКЭспецифические CD8+-Т-клетки были обнаружены только после заражения вирусом. Авторы пришли к выводу, что вакцина защищает от тяжелых случаев заболевания [476]. Исследование, проведенное J.H. Aberle et al. (2005) и выполненное на мышах, иммунизированных инактивированной вакциной против КЭ, также показало, что вакцинация приводит к 100% сероконверсии и отсутствию протективного CD8+T-клеточного ответа у мышей. Однако B. Shrestha et al. (2008) показали, что применение инактивированной вакцины против WNV индуцирует у мышей не только высокие уровни нейтрализующих антител, но и антигенспецифические CD8 +-Тклетки, способствующие усилению протективного иммунитета. Через 60 дней после однократной иммунизации одной дозой этой вакцины авторы наблюдали у мышей практически полную защиту от высоковирулентного летального внутримозгового заражения WNV. Было установлено, что истощение CD8 +-Т- 62 клеток непосредственно перед заражением WNV путем введения антимышиных CD8-антител имело тенденцию к снижению защиты у мышей, иммунизированных одной дозой вакцины. Такие же результаты были получены в экспериментах с CD8-/- мышами. Тем не менее, приобретенные или генетические дефициты CD8+Т-клеток менее влияли на выживаемость животных, если до заражения WNV мыши были ревакцинированы. Аналогичные результаты были получены после трех ревакцинаций с помощью вакцины против JEV: гуморального иммунного ответа было достаточно, чтобы защитить мышей от JEV при отсутствии CD8+-Т-клеток [407]. Тот факт, что инактивированная, не сопровождающаяся репликацией вируса, вакцина стимулировала CD8+Т-клеточные реакции против неструктурного белка вируса (NS4b) достаточно интересен. Считалось, что инактивированные вакцины не могут индуцировать достаточный CD8+Тклеточный ответ в связи с отсутствием в цитоплазме клеток белков, кодируемых вирусом, т.е. белков, которые при естественной инфекции будут представлены через молекулы MHC- I, что приводит к эффективному CD8+-Тклеточному ответу. B. Shrestha et al. (2008) предполагают, что иммунизация инактивированной WNV вакциной, вероятно, генерирует CD8 +-Т-клеточный ответ против NS4b путем перекрестной презентации антигена DCs [442]. Еще недавно считали, что пептидные фрагменты внутриклеточных белков вируса могут попасть только в состав молекул MHC-I, а пептиды экзогенного происхождения – только в состав молекул MHC-II. Поэтому было неясно, как происходит запуск цитотоксического иммунного ответа на внеклеточные патогены с участием молекул MHC-I. Ответом на этот вопрос послужило описание перекрестной презентации, в результате которой Т-клетки распознают комплексы молекул MHC класса I с пептидами экзогенного происхождения, поглощенными DCs при эндоцитозе. Предположительно, этот механизм включается в том случае, когда вирус не инфицирует антигенпрезентирующие клетки напрямую. Тогда перекрестная презентация может индуцировать 63 эффективный иммунный ответ, опосредованный CTL [52, 174]. Механизм этого явления до конца не раскрыт, но большое значение в его реализации отводят DCs и TLRs, в частности TLR3 и TLR9 [183, 208]. Результаты по изучению CD8+T-клеточного иммунного ответа после иммунизации инактивированными вакцинами были получены на животных, поэтому необходимы дальнейшие исследования механизма вирусспецифического Т-клеточного ответа у людей на инактивированные вакцины против КЭ. 2.3.3 Заболеваемость КЭ лиц, вакцинированных против КЭ Поскольку эффективность любой вакцинации никогда не достигает 100% [17], то среди лиц, ранее привитых инактивированными вакцинами против КЭ, также отмечаются случаи заболевания. В зависимости от региона и от используемой вакцины в разные периоды времени авторы указывали, что среди заболевших КЭ, вакцинированные лица составляли от 9 до 29% [16, 18]. Так, в Томской области Н.Г. Жуковой (2002) были проанализированы истории 102 пациентов с КЭ за 10 лет (1985-1995 гг.), иммунизированных вакциной против КЭ производства НПО «Вирион» (Томск). Автор сделала вывод о том, что у привитых лиц клиническое течение КЭ оказалось более легким (у 90% заболевших отмечались лихорадочные формы КЭ), а исходы заболевания у вакцинированных более благополучными по сравнению с непривитыми лицами. В свою очередь Г.Н. Леонова с соавт. (1992) в Приморском крае отмечали, что средняя многолетняя заболеваемость лиц, привитых томской вакциной против КЭ, за период с 1966 по 1983 гг. составила 3,7, а непривитых 4,3 на 100 000 населения. В настоящее время ряд авторов показали, что при использовании высокоиммуногенных вакцин против КЭ III поколения частота случаев заболевания КЭ у вакцинированных в целом ниже, чем у невакцинированных: в Омской области - в 4 раза [86], в Свердловской области - в 8,7 раза [132]. В Приморском крае при применении этих современных вакцин не 64 зарегистрировано летальных исходов в группе привитых лиц, большинство случаев заболевания ограничилось лихорадочной формой (90,2%), менингеальной – 4,2% и очаговой – 5,6% [68]. При анализе случаев заболевания у привитых против КЭ установлено, что у 29,2% больных был проведен неполный курс иммунизации с нарушением установленной схемы [68]. О случаях заболевания КЭ среди вакцинированных лиц сообщается и в странах Западной Европы [17]. Так, в Австрии в течение 2002-2008 гг. было зарегистрировано 25 случаев заболевания КЭ, из которых 8 заболевших были вакцинированы согласно календарю, рекомендованному производителем [444]. В Швеции было зарегистрировано 27 случаев заболевания КЭ за период 20002008 гг., из которых 21 заболевший получил 2 или более доз вакцины в соответствии с календарем прививок [477]. Таким образом, неудачи применение даже самых успешных вакцинопрофилактики сопровождают вакцин. Однако иммунологическое объяснение случаев заболевания у вакцинированных лиц трудно установить. Данные об особенностях функционирования иммунной системы вакцинированных пациентов при инфицировании ВКЭ, и даже заболевании КЭ, практически отсутствуют. В то же время изучение случаев заболевания вакцинированных лиц важно для оценки эффективности вакцины и для решения вопроса о необходимости изменения рекомендаций по вакцинации. 65 Глава 3. Современные средства этиотропной терапии при флавивирусных инфекциях На современном этапе стало совершенно очевидным, что лечение при флавивирусных инфекциях должно быть направлено не только на элиминацию возбудителя, но и на восстановление инверсированного иммунного ответа макроорганизма, а также на подавление индуцированных вирусом иммунопатологических реакций. Соответственно выделяют несколько мишеней терапевтического воздействия: ингибиция репликации вируса и его элиминация из организма, коррекция вторичного иммунодефицита, модуляция специфического иммунного ответа и предупреждение персистенции вируса. 3.1. Противовирусные препараты, обладающие прямым этиотропным действием (химиопрепараты и интерфероны) Химиотерапия против вирусных инфекций разрабатывается с использованием двух принципиально разных стратегий. При применении первой, традиционной стратегии блокируются функции вируса, при второй блокируются функции клетки, необходимые для размножения вируса. Второй подход, находящийся в стадии разработки, осложняется тем, что он может препятствовать нормальной клеточной функции, но его потенциальные преимущества состоят в том, что терапия действенна в отношении всех вирусов одного и того же рода, и появление резистентности к этому типу химиотерапии наблюдается в редких случаях [281, 419]. Механизм действия традиционных противовирусных химиопрепаратов заключается в избирательном подавлении отдельных этапов репродукции вирусов без существенного нарушения жизнедеятельности клеток макроорганизма. Последнее обстоятельство определяет основную сложность получения высокоэффективных противовирусных препаратов, так как обязательный внутриклеточный этап размножения вирусов тесным образом связан с функционированием инфицированных клеток. Более того, синтез вирусных геномов и белков, транспорт вирусных компонентов и сборка новых 66 вирионов осуществляются инфицированными клетками, и лишь немногие из этих процессов вирусоспецифичны. Поэтому основным требованием, предъявляемым к противовирусным препаратам, является избирательное подавление репродукции вируса без побочного действия на жизненные функции клеток хозяина. Проведенный скрининг сотен тысяч химических соединений показал, что противовирусными свойствами обладают лишь немногие из них [35]. Это, прежде всего группа аномальных нуклеозидов, к которым относится рибавирин – один из наиболее важных антифлавивирусных препаратов. Рибавирин (синонимы: виразол, рибамидил, ребетол) представляет собой синтетический аналог нуклеозидов - 1-β-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3карбоксамид [35]. Хотя рибавирин был синтезирован более 30 лет назад, точный механизм его действия остается не совсем понятным. Предполагают, что противовирусное действие рибавирина может быть обусловлено тремя различными механизмами [260, 398]. Во-первых, препарат ингибирует активность фермента хозяина - инозинмонофосфат дегидрогеназы (IMPDH), что снижает внутриклеточные запасы гуанозинтрифосфата и тем самым опосредованно угнетается синтез нуклеиновых кислот вируса. Во-вторых, он может нарушать синтез РНК с последующим нарушением транскрипции вируса. В-третьих, установлено прямое угнетающее влияние рибавирина на активность полимеразы вирусов. Показано, что рибавирин проникает в эритроциты, где его концентрация может превышать сывороточную примерно в 60 раз, что вызывает обратимую и дозозависимую гемолитическую анемию у значительной части больных [300]. Рибавирин характеризуется широким спектром противовирусного действия и эффективностью при заболеваниях, вызываемых ДНК- и РНКсодержащими вирусами (грипп, аденовирусные, герпетические инфекции, гепатиты А, В и С, геморрагические лихорадки) [3, 49, 126]. 67 Как было показано, в отношении многих флавивирусов, рибавирин проявлял противовирусную активность in vitro, но оказался не в состоянии защитить экспериментально инфицированных животных [306, 336, 338, 357, 406]. Кроме того, монотерапия рибавирином оказалась мало эффективной при лечении хронического гепатита С [413]. Однако сочетание рибавирина с пегилированным IFNα стало традиционной стандартной терапией пациентов с ХГС [254, 264]. Опубликованы сведения о клинической эффективности рибавирина в сочетании с рекомбинантным IFNα2 (интераль) в терапии острых и хронических форм КЭ [57, 144]. Таким образом, поиск и внедрение новых противовирусных препаратов высокоэффективных при флавивирусных инфекциях продолжает оставаться актуальным. Так, например, для преодоления гемолитической анемии, вызываемой рибавирином, исследователи уже разработали аналог рибавирина, новую категорию IMPDH ингибиторов. Одно из соединений – вирамидин продемонстрировало значительную противовирусную активность и эритроцитщадящие свойства и в настоящее время находится в 3-ей фазе клинических испытаний. Еще один активный аналог merimepodip проходит 2 фазу испытаний [282]. - Интерфероны Наиболее важными свойствами IFN являются их способность оказывать прямое противовирусное действие, а также участвовать в регуляции иммунных процессов. Сочетание этих свойств служит основанием для широкого применения интерферонов в качестве лечебных препаратов. В настоящее время десятки фармацевтических фирм производят широкий перечень лекарственных форм препаратов IFN. Существующие медицинские препараты интерферонов делятся на природные человеческие лейкоцитарные IFN (первое поколение) и полученные с помощью методов генной инженерии рекомбинантные IFN (второе поколение). В последние годы отмечается стремительное расширение масштабов использования рекомбинантных IFN и 68 сокращение применения природных препаратов, что связано с дефицитом сырья (донорская кровь) для производства последних и с высокой стоимостью конечного продукта [36]. Наиболее широко испытаны различные лекарственные формы природных и рекомбинантных IFNα, опыт, клинического использования которых насчитывает более 30 лет. Для IFNα противовирусная активность является основной и наиболее детально изученной. Многолетнее клиническое применение этих препаратов позволяет говорить об их универсально широком диапазоне антивирусных эффектов и возможности использования их при самых различных вирусных инфекциях. При флавивирусных инфекциях эффективность терапии препаратами IFNα изучали многие исследователи. На моделях in vitro и in vivo было показано, что применение IFNα приводит к снижению вирусной нагрузки и смертности при инфицировании разными флавивирусами [191, 195, 219, 336]. Кроме того, было показано нейропротекторное действие IFNα/β на модели нейрональных клеток, инфицированных WNV [424]. Терапия препаратами IFNα2b снижала неврологические осложнения у людей в случае энцефалитов, вызванных вирусами St. Louis и WNV [220, 267, 475]. Назначение IFNα2а детям, инфицированным JEV, улучшило исход заболевания [335]. В комплексной терапии КЭ использовались препараты IFNα как человеческие лейкоцитарные, так и рекомбинантные. Так, О.Ю. Устиновой (1996) было показано, что включение препаратов IFNα2b (реаферона и виферона) в комплексную терапию пациентов с менингеальной формой КЭ сокращает продолжительность и выраженность основных клинических симптомов болезни. В то же время автор отмечает, что назначение этих препаратов пациентам с очаговыми формами КЭ хоть и увеличивало продолжительность жизни больных, однако не предотвращало наступления летального исхода. В настоящее время прошел клинические испытания, и с 2011 года разрешен к применению в составе комплексной терапии КЭ отечественный препарат «Реаферон-ЕС-Липинт», являющийся липосомальным пероральным 69 рекомбинантным IFNα2b. Авторами [108, 123] было показано, что терапия Реаферон-ЕС-Липинтом у пациентов с лихорадочной и менингеальной формой КЭ сокращает продолжительность лихорадочного периода, предупреждает развитие двухволнового течения КЭ, препятствует хронизации процесса. Однако при анализе итогов клинических испытаний интерферонов было отмечено, что уровень лечебного действия этих препаратов оказался ниже того, который можно было бы ожидать из представлений, основанных на экспериментальных данных, полученных in vitro и in vivo [343]. Это можно объяснить тем, что эффект интерферонотерапии оказался зависим от многих факторов: от вида и тяжести течения инфекции, от индивидуальной чувствительности к IFN, от доз, частоты, продолжительности, путей введения препарата, сочетания его с другими био- и химиопрепаратами [36]. Кроме того, к другим недостаткам интерферонотерапии относят высокую стоимость препаратов, широкий длительность терапии, перечень противопоказаний наличие побочных к ее эффектов. назначению, Это создает необходимость поиска новых эффективных безвредных средств, в том числе с иммуномодулирующей активностью. 3.2.Препараты, обладающие иммуномодулирующими и противовирусными свойствами - Индукторы интерферонов Способностью индуцировать IFN обладают различные соединения, многие вирусы и микроорганизмы, продукты из них, природные полифенолы и широкий круг синтетических представляют собой весьма соединений. Созданные многочисленное индукторы семейство высоко- IFN и низкомолекулярных природных и синтетических соединений, единичные представители которого отобраны для терапевтического использования. Следует особо интерферона подчеркнуть, разработаны что все наиболее известные индукторы отечественными учеными (коллектив под 70 руководством Ф.И.Ершова лаборатории онтогенеза вирусов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН). Изучение специфической активности таких индукторов обнаружило их важнейшее свойство – широкий диапазон антивирусной активности. Помимо противовирусного этиотропного действия практически все они обладают, подобно IFN, выраженной иммуномодулирующей активностью, что позволяет отнести их к бифункциональным препаратам [421]. Использование индукторов интерферона различной природы показало, что их активность во многом совпадает с ранее выявленной активностью препаратов IFN, но индукторы интерферона имеют ряд преимуществ перед ними:1) не имеют побочных эффектов, наблюдаемых при передозировке препаратов IFN; 2) не требуется многократного введения [37] . Исследования (in vitro и in vivo) противовирусной активности индукторов интерферона при флавивирусных инфекциях проводились некоторыми зарубежными авторами [245, 266, 338, 345]. Отечественными учеными при инфекциях, вызванных флавивирусами, в том числе и при ВКЭ, была изучена экспериментальная и клиническая эффективность целого ряда низко- и высокомолекулярных природных и синтетических индукторов интерферона: циклоферона, ридостина, кагоцела, 4-йодантипирина [34, 61, 131, 168, 171]. - Циклоферон (меглюмина акридонацетат) – российский низкомолекулярный индуктор интерферона. Механизм действия препарата заключается в его способности индуцировать образование эндогенных IFNα/β в высоких титрах, сохраняющихся в течение 3-х суток, что и определяет широкий спектр его биологической активности (противовирусной, иммуномодулирующей, противовоспалительной) [133]. Препарат обладает как прямым, так и опосредованным действиями на различные звенья иммунитета. Иммуномодулирующий эффект циклоферона выражается в стимуляции стволовых клеток костного мозга, активации Мф и их миграции в ткани, активации и завершенности фагоцитоза. Воздействие циклоферона на Т- 71 клеточный иммунитет, выражающееся в нормализации субпопуляций Тлимфоцитов, повышении активности NK-клеток и CTL, осуществляется, скорее всего, не непосредственно этим препаратом, а индуцированным им эндогенным IFN. Циклоферон стимулирует также и гуморальный иммунитет, что проявляется в увеличении концентрации высокоавидных антител [37, 161]. Циклоферон активен в отношении многих вирусов: КЭ, гриппа, гепатита, герпеса, цитомегаловируса, папилломы, различных вируса иммунодефицита энтеровирусов. Ряд человека, авторов вируса показали, что использование циклоферона в комплексной терапии пациентов с лихорадочной и менингеальной формами КЭ приводит к более быстрому купированию клинических симптомов заболевания, сокращению сроков лечения в стационаре, коррекции иммунологических показателей и предупреждает развитие двухволнового течения [130, 133]. - 4-йодантипирин (1-фенил-2,3-диметил-4-йодпиразолон) – индуктор интерферона, синтезированный в Томском политехническом университете [136], разрешенный, как и вышеперечисленные препараты, Минздравом РФ к медицинскому применению в качестве противовирусного препарата для лечения и профилактики КЭ. Точный механизм действия 4-йодантипирина пока не установлен. Однако в результате исследований были выявлены его интерфероногенные и противовоспалительные свойства. Установлено, что 4-йодантипирин не прямо, а опосредовано усиливает продукцию эндогенных IFNα/β, вероятно, за счет своей способности подавлять синтез простагландинов, которые оказывают ингибирующее действие на продукцию интерферонов. В экспериментах in vitro и in vivo было показано, что препарат способен подавлять репродукцию ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов. 4-йодантипирин оказывает стабилизирующий эффект на биологические мембраны, что может также обусловливать торможение проникновения вируса в клетку. Иммуномодулирующее действие препарата обусловлено индукцией синтеза 72 вируснейтрализующих антител и стимуляцией клеточного иммунитета - зрелых Т- лимфоцитов, NK-клеток [54, 85, 95, 120]. Установлено, что применение 4-йодантипирина в комплексной терапии КЭ снижало продолжительность лихорадочного периода, длительность субфебрилитета и общеинфекционных проявлений, а также сроки пребывания в стационаре, реже наблюдался постинфекционный астенический синдром [137]. Таким образом, к настоящему времени индукторы интерферона заняли достойное место в комплексной терапии вирусных инфекций как противовирусные препараты и корректоры иммунитета, обеспечивающие эффективное завершение терапии и предотвращение хронизации инфекционного процесса и его рецидивы. Одним из вероятных подходов к коррекции иммунных нарушений у пациентов с флавивирусными инфекциями может явиться включение в комплексную терапию новых эффективных и безвредных иммуномодуляторов, в том числе и природного происхождения. 3.3.Иммуномодуляторы природного происхождения Известно, что около половины всех имеющихся на настоящий момент лекарственных средств разработаны на основе соединений, имеющих природное происхождение. С этой целью традиционно использовались высшие растения, и до сих пор почти все используемые в лечебных целях природные продукты или их производные были получены из наземных организмов [394]. Однако в мировом океане имеется огромное количество биоресурсов, содержащих биологически активные вещества (БАВ). Исследования последних лет показали, что многие из морских естественных соединений являются структурно уникальными, отсутствуют у наземных организмов и часто превосходят аналоги наземного происхождения по биологической или фармакологической активности [11, 32, 405]. Анализ этих работ показывает, что наиболее интересными источниками фармакологически активных 73 соединений являются морские беспозвоночные (губки, моллюски, асцидии) и водоросли [11, 42, 291]. В России изучением биологически активных веществ морских гидробионтов наиболее активно занимаются в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН (ТИБОХ), Тихоокеанском научно- исследовательском рыбохозяйственном центре (ТИНРО-центре) и НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Был исследован целый ряд соединений морского происхождения (белков, полисахаридов, пептидов, полифенолов и др.), обладающих высокой биологической, в том числе, иммуномодулирующей активностью и создана основа для конструирования оригинальных иммуномодуляторов. В настоящей работе для изучения противовирусной активности биополимеров из морских гидробионтов, разработанных в вышеперечисленных институтах, особое внимание было уделено исследованию тинростима комплекса пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister, и люромарина – полифенольного комплекса, выделенного из морских трав семейства Zosteraceae (Zostera marina и Zostera asiatica). Выбор представленных выше биополимеров определялся тем, что эти вещества обладают широким спектром биологического действия, позволяющим рассматривать их как потенциальные объекты для будущих лекарств. Важным обстоятельством являлось и то, что тинростим уже выпускается в виде биологически активной добавке к пище и используется практическими врачами в качестве средства сопровождения базисной терапии при некоторых заболеваниях [10, 60, 125]. Изучение пептидов, выделенных из природных источников и обладающих высокой биологической, в том числе, иммуномодулирующей активностью, является одним из перспективных направлений в иммунофармакологии. Иммунорегуляторными пептидами первого поколения были лекарственные средства, представляющие комплекс пептидов, 74 экстрагированных из тимуса (тактивин, тималин, тимоптин, тимактид и др.), костного мозга (миелопид), эпифиза (эпиталамин), простаты (простатилен) [11, 87, 92]. Трудность стандартизации препаратов первого поколения привела к созданию синтетических препаратов второго и третьего поколения (тимоген, тимопентин, иммунофан, спленин) и низкомолекулярных иммуномодулирующих олигопептидов (гепон, глутоксим и аллоферон) [155, 156]. С самого начала истории изучения пептидов они нашли достаточно широкое применение в инфекционной патологии и, в частности, при вирусных инфекциях. К настоящему времени накоплен большой опыт клинического использования таких классических иммунокорректоров пептидной природы, как тактивин, тималин, тимоптин и др., которые широко применяются в комплексной терапии герпесвирусной инфекции, гепатите, гриппе и ОРВИ и др. [12, 33]. Цикл работ дальневосточных ученых посвящен результатам получения и изучения пептидов иммуномодулирующего действия из костного мозга морских млекопитающих [104], из молок лососевых рыб выделен полипептидный препарат молокин [62]. Из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister выделен Иммуномодулирующие комплекс свойства этого пептидов – пептидного тинростим [106]. соединения были исследованы А.К. Гажа (1994), Н.Н. Беседновой (2004), Т.С. Запорожец (2006). Установлено, что тинростим стимулирует гуморальный иммунный ответ, фагоцитоз, оказывает активирующее воздействие на ферменты антиоксидантной системы, проявляет апоптозрегулирующую активность. Кроме того, тинростим влиял на перекисное окисление липидов, реакции сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, обладал противовоспалительными свойствами [125]. Учитывая иммуномодулирующие свойства тинростима, представляется важным исследовать его противовирусную активность в отношении вируса КЭ и обосновать целесообразность его применения в комплексной терапии КЭ. 75 Другим классом природных соединений, обладающих широким спектром биологической активности, являются растительные полифенолы. В лаборатории биотехнологии ТИБОХ ДВО РАН был выделен из морских трав семейства Zosteraceae (Z. marina и Z. asiatica) полифенольный комплекс «люромарин», состоящий из розмариновой кислоты (45%), дисульфата лютеолина (45%) и лютеолина (10%) [74, 127]. Ранее установлено, что полигидроксилированный фенол розмариновая кислота и флавон лютеолин, имеющие широкое распространение среди пищевых и лекарственных растений, являются биологически активными веществами с разносторонним спектром действия [268, 473, 480]. В настоящее время установлено, что основные фармакологические эффекты розмариновой кислоты и лютеолина связаны с высокой антиоксидантной и противовоспалительной активностью, а также с модуляцией функциональной активности иммунокомпетентных клеток [199, 276, 342, 434]. Важно подчеркнуть, что эти соединения хорошо абсорбируются кожей и всасываются из желудочно-кишечного тракта в кровь. Розмариновая кислота и лютеолин обладают активностью в отношении вирусов герпеса, гриппа, кори и болезни Ньюкастла [198, 302]. Исследования J. Ghosh et al. (2007) показали, что розмариновая кислота обладает высокой противовирусной активностью при полифенольный инфицировании мышей JEV. Было установлено, что комплекс кардиопротекторным, «люромарин» обладает противовоспалительным и антиоксидантным, гепатопротекторным действием [74, 117]. Авторы предполагают, что розмариновая кислота, лютеолин и его сульфатированные формы в составе комплекса «люромарин» вероятно выступают как лиганды PPAR (группа ядерных факторов транскрипции) и играют роль в уменьшении проявлений патологий, связанных с метаболическим синдромом [118, 402]. На основе этих соединений и их композиций предполагается создание новых БАД и лекарственных средств. В этой связи представляло интерес изучить активность этого комплексного соединения в отношении вируса КЭ. 76 *** Таким образом, анализ литературных данных позволяет заключить, что, несмотря на значительное число исследований по флавивирусов с различными звеньями иммунной взаимодействию системы, механизмы модуляции этими вирусами гуморальных и клеточных факторов врожденного и адаптивного иммунитета исследованы недостаточно. Так, данные литературы о состоянии иммунной системы при манифестных формах КЭ фрагментарны, что не позволяет составить целостного представления о роли изменений функционирования иммунной системы организма в патогенезе формирования вирусной инфекции. Выявление прогностически значимых иммунопатогенетических маркеров риска, характеризующих тяжесть течения и исход заболевания, является мало разработанным разделом исследований. Практически полностью отсутствуют исследования, касающиеся состояния гуморального и клеточного врожденного иммунитета и цитокиновой системы на раннем этапе инфицирования вирусом КЭ и поиска иммунологических маркеров, организме. характеризующих Отсутствуют сравнительному изучению длительную данные персистенцию о проведении особенностей возбудителя исследований функционирования в по иммунной системы пациентов с КЭ в группах невакцинированных и вакцинированных против этой инфекции лиц. Следует подчеркнуть, что в литературе нет данных о клинически бессимптомных случаях КЭ инфекции, при которых заболевание было предотвращено анамнестическим иммунным ответом на основе предыдущей вакцинации. Между тем, изучение неудач вакцинации имеет большое значение для мониторинга и оценки воздействия иммунизации на организм, а также для оценки эффективности вакцины и для возможных изменений в рекомендуемых схемах вакцинации. Поскольку лечение пациентов с КЭ должно быть комплексным, включающим использование средств патогенетической терапии в сочетании с противовирусными и 77 иммуномодулирующими препаратами, то поиск и применение новых препаратов природного происхождения представляется перспективным. Этим важнейшим вопросам посвящена настоящая работа, в которой при комплексном исследовании состояния иммунной системы пациентов с КЭ, сделан акцент на сравнительном изучении особенностей функционирования этой системы у невакцинированных и вакцинированных против этой инфекции лиц. 78 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 4. Материалы и методы исследования Экспериментальные и клинико-лабораторные исследования проведены на базе лабораторий клещевого энцефалита и иммунологии ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» СО РАМН. Отдельные разделы работы выполнены в комплексе с лабораторией биотехнологии ФГБУН Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Центром по борьбе с клещевым энцефалитом в Приморском крае и инфекционным отделением краевой клинической больницы № 2. Все экспериментальные и клинические исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» СО РАМН (протокол №1от 03.02.2008 г). 4.1 Материалы исследования 4.1.1 Характеристика клинического материала В настоящей работе приведены результаты комплексного клиниколабораторного обследования пациентов с клещевым энцефалитом, наблюдавшихся в период 2008-2012 гг. Было обследовано 252 человека (141 мужчин и 111 женщин). Критериями включения пациентов в исследование явились: возраст от 18 до 60 лет, верифицированный диагноз клещевого энцефалита (инаппарантная, лихорадочная и очаговые формы) и отсутствие сопутствующих других клещевых инфекций. Критериями исключения пациентов из исследования были: системные инфекционные заболевания и обострения хронических воспалительных процессов другой этиологии, сахарный диабет, онкологические заболевания. 79 Контрольную группу составили 25 здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту (14 мужчины и 11 женщин в возрасте от 20 до 55 лет). Диагнозы инаппарантной и манифестных форм клещевого энцефалита устанавливали на основании клинико-эпидемиологических данных и результатов специфического обследования (наличие антигена вируса и вирусспецифических антител классов IgM и IgG). Кроме того, все пациенты были обследованы на наличие иксодовых клещевых боррелиозов (ИКБ) путем выявления в ИФА антител классов IgM и IgG. Пациенты с диагнозом ИКБ не были включены в анализируемые нами группы больных. В зависимости от диагноза клещевого энцефалита обследованные пациенты были разделены на две группы: первую группу составили 185 пациентов без клинических проявлений заболевания, вторую – 67 больных с манифестными формами КЭ (рис.1). Обследование проводили до назначения специфической противовирусной и иммунокорригирующей терапии. А) Пациенты с антигенемией ВКЭ без клинических проявлений инфекции В обследование были включены 185 человек (91 мужчин и 94 женщин), у которых на 2 – 4 сутки после укуса клеща в крови был выявлен антиген вируса КЭ (рис.1). Обследованные лица, у которых на 2-4 сутки в крови был обнаружен антиген вируса КЭ, повторно обследованы через 1 месяц и при необходимости через 6 и более месяцев. Пациенты, у которых через 1 месяц антиген ВКЭ не обнаруживали, были отнесены к I группе (лица с кратковременной антигенемией). Ко II группе были отнесены пациенты с длительным (более 6 месяцев) бессимптомным носительством антигена вируса (лица с длительной антигенемией). Все обследованные пациенты в этих группах подразделялись на непривитых и привитых против КЭ. Невакцинированные лица с жалобами на укус клеща после обнаружения специфического антигена получали однократно профилактическую дозу 80 (1мл/10 кг массы тела) противоклещевого иммуноглобулина согласно санитарно–эпидемиологическим правилам «Профилактика клещевого вирусного энцефалита» [135], вакцинированным лицам противоклещевой Пациенты с клещевым энцефалитом (n=252) Пациенты с манифестными формами КЭ (n=67) Пациенты с антигенемией ВКЭ (без клинических проявлений) (n=185) Пациенты с кратковрем. антигенемией (n=144) Невакц. (n=93) Пациенты с длител. антигенемией (n=44) Невакц. (n=30) Вакц. (n=51) Вакц. (n=11) Пациенты с лихорад. формой (n=45) Невакц. (n=28) Вакц. (n=17) Пациенты с очаг.формами (благ.исход) (n=16) Невакц. (n=16) Вакц. (n=0) Пациенты с очаг.формами (летал.исход) (n=6) Невакц. (n=6) Вакц. (n=0) Рисунок 1. Группы пациентов с клещевым энцефалитом, включенные в обследование иммуноглобулин не вводили. Венозную кровь для иммунологических и вирусологических исследований забирали дважды: первый раз - на 2 – 4 сутки после укуса клеща, до введения противоклещевого иммуноглобулина и второй раз - через месяц. Б) Пациенты с манифестными формами КЭ 81 Было обследовано 67 пациентов (50 мужчин и 17 женщин), находившихся на стационарном лечении в больницах Приморского края, с манифестными (лихорадочной и очаговыми) формами КЭ (рис.1). Диагноз клещевого энцефалита (рубрика А 84.0 по МКБ 10) в остром периоде заболевания (3–9 сутки) верифицировали на основании данных оценки неврологического статуса, определения уровня вирусспецифических антител класса IgM и IgG. Выделено 3 группы: 1 группа – пациенты с лихорадочной формой КЭ средней тяжести (невакцинированные и вакцинированные против КЭ), 2 группа – пациенты с очаговыми формами КЭ с благоприятным исходом, 3 группа – пациенты с очаговыми формами КЭ с летальным исходом. Для иммунологических и вирусологических исследований использовали венозную кровь пациентов, взятую в острый период (первая неделя) заболевания. 4.1.2 Характеристика лабораторных животных Экспериментальные исследования выполнены на 480 мышах линии BALB/c (гаплотип Н-2d), а также на 1660 неинбредных мышах, полученных из питомника РАМН “Столбовая”, находившихся на стандартной диете в боксированных помещениях. Возраст животных-самцов составил 2-3 месяца, масса 10-12 г. Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам международных и биологической российских нормативных этики, изложенным документах по в защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах [122, 270]. Работа одобрена Этическим комитетом ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии» СО РАМН (протокол № 5 от 05.11.2007 г.). 4.1.3 Региональные штаммы вируса КЭ Для изучения взаимодействия штаммов вируса КЭ с иммунокомпетентными клетками и для исследования противовирусной 82 активности препаратов были использованы региональные (дальневосточные) штаммы вируса КЭ - Dal´negorsk (Dal), Kiparis-94 (Kip-94), Primorye-196 (P196), изолированные сотрудниками лаборатории клещевого энцефалита НИИЭМ СО РАМН из разных источников в разных районах Приморского края. Штамм Dal был выделен из мозга умершего больного с очаговой формой КЭ в высокоэндемичном Дальнереченском районе Приморского края в 1973 г. Штамм Kip-94 изолирован из лейкоцитов крови больного с лихорадочной формой КЭ, заражение которого произошло в Надеждинском районе края в 1997 году. Штамм P-196 выделен из лейкоцитов крови человека с инаппарантной формой КЭ, инфицирование которого произошло на территории бухты Лазурной Приморского края. В работе использованы 5-6 пассажи этих штаммов вируса КЭ на мышах двухсуточного возраста. 4.1.4 Культура клеток Титрование штаммов, реакцию нейтрализации и определение противовирусной активности препаратов in vitro проводили на перевиваемой культуре клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ). В качестве среды роста клеток использовали среду 199 с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и 100 ЕД/мл гентамицина. В качестве поддерживающей среды для клеточной культуры использовали ту же самую смесь, но с добавлением 1% сыворотки и гентамицина. 4.1.5. Исследуемые препараты Изучена противовирусная активность люромарина и тинростима - биополимеров из морских гидробионтов, обладающих высокой биологической, в том числе, иммуномодулирующей активностью. Выделение, изучение химического состава и структуры биополимеров из морских гидробионтов проведены в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН (люромарин) и ФГУП Тихоокеанском рыбохозяйственном научном центре (тинростим) с применением современных методов. 83 Люромарин - полифенольный комплекс, выделенный из морских трав семейства Zosteraceae (Zostera marina и Zostera asiatica) А.М. Поповым с соавт.[74, 107, 117], содержит розмариновую кислоту (45%), дисульфат лютеолина (45%) и лютеолин (10%). Метод выделения – экстракция морских трав семейства Zosteraceae 96% этиловым спиртом и очистка целевого продукта на гидрофобном сорбенте [74, 107]. Тинростим - комплекс пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister Л.М. Эпштейном с соавт. [106], содержит 84% низкомолекулярных пептидов молекулярной массой от 1 до 12,5 кДа и >16% свободных аминокислот, представленных, в основном, аспарагиновой, глутаминовой кислотой и лизином. Около 10% от общего количества свободных аминокислот составляет таурин [106]. Пептидные компоненты представлены несколькими пептидными фракциями, состоящими из 17 аминокислот с преобладанием аспарагиновой и глутаминовой кислот (их сумма составляет 37,5% общего количества аминокислот). Метод выделения экстракция водорастворимых последующим извлечением пептидов их с в слабокислых растворах использованием с ступенчатой ультрафильтрации, позволяющей разделять и концентрировать пептидные компоненты в зависимости от молекулярной массы [106]. Для сравнительной оценки эффективности люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ были использованы официнальные препараты, применяемые в клинике для лечения КЭ: - рибавирин – синтетический аналог нуклеозидов (ЗАО «Вертекс», СанктПетербург); - противоклещевой иммуноглобулин – антитела против клещевого энцефалита класса IgG, титры не менее 1:80 (НПО «Микроген», Хабаровск); - реаферон-ЕС – рекомбинантный альфа-2b-интерферон (ЗАО «ВекторМедика», Новосибирск); 84 - циклоферон - метилглюкамина акридонацетат (ООО НТФФ «Полисан», Санкт-Петербург); - 4-йодантипирин - 1-фенил-2,3-диметил-4-йодпиразолон (ООО «НТМ», Томск). 4.2.Методы исследований Все направления, методы и объем проведенных исследований представлены в таблице 1. Таблица 1 Направления, методы и объем исследований № I II III Объем Методы исследования исследований Клинико1.Анкетирование пациентов 252 чел. лабораторные 2.Комплексное клиническое обследование 252 чел. исследования пациентов с антигенемией ВКЭ и больных КЭ в динамике 3.Клинический анализ крови, оценка лейко- 530 проб грамм, определение ЛИИ [147, 148] Маркерная 1. Выявление антигена ВКЭ в лейкоцитах 420 проб диагностика КЭ крови лиц с укусом клеща в ИФА [105] 2.Определение вирусспецифических антител 336 проб класса IgG и IgM в сыворотке крови пациентов с ВКЭ в ИФА 3. Определение авидности вирусспецифичес- 336 проб ких антител класса IgG [58] 4.Исследование вируснейтрализующих анти- 185 проб тел в сыворотке крови обследованных лиц (на культуре клеток СПЭВ) [25] Исследование 1. Определение субпопуляционного состава 530 проб показателей лимфоцитов периферической крови методом иммунного проточной цитометрии (FACSCalibur, BD) с статуса использованием мАТ к CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25, CD95, HLA-DR (Beckman Coulter) [124, 431] Направление исследования 85 IV V Исследование показателей цитокинового статуса Исследование влияния штаммов ВКЭ на функциональную активность иммунокомпетентных клеток ex vivo и in vitro 2.Исследование основных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови (IgG, IgM, IgA) методом радиальной иммунодиффузии [182] 3. Определение концентрации подклассов иммуноглобулина IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) в сыворотке крови методом твердофазного ИФА с использованием тестсистем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) 4. Исследование концентрации компонентов комплемента (С1-инг, C3, C3a, C4, C5, C5a) в сыворотке крови методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) 5. Определение уровня и размеров ЦИК в сыворотке крови [28, 143] 1. Исследование концентрации цитокинов в сыворотке крови методом твердофазного ИФА с помощью диагностических наборов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) 2. Определение продукции цитокинов в культурах клеток цельной крови [259] методом твердофазного ИФА с использованием диагностических тест-систем ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург). 1. Исследование динамики накопления штаммов ВКЭ в супернатантах клеток цельной крови и культуры мононуклеарных клеток крови (титрование на культуре клеток СПЭВ) 2.Определение динамики накопления штаммов ВКЭ в лейкоцитах донорской крови (в реакции НМФА) [25] 3. Исследование экспрессии активационных и адгезионных маркеров на иммунокомпетентных клетках донорской крови методом проточной цитометрии (FACSCalibur, BD) с использованием мАТ к CD45, CD14, CD3, 530 проб 530 проб 530 проб 530 проб 530 проб 530 проб 390 проб 120 проб 120 проб 86 VI Исследование особенностей патогенеза экспериментального КЭ, обусловленного разными штаммами ВКЭ VII Исследование противовирусной активности БАВ из морских гидробионтов при КЭ (in vitro и in vivo) CD4, CD8, CD56, CD11b, CD54, CD69, CD25, CD95 (Beckman Coulter) [124, 431] 4. Определение продукции цитокинов в 270 проб культуре мононуклеарных клеток крови методом твердофазного ИФА с использованием диагностических тест-систем ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) 1. Исследование выживаемости и динамики 480 накопления вируса в крови и мозге мышей мышей линии BALB/c, инфицированных разными линии штаммами ВКЭ BALB/c 2. Определение продукции цитокинов в 960 проб сыворотке крови и супернатантах гомогенатов мозга мышей линии BALB/c методом твердофазного ИФА с использованием тестсистем производства «R&D Systems» 1. Исследование цитотоксичности и 380 проб ингибирующей активности исследуемых препаратов по отношению к вирусу КЭ на культуре клеток СПЭВ [134] 2. Определение протективного действия пре1660 паратов при экспериментальном КЭ [134] неинбредных мышей I. Верифицирование диагноза КЭ 4.2.1 Выявление антигена вируса КЭ в крови пациентов с ВКЭ Для выявления антигена вируса КЭ в лейкоцитах крови использовали экспресс-диагностику КЭ [105] при помощи иммуноферментной тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Учет результатов проводили по уровню оптической плотности (ОП), измеряемой при 450 нм на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США). Уровень антигенемии оценивали по показателю коэффициента (К): К = ОП исследуемой пробы / ОП контроля. 87 4.2.2 Определение вирусспецифических антител класса IgG и IgM в сыворотке крови пациентов с ВКЭ Вирусспецифические антитела класса IgG и IgM определяли в сыворотке крови обследованных лиц методом твердофазного ИФА с использованием тестсистем «ВектоВКЭ-IgG» и «ВектоВКЭ-IgM» («Вектор-Бест», Новосибирск). Постановку реакции проводили согласно инструкции к наборам. Учет результатов проводили по оптической плотности на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. Зависимость ОП от концентрации антител IgG к вирусу КЭ определяли путем построения калибровочной кривой и выражали в титрах. Для интерпретации результатов исследования содержания антител IgM к вирусу КЭ использовали коэффициент позитивности (КП): КП = ОП исследуемой пробы / ОП крит. ОП крит.=ОП ср.К- +0,2, где ОП ср.К - среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контрольным образцом . 4.2.3 Авидность вирусспецифических антител класса IgG Для определения авидности антител класса IgG в сыворотке крови обследуемых лиц применяли модифицированный вариант ИФА, выполняемый на серийно выпускаемых тест-системах «ВектоВКЭ - IgG», производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Модификация иммуноанализа заключалась в следующем: пробы сыворотки, разведенные 1:100, помещали в дубликатах в лунки стрипов с иммобилизованными антигенами. После инкубации при 37°С в течение 1 ч планшеты отмывали пятикратно раствором фосфатно-солевого буфера (рН 7,2), содержащего 0,1% Tween 20 (ФСБ-Т). Затем половину лунок заполняли ФСБ-Т, а другую - раствором детергента. В качестве денатурирующего агента использовали раствор мочевины с концентрацией 8 моль/л в ФСБ-Т. Через 15 мин планшеты двукратно отмывали раствором ФСБ-Т и далее анализ проводили в соответствии с инструкцией к тест-системе [58]. 88 Индекс авидности (ИА) антител в пробах сыворотки крови рассчитывали для положительных проб как отношение величины ОП образца, полученной при проведении анализа с добавлением раствора денатурирующего агента (ОПмоч), к величине ОП, полученной без его добавления (ОПбез моч) и выражали в %: ИА = ОПмоч х 100% / ОПбез моч Значения ИА 50% и более указывали на то, что в сыворотках крови содержатся авидные антитела, менее 50% - неавидные антитела [58]. 4.2.4 Определение вируснейтрализующих антител в сыворотке крови обследованных лиц Реакцию нейтрализации на перевиваемой культуре клеток СПЭВ использовали для определения вируснейтрализующих антител в сыворотках крови обследованных. Учет результатов проводили по цитопатическому эффекту [25]. Для постановки реакции готовили двукратные разведения предварительно прогретых до 56°С исследуемых сывороток крови, а также выбирали рабочую дозу регионального штамма Dal вируса КЭ, содержащую 2 lg ТЦД50 вирусной суспензии. Затем соединяли равные объемы каждого разведения исследуемой сыворотки и рабочей дозы вируса КЭ и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С. После чего этой смесью заражали суточный монослой клеток СПЭВ в культуральных 24-хлуночных планшетах. Для контроля выбранной дозы вируса КЭ, в отдельные лунки планшета с культурой клеток СПЭВ вносили только рабочие разведения вируса. В дальнейшем из лунок удаляли смесь, которой заражали культуру клеток и добавляли среду поддержки. После этого планшеты инкубировали в СО2инкубаторе при 37°С 5-7 дней под контролем цитопатического действия вируса. За титр нейтрализующих антител принимали предельное разведение сыворотки крови, которое подавляло цитопатогенное действие вируса на 50%, по сравнению с контролем вируса. 89 II. Общеклинические методы исследования 4.2.5 Общий клинический анализ крови Определение общего количества лейкоцитов и подсчет их отдельных морфологических форм проводили стандартными гематологическими методами [147]. Для оценки степени интоксикации и в качестве косвенного признака состояния иммунной системы использовали лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ), который рассчитывали по показателям клинического анализа крови по формуле: ЛИИ= (S+2P+4M) /(C+L)(E+1) [148], где обозначено количество: S-сегментоядерных нейтрофилов, Р- палочкоядерных нейтрофилов, М-миелоцитов, С-моноцитов, L-лимфоцитов, Еэозинофилов. Показатели ЛИИ оценивали следующим образом: от 0,5 до 2,0 усл. ед. удовлетворительная функция; от 2,1 до 7,0 усл. ед. - компенсированная недостаточность; от 7,1 до 12,0 усл. ед. - декомпенсированная недостаточность [148]. III. Иммунологические исследования 4.2.6 Проточная цитометрия (FACS-анализ) Определение популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов крови обследованных пациентов, а также исследование экспрессии адгезионных и активационных маркеров на поверхности иммунокомпетентных клеток в пробах крови, инфицированной ex vivo штаммами ВКЭ, проводили с использованием моноклональных антител (мАТ) против соответствующих антигенов [124, 431]. Оценку уровня экспрессии мембранных молекул осуществляли стандартным методом двух- или трехцветного иммунофлюоресцентного окрашивания цельной крови с использованием коммерческих лизирующего/фиксирующего (FACS Lysing Solution, Becton Dickinson) и 90 оптимизированного фосфатно-солевого буфера для клеток крови (CellWash, Becton Dickinson) и панели мАТ (Beckman Coulter) согласно инструкции производителя. В настоящей работе были использованы следующие мАТ к молекулам CD45-FITC/CD14-PE, CD3-FITC, CD4-FITC, CD8-FITC, CD16-FITC, CD14FITC, CD56-FITC, CD19-PE, CD(16+56)-PE, CD4-PE, CD8-PE, CD54-PE, CD69-PE, CD25-PE, CD95-PE, HLA-DR-PE, CD11b-PE, CD3-PC5 и соответствующие изотипические контроли. Цитофлюорометрию осуществляли на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), при этом в каждой пробе анализировали не менее 10000 клеток. Гейтирование субпопуляций гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов осуществляли по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию, NK-клеток – с помощью трехцветного анализа по параметрам CD16 или CD56 в зоне CD3-негативных лимфоцитов. Данные анализировали, используя программное обеспечение CellQuest Pro (Becton Dickinson) (рис.2). Рисунок 2. Распределение основных популяций лейкоцитов периферической крови по параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания. R1 популяция лимфоцитов; R2 - популяция гранулоцитов; R3 - популяция моноцитов. 91 Результаты моноцитов, анализа представлены экспрессирующих как процент лимфоцитов или исследуемые маркеры. Данные, характеризующие экспрессию CD11b, CD54 и CD69 на клетках, представлены в виде средней интенсивности флюоресценции популяции клеток (MFI), отражающей количество (плотность) рецепторов на клетке. 4.2.7 Определение основных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови (IgG, IgM, IgA) Исследование уровня IgG, IgM, IgA в сыворотке крови пациентов, инфицированных иммунодиффузии определение вирусом [182]. уровня КЭ, Для проводили достижения иммуноглобулинов методом радиальной сопоставимости результатов, проводили одновременно. Гепаринизированную венозную кровь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут, сыворотку отбирали, замораживали и хранили до использования при - 20°С. 4.2.8 Исследование концентрации подклассов иммуноглобулина IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) в сыворотке крови Уровень подклассов иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, определяли в сыворотке крови обследованных пациентов IgG4 методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем «Подклассы IgG» («ВекторБест», Новосибирск). Результаты регистрировали по уровню оптической плотности, измеряемой при 450 нм на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США). 4.2.9. Исследование концентрации ЦИК в сыворотке крови Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови пациентов, инфицированных вирусом КЭ, определяли методом селективной преципитации 3,75% раствором полиэтиленгликоля-6000 (ПЭГ6000) (Panreac sintesis, Испания) с последующим спектрофотометрическим измерением оптической плотности полученного преципитата в опытном и контрольном образцах [28]. Оптическую плотность образцов определяли на 92 спектрофотометре (СФ-26, Россия) при длине волны 450 нм. Разницу в оптической плотности опытной и контрольной проб, умноженную на 1000, считали показателем уровня ЦИК и выражали в условных единицах (усл. ед.). 4.2.10 Определение размеров ЦИК в сыворотке крови Способ заключается в использовании растворов ПЭГ-6000 разной концентрации для преципитации иммунных комплексов различной молекулярной массы [143]. Сыворотки крови обследуемых пациентов смешивали с 3% и 4% растворами ПЭГ-6000, инкубировали 18 часов при 4°С, после чего центрифугировали 20 минут в режиме 6000 об/мин при 4°С. Осадок растворяли в 2 мл 0,1 М раствора NaOH. На спектрофотометре (СФ-26, Россия) определяли оптическую плотность полученных растворов при длине волны 280 нм. Размер ЦИК оценивали по коэффициенту К=С1/С2, где С1 и С2 – концентрации иммунных комплексов, выделенных при преципитации, соответственно, 4% и 3% ПЭГ-6000. Комплексы считали крупными при К<1,1, при 1,1 <K<1,5 - ЦИК средних размеров, К>1,5 – ЦИК малых размеров. Величина коэффициента К косвенно характеризует размеры иммунных комплексов, преобладающих в исследуемой сыворотке. 4.2.11 Исследование концентрации компонентов комплемента в сыворотке крови Количественное определение компонентов комплемента (C1-ингибитор, C3, С3а, C4, C5, С5а) в сыворотке крови обследованных лиц проводили методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тестсистем ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) в соответствии с прилагаемой к наборам инструкцией. Результаты регистрировали по уровню оптической плотности, измеряемой при 450 нм на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США). 4.2.12 Исследование концентрации цитокинов А) Определение концентрации цитокинов (IL-8, IL-1b, IFNα, TNFα, IFNγ, IL-6, IL-4, IL-10) в сыворотке крови обследованных пациентов, а также 93 исследование уровня цитокинов (IL-8, TNFα, IFNα, IFNγ) в супернатантах культур мононуклеарных клеток проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) в соответствии с прилагаемой к наборам инструкцией. Б) Концентрацию цитокинов (TNFα, IL-6, IFNγ, IL-10) в сыворотке крови и супернатантах гомогенатов мозга мышей линии BALB/c определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем «R&D Systems» (США) согласно инструкциям производителя. Результаты регистрировали по уровню оптической плотности, измеряемой при 450 нм на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США). Концентрацию цитокинов определяли путем построения калибровочной кривой и выражали в пикограммах на мл. 4.2.13 Изучение способности клеток периферической крови пациентов к продукции цитокинов ex vivo Для определения продукции цитокинов в культурах интактных и митоген-индуцированных клеток периферической крови обследованных пациентов, гепаринизированную венозную кровь разводили в 3 раза стерильной средой RPMI 1640, содержащей 3% L-глутамина (Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина. Подготовленные таким образом образцы крови культивировали в круглодонных, стерильных пробирках в присутствии конканавалина А (КонА, Sigma, в конечной концентрации 10 мкг/мл), а также в отсутствии митогенной стимуляции. Культивирование проводили при 37°С в CO2-инкубаторе в течение 48 часов, затем центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, после чего отбирали супернатанты, замораживали и хранили до тестирования при -20°С [259]. Определение концентрации цитокинов (IL-8, IL-1b, IFNα, TNFα, IFNγ, IL6, IL-4, IL-10) в супернатантах осуществляли с помощью диагностических наборов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) методом твердофазного ИФА в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Учет результатов 94 производили на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США). Концентрацию цитокинов определяли путем построения калибровочной кривой и выражали в пикограммах на мл. IV. Вирусологические исследования 4.2.14 Титрование вируса на культуре клеток СПЭВ Цитопатическую активность региональных штаммов вируса КЭ изучали при титровании вируса на культуре клеток СПЭВ. Инфекционную активность штаммов вируса КЭ определяли путем заражения монослоя перевиваемой культуры клеток СПЭВ. Готовили десятикратные разведения суспензии изучаемого штамма вируса КЭ на питательной среде, которыми заражали (по 0,1мл) монослой клеток в культуральных 24-хлуночных планшетах. После этого планшеты инкубировали в термостате при 37°С в течение 1 ч. Затем удаляли вирус, а в лунки добавляли среду поддержки и инкубировали в термостате при 37°С 5-7 дней под контролем цитопатического действия вируса. За титр вируса принимали максимальное разведение вируса, при котором наблюдался цитопатический эффект и выражали в lg ТЦД50. 4.2.15 Титрование вируса КЭ на мышах Титры инфекционного вируса определяли на неинбредных мышах весом 6-8 г и мышах линии BALB/c весом 10-12 г. Для этого готовили десятикратные разведения вируссодержащего материала в среде 199 и заражали подкожно по 0,1 мл. Наблюдение за мышами проводили ежедневно, в течение 21 дня, регистрируя число павших животных. Титр вируса определяли по формуле L.J. Reed и Н. Muench (1938) и выражали в lg LD50. 4.2.16 Моделирование инфекции КЭ на мышах линии BALB/c Для моделирования инфекции мышей линии BALB/c весом 10-14 г заражали подкожно региональными штаммами вируса КЭ (Dal, Kip-94, P-196) в одинаковой инфицирующей дозе - 3 lg ТЦД50/0,2 мл. Животным контрольной группы вводили среду 199. Мышей, инфицированных штаммами вируса КЭ, разделяли на две подгруппы. Первые подгруппы (n=20 для каждого штамма) 95 служили для контроля летальности, которую оценивали по % погибших животных и средней продолжительности жизни. Животных 2-х подгрупп (n=80 для каждой группы) использовали для получения образцов сыворотки крови и мозга. На 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 21 сутки по 10 мышей, зараженных каждым из штаммов ВКЭ, умерщвляли, брали образцы мозга и крови, которые хранили при температуре - 80°С до использования. После размораживания половину каждого образца мозга гомогенизировали в 0,5мл раствора ФСБ (рН 7,2), центрифугировали 20 минут при 6000 об/мин, после чего отбирали супернатант. Образцы сыворотки крови и супернатанты гомогенатов мозга инфицированных мышей использовали для определения титров вируса КЭ (на культуре клеток СПЭВ) и для изучения динамики продукции цитокинов (в ИФА с использованием тест-систем «R&D Systems»). 4.2.17 Моделирование инфекции КЭ в пробах цельной крови доноров Свежую гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл) здоровых доноров (n=10) заражали вирусом КЭ путем внесения в пробы цельной крови штаммов Dal и P196 вируса КЭ в инфицирующей дозе 2 lg ТЦД50/0,1мл. В контрольных (без вируса) и опытных пробах, инкубированных в СО2-инкубаторе при 37°С, через 3, 6, 12 и 24 часа определяли накопление вируса в клетках и в супернатантах, а также оценивали экспрессию молекул адгезии и активации на поверхности клеток крови. 4.2.18 Моделирование инфекции КЭ в культуре мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров проводили с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколлверографина путем центрифугирования [160]. Цельную венозную гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл) доноров (n=10) инкубировали 40-60 мин при 37°С для отделения плазмы от эритроцитов. Слой плазмы наслаивали на градиент плотности фиколл-верографина («Pharmacia», плотностью 1,077 г/см3) и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Мононуклеарные клетки, 96 образовавшие питательной интерфазное средой кольцо, собирали RPMI-1640 и трехкратно («Вектор-Бест», отмывали Новосибирск), последовательно ресуспендируя и центрифугируя по 10 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, а оставшийся осадок ресуспендировали в среде RPMI-1640. Жизнеспособность выделенных мононуклеарных лейкоцитов, которую оценивали по окрашиванию клеток 0,5% раствором трипанового синего («Serva», США), составляла более 95%. Инфицирование культуры мононуклеарных клеток. Мононуклеарные лейкоциты разводили до концентрации 2,0x106клеток/мл средой RPMI-1640 и инфицировали штаммами (Dal, Kip-94, Р-196) вируса КЭ в одинаковой дозе 2 lg ТЦД50/1х106 клеток. Клетки инкубировали с каждым штаммом вируса в течение 1 часа при 37°С, после чего мононуклеарные лейкоциты трехкратно отмывали средой RPMI-1640 и культивировали в полной питательной среде: RPMI-1640 («Serva») с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma»), 2 мМ L-глутамина («ПанЭко») и 80 мкг/мл гентамицина («Pharmacia»). Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе при 37˚С в течение 5 сут. Для изучения динамики накопления штаммов вируса и продукции цитокинов в культуре мононуклеарных лейкоцитов, супернатанты отбирали на 3, 6, 12 час и 1, 2, 3, 4, 5 сут культивирования и хранили при температуре 80°С до использования. 4.2.19 Определение внутриклеточного накопления штаммов вируса КЭ в пробах цельной крови доноров (непрямой метод флюоресцирующих антител) Для постановки НМФА в качестве антигенов использовали региональные штаммы Dal и P-196 вируса КЭ, которыми в дозе 2 lg ТЦД50/0,1мл заражали пробы цельной крови, полученной от здоровых доноров (n=10). Инфицированные пробы крови инкубировали в CO2-инкубаторе при 37°С в течение 3, 6, 12, 24 часов, после чего из этих инфицированных клеток готовили слайды с последующей фиксацией клеток охлажденным ацетоном в течение 20 97 мин. Затем на клетки слайдов наносили в двукратных разведениях человеческую сыворотку, содержащую антитела класса IgG к вирусу КЭ в титре 1:800. Слайды инкубировали во влажной камере 1 час при 37°С, затем отмывали рабочим раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (рН 7,2) в течение 10 мин и высушивали при комнатной температуре. Затем на препараты наносили антивидовые флуоресцирующие иммуноглобулины против иммуноглобулинов человека («Медгамал» НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва). Препараты вновь инкубировали во влажной камере в течение 1 часа при 37°С, промывали рабочим раствором ФСБ (рН7,2) и просматривали в люминесцентном микроскопе. По конечному разведению сыворотки (титру сыворотки), при котором наблюдалось специфическое свечение антигена в клетках, судили о динамике накопления антигена ВКЭ в клетках донорской крови [25]. V. Исследование противовирусной активности препаратов 4.2.20 Определение противовирусной активности препаратов в культуре клеток СПЭВ Выявление противовирусной активности исследуемых препаратов в отношении вируса КЭ в опытах in vitro проводили на перевиваемой линии клеток почек эмбрионов свиней (СПЭВ). Клетки культивировали в 24луночных пластиковых панелях со средой 199, 10% сыворотки эмбрионов коров и 100 ЕД/мл гентамицина. Поддерживающая среда содержала эмбриональной сыворотки. Для оценки цитотоксичности 1% препаратов использовали односуточный монослой культуры клеток СПЭВ. Ростовую среду удаляли, после чего вносили свежую поддерживающую среду, содержащую различные концентрации исследуемых препаратов. Клетки культивировали в СО2-инкубаторе в течение 5 суток при 37°С. Результаты регистрировали по появлению цитодеструктивных изменений монослоя клеток. Контролем являлся монослой клеток, в который была внесена поддерживающая среда без препарата. В качестве показателя токсичности каждого препарата для данной 98 культуры клеток служила максимально переносимая концентрация (МПК), которая составляет ½ максимальной концентрации препарата, не оказывающей на клетки токсичного действия (по данным прижизненного морфологического исследования и нарушения поглощения клетками витального красителя) [134]. Для определения противовирусного действия препаратов монослой культуры клеток инфицировали 10-кратными разведениями штамма Dal вируса КЭ с инфекционным титром 107 ТЦД50/0,2 мл. Исследуемые препараты в различных концентрациях (опыт) или разводящую среду (контроль) вносили через 1 час после инфицирования клеток вирусом и инкубировали в СО 2инкубаторе в течение 5 суток. Противовирусный эффект препаратов рассчитывали по соотношению инфекционной активности вируса в опытных и контрольных образцах. Основными критериями оценки эффективности препаратов in vitro, являлись следующие общепринятые показатели [134]: снижение инфекционного титра вируса под воздействием препарата (∆, lg); коэффициент ингибирования (Ки, %) и химиотерапевтический индекс (ХТИ). Снижение уровня накопления вируса под влиянием препарата (∆, lg) определяли по формуле: ∆ = Ак – Ао, где Ак – уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата (lg ТЦД 50/мл); Ао - уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (lg ТЦД50/мл). Коэффициент ингибирования (КИ,%) рассчитывают по формуле: Ки = (Ак – Ао)/Ак •100%. За величину ХТИ принимали соотношение максимально переносимой концентрации (МПК) к минимально эффективной вирусингибирующей концентрации (МЭК) – концентрация препарата, снижающая титр вируса не менее чем на 2 lg ТЦИД50 [134]. 4.2.21 Определение протективной активности препаратов экспериментальной инфекции, вызываемой вирусом КЭ у мышей при 99 Для моделирования экспериментального КЭ использовали неинбредных мышей массой 10-12 г, которых инфицировали штаммом Dal вируса КЭ подкожно в дозе 100 LD50/0,2 мл. Животные получали исследуемые препараты через 1 час после заражения вирусом. В качестве контролей служила группа инфицированных вирусом КЭ мышей, не получавших препараты. Наблюдали за животными 21 день. Основными критериями оценки эффективности препаратов in vivo являлись [134] показатели летальности (отношение павших животных к общему количеству мышей в группе, в %) и средней продолжительности жизни (СПЖ) животных в группе (в сутках). Среднюю продолжительность жизни животных определяли методом Мейнелл [8]: СПЖ = N/∑[ni/i], где N - общее количество экспериментальных животных, ni - количество животных погибших в i-тые сутки, где i = [1; ∞]. VI. Статистический анализ Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ «Statistica-6» и «Exсel» [23, 27]. Использовались следующие методы статистического анализа: проверка нормальности распределения количественных признаков в группах с использованием W-критерия ШапироУилка. При нормальном распределении количественных признаков для оценки значимости различий использовали t-критерий Стьюдента (для независимых выборок). Для оценки значимости различий количественных признаков при распределении, отличающемся от нормального, использовали критерий МаннаУитни (U) для несвязанных между собой вариационных рядов; критерий Вилкоксона для связанных выборок. С целью выявления особенностей уровня антигенемии у инфицированных пациентов использовали метод многомерной статистики (кластерный анализ методом Варда). Для сравнения выживаемости 100 животных двух групп применяли логранговый критерий z (с поправкой Йетса), характеризующий значимость различий. Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах, имеют следующие обозначения: средняя арифметическая (М), стандартное отклонение (σ), медиана (Me), интерквартильный размах (LQ-UQ), объем анализируемой подгруппы (n), достигнутый уровень значимости (р). Уровень доверительной вероятности был задан равным 95%. 101 Глава 5. Комплексная оценка состояния иммунной системы пациентов с антигенемией вируса клещевого энцефалита Официальная статистика по заболеваемости КЭ свидетельствует о том, что на очаговых территориях Российской Федерации на протяжении эпидемического сезона регистрируют сотни тысяч людей с укусами клещей. В подавляющем большинстве случаев у таких лиц, подвергшихся укусам вирусофорных клещей, может развиться инаппарантная (без клинических проявлений) форма КЭ. По данным А.Н. Шаповала (1980), на один клинический случай КЭ приходится 60 бессимптомных. При замедленной элиминации вируса бессимптомная инфекция может перейти в персистентную (длительную антигенемию), а в случае активации репродукции вируса и развития патологического процесса в ЦНС - в хроническую форму КЭ [40]. Анализ случаев инфицированности людей вирусом КЭ позволяет проследить за длительностью антигенемии и динамикой элиминации вируса КЭ из организма. 5.1 Характеристика уровня антигенемии у пациентов с антигенемией вируса КЭ Для проведения комплексного анализа состояния иммунной системы обследовано 185 человек, у которых на 2-4 сутки после укуса клеща в крови был выявлен антиген вируса КЭ. Для определения особенностей уровня антигенемии у инфицированных пациентов проведен кластерный анализ, который разделил пациентов на группы (кластеры) по заданному параметру (содержание антигена ВКЭ в крови). На рис. 3 представлена вертикальная иерархическая дендрограмма, отражающая неоднородный уровень антигенемии в начале инфекционного процесса. По показателям содержания антигена пациенты разделились на два кластера: кластер А (группа 1) включал в себя 144, а кластер В (группа 2) - 41 пациента. 102 Дендрограмма дл я 185 набл . 160 140 Расстояние объед 120 100 80 60 Кл астер А 40 Кл астер В 20 0 Чл ены выборки Рисунок 3. Кластеризация показателей уровня антигенемии ВКЭ у инфицированных пациентов (метод Варда, евклидово расстояние) На рис. 4 представлены результаты дисперсионного анализа показателей антигенемии ВКЭ, которые в обеих группах имели нормальное распределение. 0,8 0,7 Значения вероятности 0,6 0,5 Группа 1 Группа 2 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Уровень антигенемии Рисунок 4. График плотности вероятности показателей уровня антигенемии ВКЭ у инфицированных пациентов. Примечание: уровень антигенемии определяли по коэффициенту К. 103 Для 1-ой группы W-критерий составил 0,994, p=0,893, для 2-ой –W=0,955, p=0,107. Среднее значение уровня антигенемии у пациентов 1-ой группы составило 2,4±0,6, у пациентов 2-ой группы - 5,8±1,7. Следовательно, группы пациентов значимо различались по содержанию антигена ВКЭ (p=0,000). В дальнейшем было установлено, что при повторном обследовании пациентов через 4-5 недель у лиц 1-ой группы антиген ВКЭ в крови не обнаруживали. Это дало нам основание считать, что у пациентов данной группы наблюдалась кратковременная антигенемия ВКЭ. Поскольку у лиц 2-ой группы антиген ВКЭ обнаруживался при повторных обследованиях через 6 и более месяцев, мы отнесли этих пациентов с бессимптомным носительством антигена ВКЭ в группу лиц с длительной антигенемией. Мы предположили, что показатели содержания антигена ВКЭ в первые дни после укуса клеща могут стать предикторами длительности антигенемии. Используя формулу функции плотности вероятности (коэффициенты – среднее арифметическое и стандартное отклонение, аргумент – значение показателей антигенемии в группах, рис. 4), были определены пороговые (граничные) значения содержания антигена, позволяющие с заданной вероятностью отнести их к одной из этих групп (табл.2). Таблица 2 Пороговые значения уровня антигенемии ВКЭ, определяющие принадлежность к группам пациентов Уровень вероятности 70% 80% 90% 95% Уровень антигенемии ВКЭ (К) Группа 1 Группа 2 < 3,3 < 3,2 <2,9 < 2,5 > 3,7 > 3,8 >4,0 > 4,2 Так, например, пациент, имеющий уровень антигенемии < 2,5, с 95% вероятностью может быть отнесен к группе лиц, для которых характерна 104 быстрая элиминация вируса КЭ. В то же время, пациент, в крови которого содержание антигена > 4,2, с 95% вероятностью может принадлежать к группе лиц, у которых элиминация возбудителя замедлена. Среди обследованных нами инфицированных ВКЭ пациентов были выявлены лица, вакцинированные против КЭ: в 1-ой группе привитых пациентов было 35,4%, во 2-ой - 26,8%. Следует отметить, что значимых отличий в содержании антигена у привитых и непривитых лиц обеих групп не зарегистрировано. Так, в 1-ой группе уровень антигенемии у вакцинированных и невакцинированных пациентов составлял 2,3±0,6 и 2,5±0,7 (p=0,182), во 2-ой группе – 5,6±1,7 и 5,9±1,9 (p=0,567), соответственно. Таким образом, проведенный статистический анализ выявил группы пациентов, различающиеся по уровню антигенемии ВКЭ и скорости элиминации возбудителя. Это позволило определить особенности реакции иммунной системы пациентов в ответ на тот или иной уровень антигенемии ВКЭ, характерный для каждой из выделенных групп. 5.2 Оценка состояния иммунной системы пациентов с разным уровнем антигенемии вируса КЭ При исследовании антигенемией ВКЭ, интересовали состояния иммунной системы пациентов с на раннем этапе инфекционного процесса, нас особенности механизмов элиминации вируса у лиц, невакцинированных и вакцинированных против КЭ, а также особенности функционирования иммунной системы, приводящие к длительной персистенции вируса. С этой целью мы провели сравнительное изучение состояния клеточного, гуморального иммунитета и цитокиновой системы привитых и непривитых пациентов на начальной стадии инфицирования вирусом КЭ для установления прогностически значимых иммунологических маркеров длительной персистенции возбудителя. 105 5.2.1 Характеристика состояния клеточного иммунитета у пациентов с антигенемией ВКЭ Хорошо известна ключевая роль клеточного иммунитета в защите от вирусных инфекций, но состояние этого звена иммунного ответа на ранней стадии инфекционного процесса, вызванного вирусом КЭ, изучено мало. Нами был исследован состав основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови пациентов на 2-4 сутки после укуса клеща (табл.2). Полученные данные анализировали с учетом нормальных значений иммунологических параметров у здоровых доноров. Проведенный анализ позволил установить, что общее количество лейкоцитов, а также относительное содержание и абсолютное количество лимфоцитов периферической крови у пациентов 1-ой и 2-ой групп на ранней стадии инфицирования ВКЭ значимо не отличались от таковых в группе здоровых доноров и находились в пределах вариабельности нормальных значений (p>0,05) (табл. 3). Показатели, характеризующие структуру и соотношение основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD4+/CD8+) , также значимо не отличались у пациентов обеих групп от соответствующих показателей в группе здоровых доноров (p>0,05). Следует отметить более высокий уровень относительного содержания и абсолютного количества В-лимфоцитов (CD3-CD19+) у вакцинированных пациентов 1-ой группы по сравнению с таковым у других обследованных пациентов и здоровых доноров (p≤0,05). Полученные данные свидетельствовали об удовлетворительном состоянии клеточного иммунитета у пациентов 1-ой и 2-ой групп на начальной стадии инфицирования ВКЭ. Способность к быстрому индуцированию клеточных факторов врожденного иммунитета (моноцитов/макрофагов, NK-клеток и NKT-клеток) на ранней стадии инфекционного процесса является одним из механизмов иммунной защиты от вирусов [425, 468]. Исследования показали, что содержание NK-клеток (CD3–CD16+CD56+) и NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+) 106 Таблица 3 Субпопуляционный состав лимфоцитов у пациентов на ранней стадии инфицирования ВКЭ (2-4 сутки) Лимфоциты и субпопуляции Единицы измерения Лейкоциты 109/л % 109/л % 109/л % 109/л % 109/л % 109/л Лимфоциты CD3+CD19CD3-CD19+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ ИРИ (CD4+/CD8+) CD3-CD16+CD56+ CD3+CD16+CD56+ CD3+25+ CD3+HLA-DR+ CD3+95+ % 109/л % 109/л % 109/л % 109/л % 109/л Здоровые доноры (n=25) M±δ 6,1±1,4 31,4±4,8 2,0±0,5 73,3±5,4 1,4±0,3 12,7±3,3 0,26±0,06 46,1±4,1 0,90±0,2 26,2±5,1 0,50±0,13 1,8±0,5 10,4±2,9 0,20±0,06 4,1±1,2 0,06±0,02 6,9±1,9 0,14±0,04 3,0±0,9 0,06±0,01 6,9±1,9 0,14±0,04 Пациенты с кратковременной АГ Невакцинированные Вакцинированные (n=93) (n=51) M±δ p1 M±δ p1 0,369 0,560 6,4±1,5 6,3±1,4 33,4±5,4 0,092 33,2±5,1 0,145 2,2±0,6 0,109 2,0±0,5 0,510 0,294 71,4±5,2 0,144 72,0±5,5 1,6±0,5 0,097 1,4±0,3 0,824 0,161 15,6±3,8 0,008 13,8±3,5 0,29±0,07 0,186 0,31±0,09 0,031 0,107 44,4±5,5 0,175 44,2±4,9 0,96±0,3 0,273 0,88±0,2 0,683 0,429 26,1±5,3 0,938 25,4±4,3 0,54±0,16 0,320 0,52±0,15 0,415 0,446 1,7±0,5 0,474 1,7±0,5 0,000 14,5±3,5 0,000 15,2±3,8 0,33±0,08 0,000 0,29±0,08 0,002 0,000 7,4±1,5 0,000 7,0±1,4 0,15±0,04 0,000 0,15±0,04 0,000 0,000 10,9±2,6 0,000 9,8±2,3 0,21±0,06 0,000 0,22±0,06 0,000 3,4±0,5 0,347 4,2±0,6 0,000 0,07±0,01 0,278 0,08 ±0,01 0,000 7,6±1,1 0,216 8,9±1,2 0,000 0,16±0,03 0,143 0,18±0,03 0,003 Пациенты с длительной АГ Невакцинированные Вакцинированные (n=30) (n=11) M±δ p2 M±δ p2 0,343 0,399 6,0±1,5 6,1±1,5 30,8±5,9 0,076 31,9±6,0 0,460 1,9±0,6 0,119 2,0±0,6 0,920 70,3±5,9 0,211 71,5±6,3 0,956 1,4±0,4 0,926 1,4±0,4 0,964 12,5±2,9 0,778 13,0±3,5 0,041 0,26±0,07 0,856 0,26±0,07 0,045 43,3±6,1 0,413 43,9±6,5 0,792 0,83±0,3 0,098 0,87±0,2 0,138 27,2±5,6 0,150 26,4±5,8 0,868 0,51±0,15 0,634 0,53±0,15 0,840 1,6±0,6 0,115 1,6±0,6 0,628 11,5±3,2 0,000 12,8±3,8 0,155 0,22±0,05 0,000 0,26±0,07 0,254 4,2±1,5 0,000 4,7±1,5 0,000 0,08±0,02 0,000 0,09±0,02 0,000 7,5±1,9 0,000 7,8±1,9 0,000 0,14±0,04 0,000 0,16±0,04 0,000 3,2±0,9 0,155 3,3±0,9 0,017 0,06±0,02 0,260 0,06±0,02 0,006 7,3±1,8 0,665 7,5±1,8 0,035 0,14±0,04 0,282 0,15±0,04 0,027 Примечание: M±δ – среднее ± стандартное отклонение; p1 – значимость различий между показателями в группах здоровых доноров и пациентов с АГ ВКЭ; p2 – значимость различий между показателями в группах пациентов с различной длительностью АГ ВКЭ (t-критерий Стьюдента для независимых выборок). 107 у пациентов 1-ой и 2-ой групп на 2-4 сутки после инфицирования ВКЭ значимо различалось (p≤0,05) (табл.3). Так, у пациентов 1-ой группы относительное содержание и абсолютное количество NK- и NKT-клеток значимо (в 1,5-2,0 раза) превышало средние значения этих показателей в группе здоровых доноров (p=0,000). При этом у невакцинированных пациентов 2-ой группы содержание этих клеток не отличалось от соответствующих показателей у здоровых лиц и находилось в пределах вариабельности нормальных значений. У вакцинированных лиц 2-ой группы количество NK-клеток было выше, чем в контрольной группе (12,8±3,8% и 10,4±2,9%, p=0,044, соответственно), и значимо не отличалось от такового у вакцинированных пациентов 1-ой группы (14,5±3,5%, p=0,155). Содержание же NKT-клеток у вакцинированных лиц 2-ой группы не отличалось от показателей в группе здоровых доноров, но было ниже такового у пациентов 1-ой группы. Увеличение содержания NK- и NKT-клеток в ответ на антиген ВКЭ, выявленное у пациентов 1-ой группы, указывает на активацию эффекторной фазы врожденного противовирусного иммунитета, обеспечивающую быструю элиминацию вируса. Средне-нормальные значения содержания этих клеток на фоне высоких антигенных нагрузок, зарегистрированные у невакцинированных пациентов 2-ой группы, расцениваются как проявление анергии, что является одним из важных факторов, обусловливающих длительную персистенцию вируса. В то же время необходимо отметить, что значимых различий в содержании субпопуляций NK- и NKT- лимфоцитов у вакцинированных и невакцинированных лиц обеих групп на ранней стадии инфицирования ВКЭ не зарегистрировано. Рядом авторов было показано, что наиболее простым и эффективным способом оценки активационных процессов в иммунной системе является определение экспрессии активационных маркеров на поверхности лимфоцитов [1, 2, 142]. К основным маркерам активации, в том числе и Т-лимфоцитов, относятся рецепторы, которые экспрессируются в следующем порядке: 108 CD25→CD71→HLA-DR→CD95 и отвечают за последовательное прохождение определенных этапов дифференцировки лимфоцитов до активационного апоптоза. В связи с этим CD25 и CD71 рассматривают как ранние активационные маркеры, а HLA-DR и CD95 - как поздние активационные маркеры [119, 174]. Нами установлено (табл.3), что у пациентов 1-ой группы на 2-4 сутки после инфицирования ВКЭ относительное содержание и абсолютное количество Т-клеток, экспрессирующих ранний маркер активации CD25, отражающий готовность лимфоцитов к вступлению в пролиферацию и дифференцировку, было значимо выше аналогичных показателей у лиц 2-ой группы и здоровых доноров (p≤0,05). В то же время у пациентов 2-ой группы количество CD3+CD25+- лимфоцитов не отличалось от показателей у здоровых доноров и находилось в пределах вариабельности нормальных значений (p>0,05). Также были исследованы субпопуляции Т-лимфоцитов, экспрессирующие поздние активационные маркеры: HLA-DR, относящийся к антигенам главного комплекса гистосовместимости II класса, и CD95/Fas, отражающий готовность лимфоцитов к запуску активационного апоптоза (табл. 2). Установлено, что относительное содержание и абсолютное количество HLA-DR+- и CD3+CD95+-лимфоцитов у пациентов обеих групп в начальной фазе инфекционного процесса не превышало средние значения этого показателя в группе здоровых доноров (p>0,05). Исключением явились вакцинированные пациенты 1-ой группы: у них содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR- и CD95-антигены, было повышено по сравнению с таковыми показателями у здоровых доноров и привитых лиц 2-ой группы (p≤0,05). При расчете коэффициентов, отражающих соотношение пролиферативных и элиминационных процессов (CD25+/CD95+), выявлено, что это соотношение у пациентов обеих групп находилось в пределах вариабельности нормальных значений (1,0 – 2,0). Однако у невакцинированных 109 пациентов 1-ой и 2-ой групп (1,29±0,26 и 1,03±0,26, p=0,000) и у вакцинированных лиц этих групп (1,22±0,26 и 1,04±0,27, p=0,040) этот коэффициент значимо различался. Анализ активационного профиля Т-лимфоцитов указывает на различную степень активации лимфоцитов в исследуемых группах пациентов. Высокий уровень экспрессии ранних активационных антигенов у невакцинированных пациентов 1-ой группы и уравновешенные высокие уровни экспрессии ранних и поздних активационных маркеров у вакцинированных пациентов этой группы свидетельствуют об адекватной реакции на вирусный антиген и эффективном иммунном ответе. Низкий уровень активации лимфоцитов у пациентов 2-ой группы отражает индуцированную патогеном иммуносупрессию, препятствующую полному удалению вируса в начальной стадии инфекции и поддерживающую персистенцию возбудителя. Таким образом, выполненные исследования позволяют установить у пациентов на ранней стадии инфицирования ВКЭ следующие особенности состояния клеточного иммунитета. У большей части (78%) обследованных лиц с невысокими дозами вирусного антигена наблюдались изменения субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, характерные для начальной стадии вирусной инфекции: повышение количества цитотоксических клеток врожденного иммунитета (NK- и NKT-клеток) и активированных Т-лимфоцитов, что отражало адекватность иммунного ответа на вирусную инфекцию. У меньшей части пациентов (22%) с более высокими дозами ВКЭ на 2-4 сутки отмечалось отсутствие изменений показателей, характеризующих структуру субпопуляций лимфоцитов, что оценивалось как вирусиндуцированная супрессия клеточного звена иммунитета и приводило к замедленной элиминации субпопуляционном составе возбудителя. лимфоцитов Значимых у различий в невакцинированных и вакцинированных пациентов в обеих группах на ранней стадии инфицирования 110 не выявлено, за исключением более высокого содержания В-лимфоцитов у привитых пациентов 1-ой группы, по сравнению с непривитыми. 5.2.2 Характеристика состояния гуморального иммунитета у пациентов с антигенемией ВКЭ Функциональная активность гуморального противовирусного иммунитета на самых ранних стадиях инфицирования людей вирусом КЭ отличается у вакцинированных и невакцинированных пациентов, прежде всего, разной степенью выраженности вирусспецифического иммунного ответа. Таблица 4 Вирусспецифический иммунный ответ на ранней стадии инфицирования ВКЭ (2-4 сутки после укуса клеща) Группы пациентов с разной длительностью АГ ВКЭ 1 группа (кратковременная АГ) 2 группа (длительная АГ) невакц. (n=93) вакц. (n=51) невакц. (n=30) вакц. (n=11) Уровень вирусспецифических антител IgG ИА IgG, % ВН отриц. отриц. отриц. 840±168 82,8±8,1 56±11 отриц. отриц. отриц. 171±43* 37,5±3,4* 13±3* Примечание: ВН – вируснейтрализующие антитела; ИА – индекс авидности антител. Значения ВН и IgG представлены в обратных величинах титров антител. * - значимость различий между показателями в группе пациентов с кратковременной и длительной АГ ВКЭ (p≤0,05) (t-критерий Стьюдента для независимых выборок). Было установлено, что у обследованных пациентов обеих групп ни клинических проявлений заболевания, ни вирусспецифических антител класса IgM к антигену ВКЭ на 2-4 сут исследования зарегистрировано не было. В то же время содержание вирусспецифических антител класса IgG у 111 вакцинированных лиц в 1-ой и 2-ой группах значительно различалось, как по количественным (уровень антител), так и по качественным (авидность антител) параметрам (табл.4). Так, у вакцинированных лиц 1-ой группы на 2-4 сутки после инфицирования показатели СГТ (средняя геометрических титров) антител класса IgG составили 840±168 с преобладанием высокоавидных антител (индекс авидности 82,8±8,1%). У вакцинированных лиц 2-ой группы в этот период наблюдения уровень IgG был значимо ниже, чем в 1-ой группе (p=0,000). У них выявлялись низкоавидные антитела с индексом авидности 37,5±3,4%. Сходная картина отмечалась в отношении вируснейтрализующих антител: СГТА в 1-ой группе составила 56±11, во 2-ой группе – 13±3. Нами было проведено исследование состояния гуморального иммунитета, которое оценивали по уровню компонентов комплемента, общих иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG и подклассов IgG) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови пациентов на 2-4 сутки после инфицирования ВКЭ (табл.5). Проведенное исследование позволило установить, что в начальной фазе инфекционного процесса у пациентов 1-ой и 2-ой групп содержание общих сывороточных иммуноглобулинов вариабельности нормальных (IgM, IgA, значений. IgG) было Исключением в пределах явились вакцинированные пациенты 1-ой группы, у которых уровень сывороточного иммуноглобулина IgG значимо превышал таковые показатели у здоровых доноров и вакцинированных пациентов 2-ой группы (p≤0,05). Выявленное изменение содержания IgG, определило необходимость изучения продукции отдельных подклассов IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), каждому из которых присущ собственный набор биологических функций [52, 174]. Так, в противовирусном иммунитете общепризнана важная роль IgG1- и IgG3-антител, наиболее эффективных в привлечении фагоцитов и киллерных клеток и в активации комплемента [103, 411, 463]. 112 Таблица 5 Гуморальные факторы иммунитета у пациентов на ранней стадии инфицирования ВКЭ (2-4 сутки) Пациенты с кратковременной антигенемией Пациенты с длительной антигенемией Ед. измерения Зд. доноры (n=25) M±δ M±δ p1 M±δ p1 M±δ p2 M±δ p2 IgM мг/мл 1,39±0,39 1,38±0,44 0,924 1,28±0,38 0,296 1,24±0,41 0,225 1,20±0,48 0,581 IgA мг/мл 1,82±0,54 1,80±0,40 0,857 1,72±0,42 0,443 1,63±0,48 0,134 1,68±0,55 0,805 IgG мг/мл 10,08±3,5 11,74±3,6 0,090 13,47±4,7 0,008 9,62±3,5 0,067 9,81±3,6 0,033 IgG1 мг/мл 6,73±2,22 7,8±2,51 0,090 8,89±2,65 0,032 6,30±2,21 0,061 6,33±2,27 0,028 IgG2 мг/мл 2,24±0,67 2,64±0,87 0,141 2,9±0,96 0,092 2,37±0,78 0,485 2,50±0,87 0,261 IgG3 мг/мл 0,74±0,22 0,88±0,27 0,079 1,25±0,31 0,000 0,60±0,21 0,015 0,62±0,20 0,000 IgG4 мг/мл 0,37±0,09 0,40±0,11 0,210 0,41±0,12 0,208 0,35±0,12 0,271 0,36±0,13 0,290 9,1±2,4 8,8±2,23 0,594 7,1±2,07 0,005 10,5±3,47 0,073 10,2±3,26 0,003 Показатели IgG1/IgG3 Невакцинир. (n=93) Вакцинир. (n=51) Невакцинир. (n=30) Вакцинир. (n=11) ЦИК усл.ед. 72±18 112±40 0,000 126±28 0,000 91±33 0,940 98±32 0,754 C1-инг мкг/мл 250±66 230±55 0,226 206±62 0,027 234±58 0,341 248±71 0,097 C4 мкг/мл 380±85 350±70 0,072 340±68 0,030 364±91 0,454 396±118 0,036 C3 мкг/мл 940±190 811±160 0,000 850±170 0,041 1075±251 0,000 1042±290 0,007 C3a нг/мл 110±25 96±21 0,108 99±30 0,187 118±32 0,069 106±35 0,526 C5 мкг/мл 84±14 76±18 0,079 75±20 0,076 83±23 0,107 81±25 0,819 C5a нг/мл 7,1±2,1 6,3±1,6 0,196 6,4±1,7 0,253 7,5±2,2 0,092 7,1±2,3 0,314 Примечание: M±δ – среднее ± стандартное отклонение; p1 – значимость различий между показателями в группах здоровых доноров и пациентов с АГ ВКЭ; p2 – значимость различий между показателями в группах пациентов с различной длительностью АГ ВКЭ (t-критерий Стьюдента для независимых выборок). 113 Результаты исследования, представленные в табл.5, свидетельствуют о том, что на 2-4 сутки инфицирования значимые изменения содержания исследуемых подклассов IgG выявлены только у вакцинированных пациентов 1-ой группы. Так, у этих лиц зарегистрировано повышение продукции IgG1 и IgG3, значимо отличающееся от таковой у здоровых доноров и привитых пациентов 2-ой группы (p≤0,05). Считается, что продукция IgG1 связана с Th2-типом иммунного ответа, а продукция IgG3, как правило, отражает Th1-тип ответа [316, 411, 463]. Для объяснения изменений содержания IgG1 и IgG3 у пациентов, инфицированных ВКЭ, было определено соотношение этих подклассов (IgG1/IgG3). Установлено, что у обследованных лиц показатели, характеризующие отношение IgG1/IgG3, находились в пределах вариабельности нормальных значений. Исключение составляют вакцинированные пациенты 1-ой группы, у которых соотношение IgG1/IgG3 было значимо ниже, чем аналогичные показатели у лиц 2-ой группы и здоровых доноров (p≤0,05). Снижение этого соотношения обусловлено высоким уровнем IgG3, наблюдаемым у пациентов 1-ой группы, и, возможно, отражает поляризацию иммунного ответа в сторону Th1-типа уже на ранней стадии инфицирования. Формирование циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), происходящее в результате взаимодействия антигена со специфическим антителом, является защитным механизмом, направленным на удаление из организма чужеродных антигенов [151]. Нами было проведено исследование процесса иммунокомплесообразования у пациентов, инфицированных вирусом ВКЭ (табл.5). Установлено, что на ранней стадии инфекционного процесса значимо повышены уровни ЦИК только у вакцинированных пациентов обеих групп (p≤0,05), что вероятно, обусловлено наличием у них вирусспецифических антител. Большинство исследователей отмечают, что от размера образующихся иммунных комплексов зависят их важнейшие биологические свойства - 114 способность активировать комплемент и взаимодействовать с Fc-рецепторами клеток, что, в конечном итоге, определяет безопасное удаление ЦИК системой мононуклеарных фагоцитов [179, 426]. Известно, что крупные ИК быстро выводятся из циркуляции, а низкомолекулярные ИК элиминируют менее эффективно [290, 403]. Результаты наших исследований показали, что в сыворотке крови здоровых лиц преобладали ЦИК крупных размеров (68%), среднемолекулярные ЦИК составили 28% и незначительная часть ЦИК (4%) относилась к низкомолекулярным комплексам. У пациентов обеих групп на ранней стадии инфицирования качественный состав иммунных комплексов значимо не отличался от такового у здоровых лиц. В рамках проводимого анализа было изучено состояние системы комплемента, способной распознавать вирусный антиген и участвовать в его клиренсе [420, 482]. Результаты наших исследований показали, что у пациентов 1-ой и 2-ой группы на ранней стадии инфицирования ВКЭ активность отдельных компонентов системы комплемента различается (табл. 5). Установлено, что у обследованных лиц содержание С1-ингибитора, с помощью которого происходит контроль активации комплемента, не отличалось от соответствующих показателей у здоровых лиц и находилось в пределах вариабельности нормальных значений (p>0,05). Исключением явились вакцинированные пациенты 1-ой группы, у которых уровень этого компонента комплемента был ниже аналогичных показателей у здоровых доноров (p≤0,05), что свидетельствовало об его активном потреблении. Поскольку С1-ингибитор действует при запуске классического пути активации комплемента, то можно предположить, что у вакцинированных пациентов данный компонент предотвращает неконтролируемую активацию этого пути. Аналогичная картина наблюдалась в отношении другого компонента классического пути активации комплемента - С4, содержание которого было снижено (p≤0,05) только у вакцинированных пациентов 1-ой группы по сравнению с остальными обследованными лицами и здоровыми донорами. 115 Известно, что активацию комплемента по классическому пути индуцируют антитела и их комплексы с антигеном, т.е. классический путь связан с адаптивным иммунитетом, а альтернативный и лектиновый пути обеспечивают врожденный иммунитет [52]. Очевидно, что вакцинированные пациенты, имеющие вирусспецифические антитела класса IgG, уже на ранней стадии инфицирования ВКЭ активируют систему комплемента по классическому пути. Содержание молекулы С3, являющейся узловым компонентом системы комплемента, было значимо ниже (p≤0,05) у вакцинированных и невакцинированных пациентов 1-ой группы по сравнению с таковыми показателями у здоровых доноров (табл.5). В то же время у непривитых пациентов 2-ой группы зарегистрировано повышение уровня С3 по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров и невакцинированных лиц 1-ой группы (p≤0,05). Вероятно, наличие высоких доз вирусного антигена у пациентов 2-ой группы обеспечивало преобладание процесса накопления С3компонента комплемента над его потреблением. Активация С5-компонента комплемента приводит к образованию мембраноатакующих комплексов, вызывающих лизис клетки-мишени [174]. У пациентов 1-ой и 2-ой группы на ранней стадии инфицирования ВКЭ содержание С5 значимо не отличалось от такового у здоровых лиц (p>0,05). Также находились в пределах вариабельности нормальных значений и уровни С3а- и С5а-компонентов комплемента, обладающих хемотаксической и анафилактогенной активностью. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что различные механизмы активации гуморального звена иммунитета у вакцинированных и невакцинированных пациентов, наблюдаемые в начальной фазе инфицирования ВКЭ, обусловлены как величиной антигенной нагрузки, так и наличием (или отсутствием) вирусспецифических антител. Невысокие уровни антигенемии ВКЭ у пациентов 1-ой группы обеспечили адекватную степень активации гуморальных факторов врожденного (у невакцинированных 116 лиц) и адаптивного иммунитета (у вакцинированных лиц). В то же время повышение содержания некоторых компонентов комплемента в крови у пациентов 2-ой группы с более высоким уровнем антигенемии свидетельствует о замедленном их потреблении, что можно рассматривать как вирусиндуцированную супрессию гуморального звена иммунитета. 5.2.3 Цитокиновый статус у пациентов с антигенемией ВКЭ При многих вирусных инфекциях установлена тесная взаимосвязь между уровнем продукции цитокинов инфекционного процесса и клиническими характеристиками [82, 186, 404]. Важным практическим аспектом оценки цитокинового звена иммунитета на ранней стадии заболевания является возможность прогнозирования течения и исхода инфекционного процесса. При исследовании цитокинового профиля пациентов на ранней стадии инфицирования ВКЭ установлено, что у пациентов 1-ой группы концентрации провоспалительных цитокинов (IL-8, IL-1β, IFNα, TNFα) были значимо выше таковых показателей у здоровых лиц (p<0,05) (табл.6). Кроме того, в этой группе у невакцинированных пациентов зарегистрировано более высокое содержание вышеуказанных цитокинов по сравнению с таковым у вакцинированных лиц (p≤0,05). Следует отметить, что у непривитых пациентов 1-ой группы было наиболее выражено повышение уровня TNFα (в 2 раза) по сравнению со здоровыми донорами. При этом показатель TNFα/IL-4, характеризующий соотношение про- и противовоспалительных цитокинов, был значимо выше у невакцинированных пациентов по сравнению с таковым у вакцинированных лиц (1,7±0,5 и 1,2±0,3, p=0,000). Не менее важно оценить содержание иммунорегуляторного цитокина - IFNγ, который, наряду с прямым действием на вирусную репликацию, способствует дифференцировке Th1клеток и развитию адаптивного иммунитета. Уровень IFNγ, а также показатель отношения IFNγ/IL-4, отражающего цитокиновый баланс Th1- и Th2лимфоцитов, были значимо выше у привитых пациентов 1-ой группы по 117 Таблица 6 Концентрация цитокинов в сыворотке крови пациентов на ранней стадии инфицирования ВКЭ (2-4 сутки) Цитокины (пкг/мл) Зд. доноры (n=25) M±δ IL–8 16,1 ±4,8 24,2±6,2 0,000 19,6±5,0 0,031 IL-1b 25,3±6,3 38,7±9,7 0,000 31,4±9,4 0,021 IFNα 14,3±3,6 21,3±5,1 0,000 18,9±4,7 0,035 TNFα 5,5±1,7 10,9±2,9 0,000 8,0±2,0 0,000 IFNγ 21,3±5,6 26,4±5,9 0,000 32,5±6,8 0,000 IL-6 3,9±1,1 4,2±1,3 0,406 4,0±1,2 0,789 IL-4 5,6±1,7 6,1±1,5 0,153 6,8±2,0 0,016 IL-10 9,4±2,7 9,9±2,5 0,385 10,8±2,7 0,037 TNFα/IL-4 1,0±0,3 1,7±0,5 0,000 1,2±0,3 0,008 IFNγ/IL-4 4,0±1,0 4,3±1,1 0,220 4,8±1,3 0,019 Пациенты с кратковременной антигенемией Невакцинир. (n=93) Вакцинир. (n=51) M±δ p1 M±δ p1 Пациенты с длительной антигенемией Невакцинир. (n=30) Вакцинир. (n=11) M±δ p1, p2 M±δ p1, p2 p1=0,027 p1=0,043 19,1±4,9 20,1±5,0 p2=0,036 p2=0,561 p1=0,020 p1=0,041 29,8±7,4 30,3±7,0 p2=0,039 p2=0,532 p1=0,915 p1=0,715 14,4±3,3 14,8±4,1 p2=0,000 p2=0,010 p1=0,000 p1=0,000 8,2±2,2 8,6±2,4 p2=0,000 p2=0,387 p1=0,201 p1=0,020 23,3±5,8 27,0±8,1 p2=0,007 p2=0,022 p1=0,116 p1=0,348 4,4±1,2 4,3±1,3 p2=0,457 p2=0,461 p1=0,005 p1=0,011 7,1±2,0 7,4±2,2 p2=0,004 p2=0,379 p1=0,002 p1=0,012 12,0±3,1 12,3±3,7 p2=0,000 p2=0,124 p1=0,224 p1=0,106 1,1±0,3 1,2±0,4 p2=0,000 p2=0,998 p1=0,018 p1=0,306 3,3±1,1 3,6±1,2 p2=0,000 p2=0,007 Примечание: M±δ – среднее ± стандартное отклонение; p1 – значимость различий между показателями в группах здоровых доноров и пациентов с АГ ВКЭ; p2 – значимость различий между показателями в группах пациентов с различной длительностью АГ ВКЭ (t-критерий Стьюдента для независимых выборок). 118 сравнению с таковыми показателями у непривитых пациентов. В то же время содержание противовоспалительных цитокинов (IL-4 и IL-10) у пациентов 1-ой группы находилось в пределах вариабельности нормальных значений. У пациентов 2-ой группы на ранней стадии инфицирования ВКЭ также отмечалось повышение продукции провоспалительных цитокинов IL-8, IL-1β и TNFα по сравнению с таковой у здоровых доноров (p≤0,05). Но показатели продукции этих цитокинов у невакцинированных пациентов данной группы были ниже (p≤0,05), чем у непривитых пациентов 1-ой группы. В то же время у вакцинированных пациентов 2-ой группы концентрация цитокинов IL-8, IL-1β и TNFα не отличалась от таковой у привитых лиц 1-ой группы (p>0,05). Обращают на себя внимание особенности продукции IFN I и II типа у пациентов 2-ой группы. Несмотря на высокую антигенную нагрузку, у пациентов данной группы уровень продукции IFNα оставался в пределах вариабельности нормальных значений, что позволяет рассматривать отсутствие изменений этого показателя как прогностический критерий замедленной элиминации антигена. Содержание IFNγ у невакцинированных пациентов 2-ой группы также не отличалось от такового у здоровых доноров (p=0,201). Хотя у привитых лиц этой группы концентрации данного цитокина и превышали таковые в контрольной группе (p=0,020), но были значимо ниже, чем у вакцинированных пациентов 1-ой группы (p=0,022). Уже на ранней стадии инфицирования ВКЭ у пациентов 2-ой группы уровни продукции противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 были выше таковых у здоровых доноров (p≤0,05) и соотношение IFNγ/IL-4 указывало на поляризацию иммунного ответа в сторону Th2-типа. Изучение секреции цитокинов на системном уровне не всегда позволяет адекватно оценить состояние иммунной системы, так как цитокины имеют короткий период полураспада в сыворотке крови, а так же способны активно связываться с растворимыми рецепторами к ним с образованием комплексов [30, 67]. 119 Изучение способности клеток крови к продукции цитокинов ex vivo, особенно в условиях дополнительной стимуляции митогеном, позволяет оценить резервный потенциал клеток. В этой связи была проведена сравнительная оценка способности клеток цельной крови здоровых доноров и пациентов, инфицированных ВКЭ (табл.7, рис.5), к продукции цитокинов ex vivo. При изучении продукции цитокинов в культурах интактных и индуцированных КонА клеток периферической крови в настоящем исследовании представлены данные, выраженные в ИС - индексе стимуляции (отношение индуцированной к интактной продукции цитокинов), отражающие функциональный резерв клеток. Таблица 7 Продукция цитокинов в культурах интактных и митоген-индуцированных клеток периферической крови здоровых доноров (n=25) Цитокины (пкг/мл) IL-8 IL-1β IFNα TNFα IFNγ IL-6 IL-4 IL-10 Интактная продукция Индуцированная продукция Me (LQ-UQ) 560 (420-640) 57 (45-60) 37 (30-42) 43 (35-55) 52 (40-65) 275 (210-320) 15 (11-17) 22 (15-25) Me (LQ-UQ) 810 (690-1050) 98 (75-130) 50 (45-60) 160 (115-200) 135 (125-160) 450 (360-600) 20 (16-28) 55 (38-70) Индекс стимуляции (ИС) Me (LQ-UQ) 1,4 (1,1-1,6) 1,7 (1,5-1,9) 1,3 (1,1-1,4) 3,7 (3,3-4,0) 2,5 (2,3-2,8) 1,6 (1,3-1,7) 1,3 (1,1-1,4) 2,45 (2,2-2,7) Уровень значимости (p) 0,000 0,000 0,031 0,000 0,000 0,000 0,042 0,000 Примечание: Mе (LQ-UQ) – медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей); р - значимость различий по отношению к показателям интактной продукции цитокинов (t-критерий Стьюдента для связанных выборок). Сравнительный анализ продукции цитокинов в культурах интактных и митоген-индуцированных клеток периферической крови пациентов 1-ой и 2-ой групп показал, что характер изменений продукции вышеуказанных цитокинов ex vivo (в пробах цельной крови) идентичен таковому в сыворотке крови этих пациентов (рис.5). 120 ИС 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 IL-8 IL-1b здоровые IFN-a TNF-a 1 гр. н/в IFN-g 1 гр.в IL-6 IL-4 2 гр. н/в IL-10 2 гр. в Рисунок 5. Индекс стимуляции (индуцированной/интактной) продукции цитокинов у пациентов на ранней стадии инфицирования ВКЭ Установлено, что при стимуляции КонА клеток крови пациентов, инфицированных ВКЭ, наблюдалось усиление продукции всех исследуемых цитокинов (IL-8, IL-1β, INFα, INFγ, IL-6, IL-4 и IL-10). Однако только у пациентов 1-ой группы выявлено значимое отличие показателей индекса стимуляции продукции цитокинов от таковых у здоровых доноров (p≤0,05). Так, по сравнению со здоровыми донорами у невакцинированных пациентов этой группы зарегистрировано повышение ИС TNFα (3,7±0,9 и 5,6±1,4, p=0,000, соответственно), у вакцинированных лиц – увеличение ИС INFγ (2,5±0,6 и 3,5±0,9, p=0,024, соответственно), что свидетельствует о высоких резервных возможностях клеток пациентов этой группы. Проведенный исследование анализ содержания цитокининдуцирующей сывороточных способности цитокинов клеток и крови обследованных лиц позволил выявить следующие закономерности. На ранней стадии инфицирования ВКЭ цитокиновый статус пациентов 1-ой группы 121 характеризуется умеренным увеличением концентраций провоспалительных цитокинов, усилением продукции этих цитокинов в культурах интактных и митоген-индуцированных клеток. Повышение уровня иммунорегуляторного цитокина у вакцинированных пациентов этой группы обусловливает активацию механизмов адаптивного иммунитета, что, в свою очередь, способствует быстрой элиминации вируса КЭ. Напротив, выявление у пациентов 2-ой группы повышенного содержания противовоспалительных цитокинов (IL-4 и IL-10) на фоне отсутствия прогностически стимуляции продукции неблагоприятным цитокина признаком IFNα замедленной является элиминации возбудителя. *** Таким образом, были установлены различия в процессе элиминации антигена вируса КЭ антигенположительного антигенемии из крови клеща. пациентов Показано, что после при присасывания невысоком уровне элиминация вируса происходит быстро, при более высоких показателях антиген может длительно персистировать в организме человека. В группе пациентов с кратковременной антигенемией установлены разные иммунологические механизмы элиминации вируса: у невакцинированных лиц активируется эффекторная фаза врожденного противовирусного иммунитета, у вакцинированных лиц наблюдается ранняя активация факторов адаптивного противовирусного характеризующих иммунитета. состояние Отсутствие клеточного, изменений гуморального показателей, иммунитета и цитокиновой системы, на ранней стадии инфицирования у пациентов с высоким уровнем антигенемии свидетельствует о вирусиндуцированной супрессии иммунного ответа и является предиктором длительной персистенции вируса. 122 Глава 6. Комплексная оценка состояния иммунной системы пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде заболевания В последнее десятилетие в структуре заболеваемости КЭ в Приморском крае наблюдается изменение клинической картины, связанной с преобладанием лихорадочных и инаппарантных форм этой инфекции. В 2012г. число заболеваний с инаппарантной формой увеличилось до 17,2% против 15,9 % в 2009г., уменьшилось число очаговых форм КВЭ до 10,3% против 27,3% в 2009г. и лихорадочных – до 58,6% против 65,5% соответственно, однако в 2012г. отмечалось увеличение менингеальных форм – 13,8% против 2,3% в 2009г. При этом случаи смерти от КЭ в Приморском крае регистрируются ежегодно, и составляют от 3,4% до 15,9% [98]. В числе больных КЭ были лица, вакцинированные против этой инфекции, удельный вес которых составлял от 3,4% до 10,1% [68]. Летальных исходов в группе привитых лиц не зарегистрировано, большинство случаев заболевания ограничилось лихорадочной (90,2%), менингеальной – 4,2% и очаговыми формами – 5,6% [68]. В период с 2008 года по 2012 год среди заболевших вакцинированных лиц в 100% были выявлены случаи только лихорадочной формы заболевания. Целью настоящего раздела исследований явилось сравнительное изучение функциональной активности клеточного и гуморального иммунитета и цитокиновой системы пациентов с манифестными формами в остром периоде заболевания КЭ. Всего обследовано 67 пациентов с зарегистрированным диагнозом КЭ (рубрика А 84.0 по МКБ 10). Выделены 3 группы: 1 группа – больные лихорадочной формой КЭ средней степени тяжести (невакцинированные и вакцинированные); 2 группа – пациенты с очаговыми формами КЭ и благоприятным исходом; 3 группа – пациенты с очаговыми формами КЭ и летальным исходом. 123 6.1 Характеристика состояния клеточного иммунитета у пациентов с манифестными формами КЭ Как видно из табл. 8, в первые дни заболевания (3-7 день) у всех пациентов 1-ой группы абсолютное количество лейкоцитов и лимфоцитов находилось в пределах вариабельности нормальных значений. В этот же период у пациентов 2-ой и 3-ей группы наблюдался умеренный лейкоцитоз (абсолютное количество лейкоцитов составило 9,1±2,3х109/л и 10,2 (8,312,2)х109/л, соответственно), а у больных 3-ей группы - относительная лимфопения (абсолютное количество лимфоцитов было - 1,4 (1,1-1,5) х109/л). Дополнительно, для оценки степени интоксикации определяли лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ), который можно использовать в качестве косвенного признака состояния иммунной системы и ее реактивности. У пациентов 1-ой группы ЛИИ не отличался от такового у здоровых доноров (0,65±0,15 и 0,51±0,10, p=0,380, соответственно), что свидетельствовало об удовлетворительном состоянии их иммунной системы. В то же время значимое повышение ЛИИ у пациентов с очаговыми формами КЭ (2-ая и 3-я группы) (2,62±0,7 и 6,43 (3,2-8,4), p≤0,05) по сравнению со здоровыми донорами (0,51±0,10) расценивалось как недостаточность иммунной системы. При анализе показателей, характеризующих структуру основных субпопуляций лимфоцитов, у пациентов всех трех групп, за исключением вакцинированных ранее лиц, были выявлены признаки Т-клеточного дефицита, связанного со значимым уменьшением количества лимфоцитов, экспрессирующих CD3+- и CD4+-антигены (p≤0,05) (табл.8). При этом в острый период болезни регистрировалось у невакцинированных снижение лишь пациентов относительного 1-ой содержания группы этих субпопуляций по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров. У вакцинированных пациентов этой группы количество CD3+ и CD4+лимфоцитов не отличалось от такового у здоровых доноров. В то же время у 124 Таблица 8 Субпопуляционный состав лимфоцитов у пациентов с манифестными формами КЭ в острый период заболевания Лимфоциты и субпопуляции Единицы измерения Лейкоциты 10 /л % 109/л % 109/л % 109/л % 109/л % 109/л Лимфоциты CD3+CD19CD3-CD19+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ 9 ИРИ (CD4+/CD8+) CD3-CD16+CD56+ CD3+CD16+CD56+ CD3+25+ HLA-DR+ CD3+95+ % 109/л % 109/л % 109/л % 109/л % 109/л Здоровые доноры (n=25) M±δ 6,1±1,4 31,4±4,8 2,0±0,5 73,3±5,4 1,4±0,3 12,7±3,3 0,25±0,06 46,1±4,1 0,92±0,2 26,2±5,1 0,50±0,13 1,8±0,5 10,4±2,9 0,20±0,06 4,1±1,2 0,08±0,02 6,9±1,9 0,13±0,04 3,1±0,9 0,06±0,01 6,9±1,9 0,14±0,04 Пациенты с лихорадочной формой КЭ Невакцинированные (n=28) M±δ 6,3±1,5 34,0±5,0 2,1±0,5 65,8±5,8 1,3±0,2 11,8±3,0 0,24±0,06 40,9±6,2 0,86±0,2 27,5±5,3 0,56±0,16 1,5±0,6 18,3±3,6 0,37±0,10 6,0±1,6 0,12±0,04 11,5±3,0 0,24±0,06 4,7±1,2 0,10±0,03 9,0±2,5 0,18±0,04 p 0,619 0,067 0,292 0,001 0,155 0,448 0,547 0,005 0,281 0,368 0,143 0,057 0,000 0,000 0,014 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Вакцинированные (n=17) M±δ 6,2±1,5 33,0±5,1 2,0±0,6 70,0±6,1 1,4±0,2 14,9±3,5 0,30±0,08 43,7±5,3 0,87±0,23 26,7±5,3 0,54±0,16 1,6±0,6 16,0±3,3 0,32±0,09 6,1±1,7 0,12±0,04 12,3±3,1 0,25±0,06 4,8±1,4 0,11±0,03 9,8±2,9 0,20±0,05 p 0,826 0,307 0,799 0,072 0,445 0,045 0,026 0,106 0,431 0,760 0,378 0,248 0,000 0,000 0,039 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,006 Пациенты с очаговыми формами КЭ с благоприятным исходом (n=16) M±δ p 9,1±2,3 0,000 20,3±5,5 0,000 1,8±0,4 0,126 58,4±7,6 0,000 1,1±0,2 0,024 25,3±5,1 0,000 0,53±0,11 0,000 32,3±6,0 0,000 0,59±0,15 0,000 25,3±5,8 0,100 0,42±0,12 0,806 1,3±0,4 0,002 7,1±2,1 0,000 0,16±0,05 0,033 4,0±1,3 0,454 0,07±0,03 1,000 7,3±2,1 0,083 0,14±0,03 0,095 3,5±1,0 0,205 0,06±0,01 0,625 7,5±1,8 0,320 0,13±0,03 0,397 Пациенты с очаговыми формами КЭ с летальным исходом (n=6) Me (LQ-UQ) 10,2 (8,3-12,2) 14,0 (11,0-16,0) 1,4 (1,1-1,5) 57,0 (54,0-60,0) 0,8 (0,6-0,9) 26,0 (25,0-29,0) 0,40 (0,38-0,45) 24,0 (22,0-27,0) 0,40(0,36-0,45) 21,0 (19,0-24,0) 0,31 (0,26-0,33) 1,1 (1,0-1,3) 6,0 (5,0-9,0) 0,08 (0,05-0,10) 3,0 (2,0-5,0) 0,05(0,03-0,08) 5,2 (4,9-6,0) 0,08 (0,07-0,10) 3,0 (2,0-4,0) 0,04 (0,03-0,06) 6,8 (6,0-8,0) 0,10 (0,09-0,11) p 0,000 0,000 0,015 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,029 0,000 0,000 0,000 0,000 0,045 0,002 0,041 0,006 0,134 0,036 0,647 0,030 Примечание: M±δ – среднее ± стандартное отклонение; Mе (LQ-UQ) – медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей); p – значимость различий между показателями в группах здоровых и инфицированных ВКЭ пациентов; (U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок). 125 пациентов 2-ой и 3-ей групп выявлено значимое уменьшение относительного содержания и абсолютного количества CD3+CD19- и CD3+CD4+-лимфоцитов. Значимое уменьшение (CD3+CD8+) содержания обнаружено только цитотоксических у пациентов Т-лимфоцитов 3-ей группы. Иммунорегуляторный индекс (ИРИ), характеризующий соотношение между субпопуляциями CD4+- и CD8+-лимфоцитов периферической крови, у пациентов с лихорадочной формой КЭ находился в пределах вариабельности нормальных значений. Снижение ИРИ при очаговых формах КЭ было обусловлено уменьшением количества CD4+Т-клеток, а у пациентов с неблагоприятным исходом еще и снижением содержания CD8 +Т-лимфоцитов (1,3±0,4 и 1,1 (1,0-1,3), соответственно). При изучении В-клеточного звена иммунитета количество CD3–CD19+лимфоцитов не изменялось только у невакцинированных пациентов 1-ой группы. У вакцинированных лиц 1-ой группы и пациентов 2-ой и 3-ей групп регистрировалось значимое увеличение относительного содержания и абсолютного количества этих клеток по сравнению с показателями в группе здоровых доноров. Исследование субпопуляций NK- и NKT-клеток, обладающих цитотоксической активностью, показало, что изменения количества этих клеток носили разнонаправленный характер в зависимости от формы заболевания КЭ (табл.8). У пациентов с лихорадочной формой КЭ в остром периоде заболевания относительное содержание и абсолютное количество CD3 – CD16+CD56+- и CD3+CD16+CD56+ -лимфоцитов было значимо повышено по сравнению с таковыми показателями у здоровых лиц (p≤0,05). У пациентов с очаговыми формами заболевания наблюдалось снижение числа этих клеток, наиболее выраженное у лиц 3-ей группы (p≤0,05). В острый период заболевания у пациентов с лихорадочной формой КЭ выявлялось значимое увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих ранние и поздние активационные антигены (CD3+CD25+, HLA-DR+, 126 CD3+CD95+). В то же время у пациентов с очаговыми формами КЭ с благоприятным исходом признаки Т-клеточной активации отсутствовали (p>0,05), с летальным исходом – экспрессия активационных маркеров была снижена (p≤0,05). Показатели, отражающие соотношение пролиферативных и элиминационных процессов (CD25+/CD95+), у обследованных пациентов различались. Так, у пациентов 1-ой группы это соотношение, будучи выше аналогичного показателя у здоровых доноров, оставалось в пределах нормативных значений (1,0 – 2,0). Снижение показателей этого соотношения при неблагоприятном исходе у больных очаговыми формами КЭ (0,76 – 0,80) свидетельствовало о выраженной вирусиндуцированной супрессии клеточного звена иммунитета этих пациентов. Установленные в настоящем исследовании изменения в субпопуляционном составе Т-лимфоцитов не только подтверждают наличие Т-клеточного дефицита у невакцинированных пациентов с разными формами КЭ, но и позволяют рассматривать эти изменения как дополнительные лабораторные критерии, указывающие на прогрессирование заболевания. Наиболее важным в плане прогноза течения КЭ является определение изменений относительного содержания и абсолютного количества следующих популяций лимфоцитов: CD3+, CD4+, CD8+, NK, NKT, CD25+, CD95+ (табл.8). Снижение показателей CD4+/CD8+ и CD25+/CD95+ является прогностически неблагоприятным признаком течения заболевания КЭ. 6.2 Характеристика состояния гуморального иммунитета у пациентов с манифестными формами КЭ Для верификации КЭ в остром периоде решающее значение имеет обнаружение в крови больных вирусспецифических антител класса IgM. В наших исследованиях у всех пациентов с лихорадочной формой КЭ в этот период уровень вирусспецифических IgM был невысоким (табл.9). Содержание антител у вакцинированных и невакцинированных пациентов этой группы значимо различалось (1,2±0,3 и 2,0±0,5, p=0,004). Уровень антител класса IgM 127 у пациентов с очаговыми формами КЭ было значимо выше (8,6 ± 1,8 и 8,9±2,1), чем у лиц 1-ой группы (p=0,000). В то же время только у пациентов 1-ой группы, ранее вакцинированных против КЭ, в остром периоде выявлялись вирусспецифические антитела класса IgG и вируснейтрализующие антитела (СГТА составила 45±11) (табл.9). Таблица 9 Уровень вирусспецифических антител в остром периоде заболевания у пациентов с манифестными формами КЭ Группы пациентов с манифестными формами КЭ Пациенты с лихорадочной формой КЭ Пациенты с очаговыми формами КЭ Вирусспецифические антитела IgM (КП) IgG невакц. 2,0±0,5 отриц. (n=28) вакц. 1,2±0,3 611±153 (n=17) невакц. с благоприятным 8,6±1,8* отриц. исходом (n=16) невакц. с летальным 8,9±2,1* отриц. исходом (n=6) ИА IgG, % ВН отриц. отсут. 58,6±11,6 45±11 отриц. отсут. отриц. отсут. Примечание: КП (коэффициент позитивности); ИА – индекс авидности антител; ВН – вируснейтрализующие антитела. Значения IgG и ВН представлены в обратных величинах титров антител. *- значимость различий между показателями в группе невакцинированных пациентов с очаговыми формами и лихорадочной формой КЭ (p≤0,05); (U-критерий МаннаУитни для независимых выборок). Исследование содержания общих сывороточных иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) показало, что уровень этих иммуноглобулинов в сыворотке крови пациентов с лихорадочной формой КЭ в острый период заболевания находился в пределах вариабельности нормальных значений (табл.10). 128 Таблица 10 Гуморальные факторы иммунитета у пациентов с манифестными формами КЭ в острый период заболевания Показатели IgM IgA IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1/IgG3 ЦИК C1-инг C4 C3 C3a C5 C5a Единицы измерения мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл мг/мл усл.ед. мкг/мл мкг/мл мкг/мл нг/мл мкг/мл нг/мл Здоровые доноры (n=25) Пациенты с лихорадочной формой КЭ Невакцинированные (n=28) Вакцинированные (n=17) Пациенты с очаговыми формами КЭ с благоприятным исходом (n=16) Пациенты с очаговыми формами КЭ с летальным исходом (n=6) M±δ M±δ p M±δ p M±δ p Me (LQ-UQ) p 1,39±0,39 1,82±0,54 10,08±2,5 6,73±2,22 2,24±0,67 0,74±0,22 0,37±0,09 9,1±2,4 72±18 250±66 380±85 940±190 110±25 84±14 7,1±2,1 1,44±0,33 1,80±0,46 9,71±2,44 6,11±1,80 2,36±0,70 0,90±0,23 0,33±0,10 6,8±1,7 128±31 230±58 290±65 630±130 91±27 67±16 5,8±1,5 0,068 0,885 0,512 0,267 0,528 0,013 0,134 0,000 0,000 0,246 0,000 0,000 0,033 0,010 0,014 1,38±0,4 2,20±0,5 10,66±2,9 6,64±1,98 2,61±0,78 1,07±0,27 0,34±0,10 6,0±1,74 134±34 220±55 302±60 750±150 95±24 76±20 6,2±1,8 0,398 0,012 0,493 0,858 0,108 0,000 0,317 0,000 0,000 0,131 0,000 0,000 0,060 0,124 0,157 2,3±0,69 2,11±0,59 8,48±2,10 5,09±1,52 2,55±0,64 0,54±0,15 0,32±0,10 9,4±2,8 173±57 316±95 475±142 1193±350 130±35 99±30 8,8±2,6 0,000 0,114 0,040 0,014 0,150 0,003 0,105 0,716 0,000 0,012 0,011 0,008 0,045 0,036 0,027 1,99 (1,9-2,2) 1,91 (1,7-2,3) 7,6 (5,8-8,9) 4,46 (3,2-4,9) 2,34 (1,8-3,2) 0,52 (0,3-0,6) 0,28 (0,2-0,4) 8,6 (8,1-9,3) 194 (158-230) 345(285-410) 468 (380-503) 1290 (1100-1430) 140 (120-190) 138 (119-178) 10 (8,5-15) 0,000 0,350 0,000 0,000 0,286 0,000 0,312 0,253 0,000 0,000 0,037 0,000 0,000 0,000 0,000 Примечание: M±δ – среднее ± стандартное отклонение; Mе (LQ-UQ) – медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей); p – значимость различий между показателями в группах здоровых и инфицированных ВКЭ пациентов; (U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок). 129 У пациентов с очаговыми формами КЭ отмечалось значимое повышение уровня IgM по сравнению с таковым у здоровых доноров (p≤0,05). При этом концентрации общего IgG у пациентов 2-ой и 3-ей групп были ниже аналогичных показателей у здоровых доноров (p≤0,05). При изучении продукции отдельных подклассов IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) установлено, что у пациентов 1-ой группы содержание IgG1, IgG2 и IgG4 не отличалось от такового у здоровых доноров (табл.10). В то же время у этих пациентов зарегистрировано значимое повышение концентраций IgG3 (p≤0,05), играющего важную роль в противовирусном иммунитете. Показатели IgG1/IgG3, характеризующие соотношение Th2-зависимых IgG1-антител и Th1зависимых IgG3-антител, у пациентов 1-ой группы были ниже, чем таковые у здоровых доноров (p≤0,05), что можно расценить как раннюю поляризацию иммунного ответа в сторону Th1-типа. В этот же период у пациентов 2-ой и 3ей групп отмечено снижение содержания подклассов IgG1и IgG3 по сравнению с таковыми показателями у здоровых доноров (p≤0,05), что может рассматриваться как один из критериев, характеризующих тяжесть течения заболевания. Исследование процесса иммунокомплексообразования у пациентов с манифестными формами КЭ показало, что в остром периоде заболевания у всех обследованных лиц уровень ЦИК был значимо выше, чем в группе здоровых доноров (p≤0,05). Следует отметить, что у пациентов с разными формами КЭ были выявлены различия качественного состава ЦИК (рис.6). Так, у вакцинированных и невакцинированных пациентов 1-ой группы размеры иммунных комплексов значимо не отличались от таковых у здоровых лиц. Анализ качественного состава ЦИК у пациентов с очаговыми формами КЭ показал изменение размеров иммунных комплексов в сторону снижения количества крупномолекулярных ЦИК и увеличения средне- и низкомолекулярных ЦИК (рис.6). Повышение уровня ЦИК в сыворотке крови преимущественно за счет низкомолекулярных и среднемолекулярных 130 иммунных комплексов может быть одним из условий развития у данных групп пациентов иммунопатологических реакций, что согласуется с данными других исследователей [149, 151]. % 70 68 66 62 60 50 50 43 43 40 30 31 30 28 25 20 10 25 14 8 4 3 0 здоровые 1 гр. н/в крупные ЦИК 1 гр вак. 2 гр. средние ЦИК 3 гр. мелкие ЦИК Рисунок 6. Качественный состав ЦИК у пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде заболевания. Важной составляющей гуморального иммунитета является система комплемента, патогенетическая роль компонентов которого в развитии воспалительных реакций, и в том числе, в гибели нейронов, отмечается целым рядом авторов [204, 439, 485]. В наших исследованиях у всех пациентов в острый период заболевания выявлялась активация системы комплемента, как в целом, так и ее отдельных компонентов (табл.10). В частности, у невакцинированных пациентов 1-ой группы отмечено значимое снижение содержания С3, С4, С5, С3а, С5а - компонентов комплемента по сравнению с таковым у здоровых доноров (p≤0,05), что свидетельствовало об активации этих компонентов и их активном потреблении. У вакцинированных лиц зарегистрировано только снижение уровня С3- и С4- компонентов 131 комплемента, содержание других компонентов находилось в пределах вариабельности нормальных значений, что, в свою очередь, можно расценивать как менее выраженную воспалительную реакцию у этих лиц по сравнению с невакцинировнными пациентами. В то же время, у пациентов с очаговыми формами КЭ (2-ая и 3-я группа) выявлено значимое повышение уровней компонентов комплемента, свидетельствующее о преобладании процессов накопления этих компонентов в крови над их потреблением (табл.10). Известно что, антитела IgG3 и IgG1, связываясь с антигеном, способны активировать систему комплемента, и, взаимодействуя с Fc-рецепторами (FcγR), экспрессированными на клетках различных типов, стимулировать клеточную активность, в частности, фагоцитоз иммунных комплексов, секрецию различных медиаторов, в том числе и цитокинов [52]. Однако антитела класса IgM более эффективно активируют систему комплемента по сравнению с антителами класса IgG [52]. В этой связи повышенное содержание компонентов комплемента может быть обусловлено тем, что у пациентов с очаговыми формами КЭ, несмотря на низкое содержание IgG1 и IgG3, отмечался высокий уровень общих иммуноглобулинов IgM и вирусспецифических антител класса IgM, а также повышенное содержание ЦИК, что способствовало чрезмерной активации системы комплемента. Гиперактивность системы комплемента является иммунопатологическим компонентом иммунного ответа и указывает на тяжелое течение инфекционного процесса [70, 99]. Таким образом, у пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде заболевания была выявлена разная степень активации гуморального иммунитета. У пациентов с лихорадочной формой КЭ отмечалась адекватная активация гуморальных факторов иммунитета, сопровождающаяся невысоким повышением уровня вирусспецифических антител класса IgM, подкласса IgG3, преобладанием ЦИК крупных размеров и активацией компонентов комплемента. У вакцинированных пациентов этой же группы отмечалось более легкое течение инфекционного процесса, которое, кроме того, было сопряжено 132 с наличием вирусспецифических антител класса IgG и менее выраженной активацией системы комплемента. При очаговых формах КЭ установлена дисфункция гуморального иммунитета, характеризующаяся повышенным синтезом общих и вирусспецифических антител класса IgM на фоне сниженного содержания общего сывороточного IgG и его подклассов IgG1 и IgG3. Кроме того, у этих больных происходит гиперактивация системы комплемента и повышение содержания ЦИК средних и мелких размеров. 6.3 Цитокиновый статус у пациентов с манифестными формами КЭ Исследование цитокинового профиля пациентов с манифестными формами КЭ выявило различный уровень продукции цитокинов в острый период заболевания (3-7 день) (табл. 11). В этот период у пациентов с лихорадочной формой КЭ концентрации провоспалительных цитокинов (IL-8, IL-1β, IFNα, TNFα) - основных участников регуляторной сети при развитии острого воспаления, в 2-3 раза превышали аналогичные показатели у здоровых лиц (p≤0,05). При этом уровень вышеназванных цитокинов у вакцинированных лиц 1-ой группы был значимо ниже такового у невакцинированных лиц этой группы (p≤0,05). У пациентов с очаговыми формами КЭ уровень продукции IL8, IL-1β, TNFα различался: при неблагоприятном исходе содержание этих цитокинов в сыворотке крови было в 3 - 10 раз, а при благоприятном исходе – в 1,4-1,6 раз выше, чем таковое в группе здоровых лиц. В то же время концентрации цитокина IFNα у этих больных находились в пределах вариабельности нормальных значений (p>0,05). В острой фазе заболевания содержание противовоспалительных цитокинов (IL-4 и IL-10) было значимо повышено только в группе пациентов с очаговыми формами КЭ и благоприятным исходом (p≤0,05). У остальных обследованных пациентов концентрации IL-4 и IL-10 не отличались от таковых у здоровых людей (табл.11). Соотношение про- и противовоспалительных цитокинов (TNFα/IL-4) при очаговых формах КЭ с неблагоприятным и 133 Таблица 11. Концентрация цитокинов в сыворотке крови пациентов с манифестными формами КЭ в острый период заболевания Цитокины (пкг/мл) Здоровые доноры (n=25) M±δ Пациенты с лихорадочной формой КЭ Невакцинированные (n=28) Вакцинированные (n=17) Пациенты с очаговыми формами КЭ с благоприятным исходом (n=16) Пациенты с очаговыми формами КЭ с летальным исходом (n=6) M±δ p M±δ p M±δ p Me (LQ-UQ) p IL-8 16,1 ±4,8 38,4±9,6 0,000 31,1±8,7 0,000 22,5±6,8 0,001 48,5 (40,9-73,5) 0,000 IL-1b 25,3±6,3 46,6±11,6 0,000 41,5±10,4 0,000 39,5±9,9 0,000 75,4 (55,0-96,6) 0,000 IFNα 14,3±3,6 30,5±7,6 0,000 23,9±6,0 0,000 14,1±4,2 0,872 12,3 (10,0-14,6) 0,634 TNFα 5,5±1,7 17,9±4,4 0,000 14,9±3,9 0,000 8,6±2,6 0,000 58,2 (35,1-65,4) 0,000 IFNγ 21,3±5,6 27,8±6,9 0,000 34,6±8,7 0,000 26,8±8,0 0,013 38,0 (30,0-43,9) 0,000 IL-6 3,9±1,1 4,9±1,2 0,003 4,1±1,3 0,594 7,9±2,4 0,000 16,2 (12,5-18,0) 0,000 IL-4 5,6±1,7 5,9±1,8 0,537 6,5±2,0 0,125 8,1±2,5 0,016 7,1 (5,9-8,0) 0,065 IL-10 9,4±2,7 9,3±2,7 0,893 10,4±3,2 0,274 13,7±4,1 0,000 9,2 (6,5-9,7) 0,808 TNFα/IL-4 1,0±0,3 3,0±0,9 0,000 2,3±0,7 0,000 1,1±0,3 0,304 8,2 (6,0-9,3) 0,000 IFNγ/IL-4 4,0±1,0 4,8±1,4 0,022 5,3±1,6 0,002 3,3±1,0 0,035 4,6 (4,0-5,0) 0,000 Примечание: M±δ – среднее ± стандартное отклонение; Mе (LQ-UQ) – медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей); p – значимость различий между показателями в группах здоровых и инфицированных ВКЭ пациентов; (U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок). 134 благоприятным исходом резко различалось (8,2 (6,0-9,3) и 1,1±0,3, p=0,000, соответственно). Известно, что лишь умеренное повышение значений показателя TNFα/IL-4 в острой фазе инфекционного процесса соответствует общеиммунологическим закономерностям [43, 82]. Таким образом, резкое повышение или отсутствие изменений этого показателя в остром периоде заболевания могут свидетельствовать о тяжелом течении инфекционного процесса. Рядом авторов продемонстрировано патологическое действие на ЦНС высоких концентраций IL-6 [46, 67, 184]. В ходе проведенного исследования нами зарегистрировано повышение уровня IL-6 у пациентов с манифестными формами КЭ (табл. 11). Исключение составили вакцинированные пациенты с лихорадочной формой заболевания, у которых содержание в сыворотке крови IL-6 находилось в пределах вариабельности нормальных значений. У пациентов 3-ей группы средние значения содержания этого цитокина уже на 3-7 день заболевания четырехкратно превышали нормативные значения (16,2 (12,5-18,0) и 3,9±1,1, соответственно). Таким образом, раннее повышение содержания IL-6 в крови может быть расценено как прогностически неблагоприятный признак, соответствующий наиболее тяжелому течению болезни с поражением нервной системы. Нами было установлено, что уровень провоспалительного цитокина IFNγ, являющимся также иммунорегуляторным цитокином, у пациентов с манифестными формами КЭ был выше, чем у здоровых доноров (p≤0,05). При этом содержание IFNγ у вакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ значимо превышало таковое у невакцинированных пациентов этой группы (p=0,006). Соотношение IFNγ/IL-4, характеризующее уровень цитокинового баланса Th1- и Th2-лимфоцитов, у пациентов с лихорадочной формой КЭ и очаговыми формами КЭ (с неблагоприятным исходом) было значимо выше, чем в группе здоровых доноров (p≤0,05), что можно расценивать как поляризацию иммунного ответа в сторону Th1-типа. У пациентов с очаговыми 135 формами КЭ и благоприятным исходом показатели отношения IFNγ/IL-4 были ниже, чем в группе здоровых доноров (p≤0,05), что указывало на преобладание Th2-типа иммунного ответа. Для изучения резервного потенциала иммунокомпетентных клеток была проведена оценка способности клеток периферической крови пациентов с манифестными формами КЭ к продукции цитокинов ex vivo. Сравнительный анализ продукции цитокинов в культурах интактных и индуцированных КонА клеток цельной крови пациентов с различными формами КЭ показал, что при стимуляции КонА наблюдалось усиление продукции всех исследуемых цитокинов (IL-8, IL-1β, INFα, INFγ, IL-6, IL-4 и IL-10). При этом индекс стимуляции (ИС), характеризующий отношение индуцированной продукции цитокинов к интактной продукции, у лиц 1-ой группы находился в пределах вариабельности нормальных значений, что свидетельствовало о достаточных резервных возможностях клеток крови этих пациентов (p>0,05) (рис.7). Рисунок 7. Индекс стимуляции (индуцированной/интактной) продукции цитокинов у пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде заболевания 136 Значимое снижение этого показателя зарегистрировано только у пациентов с очаговой симптоматикой КЭ при исследовании продукции TNFα и IFNγ, что можно расценивать как ограниченные резервные возможности их иммунокомпетентных клеток. Таким образом, цитокиновый статус у пациентов с лихорадочной формой КЭ и легким течением заболевания в острой фазе инфекционного процесса характеризовался умеренной активацией цитокинов Th1-типа и цитокининдуцирующей способности клеток. Обнаружение у пациентов в первую неделю заболевания иммуносупрессорных изменений в системе цитокинов, а именно: снижение цитокининдуцирующей функции иммунокомпетентных клеток на фоне дефицита продукции провоспалительных цитокинов и ранней поляризации иммунного ответа в сторону Th2-типа, обусловило тяжелое течение заболевания (очаговые формы с благоприятным исходом). При летальном исходе у пациентов с очаговыми формами КЭ в острой фазе инфекционного процесса регистрировалась дисфункция цитокиновой системы активационного типа, характеризующаяся Th1-типом иммунного ответа и гиперпродукцией провоспалительных цитокинов, приведших к резкому снижению резервного потенциала иммунокомпетентных клеток. *** Комплексное изучение функционального состояния иммунной системы пациентов с манифестными формами КЭ показало, что неадекватность иммунного ответа в острой фазе инфекционного процесса во многом предопределяет тяжесть течения и исход заболевания. У пациентов с лихорадочной формой КЭ, невакцинированных против КЭ, несмотря на относительный Т-клеточный дефицит, выявлено увеличение количества NK- и NKT-клеток, преобладание крупномолекулярных ЦИК, умеренная активация системы комплемента и продукция провоспалительных цитокинов, что чаще обусловливало среднюю тяжесть течения инфекционного 137 процесса. У ранее вакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ было отмечено более легкое течение заболевания, что предопределялось сбалансированной активацией Т-клеточного и гуморального иммунитета, а также цитокинового ответа Th1-типа. В то же время, зарегистрированный в острой фазе инфекционного процесса глубокий Т-клеточный дефицит, а также дисфункция гуморальных факторов иммунитета и системы цитокинов, повлекли за собой тяжелое течение КЭ. У пациентов с очаговыми формами КЭ и летальным исходом был установлен выраженный дисбаланс различных звеньев иммунной системы: на фоне значительного снижения содержания Тлимфоцитов и отсутствия их активации, зарегистрирована чрезмерная активация системы комплемента и ранняя гиперпродукция провоспалительных цитокинов. Таким образом, различная степень иммуносупрессии у пациентов с инаппарантными и манифестными формами КЭ зависит от функциональной активности иммунной системы пациентов, которая разнопланово реагирует на возбудитель, попавший в организм. В последующем разделе работы будет изучено влияние разных по биологической и молекулярно-генетической характеристике штаммов вируса КЭ на функциональную иммунокомпетентных клеток в экспериментальных условиях. активность 138 Глава 7. Особенности взаимодействия дальневосточных штаммов вируса клещевого энцефалита с клетками иммунной системы ex vivo, in vitro и in vivo В настоящее время большое внимание исследователей в области молекулярной биологии флавивирусов, и в том числе вируса КЭ, уделяется поиску связи между мутациями в геноме вирусов и тяжестью заболевания [4, 5, 360, 376]. На протяжении двух последних десятилетий в НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН и Лимнологическом институте СО РАН под руководством Г.Н. Леоновой и С.И.Беликова проводятся исследования по изучению свойств штаммов вируса КЭ с различной молекулярно-генетической характеристикой. Было выполнено полногеномное секвенирование 35 штаммов вируса КЭ, изолированных от людей с различными формами заболевания. Установлено, что все штаммы вируса, независимо от тяжести заболевания, вызванного ими, принадлежат к дальневосточному субтипу вируса КЭ [5, 13]. По результатам полногеномного секвенирования штаммов ВКЭ было построено филогенетическое древо, на котором исследуемые штаммы сформировали три кластера (I - Oshima-, II – Sofjin-, III – Senzhang-подобные штаммы) [19]. Для выполнения дальнейших исследований мы целенаправленно выбрали из каждого кластера филогенетического древа по одному штамму (табл.12). Штамм Dal'negorsk (Dal), выделенный из мозга умершего с очаговой формой КЭ, относится к группе Sofjin-подобных штаммов. Штамм Kiparis-94 (К-94), изолированный из крови пациента с лихорадочной формой КЭ, расположился в группе Oshima-подобных штаммов. А штамм Primorye-196 (P-196), изолированный из крови пациента с инаппарантной формой КЭ, находится в группе Senzhang-подобных штаммов. Целью настоящего раздела исследований явилось изучение влияния штаммов ВКЭ с различной биологической и молекулярно-генетической характеристикой на функциональную активность иммунокомпетентных клеток. 139 Таблица 12 Характеристика штаммов вируса КЭ, изолированных от пациентов с разными формами КЭ Титр вируса на неинбредных мышах при п/к заражении (lgLD50 в 1 мл) Форма заболевания КЭ Материал изоляции Номер в GeneBank Титр вируса на СПЭВ (lgТЦД50) FJ402886 9,0 9,5 № Штаммы 1 Dal'negorsk (Dal) очаговая Мозг умершего больного 2 Kiparis-94 (К-94) Primorye-196 (P-196) лихорадочная кровь JQ825146 6,0 8,7 инаппарантная кровь JQ825155 5,0 3,7 3 Примечание: СПЭВ – перевиваемая культура клеток почек эмбриона свиньи; ТЦД50 – 50% тканевая цитопатическая доза; LD50 – 50% летальная доза. 7.1 Динамика экспрессии адгезионных и активационных маркеров на клетках крови ex vivo под влиянием штаммов вируса КЭ В последние годы пристальное внимание уделяется изучению начальных этапов вирусной инфекции, в том числе, взаимодействию вируса с клетками врожденного и адаптивного иммунитета. Модуляция вирусом экспрессии мембраноассоциированных структур этих клеток вызывает изменение их функциональной активности, что, во многом, предопределяет дальнейшее течение и исход инфекционного процесса. Следует отметить, что взаимодействия проводилось на в данном разделе работы штаммов вируса модели цельной с исследование иммунокомпетентными крови здоровых доноров клетками ex vivo. Использование цельной крови не требует выделения и подготовки клеток к культивированию, что устраняет неспецифическую активацию клеток на этапах сепарации, и при этом сохраняется существующий in vivo баланс различных 140 типов клеток крови. Следовательно, оценка экспрессии адгезионных и активационных маркеров на клетках цельной крови способствует максимальному отражению процессов, происходящих in vivo. В настоящих исследованиях были использованы два штамма ВКЭ (Dal и P-196), которые в дозе 2 lg ТЦД50/0,1мл вносили в пробы крови, полученной от здоровых доноров (n=10). В контрольных (без вируса) и опытных пробах, инкубированных в СО2-инкубаторе при 370С, через 3 и 24 часа оценивали экспрессию молекул адгезии и активации на поверхности клеток крови, а также определяли накопление вируса в клетках и в супернатантах. 7.1.1 Динамика накопления штаммов вируса КЭ в пробах цельной крови доноров Первоначально проведено изучение накопления антигена этих штаммов вируса КЭ в пробах донорской крови. Внутриклеточное накопление вируса оценивали по антигенной активности штаммов к специфическим антителам вируса КЭ в реакции НМФА, а во внеклеточной жидкости – по цитопатическому действию (рис.8). lgТЦД50 обратные титры антител 100 3 80 2.5 60 2 1.5 40 1 20 0.5 0 0 0ч 3ч 6ч Dal А 12 ч P-196 24 ч 0ч 3ч 6ч 12 ч Dal 24 ч P-196 Б Рисунок 8. Динамика репликации штаммов вируса КЭ в пробах донорской крови (n=10 доноров): А) в лейкоцитах крови (в реакции НМФА; Б) в супернатантах клеток (титрование на культуре клеток СПЭВ). По оси абсцисс – время наблюдения в часах, по оси ординат: А) обратные титры антител; Б) титры вируса в lg ТЦД50 . 141 Установлено, что динамика накопления вируса в клетках крови различается для штаммов ВКЭ (рис.8А). Так, к 24 часам после инфицирования штамм Dal, вызвавший очаговую форму инфекции, имел высокий показатель антигенной активности, его титр составил 1:80. К этому времени у штамма Р196, вызвавшего инаппарантную форму КЭ, этот показатель был значимо ниже, его титр составил 1:20. Накопление штаммов вируса во внеклеточной среде имело противоположную динамику (рис.8Б). Штамм Dal во внеклеточном пространстве был выявлен только к 24 часам. В то же время титр штамма Р196 в супернатантах клеток спустя 3 часа после заражения составлял 1,0±0,2 lg ТЦД50, а к 12 часам увеличился до 2,0±0,3 lg ТЦД50. 7.1.2 Влияние штаммов вируса КЭ на экспрессию молекул адгезии и активационного маркера CD69 клетками врожденного иммунитета На ранних этапах активации клеток врожденного иммунитета важную роль играют молекулы клеточной адгезии, опосредующие связывание клеток с внеклеточным матриксом или соседними клетками [210]. Среди молекул клеточной адгезии наиболее прямое отношение к межклеточным взаимодействиям в иммунных процессах, таких как клеточно-опосредованная цитотоксичность, фагоцитоз, хемотаксис и активация клеток, имеют интегрины и их рецепторы [440, 443]. Для объяснения механизмов начальной стадии активации клеток врожденного иммунитета под действием штаммов вируса КЭ было изучено их влияние на динамику экспрессии молекул CD11b, принадлежащих семейству β2-интегринов, и их лигандов - CD54, относящихся к суперсемейству иммуноглобулинов. Известно, что молекулы CD11b, конститутивно экспрессируются на моноцитах, гранулоцитах и NK-клетках [324, 486]. Проведенный нами цитометрический анализ экспрессии CD11b показал, что уже к 3-му часу инкубации клеток крови эти молекулы выявляются на поверхности 100% инфицированных и неинфицированных клеток. Однако уровень экспрессии 142 рецептора CD11b на поверхности клеток, оцениваемый по значению средней интенсивности флюоресценции (MFI), был различным в опытных и контрольных пробах (табл.13). Наибольший эффект в изменении экспрессии CD11b на клетках врожденного иммунитета оказывал P-196 штамм ВКЭ. Интенсивность флюоресценции исследуемых молекул адгезии на моноцитах, гранулоцитах (к 3-му часу) и NK-клетках (к 24-му часу) при инкубации их со штаммом P-196 была значимо выше, чем на неинфицированных клетках (p≤0,05), и клетках, инфицированных штаммом Dal (p≤0,05). При культивировании клеток крови со штаммом Dal вируса КЭ через 24 часа было зарегистрировано снижение экспрессии CD11b на моноцитах (p=0,030), в то же время на гранулоцитах и NK-клетках интенсивность флюоресценции исследуемых адгезивных молекул значимо не отличалась от таковой на интактных клетках (p>0,05). Другие исследуемые нами молекулы межклеточной адгезии - CD54 (ICAM-1) экспрессируются конститутивно на эндотелиальных клетках, а для их выраженной экспрессии на лейкоцитах периферической крови необходима активация клеток цитокинами – IL-1, IFNγ или TNFα [416]. В проведенных нами исследованиях максимальный уровень экспрессии CD54 на клетках крови отмечался через 24 часа инкубации (табл.13). Максимальная интенсивность флюоресценции исследуемого маркера отмечалась в популяции моноцитарных и гранулоцитарных клеток. Штамм P196 также увеличивал уровень экспрессии CD54 на моноцитах и гранулоцитах в 1,8 раза по сравнению с таковым на неинфицированных клетках (p≤0,05). В то же время при инфицировании клеток крови штаммом Dal выявлено значимое снижение интенсивности флюоресценции ICAM-1 на поверхности моноцитарных клеток (p=0,032), а на гранулоцитах и NK-клетках экспрессия CD54 была в пределах вариабельности значений в контрольных пробах. 143 Таблица 13 Динамика экспрессии адгезионных и активационных молекул на клетках врожденного иммунитета под действием штаммов ВКЭ Моноклоны Сроки наблюдения 3 часа Моноциты 24 часа P-196 Dal Kонтроль P-196 Dal Kонтроль P-196 Dal 1920 (1750-2100) 2700 (2460-2900) 1540 (1200-1800) p1=0,095 p2=0,005 1640 (1400-1890) p1=0,030 p2=0,006 81 (65-90) p1=0,119 p2=0,016 104 (85-115) p1=0,032 p2=0,005 30 (25-37) p1=0,802 p2=0,110 31 (26-36) p1=0,016 p2=0,000 1380 (1230-1500) 1850 (1610-1930) 1254 (1185-1400) p1=0,343 p2=0,021 1300 (1250-1520) p1=0,114 p2=0,002 22 (15-25) p1=0,801 p2=0,814 74 (66-92) p1=0,310 p2=0,000 22 (18-28) p1=1,000 p2=0,514 29 (25-36) p1=0,293 p2=0,000 180 (150-200) 230 (190-250) 210 (175-232) p1=0,260 p2=0,493 220 (180-250) p1=0,888 p2=0,025 15 (10-19) p1=0,164 p2=0,505 21 (18-28) p1=0,641 p2=0,663 16 (14-19) p1=0,464 p2=0,079 17 (14-20) p1=0,033 p2=0,000 2110 (1900-2430) 3250 (3010-3450) p1=0,012 3 часа 101 (85-112) 120 (109-131) p1=0,211 CD54 24 часа 133 (123-154) 216 (182-250) p1=0,007 3 часа 31 (25-35) 39 (33-44) p1=0,075 CD69 24 часа NK-клетки (CD56) Kонтроль p1=0,032 CD11b Гранулоциты 46 (38-51) 199 (170-220) p1=0,000 p1=0,038 1540 (1330-1710) 2604 (2180-2920) p1=0,004 21 (18-26) 23 (17-29) p1=0,583 86 (70-93) 158 (136-170) p1=0,002 22 (18-26) 24 (20-28) p1=0,512 26 (21-31) 119 (100-135) p1=0,000 p1=0,092 216 (183-240) 315 (262-338) p1=0,020 11 (8-15) 13 (9-17) p1=0,397 22 (16-25) 26 (19-30) p1=0,360 18 (15-21) 22 (18-25) p1=0,154 28 (24-33) 208 (186-240) p1=0,000 Примечание: данные представлены в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI), для которых указана медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей); р1 - значимость различий между показателями опытной и контрольной группы; р2 - значимость различий показателей между опытными группами; (критерий Вилкоксона для связанных выборок); n=10 доноров. 144 Молекула CD69 является самым ранним активационным антигеном, экспрессирующимся на поверхности лимфоцитов, моноцитов и NK-клеток в течение 1-2 часов после активации клеток [224, 279, 326, 374]. В то же время, Craston R. et al. (1997) показали, что динамика экспрессии CD69 во многом зависит как от типа клеток, на которых этот маркер экспрессируется, так и от типа стимуляции. Нами установлено, что через 24 часа инкубации клеток крови со штаммом P-196 вируса КЭ уровень экспрессии CD69 на моноцитах и гранулоцитах увеличивался в 4,5 раза, а на NK-клетках в 7,5 раз по сравнению с таковым на неинфицированных клетках (p≤0,05) (табл.13). Инфицирование клеток крови штаммом Dal в эти же сроки выявило значимое снижение интенсивности флюоресценции CD69 на поверхности моноцитов и NK-клеток по сравнению с таковой на неинфицированных клетках (p≤0,05). На рис.9 представлен пример распределения активационного маркера CD69 на моноцитах периферической крови доноров через 24 часа культивирования со штаммами ВКЭ. 7.1.3 Влияние штаммов вируса КЭ на экспрессию активационных молекул Тлимфоцитами и NK-клетками периферической крови человека Передача активационного сигнала, приводящего к активации лимфоцитов, состоит в развитии каскада реакций, завершающихся экспрессией различных генов и их рецепторов на поверхности клетки, так называемых активационных антигенов лимфоцитов. Описано несколько десятков активационных антигенов, экспрессирующихся на мембране лимфоцитов [156]. Наиболее часто в качестве маркеров активации исследуют CD69, CD25 и CD95, экспрессия которых характеризует прохождение определенного этапа клеточного цикла. В проведенных нами исследованиях установлено, что через 3 часа инкубации клеток крови со штаммами вируса КЭ количество Т-лимфоцитов и 145 А Б В Рисунок 9. Уровень экспрессии активационного маркера CD69 на поверхности моноцитов через 24 часа инкубации клеток крови со штаммами вируса КЭ. А) Неинфицированные клетки; Б) клетки крови, инкубированные со штаммом P-196 ВКЭ; В) клетки крови, инкубированные со штаммом Dal ВКЭ. Левый пик – флуоресценция клеток при использовании изотипического контроля, правый - флуоресценция клеток при окрашивании CD69 PE. По оси ординат – количество клеток, по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции. 146 NK-клеток, экспрессирующих CD69, не отличалось от показателей в контрольных пробах (p>0,05). После 24 часов инкубации клеток крови со штаммом вируса Р-196 выявили значимое увеличение экспрессии этого активационного маркера на NK-клетках и на субпопуляциях Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+) и по сравнению с неинфицированными клетками (p≤0,05) (рис.10, рис.11А). Наиболее значимое повышение уровня CD69 зарегистрировано на NK-лимфоцитах. После инкубации клеток с Dal штаммом вируса экспрессия CD69 на поверхности NK-клеток и CD8+-Т-лимфоцитов была значимо снижена по сравнению с неинфицированными клетками (p≤0,05) (рис.10, рис.11А). CD69 имеет прямое отношение к активации генов, ответственных за синтез IL-2, и сигналы, поступающие от CD69, вызывают увеличение продукции этого цитокина и количества рецепторов к нему на клетках - CD25 [374]. Экспрессия CD25 является обязательным этапом активации иммунной системы и признаком готовности лимфоцитов к вступлению в пролиферацию и дифференцировку. В свою очередь, величина экспрессии активационного маркера CD95 (Fas-антиген) отражает готовность лимфоцитов вступить в апоптоз. Взаимодействие Fas-рецептора клетки-мишени с Fas-лигандом, экспрессируемым цитотоксическими Т-лимфоцитами, запускает апоптотический механизм цитолиза клетки-мишени [350]. Мы зарегистрировали увеличение уровня экспрессии CD25 только на CD8+-Т-лимфоцитах и NK-клетках через 24 часа инкубации клеток крови с Р196 штаммом вируса КЭ (рис.11Б). При этом доля NK-клеток, экспрессирующих CD25, увеличилась до 18,6±3,7% (контроль – 6,2±1,8%), а CD8+-лимфоцитов – до 9,3±2,1% (контроль – 3,0±0,9%). Можно предположить, что индукция вирусом экспрессии этого активационного маркера на CD8 +-Тлимфоцитах свидетельствует о готовности этих клеток вступить в пролиферацию, а повышение экспрессии на NK-клетках, вероятно, сопряжено с усилением их цитотоксической функции. К этому периоду наблюдения на клетках, инкубированных с Dal штаммом вируса, отмечалось значимое 147 Рисунок 10. Экспрессия активационного маркера CD69 на NK-клетках (CD3CD56+), CD3+CD8+-лимфоцитах, CD3+CD4+-лимфоцитах периферической крови доноров через 24 часа инкубации со штаммами вируса КЭ. Верхний ряд – неинфицированные клетки, средний – клетки, инфицированные штаммом P196 ВКЭ, нижний – клетки, инфицированные штаммом Dal ВКЭ. 148 снижение экспрессии CD25 на CD8+-лимфоцитах и NK-клетках по сравнению с таковой на неинфицированных клетках (рис.11Б). Исследование экспрессии активационного маркера CD95 на лимфоцитах показало, что через 24 часа его уровень повышен только на CD56-лимфоцитах, инкубированных с Р-196 штаммом вируса КЭ (рис.11В). Этот штамм вируса индуцировал 13,0±3,3% клеток, готовых вступить в апоптоз (в контроле – 6,1±1,8%). Инфицирование клеток штаммом Dal значимо снижало экспрессию CD95 на NK-клетках (p≤0,05). Таким образом, в результате изучения влияния разных штаммов вируса КЭ на процесс ранней активации клеток крови выявлено их разнонаправленное действие на моноциты, гранулоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки человека. Так, в течение 24 часов (исследуемый нами период времени) штамм Р-196, вызвавший инаппарантную форму КЭ, усиливал экспрессию молекул межклеточной адгезии и активационных молекул на мембранах клеток (рис.9, рис.10, рис.11), а штамм Dal – снижал экспрессию данных молекул (рис.9, рис.10, рис.11). Мы установили, что штамм Dal, являясь высоковирулентным для человека, активно размножается в клетках крови в течение первых 24 часов (рис.8А), но при этом наблюдается замедленный выход вирусных частиц во внеклеточное пространство (рис.8Б). Можно предположить, что аналогично другим высоковирулентным штаммам ВКЭ [466], активная репликация Dal штамма вируса КЭ происходит во внутриклеточных эндоплазматических компартментах, недоступных для PRRs. Это обусловливает задержку по времени индукции активации этих клеток, более поздний синтез биологически активных веществ, в том числе и IFN, что, в конечном итоге, позволяет вирусу более эффективно распространяться в организме. В эти же сроки наблюдения (24 часа) другой штамм вируса КЭ – Р-196, являясь слабовирулентным для человека, характеризовался замедленным проникновением в клетки крови, невысоким уровнем накопления вируса в них 149 90 25 * 80 CD25 (%) CD69 (%) 60 15 50 * 40 * 10 * * 20 5 * * * 10 0 0 CD4+ CD8+ Контроль P-196 А CD56+ Dal * 16 CD95 (%) 20 70 30 20 * 12 8 * 4 0 CD4+ CD8+ Контроль Р-196 Б CD56+ Dal CD4+ Контроль CD8+ Р-196 CD56+ Dal В Рисунок 11. Экспрессия активационных молекул на поверхности NK-клеток (CD56) и Т-лимфоцитов (CD4 и CD8) через 24 часа инкубации со штаммами вируса КЭ, выраженная в %: А) экспрессия CD69; Б) экспрессия CD25; В) экспрессия CD95. Примечание: * - значимость различий между показателями в опытных и контрольных пробах (p≤0,05); (критерий Вилкоксона для связанных выборок); n=10 доноров. 150 (рис.8А) и активным выходом из клеток во внеклеточное пространство (рис.8Б). Тем не менее, репликация в клетках этого штамма, отличающегося по своей биологической характеристике от штамма Dal, инициировала раннюю активацию клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Усиление экспрессии штаммом Р-196 ранних активационных маркеров на моноцитах, NK-клетках и CD8+Т-лимфоцитах, т.е. на клетках, способных оказывать цитотоксическое действие на инфицированные клетки-мишени, свидетельствует о запуске каскада защитных механизмов, способствующих эффективной элиминации этого штамма. Следующим этапом в изучении влияния штаммов ВКЭ на функциональную активность иммунокомпетентных клеток in vitro стало исследование продукции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами крови. 7.2 Динамика продукции цитокинов лейкоцитами крови in vitro под влиянием штаммов вируса КЭ с разной биологической характеристикой В настоящее время активно изучается модуляция продукции цитокинов различными вирусами, во многом обусловливающая тяжесть и характер течения инфекционного процесса [38, 39]. Исследование продукции и секреции цитокинов в модельных системах in vitro позволяет оценить раннюю реакцию клеток в ответ на воздействие различных стимулов, в том числе и вирусных антигенов [166, 238]. В данном разделе работы процесс взаимодействия вируса КЭ с иммунокомпетентными клетками воспроизводился на мононуклеарных лейкоцитах человека, выделенных из крови здоровых доноров (n=10), которые инфицировали штаммами (Dal, Kip-94, Р-196) ВКЭ в одинаковой дозе 2 lg ТЦД50/1х106. Этот методический прием позволил нам более длительно (в течение 5 суток) наблюдать за особенностями накопления штаммов вируса в культуре мононуклеарных лейкоцитов и дать характеристику изменений продукции цитокинов в зависимости от штамма вируса и продолжительности антигенной стимуляции. 151 7.2.1 Динамика накопления штаммов вируса КЭ в супернатантах культуры мононуклеарных клеток человека Проведено сравнительное изучение накопления штаммов (Dal, Kip-94, Р-196) вируса КЭ, выделенных у больных с различными формами заболевания, в культуральной жидкости мононуклеарных лейкоцитов (рис.12). lg ТЦД50 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0ч 3ч 6ч Dal 12 ч 24 ч Kip-94 2с 3с 4с 5с P-196 Рисунок 12. Динамика репродукции штаммов вируса КЭ в супернатантах культуры мононуклеарных клеток человека (n=10 доноров). По оси абсцисс – время наблюдения в часах и сутках, по оси ординат – титры вируса в lg ТЦД50 (титрование на культуре клеток СПЭВ). Установлено, что штамм Dal, выделенный от больного с очаговой формой инфекции, проявляет способность к накоплению вируса в супернатантах клеток только через 24 час. Затем показатели титров вируса быстро увеличивались в динамике с максимальными значениями на 2-3 сутки после инфицирования (3,0±0,5 lgТЦД50), проявляя выраженное цитопатическое действие до конца срока наблюдения. Штамм Kip-94, выделенный от больного с лихорадочной формой КЭ, медленнее накапливался в супернатантах культур клеток, достигая максимальных значений к 4-м суткам после инфицирования (2,0±0,4 lgТЦД50). При инфицировании культуры лейкоцитов штаммом Р-196, выделенным от пациента с инаппарантной формой инфекции, через 6 часов в культуральной жидкости отмечали наличие вируса (1,0±0,2 lgТЦД50). Затем происходило 152 длительное до 4-х сут удержание показателей количества вируса на этом уровне и только к 5-м суткам отмечалось их некоторое повышение (1,5±0,2 lgТЦД50). Судя по этим данным, можно сказать о том, что высоковирулентный штамм Dal (из кластера Sofjin-подобных штаммов) быстро проникает в мононуклеарные лейкоциты и активно реплицируется в них на протяжении 24 час, и затем вирус из клеток поступает в культуральную жидкость, где происходит его быстрое накопление. Штаммы Kip-94 (из кластера Oshimaподобных штаммов) и P-196 (из кластера Senzhang-подобных штаммов) накапливались в культуральной жидкости гораздо медленнее. Вероятно, несхожесть механизмов накопления штаммов внутри клеток и в культуральной жидкости сопряжена с их особенностями молекулярно-генетической характеристики. Также для других вирусов (WNV и вируса гриппа А) было показано, что ускоренная репликация вируса является одной из вирусных стратегий избегания иммунного, в том числе IFN ответа организма [253, 278, 332, 412]. 7.2.2 Влияние штаммов ВКЭ на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками крови in vitro Цитокин IL-8, относящийся к группе СХС-хемокинов, продуцируется многими видами клеток под действием разных флавивирусов, в том числе и вируса КЭ [203, 255, 349, 404]. Нами было установлено, что штаммы вируса КЭ активно индуцируют in vitro продукцию IL-8 мононуклеарными лейкоцитами во все сроки наблюдения. Цитокининдуцирующая активность штамма вируса Dal была значимо выше, чем у штаммов Kip-94 и P-196 (p≤0,05), в то же время значения показателей продукции IL-8, индуцируемых штаммами Kip-94 и P196, не отличались между собой (p>0,05) (табл.14). Уровень продукции IL-8 клетками, инфицированными штаммом Dal, повышался ко 2-м суткам культивирования, достигая пика на 3-и сутки, и оставался на высоком уровне до конца срока наблюдения. Максимальные 153 значения показателей продукции исследуемого цитокина при инфицировании клеток штаммом Dal (1360 (1260-1400) pg/ml) были в 2,6 раза выше, чем в неинфицированной культуре клеток (515 (450-585) pg/ml). Наибольшая цитокининдуцирующая активность штамма Kip-94 зарегистрирована на 4-е сутки культивирования клеток (990 (926-1155) pg/ml, в контроле - 550 (495-600) pg/ml, p=0,002), а у штамма P-196 – на 5-е сутки (790 (705-950) pg/ml, в контроле – 580 (510-645) pg/ml, p=0,043). Полученные нами данные совпадают с результатами исследований других авторов [233, 242, 377, 428], показавших, что белок NS5 флавивирусов DENV и HCV индуцирует экспрессию IL-8 в культуре дендритных и мононуклеарных клеток человека. Кроме того, этими авторами была выявлена нейтрализация IL-8, индуцированным флавивирусами, противовирусного действия IFNα, что способствовало усилению вирусной репликации. TNFα продуцируется, главным образом, активированными моноцитами и макрофагами в ответ на воздействие различных флавивирусов как in vitro, так и in vivo [46, 217, 233, 319, 387, 428]. Мы установили, что исследуемые штаммы вируса КЭ стимулировали in vitro продукцию TNFα с первых суток культивирования их с мононуклеарными лейкоцитами (табл.14). Однако интенсивность продукции этого цитокина, вырабатываемого клетками под воздействием вируса, отличалась у разных штаммов. Наиболее высокую цитокининдуцирующую активность проявлял штамм Dal. Для этого штамма была характерна следующая динамика индукции TNFα: показатели продукции цитокина невысокие в 1-е сутки культивирования клеток резко увеличились ко 2-м суткам, достигли своего пика к 3-м суткам, затем постепенно снижались к 5-м суткам наблюдения. При этом максимальные значения показателей продукции цитокина при инфицировании клеток штаммом Dal (62,9 (54,0-71,3) pg/ml) были в 10 раз выше, чем в неинфицированной культуре клеток (5,4 (4,06,8) pg/ml). Динамика индукции TNFα штаммами Kip-94 и P-196 была иная: показатели продукции цитокина увеличивались постепенно, достигая своего 154 Таблица 14 Динамика продукции провоспалительных цитокинов (pg/ml) в культуре мононуклеарных лейкоцитов человека, инфицированных разными штаммами вируса клещевого энцефалита Цитокины Штаммы Контроль Dal IL-8 Kip-94 P-196 Контроль Dal TNFα Kip-94 P-196 1 сут Me p (LQ-UQ) 450 (380-540) 525 p1=0,322 (420-590) 630 p1=0,032 (510-726) p2=0,233 720 p1=0,012 (670-828) p2=0,040 4,8 (3,8-6,3) 10,5 p1=0,000 (8,4-12,5) 16,8 p1=0,000 (13,8-19,2) p2=0,030 22,0 p1=0,000 (19,8-26,3) p2=0,002 2 сут Me p (LQ-UQ) 480 (400-555) 1190 p1=0,000 (910-1250) 800 p1=0,005 (705-918) p2=0,013 750 p1=0,009 (680-850) p2=0,006 5,3 (4,0-6,6) 53,4 p1=0,000 (46,6-59,3) 20,9 p1=0,000 (16,7-23,4) p2=0,000 24,7 p1=0,000 (20,0-27,0) p2=0,001 Дни после инфицирования 3 сут 4 сут Me Me p p (LQ-UQ) (LQ-UQ) 515 550 (450-585) (495-600) 1360 1320 p1=0,000 p1=0,000 (1260-1400) (1100-1395) 925 p1=0,002 990 p1=0,002 (890-1100) p2=0,018 (926-1155) p2=0,043 775 p1=0,014 780 p1=0,027 (620-910) p2=0,003 (695-936) p2=0,004 5,4 5,0 (4,0-6,8) (3,5-6,0) 62,9 p1=0,000 54,4 p1=0,000 (54,0-71,3) (48,3-60,5) 30,5 p1=0,000 36,2 p1=0,000 (24,9-35,0) p2=0,003 (30,0-41,1) p2=0,010 25,8 p1=0,000 28,4 p1=0,000 (21,5-28,0) p2=0,000 (24,1-32,1) p2=0,000 5 сут Me p (LQ-UQ) 580 (510-645) 1250 p1=0,000 (1080-1400) 890 p1=0,011 (750-1000) p2=0,031 790 p1=0,043 (705-950) p2=0,004 4,9 (3,4-5,6) 45,8 p1=0,000 (35,5-51,6) 34,7 p1=0,000 (28,0-38,5) p2=0,063 30,8 p1=0,000 (23,1-35,0) p2=0,038 Примечание: Mе (LQ-UQ) – медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей); р1 - значимость различий между показателями продукции цитокинов мононуклеарными клетками, неинфицированными (контроль) и инфицированными штаммами вируса; p2 - значимость различий между показателями продукции цитокинов мононуклеарными клетками, инфицированными штаммом Dal, и другими штаммами вируса; (критерий Вилкоксона для связанных выборок); n=10 доноров. 155 максимального значения к 4-м суткам культивирования клеток со штаммом Kip-94 (36,2 (30,0-41,1) pg/ml), и к 5-м суткам инкубации со штаммом P-196 (30,8 (23,1-35,0) pg/ml). Значения показателей продукции TNFα, индуцируемых штаммами Kip-94 и P-196, значимо между собой не отличались (p>0,05) (табл.14). Как видно из представленных данных в табл. 14, динамика продукции провоспалительных цитокинов (IL-8 и TNFα) мононуклеарными лейкоцитами сопряжена с динамикой накопления изучаемых штаммов в супернатантах клеток. Вероятно, выявленная нами ранняя и умеренная продукция IL-8 и TNFα мононуклеарными лейкоцитами под действием штаммов P-196 и Kip-94 способствует повышению на этих клетках экспрессии адгезионных и активационных молекул и усилению их цитотоксической активности. Можно предположить, что активация защитных функций клеток, в конечном итоге, обусловливает замедленное накопление супернатантах клеток. штаммов P-196 и Kip-94 в В то же время, зарегистрированные на 2-3 сутки высокие уровни продукции провоспалительных цитокинов, индуцируемые штаммом Dal, по-видимому, вызывают повреждение иммунокомпетентных клеток, и, тем самым, не предотвращают быстрого размножения вируса. Таким образом, модуляция штаммами вируса КЭ продукции провоспалительных цитокинов является одним из механизмов, обеспечивающих влияние вируса на развитие воспалительной реакции на ранних этапах инфекционного процесса. 7.2.3 Влияние штаммов ВКЭ на продукцию интерферонов I и II типов мононуклеарными клетками крови in vitro Интерфероны I типа (IFNα/β) продуцируются различными типами клеток и основными индукторами их являются РНК вирусов. Наиболее важным свойством этих интерферонов является способность их оказывать прямое противовирусное действие, что во многом определяет течение и исход вирусных инфекций [36, 216, 363, 409]. 156 При изучении влияния штаммов вируса КЭ на продукцию IFNα мононуклеарными клетками in vitro нами были выявлена различная интерферониндуцирующая активность штаммов (табл.15). Минимальной способностью индуцировать продукцию IFNα обладал штамм Dal, а максимальной – штамм P-196. Наиболее интенсивная продукция исследуемого цитокина клетками отмечалась для всех штаммов в течение первых суток после инфицирования. Так, для штамма Dal медиана и интерквартильный размах значений концентраций IFNα в этот срок составили 5,6 (4,0-7,0) pg/ml; для штамма Kip-94 -14,3 (10,5-16,5) pg/ml; для штамма P-196 - 25,0 (20,5-29,5) pg/ml; в контроле -1,6 (1,0-2,0) pg/ml. В последующие дни, по мере накопления вируса в культуральной жидкости, способность мононуклеарных клеток продуцировать IFNα снижалась. Однако до конца эксперимента различия уровней продукции исследуемого цитокина клетками, инфицированными разными штаммами ВКЭ, были статистически значимы (p=0,000). Анализ продукции IFNα мононуклеарными лейкоцитами in vitro показал, что штамм Dal вируса КЭ, обладающий высоким цитопатическим действием, индуцирует низкий уровень продукции этого цитокина. По сравнению с этим высоковирулентным штаммом, штамм Kip-94, вызвавший лихорадочную форму инфекции, индуцировал в 2,5 раза более высокий уровень продукции IFNα. А штамм P196, изолированный от пациента с инаппарантной формой КЭ, продемонстрировал высокую интерферониндуцирующую активность, в 4,5 раза превосходящую таковую у штамма Dal. Полученные нами данные подтверждаются исследованиями авторов [178, 332], установившими, что вирулентность ряда коррелирует с их способностью ингибировать флавивирусов прямо IFN-зависимую сигнальную трансдукцию. Вероятно, цитопатическая активность штаммов ВКЭ с различной молекулярно-генетической характеристикой во многом обусловлена их способностью, в разной степени, подавлять индукцию IFNα. 157 Таблица 15 Динамика продукции интерферонов I и II типов (pg/ml) в культуре мононуклеарных лейкоцитов человека, инфицированных разными штаммами вируса клещевого энцефалита Цитокины Штаммы Контроль Dal IFNα Kip-94 P-196 Контроль Dal IFNγ Kip-94 P-196 1 сут Me p (LQ-UQ) 1,6 (1,0-2,0) 5,6 p1=0,000 (4,0-7,0) 14,3 p1=0,000 (10,5-16,5) p2=0,004 25,0 p1=0,000 (20,5-29,5) p2=0,000 8,5 (6,3-9,8) 9,6 p1=0,463 (7,3-10,5) 13,1 p1=0,016 (10,8-15,1) p2= 0,041 14,6 p1=0,011 (11,9-16,2) p2= 0,032 Дни после инфицирования 2 сут 3 сут 4 сут Me Me Me p p p (LQ-UQ) (LQ-UQ) (LQ-UQ) 1,7 2,0 2,3 (1,0-2,2) (1,0-3,0) (1,5-3,0) 5,0 4,8 4,6 p1=0,002 p1=0,003 p1=0,012 (3,5-7,0) (3,0-6,0) (3,0-6,0) 13,7 p1=0,000 12,5 p1=0,000 9,9 p1=0,000 (10,3-16,7) p2=0,000 (9,4-14,3) p2=0,000 (6,9-12,0) p2=0,007 22,2 p1=0,000 21,7 p1=0,000 17,8 p1=0,000 (17,5-25,8) p2=0,000 (15,0-26,0) p2=0,000 (13,6-21,2) p2=0,000 9,5 9,2 8,5 (7,1-11,9) (6,9-11,5) (6,4-10,6) 24,3 p1=0,000 31,9 p1=0,000 22,5 p1=0,000 (20,5-28,3) (25,3-38,1) (18,5-26,7) 16,7 p1=0,003 22,7 p1=0,001 35,0 p1=0,000 (13,5-18,9) p2= 0,021 (18,5-26,1) p2=0,043 (28,3-39,4) p2=0,015 15,4 p1=0,019 15,6 p1=0,012 17,6 p1=0,003 (12,6-17,9) p2= 0,024 (13,0-18,0) p2= 0,000 (14,2-19,1) p2=0,162 5 сут Me p (LQ-UQ) 2,8 (2,0-3,5) 3,9 p1=0,126 (3,0-5,5) 7,8 p1=0,002 (5,5-9,2) p2=0,010 12,7 p1=0,000 (9,0-15,5) p2=0,000 8,1 (6,0-10,1) 15,5 p1=0,005 (11,9-17,5) 29,6 p1=0,000 (22,7-31,2) p2= 0,009 18,9 p1=0,000 (15,3-21,4) p2=0,093 Примечание: Mе (LQ-UQ) – медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей); р1 - значимость различий между показателями продукции цитокинов мононуклеарными клетками, неинфицированными (контроль) и инфицированными штаммами вируса; p2 - значимость различий между показателями продукции цитокинов мононуклеарными клетками, инфицированными штаммом Dal, и другими штаммами вируса; (критерий Вилкоксона для связанных выборок); n=10 доноров. 158 Основным источником IFNγ служат лимфоидные клетки. При отсутствии иммунного ответа его преимущественно продуцируют NK- и NKT-клетки, при иммунном ответе - цитотоксические CD8+T-лимфоциты, Th1-клетки [52, 174]. Проведенный нами анализ динамики продукции IFNγ мононуклеарными лейкоцитами, инфицированными штаммами вируса КЭ, показал, что она во многом совпадает с динамикой продукции провоспалительных цитокинов (табл.15). Так, наибольшая цитокининдуцирующая активность штамма Dal была выявлена на 3-и сутки культивирования клеток (31,9 (25,3-38,1) pg/ml), штамма Kip-94 – на 4-е сутки (35,0 (28,3-39,4) pg/ml), штамма P-196 – на 5-е сутки (18,9 (15,3-21,4) pg/ml). Обращает на себя внимание ранняя индукция продукции IFNγ клетками, инфицированными штаммами Kip-94 и P-196. Поскольку стимуляция продукции IFNγ штаммами ВКЭ наблюдалась в культуре мононуклеарных лейкоцитов, то, вероятно, в этом процессе принимают участие NK-клетки, обеспечивающие раннюю продукцию и секрецию IFNγ, необходимую для дифференцировки Тh1-клеток [154, 173]. В предыдущих разделах нами была выявлена активация NK-клеток штаммом P196 в течение 24 часов после инфицирования, это позволяет предположить участие активированных NK-клеток в ранней продукции и секреции IFNγ при инфицировании P-196 штаммом и, вероятно, Kip-94 штаммом вируса. Штаммы вируса КЭ, выделенные от пациентов с инаппарантной и манифестными формами КЭ, проявляют in различную vitro цитокининдуцирующую активность. Штамм Dal, изолированный от больного с очаговой формой инфекции, активно размножается в супернатантах мононуклеарных клеток. Этот штамм индуцирует высокие уровни продукции клетками провоспалительных цитокинов (IL-8 и TNFα) и IFNγ, подавляя секрецию IFNα. Штаммы, выделенные от пациентов с лихорадочной и инаппарантной формой инфекции (Kip-94 и P-196), медленнее размножаются в культуре клеток, стимулируя умеренную продукцию клетками провоспалительных цитокинов и раннюю продукцию IFN I и II типов. При этом 159 штамм P-196 значимо отличается от других штаммов высоким уровнем индукции IFNα. Таким образом, продемонстрирована различная способность штаммов вируса КЭ, влияющая на ранние этапы инфекционного процесса и модулирующая экспрессию адгезионных и активационных маркеров на поверхности иммунокомпетентных клеток и секрецию цитокинов этими клетками. 7.3 Продукция цитокинов у мышей линии BALB/c, инфицированных разными штаммами вируса КЭ В настоящее время активно исследуется роль цитокинов в патогенезе КЭ, их влияние на течение и исход заболевания [43, 57, 150, 203, 429]. Для изучения патогенеза заболевания и вовлеченности цитокинов в этот процесс, наиболее часто в качестве экспериментальной модели используют мышей линии BALB/c [46, 63, 387, 400, 469]. Следует отметить, что в подавляющем большинстве случаев моделирование данной инфекции осуществляется с применением классических высоковирулентных прототипных штаммов вируса КЭ (Sofjinподобные штаммы) [46, 63, 469]. В этой связи целью настоящего раздела работы явилось изучение вклада цитокинов в патогенез экспериментального КЭ, вызванного штаммами дальневосточного субтипа вируса КЭ (Sofjin-, Oshima- и Senzhang-подобные штаммы). Экспериментальные животные были разделены на группы, 3 инфицированные подкожно 3 lg ТЦД50/0,2мл штаммов Dal, Kip-94 и P-196 вируса КЭ, соответственно. Каждая из групп разделена на две подгруппы: животных одной подгруппы (n=20) использовали для контроля летальности, животных другой подгруппы – для получения образцов сыворотки крови и мозга на 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 21-е сутки. В эти сроки наблюдения в каждой группе использовано по 10 животных. Образцы сыворотки крови и мозга 160 неинфицированных животных использовали в качестве контроля при изучении продукции цитокинов. Сравнение 7.3.1 биологических свойств штаммов вируса КЭ при инфицировании мышей линии BALB/c (вирулентность, репродукция в крови и мозге) Нами установлено, что штаммы ВКЭ, при подкожном введении мышам линии BALB/c, проявляют разную степень вирулентности (рис.13). Критериями оценки вирулентности штаммов служили процент выживших животных и средняя продолжительность их жизни (СПЖ). Мыши, инфицированные штаммом Dal, заболели на 5-6 сутки и к 9-му дню погибли. В этой группе животных СПЖ составила 7,1±1,8 дней. При заражении мышей штаммом Kip94 животные заболевали на 8-9 сутки и 70% животных погибали к 12 дню, СПЖ составила 13,4±3,4 дня. При введении штамма P-196 только некоторые животные заболевали на 9-10 сутки, и к 16 дню погибало 40% животных, СПЖ составила 17,7±4,4 дня. Сравнение показателей выживаемости, выявило значимые различия в СПЖ мышей, инфицированных разными штаммами ВКЭ. Рисунок 13. Выживаемость мышей линии BALB/c, подкожно инфицированных штаммами ВКЭ (3 lg ТЦД50/0,2мл). По оси абсцисс – выживаемость животных (%), по оси ординат – дни наблюдения; n=20 животных (в каждой группе). 161 Так, логранговый критерий (z – характеризует различия в выживаемости животных двух групп) для мышей, зараженных штаммами Dal и Kip-94, составил 4,992 (p=0,000), для животных, зараженных штаммами Kip-94 и P-196, z=2,444 (p=0,015). Для понимания механизма развития инфекционного процесса в организме мышей, зараженных разными штаммами ВКЭ, мы провели наблюдения за динамикой накопления вируса в органах мышей (Рис.14). Одинаковая заражающая доза (3 lg ТЦД50/0,2мл) для трех штаммов (Dal, Kip-94, P-196) показала различия в ходе развития патогенетического процесса. В крови все штаммы ВКЭ появились на 3-и сутки (рис.14А), но самый высокий показатель вирусемии зарегистрирован для штамма Dal (4,0±0,5 lg ТЦД50), а низкий - для штамма Р-196 (1,5±0,3 lg ТЦД50). При этом пик вирусемии для штаммов Dal и Kip-94 пришелся на 5 сутки, для Р-196 – на 5-7 сутки. lgТЦД50 lgТЦД50 7 5 6 4 5 3 4 3 2 2 1 0 0 сут 1 1 сут 3 сут Dal 5 сут 7 сут Kip-94 А 9 сут 11 сут P-196 0 0 сут 1 сут 3 сут Dal 5 сут 7 сут Kip-94 9 сут 11 сут P-196 Б Рисунок 14. Динамика накопления вируса в органах мышей линии BALB/c, зараженных разными штаммами вируса КЭ (А – в крови, Б – в мозге). По оси абсцисс – титр вируса в lg ТЦД50, по оси ординат – дни наблюдения; n=10 животных (для каждого срока наблюдения в каждой группе). 162 Прохождение гематоэнцефалического барьера для штаммов Dal и Kip-94 наступило на 5 сут, а для штамма Р-196 – на 7 сут (рис.14Б). Пик накопления вируса в мозге (5,5±0,6 lg ТЦД50) для штамма Dal наблюдали на 7 сут (начало гибели животных). Для штамма Kip-94 максимальный показатель (4,0±0,5 lg ТЦД50) был на 9 сут. Штамм Р-196 появляется в мозге инфицированных мышей только на 7-е сут (0,5±0,1 lg ТЦД50), затем титр вируса постепенно повышался, достигая максимума (2,0±0,4 lg ТЦД50) на 11 сут. Полученные результаты, показавшие высокую скорость накопления штамма Dal в крови, преодоление им ГЭБ и репликацию в мозге мышей, коррелируют с исследованиями других Sofjin-подобных штаммов ВКЭ [63, 217, 225, 237, 469]. Данные по изучению биологических свойств штамма Кip94, во многом совпадают с результатами изучения некоторых Oshima-подобных штаммов ВКЭ [387]. В то же время, проведенное нами сравнительное изучение Sofjen-, Oshima- и Senzhang-подобных молекулярно-генетическую отличаются по штаммов, имеющих показало, что характеристику, ряду биологических свойств разную эти штаммы (вирулентность, скорость репликации вируса), но при этом обладают достаточно высокой степенью патогенного потенциала для мышей линии BALB/c. 7.3.2. Динамика продукции цитокинов (TNFα, IL-6, IL-10, IFNγ) в крови и мозге мышей BALB/с, инфицированных штаммами вируса клещевого энцефалита а) в крови инфицированных мышей При изучении динамики продукции цитокинов нами была установлена разная скорость вовлечения провоспалительных цитокинов в инфекционный процесс, вызванный дальневосточными штаммами ВКЭ (табл.16). Так, уже в 1е сутки после заражения мышей штаммом Dal в сыворотке крови наблюдалось двукратное повышение уровня TNFα по сравнению с таковым у неинфицированных животных (25,8 (21,7-30,0) pg/ml и 13,6 (10,0-17,0) pg/ml, p=0,000). Максимальные значения концентрации зарегистрированы на 5-е сутки (68,5 (55,0-82,3) pg/ml). этого цитокина 163 Таблица 16 Динамика изменения продукции цитокинов (pg/ml) в сыворотке крови мышей линии BALB/c, инфицированных разными штаммами вируса клещевого энцефалита Цитокины Штаммы Контроль Dal TNFα Kip-94 P-196 Контроль Dal IL-6 Kip-94 P-196 Контроль Dal IFNγ Kip-94 P-196 1 сут Me (QL-QU) 13,6 (10,0-17,0) 25,8 (21,7-30,0) 18,8 (14,1-23,5) 16,9 (13,3-20,5) 7,8 (5,8-9,8) 8,5 (6,4-10,6) 7,8 (5,5-9,5) 7,6 (5,5-9,5) 10,5 (8,0-13,0) 13,6 (10,2-17,0) 11,4 (8,5-14,2) 10,0 (8,1-12,5) p 0,000 0,096 0,175 0,600 0,912 0,860 0,144 0,613 0,765 3 сут Me (QL-QU) 14,1 (10,6-17,6) 37,7 (32,0-42,3) 28,8 (22,0-36,0) 18,6 (14,5-22,0) 8,1 (6,0-10,2) 14,7 (11,0-18,4) 16,0 (12,8-20,1) 7,4 (5,6-9,6) 10,9 (8,2-13,5) 29,9 (22,4-34,4) 20,8 (16,6-24,4) 11,2 (8,5-14,0) p 0,000 0,003 0,130 0,008 0,006 0,539 0,000 0,007 0,867 Дни после заражения 5 сут 7 сут Me Me p (QL-QU) (QL-QU) 14,0 14,5 (10,5-17,6) (10,1-18,0) 68,5 59,8 0,000 (55,0-82,3) (47,8-70,5) 47,6 32,4 0,000 (36,5-52,9) (24,5-40,0) 19,1 26,4 0,098 (15,5-25,0) (19,4-33,0) 8,0 8,5 (6,0-10,4) (6,0-10,6) 38,4 65,9 0,000 (34,7-46,1) (52,7-80,1) 14,6 46,6 0,008 (10,8-18,0) (35,9-54,8) 7,8 10,5 0,866 (5,8-10,0) (8,3-12,6) 11,3 11,8 (8,5-14,0) (8,5-15,0) 41,8 78,8 0,000 (35,6-46,7) (60,6-91,5) 30,7 49,4 0,000 (24,6-37,1) (38,5-58,7) 15,4 17,1 0,093 (11,5-18,3) (14,3-21,5) p 9 сут Me (QL-QU) 14,3 (10,5-17,5) 0,000 - p 11 сут Me (QL-QU) 14,7 (10,0-18,3) p - 23,4 20,1 0,030 0,059 (18,9-29,0) (14,5-25,6) 19,8 14,4 0,013 0,065 0,904 (15,9-24,5) (11,3-17,4) 7,9 8,2 (5,5-9,8) (5,9-10,0) 0,002 0,000 - - 31,3 21,5 0,000 0,000 (25,9-36,1) (18,5-24,4) 13,3 11,3 0,087 0,038 0,059 (10,0-16,5) (9,8-14,0) 11,5 11,6 (8,6-14,5) (8,5-14,5) 0,000 0,000 - - 41,5 35,5 0,000 0,000 (33,1-45,6) (29,1-39,6) 19,2 15,9 0,060 0,045 0,104 (16,0-22,3) (12,0-20,7) 0,000 164 Цитокины Штаммы Контроль Dal IL-10 Kip-94 P-196 Контроль IFNγ / IL-10 Dal Kip-94 P-196 1 сут Me (QL-QU) 15,6 (11,7-19,5) 18,1 (13,6-21,0) 20,5 (16,4-23,6) 24,9 (19,4-30,1) 0,67 (0,50-0,80) 0,75 (0,60-0,95) 0,56 (0,40-0,75) 0,40 (0,30-0,50) p 0,375 0,126 0,022 0,503 0,296 0,016 3 сут Me (QL-QU) 16,0 (12,3-19,8) 21,8 (16,4-25,2) 21,0 (16,3-24,4) 25,6 (20,4-31,0) 0,68 (0,50-0,85) 1,37 (1,10-1,60) 0,99 (0,70-1,2) 0,44 (0,30-0,50) p 0,085 0,138 0,021 0,004 0,051 0,029 Дни после заражения 5 сут 7 сут Me Me p (QL-QU) (QL-QU) 16,2 16,3 (12,5-20,5) (12,0-20,2) 22,4 28,3 0,080 (17,0-27,9) (24,0-32,4) 23,4 24,8 0,058 (17,6-26,2) (19,6-30,0) 26,4 28,8 0,015 (20,5-31,0) (22,3-33,4) 0,70 0,70 (0,55-0,90) (0,55-0,90) 1,87 2,72 0,000 (1,60-2,15) (2,55-3,24) 1,31 1,99 ( 0,010 (1,00-1,55) 1,70-2,30) 0,58 0,59 0,271 (0,40-0,65) (0,45-0,70) p 9 сут Me (QL-QU) 16,1 (12,5-20,0) 0,009 - p 11 сут Me (QL-QU) 16,3 (12,5-20,5) p - 31,4 28,9 0,005 0,012 (25,6-36,2) (23,9-32,7) 32,1 33,8 0,006 0,002 0,000 (28,6-36,6) (29,0-39,2) 0,71 0,70 (0,60-0,90) (0,58-0,85) 0,026 0,000 - - 1,32 1,22 0,015 0,020 (1,02-1,50) (1,0-1,5) 0,60 0,48 0,278 0,556 0,039 (0,50-0,70) (0,30-0,60) 0,000 Примечание: Mе (LQ-UQ) – медиана и интерквартильный размах (значения 25 и 75 процентилей); р - значимость различий между концентрациями цитокинов в сыворотке крови неинфицированных мышей (контроль) и инфицированных штаммами вируса; « - » - гибель животных; (U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок); n=10 животных (для каждого срока наблюдения в каждой группе). 165 Пик продукции TNFα у мышей, инфицированных штаммом Kip-94, выявлен на 5-е сутки (47,6 (36,5-52,9) pg/ml), а у животных, зараженных штаммом P196, на 7-е сутки (26,4 (19,4-33,0) pg/ml). Как видно из представленных данных, максимальный уровень продукции TNFα сопряжен с пиком накопления штаммов вируса в крови инфицированных животных. Исследование продукции IL-6, одного из наиболее активных цитокинов, участвующих в реализации иммунного ответа и воспалительной реакции [67], выявило характерные особенности (табл.16). Концентрация IL-6 в сыворотке крови у мышей, зараженных штаммом Dal, прогрессивно увеличивалась, начиная с 3-х суток, и в терминальной стадии более чем в 8 раз превышала значения показателей у неинфицированных мышей (65,9 (52,7-80,1) pg/ml и 8,5 (6,0- 10,6) pg/ml, p=0,000). Максимальный уровень продукции IL-6 для штамма Kip-94 отмечен на 7-е сутки (46,6 (35,9-54,8) pg/ml), а для штамма P-196 – на 9-е сутки (13,3 (10,0-16,5) pg/ml) после инфицирования. Поскольку гиперпродукция провоспалительных цитокинов, включая TNFα и IL-6, увеличивает проницаемость ГЭБ [184, 217, 457], то выявленное в системном кровотоке повышение продукции TNFα и IL-6, индуцированное штаммами ВКЭ, вероятно, способствует проникновению этих штаммов через ГЭБ. Несмотря на склонность мышей линии BALB/c к развитию Th2опосредованных реакций [237, 333, 452], исследуемые штаммы ВКЭ вызывали активацию продукции IFNγ в крови инфицированных животных (табл.13). Пик продукции этого цитокина совпадал с таковым продукции другого цитокина IL-6. Максимальные значения концентрации IFNγ, индуцированные штаммом Dal и Kip-94, зарегистрированы на 7-й день (78,8 (60,6-91,5) pg/ml и 49,4 (38,558,7) pg/ml, соответственно), для штамма P-196 – на 9-й день (19,2 (16,0-22,3) pg/ml). Противовоспалительный провоспалительных цитокинов цитокин (TNFα IL-10, и IL-6) подавляя и IFNγ, продукцию в контексте инфекционного заболевания играет важную роль в сохранении баланса между 166 протективным иммунитетом и развитием иммунной патологии [340]. Нами было установлено, что при инфицировании мышей BALB/c штаммом Dal уровень продукции IL-10 отличался от такового у неинфицированных животных лишь на 7-е сутки (28,3 (24,0-32,4) pg/ml и 15,9 (12,0-20,2) pg/ml, p=0,009). Показатели соотношения концентраций IFNγ/IL-10 (табл.16) свидетельствовали о преобладании ярко выраженного Th1-типа иммунного ответа в этой группе животных (2,78 (2,55-3,24) и 0,70 (0,55-0,90) в контроле). В группе мышей, зараженных штаммом Kip-94, значимое повышение уровня IL10 отмечалось на 9-е сутки (31,4 (25,6-36,2) pg/ml). Судя по показателям отношения IFNγ/IL-10, в этой группе животных также развивался Th1-тип иммунного ответа. Следует отметить, что на протяжении всего эксперимента у мышей, инфицированных штаммом P-196, показатели продукции IL-10 превышали таковые в контрольной группе (значения интерквартильного размаха 19,5-39,2 pg/ml). Показатели отношения IFNγ/IL-10 свидетельствовали о подавлении в этой группе животных Th1-типа иммунного ответа (0,44 (0,30-0,50) и 0,70 (0,550,90) в контроле), что вероятно, предопределяет замедленное накопление вируса в крови и его длительную персистенцию в организме. Б) в мозге инфицированных мышей Одной из основных биологических характеристик ВКЭ является его способность преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в центральную нервную систему, определяя его нейроинвазивность. Ранее на модели неинбредных мышей было установлено [19], что исследуемые штаммы ВКЭ отличаются по индексу инвазивности (И.И.), который вычисляли по разнице показателей инфекционных титров при подкожном и внутримозговом заражении. Так, штамм Dal обладает высокой инвазавной активностью (И.И.=0,3±0,08 lg LD50/мл), штамм Kip-94 – средней степенью инвазивности (И.И.=2,0±0,5 lg LD50/мл), а штамм P-196 нейроинвазивностью (И.И.=4,5±1,1 lg LD50/мл). характеризовался слабой 167 Рисунок 15. Динамика продукции цитокинов в мозге мышей BALB/c, инфицированных штаммами ВКЭ. По оси абсцисс – концентрация цитокинов (pg/ml), по оси ординат – сроки наблюдения. Примечание: U-критерий Манна-Уитни для независимых выборок; n=10 животных (для каждого срока наблюдения в каждой группе). Продукцию про- и противовоспалительных цитокинов и IFNγ в мозге мышей BALB/c, инфицированных штаммами Dal и Kip-94, выявляли, начиная с 5 суток, а для штамма Р-196 – с 7 суток (рис.15), т.е. с начала проникновения вируса через ГЭБ. Максимальные уровни продукции этих цитокинов отмечались на пике репликации штаммов вируса в мозге зараженных 168 животных. При этом показатели продукции цитокинов TNFα, IL-6 и IFNγ в мозге мышей BALB/c, инфицированных разными штаммами ВКЭ, значимо различались во все сроки наблюдения (p≤0,05) (рис.15). Наиболее высокие показатели концентраций этих цитокинов зарегистрированы у мышей, инфицированных штаммом Dal. На 7-е сутки уровень продукции TNFα в мозге мышей, зараженных этим штаммом (96 (80116) pg/ml), в 12 раз превышал таковой у неинфицированных животных (8 (611) pg/ml). В мозге мышей, инфицированных штаммом Kip-94, уровень продукции цитокинов TNFα, IL-6 и IFNγ был значимо ниже такового при заражении животных штаммом Dal (p≤0,05). Так, в этой группе животных на 9-е сутки значения показателей концентрации TNFα (64 (50-77) pg/ml) в 8раз превышали таковые у неинфицированных животных, уровень продукции IL-6 (56 (45-67) pg/ml) – в 7 раз, IFNγ (105 (85-125) pg/ml) – в 10 раз был выше контрольных значений (рис.15). Штамм вируса P-196 индуцировал самый низкий уровень продукции провоспалительных цитокинов и IFNγ. При этом, максимальный уровень экспрессии TNFα и IL-6 на 9 сутки составлял 22 (16-25) pg/ml и 17 (1421) pg/ml; IFNγ – на 11 сутки – 27 (23-31) pg/ml. Необходимо отметить, что уровни продукции цитокинов TNFα, IL-6, IFNγ в мозге мышей, инфицированных штаммами Dal и Kip-94, были значимо выше, чем в крови (p≤0,05). В то же время для штамма P-196 уровни этих цитокинов в крови и мозге значимо не различались (p>0,05). Вероятно, это обусловлено более высокой нейровирулентностью и нейроинвазивностью штаммов Dal и Kip-94, по сравнению со штаммом P-196. Полученные нами результаты об усилении продукции TNFα, IL-6, IFNγ в мозге мышей, инфицированных штаммами ВКЭ, соотносятся с повышением титров вируса в мозге этих мышей. Аналогичные результаты показали другие авторы, связывающие увеличение экспрессии провоспалительных цитокинов и 169 IFNγ в мозге ВКЭ и JEV-инфицированных мышей со степенью проницаемости ГЭБ [217, 225, 237, 375]. Изучение продукции противовоспалительного цитокина IL-10 в мозге инфицированных мышей выявило особенности его динамики, характерные для разных штаммов ВКЭ (рис.15). В мозге мышей, зараженных штаммом Dal, в терминальной стадии инфекционного процесса уровень продукции IL-10 повышался лишь в 1,7 раза по сравнению с интактными животными (25 (20-29) pg/ml и 15 (11-19) pg/ml, соответственно). У мышей, инфицированных штаммами Kip-94, пик продукции этого цитокина отмечался на 9-е сутки (28 (25-32) pg/ml). Наиболее активно индуцировал экспрессию IL-10 штамм P-196, к 11-м суткам эксперимента показатели концентрации этого цитокина составили 48 (40-56) pg/ml. Полученные нами данные совпадают с результатами исследований V. Swarup et al. (2007), которые показали, что при летальной инфекции, вызванной вирусом JE, в мозге мышей BALB/c резко снижается продукция противовоспалительного цитокина IL-10, обладающего нейропротективным действием. Следует подчеркнуть, что направленность Thl/Th2 - поляризации иммунного ответа, выявленная в крови инфицированных животных, в мозге становится еще более выраженной. Изучение особенностей цитокинового профиля у мышей, инфицированных штаммами вируса КЭ, показало, что цитокининдуцирующая активность является одной из важных характеристик биологических свойств штаммов, которая предопределяет тип иммунного ответа организма и исход инфекции. В целом, результаты, представленные в этой главе, демонстрируют способность штаммов ВКЭ модулировать функциональную активность клеток врожденного и адаптивного иммунитета на ранних этапах инфекционного процесса. Размножаясь в иммунокомпетентных клетках, штаммы ВКЭ в разной степени индуцируют экспрессию молекул межклеточной адгезии и активационных маркеров на поверхности моноцитов, гранулоцитов, NK-клеток, 170 Т-лимфоцитов. Модулируя процессы ранней активации клеток врожденного и адаптивного иммунитета, штаммы ВКЭ изменяют тем самым последующие стадии развития их функционального ответа, в том числе продукцию цитокинов. Цитокининдуцирующая активность штаммов ВКЭ in vitro и in vivo непосредственно сопряжена с их биологическими свойствами (вирулентностью, скоростью репродукции и нейроинвазивностью). Степень тяжести течения и исход инфекционного процесса соотносятся с индуцированным штаммами вируса КЭ ранним дисбалансом продукции Thl/Th2 цитокинов. Таким образом, учитывая нейро- и иммунотропные свойства ВКЭ, лечение при клещевом энцефалите должно быть направлено не только на элиминацию возбудителя, но и на восстановление инверсированного иммунного ответа макроорганизма, а также на подавление индуцированных вирусом иммунопатологических реакций. 171 Глава 8. Изучение противовирусной активности биологически активных веществ морских гидробионтов при экспериментальном клещевом энцефалите До настоящего времени лечение КЭ, как и других вирусных инфекций, представляет собой сложную и нерешенную проблему. Тактика терапии КЭ предполагает обязательное проведение комплексной терапии - этиотропной, патогенетической и симптоматической [40, 47, 72, 144, 81, 145, 164]. Современный включает арсенал этиотропных средств противовирусной терапии специфичный против вируса КЭ противоклещевой - иммуноглобулин, и широкий спектр препаратов, обладающих активностью в отношении РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Противовирусные препараты, которые нашли применение в этиотропной терапии КЭ, по химическому составу, механизму действия, спектру активности и длительности клинического эффекта разделяются на 3 большие группы: 1) химиопрепараты; 2) интерфероны и их индукторы; 3) иммуномодуляторы [35]. Поскольку целесообразность применения в терапии КЭ препаратов специфических иммуноглобулинов неоднозначна [17, 110], а существующие противовирусные средства недостаточно эффективны, то поиск препаратов, которые бы не только ингибировали репликацию вируса и элиминировали его из организма, но и корригировали индуцированное вирусом иммунодефицитное состояние остается актуальным. Целью настоящего раздела исследования явилось изучение эффективности новых БАВ из морских гидробионтов, обладающих широким спектром биологического действия, в отношении вируса КЭ для обоснования возможности их применения в качестве противовирусных средств в комплексной терапии КЭ. Для сравнительного изучения противовирусной эффективности тинростима и люромарина были использованы как иммуноглобулин против КЭ, так и официнальные препараты из вышеперечисленных трех групп. В качестве 172 препарата сравнения из группы химиопрепаратов был выбран рибавирин, являющийся стандартным препаратом при терапии многих флавивирусных инфекций, в том числе и при КЭ. Интерфероны и индукторы IFN в нашей работе представлены синтетическими препаратами: рекомбинантным IFN-α – реафероном-ЕС и индукторами эндогенных IFNα/β – циклофероном и 4йодантипирином. Выбор биополимеров из морских гидробионтов - люромарина и тинростима, разработанных в лабораториях ТИБОХ ДВО РАН и ТИНРОцентре, определялся тем, что эти биополимеры обладают широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами. Изучение противовирусной активности тинростима и люромарина проводили согласно требованиям Фармакологического государственного комитета РФ по доклиническому исследованию лекарственных средств, разрабатываемых на основе растительного и животного сырья, морепродуктов и других источников природного происхождения [134]. В системе доклинического изучения новых лекарственных препаратов необходимо двухэтапное исследование противовирусной активности изучаемых препаратов на моделях in vitro и in vivo. 8.1 Изучение активности люромарина и тинростима in vitro в отношении вируса клещевого энцефалита Основными критериями оценки эффективности исследуемых препаратов в культуре клеток согласно [134] являются: показатели снижения инфекционного титра вируса (∆, lg), коэффициент ингибирования (Ки,%) и химиотерапевтический индекс (ХТИ). На начальном этапе исследований оценивалась токсичность изучаемых препаратов для культуры клеток. Цитотоксичность исследуемых препаратов изучали при воздействии различных концентраций этих препаратов (1, 10, 100 и 1000 мкг/мл) на интактную культуру клеток СПЭВ. В качестве показателя токсичности каждого препарата для данной культуры клеток служила максимально переносимая концентрация (МПК), которая составляет ½ 173 максимальной концентрации препарата, не оказывающей на клетки токсичного действия. Установлено, что МПК всех изучаемых препаратов были ≥ 1000 мкг/мл, т.е. эти препараты практически не токсичны для используемой культуры клеток. Оценку эффективности препаратов по подавлению репродукции вируса КЭ проводили на культуре клеток СПЭВ, инфицированных высоковирулентным штаммом Dal, выделенным из мозга больного КЭ, умершего от очаговой формы инфекции, с инфекционным титром 107ТЦД50/0,2мл. Препараты в разных концентрациях вносили через 1 час после инфицирования культуры клеток вирусом и инкубировали в течение 5 суток. Результаты изучения способности препаратов защищать инфицированные клетки от цитопатического действия вируса КЭ, представлены в табл. 17. Исследования показали, что только рибавирин в концентрации 500 мкг/мл и цельный иммуноглобулин против КЭ полностью подавляют репродукцию вируса КЭ в культуре клеток. Внесение в культуру клеток 250 мкг/мл рибавирина, или противоклещевого иммуноглобулина (в разведении 1:10), или 125 мкг/мл циклоферона снижало инфекционный титр вируса на 4,55,0 lg ТЦД50/мл (Ки=75-83%). Максимальные концентрации других референспрепаратов (реаферон-ЕС - 104 МЕ/мл, 4-йодантипирин – 1000 мкг/мл) вызывали снижение титров вируса на 3,0-3,5 lg ТЦД50/мл (Ки=50-60%) (табл.17). Для изучаемых препаратов - люромарина и тинростима - максимальный коэффициент подавления цитопатической активности вируса КЭ составил 58,3 (50,0-66,7)%. Необходимо отметить, что указанный уровень подавления репликации вируса зарегистрирован при использовании люромарина и тинростима в невысоких концентрациях – 100 и 10 мкг/мл, соответственно (табл.17). 174 Таблица 17 Оценка влияния препаратов на репродукцию вируса КЭ в культуре клеток СПЭВ Препараты Вирус (контроль) Иммуноглобулин против КЭ Рибавирин Реаферон-ЕС Концентрация препаратов, мкг/мл Цельный 1:10 1:100 1:1000 500 250 125 62 31 4 10 МЕ/мл 103 МЕ/мл 102 МЕ/мл 10 МЕ/мл Титр вируса, lg ТЦД50/мл Подавление репродукции вируса, ∆, lg Коэффициент ингибирования (Ки), % 6,0 (5,5-7,0) 0 1,0 (0,9-1,2) 2,0 (1,8-2,1) 2,3 (2,0-2,5) 0 1,0 (0,8-1,2) 2,0 (1,8-2,3) 3,1 (2,8-3,3) 4,0 (3,8-4,3) 2,5 (2,0-3,0) 3,0 (2,7-3,2) 4,1 (3,8-4,5) 6,0 (5,5-6,5) 5,0 (4,8-5,3) 4,0 (3,7-4,3) 3,7 (3,5-4,0) 6,0 (5,5-6,5) 5,0 (4,7-5,3) 4,0 (3,7-4,2) 2,9 (2,7-3,2) 2,0 (1,7-2,2) 3,5 (3,0-4,0) 3,0 (2,8-3,3) 1,9 (1,7-2,0) 100 83,3 (81,5-87,3) 66,7 (65,1-68,5) 61,7 (58,5-63,6) 100 83,3 (81,5-85,5) 66,7 (62,1-70,0) 50,0 (47,0-53,1) 33,3 (28,2-36,7) 58,3 (50,0-66,7) 50,0 (46,7-55,0) 31,6 (28,3-33,3) 5,0 (4,6-5,2) 125 1,5 (1,2-1,8) 60 3,0 (2,6-3,4) Циклоферон 12,5 3,9 (3,5-4,2) 1,25 6,0 1000 3,0 (2,7-3,2) 100 4,2 (3,8-4,4) 4-йодантипирин 10 5,0 (4,6-5,2) 1 6,0 1000 3,0 (2,6-3,4) 100 2,5 (2,0-3,0) Люромарин 10 3,5 (3,0-4,0) 1 4,0 (3,8-4,3) 100 4,0 (3,5-4,5) 10 2,5 (2,0-3,0) Тинростим 1 3,3 (3,0-3,5) 0,1 3,9 (3,5-4,2) Примечание:Препараты вносили через 1 час после штаммом Dal вируса КЭ. 1,0 (0,9-1,3) 16,7 (15,0-21,7) 4,5 (4,3-4,7) 75,0 (71,7-78,3) 3,0 (2,9-3,1) 50,0 (48,3-52,7) 2,1 (1,8-2,4) 35,0 (30,0-40,0) 0 0 3,0 (2,8-3,3) 50,0 (46,7-55,0) 1,8 (1,6-2,2) 30,0 (26,7-36,7) 1,0 (0,9-1,3) 16,7 (15,0-21,7) 0 0 3,0 (2,6-3,4) 50,0 (43,3-56,7) 3,5 (3,0-4,0) 58,3 (50,0-66,7) 2,5 (2,0-3,0) 41,7 (33,3-50,0) 2,0 (1,7-2,2) 33,3 (28,2-36,7) 2,0 (1,5-2,5) 33,3 (25,0-41,6) 3,5 (3,0-4,0) 58,3 (50,0-66,7) 2,7 (2,5-3,0) 45,0 (41,7-50,0) 2,1 (1,8-2,4) 35,0 (30,0-40,0) инфицирования культуры клеток 175 При этом минимально эффективная вирусингибирующая концентрация (МЭК), снижающая титр вируса не менее чем на 2 lg ТЦД50 [134], для люромарина и тинростима составляла 1 и 0,1 мкг/мл, соответственно. Химиотерапевтический максимально индекс переносимой (ХТИ), определяемый концентрации к как минимально отношение эффективной вирусингибирующей концентрации, для изучаемых препаратов был высок (табл.18). Можно сделать вывод, что люромарин и тинростим на модели in vitro даже в низких концентрациях обладают ингибирующей активностью в отношении вируса КЭ. Таблица 18 Определение химиотерапевтического индекса исследуемых препаратов на культуре клеток СПЭВ Препараты Диапазон концентраций препаратов, мкг/мл МПК, мкг/мл МЭК, мкг/мл ХТИ Рибавирин 10 ÷ 8000 2000 30 67 Реаферон - ЕС 101 ÷ 106 МЕ/мл 5000 100 50 Циклоферон 1,25 ÷ 2000 1000 12,5 80 4-йодантипирин 1 ÷ 2000 1000 100 10 Люромарин 0,01 ÷ 2000 1000 1 1000 Тинростим 0,001 ÷ 6400 3200 0,1 32000 Известно, что комбинированное использование противовирусных препаратов, имеющих различную химическую структуру и принципиально различный механизм действия, приводит к усилению антивирусного эффекта аддитивного или противовирусное синергидного действие характера сочетанного [172]. Нами применения было изучено химиопрепарата рибавирина и исследуемых препаратов – люромарина и тинростима (табл.19). - 176 Таблица 19 Аддитивное действие препаратов при их комбинированном применении на культуре клеток СПЭВ Препараты Концентрация препаратов, мкг/мл Титр вируса, lg ТЦД50/мл Подавление репродукции вируса, ∆, lg Коэффициент ингибирования (Ки), % Вирус (контроль) - 6,0 (5,5-7,0) - - Рибавирин 30 4,1 (3,6-4,4) 1,9 (1,6-2,4) 31,7 (26,6-34,7) Люромарин 1 4,0 (3,8-4,3) 2,0 (1,7-2,2) 33,3 (28,2-36,7) Тинростим 0,1 3,9 (3,5-4,2) 2,1 (1,8-2,4) 35,0 (30,0-40,0) 30 + 1 1,9 (1,5-2,3) 4,1 (3,7-4,5) 68,3 (61,7-75,0) 30 + 0,1 2,0 (1,6-2,4) 4,0 (3,6-4,4) 66,7 (60,0-73,3) Рибавирин + Люромарин Рибавирин + Тинростим Монопрепараты применялись в минимально эффективных вирусингибирующих концентрациях, снижающих накопление вируса КЭ на 2 lg ТЦД50/мл. Комбинированное использование рибавирина и люромарина, рибавирина и тинростима (в соотношении 1:1) в указанных минимальных концентрациях снижало титр вируса КЭ на 4,1 (3,7-4,5) lg ТЦД50/мл, подавляя репродукцию вируса на 68,3 (61,7-75,0)%, т.е. эффект комбинации препаратов может быть оценен положительно и имеет аддитивный характер. Результаты данного этапа исследований на модели in vitro продемонстрировали вирусингибирующую активность новых иммуномодулирующих препаратов – люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ. Полученные данные свидетельствовали о целесообразности дальнейшего изучения in vivo как самих препаратов, так и их совместного применения с официнальным препаратом – рибавирином. 177 8.2 Изучение активности люромарина и тинростима при экспериментальном клещевом энцефалите Следующим этапом изучения противовирусного действия веществ, оказавшихся эффективными в культуре клеток, является экспериментальная их оценка при инфекции у животных. Корреляция между вирусингибирующей активностью препаратов в культуре клеток и в опытах на животных существует не всегда. Отсутствие корреляции обусловлено патогенетическими особенностями конкретной моделируемой вирусной инфекции и химической структурой вещества. Тем не менее, использование экспериментальной модели на животных дает ценную первичную информацию об эффективности изучаемого препарата. При изучении противовирусного действия веществ для моделирования вирусной инфекции рекомендуется использовать как несколько доз заражения (в диапазоне 1-10-100 LD50), так и профилактическую (до заражения) и лечебную (после заражения) схему введения препаратов [134]. Кроме того, рекомендуется для заражения животных использовать способ, совпадающий с естественным путем инфицирования человека, поэтому в своих исследованиях мы инфицировали мышей подкожно. Ранее нами была изучена эффективность профилактического и лечебного применения некоторых исследуемых препаратов (противоклещевой иммуноглобулин, 4-йодантипирин, тималин, реаферон и лейкинферон) при инфицировании неинбредных мышей штаммом Dal вируса КЭ в дозах 1 и 10 LD50 [75]. Было установлено, что при профилактической схеме введения препаратов наибольшая выживаемость мышей, зараженных вирусом КЭ в дозе 1 LD50, наблюдалась при применении 4-йодантипирина (100% выживаемость животных, в контрольной группе – 60,5±1,4%), а при дозе вируса 10 LD50 - при использовании лейкинферона (60,5±1,4% выживших животных, в контроле – 41,3±2,5%). При лечебной схеме введения препаратов наиболее эффективным оказалось применение тималина (92,1±1,8% и 71,5±2,1% выживших животных, 178 соответственно при дозах вируса 1 и 10 LD50) и противоклещевого иммуноглобулина, обеспечившего 100% выживаемость мышей при дозе вируса 1 LD50 и 91,7±1,6% выживших животных при дозе вируса 10 LD50 [75]. В настоящем исследовании моделировалась летальная вирусная инфекция для неинбредных мышей, инфицированных штаммом Dal вируса КЭ в дозе 100 LD50, и была использована лечебная схема введения изучаемых препаратов. Для официнальных препаратов (противоклещевой иммуноглобулин, рибавирин, реаферон-ЕС, циклоферон и 4-йодантипирин), используемых как препараты сравнения, применялись способы введения и дозы препаратов, эквивалентные дозам, рекомендуемым для применения в клинике, при перерасчете на вес животного [83]. Дозы и способ введения тинростима, иммуноактивного пептида из гидробионтов, были установлены А.К. Гажа (1994) и Т.С. Запорожец (2007). При изучении противовирусной активности люромарина - полифенола, выделенного из морских трав семейства Zosteraceae, нами был выявлен наиболее эффективный способ введения препарата (пероральный) и диапазон применяемых доз [51]. В каждой группе было по 30 животных, за которыми велось наблюдение в течение 21 суток. Для оценки Руководству эффективности (2005) использовали исследуемых следующие препаратов критерии: согласно показатель выживаемости и средняя продолжительность жизни (СПЖ) животных; логранговый критерий z, характеризующий значимость различий при сравнении выживаемости животных двух групп. Изучение протективного действия изучаемых препаратов при острой летальной инфекции мышей (инфицирующая доза 100 LD50 вируса КЭ) показало, что животные, не получавшие препаратов (контрольная группа) погибали, начиная с 9 суток (СПЖ составила 9,8±1,9дней) (табл.20). Наибольший защитный эффект в отношении вируса КЭ зарегистрирован при применении 0,25 мл/кг противоклещевого иммуноглобулина. 179 Таблица 20 Выживаемость животных, инфицированных вирусом КЭ, при лечебной схеме введения препаратов Препараты Рибавирин Способ и кратность введения препаратов Перорально 10 дней Противоклещевой иммуноглобулин Внутримышечно однократно Реаферон - ЕС Внутримышечно 5 дней Циклоферон 4-йодантипирин Люромарин Тинростим Контроль вируса (без препаратов) Внутримышечно 5 дней Перорально 5 дней Перорально 7 дней Подкожно 5 дней Дозы препаратов, мг/кг % выживших животных СПЖ, дни Логранговый критерий z 50 5,0±1,0 10,8±2,0 z=0,891, a=0,346 100 13,3±3,2 11,8±2,4 z=1,516, a=0,130 200 0 9,1±1,8 z=0,379, a=0,744 0,15 мл/кг 30,0±5,0 13,9±2,8 z=2,240, a=0,029 0,25 мл/кг 45,0±8,0 16,2±3,2 z=3,646, a=0,000 103 МЕ/кг 0 10,0±2,0 z=0,936, a=0,875 104 МЕ/кг 5,0±1,0 10,6±2,1 z=0,771, a=0,441 0,6 0 10,2±2,0 z=0,399, a=0,711 6 21,7±4,3 12,3±2,5 60 35,0±8,0 14,5±2,8 z=2,490, a=0,013 1,25 0 10,0±2,0 z=0,936, a=0,875 12,5 15,5±3,1 11,5±2,3 z=1,020, a=0,308 25 16,7±3,3 11,4±2,0 z=1,363, a=0,174 50 30,0±6,2 13,7±2,7 z=2,268, a=0,024 100 25,5±5,7 12,1±2,0 z=2,013, a=0,043 5 мкг/кг 23,3±5,8 12,5±2,5 z=2,080, a=0,041 50 мкг/кг 10,0±2,0 11,0±2,8 z=1,056, a=0,411 0 9,8±1,9 z=2,065, a=0,039 Примечание: z - логранговый критерий выживаемости с поправкой Йейтса, характеризует различия в выживаемости животных опытной и контрольных групп (1,960 – критическое значение для уровня значимости 0,05); a – уровень значимости различий в выживаемости животных двух групп; n=30 животных (в каждой группе). 180 Однократное введение этого препарата после заражения животных защищало от гибели 45,0±8,0% мышей, СПЖ увеличивалась на 6,4 дня, по сравнению с контрольной группой животных (z=3,646, a=0,000). Выживаемость мышей, получавших иммуномодулирующие препараты люромарин и тинростим, а также индуктор интерферона – циклоферон, значимо отличалась от таковой у нелеченых животных (z>1,960, a≤0,05). Эти препараты защищали от гибели в среднем 25-35% животных, увеличивая СПЖ на 2,7-4,7 дней (табл.20). Наименьшее протективное действие продемонстрировали рибавирин, реаферон-ЕС и 4-йодантипирин: в указанных дозах эти препараты защищали около 5-15% инфицированных животных, удлиняя срок их жизни лишь на 0,82,0 дня по сравнению с контрольной группой (z≤1,960, a>0,05). Проведенные нами исследования, как и данные литературы, свидетельствуют о том, что хотя рибавирин на модели in vitro проявляет высокую вирусингибирующую активность в отношении вируса КЭ, в то же время, животных, инфицированных этим вирусом, а также другими флавивирусами, препарат защищает недостаточно эффективно [338]. В этой связи нами было изучено сочетанное применение официнальных препаратов (рибавирина и циклоферона) с люромарином и с тинростимом при остром летальном КЭ у мышей (табл.21). Как видно из представленных данных (табл.21), комбинация иммуномодулирующими официнальных препаратами препаратов значимо с повышает исследуемыми выживаемость животных и срок их жизни по сравнению с таковыми в контрольной группе (z>1,960, a≤0,05). Следует отметить, что совместное применение рибавирина с люромарином (z2=2,144, a=0,033) и рибавирина с тинростимом (z2=2,060, a=0,043) более эффективно, чем монотерапия рибавирином (z=1,516, a=0,130). В то же время эффективность комбинации иммуномодуляторов с рибавирином значимо не отличалась от монотерапии люромарином (z1=0,871, a=0,384) и тинростимом (z1=0,316, a=0,752). 181 Таблица 21 Выживаемость животных, инфицированных вирусом КЭ, при комбинированном применении препаратов Препарат Способ введения препаратов Доза препарата, мг/кг % выживших животных СПЖ, дни 0 9,8±1,9 100 13,3±3,2 11,8±2,4 z=1,516, a=0,130 60 35,0±8,0 14,1±2,8 z=2,390, a=0,018 50 30,0±6,2 13,7±2,7 z=2,268, a=0,024 5 мкг/кг 23,3±5,8 12,5±2,5 z=2,080, a=0,041 Контроль вируса (без препаратов) Рибавирин Циклоферон Люромарин Тинростим Перорально 10 дней Внутримышечно 5 дней Перорально 7 дней Подкожно 5 дней перорально + перорально перорально + внутримышечно подкожно + перорально подкожно + внутримышечно Логранговый критерий z Люромарин 50 z=2,535, a=0,012 + + 41,7±6,3 14,9±3,0 z1=0,871, a=0,384 Рибавирин 100 z2=2,144, a=0,033 Люромарин 50 z=3,975, a=0,000 + + 60,0±10,0 16,8±3,3 z1=2,166, a=0,031 Циклоферон 60 z2=2,056, a=0,040 Тинростим 5 мкг/мл z=2,153, a=0,028 + + 33,3±6,7 13,8±2,5 z1=0,316, a=0,752 Рибавирин 100 z2=2,060, a=0,043 Тинростим 5 мкг/мл z=3,121, a=0,000 + + 50,0±5,0 z1=2,368, a=0,021 15,9±3,0 Циклоферон 60 z2=2,077, a=0,039 Примечание: Препараты вводились по лечебной схеме. z – значимость различий в выживаемости между животными опытной и контрольных групп. z1 – между животными, получавшими комбинированную терапию, и животными, получавшими монотерапию люромарином и тинростимом. z2 – между животными, получавшими комбинированную терапию, и получавшими монотерапию официнальными препаратами. a – уровень значимости различий в выживаемости животных двух групп. n=30 животных (в каждой группе). 182 Наиболее исследуемыми эффективной оказалась иммуномодулирующими комбинация препаратами, циклоферона которая с значимо превышала таковую каждого монопрепарата (z>1,960, a≤0,05). Кроме того, сочетанное применение циклоферона и люромарина защищало от гибели 60,0±10,0% мышей, СПЖ увеличивалась на 7,0 дней, по сравнению с контрольной группой животных (z=3,975, a=0,000). Комбинированное введение циклоферона и тинростима защищало от гибели 50,0±5,0% инфицированных животных, удлиняя срок их жизни на 6,1 дня по сравнению таковой у нелеченых мышей (z=3,121, a=0,000). Таким образом, комбинация препаратов с различным механизмом действия (люромарина и тинростима с рибавирином и циклофероном) оказывает выраженный защитный эффект аддитивного характера. Проведенные исследования показали, что наиболее эффективным препаратом в отношении вируса КЭ как на модели in vitro, так и in vivo является противоклещевой иммуноглобулин. Химиопрепарат рибавирин, который in vitro проявляет выраженную вирусингибирующую активность при репликации вируса КЭ, на малоэффективным. экспериментальной модели КЭ у мышей оказался Следует отметить, что новые иммуномодулирующие препараты – люромарин и тинростим на моделях in vitro и in vivo проявляли умеренную эффективность в отношении вируса КЭ. В то же время, сочетанное применение этих препаратов с рибавирином in vitro позволяло обеспечить выраженное ингибирование вируса КЭ при использовании комбинируемых соединений в концентрациях, значительно меньших по сравнению с концентрацией каждого из соединений, взятых в отдельности. Сочетанное применение этих препаратов с рибавирином или с циклофероном in vivo повышало выживаемость инфицированных животных и удлиняло среднюю продолжительность жизни по сравнению с контрольной группой и группами мышей, которые получали только один препарат. Таким образом, на модели in vitro и in vivo было показано, что комбинация препаратов (рибавирина и 183 люромарина, рибавирина и тинростима) приводит к усилению антивирусного эффекта аддитивного характера. Полученные в настоящем исследовании результаты протективного действия новых иммуномодулирующих препаратов – люромарина и тинростима и эффективности их сочетанного применения с официнальными препаратами (рибавирином и циклофероном) свидетельствуют перспективности их использования в комбинированной терапии КЭ. о 184 Заключение Несмотря на существенные достижения отечественной и зарубежной медицины в изучении проблемы клещевого энцефалита, эта нейроинфекция до сих пор остается одной из самых значимых природно-очаговых вирусных инфекций на Евразийском континенте. Во многом это обусловлено неполным охватом населения недостаточной эндемичных эффективностью районов вакцинацией противовирусной против терапии. КЭ и Остаются открытыми многие вопросы, касающиеся молекулярных основ патогенеза разных клинических форм КЭ. Так, до конца не установлены факторы, обусловливающие разные исходы взаимодействия вируса КЭ с организмом человека: от полной элиминации возбудителя до развития тяжелых форм заболевания ЦНС. Большинство авторов, описывающих явление клинического полиморфизма КЭ, связывают его с генотипической и фенотипической вариабельностью популяций вируса КЭ [41, 167]. По данным Г.Н. Леоновой с соавт. (2007) основную долю (до 70%) дальневосточной популяции вируса КЭ составляют ненейроинвазивные штаммы, большинство из которых обладает способностью к быстрой элиминации из организма, не вызывая манифестных форм инфекции. У большинства людей, из крови которых были выделены такие штаммы, регистрировали инаппарантную форму КЭ. Нейроинвазивные штаммы составляют меньшую долю (до 30%) вирусной популяции, которая является наиболее изученной, поскольку способна вызывать острые формы с типичной клиникой заболевания КЭ [79]. В то же время ряд исследователей отмечают четкую тенденцию к возрастанию частоты длительной персистенции антигена вируса КЭ, выраженность клинических проявлений которой варьирует от бессимптомного носительства до манифестации нейроинфекции [41, 48, 94]. Ранее В.Г. Борисевич и Г.Н. Леоновой (2002) было показано, что при повторных обследованиях 109 пациентов с длительным периодом антигенемии (от 0,5 до 2 лет) в 6 случаях (5,5%) был изолирован вирус КЭ. Установлено, что 185 только один штамм обладал нейроинвазивными свойствами, остальные были ненейроинвазивными. Известно, что способность к персистенции - видовой признак вируса КЭ, отражающий особенности его экологии, закрепленный в процессе эволюции как средство и способ сохранения вида [47, 114, 146,165]. В ее основе лежит способность вируса сохраняться в клеточных популяциях, изменяя как свои свойства, так и свойства клеток (нарушение реализации апоптоза и ДНК-репарации лимфоцитов периферической крови, и другие вмешательства в систему индукторов и эффекторов иммунитета) [6, 41, 89, 94]. Исследования С.И. Беликова слабовирулентные штаммы изолированные пациентов от с соавт. (2007) дальневосточного с показали, что вируса КЭ, субтипа инаппарантной формой инфекции, и высоковирулентные штаммы, выделенные от пациентов с очаговыми формами инфекции с летальным исходом, имеют отличия в нуклеотидных последовательностях геномов. Отличия заключались в мутациях в кодирующей и некодирующей областях генома (капсидный белок С, неструктурные белки NS1, NS3, NS5 и 3׳-нетранслируемый участок вирусной РНК) [4, 5, 69]. Поскольку большая часть этих мутаций находилась в участках вирусных белков, необходимых для обеспечения жизнеспособности флавивирусов, то данные мутации могли явиться причиной, связанной с различиями вирулентности исследуемых штаммов. В то же время рядом исследователей, изучавших влияние разных штаммов и субтипов вируса КЭ на патогенез экспериментального КЭ, было убедительно показано, что нейроинвазивность штаммов ВКЭ не является единственным условием для обеспечения фатального исхода [225, 387]. Об этом свидетельствует и изоляция вируса КЭ из мозга здоровых животных в дикой природе и сирийских хомяков в лабораторных условиях [286]. D. Hayasaka et al. (2009, 2011) полагают, что гибель животных, после периферического инфицирования мышей вирусом КЭ, является результатом комбинации вирус-индуцированной патологии ЦНС и системного 186 воспалительного ответа. В свою очередь, D. Ruzek et al. (2009) показали, что более длительное выживание мышей со SCID (с тяжелым комбинированным иммунодефицитом) или животных, дефицитных по CD8-клеткам (CD8-/-- мыши), в отличие от иммунокомпетентных мышей BALB/c и C57BL/6 после заражения нейровирулентным штаммом ВКЭ указывало на патологическую роль иммунного ответа в развитии заболевания. Тем не менее, авторы [225] выявили, что в отсутствии иммунного ответа у SCID мышей даже аттенуированный, менее инвазивный штамм вируса, в конечном итоге, достигает ЦНС и повреждает ее. У иммунокомпетентных мышей, с полноценно развитой иммунной системой, оба фактора (прямое повреждение вирусом ЦНС и иммунный ответ) вносят вклад в клинический исход заболевания. Таким образом, поражение органов иммунной системы при КЭ является ведущим звеном патогенеза, обусловливающим клинический полиморфизм заболевания и исход патологического процесса [89,129, 217, 237]. Современный прогресс в молекулярной биологии и вирусологии позволяет изучать взаимодействие вируса КЭ с иммунной системой организма на всех трех уровнях: организменном, клеточном и молекулярном [46, 63, 237, 319, 382, 419, 466, 468, 472]. В настоящем исследовании впервые проведено комплексное исследование иммуноопосредованных механизмов развития инфекционного процесса, обусловленного штаммами дальневосточной популяции вируса КЭ, вызвавших у пациентов разное клиническое течение КЭ (от инаппарантной до очаговых форм с летальными исходами). Основное внимание нами было уделено изучению начальных этапов иммунной защиты против инвазии вируса КЭ, эффективность которой в значительной мере определяет течение и исход вирусной инфекции. Воздействие вируса КЭ дальневосточного субтипа на механизмы формирования противовирусной иммунной защиты изучалось нами на модельных системах ex vivo, in vitro и in vivo, а также на контингенте пациентов с ВКЭ. Использование в качестве модельных систем цельной крови доноров (ex 187 vivo) и культуры мононуклеарных лейкоцитов (in vitro) обусловлено фактами успешного выделения вируса КЭ из лейкоцитов крови человека с первого дня после присасывания клеща [79], и показанной ранее в эксперименте in vitro репродукцией вируса КЭ в лейкоцитах крови [77]. Для воспроизведения инфекционного процесса ex vivo, in vitro и in vivo нами были выбраны три штамма вируса КЭ, изолированные от людей с разными клиническими формами заболевания и по своей молекулярно-генетической характеристике принадлежащие разным кластерам филогенетического древа дальневосточных штаммов ВКЭ (Oshima-, Sofjin-, Senzhang-подобные штаммы). Для понимания механизма развития инфекционного процесса в модельных системах, зараженных разными штаммами ВКЭ, первоначально была изучена динамика накопления вируса. Инфицирование проб цельной крови и культуры мононуклеарных лейкоцитов позволило установить, что исследуемые штаммы вируса КЭ различаются по динамике репликации их в иммунокомпетентных клетках и в супернатантах клеток. Установлено, что высоковирулентный штамм Dal, выделенный из мозга человека, умершего от КЭ (из кластера Sofjin-подобных штаммов), быстро проникает в мононуклеарные лейкоциты, активно реплицируется в них на протяжении 24 час, и только потом поступает в культуральную жидкость, где происходит его дальнейшее накопление. Штамм Kip-94 (Oshima-подобный штамм), выделенный от больного с лихорадочной формой КЭ, и штамм P-196 (Senzhang-подобный характеризовались штамм), вызвавший замедленным инаппарантную проникновением, репликации в клетках крови и медленным форму невысоким КЭ, уровнем накоплением в супернатантах клеток. Необходимо отметить временную задержку (в течение первых 24 часов) в продукции вирусных частиц во внеклеточное пространство штаммом Dal. Аналогичная замедленная фаза с продукцией очень небольшого количества вирусных частиц была описана ранее для флавивируса Kunjin [489] и для 188 высоковирулентного Sofjin-подобного штамма Hypr вируса КЭ [277, 466]. A.K. Overby et al. (2010) и L. Miorin et al. (2012) объясняют эту 24-хчасовую задержку стратегией спасения («избегания») вируса КЭ от иммунной системы организма: вирус КЭ, перестраивая внутриклеточные эндоплазматические компартменты и размножаясь в них, становится недоступным для обнаружения паттернраспознающими рецепторами (PRRs). Это обусловливает задержку по времени индукции активации этих клеток, более поздний синтез биологически активных веществ, в том числе и IFN, что, в конечном итоге, позволяет вирусу более эффективно распространяться в организме [466]. Вероятно, и для Sofjinподобного штамма Dal характерна аналогичная стратегия уклонения от иммунных механизмов. Можно предположить, что штаммы Kip-94 и P-196, отличающиеся по своим молекулярно-генетическим характеристикам от штамма Dal, не обладают такой стратегией «ускользания» от иммунного контроля. Следствием этого является более быстрое распознавание их иммунокомпетентными клетками и запуск механизмов врожденной противовирусной защиты, что, как было нами показано, приводит к сдерживанию их размножения. Характер развития инфекционного процесса in vivo оценивался по динамике накопления вируса в крови и мозге мышей линии BALB/c, подкожно инфицированных исследуемыми штаммами ВКЭ. При инфицировании мышей штаммом Dal, обладающим высокой нейроинвазивной активностью, уже на 3-и сутки в крови и на 5-ые сут в мозге регистрировали высокие титры вируса. Пик накопления этого штамма ВКЭ в мозге был сопряжен с началом гибели животных (7-е сут), 100% летальный исход отмечался на 9-е сут (СПЖ составила 7,1±1,8 дней). Инфицирование мышей штаммом Kip-94, обладающим средней степенью нейроинвазивности, обусловило пик вирусемии на 5-е сут, максимальное накопление вируса в мозге на 9-е сут, 70% животных погибали к 12 дню (СПЖ - 13,4±3,4 дня). Штамм P-196, отличающийся слабой нейроинвазивной способностью, характеризовался невысокими титрами 189 вирусемии, прохождением гематоэнцефалического барьера только на 7-е сут и пиком накопления вируса в мозге на 11 сут. При введении штамма P-196 только некоторые животные заболевали на 9-10 сутки, и к 16 дню погибало 40% животных, СПЖ составила 17,7±4,4 дня. Таким образом, на разных модельных системах (ex vivo, in vitro и in vivo) были установлены существенные отличия в течении и исходе инфекционного процесса, вызванного штаммами ВКЭ, обладающими разными молекулярногенетическими характеристиками и биологическими свойствами (скорость репликации, вирулентность, нейроинвазивность). Исследование механизмов формирования иммунного ответа при инфекционном процессе, обусловленном исследуемыми штаммами вируса КЭ, касались, в первую очередь, начальных этапов взаимодействия вируса с клетками врожденной и адаптивной иммунной системы. Иммунная защита против вирусов формируется при участии многих механизмов врожденного и адаптивного иммунитета. Реализация врожденного иммунитета, участвующего в первой линии защиты от патогена, обусловлена деятельностью клеток-эффекторов: гранулоцитов, моноцитов/макрофагов, NKи NKT-клеток, дендритных клеток и др. [257, 425, 468]. В модельной системе ex vivo было установлено, что штаммы вируса КЭ с разной вирулентностью разнонаправленно изменяли экспрессию адгезивных и активационных молекул на мембранах гранулоцитов, моноцитов и NK-клеток (рис.16). При 24-х часовой инкубации клеток крови со штаммом P-196 ВКЭ, изолированным от пациента с инаппарантной формой КЭ, отмечалось значимое повышение уровня экспрессии адгезивных молекул (CD11b и ICAM-1) и раннего активационного маркера – CD69 на моноцитах, гранулоцитах и NKклетках. В противоположность этому при культивировании клеток крови со штаммом Dal ВКЭ, выделенным от больного с очаговой формой КЭ, было выявлено снижение экспрессии этих молекул на моноцитах и угнетение активации NK-клеток. 190 Штамм DAL ВКЭ Штамм Р-196 ВКЭ ~ ~ ↓ ICAM-1 CD25 ↑ ~ ↑↑ ↑ ↓ CD25 CD95 ↑ ↓ CD95 CD11b ↑ ~ ~ ~ CD11b ICAM-1 NK-клетки Гранулоциты Моноциты CD69 CD69 ↑ ↑ CD11b ↑ ICAM-1 ICAM-1 CD69 CD69 CD4+-T лимфоциты CD25 CD95 CD69 CD8+-T лимфоциты CD25 CD95 CD11b CD69 CD11b ICAM-1 Гранулоциты CD69 ↓ ↓ ICAM-1 ↓ CD69 ↑ ~ ~ ~ CD69 ~ ↓ ~ ↓ CD25 ↑ ↑ ~ ~ ↓ ↓ ↑ ↑ NK-клетки CD11b ~ Моноциты CD4+-T лимфоциты CD95 CD69 CD25 CD8+-T лимфоциты CD95 Рисунок 16. Модуляция экспрессии адгезивных и активационных маркеров на поверхности иммунокомпетентных клеток здоровых доноров через 24 часа инкубации со штаммом P-196 ВКЭ, вызвавшим инаппарантную форму инфекции, и штаммом Dal ВКЭ, вызвавшим очаговую форму заболевания. Примечание: ↑(↓) - повышение (угнетение) экспрессии, экспрессии маркеров. ~ - отсутствие изменения 191 Известно, что молекулы CD11b (α-цепь β2-интегрина, Mac-1α, CR3α), экспрессирующиеся на поверхности лейкоцитов и опосредующие распознавание различных лигандов (в том числе молекул ICAM-1, iC3b – фрагментов C3 компонента комплемента, γ-цепи фибриногена), регулируют некоторые этапы воспалительного ответа, важнейшим из которых является участие в адгезии лейкоцитов к эндотелию [210, 310, 312, 324]. Молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 (CD54) экспрессируются на лейкоцитах крови при активации (в том числе вирусами и цитокинами IL-1, IFNγ или TNFα), и участвуют в контактных взаимодействиях клеток в иммунных реакциях: Тлимфоцита с моноцитом, цитотоксического Т-лимфоцита с клеткой-мишенью [416]. Наиболее ранний индуцибельный активационный маркер CD69, экспрессирующийся на лимфоцитах, NK-клетках, моноцитах и гранулоцитах, действует как сигнал трансдукции, что приводит к синтезу ключевых медиаторов ответа на вирусные инфекции, таких как IFNα/β и провоспалительные цитокины [224, 279, 374]. С одной стороны, увеличение экспрессии молекул адгезии на моноцитах и гранулоцитах, индуцированное штаммом P-196 вируса КЭ, свидетельствует о том, что процессы межклеточного взаимодействия облегчают диссеминацию вируса, реплицирующегося в этих клетках-мишенях. С другой стороны, повышение активационно-адгезионной способности моноцитов, гранулоцитов и NK-клеток, сопряжено с активацией этих клеток, приводящей к усилению их фагоцитарной и киллерной активности, а также к антигензависимой активации Т-лимфоцитов. Снижение адгезионной и активационной способности антигенпрезентирующих клеток (моноцитов) и NK-клеток, вызванное штаммом Dal вируса КЭ, активно размножающимся в клетках крови, является одним из механизмов вирусиндуцированной супрессии врожденного иммунитета. Полученные нами данные подтверждают клинические исследования Н.П. Пироговой (2002), показавшей, что у пациентов с инаппарантной формой КЭ в 192 отличие от больных с манифестными формами КЭ повышена как фагоцитарная, так и рецепторная активность моноцитов и нейтрофилов. Предположение автора о связи данных процессов с различиями биологических свойств попавшего в организм человека вируса КЭ подтверждается нашими экспериментами со штаммами ВКЭ, имеющими различную молекулярногенетическую характеристику. В этой же модельной системе ex vivo было исследовано влияние штаммов ВКЭ на активацию разных субпопуляций лимфоцитов: Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+) и NK-клеток (рис. 16). Известно, что представление вирусного пептида в комплексе с молекулами MHC-I и MHC-II антигенпрезентирующими клетками (моноцитами, дендритными клетками) Т-лимфоцитам служит пусковым механизмом адаптивного иммунного ответа на эти патогены. Распознавание Тклетками антигена приводит к их активации и к экспрессии большого числа активационных антигенов [225, 425, 472, 490]. NK-клетки, в отличие от Тлимфоцитов, не требуют каскада реакций антигенной презентации и действуют независимо от наличия МНС на мембране инфицированной клетки. Они активируются в присутствии клеток, несущих признаки инфицирования, либо при отсутствии (снижении) на них собственных молекул MHC-I [271, 362, 393, 397, 483]. В качестве основного источника флавивирусных пептидных детерминант для CD4+Т-клеток был определен регион NS3 белка [323, 355], что подтверждалось наличием неполноценных NS3-специфических CD4+Т- клеточных реакций у пациентов с тяжелым энцефалитом [323]. Начинают идентифицироваться флавивирусные пептидные детерминанты, распознающие CD8+Т-клетки: они включают в себя пептиды E- [247], NS4B- [192] и NS3белков [323]. Поскольку, исследуемые нами штаммы ВКЭ, как было сказано выше, имеют отличия в этих участках вирусных белков, то данные отличия могут явиться причиной различного влияния этих штаммов на активацию Тлимфоцитов. 193 Анализ количества лимфоцитов с экспрессией активационных маркеров, появляющихся в следующем порядке: CD69→CD25→HLA-DR→CD95, и отвечающих за последовательное прохождение определенных этапов дифференцировки лимфоцитов до активационного апоптоза, дает возможность оценить процессы активации, происходящие в иммунной системе [2, 174, 224]. Активированные пролиферации цитотоксические проявляют свою CD8+Т-лимфоциты функцию лизиса в процессе инфицированных флавирусами клеток либо непосредственно через Fas-FasL взаимодействия или механизм перфорин-гранзимного экзоцитоза [298, 422], либо косвенно, через секрецию провоспалительных цитокинов [425]. В свою очередь активированные CD4+Т-лимфоциты контролируют флавивирусные инфекции с помощью различных механизмов, в том числе продукции противовирусных цитокинов, переключению класса антител, прямой цитотоксичности и поддержке CD8+Т-клеточной активности [496]. Таким образом, исследуемые штаммы вируса КЭ обладают способностью модулировать ранние этапы активационного процесса иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих последующие стадии развития их функционального ответа. Механизм индукции экспрессии мембраноассоциированных структур клеток штаммами ВКЭ может быть сопряжен с особенностями молекулярногенетических характеристик штаммов. Кроме того, мы согласны с мнением О.В. Сергеева (2011), что этот строго избирательный механизм вирусиндуцированной активации или подавления экспрессии рецепторов иммунокомпетентных клеток лежит в основе таких фундаментальных свойств вируса как вирулентность и патогенность. Все клеточные события (пролиферация, дифференцировка, апоптоз и функциональная активность клеток) находятся под контролем системы цитокинов, которая формирует и регулирует весь комплекс защитных реакций организма при внедрении патогенов [36, 67, 82]. Исследование продукции и секреции цитокинов в модельных системах in vitro и in vivo позволило оценить 194 ранний вклад цитокинов в развитие и исход инфекционного процесса, вызванного штаммами вируса КЭ (табл. 22). Установлено, что штамм Dal, изолированный от пациента с очаговой формой КЭ, индуцировал значимое повышение уровня продукции провоспалительных цитокинов (IL-8, TNFα и IL-6) и IFNγ в супернатантах культуры мононуклеарных лейкоцитов, а также в крови и мозге мышей линии BALB/c. Максимальный уровень продукции этих цитокинов совпадал с пиком накопления вируса в модельных системах: в культуре клеток – на 2-3 день, в крови мышей на 5 сутки, в мозге – на 7 сутки после инфицирования. При этом концентрация исследуемых цитокинов в мозге инфицированных животных была выше, чем в крови. В то же время штамм Dal индуцировал низкие уровни продукции интерферона I типа (IFNα) и противовоспалительного цитокина IL-10. В процессе коэволюции вирусы выработали множественные стратегии ускользания от распознавания их иммунной системой или от ее эффекторных функций. Установлено, что все флавивирусы, в том числе и вирус КЭ, могут подавлять индукцию IFNα путем блокирования активации сигнальных каскадов JAK-STAT, ингибируя JAK-фосфорилирование будучи [331, 460, 488]. При этом, антагонистом STAT-фосфорилирования, не только белок NS5 флавивирусов является решающим в противодействии этих вирусов IFN I типа, [331, 488], но и другие неструктурные белки флавивирусов также могут вносить свой вклад в противодействие IFN-ответу [329, 330]. Другая стратегия избегания вируса КЭ от иммунологического надзора заключается во временной задержке (в течение первых 24 часов) начала индукции IFN I типа, когда вирус перестраивает внутренние мембраны клеток и становится недоступным для PRRs [466]. Использование вирусом КЭ комбинации двух стратегий (задержка IFN индукции и блокирование IFN сигналинга) позволяет вирусу проникать в ЦНС до того как будет запущен эффективный противовирусный ответ. 195 Таблица 22. Сравнительная характеристика цитокининдуцирующей активности штаммов ВКЭ на моделях in vitro и in vivo Методы исследова ния Цитокины Штамм P-196 ВКЭ Senzhang-подобный Штамм Kip-94 ВКЭ Oshima-подобный Штамм Dal ВКЭ Sofjin-подобный В супернатантах культуры мононуклеарных клеток человека In vitro IL-8 ↑ ↑ ↑↑ TNFα ↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑↑ IFNγ ↑ ↑↑ ↑↑ IFNα ↑↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑ В сыворотке крови и супернатантах гомогенатов мозга мышей линии BALB/c кровь мозг кровь мозг кровь мозг TNFα ↑ ↑↑ ↑↑ ↑↑↑ ↑↑ ↑↑↑↑ IL-6 ↑ ↑ ↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑↑ IFNγ ↑ ↑ ↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑↑ IL-10 ↑ ↑↑ ↑ ↑ ↑ ↑ In vi vo Примечание: ↑- повышение уровня продукции цитокинов в 1,5-2,5 раза; ↑↑ - повышение в 3-6 раз; ↑↑↑ - повышение в 7-10 раз; ↑↑↑↑ - повышение - > 10 раз. Следует подчеркнуть, что вышеприведенные исследования стратегий избегания иммунного ответа вирусом КЭ проводились с использованием высоковирулентных Sofjin-подобных штаммов ВКЭ. Вероятно, штамм Dal, также являясь высоковирулентным Sofjin-подобным штаммом ВКЭ и используя такие же стратегии, блокирует распознавание его иммунокомпетентными клетками на начальных этапах инфекционного процесса, что позволяет ему активно размножаться в этих клетках и продуцировать во внеклеточное пространство большое количество вирусных частиц. Зарегистрированные нами 196 в модельных системах in vitro и in vivo значительные уровни IL-8, TNFα, IL-6 и IFNγ (табл.22) обусловлены активацией вирусными частицами большого количества моноцитов/макрофагов, NK-клеток, нейтрофилов и других клеток, продуцирующих эти провоспалительные медиаторы. Известно, что повышение уровня провоспалительных цитокинов, как правило, сопряжено с реакцией повреждения и воспаления, а сверхвысокие концентрации - с развитием тяжелых генерализованных расстройств, а также полиорганной недостаточностью [45, 70, 154]. Кроме того, гиперпродукция TNFα и IL-6 усиливает разрушение нейронов [448] и увеличивает проницаемость ГЭБ [217, 318, 382, 387]. Необходимо отметить, что в мозге мышей, инфицированных высокоинвазивным нейротропным штаммом Dal, титры самого вируса и уровни продукции цитокинов TNFα, IL-6, IFNγ были значимо выше, чем в крови. Таким образом, в летальный исход инфицирования такими штаммами как штамм Dal вируса КЭ, вносят вклад прямое повреждение вирусом ЦНС и индуцированная им иммунопатологическая гиперпродукция провоспалительных цитокинов. Противовоспалительный цитокин IL-10, подавляя продукцию провоспалительных цитокинов (TNFα и IL-6) и являясь антагонистом IFNγ, в контексте инфекционного заболевания играет важную роль в сохранении баланса между протективным иммунитетом и развитием иммунной патологии [340]. У мышей, инфицированных штаммом Dal, уровень продукции IL-10 повышался только в терминальной стадии заболевания. Поэтому показатели соотношения концентраций IFNγ/IL-10 свидетельствовали о преобладании ярко выраженного Th1-типа иммунного ответа в этой группе животных. Таким образом, дисфункция иммунной системы активационного типа, обусловленная индуцированной вирусом избыточной продукцией провоспалительных медиаторов, является важным патогенетическим звеном неблагоприятного исхода заболевания. 197 Цитокининдуцирующая способность штамма Kip-94, выделенного от пациента с лихорадочной формой КЭ и относящегося к Oshima-подобным штаммам ВКЭ, оказалась иной (табл. 22). Этот штамм в два раза активнее индуцировал продукцию IFNα мононуклеарными лейкоцитами, в то же время позднее и менее выраженно повышал уровни провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6, IFNγ у мышей BALB/c по сравнению со штаммом Dal. У животных, инфицированных штаммом Kip-94, зарегистрированы невысокие концентрации противовоспалительного цитокина IL-10, что предопределило поляризацию иммунного ответа в направлении Th1-типа. В конечном итоге, менее выраженный дисбаланс продукции цитокинов, вызванный штаммом Kip-94, способствовал большей функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток и иммунной системы в целом, что обусловило замедленное размножение вируса и увеличило продолжительность жизни животных. Штамм P-196, выделенный от пациента с инаппарантной формой КЭ и относящийся к группе Senzhang-подобных штаммов, обладал особой цитокининдуцирующей способностью (табл. 22). В модельной системе in vitro на ранних этапах инфицирования мононуклеарных лейкоцитов этот штамм продемонстрировал высокую интерферониндуцирующую активность, в 4,5 раза превосходящую таковую у штамма Dal. Однако в ходе развития инфекционного процесса концентрации цитокина IFNα снижались. В то же время активно индуцируемая в первые сутки продукция провоспалительных цитокинов (IL-8, TNFα, IFNγ) лейкоцитами, инфицированными штаммом P-196, затем не изменялась, что сдерживало размножение вируса, но титры его не снижались. Повышение уровня провоспалительных цитокинов в крови и мозге инфицированных этим штаммом мышей BALB/c наблюдалось лишь на 9-11 сутки. При этом на протяжении всего эксперимента в крови и мозге животных зарегистрированы высокие показатели продукции противовоспалительного цитокина IL-10, супрессирующего синтез Th-1 цитокинов, что могло 198 способствовать замедленному накоплению вируса в крови и мозге и увеличить продолжительность жизни животных. Однако индуцированный штаммом P-196 ВКЭ дисбаланс продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками приводил к незавершенной элиминации вируса, что сформировало предпосылки для длительной персистенции его в организме. Таким образом, выявленные на разных модельных системах (ex vivo, in vitro и in vivo) отличительные особенности течения и исхода инфекционного процесса, вызванного вирусом КЭ, обусловлены совокупностью различий, как в биологических свойствах штаммов вируса, так и в способности этих штаммов к модуляции функциональной активности клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Разнообразие инфекционного потенциала изучаемых штаммов ВКЭ отражает гетерогенность дальневосточной вирусной популяции и во многом предопределяет клинический полиморфизм заболевания. Официальная статистика по заболеваемости КЭ свидетельствует о том, что на очаговых территориях Российской Федерации на протяжении эпидемического сезона регистрируют сотни тысяч лиц с укусами клещей. По результатам наших исследований и данным других авторов [20, 79] в крови людей уже на 1-3 сутки после укуса вирусофорного клеща выявляли специфический антиген, а также вирус КЭ, что указывало на наличие вирусемии в ранний период. В большинстве случаев такая вирусемия носит кратковременный характер и может закончиться на стадии размножения вируса в месте укуса или может развиться инаппарантная (без клинических проявлений) форма КЭ [22, 109, 150]. При замедленной элиминации вируса бессимптомная инфекция может перейти в персистентную (длительную антигенемию), а в случае активации репродукции вируса и развития патологического процесса в ЦНС - в хроническую форму КЭ [40]. Анализ случаев инфицированности людей вирусом КЭ позволяет проследить за длительностью антигенемии и динамикой элиминации вируса КЭ из организма. 199 В настоящее время практически полностью отсутствуют исследования, касающиеся состояния клеточных и гуморальных факторов врожденного иммунитета на раннем этапе инфицирования вирусом КЭ. Нами была предпринята попытка выявить взаимосвязь уровня антигенемии вируса КЭ с особенностями функционирования иммунной системы, обусловливающую впоследствии или быструю элиминацию, или длительную персистенцию антигена в организме. Находившиеся под наблюдением пациенты (185 человек), у которых на 13 сутки после укуса клеща был выявлен антиген вируса КЭ, на начальной стадии инфекционного процесса были разделены на две группы, различающиеся по содержанию антигена в крови. Среднее значение уровня антигенемии у пациентов 1-ой группы составило 2,4±0,6, у пациентов 2-ой группы - 5,8±1,7 (p=0,000). Впоследствии эти группы различались и по скорости элиминации возбудителя: для пациентов 1-ой группы была характерна кратковременная антигенемия, а для пациентов 2-ой группы – длительная персистенция антигена ВКЭ. Таким образом, показатель содержания антигена ВКЭ в первые дни после укуса клеща может стать важным предиктором длительности антигенемии (рис.17). При изучении состояния клеточного иммунитета у обследованных пациентов на ранней стадии инфекционного процесса основной популяционный состав лимфоцитов периферической крови (CD3 +, CD4+, CD8+, CD19+) не был изменен и находился в пределах средне-нормальных значений. В то же время у пациентов 1-ой группы наблюдались изменения субпопуляционного состава лимфоцитов, характерные для начальной стадии вирусной инфекции: повышение относительного содержания и абсолютного количества цитотоксических клеток врожденного иммунитета - NK- и NKTклеток (CD3-CD16+CD56+ и CD3+CD16+CD56+) и Т-лимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации CD25. У пациентов 2-ой группы в 200 Пациенты с антигенемией вируса КЭ Низкий уровень антигенемии ВКЭ Высокий уровень антигенемии ВКЭ NK- и NKT-клетки (повышение) NK- и NKT-клетки (без изменения) CD3+CD25+-лимфоциты (повышение) С3-компонент комплемента (без изменения) (снижение) Провоспалительные цитокины: IL-8, IL-1β, TNFα IFN I и II типов (повышение) Противовоспалительные С3-компонент комплемента (повышение) (повышение) CD3+CD25+-лимфоциты Провоспалительные цитокины: IL-8, IL-1β, TNFα (повышение) IFN I и II типов (без изменения) Противовоспалительные цитокины: IL-4 и IL-10 цитокины: IL-4 и IL-10 (без изменения) (повышение) Быстрая элиминация антигена ВКЭ Замедленная элиминация антигена ВКЭ Рисунок 17. Схема начального этапа иммунного ответа у пациентов с различной длительностью антигенемии ВКЭ 201 эти же сроки отмечалось отсутствие изменений показателей, характеризующих структуру субпопуляций лимфоцитов. Повышение уровня NK-клеток у пациентов 1-ой группы свидетельствует о наличии у них более высокого потенциала киллерных механизмов цитотоксической активности по сравнению с таковым у пациентов 2-ой группы. Повышение количества Т-клеток, экспрессирующих ранний маркер активации CD25, у пациентов 1-ой группы отражало готовность лимфоцитов к вступлению в пролиферацию и дифференцировку в ответ на антиген ВКЭ. По нашему мнению, быстрая элиминация антигена ВКЭ у пациентов 1-ой группы была обусловлена, с одной стороны, достаточным уровнем иммунокомпетентности пациентов этой группы, с другой – низкой заражающей дозой вируса КЭ, обладающего слабовирулентными свойствами. Обсуждая механизмы активации клеточного звена иммунитета у пациентов данной группы, уместно, на наш взгляд, сравнить их с результатами экспериментов, полученными при инфицировании крови здоровых доноров штаммом P-196, изолированным от пациента с инаппарантной формой КЭ, и также показавшими раннюю активацию NKклеток и T-лимфоцитов (CD4+ и CD8+). Отсутствие динамики количества цитотоксических клеток и слабый Тклеточный пролиферативный ответ на более высокую заражающую дозу вирусного антигена у пациентов 2-ой группы отражало индуцированную патогеном иммуносупрессию, препятствующую полному удалению вируса в начальной стадии инфекции и поддерживающую персистенцию возбудителя. Изучение гуморальных факторов иммунитета (уровень общих сывороточных иммуноглобулинов IgM, IgA, IgG и подклассов IgG1-IgG4, циркулирующих иммунных комплексов и компонентов комплемента) у обследованных пациентов в начальной фазе инфицирования ВКЭ позволило установить изменение содержания лишь отдельных компонентов системы комплемента (рис.17). Так, у пациентов 1-ой группы было зарегистрировано снижение уровня С3-компонента комплемента, что свидетельствовало об его 202 активном потреблении. В то же время у пациентов 2-ой группы отмечено повышение содержания этого компонента. Вероятно, наличие высоких доз вирусного антигена у пациентов этой группы обеспечивало преобладание процесса накопления С3-компонента комплемента над его потреблением. Можно предположить, что активация С3-компонента комплемента, характерная для всех трех механизмов реализации эффекторной функции системы комплемента, на 2-3 день инфицирования вирусом КЭ запускала альтернативный путь активации системы комплемента, поскольку он активируется сразу же после внедрения патогенов, до того, как образуются специфические антитела и специфические иммунные комплексы. Образующиеся при активации С3-компонента фрагменты C3b и iC3b играют важную роль в опсонизации мишеней (вирусы, бактерии, иммунные комплексы). При активации эффекторные клетки (гранулоциты, моноциты/макрофаги и другие клетки) экспрессируют большое количество CR1 и CR3 (рецепторы для C3b и iC3b), которые связывают и поглощают опсонизированные микроорганизмы [193, 204, 241, 420]. Полученные нами результаты, характеризующие активацию С3-компонента комплемента у обследованных пациентов, коррелируют с экспериментальными данными, полученными ex vivo и свидетельствующими об усилении экспрессии молекул CD11b (CR3) на моноцитах, гранулоцитах, NK-клетках, инфицированных штаммом P-196. Анализ содержания сывороточных цитокинов и исследование цитокининдуцирующей способности клеток крови обследуемых пациентов позволили установить, что на ранней стадии инфицирования ВКЭ цитокиновый статус пациентов 1-ой группы характеризуется умеренным увеличением концентраций провоспалительных цитокинов (IL-8, IL-1β, IFNα, TNFα), усилением продукции этих цитокинов в культурах интактных и митогениндуцированных клеток периферической крови (рис.17). В это же время у пациентов 2-ой группы повышенное содержание в крови 203 противовоспалительных цитокинов (IL-4 и IL-10) указывало на раннюю поляризацию иммунного ответа в сторону Th2-типа. Кроме того, у пациентов этой группы отсутствовало увеличение продукции IFN I и II типа. Вместе взятые, данные показатели являются прогностически неблагоприятным признаком замедленной элиминации вируса. Подтверждением этому являются эксперименты in vivo, когда штамм P-196 ВКЭ в организме мышей BALB/c индуцирует ранний дисбаланс цитокинов по Th2-типу, что впоследствии приводит к незавершенной элиминации вируса и предопределяет его длительную персистенцию. Таким образом, нами впервые показана взаимосвязь уровня антигенемии вируса КЭ с функциональной активностью эффекторной фазы врожденного иммунитета у пациентов после присасывания антигенположительного клеща. При невысокой антигенной нагрузке у пациентов на ранней стадии инфицирования отмечается адекватная активация клеточных и гуморальных факторов врожденного иммунитета и развитие комплекса регулируемых цитокинами провоспалительных уничтожению и элиминации реакций, вируса. приводящих Отсутствие к быстрому ранней активации исследуемых звеньев врожденной иммунной системы у пациентов с более высоким уровнем антигенемии указывает как на недостаточную активность противовирусного иммунитета у этих пациентов, так и на вирусиндуцированную супрессию иммунного ответа и является предиктором длительной персистенции вируса. Иммунологическими маркерами риска, на ранней стадии инфицирования предопределяющими длительную персистенцию возбудителя в организме, являются следующие показатели: высокий уровень антигенемии ВКЭ, отсутствие повышения уровня активированных Т-лимфоцитов, NK- и NKT-клеток и незначительная стимуляция цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток, активация продукции противовоспалительных цитокинов при отсутствии стимуляции продукции IFN I и II типа. 204 Развитие висцерально-невральной фазы инфекционного процесса при КЭ приводит к формированию манифестных форм заболевания (лихорадочной, менингеальной и очаговых форм КЭ) [47, 129, 305, 361] и может быть вызвано нейроинвазивными штаммами, составляющими дальневосточной популяции вируса КЭ [13]. меньшую долю В последнее десятилетие в структуре заболеваемости КЭ в Приморском крае стала преобладать лихорадочная форма (58,6% - 64,5%), число больных с менингеальными формами составляло 7,0% - 13,8%, с очаговыми формами – 10,3% - 25,7%, среди которых от 3,4% до 15,9% случаев регистрируется летальный исход [98]. В нашей работе среди 67 обследованных пациентов с зарегистрированным диагнозом КЭ (рубрика А 84.0 по МКБ 10) больные лихорадочной формой КЭ средней степени тяжести составили 67,2% (1-ая группа), пациенты с очаговыми формами КЭ и благоприятным исходом - 23,9% (2-ая группа), пациенты с очаговыми формами КЭ и летальным исходом - 8,9% (3-я группа). Для установления прогностических иммунопатогенетических маркеров тяжести течения инфекции было проведено сравнительное изучение функциональной активности клеточного и гуморального иммунитета, цитокиновой системы пациентов манифестными формами в остром периоде заболевания КЭ. Комплексное изучение функциональной активности иммунной системы пациентов с манифестными формами КЭ позволило установить общие закономерности и различия иммунного ответа, характерные для острого периода инфекционного процесса, индуцированного вирусом КЭ. Для всех обследованных пациентов в этот период было присуще: наличие Т-клеточного дефицита, активация гуморального иммунного ответа и дисбаланс системы цитокинов. Выявленные нами общие закономерности иммунного ответа при остром КЭ, свойственны многим вирусным инфекциям, в том числе и КЭ, и подтверждены клиническими исследованиями [47, 73, 89, 149, 150, 203, 319]. Однако степень выраженности вирусиндуцированной иммуносупрессии, 205 связанная как со свойствами вируса КЭ, так и уровнем иммунокомпетентности организма, во многом предопределяет различную тяжесть течения и исход инфекционного процесса. В острый период заболевания у пациентов с лихорадочной формой КЭ на фоне относительного Т-клеточного дефицита выявлено увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих ранние и поздние активационные антигены (CD3+CD25+, HLA-DR+, CD3+CD95+), и повышение содержания NK- и NKTклеток (табл. 23). Умеренное повышение уровня вирусспецифических антител класса IgM, IgG3, преобладание ЦИК крупных размеров и адекватная активация системы комплемента, вносили существенный вклад в иммунную защиту этих пациентов. Цитокиновый статус у них характеризовался умеренной активацией системного цитокинового ответа Th1-типа и высоким уровнем продукции IFN I-типа, а также повышением цитокининдуцирующей способности клеток, свидетельствующим о достаточном резервном потенциале клеток крови этих пациентов. Отмеченное в первую неделю заболевания умеренное изменение пациентов обеспечило функциональной в дальнейшем активности иммунной системы среднюю тяжесть течения инфекционного процесса. В то же время, зарегистрированные в острой фазе инфекционного процесса глубокий Т-клеточный дефицит, а также выраженная дисфункция гуморального иммунитета и системы цитокинов, повлекли за собой тяжелое течение КЭ. Были установлены иммунологические критерии, указывающие на прогрессирование заболевания. При изучении состояния клеточного иммунитета пациентов с манифестными формами КЭ наиболее важными в плане прогноза течения заболевания оказались изменения относительного содержания и абсолютного количества следующих популяций лимфоцитов: CD4+, CD8+, NK, NKT, CD25+, CD95+. Снижение показателей коэффициента CD4+/CD8+, установленное у пациентов с очаговыми формами КЭ, не только отражало соотношение регуляторных субпопуляций Т-клеток, но и 206 Таблица 23 Характер изменений показателей иммунной системы пациентов с манифестными формами КЭ в острый период заболевания Показатели иммунной системы лихорад. форма КЭ невакц. (n=28) очаговые формы КЭ (благопр. исход) (n=16) очаговые формы КЭ (летал. исход) (n=6) Т-лимфоциты (CD3 CD19-, CD3+CD4+) (109/л) N ↓ ↓↓ ↑↑ N ↓ ↑ N ↓ N N ↓ NK- клетки (109/л) NKT-клетки (CD3+CD16+CD56+) (109/л) ↑↑↑ ↓ ↓↓ ↑↑ N ↓ B-клетки (CD3-CD19+) (109/л) N ↑↑ ↑↑ вирусспецифические IgM ↑ ↑↑↑ ↑↑↑ общие IgM (мг/мл) N ↑↑ ↑↑ общие IgG (мг/мл) N ↓ ↓ общие IgG1 (мг/мл) N ↓ ↓ общие IgG3 (мг/мл) ↑ ↓ ↓ компоненты комплемента (C3, C3a, C4, C5, C5a) (мкг/мл) ↓ ↑ ↑ провоспалительные цитокины (IL-8, IL-1β, TNFα) (пкг/мл) ↑↑↑ ↑ ↑↑↑↑ IFN I типа (IFNα) (пкг/мл) ↑↑↑ N N IFN II типа (IFNγ) (пкг/мл) ↑ ↑ ↑↑ IL-6 (пкг/мл) ↑ ↑↑↑ ↑↑↑↑ противовоспалительные цитокины (IL-4, IL-10) (пкг/мл) N ↑↑ N + Показатели клеточного иммунитета Показатели гуморального иммунитета Показатели цитокиновой системы активированные Т-лимфоциты - CD3+25+, - HLA-DR+, CD3+CD95+ (109/л) цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+) (109/л) Примечание: N- показатели, находящиеся в пределах вариабельности значений у здоровых доноров («норма»); ↑(↓)- выше (ниже) нормы на 20-40%; ↑↑ (↓↓)- выше (ниже) нормы на 40-60%; ↑↑↑ (↓↓↓) - выше (ниже) нормы в 2 раза; ↑↑↑↑- выше нормы в 3 и более раз. 207 свидетельствовало о выраженном дисбалансе регуляторных механизмов клеточного иммунитета при данных формах заболевания. Низкие показатели соотношения пролиферативных и элиминационных процессов (CD25+/CD95+) у пациентов с очаговыми формами КЭ можно рассматривать как вирусиндуцированную супрессию клеточного иммунитета. Отсутствие Т-клеточной активации у пациентов с очаговыми формами КЭ подтверждалось и в экспериментах ex vivo, продемонстрировавших раннее подавление активации Т-лимфоцитов (CD4+ и CD8+) и NK-клеток крови, индуцированное штаммом Dal, изолированным из мозга пациента, умершего от очаговой формы КЭ. Таким образом, снижение показателей CD4+/CD8+ и CD25+/CD95+ является прогностически неблагоприятным признаком течения заболевания КЭ. Сравнительное изучение факторов гуморального иммунитета пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде (вирусспецифические антитела класса IgM, общие сывороточные иммуноглобулины IgM, IgA, IgG и подклассы IgG1-IgG4, уровень и размеры ЦИК, содержание компонентов комплемента) позволило выявить предикторы тяжести течения инфекционного процесса (табл.23). Повышенная продукция общих и вирусспецифических антител класса IgM на фоне сниженного содержания общего сывороточного IgG и его подклассов IgG1 и IgG3, гиперактивация системы комплемента и повышение содержания ЦИК средних и мелких размеров, зарегистрированные у пациентов с очаговыми формами КЭ, повлекли за собой тяжелое течение КЭ. Многочисленные факты, указывающие на наличие тесной взаимосвязи между уровнем продукции цитокинов и клиническими характеристиками инфекционного процесса, дают возможность на ранней стадии заболевания прогнозировать его течение [26, 43, 176, 203, 217, 465]. Комплексный анализ ранних цитокиновых реакций (продукция цитокинов IL-8, IL-1β, IFNα, TNFα, IFNγ, IL-6, IL-4 и IL-10, а также продукция цитокинов ex vivo в культуре интактных и митоген-индуцированных клеток крови) позволил 208 дифференцировать различия в системе цитокинов у пациентов с манифестными формами КЭ в острой фазе заболевания (табл.23). Установлено, что к прогностически неблагоприятным признакам, соответствующим тяжелому течению болезни, относятся: снижение цитокининдуцирующей функции иммунокомпетентных клеток, гиперпродукция либо незначительная продукция провоспалительных цитокинов. Так, неадекватно низкие уровни продукции IL8, IL-1β, TNFα, IFNγ, отсутствие стимуляции продукции IFNα, ранний дисбаланс продукции Th1/Th2 цитокинов, направленный в сторону Th2цитокинов, явились серьезной предпосылкой формирования выраженной иммуносупрессии, приведшей к развитию очаговых форм КЭ у пациентов с благоприятным исходом активационного заболевания. типа, Дисфункция системы характеризующаяся цитокинов гиперпродукцией провоспалительных цитокинов и превалированием Th1-типа иммунного ответа, вызывала резкое снижение резервного потенциала иммунокомпетентных клеток и предопределила неблагоприятный исход у пациентов. Такие же закономерности были характерны для мышей BALB/c, инфицированных высоковирулентным штаммом Dal, у которых развивался аналогичный системный (в крови) и локальный (в мозге) цитокиновый ответ активационного типа, что обеспечивало существенный иммунопатологический вклад в быструю гибель животных. Таким образом, наше исследование подтвердило и расширило текущие знания о наличии тесной взаимосвязи клинических форм КЭ с компонентами системы цитокинов, а также с клеточными и гуморальными факторами иммунной системы инфицированных пациентов, что позволяет составить более целостное представление о роли изменений функционирования иммунной системы организма в патогенезе формирования вирусной инфекции. На основе данных комплексной оценки состояния иммунитета у пациентов с манифестными формами КЭ в острой фазе заболевания иммунологические критерии, позволяющие были выявлены прогнозировать развитие 209 заболевания. Полученные результаты необходимы для развития патогенетически обоснованной терапии этой нейроинфекции. Следует особо отметить, что среди обследованных нами пациентов, инфицированных вирусом КЭ, были выявлены лица, вакцинированные против этой инфекции. Поскольку эффективность любой вакцинации никогда не достигает 100% [17], то среди лиц, ранее привитых вакцинами против КЭ, также отмечаются случаи заболевания. В зависимости от региона и от используемой вакцины в разные периоды времени авторы указывали, что среди заболевших КЭ, вакцинированные лица составляли от 9 до 29% [16, 18]. В Приморском крае при применении современных вакцин не зарегистрировано летальных исходов в группе привитых лиц, большинство случаев заболевания ограничилось лихорадочной формой (90,2%), менингеальной – 4,2% и очаговой – 5,6% [68]. В период с 2008 года по 2012 год среди заболевших вакцинированных лиц в 100% случаев была выявлена только лихорадочная форма заболевания. При этом практически отсутствуют особенностях функционирования иммунной системы данные об вакцинированных пациентов при инфицировании ВКЭ, и даже заболевании КЭ. В то же время изучение случаев заболевания вакцинированных лиц важно для оценки эффективности вакцинопрофилактики и для решения вопроса о необходимости изменений в рекомендуемых схемах вакцинации. Нами были изучены особенности механизмов элиминации вируса КЭ у вакцинированных против этой инфекции лиц при клинически бессимптомных случаях КЭ и при лихорадочной форме КЭ. По уровню антигенемии ВКЭ и скорости элиминации вируса вакцинированные пациенты, также как и невакцинированные были разделены на две группы: 1-ая группа - с невысоким содержанием антигена и быстрой его элиминацией, 2-ая группа – со значимо более высоким уровнем антигена и замедленной элиминацией его. Следует отметить, что значимых отличий в содержании антигена у привитых и непривитых лиц обеих групп не зарегистрировано. 210 Изучение функционального состояния клеточного иммунитета в начале инфекционного процесса показало различия в структуре субпопуляций лимфоцитов периферической крови вакцинированных пациентов разных групп. В этот период субпопуляционный состав лимфоцитов привитых лиц 1-ой группы (с кратковременной антигенемией) и вакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ отличался от такового у здоровых доноров лишь умеренным повышением содержания NK-клеток, В-лимфоцитов и активированных Т-лимфоцитов (CD25+, HLA-DR+, CD95+). В то же время не было отмечено изменений в структуре субпопуляций лимфоцитов вакцинированных пациентов 2-ой группы (с длительной антигенемией). Функциональная активность гуморального противовирусного иммунитета в ранней фазе инфекционного процесса отличалась у привитых пациентов разных вирусспецифического групп, прежде иммунного всего, ответа. В степенью группах выраженности вакцинированных пациентов, обследованных на 2-3 сутки после обнаружения антигена ВКЭ, вирусспецифические антитела класса IgM не выявлялись. Антитела класса IgM к вирусу КЭ, характеризующие острый период заболевания, были обнаружены только у привитых пациентов с лихорадочной формой КЭ. При этом уровень данных антител был невысоким, что указывало на легкую степень течения заболевания у этих лиц. Содержание вирусспецифических антител класса IgG, приобретенных на основе предыдущих вакцинаций, в группах привитых лиц значимо различалось, как по количественным (уровень антител), так и по качественным (авидность антител) параметрам. Наиболее высокий уровень IgG с преобладанием высокоавидных антител был выявлен у вакцинированных лиц 1-ой группы (с кратковременной антигенемией). У привитых пациентов с лихорадочной формой КЭ был отмечен средний уровень этих антител со средним уровнем авидности. Наиболее низкий уровень IgG с доминированием низкоавидных антител зарегистрирован у вакцинированных лиц 2-ой группы (с длительной антигенемией). Сходная картина у привитых пациентов отмечалась 211 в отношении вируснейтрализующих антител: наиболее высокий уровень - у лиц 1-ой группы, низкий – у лиц 2-ой группы и средний – у пациентов с лихорадочной формой КЭ. Известно, что непродолжительного в начале контакта с инфекционного антигеном процесса начинают после синтезироваться низкоавидные антитела класса IgG, которые непрочно связываются с антигеном и не способны его активно элиминировать [174]. В то же время, многократная вакцинация, охватывающая значительный промежуток времени, как правило, способствует образованию высокоавидных антител класса IgG [84]. Изучение защитного действия вакцин против DENV на экспериментальной модели обезьян, ранее привитых, а затем инфицированных вирусом DENV-2, показало значимость не только вируснейтрализующих антител, но и показателей авидности антител, самые высокие из которых были выявлены у животных, привитых инактивированной вакциной [228]. В то же время Е.В. Павленко (2010) было показано, что не все лица, вакцинированные против КЭ, даже в год вакцинации имели авидные антитела, и с течением времени происходило снижение показателей авидности антител у привитых лиц. Очевидно, выявленное в нашем исследовании невысокое содержание авидных и вируснейтрализующих антител указывало на снижение уровня иммунологической защищенности, обеспечиваемой вакцинацией, у привитых пациентов с лихорадочной формой КЭ и у вакцинированных лиц 2-ой группы (с длительной антигенемией). Исследуя гуморальный иммунный ответ у привитых пациентов, мы выявили у вакцинированных пациентов 1-ой группы наиболее высокий уровень общего IgG и его подклассов IgG1 и IgG3, эффективных в привлечении фагоцитов и киллерных клеток и в активации комплемента [103, 411, 463]. У вакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ по сравнению с другими обследованными привитыми лицами были более выражены процессы иммунокомплексообразования и активация системы комплемента. Активное 212 потребление компонентов комплемента (С3-, С4-компоненты) у пациентов данной группы обусловлено наличием вирусспецифических антител класса IgM, которые, как известно, более эффективно активируют систему комплемента по сравнению с антителами класса IgG [52]. Иммуносупрессивное действие высоких доз антигена проявилось отсутствием значимых изменений в гуморальном звене иммунитета у вакцинированных пациентов 2-ой группы. Основная закономерность, выявленная нами при исследовании системы цитокинов у привитых пациентов в начале инфекционного процесса, заключалась в повышении уровня продукции провоспалительных цитокинов (IL-8, IL-1β, TNFα) и иммунорегуляторного цитокина IFNγ у всех обследованных лиц, наиболее выраженная у вакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ. Соотношение INFγ/IL-4, свидетельствующее об уровне баланса цитокинов, продуцируемых Th1- и Th2-лимфоцитами, у вакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ и привитых лиц 1-ой группы было повышено, что свидетельствовало о преобладании Th1-иммунного ответа у данных групп пациентов. У привитых лиц 2-ой группы отсутствие изменений концентрации INFα и увеличение содержания противовоспалительных цитокинов (IL-4 и IL-10) по сравнению с показателями в группе здоровых доноров указывали на формирование Th2-иммунного ответа. Тот факт, что у привитых лиц клиническое течение КЭ оказывается более легким, а исходы заболевания у вакцинированных более благополучными по сравнению с непривитыми лицами, подтверждается многими исследователями [16, 18, 40, 68, 78, 444, 477]. Однако иммунологическое обоснование возникновения случаев заболевания у вакцинированных лиц практически отсутствовало. Проведенное нами комплексное сравнительное изучение изменений клеточных и гуморальных факторов иммунитета на начальной стадии инфицирования вирусом КЭ позволило выявить отличительные особенности и общие закономерности иммунного ответа пациентов, ранее вакцинированных против этой инфекции. 213 Для привитых пациентов уже на начальной стадии инфицирования ВКЭ была характерна индукция эффекторной фазы адаптивного иммунного ответа: активация Т- и В-лимфоцитов, повышение функциональной активности гуморальных факторов иммунитета (запуск классического пути активации системы комплемента, усиление процессов продукция иммунокомплексообразования), иммунорегуляторных цитокинов (IFNγ и IL-4). Особенности иммунного ответа вакцинированных лиц, на наш взгляд, были связаны с эффективностью вирусспецифического ответа, обеспеченного вакцинацией, величиной антигенной нагрузки, и свойствами вируса КЭ. Так, у вакцинированных пациентов 1-ой группы с невысоким содержанием антигена ВКЭ наличие высокого уровня вирусспецифического иммунного ответа сопряженного с умеренной активацией адаптивного иммунитета обусловило быструю элиминацию возбудителя. Напротив, более высокая антигенная нагрузка, а также небольшое количество вируснейтрализующих и низкоавидных вирусспецифических антител класса IgG в сочетании с незначимыми изменениями параметров гуморального и клеточного звена иммунитета и ранней поляризацией иммунного ответа в сторону Th2-типа, способствовало длительной элиминации патогена у привитых пациентов 2-ой группы. Средний уровень поствакцинального иммунного ответа, выявленный у вакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ, а также зарегистрированное в острой фазе инфекционного процесса небольшое количество вирусспецифических антител класса IgM, в комбинации с выраженной активацией систем комплемента и цитокинов, предопределили легкое течение заболевания у данных пациентов. Поскольку высокий уровень вирусспецифического иммунного ответа, обусловленного вакцинацией, оказывается важным фактором, способным предотвратить заболевание КЭ, обеспечить быструю элиминацию вируса или легкое течение этой нейроинфекции, то рекомендация о необходимости весьма актуальной исследования является эффективности 214 поствакцинального иммунного ответа (на присутствие вирусспецифических антител класса IgG) перед эпидемическим сезоном. До настоящего времени лечение КЭ, как и других вирусных инфекций, представляет собой сложную и нерешенную проблему. Несмотря на успехи комбинированной терапии с использованием препаратов различных фармакологических групп, основными проблемами противовирусной терапии КЭ в современных условиях являются её недостаточная эффективность, вероятность развития побочных эффектов и высокая стоимость противовирусных препаратов [40, 47, 72, 144, 145, 150, 164]. Следовательно, поиск препаратов, которые бы не только ингибировали репликацию вируса и элиминировали его из организма, но и корригировали индуцированное вирусом иммунодефицитное состояние остается актуальным. Одним из возможных подходов к эффективному патогенетически обоснованному лечению пациентов с КЭ является включение в комплексную терапию биологически активных соединений, выделенных из природных объектов и обладающих в ряду прочих свойств, иммуномодулирующим действием. Источником уникальных биологически активных веществ широкого спектра действия являются морские гидробионты, которые в большинстве случаев нетоксичны и характеризуются широко и успешно воспроизводимой сырьевой базой [32]. Это явилось основанием для проведения исследования противовирусной активности новых биополимеров из морских гидробионтов - люромарина и тинростима, обладающих широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами, в отношении вируса КЭ для обоснования возможности их применения в комплексной терапии КЭ. Для сравнительного изучения противовирусной эффективности тинростима и люромарина были использованы официнальные препараты, применяющиеся при терапии КЭ: иммуноглобулин против КЭ, химиопрепарат (рибавирин), рекомбинантный IFNα – (реаферон-ЕС) и индукторы эндогенных IFNα/β (циклоферон и 4-йодантипирин). Согласно требованиям 215 Фармакологического государственного комитета РФ [134] по доклиническому изучению новых лекарственных средств исследование противовирусной активности тинростима и люромарина проводили на моделях in vitro и in vivo. Противовирусную активность исследуемых препаратов in vitro оценивали по эффективности подавления репликации вируса КЭ в культуре клеток СПЭВ, инфицированных высоковирулентным штаммом Dal вируса КЭ. Протективное действие препаратов in vivo исследовалось при моделировании летальной вирусной инфекции у неинбредных мышей, инфицированных штаммом Dal вируса КЭ в дозе 100 LD50. Была использована лечебная схема введения изучаемых препаратов, т.е. через 1 час после заражения. Проведенные исследования показали, что наиболее эффективным препаратом в отношении вируса КЭ как на модели in vitro, так и in vivo является противоклещевой иммуноглобулин, который полностью подавлял репродукцию вируса в культуре клеток СПЭВ и увеличивал среднюю продолжительность жизни мышей на 6,4 дня по сравнению с животными, не получавшими лечения. Применение химиопрепарата – рибавирина, который in vitro проявлял выраженную вирусингибирующую активность при репликации вируса КЭ, на экспериментальной модели КЭ у мышей оказалось малоэффективным и удлиняло срок их жизни лишь на 2,0 дня. Полученные нами данные аналогичны данным литературы, свидетельствующим о высокой противовирусной активности рибавирина in vitro в отношении вируса КЭ, и в то же время, животных, инфицированных этим вирусом, а также другими флавивирусами, препарат защищает недостаточно эффективно [338]. Умеренную эффективность в отношении вируса КЭ на моделях in vitro и in vivo проявляли индуктор интерферона – циклоферон и новые иммуномодулирующие препараты – люромарин и тинростим. Так, например, эти препараты увеличивали среднюю продолжительность жизни животных на 2,7-4,7 дней по сравнению с нелечеными животными. Наименьшее протективное действие продемонстрировали реаферон-ЕС и 4-йодантипирин: 216 эти препараты удлиняли срок жизни инфицированных животных лишь на 0,81,7 дня. Известно, что комбинированное использование противовирусных препаратов, имеющих различную химическую структуру и принципиально различный механизм действия, приводит к усилению антивирусного эффекта аддитивного или синергидного характера [172]. В этой связи нами было изучено сочетанное применение официнальных препаратов (рибавирина и циклоферона) с люромарином и с тинростимом при остром летальном КЭ у мышей и на инфицированной вирусом КЭ культуре клеток СПЭВ. Комбинированное использование in vitro рибавирина и люромарина, рибавирина и тинростима (в соотношении 1:1) в минимально эффективных вирусингибирующих концентрациях обеспечило в два раза более выраженное подавление репродукции вируса КЭ по сравнению с монопрепаратами, применяемыми раздельно. Сочетанное применение люромарина и тинростима с рибавирином или с циклофероном in vivo повышало выживаемость инфицированных животных и удлиняло среднюю продолжительность жизни по сравнению с контрольной группой и группами мышей, которые получали только один препарат. Наиболее эффективной оказалась комбинация циклоферона с исследуемыми иммуномодулирующими препаратами, которая значимо превышала таковую каждого монопрепарата (z>1,960, a≤0,05). Так, сочетанное применение циклоферона и люромарина увеличивало СПЖ на 7,0 дней, комбинированное введение циклоферона и тинростима - на 6,1 дня по сравнению таковой у нелеченых мышей. Таким образом, на модели in vitro и in vivo было продемонстрировано, что комбинация препаратов (рибавирина и люромарина, рибавирина и тинростима, а также циклоферона с люромарином и циклоферона с тинростимом) приводит к усилению антивирусного эффекта аддитивного характера. Полученные в настоящем исследовании результаты протективного действия новых иммуномодулирующих препаратов – люромарина и 217 тинростима и эффективности их сочетанного применения с официнальными препаратами (рибавирином и циклофероном) позволяют рассматривать их как перспективные средства для комбинированной терапии КЭ. Результаты выполненных комплексных клинико-экспериментальных исследований по изучению клеточно-молекулярных иммунных механизмов патогенеза разных клинических форм КЭ позволили нам расширить существующую концепцию иммунопатогенеза КЭ. Основное внимание при этом было сосредоточено на начальных этапах иммунной защиты против инвазии вируса КЭ, эффективность которых в значительной мере определяет развитие и исход вирусной инфекции. Установленное различие в способности штаммов дальневосточного субтипа вируса КЭ модулировать ранние этапы активационного процесса иммунокомпетентных клеток и последующую секрецию цитокинов имеет принципиальное значение, внося существенный вклад в разнообразие течения и исходов инфекционного процесса. При этом механизм вирусиндуцированной активации или подавления экспрессии адгезионных и активационных рецепторов может быть сопряжен с особенностями молекулярно-генетических характеристик штаммов вируса и, вероятно, лежит в основе таких фундаментальных свойств вируса как вирулентность и патогенность. Кроме того, разнообразие инфекционных потенциалов штаммов ВКЭ отражает гетерогенность дальневосточной обусловливает клинический вирусной полиморфизм популяции заболевания, и во многом связанный с циркулирующими в данном регионе штаммами ВКЭ. Установленная нами на ранних этапах инфекционного процесса (2-4 сутки после обнаружения в крови антигена ВКЭ) взаимосвязь уровня антигенемии вируса КЭ с функциональной активностью эффекторной фазы врожденного иммунитета пациентов позволила определить иммунологические прогностические критерии быстрой элиминации или длительной персистенции возбудителя. Комплексное изучение функциональной активности иммунной 218 системы пациентов с разными манифестными формами КЭ позволило установить общие закономерности и различия иммунного ответа, характерные для острого периода инфекционного процесса, и выявить иммунопатогенетические маркеры риска, характеризующие тяжесть течения и исход заболевания. Различный характер течения инфекционного процесса (быстрая либо замедленная элиминация антигена ВКЭ, или легкое течение лихорадочной формы КЭ) у лиц, ранее вакцинированных против КЭ, прежде всего, обусловлено разной эффективностью поствакцинального вирусспецифического иммунного ответа, величиной вирусной нагрузки и степенью активации эффекторной фазы адаптивного иммунитета. Экспериментально обоснована противовирусная эффективность в отношении вируса КЭ новых иммуномодулирующих препаратов – люромарина и тинростима и их комбинированного применения с официнальными препаратами (рибавирином и циклофероном). Противовирусные свойства люромарина и тинростима, обладающих широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами, позволяют сочетать этиотропное и патогенетическое лечение, и свидетельствуют о перспективности использования этих БАВ в комбинированной терапии КЭ. Полученные нами данные открывают перспективы для дальнейшего, более детального изучения молекулярных механизмов взаимодействия штаммов вируса КЭ с иммунокомпетентными клетками, вклада этих механизмов в развитие различных вариантов инфекционного процесса, что позволит вести целевой поиск терапевтических средств, влияющих на ключевые патологические звенья заболевания. 219 ВЫВОДЫ 1. На эндемичной территории Приморского края у пациентов с КЭ в 73,4% случаев выявлены инаппарантные, в 26,6% случаев - манифестные варианты течения инфекции. В последнем случае, у 67,2% больных наблюдалась лихорадочная форма заболевания, у 23,8% - очаговые формы, у 9% - зарегистрирован летальный исход. Среди пациентов с КЭ вакцинированные лица составили 31,3%, заболевание у них протекало только в лихорадочной форме. 2. На начальной стадии инфекционного процесса у невакцинированных пациентов с антигенемией ассоциирована с вируса КЭ быстрая элиминация патогена невысоким уровнем антигенной нагрузки, увеличением в периферической крови концентрации IFNα, количества NK-, NKT-клеток и Тлимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации (CD25). Отсутствие повышения этих показателей, на фоне увеличения концентраций IL-4, IL-10, а также высокий уровень ВКЭ-антигенемии являются предикторами длительной персистенции возбудителя. 3. У лиц, ранее вакцинированных против КЭ, быстрая элиминация антигена ВКЭ связана с высоким уровнем поствакцинальных высокоавидных IgG и вируснейтрализующих антител, невысокой антигенной нагрузкой, умеренным повышением количества NK-, NKT-клеток, В-лимфоцитов и активированных Т-лимфоцитов и увеличением содержания IFNγ в сыворотке крови. При замедленной элиминации антигена установлено отсутствие изменений субпопуляционного состава лимфоцитов, повышенное содержание IL-4 и IL-10 в сыворотке крови, высокий уровень ВКЭ-антигенемии на фоне невысокого уровня поствакцинальных низкоавидных IgG и вируснейтрализующих антител. 4. В остром периоде заболевания при лихорадочной форме КЭ у невакцинированных пациентов выявлено умеренное повышение количества 220 NK-, NKT-клеток, активированных Т-лимфоцитов, увеличение содержания IL8, IL-1β, IFNα, TNFα и невысокий уровень вирусспецифических антител класса IgM в сыворотке крови. У привитых пациентов зарегистрирован средний уровень поствакцинального иммунного ответа, невысокие показатели содержания вирусспецифических IgM, значимое увеличение количества NK-, NKT-клеток, активированных Т-лимфоцитов, повышение содержания IFNγ в сыворотке крови. 5. У пациентов с очаговыми формами КЭ в острой фазе инфекционного процесса наблюдалось снижение содержания CD3+-, CD4+-Т-лимфоцитов, NKклеток, иммуноглобулинов (IgG1, IgG3) и повышение количества Влимфоцитов, увеличение содержания цитокинов (IL-4, IL-10) в сыворотке крови, высокий уровень вирусспецифических IgM. Предикторами неблагоприятного течения КЭ с летальным исходом явилось выраженное снижение числа Т-лимфоцитов (CD3+-, CD4+-, CD8+, CD25+), NK- и NKTклеток, уменьшение концентраций IgG, IgG1, IgG3 и IFNα, а также значимое повышение содержания цитокинов (IL-8, IL-1β, TNFα, IL-6 и IFNγ) и вирусспецифических IgM в сыворотке крови. 6. В экспериментах ex vivo и in vitro установлено, что штамм Dal вируса КЭ, изолированный от пациента с очаговой формой заболевания, проникает и активно реплицируется в клетках крови, снижает экспрессию адгезивных (CD11b и ICAM-1) и активационных молекул (CD69, CD25, CD95), индуцирует усиление продукции IL-8, TNFα, IFNγ мононуклеарными клетками. Штаммы Kip-94 и P-196, изолированные от пациентов с лихорадочной и инаппарантной формой КЭ, отличались невысоким уровнем репликации в клетках, усилением экспрессии молекул адгезии и активационных антигенов, индукцией высокого уровня продукции IFNα мононуклеарными клетками. 7. Инфицирование мышей линии BALB/c штаммом Dal сопровождается высоким уровнем репликации вируса и продукции цитокинов (TNFα, IL-6, IFNγ) в крови и мозге животных; штаммом Kip-94 - умеренным уровнем 221 репликации вируса и продукции TNFα, IL-6, IFNγ; штаммом P-196 – низким уровнем репликации вируса и высоким уровнем IL-10. 8. В экспериментах in vitro и in vivo установлена вирусингибирующая и протективная активность биополимеров – люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ. Комбинированное применение биополимеров с официнальными препаратами (рибавирином и циклофероном) усиливает протективный эффект и определяет перспективность использования при КЭ. 222 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Активационные маркеры лимфоцитов как показатели дизрегуляции иммунной системы при воспалении / А.Н. Казимирский, Ж.М. Салмаси, Г.В. Порядин // Пат. физиология и эксп. терапия. - 2006. - № 1. - С. 2 - 7. 2. Активационные процессы в лимфоцитах пациентов с латентной сенсибилизацией / Г.В. Порядин [и др.] // Пат. физиология и эксп. терапия. 2009. - № 1. – С. 23 - 25. 3. Активность отечественного рибавирина в опытах in vitro на моделях вирусов крымской геморрагической лихорадки, лихорадки долины Рифт, Тягиня и Дхори / А.В. Белов [и др.] // Вопр. вирусол. - 2008. - № 1. - С. 34 - 35. 4. Анализ мутаций и молекулярное моделирование комплекса сериновой протеазы NS2B-NS3 вируса клещевого энцефалита / Потапова У.В. [и др.] // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – 2011. – Т.77, № 1. Ч.1 – С. 239-244. 5. Анализ полногеномных последовательностей штаммов дальневосточного субтипа вируса клещевого энцефалита, обладающих различной нейровирулентностью для человека / С.И. Беликов [и др.] // Бюлл. СО РАМН – 2007. - №4(126). – С. 22-28. 6. Антонов, П.В., Цинзерлинг В.А. Современное состояние проблемы хронических и медленных нейроинфекции / П.В. Антонов, В.А. Цинзерлинг // Архив патологии. - 2001. - № 1. - С. 47 - 51. 7. Ахматова, Н.К. Врожденный иммунитет: противоопухолевый и противоинфекционный / Н.К. Ахматова, М.К. Киселевский - М.: Практическая медицина, 2008. - 256 с. 8. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьёв - Л., 1962. – 137 с. 9. Бахов, Н.И. Механизмы защиты организма от вирусных инфекций: нейтрофильные лейкоциты / Н.И. Бахов, Ю.Ф. Майчук, А.В. Корнев // Успехи современной биологии. - 2000. - Т.120. №1. - С. 23 - 35. 223 10. Беседнова, Н.Н. Биологически активная добавка к пище тинростим (в помощь практическому врачу) / Н.Н. Беседнова, Л.М. Эпштейн. - Владивосток: ТИНРО-центр, 2003. - 47с. 11. Беседнова, Н.Н. Иммуноактивные пептиды из гидробионтов и наземных животных / Н.Н. Беседнова, Л.М. Эпштейн - Владивосток: ТИНРО-центр, 2004. - 248 с. 12. Беседнова, Н.Н. Иммунокорректоры в комплексном лечении вирусных инфекций / Н.Н. Беседнова, Г.Н. Леонова, Т.С. Запорожец // ЖМЭИ. - 2006. № 3. С. 111 - 117. 13. Биологическая дальневосточной и популяции молекулярно-генетическая вируса клещевого характеристика энцефалита и ее патогенетическое значение / Г.Н. Леонова [и др.] // Вопр. вирусол. - 2007. - №6. - С.13-17. 14. Биологически активные добавки и лекарственные препараты на основе природных соединений из океанического, растительного и марикультурного сырья / Г.Б. Еляков [и др.] // I-й Международный инвестиционный конгресс «Новейшие технологии в системе интегральных процессов территорий стран АТР», 30 мая -2 июня 2000, Владивосток. – Владивосток: Дальневосточная морская академия, 2000. – 276 с. 15. Борисевич, В.Г. Инфекционный процесс при стертой и инаппарантной формах клещевого энцефалита / В.Г. Борисевич, Г.Н. Леонова // В кн. «Клещевой энцефалит» Изд-во ГУП «Полиграфкомбинат»: Владивосток. 2002. С.48 - 59. 16. Вакцинопрофилактика клещевого энцефалита в районах доминирования сибирского подтипа возбудителя / В.В. Погодина [и др.] // Журн. инфекционной патологии. - 2012. - Т.19. № 3. - С.42. 17. Вакцины против клещевого энцефалита: документ по позиции ВОЗ // Еженедельный эпидемиологический бюллетень. - 2011. - Т. 86. № 24. - С. 241 256. 224 18. Вакцины, иммуноглобулины и тест-системы для профилактики и диагностирования клещевого энцефалита / М.С. Воробьева [и др.] // Вопр. вирусол. - 2007. - Т.52. - С. 30 – 36. 19. Вирулентность штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных от людей с разными формами инфекции / Г.Н. Леонова [и др.] // Сибирский мед. журнал. – 2012. - №4. – С. 12 -16. 20. Вирусы комплекса клещевого энцефалита / Е.Н. Левкович, В.В. Погодина, Г.Д. Засухина, Л.Г. Карпович - М.: Ленинградское отделение, 1967. 245 c. 21. Влияние лютеолина, розмариновой кислоты и эхинохрома А на иммунитет при моделировании стресс-индуцированной кардиопатологии / А.М. Попов [и др.] // Российский Аллергологический Журнал. - 2010. - № 5. - С. 228 230. 22. Волгин, А.Р. Современные аспекты проблем клещевого энцефалита: эпидемический процесс, диагностика, профилактика / А.Р. Волгин, Н.Н. Лукин, Н.Н. Ляшенко // Военно-медицинский журнал. - 2007. - № 5. - С. 48 - 57. 23. Вуколов, Э.А. Основы статистического анализа. Практикум по статистическим методам и исследованию операций с использованием пакетов STATISTICA и EXCEL / Э.А. Вуколов - М.: Форум-Инфра-М, 2004. - 464 с. 24. Гажа, А.К. Иммуноактивный пептид из оптических ганглиев кальмара: автореф. дисс…канд. мед. наук: 14.00.36 / А.К. Гажа. - Владивосток, 1994. 23с. 25. Гайдамович, С.Я. Методические рекомендации / С.Я. Гайдамович // Итоги науки и техники. Серия Вирусология. - 1991 - Т.25 - с.113. 26. Гариб, Ф.Ю. Влияние патогенов на продукцию интерферонов и других цитокинов / Ф.Ю. Гариб // Сб. научных статей «Интерферон – 2011». М. - 2012. - С. 158 - 172. 27. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц - М.: Практика, 1999. - 459 с. 225 28. Гриневич, Ю.А. Определение иммунных комплексов в крови онкологических больных / Ю.А. Гриневич, А.Н. Алферов // Лабораторное дело. – 1981. - №8. – С. 493-496. 29. Громова, А.Ю. Полиморфизм генов семейства интерлейкина-1 человека / А.Ю. Громова, А.С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т.4. №2. С. 3 - 12. 30. Демьянов, А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике / А.В. Демьянов, А.Ю. Котов, А.С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. - 2003. - Т. 2, № 3. - С. 20 - 35. 31. Друцкая, М.С. Врожденное распознавание вирусов / М.С. Друцкая, П.В. Белоусов, С.А. Недоспасов // Молекулярная биология. - 2011. - Т.45. №1. - С. 7 19. 32. Еляков, Г.Б. Морская биоорганическая химия – основа морской биотехнологии / Г.Б. Еляков, В.А. Стоник // Известия АН: серия химия. - 2003. - № 1. - С. 1 - 18. 33. Ершов, Ф.И. Использование иммуномодуляторов при вирусных инфекциях / Ф.И Ершов // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - № 6. - С. 27 32. 34. Ершов, Ф.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств) / Ф.И. Ершов, О.И. Киселев - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 356 с. 35. Ершов, Ф.И. Антивирусные препараты / Ф.И. Ершов. - 2-е изд. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 312 с. 36. Ершов, Ф.И. Основные итоги изучения системы интерферона к 2011 году / Ф.И. Ершов, А.Н. Наровлянский // Сб. научных статей «Интерферон – 2011». М. - 2012. - С. 14 - 34. 37. Ершов, Ф.И. От чего зависят эффекты индукторов интерферона? / Ф.И. Ершов, Э.Б. Тазулахова // Сб. научных статей «Интерферон – 2011». М. - 2012. С. 80 - 106. 226 38. Железникова, Г.Ф. Воздействие вирусов на систему цитокинов / Г.Ф. Железникова // Вопр. вирусол. - 2007. - № 4. - С. 4 - 10. 39. Железникова, Г.Ф. Цитокины как предикторы течения и исхода инфекций / Г.Ф. Железникова // Цитокины и воспаление. - 2009. - № 1. - С. 10 – 16. 40. Жукова, Н.Г. Клещевой энцефалит в Томской области (Этиология, эпидемиология, клиника, диагностика, профилактика, лечение) / Н.Г. Жукова, Н.И. Команденко, Л.Е. Подоплекина - Томск: STT, 2002. - 256 с. 41. Жукова, О.Б. Вирусная персистенция: иммунологические и молекулярно-генетические аспекты патогенеза / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий // Бюлл. Сибирской медицины. - 2003. - № 4. С. 113 - 120. 42. Запорожец, Т.С. Иммуноактивные биополимеры из гидробионтов / Т.С. Запорожец - Владивосток: ТИНРО-центр, 2007. - 248 с. 43. Зима, А.П. Система цитокинов и их рецепторов при хронических вирусных инфекциях: молекулярные механизмы их дизрегуляции: автореф. дис …докт. мед. наук: 14.00.11, 03.00.25 / А.П. Зима. - Томск, 2008. 43с. 44. Злобин, В.И. Клещевой энцефалит: вопросы эпидемиологии и стратегия профилактики / В.И. Злобин // Материалы IX съезда Всероссийского научнопрактического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2007. Т. 3. С. 176-177. 45. Ивашкин, В.Т. Классические провоспалительные цитокины и их биологические эффекты при заболеваниях печени / В.Т. Ивашкин, Ю.О. Шульпекова, Е.А. Лукина // Молекулярная медицина. - 2003. - № 3. - С. 34 - 43. 46. Игнатьев, Г.М. Продукция некоторых цитокинов при экспериментальной инфекции вирусом клещевого энцефалита у мышей / Г.М. Игнатьев, Е.В. Отрашевская, М.С. Воробьёва // Вопр. вирусол. - 2003. - № 48(1). - С. 18-21. 47. Иерусалимский, А.П. Клещевой энцефалит. Руководство для врачей. / А.П. Иерусалимский - Новосибирск: Наука, 2001. - 360 с. 227 48. Иерусалимский, А.П. Клещевые инфекции в начале XXI века / А.П. Иерусалимский // Неврологический журнал. - 2009. - №3. - С.17 - 21. 49. Изучение противовирусной активности отечественных противогриппозных химиопрепаратов в культуре клеток и на модели животных / И.А. Ленева [и др.] // Вопр. вирусол. - 2010. - № 3. - С. 19 -27. 50. Изучение связи тяжести течения заболевания с концентрацией интерлейкина-2 и интерлейкина-6 в сыворотках крови больных клещевым энцефалитом / А.В. Тимофеев [и др.] // Тер. Арх. - 2002. - № 74. - С. 22 - 23. 51. Изучение эффективности препарата Люромарин при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей / Н.В. Крылова [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. - 2011. - Т. 56, № 7-8. - С. 13-15. 52. Иммунология / Д. Мейл, Дж. Бростофф, Д.Б. Рот, А. Ройтт - М.: Логосфера, 2007. – 508 с. 53. Иммунологические показатели у мышей, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита, после заражения вирусом клещевого энцефалита / Г.М. Игнатьев [и др.] // Вопр. вирусол. – 2006. – Т.51. – № 5.– С. 22-27. 54. Иммуномодулирующие свойства нестероидных противовоспалительных препаратов / А.Н. Евстропов [и др.] // Бюл. эксперим. биол. медицины. - 1991. - № 111. - С. 55 - 57. 55. Иммунопатогенез вирусного гепатита С. Иммунологические маркеры прогрессирования заболевания / Ю.В. Лобзин [и др.] // ЖМЭИ - 2007. - № 6. С. 75 - 84. 56. Иммунопатогенетические особенности клещевого энцефалита в условиях длительной вирусной антигенемии / Н.В. Рязанцева [и др.] // Вопр. вирусол. - 2006. - № 6. - С. 35 - 39. 57. Иммунопатогенетические особенности клещевого энцефалита у детей и эффект терапии / Г.Ф. Железникова [и др.] // Нейроиммунология. - 2008. - Т.VI. № 1-2. - С. 13 - 21. 228 58. Индекс авидности специфических IgG в диагностике заболеваний, вызванных вирусами Западного Нила и клещевого энцефалита / В.В. Распопин [и др.] // Клин. лаб. диагностика. - 2007. - №4. - С. 29-32. 59. Индукция апоптоза нейтрофилов вирусом клещевого энцефалита / Н.Г. Плехова [и др.] // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2012. - Т. 153. № 1. - С.118 -122. 60. Использование БАД «Тинростим» в комплексной терапии дисбактериоза кишечника у детей с аллергодерматозами / Е.А. Стукун [и др.] // Тихоокеанский мед. журнал. – 1999. - № 3. - С.67-69. 61. Использование ридостина для экстренной профилактики и комплексной терапии тяжелых форм клещевого энцефалита / Л.О. Черницына [и др.] // Сб. мат-лов науч. конф. «Применение ридостина для лечения вирусных и бактериальных инфекций и перспективы его использования при заболеваниях неинфекционной природы». Бердск. - 1998. - С. 39 - 42. 62. Казьянин, А.В. Иммунотропные эффекты молокина / А.В. Казьянин, В.В. Юшков // ЖМЭИ. - 1998. - № 2. - С. 97 - 99. 63. Карганова, Г.Г. Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита: дис…докт. биол. Наук / Г.Г. Карганова. – Москва, 2009. 385 с. 64. Картирование рецепторного домена для вирусов вэнесуэльского энцефалита лошадей и клещевого энцефалита на С-конце ламининсвязывающего белка человека /А.А. Малыгин [и др.] // Биохимия. 2009. - Т.74. № 12. - С. 1631 - 1641. 65. Кветкова, Э.А. Вирусологические и иммунологические аспекты патогенеза клещевого энцефалита: автореф. дисс…докт. мед. наук: 03.00.06 / Э.А. Кветкова. – Ленинград, 1984. 35с. 66. Кетлинский, С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета / С.А. Кетлинский // Иммунология. - 2002. - Т. 23. №2. - С. 77 - 79. 229 67. Кетлинский, С.А. Цитокины / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев - СПб: Фолиант, 2008. - 552 с. 68. Клинико-эпидемиологическая характеристика клещевого энцефалита в Приморском крае / Е.В. Павленко [и др.] // Тихоокеанский мед. журнал. - 2010. - № 3. - С. 31 - 33. 69. Кодирующие нуклеотидные последовательности штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных из крови людей без клинических проявлений инфекции / С.И. Беликов [и др.] // Генетика. – 2010. – Т.46. - №3. – С. 356 - 363. 70. Козлов, В.К. Сепсис: этиология, иммунопатогенез, концепция современной иммунотерапии / В.К. Козлов. – СПб.: Диалект, 2006. – 304 с. 71. Коненков, В.И. Структурные основы и функциональная значимость аллельного полиморфизма генов цитокинов человека и их рецепторов / В.И. Коненков, М.В. Смольникова // Мед. иммунология. - 2003. - №1-2. - С. 11 - 28. 72. Конькова-Рейдман, А.Б. Современные стратегии патогенетической терапии клещевых нейроинфекций / А.Б. Конькова-Рейдман// Инфекционные болезни. – 2009. - Т.7. № 3. - С. 35 - 39. 73. Конькова-Рейдман, А.Б. Клинико-эпидемиологическая характеристика клещевого энцефалита на Южном Урале / А.Б. Конькова-Рейдман, В.И. Злобин // Сибирский мед. журнал. – 2011. - № 4. – С. 92 - 95. 74. Кривошапко, О.Н. Экспериментальные исследования биологической активности различных соединений из морских гидробионтов: автореф. дисс…канд. биол. наук: 03.01.04 / О.Н. Кривошапко. - Владивосток, 2012. 30 с. 75. Крылова, Н.В. Изучение эффективности различных иммунокорригирующих препаратов, применяемых для лечения клещевого энцефалита / Н.В. Крылова, Г.Н. Леонова // В кн. «Клещевой энцефалит». Владивосток, 2002. - С. 157 - 165. 230 Кудрявцев, И.В. Эволюция каскада комплемента: ранние этапы / И.В. 76. Кудрявцев, А.В. Полевщиков // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т.4. №1. - С. 11-21. 77. Леонова, Г.Н. Репликация вируса клещевого энцефалита в лейкоцитах человека / Г.Н. Леонова, И.В. Тимофеев, Т.Г. Орлова // Вопр. вирусол. - 1991. №1. - С.61-63. 78. Леонова, Г.Н. Клинико-иммунологическое изучение эффективности вакцинации против клещевого энцефалита в Приморском крае / Г.Н. Леонова, СП. Кругляк, Н.М. Степанова // Вопр. вирусологии. - 1992. - № 2. - С. 225 - 228. 79. Леонова, Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае. Вирусологические и эколого-эпидемиологические аспекты / Г.Н. Леонова Владивосток: Дальнаука, 1997. – 189 с. 80. Леонова Г.Н. Вакцинопрофилактика клещевого энцефалита / Г.Н. Леонова, Е.В. Павленко, Н.В. Крылова - Владивосток: Примполиграфкомбинат, 2006. - 100 с. 81. Лечение клещевого энцефалита, иксодовых клещевых боррелиозов и других клещевых инфекций: методические рекомендации для врачей / A.B. Лепехин, Л.В. Лукашова, Н.Г. Жукова и др. Томск, 2009. - 12 с. 82. Маркелова, Е.В. Патогенетическая роль нарушений в системе цитокинов при инфекционно-воспалительных заболеваниях / Е.В. Маркелова, А.В. Костюшко, В.Е. Красников // Тихоокеанский мед. журнал. - 2008. - № 3. - С. 24 – 29. 83. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский - 16-е изд. – М.: Новая Волна, 2011. - 1216 с. 84. Медуницын, Н.В. Вакцинология / Н.В. Медуницын - М.: Триада-Х, 2010. - 512 с. 85. Мезенцева, М.В. Изучение интерферониндуцирующего действия препарата йодантипирин на модели животных и в культуре перевиваемых 231 клеток человека / М.В. Мезенцева, Ф.И. Ершов – М.: Наука, техника, медицина, 2008. - С. 11 - 14. Методология 86. оценки эпидемиологической эффективности специфической профилактики клещевого энцефалита (на примере Омской области) / Н.А. Пеньевская [и др.] // Сибирский мед. журнал. - 2012. - № 4. - С. 16 - 19. Михайлова, А.А. Миелопептиды и их роль в функционировании 87. иммунной системы / А.А. Михайлова // Иммунология. - 2001. - № 5. - С. 16 18. 88. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита / В.И. Злобин [и др.]. – Иркутск: РИО ВСНЦ СО РАМН, 2003. – 272 с. 89. Молекулярные и клеточные основы патогенеза клещевого энцефалита / Р.Ф. Насырова [и др.] // Бюлл. сибирской медицины. - 2006. - Прилож.1. - С. 42-51. 90. Молекулярные механизмы индукции врожденного иммунитета / С.С. Афанасьев [и др.] // Вестник Рос. АМН. - 2009. - № 4. - С. 42 – 49. 91. Моргацкий Н.В. Клинические особенности спорадического клещевого энцефалита у детей на территории Северо-западного региона / Н.В. Моргацкий [и др.] // Детские инфекции. – 2006. – Т. 5, № 1. – С. 24-29. 92. Морозов, В.Г. Пептидные биорегуляторы (25-летний опыт экспериментального и клинического изучения) / В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон – СПб.: Наука, 1996. - 74 с. 93. Морфогенез дальневосточного клещевого энцефалита / Л.М. Сомова [и др.] // Арх. патологии. - 2010. - №5. - С.47 - 51. 94. Наследникова, И.О. Феномен хронической антигенемии вируса клещевого энцефалита: возможные пути патогенеза / И.О. Наследникова [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2005. – № 4. – С. 446–450. 95. Неспецифическая профилактика клещевых нейроинфекций / В.Н. Худолей [и др.] // Бюл. сибирской медицины. - 2008. - Прил.1. - С. 92 -97. 232 NK и NKT клетки как иммунологические маркеры прогрессирования 96. хронического гепатита С / И.А. Сухина [и др.] // Мед. иммунология. - 2007. Т.9, №2-3. - С. 247 - 249. 97. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2012 году: Государственный доклад. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2013. - 176 с. 98. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Приморском крае в 2012 году: Государственный доклад. - Владивосток: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2013. – 240 с. 99. Одинцов, Ю.Н. Биологические функции комплемента / Ю.Н. Одинцов, В.М. Перельмутер // Бюл. сибирской медицины. - 2007. - № 2. - С. 72-82. 100. Онищенко, Г.Г. Организация надзора за клещевым вирусным энцефалитом и меры по его профилактике в Российской Федерации / Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, Н.Д. Пакскина // Вопр. вирусол. – 2007. - №5.- С.810. 101. Особенности течения клещевого энцефалита в различных регионах / В.А. Борисов [и др.] // Эпидемиология инфекционных болезней. - 2000. - № 6. С.23-26. 102. Особенности фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови у больных клещевым энцефалитом / Н.П. Пирогова [и др.] // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - Прил. 1. - 2002. - С. 82 - 85. 103. Офицеров, В.И. Подклассы иммуноглобулина G: возможности использования в диагностической практике / В.И. Офицеров – Кольцово: Вектор-Бест, 2005. - 35 с. 104. Патент: А.С 1836954 СССР, МКИ5 А61 К 35/28.- Т 4877893/14. Способ получения иммуномодулирующих пептидов / Мотавкина Н.С., Туркутюков 233 В.Б., Каленик Т.К. № 4877893; заявл. 26.10.90; опубл. 30.08.1993; Бюл. № 17. - 5 с. 105. Патент: 2217758 С2, Российская Федерация. Способ экспресс- диагностики клещевого энцефалита / Леонова Г.Н., Борисевич В.Г., Гагач Г.Ф. и др.; заявитель и патентообладатель Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (НИИЭМ СО РАМН) - № 2001128342/14; заявл: 18.10.2001; опубл. 27.11.2003. Бюл. № 23. – 6 с. 106. Патент: 2222337, Российская Федерация. МКИ С1 7 А61К35/30, А61К35/60, A23L1/333. Способ получения иммуностимулятора / Л.М. Эпштейн, Г.А. Боровская, Н.Н. Ковалев и др.; заявитель и патентообладатель Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр (ТИНРОцентр) - № 2002117863/13; заявл. 03.07.2004; опубл. 27.01.2004. Бюл. № 3. - 3 с. 107. Патент: 2432959 С1, Российская Федерация. Средство, обладающее антиоксидантным, кардиопротекторным, противовоспалительным, противодиабетическим, гепатопротекторным, противоопухолевым и противовирусным действием / Попов А.М., Артюков А.А., Кривошапко О.Н. и др.; заявитель и патентообладатель Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (ТИБОХ ДВО РАН) - №2010141686/15; заявл. 11.10.2010; опубл. 10.11.2011. Бюл. № 31. – 11 с. 108. Патент: 2473364 (13) C2, Российская Федерация. Способ лечения клещевого энцефалита / С.Н. Таргонский, С.В. Усова, О.Н. Мухина, М.Г. Шарыпова; заявитель и патентообладатель ЗАО "Вектор-Медика" - № 2011104926/15; заявл. 10.02.2011; опубл. 20.08.2012, Бюл. № 11. – 5 с. 109. Патогенетические критерии оценки вирулентности штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на юге Дальнего Востока / Г.Н. Леонова [и др.] // Вопр. вирусол. - 1995. - № 4. - С. 165-169. 110. Пеньевская, Н.А. Этиотропные препараты для экстренной профилактики клещевого энцефалита: перспективные разработки и проблемы 234 эпидемиологической оценки эффективности / Н.А. Пеньевская // Эпидемиология и вакцинопрофилактика.- 2010.- №1.- С. 39-45. 111. Пинегин, Б.В. NK-клетки: свойства и функции / Б.В. Пинегин, С.В. Дамбаева // Иммунология. - 2007. - № 2. - С.105 - 113. 112. Плетнев, А.Г. Нуклеотидная последовательность генома и полная аминокислотная последовательность полипротеина вируса клещевого энцефалита / А.Г. Плетнев, В.Ф. Ямщиков, В.М. Блинов // Биоорг. химия. 1989. - Т. 15. № 11.- С. 1504 - 1521. 113. Плехова, Н.Г. Значение клеток моноцитарно-макрофагальной системы в патогенезе флавивирусных инфекций / Н.Г. Плехова // Бюл. СО РАМН. 2007. - №4. - С.71 - 77. 114. Погодина, В.В. Хронический клещевой энцефалит / В.В. Погодина, М.П. Фролова, Б.А. Ерман – Новосибирск: Наука, 1986. - 232 с. 115. Погодина, В.В. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита и этиологической структуры заболеваемости за 60-летний период / В.В. Погодина // Вопр. вирусол. - 2005. - № 3. - С. 7-13. 116. Погодина, В.В. История изучения клещевого энцефалита: открытия, трагедии, вопросы, дискуссии / В.В. Погодина // Вестник Уральской государственной медицинской академии, посвященный II Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции. Современные аспекты клещевых инфекций». Екатеринбург, 2010. С. 121-124. 117. Попов, А.М. Влияние лютеолина, розмариновой кислоты и эхинохрома А на иммунитет при моделировании стресс-индуцированной кардиопатологии / А.М. Попов, А.А. Артюков, О.Н. Кривошапко / Российский Аллергологический Журнал. - 2010. - № 5. - С. 228-230. 118. Попов, А.М. Механизмы протективной фармакологической активности флавоноидов / А.М. Попов, О.Н. Кривошапко, А.А. Биофармацевтический журнал. - 2012. - Т. 4. № 4. - С. 27 - 41. Артюков // 235 119. Порядин, Г.В. Молекулярные и клеточные механизмы иммунопатологии / Г.В. Порядин - М., 2008. - 48 с. 120. Предклинические испытания безопасности йодантипирина / А.С. Саратиков [и др.] // Эксперим. клинич. фармакология. - 1998. - № 61. - С. 57 126. 121. Предпосылки для разработки новой тактики терапии при клещевом энцефалите у детей и её практическая эффективность / Н.В. Скрипченко [и др.] // Нейроиммунология. – 2005. – Т. 3, № 2. – С. 158-159. 122. Приложение к приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных». 123. Применение препарата Реаферон-ЕС-Липинт для лечения клещевого энцефалита / Н.Н. Воробьева [и др.] // Поликлиника. - 2011. - № 2. - С. 84 - 90. 124. Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека. Пособие для врачей-лаборантов / Б.В. Пинегин [и др.] // М., 2001. - 55 с. 125. Применение тинростима для коррекции нарушений иммунитета и гемостаза в комплексном лечении пациентов с хронической обструктивной болезнью легких / Т.А. Кузнецова [и др.] // Пульмонология. - 2010. - №1. С.106-109. 126. Противовирусная активность in vitro лекарственных препаратов в отношении возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом / С.Я. Логинова [и др.] // Вопр. вирусол. - 2007. - № 4. - С. 34 - 36. 127. Противовоспалительные и иммуномодулирующие свойства препарата «Люромарин» при окислительном стрессе / А.М. Попов [и др.] // Мед. иммунология. - 2009. - Т. 11. № 4-5. - С. 331-332. 128. Протопопова, Е.В. Выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи анти-идиотипических антител / Е.В. Протопопова, С.Н. Коновалова, В.Б. Локтев // Вопр. вирусол. - 1997. - №2, - С. 264 - 268. 236 129. Ратникова, Л.И. Современные представления о патогенезе клещевого энцефалита / Л.И. Ратникова, Л.В. Тер-Багдасарян, И.Л. Миронов // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2002. - №5. - С.41-45. 130. Ратникова, Л.И. Циклоферон в комплексном лечении больных с лихорадочной и менингеальной формами клещевого энцефалита / Л.И. Ратникова, И.В. Ермакова, И.Л. Миронов // Российский мед. журнал. - 2004. - № 6. - С.16-18. 131. Ридостин в лечении острых форм клещевого энцефалита / Н.Н. Носик [и др.] // «Человек и лекарство»: Российский нац. конгресс: Тез. докл. М.,1997. C. 281. 132. Романенко, В.В. Эффективность вакцинопрофилактики клещевого энцефалита в Свердловской области / В.В. Романенко, М.С. Есюнина, А.С. Килячина // Дезинфекционное дело. - 2007. - №1. - С. 51 - 52. 133. Романцов, М.Г. Иммуномодуляторы с противовирусной активностью: опыт применения метилглюкамина акридонацетата в педиатрической практике / М.Г. Романцов, О.Г. Шульдякова, А.Л. Коваленко // Фундаментальные исследования. - 2004. - № 1. - С. 29 - 33. 134. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.У. Хабриев. – 2 изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2005. – 832 с. 135. Санитарно–эпидемиологические правила СП 3.1.3.2352-08 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита». М. 2008. 136. Саратиков, А.С. Противовоспалительные средства группы пиразола (фармакология и клиническое применение) / А.С. Саратиков, Т.П. Прищеп, В.Е. Яворовская // Томск. 1975. – 128 с. 137. Саратиков, А.С. Клиническая эффективность йодантипирина при лихорадочной форме клещевого энцефалита / А.С. Саратиков, Е.В. Портнягина // Эпидемиология инфек. болезней. - 2000. - №1. - С. 43 - 46. 237 138. Сенников, С.В., Силков А.Н., Козлов В.А. Аллельные варианты и изоформы цитокинов в диагностике и патогенезе иммунопатологических состояний / С.В. Сенников, А.Н. Силков, В.А. Козлов // Иммунология. - 2002. №4. - С. 243 - 250. 139. Сепиашвили, Р.И. Физиологические основы функционирования новой субпопуляции лимфоцитов – ЕКТ / Р.И. Сепиашвили, И.П. Балмасова // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т.6. №1. - С. 14 - 22. 140. Сергеев, О.В. Рецепторные взаимодействия вируса и клетки как начальный этап инфицирования / О.В. Сергеев // Вопр. вирусол. - 2011. - № 4. С. 4 - 8. 141. Сибирский и дальневосточный подтипы вируса клещевого энцефалита в европейских и азиатских регионах России: генетическая и антигенная характеристика штаммов / В.В. Погодина [и др.] // Вопр. вирусол. - 2004. - № 4. - С. 20-25. 142. Синтетический пептид на основе АФП способен нормализовать активационные процессы в лимфоцитах больных ревматоидным артритом / А.А. Терентьев [и др.] // Материалы XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», М., 2010. – С. 125. 143. Скрининг-тест для оценки патогенных свойств иммунных комплексов / П.В. Стручков [и др.] // Лаб. дело. – 1985. - № 7. – С. 410 144. Скрипченко Н.В. Предпосылки для разработки новой тактики терапии при клещевом энцефалите у детей и её практическая эффективность / Н.В. Скрипченко [и др.] // Нейроиммунология. – 2005. – Т. 3, № 2. – С. 158 - 159. 145. Скрипченко Н. В. Клещевые инфекции у детей. Руководство для врачей / Н.В. Скрипченко, Г.П. Иванова. - М.: Медицина, 2008. – 424 с. 146. Смородинцев, А.А. Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика / А.А. Смородинцев, А.В. Дубов - Л.: Медицина, 1986. - 228 с. 147. Справочник по лабораторным методам исследования/ под ред. Л. А. Даниловой. - СПб.: Питер, 2003. - 736 с. 238 148. Теплый, В.К. Значение лейкоцитарного индекса интоксикации в оценке лечения гнойных заболеваний / В.К. Теплый, Ю.Ю. Супрун // Врачебное дело. 1983. - № 7. - С. 59 - 60. 149. Тер-Багдасарян, Л.В. Прогностическое значение иммунологических показателей в ранней дифференциальной диагностике клинических форм клещевого энцефалита: автореф. дис…канд. мед. наук: 14.00.36, 14.00.10 / Л.В. Тер-Багдасарян. - Челябинск, 2002. - 22с. 150. Удинцева, И.Н. Клинико-иммунологические проявления лихорадочной и стертой форм клещевого энцефалита в различные периоды заболевания: автореф. дисс…канд. мед. наук: 14.00.11 / И.Н. Удинцева. – Томск, 2010. 36 с. 151. Фрейдлин, И.С. Иммунные комплексы и цитокины / И.С. Фрейдлин, С.А. Кузнецова // Мед. иммунология. – 1999. - Т1. № 1-2. – С. 27 - 36. 152. Фрейдлин, И.С. Регуляторные функции провоспалительных цитокинов и острофазных белков / И.С. Фрейдлин, П.Г. Назаров // Вестник РАМН. - 1999. - № 5. - С. 28 - 32. 153. Фрейдлин, И.С. Клетки иммунной системы / И.С. Фрейдлин, А.А. Тотолян - СПб: Наука, 2001. - 390 с. 154. Фрейдлин, И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции / И.С. Фрейдлин // Иммунология. - 2001. - № 5. - С. 4 - 8. 155. Хаитов, Р.М. Современные иммуномодуляторы. Классификация. Механизм действия / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин - М.: Фармарус Принт, 2005. 27с. 156. Хаитов, Р.М. Аллергология и иммунология: национальное руководство / Р.М. Хаитов, Н.И. Ильина - М.: ГЭОТАР - Медиа, 2009. - 656 с. 157. Хайдуков, С.В. Идентификация NK-клеток Многоцветный цитометрический анализ. / С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка // Рос. иммунологический журнал. – 2008. – Т.2(11). №1. - С. 20 – 30. 158. Хайдуков, С.В. Многоцветный цитометрический анализ. Идентификация Т-клеток и их субпопуляций по экспрессии αβ-TCR и γδ-TCR / 239 С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка, В.А. Черешнев // Медицинская иммунология. – 2008. - №10(2-3). - C. 115 - 124. 159. Характеристика С-концевой части гликопротеина Е вируса Западного Нила и оценка силы его взаимодействия с αvβ3 интегрином как с предполагаемым клеточным рецептором / М.В. Богачек [и др.] // Биохимия. 2010. - Т.75. № 4. - С. 571 -581. 160. Хейфиц, Л.Б. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл / Л.Б. Хейфиц, В.А. Абалкин //Лаб. дело. - 1973. - № 10. - С. 579 - 581. 161. Циклоферон. Клиническая фармакология и терапия: Руководство для врачей / Ф.И. Ершов, А.Л. Коваленко, М.Г. Романцов, С.Ю. Голубев - М.-СПб: Полисан, 1998. - 109 с. 162. Черешнев, В.А. Иммунология воспаления: роль цитокинов / В.А. Черешнев, Е.Ю. Гусев // Медицинская иммунология. - 2001. - № 3. - С. 361 368. 163. Черницына, Л.О. Гуморальный иммунный ответ к структурным и неструктурным белкам вируса клещевого энцефалита в динамике заболевания: клинические и диагностические аспекты / Л.О. Черницына, А.С. Караванов // Вопр. вирусологии. - 2008. - №4. - С. 27-30. 164. Черницына Л.О. Необходимость использования данных иммунологического и иммуногенетического обследования больных клещевым энцефалитом для совершенствования тактики их лечения биологически активными препаратами этиотропного действия в остром периоде болезни / Л.О. Черницына, А.П. Иерусалимский, В.И. Коненков // Вестник Уральской государственной медицинской академии. - Екатеринбург, 2010. С. 161-168. 165. Шаповал, А.Н. Клещевой энцефаломиелит / А.Н. Шаповал - Л.: Медицина, 1980. - 253 с. 240 166. Щегловитова, О.Н. Спектр цитокинов, продуцируемых лейкоцитами крови при инфекции вирусом простого герпеса типа I / О.Н. Щегловитова, Е.В. Максянина // Вопр. вирусол. - 2004. - № 4. - С. 39 -43. 167. Эволюция клещевого энцефалита и проблема эволюции возбудителя / В.В. Погодина [и др.] // Вопр. вирусол. - 2007. - № 5. - С. 16-21. 168. Экспериментальная и клинико-лабораторная оценка эффективности комплексной терапии арбовирусных заболеваний / М.Г. Романцов [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. - 2012. - № 7-8. - С. 12 - 22. 169. Экспериментальное исследование феномена антителозависимого усиления инфекционности вируса клещевого энцефалита in vitro / С.В. Ожерелков [и др.] // ЖМЭИ. - 2008. - № 6. - С. 39 - 43. 170. Экспериментальное обоснование вариабельности клинико- морфологических проявлений клещевого энцефалита / Л.М. Исачкова [и др.] // Тихоокеанский мед. журнал. - 2001. - № 2. - С.88-91. 171. Эффективность индукторов интерферона ридостина и камедона в профилактике и лечении экспериментальных α- и флавивирусных инфекций / И.Ф. Баринский [и др.] // Вопр. вирусологии. - 1996. - № 3. - С. 133 - 135. 172. Яковлев, В.П. Рациональная антимикробная фармакотерапия / В.П. Яковлев, С.В. Яковлев - М.: Литтерра, 2003. - 1004 с. 173. Ярилин, А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии / А.А. Ярилин // Иммунология. - 1997. - № 5. - С. 7 - 14. 174. Ярилин, А.А. Иммунология / А.А. Ярилин - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 с. 175. Ястребов, В.К. Трансмиссивные клещевые природно-очаговые инфекции в Российской Федерации: тенденции эпидемического процесса, актуальные вопросы профилактики /В.К. Ястребов, Н.В. Рудаков, С.Н. Шпынов // Сибирский мед. журнал. – 2012. - №4. – С. 91-93. 241 176. A combination of genetic polymorphisms increases the risk of progressive disease in chronic hepatitis С / M.M. Richardson [et al.] // J. Med. Genet. - 2006. Vol. 42, № 7. - P. 45 - 57. 177. A detrimental role for invariant natural killer T cells in the pathogenesis of experimental dengue virus infection / J. Renneson [et al.] // Am. J. Pathol. - 2011. Vol.179 (4). - P. 1872 - 1883. 178. A Japanese encephalitis virus vaccine candidate strain is attenuated by decreasing its interferon antagonistic ability / J.J. Liang [et al.] // Vaccine. - 2009. Vol. 27(21). - P. 2746 - 2754. 179. A method for studying insoluble immune complexes / B.N. Khlebtsov [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. - V. 1670. - P. 199 - 207. 180. A paradoxical role for neutrophils in the pathogenesis of West Nile virus / F. Bai [et al.] // J. Infect. Dis. - 2010. - V. 202. - P. 1804 - 1812. 181. A single amino acid substitution in envelope protein E of tick-borne encephalitis virus leads to attenuation in the mouse model / H. Holzmann [et al.] // J. Virol. – 1990. – Vol. 64. P. 5156 – 5159. 182. A single radial-diffusion method for the immunological quantization of protein / G. Manchini [et al.] // Procides of the biological fluids (N. Peeters, ed.). – Amsterdam; N.Y.: Elsevier, 1964. – P. 370-379. 183. A subset of Toll-like receptor ligands induces cross-presentation by bone marrow-derived dendritic cells / S.K. Datta [et al.] // J. Immunol. - 2003. - Vol. 170(8). - P. 4102 - 4110. 184. Abbott, N.J. Inflammatory mediators and modulation of blood-brain barrier permeability / N.J. Abbott // Cell Mol. Neurobiol. - 2000. - Vol. 20. -P. 131 – 147. 185. Ackerman, A.L. Cellular mechanisms governing cross-presentation of exogenous antigens / A.L. Ackerman, P. Cresswell // Nat. Immunol. - 2004. - Vol.5. P. 678 - 684. 186. Activation of the cytokine network and unfavorable outcome in patients with yellow fever / J. Meulen [et al.] // J. Infect. Dis. - 2004. - № 190. - P. 1821 -1827. 242 187. Activation, coactivation, and costimulation of resting human natural killer cells / Y.T. Bryceson [et al.] // Immunol. Rev. - 2006. - Vol. 214. - P. 73 -91. 188. Adaptation of Tick-Borne encephalitis virus to BHK-21 cells results in the formation of multiple heparan sulfate binding sites in the envelope protein and attenuation in vivo / C.W. Mandl [et al.] // J. Virol. - 2001. - Vol. 75(1). - P. 5627 5637. 189. Ahmad, A. Role of NK and NKT cells in the immunopathogenesis of HCVinduced hepatitis / A. Ahmad, F. Alvarez // J. Leukoc. Biol. - 2004. - Vol.76 (4). - P. 743 - 759. 190. Akira S. Pathogen recognition and innate immunity / S. Akira, S. Uematsu, O. Takeuchi // Cell. - 2006. - Vol. 124(4). - P. 783-801. 191. Alpha/beta interferon protects adult mice from fatal Sindbis virus infection and is an important determinant of cell and tissue tropism / K.D. Ryman [et al.] // J. Virol. - 2000. - Vol. 74. - P. 3366 – 3378. 192. Altered effector functions of virus-specific and virus cross-reactive CD8+ T cells in mice immunized with related flaviviruses / D.W. Trobaugh [et al.] // European J. Immunology. - 2010. – Vol. 40. – P. 1315 - 1327. 193. Alternative complement pathway deregulation is correlated with dengue severity / E.J.M. Nascimento [et al.] // PLoS ONE. - 2009. – Vol. 4. № 8. - e6782. 194. Aluminum hydroxide adjuvant induces macrophage differentiation towards a specialized antigenpresenting cell type / A.C. Rimaniol [et al.] // Vaccine - 2004. – Vol. 22. – P. 3127 – 3135. 195. Anderson, J.F. Efficacy of interferon alpha-2b and ribavirin against West Nile virus in vitro / J.F. Anderson, J.J. Rahal // Emerg. Infect. Dis. - 2002. - Vol. 8 (1). - P. 107 - 108. 196. Anderson, R. Manipulation of cell surface macromolecules by flaviviruses / R. Anderson // Advances in Virus Research. - 2003. - Vol.59. - P. 229 - 274. 243 197. Antibodies against West Nile Virus nonstructural protein NS1 prevent lethal infection through Fc gamma receptor-dependent and -independent mechanisms / K.M. Chung [et al.] // J. Virol. - 2006. - Vol. 80. - P. 1340 – 1351. 198. Antiherpes effect of Melissa officinalis L. extracts / Z. Dimitrova [et al.] // Acta Microbiol. Bulg. – 1993. Vol. 29. – P. 65 - 72. 199. Anti-inflammatory activity of structurally related flavonoids, Apigenin, Luteolin and Fisetin / M. Funakoshi-Tagoa [et al.] // International Immunopharmacology. - 2011. - Vol. 11. - P. 1150 – 1159. 200. Antiviral and anti-inflammatory effects of rosmarinic acid in an experimental murine model of Japanese encephalitis / J. Ghosh [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2007. – Vol. 51. № 9. – P. 3367 - 3370. 201. Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargotriggered, vesicular transporters / A. Tagawa [et al.] // J. Cell Biol. - 2005. Vol. 170. - P. 769 - 779. 202. Association of TNF-beta polymorphism with disease severity among patients infected with hepatitis С virus / A. Goyal [et al.] // J. Med. Virol. -2004. - Vol. 72, № 1. - P. 60 - 65. 203. Atrasheuskaya, A.V. Changes in immune parameters and their correction in human cases of tick-borne encephalitis / A.V. Atrasheuskaya, T.M. Fredeking, G.M. Ignatyev // Clin. Exp. Immunol. - 2003. - Vol.131. – P. 148–154. 204. Avirutnan, P. Complement and its role in protection and pathogenesis of flavivirus infections / P. Avirutnan, E. Mehlhop, M.S. Diamond // Vaccine. - 2008. - Vol. 26(8). - P. 1100 - 1107. 205. B cells and antibody play critical roles in the immediate defense of disseminated infection by West Nile encephalitis virus / M.S. Diamond [et al.] // J. Virol. - 2003. - Vol. 77. - P. 2578 – 2586. 206. Baier, A. Flaviviral infections and potential targets for antiviral therapy / A. Baier // In D. Ruzek (ed.) «Flavivirus encephalitis». Published by In Tech. - 2011. P. 89 - 105. 244 207. Barrett, A.D.T. Yellow fever vaccine - how does it work and why do rare cases of serious adverse events take place? / A.D.T. Barrett, D. Teuwen // Curr. Opin. Immunol. - 2009. - Vol. 21. - P. 1 – 6. 208. Basta, S. The cross-priming pathway: a portrait of an intricate immune system / S. Basta, A. Alatery // Scand. J. Immunol. - 2007. - Vol. 65(4). - P. 311 - 319. 209. Beasley, D.W. Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein / D.W. Beasley, A.D. Barrett // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P. 13097 – 13100. 210. Becchetti, A. Integrins and ion channels in cell migration: implications for neuronal development, wound healing and metastatic spread / A. Becchetti, A. Arcangeli // Advances in experimental medicine and biology. - 2010. - Vol. 674. - P. 107 - 123. 211. Bendelac, A. The biology of NKT cells / A. Bendelac, P.B. Savage, L. Teyton // Annu. Rev. Immunol. - 2007. - Vol. 25. - P. 297 – 336. 212. Beta integrin mediates internalization of mammalian reovirus / M.S. Maginnis [et al.] // J. Virol. - 2006. - Vol. 80 № 6. - P. 2760 - 2770. 213. Bhakdi, S. Pathogenesis of dengue: an alternative hypothesis / S. Bhakdi, M.D. Kazatchkine // Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. - 1990. - Vol. 21. №4. P. 652 – 657. 214. Blocking of the alpha interferon-induced Jak-Stat signaling pathway by Japanese encephalitis virus infection / R.J. Lin [et al.] // J. Virology. - 2004. - Vol. 78. - P. 9285 - 9294. 215. Bone, R.C. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS / R.C. Bone // Crit. Care. Med. - 1996. - Vol. 24. - P. 1125 - 1129. 216. Borden, E.C. Interferon-stimulated genes and their protein products: what and how? / E.C. Borden, B.R. Williams // J. of Interferon & Cytokine Res. - 2011. - Vol. 31. № 1. - P. 1 - 4. 245 217. Breakdown of the blood-brain barrier during tick-borne encephalitis in mice is not dependent on CD8+T-cells / D. Ruzek [et al.] // PLoS ONE. – 2011. Vol. 6(5). e20472. 218. Broad specificity of virus-specific СD4+T-helper-cell responses in resolved hepatitis C virus infection / C.L. Day [et al.] // J. Virol. - 2002. -Vol. 76 (24). - P. 12584 - 12595. 219. Brooks, T. J. Interferon-alpha protects mice against lethal infection with St. Louis encephalitis virus delivered by the aerosol and subcutaneous routes / T. J. Brooks, R.J. Phillpotts // Antiviral Res. - 1999. - Vol. 41. - P. 57 – 64. 220. Calgary experience with West Nile virus neurological syndrome during the late summer of 2003 / A.L. Sayao [et al.] // Can. J. Neurol. Sci. - 2004. - Vol. 31. - P. 194 – 203. 221. Cardosa, M.J. Complement receptor mediates enhanced Flavivirus replication in macrophages / M.J. Cardosa, J.S. Porterfield, S. Gordon // J. Exp. Med. - 1983. Vol. 158. - P. 258 - 263. 222. Carroll, M.C. The complement system in regulation of adaptive immunity / M.C. Carroll // Nat. Immunol. - 2004. - Vol. 5. - P. 981 - 986. 223. CD4+T cell-derived IL-2 signals during early priming advances primary CD8+T cell responses / Y.P. Lai [et al.] // PLoS ONE. - 2009. - Vol. 4. № 11. e7766. 224. CD69 expression as an index of T-cell function: assay standardization, validation and use in monitoring immune recovery / W. Lindsey [et al.] // Cytotherapy. - 2007. - Vol. 9. № 2. - P. 123 - 132. 225. CD8+T-cells mediate immunopathology in tick-borne encephalitis / D. Ruzek [et al.] // Virology. - 2009. - Vol. 384. - P. 1 – 6. 226. Cecilia, D. Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutralization-resistant mutants / D. Cecilia, E.A. Gould // Virology. - 1991. - Vol. 181. - P. 70 –77. 246 227. Changes in hypervariable region 1 of the envelope 2 glycoprotein of hepatitis C virus in children and adults with humoral immune defects / U. Gaud [et al.] // J. Med. Virol. - 2003. - Vol. 69. - P. 350 – 356. 228. Characterization of antibody responses to combinations of a dengue virus type 2 DNA vaccine and two dengue virus type 2 protein vaccines in rhesus macaques / M. Simmons [et al.] // J. Virol. - 2006. - Vol. 80. - № 19. - P. 9577-9585. 229. Characterization of neutralizing antibodies to Far Eastern of tick–borne encephalitis virus subtype and the antibody avidity for four tick–borne encephalitis vaccines in human / G.N. Leonova [et al.] // Vaccine. - 2009. - Vol. 27. - P. 2899 – 2904. 230. Characterization of Siberian virus isolated from a patient with progressive chronic tick-borne encephalitis / T.S. Gritsun [et al.] // J. Virol. - 2003. Vol. 77. – P. 25–36. 231. Chaturvedi, U.C. Macrophage & dengue virus: Friend or foe? / U.C. Chaturvedi, R. Nagar, R. Shrivastava // Indian J. Med. Res. - 2006. - Vol. 124. - P. 492 - 498. 232. Chen, Y.C. Bacterial lipopolysaccharide inhibits DEN infection of primary human monocytes/macrophages by blockade of virus entry via a CD14-dependent mechanism / Y.C. Chen, S.Y. Wang, C.C. King // J. Virol. - 1999. - Vol. 73. - P. 2650 - 2657. 233. Chen, Y.C. Activation of terminally differentiated human monocytes/macrophages by dengue virus: productive infection, hierarchical production of innate cytokines and chemokines, and the synergistic effect of lipopolysaccharide / Y.C. Chen, S.Y. Wang // J. Virol. - 2002. - Vol. 76, № 19. - P. 9877 - 9887. 234. Chu, J.J.H. Infectious entry of West Nile Virus occurs through clathrin- mediated endocytic pathway / J.J.H. Chu, M.L. Ng // J. Virol. - 2004. Vol. 78. №19. P. 10543 - 10555. 247 235. Cleavage of protein prM is necessary for infection of BHK-21 cells by tick- borne encephalitis virus / S. Elshuber [et al.] // J. Gen. Virol. - 2003. - Vol. 84. Pt. 1. P. 183–191. 236. Clemens, M. J. Translational control in virus-infected cells: models for cellular stress responses / M. J. Clemens // Semin. Cell Dev. Biol. - 2005. - Vol. 16. - P. 13 20. 237. Clinical evaluation of highly pathogenic tick-borne flavivirus infection in the mouse model / B. Tigabu [et al.] // J. Med. Virol. – 2009. - Vol.81. – P. 1261–1269. 238. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function / M. Reddy [et al.] // Immunol. Methods. - 2004. - Vol. 293. - P. 127 - 142. 239. Complement activation is required for induction of a protective antibody response against West Nile virus infection / E. Mehlhop [et al.] // J. Virol. - 2005. Vol. 79(12). - P. 7466 – 7477. 240. Complement protein C1q inhibits antibody-dependent enhancement of flavivirus infection in an IgG subclass-specific manner / E. Mehlhop [et al.] // Cell Host Microbe. - 2007. - Vol. 2. - P. 417 – 426. 241. Complement-mediated neutralization of dengue virus requires mannosebinding lectin / P. Avirutnan [et al.] // mbio. asm. org. – 2011. – Vol. 2. - e00276-11. 242. Control of PKR protein kinase by hepatitis C virus nonstructural 5A protein: molecular mechanisms of kinase regulation / M. Gale [et al.] // Mol. Cell. Biol. 1998. - Vol. 18. P. 5208 – 5218. 243. Crill, W. D. Monoclonal antibodies that bind to domain III of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vero cells / W. D. Crill, J. T. Roehrig // J. Virol. - 2001. - Vol. 75. - P. 7769 - 7773. 244. Cytokine cascade in dengue hemorrhagic fever: implications for pathogenesis / U.C. Chaturvedi [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2000. - Vol. 28. - P. 183 - 188. 248 245. De Clercq, E. Interferon and its inducers - a never-ending story: “old” and “new” data in a new perspective / E. De Clercq // J. Infec. Dis. - 2006. - P. 19 - 26. 246. Decrease of CD56+T cells and natural killer cells in cirrhotic livers with hepatitis C may be involved in their susceptibility to hepatocellular carcinoma / N. Kawarabayashi [et al.] // Hepatology. - 2000. - Vol. 32 (5). - P. 962 - 969. 247. Definition of an epitope on Japanese encephalitis virus (JEV) envelope protein recognized by JEV specific murine CD8+ cytotoxic T lymphocytes / K. Takada [et al.] //Archives of Virology. - 2000. – Vol. 145. - P. 523-534. 248. Degradation of Japanese encephalitis virus by neutrophils / S. Srivastava [et al.] // Int. J. Exp. Path. - 1999. - Vol. 80. - P. 17 - 24. 249. Del Giudice, G. Molecular basis of vaccination / G. Del Giudice, M. Pizza, R. Rappuoli // Mol. Aspects Med. - 1998. - Vol. 19(1). - P. 1 - 70. 250. Demicheli, V. Vaccines for preventing tick–borne encephalitis / V. Demicheli, M.G. Debalini, A. Rivetti // Cochrane Database of Systematic Reviews. - 2009. - (1). - CD000977. 251. Dengue virus type 2 antagonizes IFN-alpha but not IFN-gamma antiviral effect via down-regulating Tyk2-STAT signaling in the human dendritic cell / L.J. Ho [et al.] // J. Immunol. - 2005. - Vol. 174. - P. 8163 - 8172. 252. Diamond, M.S. West Nile virus: crossing the blood-brain barrier / M.S. Diamond, R.S. Klein // Nat. Med. – 2004. - Vol.10. – P. 1294–1295. 253. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses / M. S. Diamond // J. Interferon Cytokine Res. - 2009. - Vol. 29. P. 521 – 530. 254. Dienstag, J.L. American Gastroenterological Association medical position statement on the management of hepatitis C / J.L. Dienstag, J.G. McHutchison // Gastroenterology. - 2006. - Vol. 130. - P. 225 - 230. 255. Different chemokine expression in lethal and non-lethal murine West Nile virus infection / K. Shirato [et al.] // J. Med. Virol. – 2004. – Vol. 74. P. 507 - 513. 249 256. Differential proinflammatory and angiogenesis-specific cytokine production in human pulmonary endothelial cells, HPMEC-ST1.6R infected with dengue-2 and dengue-3 virus / A. Azizan [et al.] // J. Virol. Methods. - 2006. - Vol. 138, № 1-2. - P. 211 - 217. 257. Differential regulation of innate and adaptive immune responses in viral encephalitis / J.D. Rempel [et al.] // Virology. - 2004. - V. 5. - P. 381 – 392. 258. Direct recognition of cytomegalovirus by activating and inhibitory NK cell receptors / H. Arase [et al.] // Science. - 2002. - Vol. 296. - P. 1323 - 1326. 259. Direct stimulation of cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, IL-6, IL-2, IFN-gamma and GM-CSF) in whole blood. I. Comparison with isolated PBMC stimulation / D. De Groote [et al.] // Cytokine. – 1992. – Vol. 4. №3. – P. 239 - 248. 260. Dixit, N.M. The metabolism, pharmacokinetics and mechanisms of antiviral activity of ribavirin against hepatitis C virus / N.M. Dixit, A.S. Perelson // Cell Mol. Life Sei. - 2006. - Vol. 63. - P. 832 - 842. 261. Does Japanese encephalitis virus share the same cellular receptor with other mosquito-borne flaviviruses on C6/36 mosquito cells / J. Ren [et al.] // J. Virol. 2007. - Vol.83. № 4. - P. 1743 - 1750. 262. Donoso Mantke, O. A survey on cases of tick-borne encephalitis in European countries / O. Donoso Mantke, R. Schadler, M. Niedrig // Euro Surveill. – 2008. - 13, 18848. 263. Dowd, K.A. Antibody-mediated neutralization of flaviviruses: A reductionist view / K.A. Dowd, T.C. Pierson // Virology. - 2011. - Vol. 411. - P. 306 – 315. 264. Dusheiko, G. Optimization of antiviral therapy - role of ribavirin / G. Dusheiko, D. Nelson, K. Reddy // Antiviral Therapy. - 2008. - Vol. 13 (suppl. 1). - P. 23 - 30. 265. Early CD69 expression on peripheral blood lymphocytes from children with dengue hemorrhagic fever / S. Green [et al.] // J. Infect. Dis. - 1999. - Vol. 180. - P. 1429 - 1435. 250 266. Effect of interferon-alpha and interferon-inducers on West Nile virus in mouse and hamster animal models / J.D. Morrey [et al.] // Antiviral Chemistry and Chemotherapy. - 2004. - Vol. 15. - P. 67 - 75. 267. Effect of interferon-α2b therapy on St. Louis viral meningoencephalitis: clinical and laboratory results of a pilot study / J.J. Rahal [et al.] // J. Infect. Dis. 2004. - Vol.190. - P. 1084 – 1087. 268. Effects of a water-soluble extract of rosemary and its purified component rosmarinic acid on xenobiotic-metabolizing enzymes in rat liver / P. Debersac [et al.] // Food Chem. Toxicol. – 2001. – Vol. 39. № 2. P. 109 - 117. 269. Enlers, S. Shaping adaptive immunity against pathogens: the contribution of innate immune responses / S. Enlers, S. Bulfone-Paus // Novel Vaccination Strategies. Ed.by S.H. Kaufmann. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co, 2004. - P. 19-50. 270. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes Strasbourg, 18.III.1986. – URL: http://conventions.coe.int/Treaty/en/Treaties/Html/123.htm. 271. Farag, S.S. Human natural killer cell development and biology / S.S. Farag, M.A. Caligiuri // Blood Rev. – 2006. – Vol. 20. P. 123–137. 272. Feldmann, M. Cytokines and disease / M. Feldmann, F.M. Brennan // In: «Cytokine Reference Book» J. Oppenheim [et al.] (Eds). - 2004. - Vol. 1. - P. 35 51. 273. Field effectiveness of vaccination against tick–borne encephalitis / F.X. Heinz [et al.] // Vaccine. - 2007. - Vol. 25. - P. 7559 – 7567. 274. Flavivirus cell entry and membrane fusion / J.M. Smit [et al.] // Viruses. 2011. - Vol. 3. № 2. - P. 160 – 171. 275. Flavivirus genome organization, expression, and replication / T.J. Chambers [et al.] // Annu. Rev. Microbiol. - 1990. - Vol. 44. - P. 649–688. 276. Flavonoids, vascular function and cardiovascular protection / D. Grassi [et al.] // Curr Pharm Des. - 2009. - Vol. 15. - P. 1072 – 1084. 251 277. Formation of membrane-defined compartments by tick-borne encephalitis virus contributes to the early delay in interferon signaling / L. Miorin [et al.] // Virus Res. 2012. - Vol. 163. - P. 660 - 666. 278. Fredericksen, B. L. West Nile virus evades activation of interferon regulatory factor 3 through RIG-I-dependent and –independent pathways without antagonizing host defense signaling / B. L. Fredericksen, M. Gale // J. Virol. - 2006. – Vol. 80. – P. 2913 – 2923. 279. Functional significance of the activation-associated receptor CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells / J. Clausen [et al.] // Immunobiology. 2003. - V.207, № 2. - P. 85 - 93. 280. GAG-binding variants of tick-borne encephalitis virus / L.I. Kozlovskaya [et al.] // Virology. - 2010. - Vol. 398. - P. 262 - 272. 281. Ghosh D. Present perspectives on flaviviral chemotherapy / D. Ghosh, A. Basu // Drug Discovery Today. - 2008. - Vol. 13. № 13/14. - P. 619 - 624. 282. Gish, R.G. Treating HCV with ribavirin analogues and ribavirin-like molecules / R.G. Gish // J. Antimicrob. Chemother. - 2006. - Vol. 57. - P. 8 – 13. 283. Godfrey, D.I. Going both ways: immune regulation via CD1d-dependent NKT cells / D.I. Godfrey, M. Kronenberg // J. Clinic. Investigation. - 2004. - Vol. 114(10). - P. 1379 - 1388. 284. Gould, E.A. Antibody-dependent enhancement of yellow fever and Japanese encephalitis virus neurovirulence / E.A. Gould, A. Buckley // J. Gen. Virol. - 1989. Vol. 70(6). - P. 1605 - 1608. 285. Greber, U.F. Signaling in viral entry / U.F. Greber // Cell. Mol. Life Sci. 2002. - Vol. 59. - P. 608 – 626. 286. Gritsun, T.S. Tick-borne encephalitis / T.S. Gritsun, V.A. Lashkevich, E.A. Gould // Antiviral Res. – 2003. – Vol. 57. – P. 129–146. 287. Groscurth, P. Killing mechanisms of cytotoxic T- lymphocytes / P. Groscurth, L. Filgueira // Physiology. - 1998. - Vol. 13. №1. - P. 17 - 21. 252 288. Guo, J.T. West Nile virus inhibits the signal transduction pathway of alpha interferon / J.T. Guo, J. Hayashi, C. Seeger // J. Virology. - 2005. - Vol. 79. - P. 1343 – 1350. 289. Guzman, M.G. The complexity of antibody-dependent enhancement of dengue virus infection / M.G. Guzman, S. Vazquez // Viruses. - 2010. - Vol. 2. № 12. - P. 2649 - 2662. 290. Haakenstad, A.O. The disappearance kinetics and glomerular deposition of small-latticed soluble complexes / A.O. Haakenstad, G. E. Striker, M. Mannik // Immunology. - 1982. - V. 47. - P. 407 - 414. 291. Haefner, B. Drugs from the deep: marine natural products as drug candidates / B. Haefner // Drug. Discov. Today. - 2003. - Vol. 8. № 12. - P. 536 - 544. 292. Haglund, M. Tick-borne encephalitis – pathogenesis, clinical course and long-term follow-up / M. Haglund, G. Gunther // Vaccine. – 2003. - Vol. 21 (Suppl. 1). – P. 11-18. 293. Haller, O. Interferon, Mx, and viral countermeasures / O. Haller, G. Kochs, F. Weber // Cytokine Growth Factor Rev. - 2007. - Vol.18. - P. 425 - 433. 294. Haller, O. Interferon-induced Mx proteins in antiviral host defense / O. Haller, P. Staeheli, G. Kochs // Biochimie. - 2007. -Vol. 89. - P. 812 - 818. 295. Halstead, S.B. Dengue viruses and mononuclear phagocytes: II. Identity of blood and tissue leukocytes supporting in vitro infection / S.B. Halstead, E.J. O'Rourke, A.C. Allison // J. Exp. Med. - 1977. - Vol. 146. - P. 218 - 229. 296. Halstead, S.B. Immune enhancement of viral infection / S.B. Halstead // Prog. Allergy. - 1982. - Vol. 31. - P. 301 - 364. 297. Hangartner, L. Antiviral antibody responses: the two extremes of a wide spectrum / L. Hangartner, R. M. Zinkernagel, H. Hangartner // Nature Reviews Immunology. - 2006. - Vol. 6. - P. 231 - 243. 298. Harty, J. T. Influence of effector molecules on the CD8+ T cell response to infection / J.T. Harty, V.P. Badovinac. // Curr. Opin. Immunol. - 2002. – Vol. 14. – P. 360-365. 253 299. Heinz, F.X. Epitope mapping of flavivirus glycoproteins / F.X. Heinz // Adv. Virus Res. - 1986. - Vol.31. - P.103 - 168. 300. Hemolytic anemia induced by ribavirin therapy in patients with chronic hepatitis C virus infection: role of membrane oxidative damage / L. De Franceschi [et al.] // Hepatology. - 2000. - Vol. 31. - P. 997 - 1004. 301. Hepatitis C virus non-structural protein 4 suppresses Th1 responses by stimulating IL-10 production from monocytes / M.T. Brady [et al.] // Eur. J. Immunol. - 2003. - Vol. 33 (12). - P. 3448 - 3457. 302. Herrmann, E.C. Antiviral substances in plants of the mint family (labiatae). II. Nontannin polyphenol of Melissa officinalis / E.C. Herrmann, L.S. Kucera // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1967. – Vol. 124. № 3. – P. 869 - 874. 303. High circulating levels of the dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of dengue hemorrhagic fever / D.H. Libraty [et al.] // J. Infect. Dis. - 2002. - Vol. 186. - P. 1165 – 1168. 304. Hoebe, K. The interface between innate and adaptive immunity / K. Hoebe, E. Janssen, B. Beutler // Nat. Immunol. - 2004. – Vol. 5. – P. 971 – 974. 305. Holzmann, H. Diagnosis of Tick-borne encephalitis / H. Holzmann // Vaccine. – 2003. – Vol. 21 (Suppl. 1). – P. 36 – 40. 306. Huggins, J.W. Prospects for treatment of viral hemorrhagic fevers with ribavirin, a broad-spectrum antiviral drug / J.W. Huggins // Rev. Infect. Dis.- 1989. Vol. 11(Suppl.4). - P. 750 – 761. 307. Human cytotoxic T lymphocyte responses to live attenuated 17D yellow fever vaccine: identification of HLA-B35-restricted CTL epitopes on nonstructural proteins NS1, NS2b, NS3, and the structural protein E / M.D. Co [et al.] // Virology. - 2002. Vol. 293. - P. 151 – 163. 308. Human effector and memory CD8+ T cell responses to smallpox and yellow fever vaccines / J. D. Miller [et al.] // Immunity. - 2008. - Vol. 28. - P. 710 – 722. 254 309. Humoral and cellular immune response to RNA immunization with flavivirus replicons derived from tick-borne encephalitis virus / J.H. Aberle [et al.] // J Virol. 2005. - Vol. 79(24). - P. 15107 - 15113. 310. Humphries, M.J. Integrin structure / M.J. Humphries // Biochemical Society transactions. - 2000. - Vol. 28. - P. 311-339. 311. Hurrelblink, R.J. Attenuation of Murray Valley encephalitis virus by sitedirected mutagenesis of the hinge and putative receptor-binding regions of the envelope protein / R.J. Hurrelblink, P.C. McMinn // J. Virol. - 2001. - Vol.75. - P. 7692 - 7702. 312. Hynes, R.O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines / R.O. Hynes // Cell. - 2002. - Vol. 110. - P. 673 - 687. 313. IFN-γ production by antigen-presenting cells: mechanisms emerge / D. Frucht [et al.] // Trends Immunol. - 2001. - Vol. 22. - P. 556 - 560. 314. IFN-γ production depends on IL-12 and IL-18 combined action and mediates host resistance to dengue virus infection in a nitric oxide-dependent manner / C.T. Fagundes [et al.] // PLoS Negl. Trop. Dis. - 2011. - 5(12): e1449. 315. Immune evasion of natural killer cells by viruses / S. Jonjic [et al.] // Curr. Opin. Immunol. - 2008. - Vol. 20. - P. 30 – 38. 316. Immune responses of mice with different genetic backgrounds to improved multiepitope, multitarget malaria vaccine candidate antigen FALVAC-1A / S. A. Kaba [et al.] // Clin. Vaccine Immunol. – 2008. - Vol. 15. - P. 1674 –1683. 317. Immunity versus immunopathology in West Nile virus induced encephalitis / T. Wang [et al.] // In D. Ruzek (ed.) «Flavivirus encephalitis». Published by In Tech. - 2011. - P. 53-70. 318. Immunomodulatory cytokines determine the outcome of Japanese encephalitis virus infection in mice / S.M. Biswas [et al.] // J. Med. Virol. – 2010. – Vol. 82. – P. 304 – 310. 319. Immunopathology of flavivirus infections / N.J. King [et al.] // Immunol. Cell Biol. - 2007. - Vol. 85. - P. 33 – 42. 255 320. Immunotherapy via dendritic cells / A.K. Palucka [et al.] // Adv. Exp. Med. Biol. - 2005. – Vol. 560. – P. 105 – 114. 321. Impact of protein kinase PKR in cell biology: from antiviral to antiproliferative action / M. A. Garcia [et al.] // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2006. - Vol. 70. - P. 1032 - 1060. 322. Impaired effector function of hepatitis C virus-specific CD8+Tcells in chronic hepatitis C virus infection / H. Wedemeyer [et al.] // J. Immunol. - 2002. - Vol.169. P. 3447 - 3458. 323. Impaired T helper 1 function of nonstructural protein3-specific T cells in Japanese patients with encephalitis with neurological sequelae / P. Kumar [et al.] // J. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 189. - P. 880 - 891. 324. Increased expression of monocyte CD11b (Mac-1) in overweight recent-onset type 1 diabetic children / V Cifarelli [et al.] // Rev. Diabet. Stud. -2007. - Vol. 4, № 2. - P. 113 - 120. 325. Increased natural killer cell cytotoxicity and NKp30 expression protects against hepatitis C virus infection in high-risk individuals and inhibits replication in vitro / L. Golden-Mason [et al.] // Hepatology. - 2010. - Vol.52. - P. 1581 - 1589. 326. Induction of CD69 activation molecule on human neutrophils by GM-CSF, IFN-γ and IFN-α / F. Atzeni [et al.] // Cell Immunol. – 2002. - Vol. 220. P. 20 - 29. 327. Infection and activation of human peripheral blood monocytes by dengue viruses through the mechanism of antibody-dependent enhancement / P. Sun [et al.] // Virology. - 2011. - Vol. 421. № 2. - P. 245 - 252. 328. Inflammatory response in human tick-borne encephalitis: analysis of postmortem brain tissue / E. Gelpi [et al.] // J. Neurovirol. - 2006. - Vol.12. - P. 322 – 327. 329. Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses / J.L. Munoz-Jordan [et al.] // J. Virology. - 2005. - Vol. 79. - P. 8004 8013. 256 330. Inhibition of interferon signaling by the New York 99 Strain and Kunjin subtype of West Nile involves blockage of STAT1 and STAT2 activation by nonstructural proteins / W.J. Liu [et al.] // J. Virology. - 2005. - Vol. 79. - P. 1934 1942. 331. Inhibition of interferon-stimulated JAK-STAT signaling by a tick-borne flavivirus and identification of NS5 as an interferon antagonist / S.M. Best [et al.] // J. Virology. - 2005. - Vol. 79. - P. 12828 - 12839. 332. Innate immune evasion by hepatitis C virus and West Nile virus / B.C. Keller [et al.] // Cytokine Growth Factor Rev. - 2007. – Vol. 18. P. 535 –544. 333. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains / H. Watanabe [et al.] // Shock. - 2004. - Vol. 22, №5. - P. 460 - 466. 334. Interaction of West Nile virus with primary murine macrophages: role of cell activation and receptors for antibody and complement / M.J. Cardosa [et al.] // J. Virol. 1986. - Vol. 57. - P. 952 - 959. 335. Interferon alfa-2a in Japanese encephalitis: a randomized double-blind placebocontrolled trial / T. Solomon [et al.] // Lancet. - 2003. - Vol. 361. - P. 821 – 826. 336. Interferon, ribavirin, 6-azauridine and glycyrrhizin: antiviral compounds active against pathogenic flaviviruses / J.M. Crance [et al.] // Antiviral Res. - 2003. - Vol. 58. - P. 73 – 79. 337. Interferon-dependent immunity is essential for resistance to primary dengue virus infection in mice, whereas T- and B-cell-dependent immunity are less critical / S. Shresta [et al.] // J. Virol. - 2004. - Vol. 78. - P. 2701 – 2710. 338. Interferons, interferon inducers, and interferon-ribavirin in treatment of flavivirus-induced encephalitis in mice / P. Leyssen [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. - 2003. - Vol. 47. - P. 777 – 782. 339. Janeway, J.C.A. Innate immune: recognition / J.C.A. Janeway, R. Medzhitov // Annu. Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 20. - P. 197 - 216. 257 340. Japanese encephalitis virus infection decrease endogenous IL-10 production: correlation with microglial activation and neuronal death / V. Swarup [et al.] // Neuroscience Letters. - 2007. - Vol. 420. - P. 144 - 149. 341. Japanese encephalitis virus: innate and adaptive immunity / S. Abraham [et al.] // In D. Ruzek (ed.) «Flavivirus encephalitis». Published by In Tech. 2011. - P. 339 383. 342. Jeong, E. Intrinsic and extrinsic regulation of innate immune receptors / E. Jeong, J.Y. Lee // Yonsei. Med J. - 2011. - Vol. 52(3). - P. 379 - 392. 343. Johnson, R.T. Acute encephalitis / R.T. Johnson // Clin. Infect. Dis. - 1996. Vol. 23. - P. 219 - 226. 344. Jones, S. Directing transition from innate to acquired immunity: defining a role for IL-6 / S. Jones // J. Immunol. - 2005. - Vol.175. - P. 3463 - 3468. 345. Julander, J.G. Effect of exogenous interferon and an interferon inducer on western equine encephalitis virus disease in a hamster model / J.G. Julander // Virology. - 2007. - Vol. 360(2). - P. 454 – 460. 346. Kalayanarooj S. Early clinical and laboratory indicators of acute Dengue illness / S. Kalayanarooj [et al.] // J. Infect. Dis. - 1997. - Vol.176. - P. 313–321. 347. Kaufmann, B. Molecular mechanisms involved in the early steps of flavivirus cell entry / B. Kaufmann, M.G. Rossmann // Microbes Infect. - 2011. - Vol.13. №1. P. 1 – 9. 348. Kawai, Т. Innate immune recognition of viral infection / Т. Kawai, S. Akira // Nature Immunol. - 2006. - Vol.7. N 2. - P. 131 - 137. 349. Khabar, K. S. Hepatitis C virus-host interactions: the NS5A protein and the interferon/chemokine systems / K.S. Khabar, S.J. Polyak // J. Interferon Cytokine Res. - 2002. - Vol. 22. – P. 1005 – 1012. 350. Krammer, P.H. CD95’s deadly mission in the immune system / P.H. Krammer // Nature. – 2000. – Vol. 407. – P. 789 - 795. 351. Krishna, V. D. Virus-specific cytolytic antibodies to nonstructural protein 1 of Japanese encephalitis virus effect reduction of virus output from infected cells / V.D. 258 Krishna, M. Rangappa, V. Satchidanandam // J. Virol. - 2009. - Vol. 83. - P. 4766 4777. 352. Kunz, C. TBE vaccination and the Austrian experience / C. Kunz // Vaccine. 2003. - Vol. 21 (Suppl 1). - P. 50 - 55. 353. Lambris, J.D. Complement evasion by human pathogens / J.D. Lambris, D. Ricklin, B.V. Geisbrecht // Nat. Rev. Microbiol. - 2008. - Vol. 6. № 2. - P. 132 – 142. 354. Lanier, L.L. Natural killer cell receptor signaling / L.L. Lanier // Curr. Opin. Immunol. - 2003. - Vol. 15. - P. 308 - 314. 355. Larena, M. Immunobiology of Japanese encephalitis virus / M. Larena, M. Lobigs // In D. Ruzek (ed.) «Flavivirus encephalitis». Published by In Tech. 2011. P. 317 - 338. 356. Lehner, P.J. Recent developments in MHC class I-mediated antigen presentation / P.J. Lehner, P. Cresswell // Curr. Opin. Immunol. - 2004. - Vol. 16. - P. 82 - 89. 357. Leyssen, P. Perspectives for the treatment of infections with Flaviviridae / P. Leyssen, E. De Clercq, J. Neyts // Clinic. Microbiol. Reviews. - 2000. - Vol. 13 (1). P. 67 - 82. 358. LFA-1 contributes an early signal for NK cell cytotoxicity / D.F. Barber, M. Faure, E.O. Long // J. Immunol. - 2004. - Vol. 173(6). - P. 3653 - 3659. 359. Lindenbach, B.D. Molecular biology of flaviviruses / B.D. Lindenbach, C.M. Rice // Adv. Virus Res. - 2003. - V. 59. - P. 23-60. 360. Lindenbach, B.D. Flaviviridae: The viruses and their replication / B.D. Lindenbach, H.J. Thiel, C.M. Rice // Fields Virology. 5th Edition / Knipe D. M. and Howley P. M., Eds. Philadelphia. Lippincott-Raven Publishers. 2007. - P. 1101– 1152. 361. Lindquist, L. Tick-borne encephalitis / L. Lindquist, O. Vapalahti // Lancet. 2008. – Vol. 371. – P. 1861–1871. 362. Lisnić, V.J. Modulation of natural killer cell activity by viruses / V.J. Lisnić, A. Krmpotić, S. Jonjić // Curr. Opin. Microbiol. - 2010. - Vol. 13. №4. - P. 530 – 539. 259 363. Liu, S-Y. New developments in the induction and antiviral effectors of type I interferon / S-Y. Liu, D.J. Sanchez, G. Cheng // Current Opinion in Immunology. 2011. - Vol. 23 №1. - P. 57 - 64. 364. Live attenuated yellow fever 17D infects human DCs and allows for presentation of endogenous and recombinant T cell epitopes / G. Barba-Spaeth [et al.] // J. Exp. Med. - 2005. - Vol. 202. - P. 1179 – 1184. 365. Locksley, R.M. The TNF and TNF receptors super families: integrating mammalian biology / R.M. Locksley, N. Killen, M.J. Lenardo // Cell. - 2001. - Vol. 104. - P. 487 - 501. 366. Lok, S.M. Amino acid and phenotypic changes in dengue 2 virus associated with escape from neutralisation by IgM antibody / S.M. Lok, M.L. Ng, J. Aaskov // J. Med. Virol. - 2001. - Vol. 65. - P. 315 – 323. 367. Lyme Borreliosis and Tick-Borne Encephalitis / P. Oschmann [et al.] // Bremen: UNI-MED, 1999. - 352 p. 368. MacFarlane, A.W. Signal transduction in natural killer cells /A.W. MacFarlane, K.S. Campbell // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2006. - Vol. 298. - P. 3 - 57. 369. Mackenzie, J.S. Emerging flaviviruses: the spread and resurgence of Japanese encephalitis, West Nile and dengue viruses / J.S. Mackenzie, D.J. Gubler, L.R. Petersen // Nat Med. - 2004. - Vol.10. - P. 98 - 109. 370. Malasit, P. Complement and dengue hemorrhagic fever/shock syndrome / P. Malasit // Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. - 1987. - Vol. 18. № 3. - P. 316 – 320. 371. Mandl, C.W. Sequens of the structural proteins of tick-borne encephalitic virus (western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses / C.W. Mandl, F. Heinz, C. Kunz // Virology. - 1988. - Vol. 166. - P. 197-205. 372. Marsh, M. Virus entry into animal cells / M. Marsh, A. Helenius // Adv. Virus Res. - 1989. - Vol. 36. - P. 107 - 151. 260 373. Martina, B.E. Dengue virus pathogenesis: an integrated view / B.E. Martina, P. Koraka, A.D. Osterhaus // Clin. Microbiol. Rev. - 2009. - Vol. 22. - P. 564 - 581. 374. Marzio, R. CD69 and regulation of the immune function / R. Marzio, J. Mauel, S. Betz-Corradin // Immunopharmacol. Immunotoxicol. - 1999. - Vol. 21. - № 3. - P. 565 - 582. 375. Mathur, A. Breakdown of blood-brain barrier by virus-induced cytokine during Japanese encephalitis virus infection / A. Mathur, N. Khanna, U.C. Chaturvedi // Int. J. Exp. Pathol. - 1992. – Vol. 73. P. 603 - 611. 376. McMinn, P. C. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses / P. C. McMinn // J. Gen. Virol. - 1997. - Vol. 78. № 11. - P. 2711– 2722. 377. Medin, C. L. Dengue virus nonstructural protein NS5 induces interleukin-8 transcription and secretion / C. L. Medin, K.A. Fitzgerald, A.L. Rothman // J. Virol. 2005. - Vol. 79, № 17. - P. 11053 – 11061. 378. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response / R. Medzhitov // Nature. - 2007. - Vol. 449. N 18. - P. 819-826. 379. Mehlhop, E. Protective immune responses against West Nile virus are primed by distinct complement activation pathways / E. Mehlhop, M.S. Diamond // J. Exp. Med. - 2006. - Vol. 203(5). - P. 1371 – 1381. 380. Mercer, J. Virus entry by endocytosis / J. Mercer, M. Schelhaas, A. Helenius // Ann. Rev. Biochem. - 2010. - Vol. 79. №1. – P. 803 - 833. 381. Mercer, J.C. Natural killer T cells: rapid responders controlling immunity and disease / J.C. Mercer, M.J. Ragin, A. August // I. J. Biochemistry & Cell Biology. 2005. - Vol. 37. - P. 1337 – 1343. 382. Mice with different susceptibility to tick-borne encephalitis virus infection show selective neutralizing antibody response and inflammatory reaction in the central nervous system / M. Palus [et al.] // J. Neuroinflammation. - 2013. – Vol. 10. – P. 77 – 90. 261 383. Monath, T.P. Flaviviruses / T.P. Monath, F.X. Heinz // "Fields Virology" /Eds. Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M. et al. - Lippincott-Raven Publishers Philadelphia, 1996. - P. 961-1034. 384. Monath, T.P. Pathogenesis and pathophysiology of yellow fever / T.P. Monath, A.D. Barrett // Adv. Virus Res. - 2003. - Vol.60. - P. 343 – 395. 385. Monath, T. P. Yellow fever vaccine / T.P. Monath // Expert Rev. Vaccines. 2005. - Vol. 4. - P. 553 – 574. 386. Monocytes-macrophages are a potential target in human infection with West Nile virus through blood transfusion / M. Rios [et al.] // Transfusion. - 2006. - Vol. 46. - P. 659 - 662. 387. Mortality following peripheral infection with tick-borne encephalitis virus results from a combination of central nervous system pathology, systemic inflammatory and stress responses / D. Hayasaka [et al.] // Virology. - 2009. - Vol. 390. P. 139–150. 388. Mukada, N. Interleukin-8: an expanding universe beyond neutrophil chemotaxis and activation / N. Mukada // Int. J. Hematol. - 2000. - Vol. 72. - P. 391 398. 389. Mutation in a 17D-204 vaccine substrain-specific envelope protein epitope alters the pathogenesis of yellow fever virus in mice / K.D. Ryman [et al.] // Virology. - 1998. - Vol. 244. - P. 59 – 65. 390. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities / C. Nathan // Nat. Rev. Immunol. - 2006. - Vol. 6. - P.173–182. 391. Nelson, C.A. Structural principles of MHC class II antigen presentation / C.A. Nelson, D.H. Fremont // Rev. Immunogenet. - 1999. - Vol. 1. - P. 47 - 59. 392. Neurologic disease induced in transgenic mice by cerebral overexpression of interleukin 6 / I.L. Campbell [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. – Vol. 90. - P. 10061–10065. 262 393. New aspects of NK cell subset identification and inference of NK cells’ regulatory capacity by assessing functional and genomic profiles / E. Wilk [et al.] // Immunobiology. – 2008. – Vol. 213. –P. 271–283. 394. Newman, D. J. The influence of natural products upon drug discovery / D. J. Newman, G.M. Cragg, K.M. Snader // Nat. Prod. Rep. - 2000. - Vol. 17. - P. 215 234. 395. Novel CD4+ and CD8+T-cell determinants within the NS3 protein in subjects with spontaneously resolved HCV infection / A.M. Wertheimer [et al.] // Hepatology. - 2003. - Vol. 37 (3). - P. 577 - 589. 396. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH / S.L. Allison [et al.] // J. Virol. - 1995. - Vol. 69. №2. - P. 695–700. 397. Orange, J.S. Natural killer cells in human health and disease / J.S. Orange, Z.K. Ballas // Clin. Immunol. – 2006. – Vol. 118. – P. 1–10. 398. Parker, W.B. Metabolism and antiviral activity of ribavirin / W.B. Parker // Virus Res. - 2005. - Vol. 107. - P. 165 - 171. 399. Pashine, A. Targeting the innate immune response with improved vaccine adjuvants / A. Pashine, N.M. Valiante, J.B. Ulmer // Nat. Med. - 2005. - Vol. 11. - P. 63 – 68. 400. Pathogenicity of Tick-borne encephalitis virus isolated in Hokkaido, Japan in mouse model / N. Chiba [et al.] // Vaccine. - 1999. – Vol. 17 (7–8). – P. 779–787. 401. Pattern recognition receptors TLR4 and CD14 mediate response to respiratory syncytial virus / E.A. Kurt-Jones [et al.] // Nature Immunol. - 2000. - Vol. 1. - P. 398 - 401. 402. Peculiarities of the corrective effects of polar lipids and bioantioxidants from sea hydrobionts in impairments of lipid and carbohydrate metabolism / O.N. Krivoshapko [et al.] // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. – 2011. - Vol. 5. № 2. - P. 152 – 157. 263 403. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism / J.B. Cornacoff [et al.] // J. Clin. Invest. - 1983. - V. 71. - P. 236 - 247. 404. Proinflammatory cytokines and chemokines in humans with japanese encephalitis / P. Winter [et al.] // J. Infect. Dis. - 2004. - № 190. - P. 1618 -1626. 405. Proksch, P. Drugs from the Sea - opportunites and obstacles / P. Proksch, R. Edrada-Ebel, R. Ebel // Marine Drags. - 2003. - № 1. - P. 5 - 17. 406. Prophylactic ribavirin treatment of dengue type 1 infection in rhesus monkeys / F.J. Malinoski [et al.] // Antiviral Res. - 1990. - Vol. 13. - P. 139 – 149. 407. Protective mechanisms induced by a Japanese encephalitis virus DNA vaccine: requirement for antibody but not CD8+- cytotoxic T-cell responses / C.H. Pan [et al.] // J. Virol. - 2001. - Vol. 75(23). - P. 11457 – 11463. 408. Pulendran, B. Learning immunology from the yellow fever vaccine: innate immunity to systems vaccinology / B. Pulendran // Nature Reviews Immunology. 2009. - Vol. 9. - P. 741 – 747. 409. Randall, R. E. Interferons and viruses: an interplay between induction, signaling, antiviral responses and virus countermeasures / R.E. Randall, S. Goodbourn // J. Gen. Virol. - 2008. - Vol. 89. - P. 1 - 47. 410. Relation of genetic phylogeny and geographical distance of tick-borne encephalitis virus in central Europe / M. Weidmann [et al.] // J. General Virology. 2011. – Vol. 92. – P. 1906–1916. 411. Relationship of serum immunoglobulin and IgG subclass levels to race, ethnicity and behavioral characteristics in HIV infection / J.P. McGowan [et al.] // Med. Sci. Monit. – 2006. – V. 12(1). – P. 11 - 16. 412. Replication fitness determines high virulence of influenza A virus in mice carrying functional Mx1 resistance gene / D. Grimm [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2007. – Vol. 104. P. 6806 – 6811. 413. Ribavirin monotherapy in patients with chronic hepatitis C: a retrospective study of 95 patients / F. Zoulim [et al.] // J. Viral. Hepatol. - 1998. - Vol. 5. - P. 193 – 198. 264 414. Rice, T.W. Therapeutic intervention and targets for sepsis / T.W. Rice, G.R. Bernard // Annu. Rev Med. - 2005. - Vol. 56. - P. 225 - 248. 415. Risk factors is dengue shock syndrome / S. Thein [et al.] // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1997. - Vol. 56. - P. 566 - 572. 416. Roebuck, K.A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression / K.A. Roebuck, A. Finnegan // J. Leukoc. Biol. - 1999. - № 66. - P. 876 – 888. 417. Role of complement in immune regulation and its exploitation by virus / K.L. Cummings [et al.] // Viral. Immunol. - 2007. - Vol. 20. № 4. - P. 505 – 524. 418. Role of heparan sulfate for attachment of Tick-Borne encephalitis virus / H. Kroschewski [et al.] // Virology. - 2003. -Vol. 308(1). - P. 92 - 100. 419. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs / B. Pastorino [et al.] // Antiviral Res. - 2010. Vol. 87. - P. 281 – 294. 420. Roozendaa l, R. Emerging patterns in complement-mediated pathogen recognition / R. Roozendaal, M.C. Carroll // Cell. - 2006. - Vol. 125. - P. 29 - 32. 421. Rubenstein, M. Bispecific oligonucleotides may induce interferon expression in LNCaP cells enhancing surface antigen expression: effect of intrastrand base pair complementarity / M. Rubenstein, C.M. Hollowell, P. Guinan // In Vivo. - 2011. Vol. 25(1). - P. 61 - 67. 422. Russell, J. H. Lymphocyte-mediated cytotoxicity / J.H. Russell, T.J. Ley // Annu. Rev. Immunol. - 2002. – Vol. 20. – P. 323 - 370. 423. Ruzek, D. Tick-borne encephalitis: pathogenesis and clinical implications / D. Ruzek, G. Dobler, O.D. Mantke // Travel Med. Infect. Dis. – 2010. – Vol. 8. - P. 223– 232. 424. Samuel, M.A. Alpha/beta interferon protects against lethal West Nile virus infection by restricting cellular tropism and enhancing neuronal survival / M.A. Samuel, M.S. Diamond // J. Virol. - 2005. - Vol. 79 (21). - P. 13350 -13361. 265 425. Samuel, M.A. Pathogenesis of West Nile virus infection: a balance between virulence, innate and adaptive immunity, and viral evasion / M.A. Samuel, M.S. Diamond // J. Virology. - 2006. - Vol. 80. № 19. - P. 9349 - 9360. 426. Schifferli, J.A. Physiological and pathological aspects of circulating immune complexes / J.A. Schifferli, R.P. Taylor // Kidney Int. - 1989. - V. 35. - P. 993 1003. 427. Schmidt, K. Cellular factors modulating the entry efficiency of West Nile virus. Involvement of integrins / K. Schmidt // in network project «Emerging Arthropod-Borne Viral Infections in Germany: Pathogenesis, Diagnostic and Surveillance». Hannover, 2012. - P. 29-35. 428. Sequential production of cytokines by dengue virus-infected human peripheral blood leukocyte cultures / U.C. Chaturvedi [et al.] // J. Med. Virol. – 1999. – Vol. 59. – P. 335 - 340. 429. Serum levels of interleukin 6 in recently hospitalized tick-borne encephalitis patients correlate with age, but not with disease outcome / M.G. Toporkova [et al.] // Clin. Exp. Immunol. - 2008. – Vol. 152. P. 517 – 521. 430. Serum time course of two brain-specific proteins, alpha (1) brain globulin and neuron-specific enolase, in tick-born encephalitis and Lyme disease /. V.P. Chekhonin [et al.] // Clin. Chim. Acta. – 2002. – Vol. 320. P. 117–125. 431. Shapiro, J.M. Practical flow cytometry / J.M. Shapiro. - 4th edition, New York: John Wiley & Sons, 2003. – 875 p. 432. Shrestha, B. Role of CD8+T cells in control of West Nile virus infection / B. Shrestha, M.S. Diamond // J. Virol. - 2004. - Vol. 78. - P. 8312 – 8321. 433. Siergist, C.A. Vaccine immunology / C.A. Siergist // In S.A. Plotkin, W.A. Orenstein, P.A. Offit (ed.) «Vaccines». Published by Elsevier Health Sciences. 2008. - P. 17 - 36. 434. Sies, H. Polyphenols and health: update and perspectives / H. Sies // Arch. Biochem. Biophys. - 2010. - Vol. 501(1). - P. 2 - 5. 266 435. Sitati, E.M. CD4+T-cell responses are required for clearance of West Nile virus from the central nervous system / E.M. Sitati, M.S. Diamond // J. Virol. - 2006. - Vol. 80. - P. 12060 – 12069. 436. Skarphedinsson, S. Survey of tick-borne infections in Denmark / S. Skarphedinsson, P.M. Jensen, K. Kristiansen // Emerg. Infect. Dis. – 2005. - Vol. 11. - P. 1055–1061. 437. Smith, D.B. Evolution of the hypervariable region of hepatitis C virus / D.B. Smith // J. Viral. Hepat. - 1999. - Vol. 6. - P. 41 – 46. 438. Spellberg, B. Type1/Type2 immunity in infectious diseases / B. Spellberg, J.E. Edwards // Clin. Infect. Dis. - 2001. - № 32. - P. 76 - 102. 439. Speth, C. Neuroinvasion by pathogens: a key role of the complement system / C. Speth, M.P. Dierich, P. Gasque // Mol. Immunol. - 2002. – Vol. 38(9). – P. 669 679. 440. Springer, T.A. Adhesion receptors of the immune system / T.A. Springer // Nature. -1990. - № 346. - P. 425 – 434. 441. Steinman, R. M. Taking dendritic cells into medicine / R.M. Steinman, J. Banchereau // Nature. - 2007. - Vol. 449. - P. 419 – 426. 442. Steinman, R.M. Exploiting dendritic cells to improve vaccine efficacy / R.M. Steinman, M. Pope // J. Clin. Invest. - 2002. - Vol. 109(12). - P. 1519 – 1526. 443. Stewart, M. Leukocyte integrins / M. Stewart, M. Thiel, N. Hogg // Curr. Opin. Cell Biol. - 1996. - Vol. 7, № 5. - P. 690 - 696. 444. Stiasny, K. Characteristics of antibody responses in tick–borne encephalitis vaccination breakthroughs / K. Stiasny, H. Holzmann, F. X. Heinz // Vaccine. - 2009. - Vol. 27. - P. 7021 – 7026. 445. Structural basis of a flavivirus recognized by its neutralizing antibody: solution structure of the domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein / K. P. Wu [et al.] // J. Biol. Chemistry. - 2003. - Vol. 278. - P. 46007 - 46013. 446. Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody / G. E. Nybakken [et al.] // Nature. - 2005. - Vol. 437. - P. 764 - 769. 267 447. Susceptibility to mouse cytomegalovirus is associated with deletion of an activating natural killer cell receptor of the C-type lectin superfamily / S.H. Lee [et al.] // Nat. Gen. - 2001. - Vol. 28. - P. 42 - 45. 448. Synergistic neurotoxic effects of combined treatments with cytokines in murine primary mixed neuron/glia cultures / G.H. Jeohn [et al.] // J. Neuroimmunol. - 1998. – Vol. 85. – P. 1–10. 449. Szomolanyi-Tsuda, E. T-cell-independent antiviral antibody responses / E. Szomolanyi-Tsuda, R. M. Welsh // Curr. Opin. Immunol. - 1998. - Vol. 10. - P. 431 435. 450. Takeuchi, O. Recognition of viruses by innate immunity / O. Takeuchi, T. Kaisho, S. Akira // Immunol. Rev. - 2007. - Vol. 220. - P. 214 - 224. 451. Temporal dynamics of CD69 expression on lymphoid cells / R. Craston [et al.] // J. Immunol Methods. - 1997. - Vol. 10, № 209(1). - P. 37 - 45. 452. Thach D.C. Differences between C57BL/6 and BALB/c by mice in mortality and virus replication after intranasal infection with neuroadapted Sindbis virus / D.C. Thach, T. Kimura, D.E. Griffin // J. Virol. – 2000. – Vol. 74. P. 6156 – 6161. 453. The cells of innate systems in tick-borne encephalitis / N.G. Plekhova [et al.] // In D. Ruzek (ed.) «Flavivirus encephalitis». Published by In Tech. 2011. - P. 167 – 194. 454. The flavivirus 3'-noncoding region: extensive size heterogeneity independent of evolutionary relationships among strains of tick-borne encephalitis virus / G. Wallner [et al.] // Virology. - 1995. - Vol. 20. № 213. - P. 169–178. 455. The IL-2 receptor promotes lymphocyte proliferation and induction of the cmyc, bcl-2, and bcl-x genes through the trans-activation domain of Stat5 / J.D. Lord [et al.] // J. Immunol. - 2000. - Vol. 164. - P. 2533 – 2541. 456. The immunopathogenesis of neurotropic flavivirus infection / N.J.C. King [et al.] // In D. Ruzek (ed.) «Flavivirus Encephalitis». In Tech. – 2011. - P. 25–52. 457. The influence of cytokines on the integrity of the bloodbrain barrier in vitro / H.E. De Vries [et al.] // J. Neuroimmunol. - 1996. - Vol. 64. - P. 37–43. 268 458. The interactions of the flavivirus envelope proteins: implications for virus entry and release / F.X. Heinz [et al.] // Arch. Virol. Suppl. - 1994. – Vol. 9. P. 339– 348. 459. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection / A. Fuchs [et al.] // Virology. - 2011. - Vol. 412. - P. 101 109. 460. The NS5 protein of the virulent West Nile virus NY99 strain is a potent antagonist of type I interferon-mediated JAK-STAT signaling / M. Laurent-Rolle [et al.] // J. Virology. – 2010. - Vol. 84, № 7. – P. 3503–3515. 461. The potential pathogenic role of complement in dengue hemorrhagic shock syndrome / V.A. Bokisch [et al.] // N. Engl. J. Med. - 1973. - Vol. 289. № 19. - P. 996 – 1000. 462. The relative contribution of antibody and CD8+T cells to vaccine immunity against West Nile encephalitis virus / B. Shrestha [et al.] // Vaccine. - 2008. - Vol. 26(16). - P. 2020 – 2033. 463. The study of IgG subclass profiles of anti-hbc in populations with different status of HBV infection / Y.Y. Yang [et al.] // Cell Mol. Immunol. – 2005. – Vol. 2(5). – P. 393 - 398. 464. Thepparit, C. Serotype-specific entry of dengue virus into liver cells: identification of the 37-kilodalton/67 kilodalton high-affinity laminin receptor as dengue virus serotype 1 receptor / C. Thepparit, D.R. Smith // J. Virol. - 2004. - Vol. 78(22). - P. 12647 - 12656. 465. Tick-borne encephalitis virus and the immune response of the mammalian host / B. Dorrbecker [et al.] // Travel Med. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 8. - P. 213–222. 466. Tick-borne encephalitis virus delays interferon induction and hides its doublestranded RNA in intracellular membrane vesicles / A.K. Overby [et al.] // J. Virology. - 2010. - Vol. 84. - P. 8470 - 8483. 467. Tick-borne encephalitis virus natural foci emerge in western Sweden / Brinkley [et al.] // Int. J. Med. Microbiol. - 2008. – Vol. 298. – P. 73–80. C. 269 468. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures / S.J. Robertson [et al.] // Immunol. Res. - 2009. - Vol. 43. - P. 172 - 186. 469. Tigabu B. Comparative analysis of immune responses to Russian springsummer encephalitis and Omsk hemorrhagic fever viruses in mouse models // B. Tigabu, T. Juelich, M.R. Holbrook // Virology. - 2010. - Vol. 408(1). - P. 57–63. 470. Toll-like receptor 3 mediates West Nile virus entry into the brain causing lethal encephalitis / T. Wang [et al.] // Nat. Med. - 2004. – Vol. 10. – P.1366–1373. 471. Tumor necrosis factor alpha and interleukin 1 -beta in serum of patients with tick-borne encephalitis / M. Kondrusik [et al.] // Pol. Merkuriusz. Lek. - 2001. - Vol. 11. - P. 26 - 28. 472. Turtle, L. Encephalitis caused by flaviviruses / L. Turtle, M.J. Griffiths, T. Solomon // Q. J. Med. – 2012. Vol.105. – P. 219–223. 473. Ueda, H. Luteolin as an anti-inflammatory and anti-allergic constituent of Perilla frutescens / H. Ueda, C. Yamazaki, M. Yamazaki // Biol. Pharm. Bull. – 2002. – Vol. 25. № 9. - P. 1197 - 1202. 474. Ultrastructure of Kunjin virus-infected cells: colocalization of NS1 and NS3 with double-stranded RNA, and of NS2B with NS3, in virus-induced membrane structures / E. G. Westaway [et al.] // J. Virol. - 1997. – Vol.71. P. 6650–6661. 475. Use of interferon-alpha in patients with West Nile encephalitis: report of 2 cases / A.C. Kalil [et al.] // Clin. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 40. - P. 764 – 766. 476. Vaccination against tick-borne encephalitis virus, a flavivirus, prevents disease but not infection, although viremia is undetectable / T.R. Kreil [et al.] // Vaccine. 1998. - Vol. 16(11-12). - P. 1083 - 1086. 477. Vaccine failures after active immunisation against tick–borne encephalitis / C.R. Andersson [et al.] // Vaccine. - 2010. - Vol. 28. - P. 2827 – 2831. 478. Van Duin, D. Triggering TLR signaling in vaccination / D. van Duin, R. Medzhitov, A.C. Shaw // Trends Immunol. - 2006. - Vol. 27. - P. 49 – 55. 270 479. Van Kaer, L. Innate immunity: NKT cells in the spotlight / L. Van Kaer, S. Joyce // Curr. Biol. - 2005. - Vol.15. - P. 429 – 431. 480. Van Kessel, K.P. Rosmarinic acid inhibits external oxidative effects of human polymorphonuclear granulocytes / K.P. Van Kessel, E.S. Kalter, J. Verhoef // Agents Actions. – 1986. – Vol. 17. – P. 375 – 376. 481. Vargin, V.V. Changes of natural killer cell activity in different mouse lines by acute and asymptomatic flavivirus infections / V.V. Vargin, B.F. Semenov // Acta Virol. - 1986. - Vol. 30. № 4. - P. 303 - 308. 482. Vascular leakage in severe dengue virus infections: a potential role for the nonstructural viral protein NS1 and complement / P. Avirutnan [et al.] // J. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 193(8). - P. 1078 – 1088. 483. Viral evasion of natural killer cells / J.S. Orange [et al.] // Nature Immunology. - 2002. - Vol. 3. - P. 1006 – 1012. 484. Viral mimicry of the complement system / J. Bernet [et al.] // J. Biosci. - 2003. - Vol. 28. № 3. - P. 249 – 264. 485. Virus complement evasion strategies / H.W. Favoreel [et al.] // J. Gen. Virol. 2003. - Vol. 84. № 1. - P. 1 – 15. 486. Walzog, B. Adhesion molecules. The path to a new understanding of acute inflammation / B. Walzog, P. Gaehtgens // News Physiol Sci. - 2000. - № 15. - P. 107 – 113. 487. Watts, C. Pathways of antigen processing and presentation / C. Watts, S. Powis // Rev. Immunogenet. - 1999. - Vol. 1. - P. 60 - 74. 488. Werme, K.M. Tick-borne encephalitis virus NS5 associates with membrane protein scribble and impairs interferon-stimulated JAK-STAT signaling / K.M. Werme, M. Wigerius, M. Johansson // Cell Microbiol. - 2008. - Vol. 10. - P. 696 712. 489. Westaway, E. G. Proteins specified by group B togaviruses in mammalian cells during productive infections / E.G. Westaway // Virology. - 1973. – Vol. 51. P. 454 465. 271 490. Whitmire, J.K. Induction and function of virus-specific CD4+-T cell responses / J.K. Whitmire // Virology. - 2011. - № 411. - P. 216 – 228. 491. Yamanaka, A. Infection-enhancing and -neutralizing activities of mouse monoclonal antibodies against dengue type 2 and 4 viruses are controlled by complement levels / A. Yamanaka, S. Kosugi, E. Konishi // J. Virol. - 2008. - Vol. 82. - P. 927 – 937. 492. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses / D. Gaucher [et al.] // J. Exp. Med. - 2008. - Vol. 205. - P. 3119 – 3131. 493. Yellow fever vaccine YF-17D activates multiple dendritic cell subsets via TLR2, 7, 8, and 9 to stimulate polyvalent immunity / T. Querec [et al.] // J. Exp. Med. - 2006. - Vol. 203. - P. 413 – 424. 494. Young, J.A. Virus entry and uncoating / J.A. Young // Fields Virology. 5-th Ed. Philadelphia. - 2001. - P. 99 - 117. 495. Zhang, N. CD8+T cells: foot soldiers of the immune system / N. Zhang, M.J. Bevan // Immunity. - 2011. - Vol. 35. - P. 161 - 168. 496. Zhu, J. Differentiation of effector CD4 T cell populations / J. Zhu, H. Yamane, W. E. Paul // Ann. Rev. Immunol. - 2010. - Vol. 28. - P. 445 - 489. 497. Zlotnik, A. Chemokines classification system and their role in immunity / A. Zlotnik, O. Yoshie // Immunity. - 2000. - Vol. 12. - P. 121 - 127.