Лукова Ольга Алексеевна - Институт медико

Государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Нижегородская государственная медицинская академия»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
На правах рукописи
Лукова Ольга Алексеевна
Факторы и условия, регулирующие функциональную
активность буккальных эпителиоцитов и их взаимодействие
с Candida albicans
03.03.01 физиология
03.02.03 микробиология
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
Заславская М. И.
2
Нижний Новгород
2015
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………….…………
6
3
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………….…………………..
12
1.1. Функциональная активность эпителиоцитов слизистых
оболочек…………………………………………………………....... 12
1.2. Адгезивные взаимодействия мукозальных эпителицитов с
микроорганизмами………………………………………………………... 14
1.3. Толл - подобные рецепторы эпителиоцитов слизистых оболочек
16
1.4. Внутриклеточные сигнальные пути эпителиоцитов……………...
19
1.5. Факторы, способные влиять на функциональную активность
эпителиоцитов …………………...………………………………….. 22
1.5.1. Гормоны………………………………………………………. 22
1.5.2. Цитокины……………………………………………………... 25
1.5.3. Иммуномодуляторы………………………………………….
27
1.5.4. Микробные метаболиты……………………………………... 32
1.6. Эпителиоциты слизистых оболочек в клинико-лабораторных
исследованиях…………………………………………............................ 33
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………….. 35
2.1. Объем исследований ………………………………………………..
35
2.2. Получение эпителиоцитов слизистых оболочек…………………..
35
2.3. Оценка естественной колонизации эпителиоцитов……………….
35
2.4. Получение клеточной суспензии Candida аlbicans ………………... 36
2.5. Оценка адгезии в системе «эпителиоциты – C.albicans»…………. 36
2.6. Приготовление факторов для воздействия на эпителиоциты…….
37
2.6.1. Получение продуктов метаболизма микроорганизмов….....
37
2.6.2. Женские половые гормоны………………………………….
37
2.6.3. Цитокины……………………………………………………..
38
2.6.4. Иммуномодулирующие препараты…………………………. 38
2.6.5. Антисептические средства…………………………………..
38
2.7. Определение уровня экспрессии Toll-подобных рецепторов на
буккальных эпителиоцитах и жизнеспоспособности клеток …..
38
2.8. Ингибирование внутриклеточных сигнальных путей ……………. 41
2.8.1. Подавление активации транскрипционного фактора
NF-kB …………………………..…..………………………… 41
4
Список сокращений
ДМСО
- диметилсульфоксид
ЗФР
- забуференный физиологический раствор (рН 7,2-7,4)
ЛГ
- лютеинизирующий гормон
ОРЗ
- острое респираторное заболевание
ФСГ
- фолликулостимулирующий гормон
ХГЧ
- хорионический гонадотропин
ЧБД
- часто болеющие дети
CD
- маркёры клеточной дифференцировки (cluster of differentiation)
sICAM-I
- растворимые молекулы межклеточной адгезии I
IFN
- интерферон (interferon)
IL
- интерлейкин (interleukin)
NF-kB -
- нуклеарный фактор kB
NK
- естественный киллер (natural killer)
PAMPs
- патоген-ассоциированные паттерны и молекулярные образы
микроорганизмов
TLR
- толл-подобные рецепторы (toll-like receptor)
TNFα
- Фактор некроза опухоли α (tumor necrosis factor)
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время большое внимание уделяется поиску простых и
неинвазивных методов выявления патологических изменений в организме
человека.
Одним из таких перспективных направлений является исследование
функционального состояния эпителиоцитов слизистых оболочек, которое может
служить источником важной диагностической и прогностической информации
[Маянский А.Н. и соавт. 2004; Полякова В.О. и соавт., 2015)].
Функциональная активность мукозальных клеток находит отражение в
процессах клеточной дифференцировки, синтезе различных молекул, экспрессии
рецепторов и отражает состояние местного и общего гомеостаза организма
5
человека, а также его нарушения при патологии и старении [Маянский А.Н и
соавт., 2004;
Пальцев М.А.и соавт., 2012; Полякова
В.О. и соавт., 2015].
Изменение функционального состояния эпителиоцитов является следствием
различных воздействий на рецепторный аппарат клетки.
способности экспрессировать toll-подобные
Так, благодаря
рецепторы (TLRs), эпителиальные
клетки могут обнаруживать типовые молекулярные последовательности-паттерны
(PAMPs) микробного или иного
происхождения,
не свойственные тканям
человека [Полторак, А.Н., 2014; Brightbill H., Modlin R. 2000; Zhang G.,2001; Cario
E.,2002; Akira S., Hemmi H., 2003; Takeda K., Akira S., 2005; Weindl, G. et all, 2007.
Naglik, J.R.,
Moyes
D., 2011а; McClure R., Massari P., 2014].
TLRs являются мощными активаторами внутриклеточных сигнальных путей,
таких как система нуклеарного фактора kB и МАР-киназ, которые способствуют
синтезу функционально активных молекул (цитокины, молекулы межклеточной
адгезии, рецепторы, белки острой фазы, ферменты, молекулы главного комплекса
гистосовместимости и др.) мукозальными клетками [Маянский А.Н. и соавт., 2007;
Baldwin A.S.Jr., 1996; Barnes P.J. et all., 1997; Andreakos E. et.all. 2005; Weindl, G. et
all, 2010; Hayden M. S., Ghosh S. 2011]. Через продукцию данных медиаторов,
эпителиоциты слизистых оболочек активно вовлекаются в воспалительные и
иммунные реакции, транслируя сигналы лимфоцитам, макрофагам и дендритным
клетками, присутствующим в lamina propria [Топтыгина А.П., Афанасьев С.С.,
2009].
Для оценки функциональной активности эпителиоцитов слизистых оболочек
в настоящее время используют различные методы, основанные на изучении их
морфологии, выявлении клеточных маркеров и рецепторов (иммуногистохимия),
продукции
цитокинов,
медиаторов,
определении
содержания
ДНК
(микроспектрофотометрия), а также уровня естественной колонизации нормальной
микрофлорой [Банченко Г.В. и соавт. 1997; Быков В.Л.,1997; Абаджиди М.А. и
соавт., 2003; Авдалян А.М. и соавт., 2003; Сапронова Е.А. и соавт, 2003; Махрова
Т.В., и соавт., 2004; Маянский А.Н. и соавт.. 2005; Караулов А.В. и соавт.,2012;
Бочкарева О.П. и соавт, 2013; Полякова В.О. и соавт., 2015; Steele С., Fidel P.L.,
6
2002]. В то же время, функционирование рецепторного аппарата эпителиоцитов и
его реактивность, т. е. способность отвечать на стимулы - изучены недостаточно.
Также не в полной мере определен спектр экзогенных и эндогенных факторов,
способных регулировать экспрессию рецепторов эпителиальных клеток, в
частности, обеспечивающих адгезивные контакты с микроорганизмами.
В настоящей работе были использованы новые методические подходы для
оценки функционального статуса клеток слизистых оболочек, основанные на
изучении
работы
их рецепторного аппарата.
Реактивность рецепторов
эпителиоцитов оценивалась по экспрессии TLRs, а также по способности клеток к
адгезивным взаимодействиям с тест-культурой
Сandida albicans в процессе
искусственной колонизации in vitro.
Целью работы является исследование функциональной активности рецепторного
аппарата буккальных эпителиоцитов под влиянием различных факторов и условий,
а также при взаимодействии с C. albicans и микробиотой полости рта.
Задачи исследования:
1. Определить влияние эндогенных и экзогенных факторов: половых гормонов,
цитокинов, иммуномодуляторов, антисептиков и микробных метаболитов -
на
функциональную активность рецепторного аппарата эпителиоцитов слизистых
оболочек при адгезивных контактах с C. albicans.
2. Проанализировать взаимоотношение систем нуклеарного фактора kB и митогенактивированных киназ с активностью рецепторного аппарата
буккальных
эпителиоцитов при адгезивных взаимодействиях с C. albicans.
3. Оценить экспрессию TLR-2
и TLR-4
буккальными
эпителиоцитами под
влиянием эндогенных и экзогенных факторов, а также, при хроническом
пародонтите.
7
4. Сравнить уровень естественной колонизации буккального эпителия у пациентов
с заболеваниями различного генеза до и после терапии с использованием
иммуномодуляторов и оральных антисептиков.
Научная новизна
Впервые получены данные об изменении адгезивных свойств буккальных
эпителиоцитов под действием эндогенных и экзогенных факторов: половых
гормонов, цитокинов, иммуномодуляторов и антисептиков в системах с C. albicans
in vitro.
Получены новые сведения о значении нуклеарного фактора kB для
реализации контактных взаимодействий
буккальных
эпителиоцитов с
С. albicans.
Впервые определен уровень экспрессии TLR-2 и TLR-4
на буккальных
эпителиоцитах в норме и при пародонтите методом проточной цитофлюориметрии,
а также выявлены субпопуляционные изменения среди TLR-2- и TLR-4позитивных клеток под влиянием эндогенных и экзогенных факторов.
Впервые изучена динамика изменения уровня
естественной колонизации
буккальных эпителиоцитов у пациентов на фоне применения комплексной терапии
с использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков.
Теоретическая и практическая значимость
Подтверждена
высокая
чувствительность
и
информативность
экспериментальной модели «адгезия C. albicans на эпителиоцитах слизистых
оболочек in vitro» для оценки реактивности рецепторного аппарата эпителиальных
клеток в ответ на различные стимулы.
Показано, что эпителиоциты разных биотопов – буккальные и вагинальные
клетки – однотипно меняют адгезивную активность в отношении кандид
под
действием половых гормонов in vitro.
Разработан способ изучения функциональной активности и реактивности
буккальных эпителиоцитов по оценке экспрессии toll-подобных рецепторов
методом проточной цитофлюориметрии.
8
На основе метода исследования естественной колонизации буккального
эпителия
разработан
иммуномодуляторов
и
алгоритм
оценки
эффективности
оральных
антисептиков
в
применения
комплексном
лечении
хронических патологий.
Внедрение результатов работы
Разработанные
методы
и
алгоритмы
используются
в
лабораторно-
диагностической и научно-исследовательской работе Нижегородского филиала
ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии»
Минздрава РФ и стоматологической поликлинике ГОУ ВПО «НижГМА
Минздрава» (г. Нижний Новгород).
Положения, выносимые на защиту
Гормоны, участвующие в обеспечении овуляции и поддержании состояния
беременности (лютеинизирующий гормон, прогестерон) усиливают адгезивность
эпителиоцитов слизистых оболочек в отношении C. albicans in vitro.
Обработка
эпителиоцитов
иммуномодуляторами
и
оральными
антисептиками in vitro снижает способность буккальных клеток адгезировать C.
albicans.
Кандида-зависимая активация нуклеарного фактора kB в буккальных клетках
усиливает контактное взаимодействие эпителиоцитов с
C. albicans.
Экспрессия TLR-2 и TLR-4 на буккальных эпителиоцитах способна
регулироваться микробными метаболитами и иммуномодуляторами,
а также
меняется при хроническом пародонтите.
Анализ изменения уровня естественной колонизации буккального эпителия
может применяться в оценке эффективности терапевтических мероприятий
с
использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков у пациентов
разных возрастных групп с хроническими патологиями (онихомикоз, микробная
экзема, респираторные заболевания).
9
Апробация материалов диссертации
Диссертация
апробировалась
на
расширенном
заседании
кафедры
микробиологии и иммунологии ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава (г. Нижний
Новгород) 20 февраля 2015 г; протокол № 8.
Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на: XI, XII,
XVI научно-практических конференциях по медицинской микологии
(Санкт-
Петербург; 2008, 2009, 2013), 2-ом съезде Микологов России (Москва, 2008), Х
международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и
иммунофармакологии»
(Казань,2009),
2-ом
Международном
конгрессе
по
пробиотикам (Санкт-Петербург,2009), XVII Российском национальном конгрессе
«Человек и лекарство» (Москва,2010), всероссийской научно-практической
конференции, посвященной 95-летию ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н.
Блохиной (Нижний Новгород, 2014), на III Санкт-Петербургском международном
экологическом форуме «Инфекция и иммунитет» (Санкт-Петербург, 2014).
Публикации
По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 3 – в
журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из
введения,
обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
главы собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы.
Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 39 рисунками. Библиографический
указатель включает 185 источников литературы, в том числе 118 отечественных и
67 зарубежных авторов.
Вклад автора
Диссертация представляет собой обобщение результатов, полученных
автором лично. Эксперименты на проточном цитофлюориметре выполнялись
10
совместно с к.б.н. Кропотовым В.С. на базе ФГУ "Нижегородский НИИ детской
гастроэнтерологии" Минздрава РФ. Оценка ряда лабораторных показателей у
больных с микробной экземой и онихомикозом проводилась совместно с врачами
ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии»
Минздрава РФ (Пышкина Е.И., к.м.н. Шебашова Н.В, к.м.н. Мишина Ю.В). Работы
по изучению уровня колонизационной резистентности полости рта у частоболеющих и здоровых детей проводились совместно с сотрудниками кафедры
гигиены ГБОУ НижГМА Минздрава РФ (проф., д.м.н. Якубова И.Ш.,
Поляшова А.С.). Буккальный
к.м.н.
эпителий от больных пародонтитом был
предоставлен зав. стоматологической поликлиникой ГБОУ ВПО
НижГМА
Минздрава РФ, к.м.н. Китаевой Е.В.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Функциональная активность эпителиоцитов слизистых оболочек
Эпителиальные клетки слизистых оболочек входят в систему мукозального
иммунитета,
обеспечивающую
первую линию защиты против колонизации
различными патогенами [Маянский А.Н. 2006]. От функционального состояния и
активности мукозальных эпителиоцитов
во многом зависит устойчивость к
микробной агрессии, острота ранней фазы воспаления и ее исходы [Маркелова Е.В.
и др.,2005; Лебедева О.П, и др.,2006].
11
Поддержание целостности и барьерных свойств эпителия обеспечивают три
взаимноуравновешенные
и
одновременно
протекающие
процесса
[ГемоновВ.В.,1996,Быков В.Л., 1997; Kalinin A.E.et all.,2002]:
1) регенерация – непрерывное образования клеток в самом глубоком (базальном)
слое благодаря делению малодифференцированных предшественников;
2) дифференциация - изменение морфофункциональных характеристик
клеток одновременно с их смещением в вышележащие слои;
3) десквамация – удаление с поверхности эпителия клеток (роговых чешуек),
поврежденных и содержащих на своей поверхности микробы.
Функциональный статус эпителиоцитов слизистых оболочек
зависит от
степени их зрелости. В составе многослойного пласта клетки эпителия находятся
на
разных
стадиях
морфофункциональной
дифференцировки
–
от
малодифференцированных предшественников в базальном слое (обеспечивают
регенерацию эпителия) до высокоспециализированных клеток, которые по мере
дифференцировки смещаются в поверхностные слои, подвергаясь десквамации
[Банченко Г.В. и др., 1997, Быков В.Л.,1997], с признаками ороговения (наличие
кератина) [Jacob H.S. et all.,1980]. Ороговение
эпителия
служит
мощным
защитным механизмом слизистой оболочки полости рта благодаря механической
прочности, высокой химической устойчивости и низкой проницаемости рогового
слоя. Интенсивное воздействие на буккальный эпителий раздражающих факторов
(микробных, механических, химических, температурных) способно вызывает его
усиленное ороговение [Данилевский Н.Ф. и др.,1979; Бурягина Н.В. и др., 2013]
Присутствие в эпителиальных чешуйках гидролитических ферментов (кислая
фосфотаза, неспецифическая эстераза) также свидетельствуют в пользу участия
клеток эпителия в защитных реакциях слизистой оболочки в качестве элемента,
способного вызвать протеолиз микроорганизмов. Это возможно либо в результате
разрушения эпителиальных чешуек, либо на их поверхности, в результате прямого
действия на адсорбированные микроорганизмы [Быков В.Л., 1997].
Десквамация и секреция слизи являются физиологическими функциями
эпителия, благодаря которым формируется физический (механический) барьер
12
противомикробной защиты. Химический компонент представлен растворимыми и
связанными с клеткой рецепторами, а также антимикробными пептидами
[Ахматова, Н.К. и др.,2008; Ярилин, 1999].
Подобно
другим
клеткам,
эпителиоциты секретируют различные медиаторы, которые оказывают влияние на
развитие иммунных и воспалительных реакций. Зпителиальные клетки способны
синтезировать интерлейкины IL-6, IL-8, IL-18, гамма-интерферон, хемокины,
гранулоцитарно-макрофагальный
лейкотриены (ЛТ-В4),
колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ),
простагландины (ПГ-Е2), а также экспрессировать
коадгезивные (CD54), костимулирующие (CD40) и антигенпредставляющие (HLA)
молекулы [Eberhard, J. et al., 2002, Ellmerich, S et al.,2000; Farmer, I. et al., 2001;
Mannhardt, W. et al.,1999; Rouabhia, M et al.,2002; Smith, J.K et al., 1996; Steele C. et
al., 2002]. С помощью этих
активных молекул мукозальные эпителиоциты
способны вступать в кооперацию с индукторами и эффекторами воспаления и
иммунитета, такими как нейтрофилы, макрофаги, Т- и В-лимфоциты,
тучные
клетки, эозинофилы, дендритные клетки [Симбирцев А.С., 2004]. Таким образом
эпителиоциты слизистых оболочек участвуют
в
поддержании функций
гомеостаза и способны координировать иммунные реакции [Маянский А.Н.2006;
Weindl G, et all., 2010; Сотникова Н.Ю.,2009].
Образование медиаторов и
других активных молекул зависит от
функционального состояния буккальных эпителиоцитов, меняясь под влиянием
различных воздействий [Rouabhia M, 2002. et al].
Известно, что эпителиоциты постоянно подвергаются механическому
травмированию, воздействию широкого спектра температур и значений
pH,
раздражающих и повреждающих веществ, а также атаке микроорганизмов
[Абаджиди, и др., 2003; Бурягина Н.В., и др., 2013]. Все эти воздействия способны
улавливать различные группы сигнальных молекул, в частности, toll-подобные
рецепторы (TLRs) (см. п 1.3.), после чего сигнал транслируется на генетический
аппарат клетки при помощи ряда внутриклеточных сигнальных систем (см. п.
1.4.). Изменение уровня экспрессии генов, отвечающих за синтез биологически
13
активных молекул, процессы дифференциации и апоптоза способствуют переходу
клетки в новое функциональное состояние.
1.2.
Адгезивные взаимодействия мукозальных эпителиоцитов
с микроорганизмами
Закрепление микроорганизмов на поверхности эпителиальных клеток может
служить началом инфекционного процесса [Маянский А.Н., 2006; E. Nester., et all.,
2009]. При этом, успех микробной колонизации зависит от наличия у
микроорганизма
соответствующих
рецепторов,
вирулентности
штамма,
выраженности иммунных реакций на уровне слизистых оболочек и состояния
колонизируемой ткани [Маянский А.Н. 2006;
Cannon, R.D. et all.,1995; Лесовой
В.С.и др.,2003; Величко Е.В.,2003; Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В., 2001].
Способность
к
адгезивным
взаимодействиям
является
функциональной характеристикой эпителиоцитов. Прикрепление
важнейшей
(адгезия)
микроорганизма к клеткам слизистых оболочек имеет два механизма. Первый - не
зависит от уровня метаболической и цитоскелетной активности эпителиоцитов.
Это пассивный механизм, который не связан со специфическими рецепторами и
может определяться гидрофобными, электростатическими или прочими слабыми
взаимодействиями в системе «эпителиоцит-микроорганизм».
-
Второй механизм
рецептор-зависимый - является результатом метаболической активности
мукозальных клеток [Махрова Т.В., 2004ав]. В рецепторные взаимодействия
эпителиоцитов с микроорагнизмами могут быть вовлечены разнообразные группы
молекул, такие как гликосфинголипидные рецепторы, фукозные (N-ацетил-Dглюкозаминовые
остатки),
RGD-содержащие
полипептиды,
содержащие
последовательность Арг-Гли-Асп [Cannon R.D et al.,1995].
При этом, на реализацию адгезии потенциала в
микроорганизм»
системе «эпителиоцит-
могут оказывать влияние многие факторы,
как со стороны
макроорганизма, так и со стороны потенциального патогена [Черкасов С.В. и др,
2011].
14
Регулирование адгезии микроорганизмов на эпителиоцитах часто зависит от
секрета слизистых оболочек. Так, гипосаливация может предшествовать развитию
инфекций ротовой полости, в то же время антиадгезивным эффектом обладают
различные факторы слюны, в частности, антитела, муцины,
катионные белки,
ферменты [Зеленова Е.Г. и др. 2004 Махрова Т.В. и др. 2005, Naglik J.R.В 2011].
Гормональные изменения могут оказывать влиянии на адгезию микроорганизма к
мукозальным эпителиоцитам [Кравцов Э.Д и др.,2014], также
как и
наличие
местного или системного воспалительного процесса [Абаджиди М.А. и др, 2000.,
Маянский А.Н и др., 2002]. В последнем случае рецепторный аппарат
эпителиоцитов подвергается
ферментов
воздействию протеолитических и гликозидазных
мукозальных секретов, влияющих на поверхностные структуры
эпителиальных клеток. Количество подобных ферментов подвержено изменениям,
заметно повышаясь во время тяжелых (критических) заболеваний. Это вызывает
функциональную трансформацию
эпителиальных клеток,
что отражается
на
качественных и количественных показателях микробиоценоза слизистых оболочек
[Маянский А.Н. и др.1987; Абаджиди, М.А. и др. 2000; Маянский, А.Н. и др. 2004]
и ведет к ослаблению колонизационной резистентности.
Конкурентные отношения между представителями микробиоценоза, а также
продукты
их
метаболизма
могут
оказывать
влияние
на
микроорганизмов с эпителиоцитами [Махрова T.В. и др., 2004;
взаимодействие
Кремлева Е.А. и
др., 2012].
Адгезины микроорганизмов могут выполнять и другие функции, помимо
собственно адгезии (прикрепления к поверхности). Некоторые из них являются
антигенами и способствуют активации эпителиоцитов, через взаимодействие с
сигнальными молекулами на поверхности клеток, например такими как
подобные рецепторы (TLR) [Weindl, G. et al., 2007].
1.3. Толл - подобные рецепторы эпителиоцитов слизистых оболочек
toll–
15
Клетки человека способны обнаруживать и распознавать структуры, общие
для разных групп патогенов (PAMP), используя toll – подобные рецепторы [Akira
S, 2003;
McClure et.all., 2014]. Toll-зависимая рецепция является пусковым
моментом для активации эпителиальных клеток через каскад внутриклеточных
реакций, в результате чего изменяется функциональная активность эпителиоцитов,
которая может проявляться в виде усиленной секреции цитокинов, пептидных
медиаторов, дифенсинов, ингибиторов провоспалительных агентов, цитокиновых и
прочих рецепторов, молекул главного комплекса гистосовместимости и молекул
межклеточных взаимодействий [Cario E., et al., 2002; Sasai M,et all., 2013; Weindl,
G. et al., 2007; Weindl G. et all.,2010; Naglik J.R.,2011а; McClure R. et.all., 2014].
Таким способом - через активацию TLRs - эпителиоциты могут принимать
участие в регуляции врожденного и адаптивного иммунитета за счет трансдукции
сигнала лимфоцитам, макрофагам и дендритным клеткам, присутствующим в
Lamina propria [Топтыгина А.П., и др. 2009; Бережная Н.М. 2013].
Непосредственный контакт TLR с лигандом инициирует внутриклеточную
передачу сигнала. При этом, один из путей связан с включением адаптерного белка
MyD 88 (белок первичного ответа миелодной дифференцровки 88), который
активирует
ядерный
(нуклеарный)
транскрипционный
фактор
-
NF-kB,
инициирующий в ядре транскрипцию генов провоспалительных цитокинов и
антимикробных пептидов [Лебедева О.П. и др.,2012].
Известно, что эпителиоциты человека способны экспрессировать широкий
спектр toll-подобных рецепторов - от TLR-1 до TLR-9 [Naglik J.R., 2011А]. В
зависимости от локализации, в клетке выделяют рецепторы, расположенные на
цитоплазматической мембране (TLR-1, TLR-2, TLR-4, TLR-5, TLR-6) или на
мембранах внутриклеточных органелл - лизосом, эндосом, аппарата Гольджи.
(TLR-3, TLR-7, TLR-8 и TLR-9). При этом, каждый член семейства TLR распознает
определенные
PAMP
грибкового,
вирусного,
бактериального
и
другого
происхождения..
Лигандами
цитоплазматической
toll-подобных
мембране,
рецепторов,
являются
локализованных
поверхностные
на
структуры
16
микроорганизмов - липопротеины, липополисахариды, флагеллин, маннаны,
зимозан. Рецепторы, локализованные в мембранах внутриклеточных органелл,
распознают молекулы ядерных структур микроорганизмов (ДНК), но могут быть
активированы и поврежденными молекулярными структурами собственного
организма [Naglik, J.R., 2011а; Кубанов А.А.,и др.,2013; Катунина О.Р., 2011;
Сорокина Е.В., 2012].
Наиболее изучены мишени и принцип работы для мебранных рецепторов
TLR-2 и TLR-4. TLR-2 по структуре сходен с TLR-1 и TLR-6. TLR-2 формирует
гетеродимеры
с
TLR-1
и
TLR-6,
что
необходимо
для
распознавания
диацетилированных и триацетилированных липопептидов. Комплекс TLR-1 и
TLR-2 распознает различные микробные компоненты, такие, как пептидогликан
грамположительных и грамотрицательных бактерий, фенол-растворимый модулин
Staphylococcus aureus и гликолипиды Treponema maltophylum. В женских половых
путях TLR2 способен также распознавать пептидогликан Chlamydia trachomatis,
липополисахарид
и
фрагменты
пептидогликана
Neisseria
gonorrhoeae
и
фософолипоманнан Candida albicans [Симбирцев А.С., 2005, Ганковская Л.В., и
др.2009]. TLR-2 также вовлечен в распознавание компонентов вирусов простого
герпеса I типа и цитомегаловируса. TLR-2 в совокупности с TLR-6 распознают
белки клеточной стенки микоплазмы [Akira S.,2004; Сорокина Е.В., 2012].
TLR4 экспрессируется в маточных трубах, эндометрии, шейке матки и
влагалище, гладкомышечных клетках матки и шейки матки, стромальных клетках
эндометрия и маточных натуральных киллерах [Hirata T., et al., 2005]. Лигандом
рецептора
TLR-4
являются
липополисахариды
клеточной
стенки
грамотрицательных бактерий. Кроме того, TLR-4 распознает белок теплового шока
60, гликофосфолипиды простейших и белковую оболочку вирусов. В клинических
исследованиях показана способность TLR4 связываться с липополисахаридами
Neisseria gonorrhoae, липополисахаридами и белками теплового шока Chlamydia
trachomatis, маннаном Candida albicans [Симбирцев А.С., 2005].
17
Эпителиальная клетка
Комменсалы
(нормальная
микрофлора)
TLR
Патогенные
микроорганизмы
Конститутивные Индуцибельные
Цитокины, хемокины
Низкий
уровень
Высокий
уровень
Гомеостаз
( саногенез)
Воспаление
(патогенез)
Рис.1 Участие TLR в регуляции функцональной активности эпителиальной
клетки (по McClure R., Massari P., 2014; в собственной модификации)
Сложность
структуры
патогена
или
иных
лигандов,
а
также
множественность его распознавания с участием толл-подобных рецепторов
создают возможность регулирования и «индивидуализации» реагирования клеток.
Так, некоторые сигналы могут вызывать «физиологический» уровень продукции
медиаторов (например, цитокинов), поддерживая саногенез, другие же сигналы,
наоборот – способны индуцировать гиперпродукцию цитокинов и хемокинов и
как следствие - воспалительные процесс [Лебедева О.П., и др., 2012; McClure R., et
al.2014](рис.1.).
Изменение уровня экспрессии сигнальных рецепторов может
меняться в процессе инфекционного или аллергического заболевания [Воропаева
Е.А.,и др. 2008; Ганковская Л.В. и др., 2009.; Сорокина Е.В., 2012; Ю.А. Тюрин и
др., 2013]. Также есть данные, что экспрессия толл-подобных рецепторов может
зависеть от фазы менструального цикла [Hirata T. 2007].
18
Полагают, что активация клеток через
TLR4 возбуждает секрецию
хемокинов, мобилизацию нейтрофилов и организацию иммунного воспаления
(Th1), что связывают с развитием иммунитета, уничтожением возбудителя и
выздоровлением [Hirata T.,2005].
Активация TLR2, в большей мере, вызывает
«иммунологическое отклонение» - смещение равновесия Th1/Th2 в сторону Th2
(стимуляция гуморальных реакций / гиперчувствительности немедленного типа) –
такое развитие инфекционного процесса грозит формированием «пермиссивного
фенотипа» и хронизацией заболевания. В то же время, распознавание через
лектиновые рецепторы и рецепторы комплемента играет важную роль в
фагоцитозе возбудителя и регулировании воспаления [Альтман Э.Д., и др. 2011;
Zhang G. et al., 2001; Hirata T.2007].
1.4. Внутриклеточные сигнальные пути эпителиоцитов
Изменение реактивности эпителиальных клеток в ответ на внеклеточные
стимулы опосредуется через внутриклеточные сигнальные пути, осуществляющие
передачу активирующего сигнала с поверхности на генетический аппарат клетки.
Транслирующую функцию в клетках человека выполняют внутриклеточные
регуляторы генной транскрипции,
такие как нуклеарный фактор-kB (NF-kB)
[Baldwin, A.S. 2001, Jobin Ch, Sartor R.B., 2000., Маянский А.Н., 2007], и митогенактивированные протеинкиназы (MAP- киназы)[ Tian W. et al., 2000]. Эти системы
играют важную роль в регуляции активности генов, отвечающих за адаптивные
реакции клеток [Baldwin, A.S. 2001; Jobin Ch., Sartor R.B., 2000; Tang, N.et al. 2004;
Tato C.M., Hunter C.A., 2002]. Имеются сведения об участии TLRs в качестве
стартового сигнала, путем эстафетной стимуляции NF-kB и MAP- киназ р38
[Andreakos E2005].
NF-kB активируется в ответ
на
воспалительные
цитокины,
митогены,
инфекции, и микробные продукты [Matthew E. Poynter, 2002; M. R.Milward I. L.
C.Chapple, 2007].
Активация NF-kB под действием различных стимулов (провоспалительные
цитокины, физические и химические агенты, микробные компоненты и пр.) ведет
19
к усилению экспрессии многих генов (рис.3),
задействованных в иммунном,
воспалительном процессах и апоптозе [Маянский А.Н., 2007;, C.M. Tato, C.A.
Hunter 2002]. Мишенями для NF-κB служат гены, кодирующие цитокины (ИЛ-1,
ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИФ-γ, ФНО-α, ГМ-КСФ, и др.), адгезивные молекулы
межклеточного взаимодействия (ICAM, VCAM, ELAM и др.), острофазные белки,
ферменты
дифенсины),
(NO-синтаза,
молекулы
циклооксигеназа-2),
главного
комплекса
антимикробные
пептиды
гистосовместимости
(β-
(HLA),
регуляторы апоптоза (Fas-лиганд, с-myc, p53, циклин D1) и пр. [Caamano J. Hunter
C.A., 2002.).
Протеинкиназы также играют важную роль в передаче сигналов. Группа
ферментов, объединенная под названием «протеинкиназы» катализирует перенос
концевого остатка фосфата с АТФ на различные химические группы в структуре
белка [Tian W.et al., 2000] и активируется по каскадному механизму.
Протеинкиназы активируют внутриклеточные сигнальные каскады, которые в
свою очередь регулируют экспрессию генов, метаболизм и адаптивное поведение
клеток.
Протеинкиназы разделены на пять классов в зависимости от мишеней для
фосфорилирования. Митоген-активированные протеинкиназы (MAP) относятся к
протеинкиназам первого класса – группе серин-треониновых киназ [Tang, et al.
2004] – переносящим фосфат на спиртовые группы серина и треонина [Гусев, Н.Б.
2000]. Классические МАР киназы проходят в ядро, где фосфорилируют свои
20
Стимулы: цитокины, компоненты бактерий (ЛПС), б
вирусная инфекция, оксиданты (активные формы кисл
пероксидаза), стресс и др.
Клеточная мем
MyD 88
MKK3/6
p 38
IkB
p 65
ERK
NF-k
MAPK
AP-1
p - 65
p 50
Ядро
активация генов
цитокины, хемокины, рецепторы,
молекулы межклеточной адгезии,
IBα , белки острой фазы, MHC-I, MHC-II
индуцибельные ферменты
Рис. 3 Некоторые механизмы и функциональные последствия активации
рост
апоп
21
NF-B и митоген-активированных – киназ. (по Villena J.,2014 в
собственной модификации)
мишени
–
факторы
транскрипции.
Альтернативным
путем
является
фосфорилирование цитоплазматических факторов [Tian W. et al., 2000].
Митоген-активированные протеинкиназы участвуют в трансдукции сигналов,
вызванных митогенами, стрессорными факторами
(УФ-излучение, нагревание,
осмотический шок), ростовыми факторами, провоспалительными цитокинами
(такими как ФНО-α и ИЛ-1) и патогенами [Tian W. et al., 2000, Tang N.et al. 2004].
В настоящее время описаны 4 подгруппы MAP-киназ: киназы, регулируемые
внеклеточными сигналами (ERK);
c-jun N-концевая, или стресс-активируемая
протеинкиназа (JNK/SAPK), p38 и ERK-большая MAP-киназа 1 (Big MAP).
Активация
MAP-киназ
играет
существенную
роль
в
продукции
провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-α и ИЛ-6), индукции ферментов (COX2), адгезивных белков (VCAM-1 и др.), экспрессии внутриклеточных ферментов
(iNOS) [Tian W. et al., 2000].
Таки образом, активация нуклеарного фактора-kB (NF-kB) и митогенактивированных протеинкиназ (MAP- киназы) приводит к усилению экспрессии
индуцибельных генов, перестраивает фенотип клеток и адаптируя их к новым
условиям [Jobin Ch, Sartor R.B., 2000].
1.5.
Факторы, способные влиять на функциональную активность
эпителиоцитов
Функциональная активность эпителиоцитов может изменяться
под
действием эндогенных и экзогенных стимулов [Маянский А.Н, Маянская И.В.,
2004].
22
1.5.1. Гормоны
Основные женские половые гормоны – эстрогены, такие как
эстрадиол,
эстриол и эстрон [Шустов С. Б, и соавт, 2012;. Леонова З.А, Флоренсов В.В., 2013].
Эстрогены относятся к подклассу стероидных женских половые гормонов
и
производятся, в основном, фолликулярным аппаратом яичников у женщин.
Эстрадиол – главный эстроген, функционирующий с момента полового созревания
до менопаузы; он несет ответственность более чем за четыреста функций в
организме женщины. Эстрадиол, в отличие от прогестерона, потенцирует действие
возбуждающих
нейромедиаторов.
В
синапсах
эстрадиол
обеспечивает
рецептивность клеток к прогестерону, индуцируя экспрессию рецепторов
прогестерона [Шустов С. Б, и соавт, 2012; Леонова З.А., Флоренсов В.В.; 2013
C.L
et all.,2010;
Beagley K.,2003].
Эстриол — самый «слабый»
Butts
из эстрогенов, в
наибольшем количестве производится плацентой во время беременности, у
небеременных женщин его мало. Прогестерон — является не только одним из
стероидных гормонов, но и фактически родоначальником их подавляющего
большинства. Прогестерон образуется главным образом желтым телом в
лютеиновую фазу, секретируется также фетоплацентарным комплексом во время
беременности. [Татарчук Т.Ф.,2003; Леонова З.А., Флоренсов В.В.,2013].
В
фолликулярной фазе менструального цикла концентрация прогестерона в плазме
равна 0,06-1,25 мкг/л, на пике овуляции – 0,08-1,2мкг/л, в лютеиновой фазе – 2,525мкг/л, в менопаузе – 0,06-1,6 мкг/л [Камышников,2004]. Прогестерон относят к
группе гормонов -
нейростероидов, названных так в связи с его значимым
влиянием на мозговые структуры. Он способен взаимодействовать не только с
собственными рецепторами, но и рецепторами других стероидных гормонов:
глюкокортикостероидов, андрогенов, минералокортикоидов. Однако приоритетной
функцией для прогестерона является поддержка беременности [Pluchino N., et al.
2009.; Репина М.А.,2011].
Лютеинизирующий гормон (ЛГ) совместно с фолликулостимулирующим
гормоном (ФСГ) необходимы для нормальной работы репродуктивной системы.
23
Содержание ЛГ в крови составляет 0,4-3,0 мкг/л сыворотки.
ЛГ способен
стимулировать секрецию эстрогенов яичниками, при этом, пиковое повышение его
уровня в крови в середине менструального цикла инициирует овуляцию. ФСГ
ускоряет развитие фолликулов в яичниках у женщин и образование эстрогенов
[Шустов С. Б, и соавт, 2012].
Процессы, происходящие в течение менструального цикла, регулируются
вышеописанными гормонами
и могут быть представлены
как фазы,
соответствующие изменениям в яичниках (фолликулярная, овуляторная и лютеиновая), и
в эндометрии (менструальная, пролиферативная и секреторные фазы) [Fahey J.V.,
2005].
Рис.2. Динамика изменения сывороточной концентрации женских половых гормонов
в течение менструального цикла ( по Татарчук Т.Ф.,Сольский Я.П.2003)
Стоит также
упомянуть еще один важный гормон - хорионический
гонадотропин (ХГЧ), который выделяется плацентой во время беременности у
женщин и играет важную роль в поддержании этого состояния. Концентрация
ХГЧ постепенно нарастает к 11 неделе беременности, затем несколько снижается
[Шустов С. Б, и соавт, 2012].
В
последние
годы
установлено,
что
метаболические
процессы
в
эпителиальных тканях разных органов являются гормонозависимыми [Ferrucci L.
24
Guralnik J.M.,2003; Mariottu A., 2013]. В эпителиоцитах слизистой оболочки десны
обнаружены рецепторы к ряду гормонов, в том числе и к эстрадиолу и
токсостеролу,
которые
преимущественно
находятся
в
ядрах
клеток
промежуточного и камбиального слоев [Кравцов Э.Г.и др.,2014; Wira C.R., Fahey
J.V.,2010].
Половые
воздействием,
гормоны
обладают
не
только
специфическим
системным
но и оказывают значительнее влияние на состояние местного
иммунитета слизистых оболочек [Pluchino N., et al.2009; Татарчук Т.Ф.,Сольский
Я.П. 2003; Леонова, З.А., Флоренсов В.В.2013; Klein S. L., 2004]. Гормоны могут
влиять на физиологию эпителиальных клеток слизистых оболочек [Ochiel D.O., et
all.,2008]. При гормональном дисбалансе в эпителии слизистой оболочки полости
рта развиваются морфофункциональные изменения [Markou E., 2011; Герасимов
И.Г. и др.,1996; Сафонова О.П.и др., 2004]. Морфологические изменения в
эпителии у женщин в разные фазы менструального цикла [Сапронова Е.А. и др.
2003; Служаев, И.Ф. и др.,
2004].
Доказано участие эстрогена в
процукции цитокинов в клетках парадонта
регуляции
[Zhou Y, et all., 2009]. Установлено
влияние женских половых гормонов на адгезию кандид к буккальному эпителию, а
также
формироване микрофлоры влагалища [Кравцов Э.Г.и др.,2014.; Лебедева
О.П., Калуцкий П.В., 2006; Лебедева.О.П. и др.2009].
1.5.2. Цитокины
Цитокины - группа пептидных медиаторов с молекулярной массой от 8 до 80
кДа, продуцируемая клетками организма [Ройт А.2000]. Цитокины участвуют в
регуляции различных процессов, таких как иммунный ответ (дифференцировка
предшественников клеток иммунной системы, представление антигена, активация
и пролиферацию иммунокомпетентных клеток
и др.), воспаление (экспрессия
молекул межклеточной адгезии, миграция лейкоцитов и пр.),
эмбриогенез (в том числе, закладка и развитие органов иммунной
гемопоез,
системы)
и
апоптоз [Ройт А.2000,; Ярилин А.А. 1999; Парахонский А.П.,2005; Симбирцев
А.С., 2007].
25
Синтез цитокинов начинается после активации клеток, например при
проникновении в ткани патогенов либо нарушении целостности тканей, что
обычно
протекает
параллельно.
Регуляция
защитных
реакций
организма
цитокинами в рамках иммунного и воспалительного ответа связана с двумя
основными направлениями биологического действия цитокинов - защитой от
инфекционных агентов и восстановлением поврежденных тканей [Ройт А.2000;
Ярилин А.А. 1999; Парахонский А.П.,2005; Симбирцев 2007].
Цитокины воздействуют на клетку через специфические рецепторы
клеточной мембраны и вызывают активацию или подавление регулируемых ими
генов [Эфрон, 1998; Ярилин А.А. 1999]. Цитокины в первую очередь регулируют
развитие защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови,
эндотелия, соединительной ткани и эпителиев. Защита на местном уровне
развивается путем формирования типичной воспалительной реакции с ее
классическими проявлениями: гиперемией, развитием отека, появлением болевого
синдрома и нарушением функции [Эфрон, А.Г. 1998; Железникова Г.Ф., 2009;
Белова О.В., 2008; Mantovani A.,1997].
Продукция цитокинов является составной частью клеточного ответа,
связанного с распознаванием клетками миеломоноцитарного ряда сходных
структурных
компонентов
различных
патогенов,
ассоциированными молекулярными паттернами
называемых
патоген-
[Меджитов Р., Джаневей Ч.,
2004]. Активация TLR приводит к синтезу двух основых групп цитокинов:
провоспалительных цитокинов и интерферонов I типа, главным образом INFα/β
[Takeda K., 2005]. Ключевым по значимости событием является синтез комплекса
провоспалительных цитокинов из семейств IL-1, IL-6, TNF и хемокинов,
стимулирующих большинство дальнейших событий в развитии воспалительной
реакции и обеспечивающих веерное расширение активации различных типов
клеток, участвующих в поддержании и регуляции воспаления, включая все типы
лейкоцитов, дендритные клетки, Т и В-лимфоциты, НК клетки, эндотелиальные и
эпителиальные клетки, фибробласты и другие. Это обеспечивает последовательные
этапы развития воспалительной реакции, являющейся основным механизмом
26
реализации врожденного иммунитета [Белан Э.Б. и др., 2011; Симбирцев А.С.,
2007; Абаджиди М.А. и др.,2002].
Экспрессия генов отдельных цитокинов происходит стадиоспецифически на
определенных этапах эмбрионального развития. Фактор стволовых клеток,
трансформирующие ростовые факторы, цитокины семейства TNF и хемокины
регулируют дифференцировку и миграцию различных клеток и закладку органов
иммунной системы [Lv W. 2013]. После этого синтез некоторых цитокинов может
не возобновляться, тогда как другие продолжают регулировать нормальные
физиологические процессы или участвуют
в
развитии
защитных реакций
[Mantovani A ,1997]. Несмотря на то, что большинство цитокинов являются
типичными индуцибельными медиаторами и в постнатальном периоде не
синтезируются клетками вне воспалительной реакции и иммунного ответа,
некоторые − не подпадают под это правило. В результате конститутивной
экспрессии генов часть из них синтезируются постоянно и в достаточно больших
количествах
находятся
в
циркуляции,
регулируя
пролиферацию
и
дифференцировку отдельных типов клеток в течение всей жизни. Примерами
такого типа физиологической регуляции функций цитокинами может быть
постоянно высокий уровень эритропоэтина и некоторых КСФ для обеспечения
гемопоэза [Серебренникова С.Н., и др.,
2008].
Эффект цитокинов проявляется уже при пикограммовых концентрациях.
Определение концентрации цитокинов в крови и других жидкостях тела имеет
прогностическое значение. Для оценки тяжести заболевания и прогнозирования его
течения целесообразно определять концентрацию про- и противовоспалительных
цитокинов в динамике развития болезни. Цитокиновый статус организма важно
оценивать и во время цитокинотерапии для оценки эффективности проводимого
лечения и его оптимизации [Татаурщикова И.С. и др., 2012; Arend W.P.,2001;
Демихов В.Г., 2011; Хаитов, Р.М.,2009].
1.5.3. Иммуномодуляторы
27
Иммуномодуляторы
представляют
собой
лекарственные
средства,
устраняющие дисбаланс различных звеньев иммунной системы. В соответствии с
основными требованиями, предъявляемыми к иммунотропным препаратам, они
должны отвечать следующим характеристикам: [Хаитов Р.М. и др.,1996; Хаитов,
P.M. и др. 2005].
• обладать иммуномодулирующими свойствами;
• иметь высокую эффективность;
• быть безопасными, не иметь противопоказаний, не вызывать привыкания,
побочных реакций и канцерогенных эффектов;
• не вызывать иммунопатологических реакций;
• не провоцировать чрезмерную сенсибилизацию и не потенцировать ее у других
лекарственных средств;
• легко метаболизироваться и выводиться из организма;
• не вступать во взаимодействие с другими препаратами, обладать высокой
совместимостью с ними;
• иметь непарентеральные пути введения
В зависимости от происхождения иммуномодуляторы делят на 6 основных
групп: микробные, тимические, костномозговые, цитокины, нуклеиновые
кислоты и химически чистые иммуномодуляторы (синтетические препараты)
[Хаитов М.Р. и др., 1996; Справочник Видаль, 2014 ] ( табл.1.).
Иммуномодуляторы микробного происхождения условно можно разбить на 3
поколения. Первым препаратом, разрешенным к медицинскому применению в
качестве иммуностимулятора, была вакцина БЦЖ, обладающая выраженной
способностью
усиливать
факторы
как
врожденного,
так
и
приобретенногоиммунитета [Хаитов Р.М. и др., 2005]. К микробным препаратам I
поколения можно отнести также Пирогенал и продигиозан, представляющие собой
полисахариды
бактериального
происхождения.
В
настоящее
время
из-за
пирогенности и других побочных эффектов они применяются редко [Петров Р. М.
и др., 1998]. К микробным препаратам II поколения, в свою очередь, принадлежат
28
лизаты (Бронхомунал, ИPC-19, Имудон, Бронхо-Ваксом) и рибосомы (Рибомунил)
бактерий, относящихся в основном к возбудителям респираторных инфекций
(Klebsiella
pneumoniae,
Streptococcus
pneumoniae,
Streptococcus
pyogenes,
Haemophilus influezae и др.). Эти препараты имеют двойное назначение –
специфическое («вакцинирующее», т.е. действуют как мукозальные вакцины)
и
Таблица 1
Примеры иммуномодулирующих препаратов разных групп
Группа
Состав
Естественные
бактериальные
препараты
Смесь лизатов бактерий:
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus
helveticus,
Lactobacillus fermentum, Streptococcus
pyogenes группа A, Streptococcus
sangius,
Staphylococcus aureus,
Enterococcus faecium,
Enterococcus faecalis,
Klebsiella pneumoniae,
Fusobacterium nucleatum,
Corynebacterium pseudodiphtheriticum,
Candida albicans
Рибосомы бактериальные
Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae типа B
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus
aureus,
Acinetobacter calcoaceticus,
Neisseria subflava и perflava, Moraxella
catarrhalis,
Streptococcus pyogenes группы A,
Streptococcus dysgalactiae группы C
Enterococcus faecium и faecalis
Streptococcus группы G.
Глюкозаминид мурамилдипептид
Синтетические
препараты
Препараты
на основе
природных
компонентов
растений
Эхинацеи пурпурной травы сок
Торговое
название ®
Имудон
Рибомунил
ИРС-19
Ликопид
Иммунал
29
Рекомбинантный
интерферон
Производные
различных химических
групп
Нуклеиновые кислоты
Иммунорегулятор-ные
пептиды
неспецифическое
Интерферон-ɑ
Гриппферон
Азоксимер бромид
Полиоксидоний
Дезоксирибонуклеат натрия
Тимуса экстракт
Деринат
Тактивин
(иммуностимулирующее) [Шумский А.В., 2000]. Наконец, к
микробным препаратам III поколения можно отнести Ликопид. Он состоит из
природного дисахарида – глюкозаминилмурамила и присоединенного к нему
синтетического дипептида – L-аланил-D-изоглутамина [Винницкий Л.И. и др.,
1997; Жаркова О.А.,2005; Воронина Е.В.,2011].
В организме главной мишенью для микробных иммуномодуляторов
являются фагоцитарные клетки. Под влиянием этих препаратов усиливаются
функциональные свойства фагоцитов (повышаются фагоцитоз и внутриклеточный
киллинг поглощенных бактерий), возрастает продукция провоспалительных
цитокинов, необходимых для инициации гуморального и клеточного иммунитета.
В результате может увеличиваться продукция антител, активироваться образование
антигенспецифических Т-хелперов и Т-киллеров [Hadden J.W. 1993; Хаитов Р.М. и
др., 1996].
К иммуномодуляторам, получаемым из костного мозга млекопитающих
(свиней или телят), относится Миелопид. В его состав входят 6 специфичных для
костного мозга медиаторов иммунного ответа, называемых миелопептидамин
(МП),
которые обладают способностью
стимулировать
различные
звенья
иммунного ответа, особенно гуморальный иммунитет. Каждый МП обладает
определенным биологическим действием, совокупность которых и обусловливает
его клинический эффект. МП-1 восстанавливает нормальный баланс активности Тхелперов и Т-супрессоров. МП-2 подавляет пролиферацию злокачественных
клеток и существенно снижает способность опухолевых клеток продуцировать
токсические
субстанции,
ингибирующие
функциональную
активность
Т-
30
лимфоцитов. МП-3 стимулирует активность фагоцитарного звена иммунитета и,
следовательно, повышает антиинфекционный иммунитет. МП-4 оказывает влияние
на дифференцировку гемопоэтических клеток, способствуя их более быстрому
созреванию, т. е. обладает лейкопоэтическим эффектом. При иммунодефицитных
состояниях препарат восстанавливает показатели В- и Т-систем иммунитета,
стимулирует
продукцию
иммунокомпетентных
антител
клеток,
и
способствует
функциональную
восстановлению
активность
ряда
других
показателей гуморального звена иммунитета [Богомолова Н.С. и др., 1999].
Основой для создания большой группы
иммуномодуляторов являются
цитокины - эндогенные молекулы, участвующие в регуляции иммунного ответа
(см. п. 1.5.3.).
К подгруппе, имеющих естественное происхождение относятся
Лейкинферон и Суперлимф, к группе рекомбинантных препаратов - Бета-лейкин,
Ронколейкин и Лейкомакс (молграмостим) [Hadden J.W., 1993]. К лекарственным
средствам,
характеризующимся
выраженными
иммуномодулирующими
свойствами, следует отнести также цитокины -интерфероны (природные и
рекомбинантные) и индукторы интерферонов.
Химически чистые (синтетические) иммуномодуляторы можно разделить на
2 подгруппы - низкомолекулярные и высокомолекулярные. К первым относятся
лекарственные
средства,
дополнительно
обладающие
иммунотропной
активностью. Их родоначальником стал левамизол (Декарис) – известное
противоглистное
средство,
у
которого
в
последующем
были
выявлены
выраженные иммуностимулирующие свойства. Другим перспективным лекарством
из подгруппы низкомолекулярных иммуномодуляторов является Галавит –
производное фталгидразида. Особенность этого препарата заключается в наличии
не только иммуномодулирующих, но и выраженных противовоспалительных
свойств. К подгруппе низкомолекулярных иммуномодуляторов также относятся и
3 синтетических олигопептида: Гепон, Глутоксим и Аллоферон [Арион В.Я., 1991].
К высокомолекулярным химически чистым иммуномодуляторам, полученным с
помощью направленного химического синтеза, относится Полиоксидоний. Этот
препарат характеризуется широким спектром фармакологического действия на
31
организм,
включающим
иммуномодулирующий,
антиоксидантный,
детоксирующий и мембранопротекторный эффекты [Петров Р.В. и др.,1999;
Караулов А.В., 2008].
Обширный диапазон положительных воздействий на организм характерен и
для иммуномодулирующих препаратов из группы нуклеиновых кислот, которые
подразделяются на синтетические (Полудан) и естественные (Деринат, нуклеинат
натрия).
В
частности,
противогрибковый
и
Деринат,
активирующий
противомикробный
местный
противовирусный,
иммунитет
за
счет
иммуномодулирующего действия на клеточном и гуморальном уровнях и
повышения фагоцитоза, реализует также радиопротекторный, репаративный,
противовоспалительный, анальгезирующий и противоопухолевый и легкий
антикоагулянтный
эффекты.
Это
обусловливает
применение
данного
иммуномодулятора при очень большом круге заболеваний (прежде всего,
инфекционных) различной природы и локализации [Дугина В.В.,2010; Каплина
Э.Н. и др.,2005].
Определение степени поражения иммунной системы является одним из
важнейших этапов в подборе препарата для иммуномодулирующей терапии. Точка
приложения действия препарата должна соответствовать степени нарушения
деятельности определенного звена иммунной системы с целью обеспечения
максимальной
эффективности
проводимой
терапии
[Арион
В.Я.,
1991;
Аллахвердиева Л.И, и др. 2011]. Однако, стоит сказать и о том, что, к сожалению,
в настоящее время нет четкого алгоритма, позволяющего определиться с точным
выбором иммуномодулятора для
коррекции
работы иммунной системы
при
различных патологических состояниях.
1.5.4. Микробные метаболиты
Патогенные/условно-патогенные
бактерии
и
микромицеты
обладают
способностью продуцировать экзтоксины, интимины (инъекционные/ контактные
токсины) и ферменты инвазии, способные разрушать структуру клеток человека,
32
либо нарушать их фунцкии [Маянский, А.Н. 2006; Nester E., et all.2009; Сергеев
А.Ю.,Сергеев Ю.В.,2001]. С другой стороны, имеются примеры стимулирующего
действия и усиления функций эпителиальных клеток и других механизмов
мукозальног иммунитета под влияним пробиотических штаммов микрооранизмов
– представителей нормальной микрофлоры человека [Шендеров,
Forsythe P., Bienenstock J.
1.6.
Б. А, 1998:
2010; Wan L.Y., et all , 2015].
Эпителиоциты слизистых оболочек в клинико-лабораторных
исследованиях
Известно, что эпителиатные клетки (в частности, буккальные), являются
чувствительным индикатором изменений местного и общего гоместоза [Маянский
А.Н. и др., 1987; Быков В.Л., 1997; Зеленова Е..Г. и др.,1999; Абаджиди М.А.и
др., 2000; Ланкина М.В., 2002; Величко Е.В., 2003; Маянский, А.Н., и др. 2004;
Полякова В.О. и др., 2015]. Однако, до сих пор не существет единого мнения о
том, какие методы и молекулярные маркеры наиболее эффективно отражают
функциональые сдвиги в эпителиоцитах [Полякова, В.О. и др., 2015].
Классичечствим
методом
исследования
является
оценка
морфофункциональных изменений клеток и определения электрокинетических
характеристик ядра эпителиоцитов [Банченко Г. В. и др. ,1997; Быков, В.Л.,
1997; Хусаинова, И.С. и др. 1997; Цепов Л.М. и др.,1999; А.М. Авдалян и др.,
2003.; Бочкарева Е.П. и др.,2013]
Довольно
широко используется метод определения
активность эпителиальных клеток
по
функциональной
выраженности их взаимоотношений с
нормальной микрофлорой полости рта - естественная колонизация буккальных
эпителитоцитов [Маянский, А.Н. и др. 1991, Лукиных Л.М. и др.,1999 , Караулов
А.В. и др, 2012].
В настоящее время активно развивается направление
морфологии,
основанное
на
использовании
молекулярной
гистохимических,
иммуногистохимических и иммуноцитхимическтие методов [Полякова, В.О. м др.
2015]. Данные методы позволяют выявлять особенности строения клеток и
33
сигнальные молекулы - биологически активные вещества, секретируемые
эпителиоцитами. Патологические сдвиги в организме могут сопровождаться
изменением количества
продукции следующих маркеров
мукозальных
эпителиоцитов: матриксные металлопротеиназы [Montagner A. F. et al., 2014],
факторы роста эндотелия сосудов – VEGFp [Astekar
M. et al., 2012 ],
хромогранин А и мелатонин, [Angelone T. et al.,, 2012], клеточный маркер
пролиферации Ki67, активатор генной транскриапции p53, экспрессию TNF-α,
[Полякова, В.О. и др., 2015], продукцию β-дефезинов [Гемонов, В.В.и др.,1996,
Цывкина А.А. и др., 2011].
Все эти методы отражают измененное состояние эпителиоцитов при
локальном или системном патологическом процессе.
Нам представляется, что с появлением возможности оценивать эксперссию
клкточных
маркеров и рецепторов
методом
проточной цитофлуориметрии,
может развиться новое направление в исследования эпителиоцитов слизистых
оболочек - по выраженности экспрессии toll-подобных рецепторов или иных
сигнальных молекул. Такой метод позволит оценить не только функциональное
состояние клеток на момент исследования, но и
немедленную способность отвечаьть на стимулы.
их реактивность, т.е.
34
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объем исследований
В работе
было исследовано свыше 1800 препаратов эпителиоцитов
(буккальных и вагинальных) человека. Проведено 54 серии экспериментов
с
искусственной колонизацией кандид на эпителиоцитах. Естественная колонизация
буккальных эпителиоцитов исследована у пациентов с онихомикозом (53 взрослых
и 23 детей), у 52 больных микробной экземой, у часто болеющих детей (21
человек), а также у 57 здоровых доноров. Проведено свыше 200 анализов
сыворотки 78 пациентов методом иммуноферментного анализа. Выполнено 17
серий экспериментов с использованием проточного цитофлюориметра (BD FACS
Canto II System with Fluidics Cart, 6-color, blue/red, USA).
2.2. Получение эпителиоцитов слизистых оболочек
Клетки буккального эпителия получали утром, натощак от здоровых женщин
и мужчин
21-38 лет, а также детей и подростков 2-14 лет путем соскоба с
внутренней поверхности
щеки. Клетки вагинального эпителия получали от
женщин 25-36 лет (на базе женской консультации №1, г. Нижний Новгород).
Эпителиальные клетки трижды отмывали от слизистого секрета ЗФР (40g, 5
минут), готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл. Концентрацию эпителиоцитов
определяли путем измерения оптической плотности суспензии на денситометре
DEN-1 (ООО «Biosan», Латвия).
В каждой серии
экспериментов участвовали
эпителиоциты, полученные не менее чем от 5 доноров.
35
2.3. Оценка естественной колонизации эпителиоцитов
Индекс
естественной
колонизации
бактериальных клеток, адгезировавшихся
оценивали
методом
подсчёта
на эпителиоцитах. Для этого из
суспензии эпителиоцитов готовили мазки, фиксировали метанолом (10 мин) и
окрашивали 0,25% водным раствором азура А («Sigma», USA). Индекс
естественной колонизации оценивали по числу бактериальных клеток в пересчёте
на один эпителиоцит (бакт/эп). Учитывали средний результат после подсчета 100
эпителиоцитов.
В ряде экспериментов оценивали уровень естественной колонизации при
различных патологиях у взрослых и детей, а также после применения препаратов
(иммуномодуляторов, антисептиков) (см. п. 2.12., 2.13.).
2.4. Получение клеточной суспензии Candida аlbicans
В работе использовали штамм Candida аlbicans штамм 601 (из коллекции
кафедры микробиологии и иммунологии ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава РФ, г.
Н. Новгород). Культуру C. albicans получали в дрожжевой фазе на декстрозном
агаре Сабуро
(HiMedia, India) (24 ч, 37С). Посевы смывали забуференным
физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2-7,4), трижды отмывали десятикратным
объемом ЗФР (1000g, 15 мин), удаляли клеточные агрегаты центрифугированием
(40g, 2 мин) и ресуспендировали в концентрации 107 кл/мл в ЗФР.
2.5. Оценка адгезии в системе «эпителиоциты – C.albicans»
Эпителиоциты получали в концентрации 106 кл/мл (см. п. 2.2) и подвергали
влиянию различных факторов (см. п. 2.6.). Эпителиальные клетки и исследуемый
фактор смешивали в равных объемах (по 0,5 мл) и инкубировали 30 мин при 37С.
В контрольных пробах
вместо
фактора
использовали
бульоны для культивирования микроорганизмов).
отмывали ЗФР.
растворитель
(ЗФР,
Эпителиоциты дважды
36
Получали суспензию C.albicans штамм 601 как описано ранее (см. п. 2.4.),
удаляли клеточные агрегаты центрифугированием (40g, 2 мин) и доводили до
концентрации 107 кл/мл.
Проводили искусственную колонизацию C.albicans штамм 601, для чего
равные объемы (по 0,5 мл) взвеси эпителиоцитов (106 кл/мл) и кандид (107 кл/мл)1,
полученных в дрожжевой фазе инкубировали (30 мин, 37°С) в растворе Хенкса без
фенолового красного, встряхивая каждые 5 мин.
Эпителиоциты трехкратно отмывали ЗФР от
неприкрепившихся кандид
(40g, 5 мин), из осадка клеток (0,2 мл) готовили мазок, который после фиксации
метанолом (10 мин) окрашивали 0,25% раствором
азура А.
Подсчитывали
количество кандид, закрепившихся на одном эпителиоците. Рассчитывали индекс
искусственной колонизации как среднее количество адгезированных кандид в
перерасчете на один эпителиоцит (канд/эп), после световой микроскопии 100
эпителиальных клеток.
2.6. Приготовление факторов для воздействия на эпителиоциты
2.6.1. Получение продуктов метаболизма микроорганизмов
Candida albicans штамм 601, Candida krusei штамм 583, Candida glabrata
штамм 441 выращивали на бульоне Сабуро (ННПЦ ГИП, Оболенск) (24 ч, 37С).
Staphylococcus. aureus штамм 5983,
Enterococcus faecium штамм 179/2 и E.coli
штамм 205 (lact+) 601 (из коллекции кафедры микробиологии и иммунологии
ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава РФ, г. Н. Новгород) культивировали в бульоне
TSB (Soybean-Casein Digest broth, Becton, Dickenson and Company, USA, France).
Супернатанты отделяли от микробных клеток центрифугированием при 2000g в
течение 15 минут, и фильтровали через бактериальные фильтры с диаметром пор
20 мкм (Sterile syringe filter, Corning, Germany).
Выбранная концентрация кандид давала максимальные показатели искусственной
колонизации при наименьшем количестве отмывок для получения препаратов свободных от не
прикрепившихся к эпителиоцитам кандид
1
37
2.6.2. Женские половые гормоны
В экспериментах использовали растворы гормонов в ЗФР: эстрадиол – 450
пмоль/л («Sigma», USA), прогестерон - 50 нмоль/л («Sigma», USA), ХГЧ – 500
МЕ/л («Sigma», USA), Эстриол - 15 нг/мл («Sigma», USA). ЛГ- 100мМе/мл
(«Sigma», USA), ФСГ - 50 мМЕ/мл («Sigma», USA), тестостерон – 1,71 нмоль/л
(«Sigma», USA).
2.6.3. Цитокины
В экспериментах использовали цитокинов человека в ЗФР: IL-1 («Sigma»,
USA;10– 12 г/мл) с; IL-6 («Sigma», USA;10– 12 г/мл) IL8 («Sigma», USA;10– 12 г/мл); с
TNFα («Sigma», USA;10– 9 г/мл) и с INFα («Sigma», USA;10– 9 г/мл).
2.6.4. Иммуномодулирующие препараты
В экспериментах использовали коммерческие препараты с заявленным
иммуномодулирующим действием в рекомендованных терапевтических дозах:
Ликопид® − 1мг/мл (ЗАО «ПЕПТЕК», Россия); Рибомунил® −0,15 мг/мл (Пьер
Фабр Медикамент Продакшн», Франция); Полиоксидоний® − 6мг/мл (ООО « НПО
Петровакс Фарм», Россия); Иммунал® − 8мг/мл (Лек , Словения); Деринат® −
0,25% раствор (ЗАО ФП «Техномедсервис», Россия), Имудон® − 5мг/мл (ОАО
«Фармстандарт-Томскхимфарм», Россия); Гриппферон ® - 3000МЕ (ЗАО «Фирн
М», Россия).
2.6.5. Антисептические средства
В экспериментах использовали коммерческие препараты с заявленным
антисептическим эффектом.
Применяли
водный
2%
раствор
Ксидифон® (ФГУП «Мосхимфармпрепараты», Россия), и Лизобакт®
препарата
(1мг/мл)
(АО «Босналек», Босния и Герцеговина).
2.7. Определение уровня экспрессии toll-подобных рецепторов на буккальных
эпителиоцитах и жизнеспоспособности клеток
38
Пул
буккальных эпителиоцитов получали от 5-6 здоровых некурящих
доноров-добровольцев. В ряде экспериментов использовали эпителиоциты,
полученные от больных пародонтитом. Взвесь клеток ресуспендировали в ЗФР
(концентрация 108 кл/мл), пропускали через через фильтры CellTricks с диаметром
пор 100 мкм (Partec, Germany) и переносили в пробирки для цитофлюориметра.
Клетки осаждали центрифугированием (5 мин, 40 g), к осадку добавляли 1 мл
среды 199 с солями Хэнкса и
глутамином (ПанЭко, г. Москва). В ряде
экспериментов эпителиоциты предварительно инкубировали (30 мин, 37°С) с
различными факторами (п. 2.6.). Затем эпителиоциты дважды отмывали ЗФР (5
мин, 40 g) и взвешивали в 100 мкл жидкости для цитофлюориметра «Cell wash».
Эксперименты каждой серии ставили в трех повторах. К 100 мкл взвеси
буккальных эпителиоцитов добавляли следующие реактивы:
1) 20 мкл 7AAD (7-амино-актиномицин D) (BD Pharmingen, USA) и
инкубировали 15 минут. Известно, что клетки с поврежденными мембранами
(мертвые) способны воспринимать (окрашиваться) 7-AAD, в отличие от живых
[Сырцова М.А.,и др., 2014]. В контрольный образец не добавляли краситель, с
целью определения спонтанного окрашивания.
2) 10 мкл коктейля (смеси) антител для идентификации TLR-2 (CD282)
(5мкл) и TLR-4 (CD284) (5мкл) (BD Pharmingen, USA) для анализа активности
эпителиоцитов в контроле и при различных вариантах стимуляции.
Пробирки с материалом перемешивали на лабораторном механическом
встряхивателе (Вортекс V3, Elmi Латвия), затем
помещали в проточный
цитофлюориметр BD FACS Canto II System with Fluidics Cart (6-color, blue/red,
USA). Для калибровки прибора применяли программу BD Cytometer Setup and
Tracking Beads (BD CS&T). Использовали полуавтоматический режим с ручной
подачей пробирки.
Гейт эпителиальных клеток (рис.4) отбирали на основании параметров
бокового (SSC) и прямого (FSC) светорассеивания характерных для буккальных
эпителиоцитов (клетки с низкой гранулярностью - регион низкого светорассеяния)
39
[Хайдуков С.В, и др., 2011; Хаитов Р.М. и др.,2009]. Было выделены следующие
зоны (облака, гейты):
1) с низкой гранулярностью и малыми размерами; было сделано предположение,
что это остатки разрушенных клеток (дебрис);
Рис.4. Гейты эпителиальных клеток.
2) с небольшими размерами и более высокой гранулярностью – эпителиальные
клетки [Копыльцова Е.А., и др., 2005] (рис.4).
В работе проводили анализ гейта №2 (эпителиальные клетки). Результаты
(рис.5,6) обрабатывались с помощью программы FacsDiva 4.1. и выражались в
процентах, как отношение числа клеток, презентирующих на своей поверхности
TLR-2 или TLR-4 к общему числу жизнеспособных клеток в популяции.
40
Рис.5. Гистограмма (вариант №1), показывающая общее содержание TLR-2 и
TLR-4- позитивных буккальных клеток в популяции жизнеспособных
эпителиоцитов.
Рис.6. Гистограмма (вариант №2), показывающая содержание отдельных
фракций TLR-2 и TLR-4- позитивных буккальных клеток в популяции
жизнеспособных эпителиоцитов.
2.8. Ингибирование внутриклеточных сигнальных путей
2.8.1. Подавление активации транскрипционного фактора NF-kB
Блокаду активации транскрипционного фактора NF-kB проводили с
использованием протеасомного ингибитора – ALLN (N-acetyl-leucinyl-leucinylnorleucinal) («Sigma», USA) [Dahan, S. et all .,2000; Carlson D.L., et all., 2003).
Ингибитор (1 мг) растворяли в ДМСО. Буккальные эпителиоциты человека (106
41
кл/мл) инкубировали с ALLN (100 мкл, 90 мин, 37°С). В контроле использовали
интактные клетки (без ингибитора).
2.8.2. Ингибирование активности внутриклеточных митогенактивированных киназ ERK1/2 и p38
В качестве специфического ингибитора ERK1/2 использовали U0126
(«Sigma», USA) [Tian W., et all., 2000] ,
специфическим ингибитором p38 MAP-
киназы служил SB203580 («Sigma», USA) (Jiang Y, et all.,1996). Ингибиторы
MAP-киназ (1 мг) растворяли в ДМСО. В эксперименте использовали ингибиторы
в конечной концентрации 20 M. Эпителиоциты (106) человека инкубировали с
раствором ингибитора (37°С, 1ч). В контроле использовали интактные клетки (без
ингибитора).
2.9. Получение сыворотки человека
Кровь из локтевой вены отбирали утром натощак в объеме 5 мл, получали
сыворотку путем центрифугирования (1000g, 20 мин, 4°С).
2.10. Определение уровня сывороточных иммуноглобулинов IgE и IgG
В работе исследовали уровень IgE и IgG в сыворотке пациентов с микробной
экземой. Исследования проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) на
спектрофотометре BIO-RAD-480 (USA), c использованием коммерческих тестсистем для определения IgE и IgG (ЗАО «Вектор Бест», Россия).
2.11. Определение уровня растворимых s ICAM-I в сыворотке
В работе исследовали уровень sICAM-I в сыворотке пациентов с микробной
экземой. Исследования проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) на
спектрофотометре BIO-RAD-480 (USA), c использованием коммерческих тестсистем для определения ICAM-I (Bender MedSystems, Austria).
42
2.12. Схема применения лизоцим-содержащего антисептического
препарата у часто-болеющих детей
В ряде экспериментов оценивали состояния нормальной микрофлоры
буккального эпителия у часто-болеющих детей с
острыми заболеваниями
респираторной системы в анамнезе, в период ремиссии,
до и после приема
сублингвального препарата, содержащего лизоцим (ЗАО «Биофит», Россия). 1
таблетка
препарата
содержит 7 мг лизоцима. Препарат использовали по
следующей схеме: 3 таблетки 1 раз в день; курс приема - 21 день.
2.13. Схема лечения больных с онихомикозом и микробной экземой
с использованием иммуномодулирующих препаратов
Пациенты с онихомикозом
получали комбинацию из 3-4 препаратов по
следующей схеме [Шебашова Н.В., и др.,2008]:
Таблица 3
Схема комплексного лечения пациентов с онихомикозом
Группы препаратов:
1.Системный антимикотик
(в соответствии с данными
резистограммы)
Препараты выбора:
1. Флюконазол (Дифлюкан, Франция) −150мг в
неделю до полного отрастания ногтевых пластин;
2. Интраконазол−400мг/день в течение недели
(Орунгал, Бельгия);
3. Кетаконазол−200 мг/день в течение 7-14 дней
(Низорал, Россия)
2.Местный антимикотик
1. Клотримазол, (Польша)
(мазь): (в соответсвии с 2. Пимафуцин, (Нидерланды)
данными резистограммы) 3. Низорал, (Бельгия)
4. Травоген, (Германия)
5. Микоспор (Германия)
3.Поливитаминный
препарат
1. Ревалид−1-2 капсулы 3 раза в день 2-4 месяца
(Revalid, Венгрия)
43
2. Цинкертал−1 таблетка 2 раза в день 3-4 месяца,
(Zincertal, Польша)
4.Иммуномодулятор
(в подгруппе с
комплесным лечением)
Полиоксидоний® −24мг 2 раза/день 10 дней (ООО
«НПО Петровакс Фарм», Россия).
Пациенты с микробной экземой получали терапию согласно стандарту лечения.
данного заболевания. В подгруппе с комбинированной терапией пациенты
дополнительно
получали
иммуномодулятор
Деринат®
(ЗАО
ФП
«Техномедсервис», Россия) внутримышечно по 5 мл 1,5% раствора с интервалом
24-72 часа (курс 5-10 инъекций).
2.14. Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку проводили по общепринятой методике с
использованием компьютерных программ Excel и Stadia. Данные проверяли на
нормальность распределения и представляли в таблицах (вместе со значением n)
в виде группового среднего арифметического (М) и стандартной ошибки
среднего (SEM). Межгрупповые различия анализировались параметрическими
или непараметрическими методами, в зависимости от типа распределения. В
качестве параметрического критерия будет использован критерий Стьюдента. В
качестве непараметрического критерия – критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.
Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Взаимосвязь
параметров
оценивали
методом
корреляционного
анализа,
определяя
коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs). Силу корреляционной связи
определяли по значению rs: ниже 0,3 считали слабой, от 0,3 до 0,7 – средней и
от 0,7 до 1,0- сильной.
44
ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Влияние эндогенных и экзогенных факторов на адгезивность
эпителиоцитов слизистых оболочек в экспериментальной системе
с C. albicans in vitro
Адгезия и колонизация патогенных /условно-патогенных микроорганизмов
на тканях хозяина является первым и обязательным этапом инфекции [Маянский
А.Н. 2006; Nester E., 2009]. При этом, адгезия рассматривается не только как
прикрепление микроорганизма к субстрату, но и как процесс, в котором оба
компонента
системы «эпителиальная клетка - микроорганизм»
активно
взаимодействуют между собой [Маянский А.Н. 2006; Зеленова Е.Г.и др., 2002;
Кремлева Е.А.и др., 2012].
При
этом,
на
функциональную
активность
и
реактивность эпителиоцитов слизистых оболочек могут оказывать влияние
различные факторы как экзогенной, так и эндогенной природы [Цывкина А.А. и
др., 2011].
В нашей работе мы исследовали изменение адгезивности эпителиальных
клеток слизистых оболочек в отношении микроорганизмов под воздействием
факторов экзо - и эндогенной природы. Для оценки способности эпителиоцитов
45
вступать в адгезивные контакты, использовалась экспериментальная тест-система
«искусственная колонизация C. albicans на буккальных клетках in vitro» (рис.7.).
кандиды
ядро эпителиоцита
Рис 7. Искусственная колонизация буккальных эпителиоцитов клетками
С.albicans штамм 601 (увеличение  800, окраска азуром А).
Для этого, эпителиоциты инкубировали (37°С, 30 мин) с эндогенными или
экзогенными факторами, отмывали от несвязавшихся кандид (см.п.2.6.). Из осадка
клеток готовили мазки.
Подсчитывали количество кандид, закрепившихся на
одном эпителиоците. Определяли индекс искусственной колонизации C. albicans
как среднее количество адгезированных кандид на один эпителиоцит (канд/эп),
после микроскопии 100 эпителиальных клеток.
3.1.1. Влияние женских половых гормонов на адгезивность эпителиоцитов в
системах с C. albicans
Гормональные изменения, регулярно происходящие в организме женщины,
влияют на фунциональную активность эпителиоцитов [Beagley K. et all.,2003;
Coleman H. et all., 2001]. Имеются данные, что изменение гормонального фона
изменяет чувствительность эпителия к кандидам. [Тютюнник В.Л. и др., 2013;
Бурменская О.В.и др.,2011;Лебедева Т.Н. 2004]. Поэтому важно учитывать фазу
менструального цикла и соответственно гормональное влияние на эпителиоциты
слизистых оболочек различных биотопов [Служаев И.Ф. и др., 2004; Fahey J.V. et
all,2005; Сапронова Е.А.и др., 2003].
46
Было проведено сравнение действия основных гормонов, регулирующих
менструальный цикл у женщин:
прогестерон, ФСГ, ЛГ, эстрадиол,
эстриол,
тестостерон, ХГЧ − на возможность эпителиоцитов слизистых оболочек ротовой
полости вступать в адгезивные контакты с C.albicans in vitro (табл.4, рис.8).
Инкубация
эпителиальных
клеток
ротовой
полости
с
эстрадиолом,
эстриолом, тестостероном и ХГЧ приводила к подавлению адгезии кандид в 1,29 ±
0,2; в 1,4 ± 0,3; в 1,29 ± 0,3; в 1,42 ± 0,2 раз соответственно (р <0,05) (см. табл 4). В
то же время, обработка эпителиоцитов прогестероном и ЛГ повышала адгезию
C.albicans на буккальных клетках в 1,26 ± 0,2; в 1,31 ± 0,1 раз (р <0,05). Обработка
эпителиоцитов ФСГ не приводила к изменению адгезивности клеток (р <0,05). (см.
табл. 4). Таким образом, адгезивная эпителиоцитов изменяется в разные периоды
менструального цикла, в результате работы разных гормонов.
Таблица №4
Влияние гормонов репродуктивного цикла женщин на адгезивные взаимодействия
буккальных эпителиоцитов с C. albicans штамм 601, М ± m
Гормоны
ЛГ
Прогестерон
ФСГ
Эстрадиол
Эстриол
Тестостерон
ХГЧ
Показатель адгезии (канд/эпит)
Контроль:
интактные
эпителиоциты
(канд/эпит)
Эпителиоциты,
обработанные
гормонами до
контакта с
C.albicans
(канд/эпит)
3,6 ± 0,2
6,5 ± 0,4
5,1 ± 1,1
4,9 ± 0,3
8,3± 0,5
6,0 ± 0,9
3,7 ± 0,4
4,7 ± 0,2*
8,2 ± 0,3*
5,2 ± 0,6
3,8 ± 0,2*
5,7 ± 1,1*
5,4 ± 0,6*
2,6 ± 0,2*
Кратность
изменения
показателя
адгезии
относительно
контроля
(количество
раз)
1,31 ± 0,1*
1,26 ± 0,2*
0,90 ± 0,1
1,29 ± 0,2*
1,40 ± 0,3*
1,29 ± 0,3*
1,42 ± 0,2*
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
Снижение (↓)
или
увеличение (↑)
уровня
адгезии кандид
на
эпителиоцитах
относительно
контроля
↑
↑
≈
↓
↓
↓
↓
47
+
*
*
*
*
*
*
−
Рис.8. Влияние половых гормонов на способность буккальных эпителиоцитов
адгезировать C. albicans; по оси ординат: «+» - увеличение показателя, «−»
- снижение показателя.
Условные обозначения: ЛГ-лютеинизирующий гормон, ПГ-прогестерон,
ФСГ фолликулостимулирующий гормон, ЭД - эстрадиол, ЭС-эстриол, ТС тестостерон, ХГЧ - хориониический гонадотропин.
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
Та же схема была использована и в экспериментах с
эпителиоцитами.
Было
проведено
сравнение
вагинальными
способности буккальных и
вагинальных клеток, прединкубированных с гормонами, к адгезивным контактам
с C.albicans (табл. 5, рис.9).
Таблица №5
Влияние гормонов на адгезивные
взаимодействия буккальных и
вагинальныхклеток с C. albicans при разных режимах обработки эпителиоцитов, М
±m
Гормоны
Кратность изменения индекса искусственной
колонизации эпителиоцитов (количество раз)
Корреляция
(r)
Обработка
гормонами
буккальных
эпителиоцитов
до контакта
Обработка
гормонами
буккальных
эпителиоцитов
в процессе
Обработка
гормонами
вагинальных
эпителиоцитов
до контакта
48
с C. albicans
ЛГ
Прогестерон
ФСГ
Эстрадиол
Эстриол
Тестостерон
ХГЧ
1,31 ± 0,1 * ↑
1,26 ± 0,2 * ↑
0,90 ± 0,2
1,29 ± 0,2 * ↓
1,40 ± 0,3 * ↓
1,29 ± 0,3 * ↓
1,42 ± 0,2 * ↓
контакта
с C. albicans
2,59 ± 0,1*/** ↑
1,34 ± 0,1 * ↑
1,40 ± 0,1
1,60 ± 0,2 * ↓
1,36 ± 0,3 * ↓
1,80 ± 0,2 * ↓
1,60 ± 0,3 * ↓
с C. albicans
1,28 ± 0,1
1,17 ± 0,1
1,11 ± 0,3
1,25 ± 0,2
1,61 ± 0,3
1,27 ± 0,2
1,38 ± 0,3
*
*
*
*
*
↑
↑
↓
↓
↓
↓
0,82
0,71
0,81
0,76
0,83
0,82
0,71
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
Эксперименты показали сходное по направлению изменение адгезивности
у буккальных и вагинальных эпителиоцитов в отношении кандид под влиянием
гормонов (р > 0,05) ( рис. 9). Изменения имели сильную корреляцию от 0,71 до
0,83 (см. табл.5).
Отсутствие различий в адгезивности эпителиоцитов из разных биотопов
(вагинальная, оральная полости) позволило сделать вывод об
однотипной
реактивности мукозальных клеток человека в системах с кандидами. В связи с
этим, в последующих экспериментах использовали тест-системы только с
буккальными эпителиоцитами.
49
рис.9.
Влияние женских половых гормонов на изменение адгезивности
взаимодействия буккальных и вагинальных эпителиоцитов к C. albicans
штамм 601 in vitro
Условные обозначения:
ЛГ - лютеинизирующий гормон,
ПГ
прогестерон, ФСГ - фолликулостимулирующий гормон, ЭД - эстрадиол,
ЭС - эстриол, ТС - тестостерон, ХГЧ - хориониический гонадотропин
Для оценки возможного изменения адгезивности эпителиоцитов уже после
контакта с кандидами проводили дополнительную серию экспериментов по
исследованию
влияния гормонов на способность буккальных эпителиоцитов
удерживать прикрепившиеся к ним C. albicans (табл.6, рис. 10).
Адгезивность эпителия в процессе их контакта с кандидами также
изменяется на фоне действия различных половых гормонов. Эстрадиол, эстриол,
тестостерон и ХГЧ приводили к снижению адгезии в 1,60 ± 0,2; 1,36 ± 0,3; 1,80 ±
0,2; 1,60 ± 0,3 раз соответственно (р < 0,05). А ЛГ и прогестерон, напротив
способствовали увеличению адгезии кандид на эпителиоцитах 2,59 ± 0,1; 1,34 ± 0,1
раз соответственно (р < 0,05) (табл. 6, рис.10).
Кроме того существенное усиление адгезивности эпителиоцитов во время
контакта с микробом под влиянием ЛГ. Это может указывать на то, что данный
гормон (ЛГ) и кандиды могут
обладать костимулирующим эффектом
в
отношении экспрессии адгезивных молекул на букаальных клетках.
Таблица 6
Влияние женских половых гормонов на адгезивность буккальных клеток к
C. albicans штамм 601 при разных режимах обработки эпителиоцитов, М ± m
Гормоны
ЛГ
Обработка гормонами
эпителиоцитов до контакта с
C. albicans
Кратность
Снижение (↓)
изменения
или
индекса
увеличение (↑)
искусствен- адгезивности
ной
эпителиоцитов
колонизации
(количество
раз)
1,31 ± 0,1*
↑
Обработка гормонами
эпителиоцитов в процессе
контакта с C. albicans
Кратность
Снижение (↓)
изменения
или
индекса
увеличение (↑)
искусственадгезивности
ной колон
эпителиоцитов
изации
(количество
раз)
2,59 ± 0,1*/**
↑
50
Прогестерон 1,26 ± 0,2*
↑
1,34 ± 0,1*
↑
ФСГ
0,90 ± 0,2
1,40 ± 0,1
Эстрадиол
1,29 ± 0,2*
1,60 ± 0,2*
↓
↓
Эстриол
1,40 ± 0,3*
1,36 ± 0,3*
↓
↓
Тестостерон 1,29 ± 0,3*
1,80 ± 0,2*
↓
↓
ХГЧ
1,42 ± 0,2*
1,60 ± 0,3*
↓
↓
* - достоверность отличий относительно необработанных эпителиоцитов
(контроль) (р < 0,05)
** - достоверность отличий относительно эпителиоцитов, обработанных до
контакта с C. albicans (р < 0,05)
Таким образом,
наши исследования
прогестерон, ФСГ, ЛГ, эстрадиол,
изменять
реактивность
C.albicans.
Зная, что
показали, что половые гормоны:
эстриол, тестостерон, ХГЧ — способны
эпителиоцитов
слизистых
изменение концентрации
оболочек
в
отношении
женских половых гормонов
наблюдается как во время менструального цикла, так и при беременности [Леонова
З.А., и др., 2013], можно предположить, что высокий уровень прогестерона,
характерный для состояния беременности и ЛГ, характерный для стадии овуляции,
повышают готовность мукозальных эпителиоцитов к адгезивным взаимодействиям
с кандидами. Это косвенно подтверждается исследованиями, указывающими на
увеличении
частоты
вагинального кандидоза среди беременных женщин
[Лебедева О.П.,и др., 2006].
51
+
*/**
*
*
*
* *
*
*
*
* *
*
−
Рис. 10. Среднее значение изменения уровня искусственной колонизации C.
albicans при разных режимах обработки буккальных эпителиоцитов
гормонами
- обработка гормонами эпителиоцитов до контакта с C. albicans
- обработка гормонами эпителиоцитов в процессе контакта с C. albicans
«+» - увеличение показателя; «−» - снижение показателя
Условные обозначения: ЛГ-лютеинизирующий гормон, ПГ-прогестерон, ФСГ фолликулостимулирующий гормон,
ЭД - эстрадиол,
ЭС - эстриол, ТС тестостерон, ХГЧ - хорионический гонадотропин.
* - достоверность отличий системы «эпителиоциты – C. albicans» относительно
эпителиоцитов (р < 0,05)
При этом, отметим, что вагинальный кандидоз
не
обязательно
сопровождается кандидозом полости рта. Это противоречие можно объяснить тем,
что микробная колонизация слизистых оболочек является не только результатом
контакта между эпителиоцитом и патогеном и патогеном, но также зависит от
механизмов клиренса (самоочищения) слизистых оболочек, а также конкуренции
C. albicans с облигатными представителями микробиоты данного биотопа
[Лебедева О.П.и др., 2006; Лебедева О.П. и др., 2007; Cannon R.D. et all,1999].
52
3.1.2. Влияние цитокинов на адгезивность эпителиоцитов в системах
с C. albicans
Известно, что цитокины IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α относятся к медиаторам,
запускающим и поддерживающим воспалительную реакцию [Хаитов Р.М. и др.,
2009], тогда как IFN-α и IFN-β образуются при вирусной инфекции, и
опосредованно участвуют в подавлении репликации вирусов, а IFN-γ обладают
иммунорегуляторной активностью [Ярилин А.А.,1999 ,Симбирцев А.С.,2004].
В работе оценивали влияние различных цитокинов IL-1 (IL-1β), IL-6, IL-8,
TNF-α, IFN-α на способность буккальных эпителиоцитов взаимодействовать с
C.albicans in vitro.
Прединкубация эпителиальных клеток с IFN-α приводила к снижению
адгезии в системе в 2,1 ± 0,3 раз (p<0,05). В то же время, обработка эпителиоцитов
IL-1, TNF-α, IL-6, IL-8 повышала адгезию C.albicans на буккальных клетках в 1,3 ±
0,1; 2,0 ± 0,2; 1,2± 0,1; 1,8 ± 0,5 раз соответственно по сравнению с контролем
(p<0,05) (табл 7, рис.11).
Таблица 7
Влияние цитокинов на адгезивные взаимодействия буккальных эпителиоцитов с
C. albicans штамм 601, М ± m
Цитокины
Показатель адгезии (канд/эпит) Кратность
изменения
показателя
адгезии
относительно
контроля
Увеличение(↑)
или
снижение (↓)
адгезии
кандид на
эпителиоцитах
относительно
контроля
интактные
Эпителиоциты,
эпителиоциты обработанные
(контроль)
цитокинами до
контакта с C.
albicans
(эксперимент)
IL-1
IL-6
6,62 ± 2,0
8,59 ± 2,7
8,83 ± 2,3 *
10,24 ± 2,8 *
1,3 ± 0,1 *
1,2 ± 0,1 *
↑
↑
53
IL-8
TNF- α
IFN- α
3,21 ± 1,1
5,04 ± 1,8
4,83 ± 1,0
5,52 ± 0,8 *
10,16 ± 2,2 *
2,31 ± 0,3 *
↑
↑
↓
1,8 ± 0,5 *
2,0 ± 0,2 *
2,1 ± 0,3 *
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
*
+
*
−
*
*
*
Рис.11. Влияние цитокинов на
способность буккальных эпителиоцитов
адгезировать C. albicans штамм 601;
по оси ординат:
«+» - увеличение показателя, «−» - снижение
показателя.
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
Проводили дополнительную серию экспериментов под влиянием цитокинов
на процесс взаимодействия буккальных эпителиоцитов с C. albicans (табл. 8,
рис.12).
Таблица 8
Влияние цитокинов на адгезивные взаимодействия буккальных клеток с
C. albicans при разных режимах обработки эпителиоцитов, М ± m
Цитокины
IL-1
IL-6
IL-8
Кратность изменения индекса искусственной колонизации
буккальных эпителиоцитов (количество раз)
Обработка цитокинами
Обработка цитокинами
эпителиоцитов до контакта
эпителиоцитов в процессе
с C. albicans (контроль)
контакта с C. albicans
1,3 ± 0,1 *
1,5 ± 0,1 *
↑
↑
1,2 ± 0,1 *
1,2 ± 0,15
↑
↑
1,8 ± 0,5 *
1,8 ± 0,7
↑
↑
54
TNF-α
IFN-α
↑
2,0 ± 0,2 *
2,1 ± 0,3 *
↑
1,9 ± 0,2 *
2,0 ± 0,8 *
↓
↓
* –
достоверность отличий относительно небработанных эпителиоцитов
(р< 0,05)
↑ - увеличение, ↓ - снижение адгезии
+
*
*
*
*
*
−
*
*
Рис.12.
Среднее значение изменения уровня искусственной колонизации C.
albicans при разных режимах обработки буккальных эпителиоцитов
цитокинами; по оси ординат:
«+» - увеличение показателя, «−» снижение показателя.
- обработка цитокинами эпителиоцитов до контакта с C. albicans
- обработка цитокинами эпителиоцитов в процессе контакта с C. albicans
* –
достоверность отличий относительно необработанных эпителиоцитов
(контроль) (р< 0,05)
Влияние провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, TNF-ɑ - в процессе
взаимодействия
также
приводили
к
увеличению
индекса
искусственной
колонизации, но только действие IL-1 и TNF-ɑ приводило к достоверному
увеличению адгезивности клеток (табл.8, рис.12).
Таким образом, цитокины способны влиять на функциональный статус
эпителиальных клеток, при этом разные группы цитокинов
могут оказывать
противоположные эффекты.
Эксперименты показали, что патологические процессы,
протекающие на
уровне слизистых оболочек и сопровождаемые синтезом большого количества
цитокинов [Серебренникова С.Н. и др., 2008],
участвующих
в развитии
воспалительной реакции: IL-1, IL-6, IL-8 и TNF-α – способны увеличивать риск
55
развития кандидоза. В то же время, цитокины обладающие опосредованной
противомикробной активностью - IFN-α - снижают возможность контаминации
эпителиоцитов C. albicans.
3.1.3. Влияние иммуномодуляторов на адгезивность эпителиоцитов
в системах с C. albicans
Известно,
что
иммуномодулирующие
препараты
способны
менять
функциональную активность клеток. Была проведена оценка способности
иммуномодулирующих препаратов различных групп (см. п.1.2.3.):
«Имудон»,
«Иммунал»,
«Ликопид» -
влиять на адгезивность буккальных эпителиоцитов в отношении
кандид.
Для
этого,
«Рибомунил»,
буккальные
«Гриппферон»,
«Деринат»,
эпителиоциты
«Полиоксидоний»,
обрабатывали
растворами
иммуномодулирующих препаратов (терапевтическая доза, 30 мин, 37°С), отмывали
ЗФР. В контроле вместо иммуномодуляторов использовали ЗФР. Равные объёмы
взвеси эпителиоцитов и C. albicans штамм 601 инкубировали 30 мин при 37° С,
затем отмывали от неприкрепившихся кандид (см. п.2.5.) Из осадка отмытых
эпителиальных клеток готовили мазки.
Посчитывали индекс искусственной
колонизации C. albicans как среднее количество адгезированных кандид в
пересчёте на один эпителиоцит (канд/эп).
Было
установлено,
что
прединкубация
буккальных
иммуномодулирующими препаратами: «Деринат», «Имудон»,
«Рибомунил»,
«Гриппферон»,
«Полиоксидоний»
приводила
клеток
с
«Иммунал»,
к
изменению
адгезивности в диапазоне от 1,2 ± 0,2 и до 2,1 ± 0,7 раз (табл.9, рис. 13). Также,
было отмечено, что прединкубация буккальных клеток с препаратом «Ликопид»
приводила к незначительному снижению адгезивности кандид к эпителиоцитам
(p>0,05).
На
следующем
этапе
проводили
серию
экспериментов
влияния
иммуномодуляторов на процесс взаимодействия буккальных эпителиоцитов с C.
albicans in vitro. Для этого, взвесь эпителиоцитов, кандид и иммуномодулирующих
препаратов (в терапевтической дозе) инкубировали совместно (30 мин, 37° С),
56
после чего отмывали ЗФР от неприкрепившихся кандид.
В контроле вместно
иммуномодуляторов использовали ЗФР. Из отмытых клеток (осадок) готовили
мазок, определяли индекс искусственной колонизации (канд/эп.).
Таблица 9
Влияние иммуномодулирующих препаратов на адгезивные
буккальных эпителиоцитов с C. albicans штамм 601, М ± m
Показатель адгезии
(канд/эпит)
Группы
иммуномодулирующих
препаратов
Необрабо
танные
эпителио
циты
(контроль)
взаимодействия
Кратность
изменения
показателя
адгезии
относи
тельно
контроля
Увеличени
е
(↑) или
снижение
(↓)
адгезии
кандид
на
эпителиоцитах
относи
тельно
контроля
Эпителио
циты,
обработан
ные до
контакта с
C. albicans
1. Содержащие бактериальные
компоненты (рибосомы, лизаты)
Рибомунил
Имудон
2,9±1,5
6,4±2,1
1,9±0,9*
3,1±1,2*
1,7±0,5*
2,1±0,7*
↓
↓
8,5±2,5
5,6±1,2*
1,6±0,4*
↓
4,5±1,5
3,5±1,7*
1,6±0,4*
↓
1,9±0,5
4,5±0,5
1,7±0,6
3,1±0,8*
1,2±0,2
1,7±0,4*
≈
↓
2. Растительного происхождения
(Echinácea purpúrea)
Иммунал
3. На основе нуклеиновых кислот
Деринат
4. Синтетические препараты
Ликопид
Полиоксидоний
5. Цитокины ( рекомбинантный
интерферон)
5,3±2,1
2,9±1,1*
1,8±0,6*
↓
Гриппферон
* – достоверность отличий относительно необработанных эпителиоцитов
(контроль) (р< 0,05)
57
Было
выявлено,
что
иммуномодулирующие
препараты:
«Деринат»,
«Имудон», «Иммунал», «Рибомунил», «Гриппферон», «Полиоксидоний», также
влияли на процесс взаимодействия и приводили к снижению
искусственной колонизации
уровня
эпителиоцитов в диапазоне 1,2 до 2,1 раз по
сравнению с контролем (рис.14, табл. 10).
*
*
*
*
*
*
Рис.13. Влияние иммуномодулирующих препаратов на способность буккальных
эпителиоцитов адгезировать C. albicans
* –
достоверность отличий относительно необработанных эпителиоцитов
(контроль) (р< 0,05)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*/**
Кратность уменьшения искусственной колонизации C.albicans на буккальных
эпителиоцитах (количество раз)
58
Рис.14. Среднее значение изменение уровня искусственной колонизции C. albicans
при
разных
режимах
обработки
буккальных
эпителиоцитов
иммуномодулирующими препаратами.
- обработка иммуномодулирующими препаратами эпителиоцитов до контакта
с C. albicans
- обработка иммуномодулирующими препаратами эпителиоцитов в процессе
контакта с C. albicans
* - достоверность отличий относительно интактных эпителиоцитов (р < 0,05)
** - достоверность отличий относительно эпителиоцитов, обработанных до
контакта с C. albicans (р < 0,05)
Таблица 10
Влияние иммуномодулирующих препаратов
на процесс взаимодействия
буккальных эпителиоцитов и C. albicans штамм 601, М ± m
Показатель адгезии
(канд/эпит)
Группы
иммуномодулирующих
препаратов
Кратность
снижения
индекса
искусствен
ной
колониза
ции
(кол-во
раз)
Увеличен
ие
(↑) или
снижение
(↓)
адгезии
кандид
на
эпителиоцитах
относи
тельно
контроля
Необработан
ные
эпителиоци
ты(контроль)
Эпителио
циты,
обработан
ные во
время
контакта с
C. albicans
(экспери
мент)
4,3±0,4
2,9±1,1
2,2±0,3*
1,8±0,4*
2,1±0,3*
1,9±0,5*
↓
↓
6,1±1,2
3,4±1,1*
1,7±0,9*
↓
4,5±0,5
3,4±0,5*
1,5±0,3*
↓
1. Содержащие бактериальные
компоненты (рибосомы, лизаты)
Рибомунил
Имудон
2. Растительного происхождения
(Echinácea purpúrea)
Иммунал
3. На основе нуклеиновых кислот
Деринат
4. Синтетические препараты
59
Ликопид
Полиоксидоний
1,5±0,5
2,3±0,5
1,4±0,6
2,1±0,4*
1,2±0,3
1,6±0,8*
≈
↓
7,5±1,2
3,7±1,1*
2,0±0,8*
↓
5. Цитокины (рекомбинантный
интерферон)
Гриппферон
* –
достоверность отличий относительно необработанных эпителиоцитов
(контроль) (р< 0,05).
Исключением, как и в предыдущем случае,
представлял препарат «Ликопид»,
который гораздо слабее снижал адгезивную способность эпителиоцитов в системах
с C. albicans.
Таким образом, вещества с иммуномодулирующим эффектом
снижают
восприимчивость эпителиоцитов к кандидам и этот эффект наблюдается при их
добавление в тест-систему как до, так и во время взаимодействия эпителиальных
клеток с C. albicans. Отметим, что препарат «Рибомунил», дополнительно снижал
адгезивность
эпителиоцитов
к
кандидам,
если
был
добавлен
во
время
взаимодействия буккальных клеток с C. albicans.
Таким образом, все исследованные иммуномодулирющие препараты, через
регуляцию адгезивности эпителиоцитов позволяют
снижать риск контаминации
эпителия слизистых оболочек (ротовая полость)
представителями условно-
патогенной микрофлоры, такими как кандиды.
3.1.4. Влияние антисептических препаратов на адгезивные реакции
эпителиоцитов в системах с C. albicans
Эпителиоциты предварительно инкубировали с препаратами «Ксидифон»,
«Лизобакт», затем инкубировали с C.albicans (30 мин, 37°С). В отдельной группе
экспериментов изучали влияние антисептических препаратов на сам процесс
адгезии, для чего «Ксидифон», и «Лизобакт» смешивали с буккальными
эпителиоцитами и взвесью C.albicans, а затем инкубировали (30 мин, 37°С). В
контроле вместо препаратов использовали ЗФР. Эпителиоциты отмывали от
несвязавшихся кандид, из осадка клеток готовили мазки. Посчитывали индекс
60
искусственной колонизации C. albicans (канд/эп) (см. п.2.5). Результаты
представлены в табл. 11.
Таблица 11
Влияние антисептических препаратов на адгезивные взаимодействия буккальных
эпителиоцитов с C. albicans штамм 601, М ± m
Исследуемые
антисептические
препараты
Ксидифон
Лизобакт
Обработка препаратами
эпителиоцитов до контакта с C.
albicans
Обработка препаратами
эпителиоцитов в процессе
контакта с C. albicans
Кратность
снижения
индекса
искусственной
колонизации
(количество
раз)
Кратность
снижения
индекса
искусственной
колонизации
(количество
раз)
1,5 ± 0,3*
1,3 ± 0,1*
1,4 ± 0,2*
1,4 ± 0,3*
Снижение (↓)
адгезивности
эпителиоцитов
↓
↓
Снижение (↓)
адгезивности
эпителиоцитов
↓
↓
* - достоверность отличий относительно необработанных эпителиоцитов (р< 0,05)
*
*
*
*
Рис.15 Кратность снижения уровня искусственной колонизации C. albicans
при разных режимах обработки
буккальных эпителиоцитов
антисептическими препаратами «Лизобакт» и «Ксидифон»
* - достоверность отличий относительно необработанных эпителиоцитов (р< 0,05)
Обработка
препаратами
«Ксидифон»
и
«Лизобакт»
буккальных
эпителиоцитов приводили к снижению уровня искусственной колонизации
эпителиоцитов в: 1,4 ± 0,2 и 1,4 ± 0,3 соответственно (р<0,05) (табл. 11 рис.15).
61
Та же закономерность наблюдалась и при добавлении антисептиков в
процессе контакта эпителиоцитов с кандидами: «Ксидифон» снижал уровень
искусственной колонизации в 1,5 ± 0,3 раз,
а «Лизобакт» в 1,3 ± 0,1 раз
соответственно (р<0,05) (табл. 11 рис.15).
3.1.5. Влияние микробных метаболитов на адгезивность эпителиоцитов
в системах с C. albicans
Были проведены эксперименты с микробными метаболитами, полученными
от Candida
Staphylococcus
albicans штамм 601, Enterococccus faeсium штамм 179/2,
aureus штамм 5983,
Escherichia coli штамм 205 с целью
установления их влияния на способности
эпителиоцитов адгезировать
микробные клетки, такие как C. albicans.
Метаболические продукты S. aureus и E. faecium не изменяли уровень
искусственной колонизации кандид на эпителиоцитах: результаты адгезии были
приблизительно одинаковы в контроле и опыте: 11,3 ± 0,75 / 10,6 ± 0,99 и 4,86 ±
2,32 / 5,85 ± 2,06 соответственно (р < 0,05) (табл.12. рис.16).
Таблица 12
Влияние микробных метаболитов на адгезивные взаимодействия буккальных
эпителиоцитов с C. albicans штамм 601, М ± m
Цитокины
Показатель адгезии (канд/эп)
интактные
эпителиоциты
(контроль)
C. albicans 601
E. faecium 179/2
8,04 ± 3,04
4,86 ± 2,32
Кратность
увеличения
показателя
адгезии
относительно
контроля
( кол-во раз)
Эпителиоциты,
обработанные
микробными
метаболитами
(эксперимент)
10,52 ± 2,78 *
5,85 ± 2,06
1,43 ± 0,22 * ↑
1,12 ± 0,31
↑
62
S. aureus 5983
11,3 ± 0,75
10,6 ± 0,99
1,07 ± 0,30
E.coli 205
4,27 ± 2,41
6,14 ± 3,02
1,53 ± 0,47
* - достоверность отличий относительно контроля (р < 0,05)
↑
↑
*
Рис.16. Влияние микробных метаболитов C. albicans (штамм 601), E. faecium
(штамм 179/2) и S.aureus (штамм 5983) и E.coli (штамм 205) на изменение
уровня искусственной колонизации C. albicans на буккальных
эпителиоцитах.
* - достоверность отличий относительно контроля (р < 0,05)
Отсутствие
существенного
влияния
метаболитов
стафилококка
и
энтерококка на адгезивные свойства буккальных эпителиоцитов могло быть
связано с тем, что экзоферменты или другие активные эксретируемые продукты
метаболизма бактерий существенно не повреждали / не изменяли рецепторный
аппарат эпителиоцитов.
Метаболиты E.coli и C.albicans, напротив, способствовали усилению
способности эпителиальных клеток сорбировать кандиды. При этом обработка
эпителиоцитов продуктами метаболизма C.albicans приводила к существенному
повышению индекса искусственной колонизации. Так, среднее количество
кандид, закрепившихся на интактных эпителиоцитах составляло
8,04 ± 3,04
канд/эп, в то время как к эпителиоцитам, обработанным метаболитами кандид 10,52 ± 2,78
канд/эп. (р < 0,05). Можно предположить, что способность
метаболитов
усиливать контакты между клетками слизистых оболочек и
63
кандидами
можно
рассматривать
как
проявление
патогенности
данного
микроорганизма и его высокой адаптации к данному биотопу.
Полагаем, что повышение адгезивности буккальных клеток в присутствии
метаболитов C.albicans
может быть связано с увеличением экспрессии
дополнительных молекул, часть из которых задействована в контактах с
кандидами. В пользу этого предположения говорят также данные о том, что
обработка эпителиоцитов метаболитами кандид приводит к повышению
экспрессии toll-подобных рецепторов (см. п.3.3.6.).
_______
Таким образом, было установлено, что половые гормоны,
микробные
метаболиты
способны
влиять
на
цитокины и
функциональный
статус
эпителиоцитов слизистых оболочек, разнонаправлено меняя их адгезивность в
отношении
C.
albicans
in
vitro.
Тогда
как
обработка
иммуномодуляторами и оральными антисептиками in vitro
эпителиоцитов
всегда снижала
способность буккальных клеток к контактным взаимодействиям с C. albicans.
3.2 Участие внутриклеточных сигнальных систем в регуляции адгезивных
реакций буккальных эпителиоцитов
Одной из универсальных систем, обеспечивающей трансляцию сигнала от
клеточной поверхности на генетический аппарат клетки является система
регуляторов генной транскрипции - NF-kB [Baldwin A.S.,1996; Barnes P.J et
all.,1997; Caamano J. et all,2002; Маянский А.Н. и др.,2007].
В
передаче
сигнала с поверхности клетки на систему NF-kB также могут принимать участие
митоген-активированные киназы (МАРK) [Tato C. M., et all., 2002]. NF-kB, через
активацию соответствующих генов влияет на синтез цитокинов,
молекул межклеточной
хемокинов,
адгезии, HLA, белков острой фазы, индуцибельные
ферментов и рецепторов, участвуя, таким образом, в регуляции функций клетки.
В настоящем исследовании мы попытались установить взаимосвязь между
активностью NF-kB, МАР-киназ (p-38 и ERK1/2) и способностью эпителиоцитов
64
слизистых оболочек вступать в контактные взаимодействия с микроорганизмами,
с использованием тест-системы искусственной колонизации C. albicans.
Для
подавления
эпителиальных клетках
активации
транскрипционного
использовали
фактора
NF-kB
в
протеасомный ингибитор – ALLN
(«Sigma»,USA). Буккальные эпителиоциты (106 кл/мл) инкубировали с ALLN (90
мин, 37°С, 100 M). В контроле использовали интактные клетки (без ингибитора)
(см. п.2.8.1.).
Блокаду внутриклеточных MAP - киназ (ERK1/2 и p38) в
эпителиоцитах проводили путем прединкубации клеток (60 мин,37°С, 20M) со
специфическими ингибиторами U0126 («Sigma», США) или SB203580 («Sigma»,
USA) (см. п.2.8.2.). В контроле использовали интактные клетки. Искусственную
колонизацию C.albicans на буккальных эпителиоцитах производили методом,
описанным ранее (п.2.5.).
Эксперименты показали, что блокирование NF-kB в клетках человека
приводило к снижению уровня адгезии кандид на буккальных эпителиоцитах в 1,7
 0,6 раза и составляло 6,6  1,3 усл. ед. в контроле и 4,1  0,9 усл ед. в
экспериментах с ингибитором протеасом ALLN (p 0,05) (см. табл.13, рис. 17) .
Таблица 13
Влияние блокады нуклеарного фактора -kB и МАР - киназ в эпителиоцитах на их
способность к контактным взаимодействям с C.albicans штамм 601, М ± m
Внутриклеточные
сигнальные системы
(молекулы)
Показатели адгезии (усл. ед.)
6,60  1,30
после обработки
эпителиоцитов
соответствующими
ингибиторами
4,10  0,9 *
p38
6,24  0,64
7,81  1,03
ERK1/2
3,89 0,65
3,86 0,55
Необработанные
эпителиоциты
NF-kB
МАР киназы
65
*- достоверные отличия относительно контроля (p 0,05)
*
контроль
блокада контроль блокада
контроль
MAPNF-kB
киназы p-38
блокада
ERK 1/2
киназы
Рис. 17 Влияние блокады нуклеарного фактора kB и МАР - киназ на адгезию
буккальных эпителиоцитов с C.albicans
- необработанные эптелиоциты
- эпителиоциты после обработки ингибиторами метаболических путей
*- достоверные отличия относительно контроля (p 0,05)
При добавлении ингибитора p38 киназы к буккальным эпителиоцитам
наблюдалась некоторое увеличение индекса адгезии кандид:
6,24 
0,64
(контроль) и 7,81  1,03 (эксперимент ) усл.ед. (р  0,05). В то же время, ингибитор
ERK1/2-киназ не вызывал значимых изменений адгезии в системе по сравнению с
контролем: 3,89  0,65 и 3,86  0,55 усл.ед. соответственно (рис17).
Таким образом, было установлено, что активность системы NF-kB, возможно
чрез усиление экспрессии адгезивных молекул, способствует контактному
взаимодействию буккальных клеток с микроорганизмами, такими как C. albicans.
3.3. Условия и факторы, регулирующие экспрессию TLR-2 и TLR-4
на буккальных эпителиоцитах
66
Активация эпителиальных клеток возможна через toll-подобные рецепторы
(TLRs) [Naglik J.R., et all 2011а; McClure R., et all 2014]. Распознавание патогенассоциированных
молекулярных образов (PAMP) c помощью TLRs запускает
каскад внутриклеточных реакций, в результате чего меняется функциональная
активность эпителиоцитов, что может проявляться в виде усиления секреции
цитокинов, пептидных медиаторов, дифенсинов, ингибиторов провоспалительных
агентов, молекул главного комплекса гистосовместимости, молекул межклеточных
взаимодействий, цитокиновых и прочих рецепторов [Naglik J.R., et all 2011б].
В нашей работе мы исследовали «фоновую» экспрессию TLR-2 и TLR -4 у
буккальных эпиелиоцитов, а также
изменение экспрессии toll-подобных
рецепторов под влиянием эндогенных и экзогенных факторов стимулов в норме и
при патологии.
Эпителиоциты
субстанциями
предварительно
(гормоны,
цитокины,
инкубировали
с
иммуномодулирующие
исследуемыми
препараты,
антисептики, микробные метаболиты) в течение 30 мин, затем оценивали
количество жизнеспособных клеток в популяции, экспрессирующих toll-подобные
рецепторы, на проточном цитофлюориметре BD FACS Canto II System with Fluidics
Cart (6-color, blue/red, USA) (см. п.2.7). Живые клетки выявляли по их способности
не воспринимать краситель 7-AAD (7-амино-актиномицин D, BD Pharmingen,
USA). Экспрессию TLR-2 и TLR-4 оценивали у клеток жизнеспособного пула по
наличию на их поверхности CD 282 или CD 284 (BD Pharmingen, USA)
соответственно. Полученные результаты выражали в процентах, как отношение
числа клеток, презентирующих на своей поверхности
TLR-2, TLR-4 или
экспрессирующих одновременно оба рецептора, к общему числу жизнеспособных
эпителиоцитов.
3.3.1. Влияние половых гормонов на экспрессию toll - подобных рецепторов
буккальными эпителиоцитами in vitro
67
В экспериментах использовали
пул эпителиоцитов, полученных от 5-7
здоровых доноров. Ставили серию экспериментов, где часть пула инкубировали
отдельно с каждым из гормонов (прогестерон, эстрадиол, тестостерон, эстриол, ЛГ,
ХГЧ), затем замеряли экспрессию TLR-2 и TLR-4 рецепторов на проточном
цитофлюориметре. Одновременно оценивали число жизнеспособных клеток пула в
каждой серии. Контролем служили необработанные эпителиоциты.
Было отмечено, что экспрессия TLR-2 на нативных (необработанных)
буккальных эпителиоцитах была достаточно низкая (табл.14).
гормонов
Под воздействием
процент буккальных клеток, способных экспрессировать
TLR-2
дополнительно снижался, однако эти изменения были незначительны (р > 0,05)
(таблица 14, рис.18).
Общее
количество
TLR-4
–
позитивных
клеток
среди
нативных
(необработанных) буккальных эпителиоцитов было существенно выше, чем
экспрессирующих
TLR-2
(табл.15.).
Процент
буккальных
клеток,
экспрессирующих TLR-4 после обработки гормонами менялся незначительно (р
> 0,05) (таблица 15, рис.19).
Таблица №14
Процент буккальных эпителиоцитов, экспрессирующих TLR обработки гормонами in vitro, М ± m
Гормоны
Контроль
Прогестерон
Эстрадиол
Тестостерон
Эстриол
2 до и после
Буккальные эпителиоциты, экспрессирующие
(% клеток в популяции)
TLR-2
TLR-2 позитивные
клетки
TLR-2 /TLR-4 позитивные
клетки
Всего клеток,
экспрессирующих
TLR -2
0,1 ± 0,01
0,1 ± 0,01
0,2 ± 0,02
0,1 ± 0,02
0,1 ± 0,01
8,8 ± 2,3
5,6 ± 1,2
6,5 ± 2,2
6,1 ± 2,8
5,7 ± 2,2
8,9 ± 2,25
5,7 ± 1,22
6,7 ± 2,25
6,2 ± 2,84
5,8 ± 2,19
↓
↓
↓
↓
68
ХГЧ
ЛГ
0,1 ± 0,01
0,1 ± 0,01
5,7 ± 2,3
5,6 ± 1,9
5,7 ± 2,35 ↓
5,7 ± 1,89 ↓
↓ - снижение показателя
Рис.18 Влияние половых гормонов на экспрессию TLR-2 буккальными
эпителиоцитами, где ПГ-прогестерон, ЭД-эстрадиол, ЭС-эстриол, ХГЧхорионический гормон, ЛГ-лютеинизирующий гормон.
Таблица №15
Процент буккальных эпителиоцитов, экспрессирующих
обработки гормонами in vitro, М ± m
Гормоны
Контроль
Прогестерон
Эстрадиол
Тестостерон
TLR - 4 до и после
Буккальные эпителиоциты, экспрессирующие
TLR-4 (% клеток в популяции)
TLR-4 позитивные
клетки
TLR-2 /TLR-4 - Всего клеток,
позитивные
экспрессирующих
клетки
TLR -4
29,2 ± 4,3
36,3 ± 3,1
24,5 ± 4,2
28,5 ± 3,5
8,8 ± 2,3
5,6 ± 1,2
6,5 ± 2,2
6,1 ± 2,8
38,0 ± 6,4
41,9 ± 4,5
↑
31,0 ± 6,3 ↓
34,1 ± 6,1 ↓
69
Эстриол
ХГЧ
ЛГ
27,5 ± 2,1
39,8 ± 2,1
37,9 ± 5,0
5,7 ± 2,2
5,7 ± 2,3
5,6 ± 1,9
33,2 ± 4,4 ↓
45,5 ± 4,2
↑
43,5 ± 6,8
↑
↑- увеличение, ↓ - снижение показателя
Рис.19
Влияние половых гормонов на экспрессию TLR-4 буккальными
эпителиоцитами, где ПГ-прогестерон, ЭД-эстрадиол, ЭС-эстриол, ХГЧхорионический гонадотропный гормон, ЛГ-лютеинизирующий гормон.
Однако, мы обратили внимание на тенденцию к некоторому увеличению
общего процента
TLR-4-позитивных клеток после воздействия гормонов,
участвующих в обеспечении овуляции (ЛГ) и поддержании беременности
(прогестерона и ХГЧ). Возможно, именно с этим связано некоторое изменение
взаимоотношений
эпителиоцитов
слизистых
оболочек
с
представителями
нормальной (облигатной и факультативной микрофлоры), наблюдаемое у
беременных [Акопян Т.Э., 1996]. Отметим, что жизнеспособность эпителиоцитов
под воздействием гормонов существенно не изменялась, и даже - в ряде случаев незначительно увеличивался
процент живых клеток в пуле после проведения
мангипуляций. Так, жизнеспособных клеток в контроле было 66,7 ± 8,2 %, а после
70
воздействии прогестерона, эстрадиола, тестостерона, эстриола, ХГЧ и ЛГ – 67,0
±7,4; 77,5 ±7,8; 75,1 ±8,1; 76,2 ±7,6; 59,7±8,2; 61,2±7,9 % соответсвенно (р > 0,05).
Таким образом, воздействие эндогенных факторов, таких как половые
гормоны незначительно изменяло уровень экспрессии
TLR-2 и TLR-4
буккальными эпителиоцитами.
3.3.2. Влияние цитокинов на экспрессию toll – подобных рецепторов
буккальными эпителиоцитами in vitro
Изменения процента TLR-2 и TLR-4 - позитивных клеток после стимуляции
цитокинами IL-1, IL-6, IL-8,TNF-α и IFN-α представлены в табл.16 и рис.20..
Жизнеспособность клеток
после воздействия цитокинов не менялась и
оставалась высокой. Так, процент живых клеток в популяции был
92,1 ± 4,1% в
контроле (нативные эпителиоциты) и 90,3 ± 3,8; 90,5 ± 4,2; 85,8 ± 3,9; 92,1 ± 3,6;
95,1 ± 5,1 % после обработки IL-1, IL-6, IL-8,TNF-ɑ и IFN-ɑ,соответственно (р >
0,05). Добавление цитокинов к эпителиоцитам существенно не
влияли на
экспрессию ими TLR-2 (см. табл.16, рис.20.), за исключением IL-6, который
снижал количество TLR-2 позитивных клеток.
Таблица № 16
Процент буккальных эпителиоцитов, экспрессирующих TLR - 2 после обработки
цитокинами in vitro, М ± m
Цитокины
Буккальные эпителиоциты, экспрессирующие
TLR-2 (% клеток в популяции)
TLR-2 позитивные
клетки
Интактные
эпителиоциты
IL-1
IL-6
IL-8
TNF-α
IFN-α
TLR-2 /TLR-4 - Всего клеток,
позитивные
экспрессирующих
клетки
TLR -2
0,1± 0,01
1,0 ± 0,19
1,1 ± 0,
0,1 ± 0,01
0,1 ± 0,02
0,1 ± 0,01
0,2 ± 0,03
0,1 ± 0,01
0,8 ± 0,09
0,6 ± 0,03
1,1 ± 0,09
1,0 ± 0,02
0,8 ± 0,09
0,9 ± 0,1 ↓
0,7 ± 0,07 * ↓
1,2 ± 0,3
↑
1,2 ± 0,06
↑
0,9 ± 0,2 ↓
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
71
↑ - увеличение, ↓- снижение показателя
*
Рис.20 Влияние цитокинов на экспрессию TLR-2 буккальными эпителиоцитами.
* – достоверность отличий относительно контроля ( р< 0,05)
Отметим, что IL-6 также заметно влиял и на экспрессию TLR-4, тогда как
остальные цитокины практическит не изменяли процент TLR-4 –позитивных
клеток (табл.17, рис. 21).
Процент буккальных эпителиоцитов, экспрессирующих
обработки цитокинами in vitro, М ± m
Цитокины
Буккальные эпителиоциты, экспрессирующие
TLR-4 (% клеток в популяции)
TLR-4 позитивные
клетки
Интактные
эпителиоциты
IL-1
Таблица № 17
TLR - 4 до и после
TLR-2 /TLR-4 - Всего клеток,
позитивные
экспрессирующих
клетки
TLR -4
76,4 ± 3,3
1,0± 0,19
85,8 ± 4,0
0,8± 0,09
77,4± 3,47
86,6± 4,07 ↑
72
IL-6
IL-8
TNF-ɑ
IFN- ɑ
90,7 ± 2,0
84,8 ± 3,1
80,7 ± 5,2
76,1 ± 3,0
91,3± 2,05 *↑
85,9± 3,15 ↑
81,7± 5,23 ↑
76,9± 3,2 ↓
0,6± 0,03
1,1± 0,09
1,0± 0,02
0,8± 0,09
* – достоверность отличий относительно контроля ( р< 0,05)
↑ - увеличение, ↓- снижение показателя
*
Рис.21 Влияние цитокинов на экспрессию TLR-4 буккальными эпителиоцитами.
* – достоверность отличий относительно контроля ( р< 0,05)
Таким образом,
эксперименты показали, что среди всех
тестируемых
цитокинов, только IL-6 обладает способностью изменять экспрессию TLR-2 и
TLR-4 на букальных клетках.
3.3.3. Влияние иммуномодулирующих препаратов на экспрессию
toll–подобных рецепторов эпителиоцитов здоровых доноров in vitro
Определяли количество эпителиоцитов способных экспресиировать TLR-2
и TLR-4
после воздействия на клетки ряда иммуномодулирующих препаратов.
Проводили серию
предварительно
экспериментов, в каждом из которых эпителиоциты
инкубировали
с
препаратами
«Рибомунил»,
«Деринат»,
«Имудон», «Полиоксидоний», «Ликопид», «Иммунал», «Гриппферон» (см. п.
73
2.5.4.)
Затем, к буккальных эпителиоцитам
добавляли
антитела для
идентификации TLR-2 и TLR-4. Результаты представлены в таблице 18.
Таблица №18
Экспрессия TLR-2 на буккальных эпителиоцитах
иммуномодулирующими препаратами in vitro, М ± m
Группы
иммуномодулирующих
препаратов
Контроль (без препарата)
после
обработки
Буккальные эпителиоциты, экспрессирующие
TLR-2 (% клеток в популяции)
TLR-2 позитивные
клетки
0,1± 0,01
TLR-2 /TLR-4 позитивные
клетки
19,5 ± 2,1
Всего клеток,
экспрессирующ
их TLR -2
19,6± 2,3
1. Содержащие бактериальные
компоненты (рибосомы, лизаты)
Рибомунил
Имудон
0,4± 0,03
0,1± 0,01
23,9± 3,4
24,1± 3,6*
24,3± 3,43
24,2± 3,65
↑
↑
7,6± 0,04
38,3± 3,5
45,9± 3,52* ↑
1,5± 0,01
34± 2,9
35,5± 2,94* ↑
0,1± 0,03
0,1± 0,02
14,5± 2,5
6,8± 1,6
14,6± 2,54 ↓
6,9± 1,64* ↓
0,1± 0,01
5,5± 1,1
5,6± 1,15* ↓
2. Растительного
происхождения (Echinácea
purpúrea)
Иммунал
3. На основе нуклеиновых
кислот
Деринат
4. Синтетические /
полусинтетические препараты
Ликопид
Полиоксидоний
5. Цитокины (рекомбинантный
интерферон)
Гриппферон
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
↑ - увеличение, ↓- снижение показателя
Эксперименты показали, что иммуномодуляторы по - разному влияли на
экспрессию TLR-2 и TLR-4. Так, количество клеток, экспрессирующих TLR-2 под
влиянием препаратов «Иммунал» и «Деринат» значительно увеличиывалось (р<
0,05), тогда как «Полиоксидоний» и «Гриппферон» вызывали сниженения числа
TLR-2 - позитивных клеток (р< 0,05) (см. табл. 18, 19; рис.22, 23).
74
*
*
*
*
Рис.22 Влияние иммуномодулирующих препаратов на экспрессию TLR-2
буккальными эпителиоцитами
* – достоверность отличий относительно контроля (р < 0,05)
*
*
на
*
*
Рис.23 Влияние иммуномодулирующих препаратов на экспрессию TLR-4 на
буккальными эпителиоцитами
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
Таблица 19
Экспрессия TLR-4 на буккальных эпителиоцитах после обработки
иммуномодулирующими препаратами in vitro, М ± m
Группы
иммуномодулирующих
препаратов
Буккальные эпителиоциты, экспрессирующие
TLR-4 (% клеток в популяции)
TLR-4 -
TLR-2 /TLR-4 -
Всего клеток,
75
Контроль (без препаратов)
позитивные
клетки
76,2± 5,6
позитивные
клетки
19,5 ± 2,1
экспрессирующ
их TLR -4
95,7± 7,9
63,2± 4,9*
65,4± 4,8*
23,9± 3,4
24,1± 3,6*
87,1± 8,5 ↓
89,5± 8,2 ↓
1,5± 0,4
38,3± 3,5
39,8± 3,8* ↓
30± 3,2
34± 2,9
64± 6,3* ↓
44,1± 4,3
53,5± 4,6
14,5± 2,5
6,8± 1,6
58,6± 6,4 * ↓
60,3± 6,5* ↓
76,1± 5,1
5,5± 1,1
81,6± 6,4 ↓
1. Содержащие бактериальные
компоненты (рибосомы, лизаты)
Рибомунил
Имудон
2. Растительного
происхождения (Echinácea
purpúrea)
Иммунал
3. На основе нуклеиновых
кислот
Деринат
4.Синтетические/полусинтетичес
кие препараты
Ликопид
Полиоксидоний
5. Цитокины (рекомбинантный
интерферон)
Гриппферон
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
↑-увеличение, ↓- снижение показателя
Затетим, что изменение экспресcия TLR-2
эпителиоцитах
было схожим
под
- и TLR-4 на буккальных
воздействием иммуномодуляторов,
принадлежащих к одной химической группе (например, группа бактериальных
препаратов «Рибомунил»-«Имудон», группа синтетических/полусинтетических
препаратов «Полиоксидоний»-«Ликопид») (см. табл. 18, 19; рис.22, 23).Таким
образом, разные группы иммуномодуляторов способны разнонаправлено изменять
функциональную активность клеток через регуляцию экспрессию toll-подобных
рецепторов TLR-2 и TLR-4.
3.3.4. Влияние иммуномодулирующих препаратов на экспрессию
toll – подобных рецепторов буккальных эпителиоцитов у пациентов с
заболеваниями пародонта
76
Было произведено сравнение экспрессии toll-подобных рецепторов на
буккальных эпителиоцитах здоровых людей и пациентов с заболеваниями
пародонта (табл.20, рис.24, 25. 25а,б).
Таблица 20.
Процент
буккальных эпителиоцитов, экспрессирующих toll – подобных
рецепторов у здоровых людей и пациентов с заболеваниями пародонта, М ± m
Вариант
экспрессии
toll-подобных
рецепторов
на эпителиоцитах
Буккальные эпителиоциты,
экспрессирующие
toll-подобные рецепторы
(% клеток в популяции)
Кратность
снижения или
увеличения
процента toll –
позитивных
клеток (кол-во
раз)
здоровые
пациенты с
люди
заболеваниями
(контроль)
пародонта
только TLR-2
0,28 ± 0,01
1,91 ± 0,1*
6,7 ± 0,2*
только TLR-4
64,0 ± 10,2
26,72 ± 7,1*
2,4 ± 0,1*
TLR-2/ TLR-4
11,16 ± 5,2
27,32 ±10,2*
2,4 ± 0,2*
всего TLR-2-позитивных 11,44 ± 5,23
29,23 ±10,32 *
2,6 ± 0,2*
всего TLR-4-позитивных 75,16 ± 15,45
54,04 ±17,34 *
1,4 ± 0,1*
* – достоверность отличий относительно здоровых (контроль) (р < 0,05)
↑- увеличенияе, ↓- снижение показателя (р > 0,05)
↑
↓
↑
↑
↓
Было отмечено, у больных с хроническим пародонтитом процент клеток
экспрессирующих
TLR-2 увеличивается в 6,7 ± 0,2 (р < 0,05),
уменьшалась в 2,4 ± 0,1 раза (р < 0,05).
а
TLR-4 –
Доля клеток экспрессирующих оба
варианта рецепторов возрастала в 2,4 ± 0,2 раза (р < 0,05), количество клеток не
экспрессирующих ни один из этих рецепторов также увеличивалось (рис.26 а, б).
Таким образом, экспрессия TLR-2 и TLR-4
эпителиальными клетками
разнонаправлено изменяется при пародонтите. У пациентов с воспалительным
заболеванием тканей пародонта
увеличивается количество эпителиоцитов,
экспрессирующих TLR-2 , а TLR-4 – уменьшается.
77
*
*
*
*
*
Рис. 24. Общее количество TLR-4 и TLR-2 – позитивных буккальных
эпителиоцитов у пациентов с заболеваниями пародонта до (контроль) и
после обработки иммуномодулирующими препаратами
- общая фракция TLR-4- позитивных клеток
- общая фракция TLR-2- позитивных клеток
* – достоверность отличий относительно контроля (р < 0,05)
*
*
*
*
*
*
*
*
Рис 25. Общее количество TLR-4 и TLR-2 – позитивных буккальных
эпителиоцитов у здоровых доноров до (контроль) и после обработки
иммуномодулирующими препаратами.
- общая фракция TLR-4- позитивных клеток
- общая фракция TLR-2- позитивных клеток
* – достоверность отличий относительно контроля (р < 0,05)
78
а
б
в
Рис. 26 Процент буккальных эпителиоцитов, экспрессирующих TLR-2 и TLR-4 в
популяции здоровых доноров (а),
у пациентов с заболеваниями
пародонта (б), после обработки эпителиоцитов больных людей
препаратом «Имудон» in vitro (в).
79
На следующем этапе оценивали изменение уровня экспрессии toll-подобных
рецепторов эпителиальными клетками пациентов с заболеваниями пародонта под
влиянием иммуномодулирующих препаратов.
Обработка эпителиоцитов от больных пародонтитом иммуномодуляторами
in
vitro
показала
следующее:
все
иммуномодулирующие
препараты,
за
исключением препарата «Деринат», не меняли существенно способности клеток
экспрессировать TLR-2. Деринат способствовал увеличению количества TLR-2
позитивных клеток в 2 раза (p<0,05)(рис.24).В то же время, при определении
числа клеток, экспрессирующттх
TLR-4, было установлено, что препараты
«Ликопид», «Иммунал», «Деринат» и
«Полиоксидоний» заметно снижали
спообность к экспрессии данного рецептора(p<0,05) (рис.24).
Изменение процента эпителиоцитов экспрессирующих TLR-2 и TLR-4 при
патологии
слизистых
оболочек
полости
предположить следующее. Экспрессия
связана
с уровнем возбужденности
рта
пародонтите
TLR-2 (в норме низкая)
позволили
может быть
клеток, поскольку увеличивается
патологических состояниях. С другой стороны,
высокая)
-
при
экспрессия TLR-4 (в норме
снижается при заболевании, это указывает на то, что данный признак
связан с возможностью клетки отвечать на стимулы, т.е. отражает ее реактивность
(рис.24,25).
Отметим, что на снижении реактивности клеток при парадонтите
указывает также и то, что количество TLR-2-/ TLR-4 - негативных клеток (не
способных экспрессировать данные TLRs) резко увеличивается при данной
патологии (рис. 2 а,б).
Изменение
общего
процента
буккальных
клеток
в
популяции,
экспрессирующих TLR-2 или TLR-4 (с учетом клеток, экспрессирующих TLR-2/
TLR-4) под действием иммуномодуляторов было слабее выражено у больных с
парадонтитом, чем
у здоровых (рис.24, 25, рис 26 а, б, в). Это связано, по-
видимому, с тем, что уже значительный процент буккальных клеток подвергся
ранее воздействию со стороны эффекторов воспаления, что могло
повысить
уровень возбуждения (активность) эпителиоцитов, и одновременно понизить их
способность отвечать на стимулы (реактивность).
80
* *
*
*
*
*
*
*
Рис.27
Количество буккальных эпителиоцитов, способных экспрессировать
только TLR-4 или TLR-2 у пациентов с заболеваниями пародонта до
(контроль) и после обработки иммуномодулирующими препаратами.
- TLR-4- позитивные клетки
- TLR-2- позитивные клетки
*
*
*
*
*
*
Рис 28. Количество буккальных эпителиоцитов, способных экспрессировать
только TLR-4 или TLR-2 у здоровых доноров до и после обработки
иммуномодулирующими препаратами.
- TLR-4- позитивные клетки
- TLR-2- позитивные клетки
81
Рис.29 Количество, клеток, экспресиирующих TLR-4 в популяции больных
с пародонтитом под влиянием иммуномодуляторов.
- общий процент TLR-4 (TLR-4 ,TLR-4/2) - позитивных клеток (%)
- процент, клеток, экспрессирующих только TLR-4 (%)
Рис.30 Количество, клеток, экспресиирующих TLR-2 в популяции больных
с пародонтитом под влиянием иммуномодуляторов.
- общий процент TLR-2 (TLR-4 ,TLR-4/2) - позитивных клеток (%)
- процент, клеток, экспрессирующих только TLR-2 (%)
82
Проанализировав полученные результаты, мы обратили внимание на то,
чтобы дать оценку направления изменений, которые вызывает иммуномодулятор в
клетках
при
патологии,
удобнее
рассматривать
на
примере
фракций
эпителиоцитов, экспрессирующих только TLR-2 или только TLR-4 (без учета
клеток экспрессирующих оба рецептора TLR-2 / TLR-4), поскольку изменения в
этих фракциях резче выражены (рис.27,28).
Основанием для подобного мнения могут
послужить наши
результаты,
показывающие, что иммуномодуляторы вызывают однонаправленные колебания
количества клеток как в общей фракции эпителиоцитов, экспрессирующих TLR-2
или TLR-4 (с учетом TLR-2/ TLR-4)
так и в отдельных «малых» фракциях,
которые экспрессируют только один из TLR (рис. 29, 30).
3.3.5. Влияние антисептических препаратов на экспрессию toll – подобных
рецепторов буккальными эпителиоцитами in vitro
В
экспериментах
эпителиоциты
предварительно
инкубировали
с
антисептическими препаратами, рекомендуемыми для обработки слизистых
оболочек: «Лизобакт» и «Ксидифон».
Процент клеток, экспрессирующих TLR-4 существенно не изменяется под
влиянием антисептических препаратов (табл. 21, рис.31).
Экспрессия TLR-4 на буккальных эпителиоцитах
антисептическими препаратами in vitro, М ± m
Антисептические
препараты
Буккальные эпителиоциты, экспрессирующие
TLR-4 (% клеток в популяции)
TLR-4позитивные
клетки
Контроль
Лизобакт
Ксидифон
Таблица № 21
после обработки
80,8 ± 7,5
88,3 ± 7,2
71,5 ± 7,9
TLR-2 /TLR-4 - Всего клеток,
позитивные
экспрессирующих
клетки
TLR -4
15,5± 0,5
8,2± 0,6
22,8± 1,5
96,3± 7,8
96,5± 8,2
94,3± 9,1
83
В отношении TLR-2 наблюдали незначительное снижении экспрессии
toll–
подобных рецепторов под влиянием препарата «Лизобакт» и некоторое увеличение
количества TLR-2-позитивных клеток под действием препарата «Ксидифон» (р>
0,05) (табл. 22, рис.31).
Экспрессия TLR-2 на буккальных эпителиоцитах
антисептическими препаратами in vitro, М ± m
Антисептические
препараты
Контроль
Лизобакт
Ксидифон
Таблица №22
после обработки
Буккальные эпителиоциты, экспрессирующие
TLR-2 (% клеток в популяции)
TLR-2позитивные
клетки
TLR-2 /TLR-4 - Всего клеток,
позитивные
экспрессирующих
клетки
TLR -2
0,1± 0,01
0,1± 0,01
0,1± 0,01
15,5± 0,5
8,2± 0,6
22,8± 1,5
15,6± 0,53
8,3± 0,62 ↓
22,9± 1,53
↑
↑ -увеличение, ↓ - снижение показателя
TLR-2
контроль
Лизобакт Ксидифон
TLR-4
контроль Лизобакт
Ксидифон
Рис.31 Влияние антисептических препаратов на экспрессию TLR-2 и
буккальными эпителиоцитами
TLR-4
84
Таким
образом,
антисептические
препараты,
рекомендуемые
к
использованию для орошения полости рта, не меняют функциональную активность
клеток по уровню экспрессии toll – подобных рецепторов. Примечательно, что
подсчет количества живых клеток после воздействия антисептиков показал, что
«Лизобакт» не влиял (р> 0,05) на жизнеспособность эпителиоцитов, тогда как
«Ксидифон» заметно (р< 0,05) поддерживал высокое число живых клеток в
популяции по сравнению с контролем: 49,9± 8,5 % живых клеток («Лизобакт»),
71,2± 6,2% («Ксидифон») и 6,7± 7,5 % (контроль). Возможно, это связано с тем,
этидроновая кислота, входящая в состав препарата «Ксидифон», обладает
мембранопротекторным свойством [Лукоянова Т.В.,2011].
3.3.6. Влияние микробных метаболитов на экспрессию toll – подобных
рецепторов буккальными эпителиоцитами in vitro
Известно, что экспрессия TLR может меняться в присутствии различных
микроорганизмов
[McClure
микроорганизмов
R.,
et
регулировать
all
2014].
экспрессию
Для
оценки
способности
toll-подобных
рецепторов,
использовали метаболиты кандид и бактерий разных видов: C.albicans штамм 601,
C.glabrata штамм 441, C. krusei штамм 583, S. aureus штамм 5983,
штамм 179/2 и
E.coli штамм 205. Буккальные эпителиоциты
E.faecium
обрабатывали
микробными метаболитами в течение 30 мин при 37°С (см.п.2.6.1.),
затем
добавляли антитела для выявления TLR-2 b TLR-4.
Результаты
показали,
что
микробные
продукты
не
влияли
на
жизнеспособность клеток. Так, в контроле процент жизнеспособных клеток был
78,85 ± 7,6 %, а после воздействия метаболитами C.albicans, C. glabrata, C.krusei,
S.aureus,
E.faecium,
E.coli-
86,66
±
8,2;
88,19
±
6,3;
90,10
±
7,6;
86,21 ± 7,8; 99,56 ± 8,5; 87,78 ± 8,4 % соответсвенно (р> 0,05).
Эксперименты позволили установить, что метаболиты всех исследуемых
бактерий: S. aureus, E. faecium и E.coli – подавляли клеточную экспрессию TLR-
85
2,
что проявлялось в снижение процента TLR-2–позитивных эпителиоцитов в
популяции (табл. 23, рис.32).
Таблица №23
Экспрессия TLR-2 на буккальных эпителиоцитах после обработки микробными
метаболитами in vitro, М ± m
Метаболиты
бульонных культур
микроорганизмов
контроль (бульон
Сабуро/TSB)
C. albicans 601
C.glabrata 44
C. krusei 583
S. aureus 5983
E. faecium 179/2
E. coli 205 (lact+)
Буккальные эпителиоциты, экспрессирующие
TLR-2 (% клеток в популяции)
TLR-2позитивные
клетки
TLR-2 /TLR-4 - Всего клеток,
позитивные
экспрессирующих
клетки
TLR -2
1,1 ± 0,3
27,4 ± 2,5
28,5 ± 2,8
1,4 ± 0,2
1,6 ± 0,3
1,7 ± 0,3
2,4 ± 0,5
0,4 ± 0,2
1,1 ± 0,3
32,7 ± 3,1
32,4 ± 2,7
35,9 ± 3,3
17,1 ± 2,9
15,2 ± 2,3
18,3 ± 2,1
34,2 ± 3,3
34,0 ± 3,0
37,6 ± 3,6
19,5 ± 3,4
15,6 ± 2,5
19,4 ± 2,4
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
↑- увеличение, ↓ - снижение показателя
*
*
*
*
*
*
*
*
↑
↑
↑
↓
↓
↓
86
Рис.32 Влияние микробных метаболитов на экспрессию TLR-2 - рецепторов
буккальных эпителиоцитов in vitro.
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
Так, действие метаболитов S. aureus уменьшало общее количество
TLR -2-
позитивных клеток в 1,46 раза (р< 0,05); а метаболитов E.faecium и E.coli в 1,83
и
1,47
раз соответственно (р< 0,05).
В то же время,
различных видов: C. albicans , C.glabrata,
метаболиты кандид
C. krusei – усиливали способность
эпителиоцитов к экспрессии TLR-2, причем для экспериментов с супернатантами
C. krusei эти измения носили выраженный характер, увеличивая процент TLR-2
позитивных клеток с 28,5 ± 2,8% (контроль) до 37,6 ± 3,6 (р< 0,05) ( см. табл.
23, рис.32) .Похожие результаты были получены и при оценке экспрессии TLR-4
(табл. 24, рис.33).
Таблица №24
Экспрессия TLR-4 на буккальных эпителиоцитах после обработки микробными
метаболитами in vitro, М ± m
Метаболиты
бульонных культур
микроорганизмов
контроль (бульон
Сабуро/TSB)
C. albicans 601
C.glabrata 441
C. krusei 583
S. aureus 5983
E. faecium 79/2
E. coli 205 (lact+)
Буккальные эпителиоциты, экспрессирующие
TLR-4 (% клеток в популяции)
TLR-4позитивные
клетки
TLR-2 /TLR-4 - Всего клеток,
позитивные
экспрессирующих
клетки
TLR -4
63,35 ± 7,2
27,4 ± 2,5
90,7 ± 7,6
64,76 ± 8,3
63,60 ± 7,5
58,58 ± 6,9
45,91 ± 6,5
53,71 ± 7,1
69,31 ± 9,1
32,7 ±
32,4 ±
35,9 ±
17,1 ±
15,2 ±
18,3 ±
97,5
96,0
94,5
63,3
68,9
87,6
3,1
2,7
3,3
2,9
2,3
2,1
* – достоверность отличий относительно контроля (р < 0,05)
↑- увеличение, ↓ - снижение показателя
±
±
±
±
±
±
8,2
↑
7,8
↑
7,2
↑
7,8 * ↓
8,5 * ↓
8,4
↓
87
Метаболиты бактерии преимущественно подавляли экспрессию TLR-4 на
буккальных клетках: в экспериментах с супернатантами S. aureus и E.faecium
процент TLR-4 – позитивных клеток существенно уменьшалось: в 1,43 и 1,32 раз
соответственно (р < 0,05); эксперименты с метаболитами E. coli имели такую же
тенденцию, но оказывали менее выраженный эффект (р> 0,05). В то же время,
*
*
Рис.33 Влияние микробных метаболитов на экспрессию TLR-4 буккальных
эпителиоцитов.
метаболиты кандид приводили к незначительному увеличению процента TLR-4 –
позитивных эпителиоцитов в популяции (p>0,05).
Таким образом, результаты показали, что представители кандиды и бактерии,
обладают разными механизмами регуляции экспрессии TLR-2 и TLR-4 на
эпителиальных клетках слизистых оболочек. Поскольку регуляция экспрессии tollподобных рецепторов эпителиальных клеток ротовой полости является одним из
механизмов, сопряженных со
стимуляцией местного и общего иммунитета
[Weindel G. et all., 2010], то, по-видимому, представители фунгальной и
бактериальной микрофлоры могут вносить разный вклад в этот процесс.
88
Кроме
того,
нами
были
отмечены
однонаправленные
реактивности рецепторного аппарата буккальных эпителиоцитов
изменения
и количества
TLR-4 - позитивных клеток под действием микробных метаболитов. При этом
направление изменений определялись, в первую очередь, видом микроорганизма и
его принадлежностью к одной из категорий - к микромицетам или бактериям
(рис.34).
Канд./эпит.
% TLR-4 + клеток
- уровень искусственной колонизации
- Процент TLR-4 + клеток
Рис.34 Влияние метаболитов микроорганизмов на экспрессию TLR-4
буккальными эпителиоцитами
и уровень искусственной колонизации
________
Таким образом, было установлено, что
экзогенные факторы,
такие как
иммуномодулирующие и антисептические препараты, а также микробные
метаболиты, в большей степени, меняют экспрессию TLR-2 и TLR-4 на
буккальных эпителиоцитах, чем эндогенные стимулы (гормоны, цитокины) при
кратковременной экспозиции в системах in vitro. В то же время наличие в
организме хронического воспалительного процесса (пародонтит) резко меняет
соотношение клеток, способных TLR-2 и TLR-4, а также число эпителиоцитов,
89
лишенных данных трецепторов.
3.4. Естественная колонизация буккальных эпителиоцитов в оценке
эффективности применения иммуномодуляторов и антисептиков
при некоторых хронических патологиях
Уровень естественной колонизации буккальных эпителиоцитов оральной
микрофлорой (рис.35) отражает функциональное состояние эпителиальных клеток
и считается одним из показателей состояния как местного иммунитета, так и
здоровья организма в целом [Маянский А.Н.,2006]. Известно, что при разных
патологических состояниях уровень естественной колонизации может меняться
[Зеленова Е.Г. и др.,1999, Маянский А.Н. и др.,1991 ; МаянскийА.Н. и др., 1999].
Естественную колонизацию буккальных клеток можно рассматривать как
интегральный показатель активности рецепторного аппарата эпителиоцитов,
которая реализуется при непосредственных контактах с представителями
нормального биоценоза полости рта.
Ранее в нашей работе (п. 3.1.3.) было установлено, что иммуномодуляторы
и
оральные
антисептики
способны
регулировать
адгезивные
реакции
эпителиоцитов (на примере тест-системы с участием C. albicans). Поэтому, мы
поставили себе цель естественной
колонизации
оценить
возможность использования показателя
буккального
эпителия
в
качестве
критерия
эффективности комплексной терапии с использованием иммуномодуляторов и
оральные антисептиков у больных с хроническими патологиями.
Исследование проводили с участием следующих групп:
1-я группа - здоровые доноры (дети и взрослые);
2-я группа - больные с микробной экземой.
3-я группа - больные с онихомикозом дрожжевого генеза.
Во 2-й и 3-й группах использовали стандартное или комплексное лечение с
применением иммуномодуляторов (п.2.13);
90
4-я группа - дети, учащиеся средних школ г. Нижнего Новгорода с хроническими
патологиями респираторного тракта (в состоянии ремиссии). Используемый
профилактический препарат содержащий лизоцим («Биофит», Россия).
Эпителиоцит
Бактерии –
представители
микрофлоры
полости рта
Рис.35. Естественная колонизация буккального эпителиоцита (увеличение  800,
окраска азуром А).
.
Уровень естественной колонизации оценивали по числу бактериальных
клеток в пересчете на один буккальный эпителиоцит (просматривали 100 клеток)
(рис. 35) ( п 2.3.).
3.4.1. Естественная колонизация буккального эпителия больных с микробной
экземой до и после лечения с использованием препарата «Полиоксидоний»
Экзема - аллергическое полиэтиологическое заболевание, сопровождающееся
воспалительно-дистрофической
реакцией
кожи,
характеризующееся
полиморфизмом элементов сыпи. Заболевание развивается на фоне изменений
реактивности организма, сопровождается нарушениями в работе иммунных
факторов и склонно к хроническому рецидивирующему течению [Парахонский
А.П.,2004; Абдрахимова Н.А. и др., 2013 Никонова И.В. и др.,2011]. Одним из
91
этиологических факторов развития экземы могут могут быть микроорганизмы
(«микробная экзема»).
В работе определяли уровень сывороточных молекул sICAM-I, IgЕ и IgG, а
также естественную колонизацию буккального эпителия у больных с микробной
экземой до и после лечения по стандартной схеме, либо
лечения
с
сывороточных
применением
факторов
препарата
для
после комплексного
«Полиоксидоний»
исследования
был
(п.2.13).
Выбор
обусловлен
патогенезом
–
мембранный
заболевания.
ICAM-I
(InterCellular
Adhesion
Molecule
I,
CD54)
гликопротеин с молекулярной массой 80–114 кДа. ICAM-I относится к группе
молекул клеточной адгезии, вовлечённых в межклеточные адгезивные контакты, а
также в контакты между клетками и межклеточным матриксом.
Существует
несколько суперсемейств молекул адгезии клеток, различающихся структурными
и
фунциональными
особенностями
хоминговые рецепторы лейкоцитов и
(селектины,
интегрины,
кадгерины,
прочие рецепторы суперсемейства
иммуноглобулиновых молекул), при этом помимо мембраносвязанных форм,
существуют также растворимые формы молекул адгезии клеток [Новиков В.В., и
др., 2007; Lawson C, Wolf S., 2009]. Изменения уровня экспрессии молекул
межклеточной адгезии, в частности ICAM-I, увеличение их концентрации на
мембране клеток, а
также в сыворотке крови наблюдается при активации
иммунной системы, воспалительных и опухолевых процессах [Никулин Н.К.,
Клеменова И.А., 2003; Максимова А.В. и др., 2005]. В свою очередь, известно, что
концентрация IgE и IgG в сыворотке возрастает при антигенных нагрузках и
атопиях [Ройт А., 2000].
Эксперименты показали, что у больных микробной экземой наблюдалось
некоторое повышение средних величин всех исследуемых показателей (р > 0,05)
(табл.25). Так, уровень IgE в сыворотке повышался в 1,6 раза, уровень Ig G – в 1,2
раза, ICAM-I – в 1,4; а показатель адгезии (уровень естественной колонизации)
увеличился в 2,5 раза (р > 0,05). Стандартная схема лечения (п. 2.13) не приводила
к существенному снижению индекса естественной колонизации – 35,12 ± 15,21
92
бакт/эп. (р > 0,05).
«Полиоксидоний»,
После комплексной терапии с использованием препарата
индекс естественной колонизации
степени и составлял 26,47 ± 12,03 бакт/эп.,
контрольной
снижался
в большей
приближаясь к показателям в
группе (табл.25, рис.36). Уровень sICAM-I снижался крайне
незначительно во время стандартного и комплексного лечения (р > 0,05).
Таблица 25
Естественная колонизация буккального эпителия и сывороточные показатели у
больных с микробной экземой при различных схемах лечения, М ± m
показатели
группы
Пациентов
здоровые (n=25)
Показатель
адгезии
(бакт/эпит)
14,31 ± 6,91
пациенты с экземой
36,79 ± 15,52↑
до лечения (n=52)
пациенты с экземой
после стандартного 35,12 ± 15,21
лечения (n=28)
пациенты с экземой
после комплексного 26,47 ± 12,03↓
лечения ● (n=24)
факторы сыворотки
sIСАM-I
(ng/ml)
IgG
(mg/ml)
377,6 ± 92,78
10,45 ± 0,68
IgE
(mg/ml)
25,53 ± 5,51
514,73 ± 110,57↑ 12,92 ± 0,93
42,38 ± 15,74↑
510,54 ± 110,26
12,92 ± 0,89
42,85 ± 15,25
505,61 ± 114,29
12,87 ± 0,56
43,81 ± 16,87
● - комплексное лечение с применением препарата «Полиоксидоний»
↑ - увеличение показателя относительно группы здоровых; ↓ - снижение показателя в
процессе лечения.
93
Рис.36 Влияние терапии с использованием препарата «Полиоксидоний» на
уровень естественной колонизации буккальных эпителиоцитов у больных экземой.
В то же время, положительная динамика изменений уровня IgG, IgE в период
наблюдений (20 дней) не отмечалась.
Проведенные исследования показали, что индекс естественной колонизации,
молекулы межклеточной адгезии sICAM-I, титр иммуноглобулинов IgE возможно
использовать в оценке выраженности патологического процесса при микробной
экземе. Однако, только индекс естественной колонизации
имеет динамику
положительных изменений показателя в ходе лечении данной патологии.
3.4.2. Естественная колонизация буккального эпителия у пациентов
с онихомикозом дрожжевого генеза до и после лечения с использованием
препарата «Деринат»
Онихомикоз
является
грибковой
инфекцией
ногтей
рук
или
ног,
вызывающий уплотнение, обесцвечивание, деформацию и растрескивание ногтей.
Одним из этиологических факторов являются грибы рода Candida (онихомикоз
дрожжевого генеза)
[Сергеев Ю.В., 1998].
94
Сравнительная оценка естественной колонизации детей
и взрослых
с
онихомикозом показала одинаковую динамику изменений (табл.26) уровня
естественной колонизации при патологии: у детей и взрослых увеличивается
количество бактерий, закрепившихся на эпителиоцитах в 2,08
и 3,17 раза
соответственно (р > 0,05).
Таблица 26
Естественная колонизация буккального эпителия детей и взрослых
при поражениях ногтевой пластины дрожжевого генеза, М ± m
Группы пациентов
Показатель адгезии (бакт/эп.)
здоровые дети n =28
40,56 ± 18,98
здоровые взрослые n =28
14,30 ± 7,89
онихомикоз у детей n =23
84,31 ± 39,06
онихомикоз у взрослых n = 53
45,32 ± 22,14
Таким
образом,
увеличение
естественной
микробной
колонизации
буккального эпителия при онихомикозах дрожжевого генеза отражает наличие
очага местной инфекции, как у детей, так и у взрослых.
Проводили оценку естественной колонизации буккального эпителия на фоне
комплексного лечения
онихомикозов, вызываемых грибами рода Candida
с
использованием препарата «Деринат». В работе использовали буккальные
эпителиоциты, полученные от больных с онихомикозом, взятые до и после курса
лечения: классическое лечение антимикотиками (26 человек), и комплексное
(вместе с препаратом «Деринат») (27 человек), а также
взятые от здоровых
доноров-добровольцев (28 человек).
Эксперименты
показали,
что
уровень
естественной
колонизации
эпителиоцитов у больных онихомикозом был значительно выше, чем у здоровых
доноров: 45,32 ± 22,14 и 14,30 ± 7,89 соответственно (p<0,05) (рис.37).
После проведенного курса стандартного лечения уровень естественной
колонизации был ниже и составлял 34,19 ± 17,21 (p>0,05). После комплексной
95
Рис. 37 Влияние препарата «Деринат» на уровень естественной колонизации
буккальных эпителиоцитов у больных онихомикозом.
терапии
с использованием препарата «Деринат»,
индекс естественной
колонизации снижался еще в большей степени и составлял 23,71 ± 11,0 (p>0,05),
приближаясь к показателям в контрольной группе.
Таким
образом,
имммуномодуляторов
при
использовании
в
комплексной
терапии
восстановление уровня естественной колонизации у
буккальных эпителиоцитов были выражены сильнее.
3.4.3. Естественная колонизация буккального эпителия у часто-болеющих
детей до и после применения лизоцим - содержащего препарата
Часто болеющие дети (ЧБД) – термин, обозначающий группу детей,
выделяемую при диспансерном наблюдении, характеризующуюся более высоким,
чем
их
сверстники,
уровнем
заболеваемости
острыми
респираторными
инфекциями [Альбицкий и др., 1986]. Среди ЧБД значительно чаще выявляются
хронические заболевания носоглотки и легких, тяжелее протекает бронхиальная
астма и аллергический ринит, выше частота ревматизма, гломерулонефрита и ряда
других заболеваний. В подростковом возрасте ЧБД склонны к хроническим
96
заболеваниям желудочно-кишечного тракта, сосудистым дистониям, у них легче
развиваются невротические реакции, они быстрее утомляются и хуже учатся
[Коровина и др., 2001]. В эту группу педиатры относят детей на основании
критериев, предложенных В.Ю.Альбицким и А.А.Барановым (1986):

дети до 3 лет - 6 и более эпизодов ОРЗ в год;

дети 4-5 лет - 5 и более эпизодов ОРЗ в год;

дети старше 5 лет - 4 и более эпизодов ОРЗ в год.
В нашей работе были проанализированы результаты состояния естественной
колонизации буккального эпителия
у здоровых детей, а также у ЧБД с
заболеваниями респираторной системы в анамнезе до и после курса приема
сублингвального таблетированного препарата («Биофит», Россия) содерожащего
лизоцим.
Результаты показали, что у ЧБД наблюдалась тенденция к повышению
уровня естественной колонизации до 70,18 ± 31,97 (бакт/эп) по сравнению с
группой здоровых: 40,56±18,98 (бакт/эп) (табл.27.).
После курса приема
сублигнгвального
индекс
препарата,
содержащего
лизоцим,
естественной
колонизации эпителиоцитов у ЧБД снижался до 48,36 ± 31,15 (бакт/эп) (р>0,05)
(рис.38), приближаясь к среднему значению показателя в контрольной
группе
(здоровые дети) (р>0,05).
Таблица 27.
Естественная колонизация буккальных эпителиоцитов у часто-болеющих детей с
заболеваниями респираторной системы, М ± m
Группа детей
Уровень естественной
колонизации буккальных
эпителиоцитов (бакт/эпит)
здоровые
n=29 40,56 ± 18,98
больные (заболевания респираторной системы) n=21 70,18 ± 31,97
больные после применения лизоцим-содержащего
48,36 ± 31,15
препарата
n=21
97
n=29
n=21
n=21
Рис.38. Естественная колонизация буккального эпителия у здоровых детей и
больных до и после курса приема сублингвального препарата с лизоцимом
_________
Таким образом, наши исследования с участием взрослых и детей с различными
хроническими патологиями (онихомикоз дрожжевого генеза, микробная экзема,
часто болеющие дети) показали, что изменение индекса естественной колонизации
буккальных клеток отражает наличие данных патологических процессов среди
пациентов различных возрастных групп. При этом, положительная динамика
изменений уровня естественной колонизации эпителиоцитов полости рта
позволяла в короткие сроки
(сразу же, после окончания курса терапии)
объективно оценить эффективность лечебных и профилактических мероприятий с
использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков.
98
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Эпителиоциты слизистых оболочек человека являются частью мукозальной
системы, которая играет существенную роль в поддержании гомеостаза и
обеспечивает «первую линию» защиты от инфекционных агентов [Меджитов Р,
2004; Быков В.Л., 2006, Маянский А.Н., 2006; Ахматова Н.К., и др.2008: Ярилин
А.А, 2008; Сотникова Н.Ю., 2009; Комарова Ю.Р. и др., 2010; Бурменская О.В.и
др., 2011, Цывкина А.А. и др., 2011, Бурягина Н.В.,2013; Takizawa H.,1998, Farmer
I. et.all., 2001; Nester, E. 2009.; Zhu, W.,2010; Weindl G., Wagener J., 2010, Maier E.
et.all, 2014].
Известно, что функциональное состояние клеток слизистых оболочек способно
меняться под влиянием различных факторов экзогенной и эндогенной природы,
патологических процессах и старении [Абаджиди М.А.и др., 2003; Альтман
Э.Д.,2011; Бочкарева О.П и др.,2013; Маянский А.Н. и др., 2004; Кравцов и др.,
2014]. При этом, изменение физиологического состояния эпителиоцитов способно
повлиять на их способность взаимодействовать с патогенами.
Кроме того,
дестабилизация мукозальных клеток может
изменениями
сопровождается
99
количества и видового состава нормальной микрофлоры,
колонизирующей
эпителиоциты,
колонизационной
что
ведет
к
ослаблению
механизмов
резистентности слизистых оболочек [Зеленова Е.Г. и др., 1999, Абаджиди М.А. и
др., 2000, Ланкина, М.В., 2002..;Абаджиди М.А. и др., 2003, Лукиных Л.М. и др.,
1999, Лукоянова Т.В., 2011, Сафонова О.П. и др., 2004].
Высокая
буккальных)
физиологическая
пластичность
эпителиоцитов,
отражающая
мукозальных
их
(в
частности,
восприимчивость
к
дестабилизирующим сигналам, а также
участие в реакциях, стыкующих
механизмы врожденного и адаптивного
иммунитета, делает возможным
использование этих клеток в качестве индикатора местных и общих нарушений
гомеостаза [Маянский А.Н., и др., 2004, Топтыгина А.П. и др., 2009, Полякова В.О.
и др., 2015].
В настоящей работе был применен оригинальный подход к оценке
функционального состояния мукозальных (преимущественно, буккальных) клеток
и его изменений под действием дестабилизирующих факторов (гормоны,
цитокины, микробные метаболиты, иммуномодулирующие препараты, оральные
антисептики) и при патологических состояниях - через определение активности
и реактивности (способности реагировать на стимулы) рецепторного аппарата
эпителиоцитов.
Способность клеток к адгезивным контактам с микроорганизмами
оценивали в условиях экспериментальной модели «искусственная колонизация
тест-культуры Сandida albicans
vitro», а также по уровню
Проводили
также
на буккальных/вагинальных эпителиоцитах in
естественной колонизации оральной микрофлорой.
исследование
выраженности
экспрессии
toll-подобных
рецепторов на буккальных эпителиоцитах.
Влияние эндогенных и экзогенных факторов на адгезивность эпителиоцитов в
экспериментальной системе с C. albicans in vitro
100
Гормональные изменения, регулярно происходящие в организме женщины,
влияют на фунциональную активность эпителиоцитов [Coleman H.,et all., 2001;
et all.,2003]. Было проведено сравнение действия
Beagley K.
гормонов,
регулирующих менструальный цикл и репродуктивную активность у женщин:
прогестерон, ФСГ, ЛГ, эстрадиол, эстриол, тестостерон, ХГЧ − на возможность
эпителиоцитов слизистых оболочек ротовой полости вступать в адгезивные
контакты с C.albicans in vitro.
Эксперименты показали, что контакт буккальных клеток
эстриолом,
тестостероном
и
ХГЧ
снижал
способность
с эстрадиолом,
эпителиоцитов
к
взаимодействию с кандидами в 1,29 ± 0,2; 1,4 ± 0,3; 1,29 ± 0,3; 1,42 ± 0,2 раза
соответственно (р<0,05). Напротив, обработка эпителиоцитов прогестероном и ЛГ
усиливала способность буккальных клеток адгезировать C.albicans в 1,26 ± 0,2; в
1,31 ± 0,1 раз (р<0,05). Обработка эпителиоцитов ФСГ не приводила к изменению
адгезивности клеток (р<0,05).
прогестерона,
характерный
Можно предположить, что высокий уровень
для
беременных,
обеспечивает
повышенную
готовность мукозальных эпителиоцитов к адгезивным взаимодействиям с
кандидами. Это хорошо согласуется с исследованиями, указывающими на
увеличении
частоты
вагинального кандидоза среди беременных женщин
[Лебедева О.П. и соавт. 2006].
Эксперименты
с вагинальными эпителиоцитами показали
прямую
сильную корреляцию - от 0,71 до 0,83 изменений адгезивности буккальных и
вагинальных эпителиоцитах под влиянием гормонов. Отсутствие различий в
способности к контактным взаимодействиям с кандидами у эпителиоцитов разных
биотопов позволило сделать вывод об
однотипной реактивности мукозальных
клеток. В связи с этим, последующие эксперименты выполняли только с
буккальными эпителиоцитами.
В экспериментах с ЛГ наблюдали значительно большее усиления эффекта от
гормона (p<0,05), если он был добавлен во время
контакта эпителиоцитов с
кандидами. Это может означать, что контакт с микроорганизмом повышает
чувствительность эпителиальных клеток к данному гормону (ЛГ).
101
Оценивали влияние цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-α на способность
буккальных эпителиоцитов адгезировать кандиды.
IL-1, IL-6, IL-8 и TNF-α
относятся к цитокинам, запускающим и поддерживающим воспалительную
реакцию [Хаитов Р.М., и соавт., 2009], тогда как IFN-α обладает противовирусной
противоопухолевой, и иммунорегуляторной активностью [Симбирцев А.С., 2004].
Прединкубация эпителиальных клеток с IFN-α приводила к снижению
адгезии в системе в 2,1 ± 0,3 раз (p<0,05). В то же время, обработка эпителиоцитов
IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 повышала адгезию C.albicans на буккальных клетках в 1,3 ±
0,1; 2,0 ± 0,2; 1,2± 0,1; 1,8 ± 0,5 раз соответственно по сравнению с контролем
(p<0,05). Добавление провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, TNFα) в ходе
взаимодействия эпителиоцитов и кандид также приводило к увеличению индекса
искусственной колонизации в
1,2-2,0 раза (р<0,05).
Таким образом, можно
предположить, что патологические процессы на уровне слизистых оболочек,
сопровождаемые синтезом большого количества провоспалительных цитокинов
[Серебренникова С.Н., 2008], увеличивает восприимчивость эпителиальных клеток
к микроорганизмам, таким как кандиды.
Было
установлено,
что
прединкубация
буккальных
клеток
с
иммуномодулирующими препаратами и антисептиками, применяемыми для
обработки
слизистых
эпителиоцитов
оболочек,
приводила
в отношении кандид в
к
снижению
1,2 - 2,1
раза.
адгезивности
Во всех случаях, за
исключением экспериментов с препаратом «Ликопид», эти изменения носили
выраженный характер (p<0,05). Аналогично иммуномодулирующие препараты и
антисептики действовали и на процесс взаимодействия буккальных эпителиоцитов
с кандидами, снижая восприимчивость эпителиоцитов к микроорганизмам.
Были
проведены
эксперименты
с
микробными
метаболитами
(супернатантами, полученными в ходе культивирования микроорганизмов в
жидкой среде) C. albicans 601, E. faecium 179/2, S.aureus 5983 и E.coli 205
целью установления их влияния на адгезивные способности
с
эпителиоцитов.
Продукты метаболизма S.aureus, E. faecium не изменяли адгезивности буккальных
эпителиоцитов; действие метаболитов E.coli было неоднозначным и варьировало,
102
по-видимому, в зависимости от функциональной активности клеток у разных
доноров.
В то же время, продукты метаболизма C.albicans существенно (р < 0,05)
усиливали возможность контакта эпителиоцитов с кандидами. Эту способность
кандид можно рассматривать как еще одно из проявлений патогенности данных
микроорганизмов и их высокой адаптации к данному биотопу.
Таким образом,
«эпителиоциты-кандиды»
реактивности
использованная тами экспериментальная тест-система
показала
рецепторного
аппарат
высокую
клеток,
чувстаительесть
участвующего
при
в
оценке
конаткных
взаимодейсвиях с потенциальными патогенами, в ответ на эндогенные и
экзогенные стимулы.
Участие внутриклеточных сигнальных систем в регуляции адгезивных
реакций буккальных эпителиоцитов
Исследовали взаимосвязь между активностью NF-κB и МАР-киназами
способностью
эпителиоцитов слизистых оболочек
и
вступать в контактные
взаимодействия с микроорганизмами, такими как C. albicans.
Эксперименты показали, что блокирование NF-kB в клетках человека
приводило к существенному снижению уровня адгезии кандид на буккальных
эпителиоцитах в 1,7  0,6 раза и составляло 6,6  1,3 усл. ед. в контроле и 4,1  0,9
усл ед. в экспериментах с ингибитором протеасом ALLN
(p 0,05).
При
добавлении ингибитора p38 киназы к буккальным эпителиоцитам наблюдалась
некоторое увеличение индекса адгезии кандид:
6,24  0,64 (контроль) и 7,81 
1,03 (эксперимент) усл.ед. (р  0,05).
Ингибитор ERK1/2-киназ не вызывал значимых изменений адгезии в системе
по сравнению с контролем: 3,89  0,65 и 3,86  0,55 усл.ед. соответственно.
Полученные данные продемонстрировали, что активность NF-κB, но не
МАР-киназ, способствует усилению рецепторной активности буккальных клеток в
103
отношении микроорганизмов, например,
свойство
можно
C. albicans
патогенности»
микромицета
C. albicans.
рассматривать как
и
способности
По-видимому, данное
проявление «контактной
«управлять»
адгезивностью
эпителиоцитов.
Из полученных данных можно также сделать вывод. что активность
внутриклеточных сигнальных систем эпителиоцитов, сопряженных с NF-κB,
является
необходимым
условием
неспосредственне участие
экспрессии
молекул,
принимающих
в закреплении микроорганизмов на поверхности
букаальных клеток.
Условия и факторы, регулирующие экспрессию TLR-2 и TLR-4
на буккальных эпителиоцитах
Клетки человека способны обнаруживать и распознавать структуры, общие
для
разных групп микроорганизмов, используя toll – подобные рецепторы
[McClure R., Massari P., 2014]. В настоящей работе исследовали экспрессию TLR-2
и TLR-4 для оценки функциональной активности и реактивности (способности
отвечать на стимулы) toll-зависимого рецепторного аппарата буккальных клеток.
Эпителиоциты
субстанциями
предварительно
(гормоны,
цитокины,
инкубировали
с
иммуномодулирующие
исследуемыми
препараты,
антисептики, микробные метаболиты). Экспрессию TLR-2 и TLR-4 оценивали у
клеток жизнеспособного пула по наличию на их поверхности CD 282 или CD 284
соответственно. Полученные результаты выражали в процентах, как отношение
числа клеток, презентирующих на своей поверхности только TLR-2 или TLR-4,
одновременно оба рецептора (TLR-2/ TLR-4), или же общую фракцию TLR-2- или
TLR-4-позитивных клеток к общему числу живых эпителиоцитов. Отметим, что
жизнеспособность эпителиоцитов под воздействием экзогенных и эндогенных
104
стимулов существенно не отличалась от контроля (интактные клетки) во всех
сериях эксперимента (р > 0,05).
Процент буккальных клеток, экспрессирующих TLR-4 после обработки
гормонами менялся незначительно (р>0,05). Однако, мы обратили внимание на
небольшое увеличение общего процента
TLR-4-позитивных клеток после
воздействия гормонов, играющих роль в обеспечении овуляции (ЛГ) и
беременности (прогестерон, ХГЧ). Возможно, это одна из причин, которая
приводит к изменению взаимоотношений эпителиоцитов слизистых оболочек с
представителями нормальной микрофлоры, часто наблюдаемое у беременных
[Акопян Т.Е., 1996].
Цитокины также существенно не влияли на экспрессию TLR-2 и TLR-4, за
исключением IL-6, который снижал количество клеток, экспрессирующих TLR-2
и одновременно увеличивал количество TLR-4 –позитивных клеток (р< 0,05).
Процент клеток, экспрессирующих TLR-2- и TLR-4 существенно не менялся
под
влиянием
антисептических
препаратов
«Лизобакт»
и
«Ксидифон»,
применяемых для обработки слизистых оболочек (р> 0,05).
Таким образом, половые гормоны, большинство исследуемых цитокинов (за
исключением IL-6) и антисептические препараты, применяемых для обработки
слизистых оболочек,
принципиально не меняли функциональную активность
клеток, выраженную в способности экспрессировать TLR-2- и TLR-4.
В то же время, иммуномодуляторы разнонаправлено стимулировали
экспрессию toll- подобных рецепторов на эпителиоцитах. Так, количество
эпителиальных клеток, экспрессирующих TLR-2
под влиянием препаратов
«Иммунал» и «Деринат» значительно увеличивалось (р<0,05), тогда как
«Полиоксидоний» и «Гриппферон» вызывали заметное снижение числа TLR-2 позитивных клеток (р<0,05). Способность подавлять экспрессию TLR-4 отчетливо
наблюдалась у препаратов «Иммунал», «Деринат», «Ликопид» и «Полиоксидоний»
(р<0,05).
Отметим,
что
направленность
изменений
была
схожей
у
иммуномодуляторов, принадлежащих к одной химической группе, например, у
бактериальных
препаратов
(«Рибомунил»,
«Имудон»),
и
синтетических
105
/полусинтетическиъ препаратов («Полиоксидоний», «Ликопид»). Это говорило о
том, что направление и сила изменения экспрессии toll-подобных рецепторов
эпителиоцитов
определяются, в первую очередь, химическим составом
активирующих молекул
В серии экспериментов было произведено измерение экспрессии рецепторов
на буккальных эпителиоцитах здоровых людей и пациентов с заболеваниями
пародонта. Установлено, что среди буккальных эпителиоцитов здоровых людей
общее количество TLR-4 – позитивных клеток выше, чем TLR-2 – позитивных. В
то же время, у пациентов с заболеваниями пародонта процент эпителиоцитов,
экспрессирующих TLR-4 заметно снижался, а экспрессирующих TLR-2
–
увеличивался (р<0,05). Одновременно существенно увеличивался процент клеток,
способных производить оба рецептора (р<0,05).
Изменения уровня экспрессии TLR-2, а TLR-4 среди эпителиоцитов на фоне
патологического процесса в полости рта (хронический пародонтит) позволили
предположить следующее. Увеличение числа
клеток, экспрессирующих TLR-2
при патологических состояниях, может быть связано
возбужденности
эпителиоцитов.
Напротив,
с нарастанием уровня
снижение
процента
клеток,
экспрессирующих TLR-4 при парадонтите, указывает на истощение резервов,
необходимых для формирования данного рецептора и свидетельсвует о том, что
формировангие TLR-4 , в большей мере, отражает способностью клетки отвечать
на стимулы, т.е. показывает ее реактивность.
Отметим, что на снижении реактивности клеток при парадонтите указывает
также резкое увеличение количества TLR-2-/ TLR-4 - негативных клеток, т.е.
клеток не способных экспрессировать ни один из вышеупомянутых toll-подобных
рецепторов при патологии.
Было замечено, что у больных с парадонтитом изменения процентного
соотношения
TLR-2
и
TLR-4-позитивных
клеток
после
воздействия
иммуномодуляторов выражены слабее, чем у здоровых доноров. Это, возможно,
связано с тем, что буккальные клетки уже подверглись воздействию со стороны
эффекторов
воспаления,
что,
возможно,
повысило
уровень
возбуждения
106
(активность) пула эпителиоцитов и одновременно снизило возможность отвечать
(реактивность) на дополнительные стимулы. С другой стороны, появления
значительного
числа
клеток
у
больных
пародонтитом,
экспрессирующих
одновременно TLR-2 и TLR-4 (рис.3 б) могло сглаживать результаты воздействия
иммуномодуляторов. Проанализировав полученные данные, мы пришли к выводу,
что
для
оценки
действия
иммуномодуляторов
при
патологии
удобнее
рассматривать колебания фракций эпителиоцитов, экспрессирующих только TLR-2
или TLR-4 (без учета фракции
TLR-2/ TLR-4), поскольку изменения в этих
фракциях резче выражены.
Известно, что экспрессия TLR может меняться в присутствии различных
микроорганизмов [McClure R., Massari P., 2014]. Эксперименты позволили
установить, что метаболиты всех исследуемых штаммов бактерий: S. aureus 5983,
E.faecium 179/2 и E.coli 205 – подавляли клеточную экспрессию TLR-2 .Так,
воздействие метаболитов S. aureus уменьшало общее количество
TLR-2-
позитивных клеток в 1,46 раза (р<0,05); метаболитов E.faecium и E.coli в 1,83 и
1,47 раз соответственно (р< 0,05). В то же время, метаболиты кандид различных
видов: C. albicans 601, C.glabrata 441,
C. кrusei 583 – усиливали способность
эпителиоцитов к экспрессии TLR-2, причем для экспериментов с супернатантами
C. кrusei эти измения носили наиболее выраженный характер: количество TLR-2позитивных клеток увеличивалось с 28,5 ± 2,8% (контроль) до 37,6 ± 3,6 (р<
0,05).
Метаболиты бактерии преимущественно подавляли экспрессию TLR-4 на
буккальных клетках: в экспериментах с супернатантами S. aureus и E.faecium
количество TLR-4 – позитивных клеток существенно уменьшалось: в 1,43 и 1,32
раз соответственно (р< 0,05); эксперименты с метаболитами E. coli имели туже
тенденцию, но оказывали менее выраженный эффект (р> 0,05). В то же время,
воздействие метаболитов кандид вело к некоторому увеличению процента TLR-4
– позитивных эпителиоцитов в популяции (р> 0,05).
Таким образом, результаты показали, что представители фунгальной и
бактериальной
микрофлоры, обладают разными механизмами регуляции
107
экспрессии TLR-2 и TLR-4 на буккальных эпителиоцитах. Это не вызывает
удивления, поскольку бактерии и микромицеты имеют существенные различия в
строении и химическом составе клеточной стенки [Сергеев А. Ю.,. Сергеев Ю.В,
2001; E. Nester., 2009.] и других компонентов, которые могут быть распознаны tollподобными рецепторами эпителиоцитов.
Сложность структуры патогенов и
множественность вариантов их распознавания с помощью сигнальных молекул
дает
возможность для регулирования и «индивидуализации» реагирования со
стороны
мукозальных клеток и различных
эффекторов
иммунного ответа
[Ярилин А.А..,1999; Brightbill H., Modlin R., 2000, Sasai, M Yamamoto M., 2013].
Естественная колонизация буккальных эпителиоцитов в оценке
эффективности применения иммуномодуляторов и антисептиков
при некоторых хронических патологиях
Естественная колонизация буккальных эпителиоцитов отражает состояние
местной и системного гомеостаза организма, а также его нарушения при патологии
(Маянский А.Н. и соавт. 2004; Полякова В.О. и соавт., 2015). В работе была
рассмотрена возможность использования уровня естественной колонизации
эпителиоцитов
как
критерия
эффективности
лечебно-профилактических
мероприятий у больных с хроническими заболеваниями (микробная экзема,
онихомикозом дрожжевого генеза, хронические заболевания респираторной
системы) с использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков.
Пациенты получали терапию согласно стандарту лечения соответствующих
патологий. Антибиотики назначались лечащим врачом в соответствии с данными
резистограммы. У отдельных групп пациентов в схему лечения были добавлены
иммуномодуляторы: «Полиоксидоний» (для больных с микробной экземой) и
«Деринат» (для больных онихомикозом).
Показатель адгезии буккальных клеток у пациентов с экземой повышался до
36,79 ± 15,52 (р>0,05). Стандартная схема лечения больных приводила к снижению
108
индекса естественной колонизации до 35,12 ± 15,21 бакт/эпит. После комплексной
терапии
с использованием препарата «Полиоксидоний»,
колонизации
индекс естественной
снижался в большей степени и составлял 26,47 ± 12,03 бакт/эпит.,
приближаясь к показателям в контрольной группе 14,31 ± 6,91: бакт/эпит (р>
0,05).
Мы сравнили возможность использования различных параметров: индекса
естественной
колонизации
буккального
эпителия,
межклеточной адгезии sICAM-I и иммуноглобулинов
растворимых
IgG,
молекул
IgЕ для оценки
выраженности патологического процесса и эффективности терапии у больных с
микробной экземой. Исследования показали, что концентрация sICAM-I и IgE в
сыворотке также повышалась при патологии, однако, в отличие от индекса
естественной колонизации, не отражала динамику положительных изменений в
ходе лечении заболевания.
На
следующем
этапе
проводили
оценку
естественной
колонизации
буккального эпителия на фоне комплексного лечения онихомикозов, вызываемых
грибами рода Candida с использованием препарата «Деринат».
Эксперименты
показали,
что
эпителиоцитов у больных онихомикозом
уровень
естественной
колонизации
был выше, чем у здоровых как для
взрослых: 45,32 ± 22,14 бакт/эпит. и 14,30 ± 7,89 бакт/эпит. соответственно
(p>0,05), так и для детей: 84,31 ± 39,06 бакт/эпит. (23 человека) и 40,56 ± 18,98
бакт/эпит. (28 человек) соответственно (p>0,05). При этом, отмечали, что уровень
естественной колонизации эпителиоцитов у детей, в среднем, выше, чем у
взрослых.
После проведенного курса стандартного лечения
колонизации несколько понижался
уровень естественной
и составлял 34,19 ± 17,21 (p>0,05). При
комплексной терапии с использованием препарата «Деринат» индекс естественной
колонизации снижался в большей степени - до 23,71 ± 11,0 (p>0,05), приближаясь
к показателям в контрольной
комплексной
терапии
группе. Результаты показали, что на фоне
(хронических
заболеваний)
с
использованием
109
иммуномодуляторов, изменения показателя естественной колонизации буккальных
эпителиоцитов всегда были выражены сильнее и стремились к норме.
Дополнительно были проанализированы результаты состояния естественной
колонизации буккального эпителия детей 6-8 лет двух общеобразовательных школ
Нижнего Новгорода. Были выделены группа здоровых (29 человек) и группа
часто болеющих детей (ЧБД) (21человек) в состоянии ремиссии, имеющих в
анамнезе хронические заболевания верхних дыхательных путей. Группа ЧБД
получала сублингвальные 3 таблетки лизоцима («Биофит», Россия), 1 раза в день,
в течение 21 дня.
Средний показатель естественной колонизации буккальных эпителиоцитов
был в 1,6 раза (р>0,05). выше в группе ЧБД , чем у здоровых детей и составлял
70,18 ± 31,97 бакт/эпит и 40,56 ± 18,98 бакт/эпит. соответственно. После приема
лизоцим-содержащего препарата уровень естественной колонизации в группе ЧБД
снижался до 48,4 ± 25,61 бакт/эпит., приближаясь к показателям в группе контроля
(здоровые дети)(р>0,05). Таким образом, сублингвальное применение препарата с
лизоцимом нормализовало состояние микробиоциноза полости рта у детей с
хроническими заболеваниями верхних дыхательных путей.
Это говорит о том, что применение в вышеуказанных группах пациентов
иммуномодулирующих
и
антисептических
препаратов
способствовало
восстановлению гомеостаза, что нашло свое отражение в нормализации
функционального состояния буккальных эпителиоцитов и их взаимоотношения с
микробиотой полости рта. Кроме того,
положительная динамика
изменений
уровня естественной колонизации эпителиоцитов полости рта у пациентов
позволяла в короткие сроки оценить эффективность лечебных и профилактических
мероприятий с использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков.
______
В заключение, на основании проведенных нами исследований,
составлено
описание
экспериментальных
моделей,
предназначенных
был
для
110
исследования
функциональной
активности
эпителиоцитов с помощью различных
и
реактивности
буккальных
методов оценки рецепторного аппарата
буккальных клеток (рис.39). Данная схема дает представление о возможностях и
области использования каждого из методов.
Исследование функциональной активности и реактивности (способности
реагировать на стимулы) буккальных эпителиоцитов
Оценка функционирования рецепторного аппарата буккальных клеток
Искусственная
колонизация
C.albicans на
буккальных
эпителиоцитах
(микроскопия)
Экспрессия
TLR-2 и TLR-4
буккальными
клетками
( проточная
цитофлюориметрия)
Естественная
колонизация
нормальной
микрофлорой
буккальных
эпителиоцитов
(микроскопия)
оценка
нарушений местного или
системного гомеостаза
оценка факторов.
способствующих или
препятсвующих
микробной
колонизации
1. оценка
немедленной реакции
(изменения
активности) клеток
в ответ на
оценка
эффективности
лечения, в том числе ,
с использованием
иммуномодуляторов
111
Рис.39. Оценка функционирования рецепторного аппарата буккальных
эпителиоцитов и области практического использования
Выводы
1.
Половые гормоны, цитокины и микробные метаболиты способны влиять на
функциональный
статус
эпителиоцитов
слизистых
оболочек,
разнонаправленно меняя их адгезивность в отношении C. albicans in vitro.
Прогестерон, лютеинизирующий гормон, IL-1, IL-6, IL-8, TNFα и метаболиты
C.albicans значительно усиливают адгезивность эпителиоцитов, тогда как
эстрадиол, эстриол, тестостерон, хорионический гонадотропин и IFN-α существенно снижают.
2.
Обработка
буккальных
клеток
иммуномодуляторами
и
оральными
антисептиками in vitro снижает способность эпителиоцитов адгезировать C.
albicans.
3.
Изменение способности к рецепции C. albicans у буккальных и вагинальных
эпителиоцитов под действием половых гормонов in vitro носит характер
сильной прямой корреляции.
112
4.
Кандида-зависимая
активация
системы
способствует
NF-kB
усилению
контактного взаимодействия буккальных клеток с C. albicans. Активность
МАР - киназ существенно не влияет на изменение адгезивных параметров
эпителиальных клеток в системах с C. albicans.
5.
Микробные метаболиты и иммуномодуляторы влияют на экспрессию TLR-2 и
TLR-4 на буккальных эпителиоцитах in vitro. Кандиды и бактерии
различаются по направлению регуляции экспрессии TLR-2 и TLR-4 на
эпителиальных клетках.
6.
Среди буккальных эпителиоцитов здоровых людей общее количество TLR-4
– позитивных клеток в популяции выше, чем TLR-2 – позитивных. У
пациентов
с
заболеваниями
экспрессирующих TLR-4
пародонта
процент
эпителиоцитов,
снижается, а экспрессирующих TLR-2
–
повышается; при этом существенно увеличивается процент клеток, имеющих
оба рецептора. Изменение экспрессии TLR-2 и TLR-4 на буккальных клетках
под
действием
иммуномодуляторов
выражено
слабее
у
больных
с
повышается
у
пародонтитом по сравнению со здоровыми.
7.
Уровень естественной колонизации буккального эпителия
взрослых и детей при хронических патологиях различного генеза (онихомикоз,
микробная
экзема,
респираторные
заболевания).
После
лечебных
мероприятий с использованием иммуномодулирующих препаратов уровень
естественной колонизации эпителиоцитов имеет тенденцию к снижению,
приближаясь к показателям, характерным для здоровых людей; та же
закономерность
наблюдается
оральных антисептиков.
и
при
профилактическом
использовании
113
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Абаджиди,
М.А.
Состояние
естественной
колонизации
буккальных
эпителиоцитов у детей, часто болеющих острыми респираторными инфекциями /
М.А. Абаджиди // Нижегородский мед. журн. – 2000.  № 3. – С. 16-18.
2. Уровень цитокинов в секрете ротовой полости у детей с бронхиальной астмой/
М.А. Абаджиди, Е.Ф. Лукушкина, И.В. Маянская и др.// Цитокины и воспаление.
– 2002. –Т. 1 –№3. –С.9-14.
3. Буккальные
эпителиоциты
как
инструмент
клинико-лабораторных
исследований/ М.А. Абаджиди, Т.В. Махрова, И.В. Маянская, М.И. Заславская,
А.Н. Маянский // Нижегородский медицинский журнал. – 2003. – N. 3-4. – С.
105-110.
4. Эффективность
Абдрахимова,
традиционной
Р.М.
терапии
Надырченко,
при
микробной
Г.Р.Мустафина,
З.Р.
экземе
/
Н.А.
Хисматуллина,
В.Д.Захарченко // Медицинский вестник Башкортостана. –2013. –Т.8. –№4. –
С.27-30.
5. Авдалян, А.М., Динамика содержания днк в ядрах клеток слизистой оболочки
желудка от гистологической нормы до неопластических изменений/ А.М.
114
Авдалян, В.В. Климачев, А.Ф. Лазарев // Успехи современного естествознания.
– 2003. – № 10 – С. 24-27.
6. Акопян Т.Э. Бактериальный вагиноз и вагинальный кандидоз у беременных.М.,
1996; 1-58.
7. Аллахвердиева, Л.И. Влияние иммуномодулирующей терапии на показатели
иммунитета и апоптоз у детей с атопической бронхиальной астмой/ Л.И.
Аллахвердиева, А.А. Эюбова, Г.П. Ахмедова// Иммунология. – 2011. – №3. –
С.160-163.
8. Альбицкий В.Ю. Часто болеющие дети. Клинико-социальные аспекты. Пути
оздоровления. – Саратов. –1986. –С181.
9. Характеристика
клеточного
и
гуморального
звеньев
иммунитета
мукосаливарной зоны у лиц зрелого, пожилого и старческого возраста/ Э.Д.
Альтман, А.В. Зурочка, С.Н. Теплова,
Е.В. Давыдов, Д.Ш. Альтман
//Медицинская иммунология. – 2011. – т. 13. – № 2-3. – С.167-174.
10.
Арион, В. Я. Итоги науки и техники./ В. Я. Арион // Серия Иммунология М.:
Наука, 1991. т. 9.
11.
Ахматова,
Н.К.
Врожденный
иммунитет:
противоопухолевый
и
противоинфекционный/Н.К. Ахматова, М.В. Киселевский// М: Практическая
медицина. – 2008. – 255 с.
12.
Оценка уровня дифференцировки клеток эпителия в отпечатках с различных
участков слизистой оболочки полости рта здоровых людей / Банченко Г. В.,
Акопян О. Г., Агаджанян А. А. и др. // Стоматология.— 1997.— № 1. — С. 12-14.
13.
Белова, О.В. Роль Цитокинов в иммунологической функции кожи /О.В.
Белова, В.Я Арион., В.И. Сергиенко // Иммунопатология, аллергология,
инфектология. – 2008. – №1. – С.41-55
14.
Уровень IL-8 в сыворотке крови как маркер течения воспалительного
процесса у больных с гинекологической патологией /
Э.Б. Белан, Р.Ф.
Пахуридзе, Н.В. Смолова, М.В. Андреева // Цитокины и воспаление. – 2011. – Т.
10, № 3. – С. 55–60.
115
15.
Бережная, Н.М. Toll-like рецепторы и онкогенез / Н.М. Бережная //
Онкология.—2013.—Т.15.—№2.—С.76-87.
16.
Богомолова Н. С.,. Иммунокорригирующее действие миелопида у больных
после операции на сердце в условиях искусственного кровообращения / Н. С.
Богомолова, Р. Н.Аббакумов, Р. Н Степаненко // Иммунология. – 1991. – №1. –
С. 55–58.
17.
Морфофункциональное состояние буккальных эпителиоцитов у больных
раком легкого / О.П. Бочкарева, Е.П. Красноженов, В.Е. Гольдберг, Н.О. Попова,
Л.Р. Мустафина // Сибирский онкологический журнал. – 2013. – № 3.– С. 57-60.
18.
Бурягина, Н.В. Вклад возраста и соматической патологии в оценку состояния
мукозального
иммунитета
полости
рта
при
хроническом
апикальном
периодонтите / Н.В. Бурягина, Бессарабов В.И. // Геронтология. – 2013. – № 4. –
С.365-371.
19.
Состояние локального иммунитета при хроническом рецидивирующем
вульвовагинальном кандидозе / О.В. Бурменская, Г.Р. Байрамова, О.С. Непша,
Д.Ю. Трофимов, C.М. Муллабаева, А.Е. Донников, А.Н. Екимов // Акушерство и
гинекология. –2011. –№1. –С.52-56.
20.
Быков, В.Л. Функциональная морфология эпителиального барьера слизистой
оболочки полости рта / В.Л. Быков // Стоматология. – 1997. – № 3. –С. 12-16.
21.
Быков, В.Л. Защитные механизмы покровного эпителия слизистой оболочки
пищевода человека / В.Л. Быков, Е.А. Исеева // Морфология. –2006. – Т.130,
вып. 6. –С.12 - 24.
22.
Величко, Е.В. Условия и факторы адгезии грибов Candida к эпителиоцитам
слизистых оболочек / Е.В. Величко // Гинекология –2003. – Т. 5, № 5. – С. 20-22.
23.
Воронина, Е.В. ГМДП (Ликопид) в снижении сезонной заболеваемости у
взрослых (данные слепого плацебо-контролируемого исследования) / Е.В.
Воронина // Практическая медицина. – №1 (48). – 2011. – С. 2-4.
24.
Отечественный иммуномодулятор нового поколения ликопид в комплексном
лечении и профилактике инфекционных осложнений в хирургической практике /
116
Л. И.Винницкий, К. А. Бунатян, Б. В. Пинегин и др. // Вестник РАМН. –1997. –
№11. – С. 46–48.
25. Связь уровней экспрессии генов TLR-2
и TLR-4 с изменениями
микробиоценоза урогенитального тракта при урогенитальном хламидиозе у
женщин / Е.А. Воропаева, А.В. Караулов, А.Л. Байракова, С.С. Афанасьев, В.А.
Алешкин, Л.И. Кафарская, Ю.В. Несвижский, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г.
Гречишникова, С.А. Леваков, В.А. Метельская, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова,
В.В.
Слободенюк,
Е.В.
Фандеева
//
Иммунопатология,
аллергология,
инфектология. –2008. –№2. –С.68-76.
26.
Изменение уровня экспрессии сигнальных рецепторов врожденного
иммунитета при инфекции, вызванной Candida albicans in vitro и in vivo / Л.В.
Ганковская, В.В. Зверев, Л.П. Блинкова, В.Ф. Лавров, О.А. Ганковская, П.А.
Кузнецов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.—
2009.—№3.—С.60-63.
27.
Гемонов, В.В. Защитные свойства поверхностных слоев эпителия слизистой
оболочки полости рта / В.В. Гемонов, М.Л. Могильный // Стоматология. – 1996.
– № 3. – С. 4-6.
28.
Герасимов, И.Г. Динамика клеточных параметров буккального эпителия в
течение менструального цикла у женщин / И.Г. Герасимов, О.А. Калютская //
Цитология. – 1996. – № 11. – С. 1152-1157
29.
Гусев,
Н.Б.
Протеинкиназы:
строение,
классификация,
свойства
и
биологическая роль / Н.Б. Гусев // Соросовский образовательный журнал. – 2000.
– Т. 6, № 12. – С. 4-13.
30.
Данилевский, Н.Ф. Кератозы слизистой оболочки полости рта и губ /
Н.Ф.Данилевский, Л.И. Урбанович // Киев, 1979. – 278 с.
31.
Роль провоспалительных цитокинов и эстрогенов в мультифакторном
патогенезе анемий беременных /
В.Г. Демихов, Е.В. Демихова, Е.В.
Климовская, О.Н. Журина, Е.Ф. Морщакова, Л.И. Соловьева // Цитокины и
воспаление. – 2011. Т. 10, № 3. – С. 17–21.
117
32.
Дугина, В.В. Влияние ликопида и дерината на активность лизоцима как
фактора неспецифической иммунной защиты при хронической язвенной болезни
желудка и двенадцатиперстной кишки / В.В. Дугина // Медицинский Альманах.
– 2010. – № 3. – С.201-203.
33.
Жаркова,
использования
О.А.
Оценка
ликопида
ненарализованного
клинико-иммунологической
в
периодонтита.
комплексном
/
О.А.
лечении
Жаркова
эффективности
хронического
//Иммунопатология,
аллергология, инфектология. –2005. –№4. –С. 19-22.
34.
Железникова, Г.Ф. Цитокины как предикторы течения и исхода инфекций /
Г.Ф. Железникова // Цитокины и воспаление. – 2009. - Т. 8, № 1. – С. 10 – 17.
35.
Диагностическая
ценность
показателя
естественной
колонизации
буккального эпителия при стоматологических заболеваниях / Е.Г. Зеленова, Л.М.
Лукиных, Т.В. Присада, Е.В. Салина // Клиническая лабораторная диагностика. –
1999. – № 11. – С. 37.
36.
Зеленова, Е.Г. Кандиды: экология, морфофункциональные особенности и
факторы патогенности / Е.Г. Зеленова, М.И.Заславская, Т.В. Махрова //
Нижегородский медицинский журнал. – 2002. – № 1. – С. 73-84.
37.
Зеленова Е.Г. Микрофлора ротовой полости: норма и патология. / Е.Г.
Зеленова, М.И. Заславская, Е.В. Салина, С.П. Рассанов// Учебное пособие
Лекции для студентов стоматологического факультета // Нижний Новгород :
НГМА, 2004. – 158 с.
38.
Камышников, В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и
лабораторной диагностике / В.С. Камышников. — М.:МЕДпресс-информ, 2004.
— 911 с.
39.
Караулов, А.В. Полиоксидоний в клинической практике/ Под ред.
А.В.Караулова //– М.:ГЭОТАР. – Медиа. –2008. –136с.
40.
Показатели колонизационной резистентности слизистых ротоглотки как
объективные критерии мукозального иммунитета при бронхитах у детей / А.В.
Караулов, В.А. Алешкин, Е.А. Воропаева, В.А. Метельская, В.В. Слободенюк,
М.С. Афанасьев, А.М. Затевалов, А.П. Топтыгина , С.С Афанасьев, Ю.В.
118
Несвижский, Ю.Н. Урбан, Е.О. Рубальский, Н.С. Матвеевская / Иммунология. –
2012. – Т.33. –№5. – С.255-259.
41.
Каплина, Э.Н., Вайнберг Ю.П. Деринат — природный иммуномодулятор для
детей и взрослых. М, –2005. –186 с.
42.
Катунина, О.Р. Функции Толл-подобных рецепторов как компонента
врожденного иммунитета и их участие в патогенезе дерматозов различной
этиологии // Вестн. дерматол. и венерол. – 2011. – № 2. – С.18-25.
43.
Комарова,
Ю.Р.
Участие
эпителиоцитов
в
местной
защите
при
воспалительных заболеваниях дыхательных путей / Ю.Р. Комарова, А.П.
Годовалов, О.В. Лебединская // Успехи современного естествознания. – 2010. –
№ 7 – С. 50-51.
44.
Миелодиспластические заболевания у детей: варианты клинического течения
и биологические особенности кроветворения часть 2. анализ клеточных
популяций костного мозга в диагностике методом проточной цитометрии при
миелодиспласических заболеваниях у детей / Е.А. Копыльцова, Е.Л. Семикина,
Н.А. Торубарова, Р.Ф. Тепаев, Е.Н. Мазитова, А.В. Мигали, О.Ю.Филина //
Гематология и трансфузия. –2005. –№1. –С.3-6.
45.
Часто
и
длительно
иммунореабилитации
болеющие
(руководство
для
дети;
современные
врачей)/
Н.А
возможности
Коровина,
А.Л.
Заплатников, А.В. Чебуркин, И.Н. Захарова. – М. . –2001.
46.
Влияние женских половых гормонов на адгезию дрожжеподобных грибов
Candida albicans к буккальному эпителию / Э.Г.Кравцов, И.В. Анохина, Я.А.
Рыбас,
Н.П.
Сачивкина,
А.В.
Ермолаев,
С.Б.
Бродская
//
Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. –2014. –№2. –С.211-213.
47.
Кремлева Е.А. Эпителиально-бактериальные взаимодействия как основа
формирования микробиоценоза / Е.А. Кремлева, С.В.Черкасов, О.В. Бухарин //
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2012. – N 6. –
С.95-99.
119
48.
Кубанов, А.А. Роль толл-подобного рецептора 7 типа в развитии истинной
акантолитической пузырчатки / А.А. Кубанов, А.В. Миченко, Т.В. Абрамова,
Л.Ф. Знаменская // Цитокины и воспаление. –2013. –Т. 12, № 4. – С. 11–17.
49.
Ланкина, М.В. Микрофлора зева человека как показатель определения
резистентности
организма /
М.В. Ланкина //
Журнал
микробиологии,
эпидемиологии и иммунобиологии.  2002.  № 3. – С. 97-99.
50.
Лебедева, Т.Н. Иммунитет
при кандидозе (обзор)/ Т.Н. Лебедева
//
Проблемы медицинской микологии. 2004. Т.6, №4  С.8-16.
51.
Лебедева, О.П. Влияние половых стероидов на микрофлору влагалища
(обзор) / О.П. Лебедева, П.В. Калуцкий // Лечебное дело.  2006. №2.  С.44-47.
52.
Лебедева, О.П., Антиинфекционная защита влагалища на фоне изменения
низкодозированных монофазных контрацептивов / О.П. Лебедева,
П.В.Калуцкий // Журнал Микробиологии.  2007.  №1. С.67-70
53.
Врожденный иммунитет женских половых путей и его гормональная
регуляция (мини-обзор). / О.П.Лебедева, П.В Калуцкий, С.П. Пахомов, М.И.
Чурносов, П.А. Карпов // Научные ведомости Белгородского государственного
университета. Серия: Медицина. Фармация.  2009. Т. 67, №8.  С.25-30.
54.
Роль Толл-подобных рецепторов врожденного иммунитета в развитии
акушерской и гинекологической патологии / О.П. Лебедева, С.П. Пахомов, П.В.
Калуцкий, П.А Карпов, М.И.Чурносов, В.Н. Попов // Иммунопатология,
аллергология, инфектология. 2012.  №1.  С.19-26.
55.
Леонова, З.А. Синтез и функции женских половых гормонов / З.А. Леонова,
В.В. Флоренсов // Сибирский медицинский журнал.  2013.  № 2. —С. 10-13.
56.
Лесовой,
В.С., Кандидоз ротовой полости (обзор) / В.С. Лесовой, А.В.
Липницкий, О.М. Очкурова // Проблемы медицинской микологии. 2003.  Т.5,
№1. —С. 3-7.
57.
Лукиных, Л.М. Значение колонизационной резистентности и местного
иммунитета полости рта при кариесе зубов / Л.М. Лукиных, Е.Г. Зеленова //
Нижегородский мед. журн. – 1999. – № 4. – С. 23-27.
120
58.
Лукоянова, Т.В. Обоснование и оценка эффективности применения
этидроновой
кислоты
для
профилактики
и
комплексного
лечения
воспалительных заболеваний полости рта: автореф. дис. … канд. мед. наук / Т.В.
Лукоянова – Москва, 2011. – 25 с.
59.
Сывороточное содержание растворимых антигенов адгезии и молекул
гистосовместимости у детей с бронхиальной астмой / А.В. Максимова, Н.И.
Кубышева, Е.В. Ермолаева, Л.Б.Постникова, Т.В. Чеснокова, Л.Г. Лазарева, В.В.
Новиков // Аллергологи. –2005. –№4. –С.30-34.
60.
Механизмы регуляции фагоцитарной активности клеток урогенитального
тракта / Е.В. Маркелова, И.А. Юцковская, С.Н. Анцупов, Т.Ю. Курлеева //
Успехи современного естествознания. 2005. –№ 4. – С. 60-61.
61.
Маянский, А.Н. Взаимоотношения между естественной колонизацией и
адгезией бактерий к буккальному эпителию у человека / А.Н. Маянский, О.Н.
Воробьева, Э.Ф. Малышева и др. // Журн. микробиол. – 1987. – № 2. – С.18-20.
62.
Маянский, А.Н. Естественная колонизация буккального эпителия у больных
с пародонтитом / А.Н. Маянский, Л.П. Пичугина, Э.Ф. Малышева //
Нижегородский медицинский журнал. – 1991.  № 3.  С. 20-22.
63.
Естественная колонизация буккального эпителия у детей с аллергическими
заболеваниями / А.Н. Маянский, М.А. Абаджиди, И.В. Маянская, А.П.
Разживин // Российский педиатрический журнал. – 1999.  № 3. – С. 47-49.
64.
Маянский А.Н., Салина Е.В., Абаджиди М.А., Ашкинази В.И., Заславская
М.И. Адгезивные реакции в системе "буккальные эпителиоциты Candida
albicans" у детей с бронхиальной астмой и гастродуоденитом / А.Н.Маянский,
Е.В Салина., М.А., Абаджиди В.И Ашкинази, М.И. Заславская // Педиатрия. 2002. - № 3. - С. 41 - 43.
65.
Маянский, А.Н. Реактивность буккальных эпителиоцитов: индикация
местных и общих нарушений гомеостаза/ А.Н. Маянский, М.А. Абаджиди, И.В.
Маянская // Клиническая лабораторная диагностика. – 2004. –№ 8. –С.31-34.
66.
Маянский,
А.Н.
Адгезивные
реакции
буккальных
эпителиоцитов
в
индикации нарушений местного и общего гомеостаза / А.Н. Маянский, М.И
121
Заславская, Е.В. Салина, Ю.Ю. Строгова, С.П. Рассанов, Э.Ф. Малышева //
Нижегородский медицинский журнал. –2005. –№1. –С.158-161.
67.
Маянский, А.Н. Патогенетическая микробиология: руководство / А.Н.
Маянский. – Н.Новгород : НГМА, 2006.  520 с.
68.
Маянский, А.Н. Реактивность и медиаторные функции интестинальных
эпителиоцитов в системе мукозального гомеостаза / А.Н. Маянский, И.В.
Маянская // Иммунология. – 2004. –№ 3. –С.185-191.
69.
Маянский, А.Н. Нуклеарный фактор kB и воспаление / А.Н. Маянский, Н.А.
Маянский, М.И. Заславская // Цитокины и воспаление. –2007 Т. 6,
№ 2.  С.3-
9.
70.
Махрова, T.В. Влияние метаболитов стафилококка на адгезивные реакции в
системе "Candida albicans - буккальные эпителиоциты" / Т.В. Махрова, М.И.
Заславская, А.Н. Маянский // Журн. микробиол. – 2004. –№ 5. –С.4-7.
71.
Махрова Т.В. Факторы и условия, влияющие на адгезивную активность
Candida
Albicans в системах с буккальными эпителиоцитами:автореф.дис.
…канд.мед.наук / Т.В. Махрова –Челябинск, 2004.–24 с.
72.
Махрова, Т.В. Некоторые механизмы антиадгезивного эффекта секрета
ротовой полости в системе « Candida albicans – буккальные эпителиоциты» /Т.В.
Махрова., А.Н. Маянский, М.И. Заславская// Журн. микробиол. эпидемиол. и
иммунол. –2005. –№2. –С.11-14.
73.
Меджитов, Р. Врожденный Иммунитет / Р.Меджитов, Ч. Джаневей //
Казанский медицинский журнал. –2004. –Т. 85, № 3. – С.161-167.
74.
Никонова И.В. Состояние биоценоза кожи при микробной экземе / И.В.
Никонова, Е.В. Орлов, П.Е. Коннов // Практическая медицина. –2011. –№2(49) . –
С.80-83.
75.
Никулин, Н.К. Мембранная экспрессия межклеточных молекул адгезии
ICAM-1 и ICAM-3 у больных псориазом / Н.К. Никулин, Клеменова И.А. //
Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2003. – №3. – С. 24-25.
122
76.
Новиков, В. В. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной
системы // В.В. Новиков, А. В.Караулов, А. Ю Барышников // Иммунология. –
2007. – № 4. – С. 249–253.
77.
Парахонский,
А.П.
Иммунный
ответ
при
экземе
с
повышенной
чувствительностью к стафилококкам / А.П. Парахонский, С.С. Цыганок //
Современные технологии. –2004. –№3. –С.102-103.
78.
Парахонский, А.П. Роль цитокинов в патогенезе заболеваний / А.П.
Парахонский // Успехи современного естествознания. – 2005. – № 4 – С. 63-64.
79.
Петров, Р. В. Искусственные антигены и вакцины / Р.В. Петров, Р. М Хаитов
// М.: Медицина.– 1998. – 208с.
80.
Петров, Р. В.. Полиоксидоний - иммуномодулятор последнего поколения:
итоги трехлетнего клинического применения / Р.В. Петров, Р.М. Хаитов, А. В
Некрасов. и др. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. –1999. –№ 3. – С.
3-6.
81.
Полторак, А. Н. Toll-подобные рецепторы как парадигма клетки /
А.Н.Полторак // Journal of Biomedical Technologies. – 2014. – № 1. – С. 52–57.
82.
Караулов, А.В. Полиоксидоний в клинической практике/ Под ред.
А.В.Караулова //– М.:ГЭОТАР. – Медиа. –2008. –136с.
83.
Сигнальные молекулы в буккальном эпителии: оптимизация диагностики
социально значимых заболеваний / М.А. Пальцев,
И.М. Кветной,
В.О.
Полякова, С.С. Коновальв, О.М. Литвякова, Н.С. Линькова, Н.Н. Севастьянова,
А.О. Дурнова, Г.Х.Толибова // Молекулярная медицина.—2012.—№4.—С.18-23.
84.
Полякова, В.О. Буккальный эпителий. Новый подходы
к молекулярной
диагностике социально значимй патологии / В.О. Полякова, Е.М. Пальцева, В.А.
Крулевский // Сбп. «Н-Л».-.2015.- 128 с.
85.
Репина, М.А. Дидрогестерон — прогестерон успешной беременности / М.А.
Репина // Гинекология. – 2011. – Т.13. – № 2. – С.4-9.
86.
Сапронова, Е.А. Цитологические особенности эпителия слизистой оболочки
десны у женщин в разные фазы менструального цикла и у мужчин / Е.А.
123
Сапронова, Б.Я. Рыжавский, И.Ф. Служаев // Дальневосточный медицинский
журнал. – 2003. –№2. – С. 19-22.
87.
Сафонова, О.П. Влияние половых стероидов на микрофлору влагалища / О.П.
Сафонова, П.В. Калуцкий, Б.Ф. Хурасев //
Научные ведомости БелГУ. Сер.
Медицина. – 2004. – №1. – С.139-142.
88.
Сергеев, Ю.В. Онихомикозы. Грибковые инфекции ногтей / Ю.В. Сергеев,
А.Ю. Сергеев // М.ГЭОТАР. Медицина. –1998. – 38с.
89.
Сергеев, А. Ю. Кандидоз / А. Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев // М: Триада –
Х. 2001. – 472 с.
90.
Серебренникова, С.Н. Роль цитокинов в воспалительном процессе / С.Н.
Серебренникова, И.Ж. Семинский // Сибирский медицинский журнал. –2008. –
№ 8. – С. 5-8.
91.
Симбирцев, А.С. Цитокины: классификация и биологические функции А.С.
Симбирцев // Цитокины и воспаление. – 2004. – Т.3., №2. – С.16-23.
92.
Симбирцев, А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического
иммунитета. / А.С. Симбирцев // Иммунология. – 2005. –№ 6. – С.368-376.
93.
Симбирцев, А.С. Цитокины в иммунопатогенезе и лечении аллергии / А.С.
Симбирцев // Российский аллергологический журнал. – 2007. – № 1. – С. 5-19
94.
Служаев, И.Ф,
Сравнительная морфологическая характеристика десневого и
буккального эпителия у женщин в разные фазы менструального цикла / И.Ф.
Служаев, Е.А. Сапронова, Я.Б. Рыжавский // Клиническая лабораторная
диагностика. –2004. –№8. –С.34-36.
95.
Сорокина, Е.В. Toll-подобные рецепторы и первичное распознавание
патогена при дерматозах инфекционной и неинфекционной этиологии / Е.В.
Сорокина // Иммунопатология, аллергология, инфектология.–2012.– №2.–С.6-15.
96.
Сотникова, Н.Ю. Иммунная система слизистых и микрофлора. / Н.Ю.
Сотникова // Российский иммунологический журнал. – 2009. – Т. 3, №2. –
С.111-120.
97.
Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. –ЮБМ Медика Рус.
–2014. –1600 С.
124
98.
Применение различных флуоресцентных красителей для окраски ядер
клеток в фиксированном биологическом материале / М.А. Сырцова, Е.А Колос,
В.А. Снегова, В.В. Гусельникова // Медицинский академический журнал. –
2014. – Т.14, №2. – С. 34-39.
99.
Татарчук,
Т.Ф.
Эндокринная
гинекология
(клинические
очерки)
/
Т.Ф.Татарчук, Я.П.Сольский// – К. –2003. –303с.
100. Татаурщикова, Н.С. Цитокиновый статус как критерий эффективности
интраназальной
аэрозольтерапии
раствором
циклоферона
в
лечении
аллергического риносинусита / Н.С. Татаурщикова, И.Г. Сидорович Вестник
оториноларингологии. – 2012. – №3. С.79-82.
101. Топтыгина,
А.П. Особенности индукции иммунного ответа у больных
урогенитальным хламидиозом / А.П. Топтыгина, С.С. Афанасьев, А.Л.
Байракова, Е.А. Воропаева, В.А. Алешкин, Л.И. Кафарская, М.С.Афанасьев,
Е.В.Фандеева // Российский иммунологический журнал. –2009. – Т. 3(12), №2,
С.171-176.
102. Содержание
эпителиоцитов,
экспрессирующих
TLR-2,
и
состояние
бактериоценоза слизистой носа при различных формах аллергического ринита /
Ю.А. Тюрин, А.А. Шарифуллина, И.Г. Мустафин, Р.С. Фассахов // Российский
аллергологический журнал. – 2013. – №6. – С.20-24.
103. Тютюнник, В.Л. Изменение локального и системного иммунитета при
оппортунистических инфекциях влагалища у беременных / В.Л. Тютюнник, Т.Э.
Карапетян,
А.Е. Донников, Н.Е. Кан, О.В. Бурменская //Акушерство и
гинекология. – 2013. – №8. – С.25-29.
104. Шендеров, Б. А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья
человека / Б.А. Шендеров // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии,
колопроктологии. – 1998. – №1. – С. 61-65.
105. Хаитов, Р. М. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического
применения / Р.М. Хаитов, Б. В. Пинегин // Клиническая медицина. – 1996. – Т.
74, № 8. – С.7-12.
125
106. Хаитов, P.M. Современные иммуномодуляторы. Классификация, механизм
действия / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин.//Российский аллергологический журнал.
– 2005. – №4. – С.30-43.
107. Хаитов, Р.М. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика
заболеваний иммунной системы:рукводство для врачей / Р.М Хаитов, Б .В.
Пинегин, А.А. Ярилин // М.: ГЭОТАР.Медиа. –2009. –-352с.
108. Хайдуков С.В, Возможности проточной цитофлюориметрии в диагностике
инфекционных заболеваний. Часть 1 / С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка // Инфекция
и иммунитет. – 2011. – Т.1, №1. – С.59-66.
109. Хусаинова, И.С. Оценка цитологических показателей буккального эпителия
для диагностики функционального состояния человека / И.С. Хусаинова, И.Ю.
Варулева, Н.А. Кожина // Клин. лаб. диагн. –1997. –№ 3. – С.10-12.
110. Цитогенетические показатели и электрокинетическая подвижность ядер
клеток буккального эпителия в оценке состояния пародонта / Л.М. Цепов, Н.С.
Левченкова, О.Н. Золотарева, Е.И. Васильева, А.П. Хромченков, А.И. Николаев,
Е.Н. Жажков // Стоматология. –1999. –№ 3. –С.7-8.
111. Цывкина,
А.А.
Мукозальный
иммунитет
дыхательных путей /А.А. Цывкина,
при
патологии
верхних
Л.В. Лусс, С.В. Царев// Российский
аллергологический журнал. – 2011. – №2. – С.22-26.
112. Черкасов.С.В.
Влияние
микробно-эпителиального
взаимодействия
на
биологические характеристики вагинальной микрофлоры / С.В. Черкасов, Е.А.
Кремлева,
О.В.
Бухарин
//
Журнал
микробиологии,
эпидемиологии
и
иммунобиологии. – 2011. – № 2. – С.53-57.
113. Шебашова, Н.В. Метод комплексной терапии кандидоза кожи и ногтей с
использованием иммуномодуляторов: пособие для врачей / Н.В Шебашова, И.А.
Клеменова, Ю.В. Мишина //Н.Н. – 2008. – 13с.
114.
Шумский,
А.В.
"Имудон"
в
лечении
инфекционно-воспалительных
заболеваний слизистой оболочки полости рта / А.В. Шумский // Стоматология. –
2000. – Т. 79, № 6. – С. 53-54.
126
115. Шустов С.Б. Клиническая эндокринология / С.Б. Шустов, В.Л. Баранов,
Ю.Ш. Халимов // Изд-во :Медицинское информационное агенство. –2012. –632
С.
116. Эфрон, А.Г.Цитокины как иммунномодуляторы течения воспалительного
процесса / А.Г. Эфрон. – Смоленск. – 1998. – 115 с.
117. Ярилин, А.А. Основы иммунологии / А.А. Ярилин. – М. : Медицина, 1999. –
608 с.
118. Ярилин, А.А. Клеточные основы мукозального иммунитета/ А.А.
Ярилин //
Российский иммунологический журнал. –2008 –Т2, №1. – С.3-19
119. Akira S, Hemmi H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR
family/ S. Akira// Immunol. Lett. – 2003. –Vol. 85. – P.85–9510.
120.
Andreakos, E. The toll-like receptor-nuclear factor kappaB pathway in rheumatoid
arthritis. / E. Andreakos, S. Sacre, B.M. Foxwell, M. Feldmann. // Front Biosci. –
2005. –Vol.10. – P. 2478–2488.
121. Angelone,
T.
disease / T.
Chromogranin-A: a multifaceted cardiovascular role in health and
Angelone
, R.Mazza, M.C.
Cerra
. //
Curr. Med. Chem.
– 2012.-Vol.19, N 24.-
P.4042-4050.
122.
Arend, W.P. Cytokines and cellular interactions in inflammatory synovitis / W.P.
Arend // J. Clin. Invest. – 2001. – Vol. 107. – P. 1081– 1082.
123. Expression
of vascular endothelial growth factor and microvessel density in oral tumorigenesis
/ M.
Astekar, A. Joshi, G. Ramesh, R. Metgud // Oral. Maxillofac. Pathol.- 2012-Vol 16,
N1.-P.22-26.
124. Baldwin, A.S.Jr. The NF-kappa B and I kappa B proteins: new discoveries and
insights / A.S.Jr. Baldwin // Annu. Rev. Immunol. – 1996. – Vol. 14. - P.649-683.
125. Baldwin, A.S. Ir. Series introduction: the transcription factor NF-κB and human
disease / A.S. Baldwin // J. Clin. Invest. – 2001 -. Vol. 107. - P.3-6.
126. Barnes, P.J. Nuclear Factor-B – A Pivotal Transcription Factor in Chronic
Inflammatory Diseases/ P.J. Barnes, M. Karin // The new England Journal of
medicine. – 1997. – Vol. 336, N 15. – P. 1066-1071.
127
127.
Brightbill, H. Toll-like receptors: molecular mechanisms of the mammalian immune
response/ H. Brightbill, R. Modlin // Immunology. – 2000– Vol.101. – P.1-10.
128. Beagley, K.
Regulation of adaptive immunity by female sex hormones oestradiol and
progesterone / K.
Beagley.,
C.
Gokel.
//FEMS Immunol and Med Microbiol Rew. –
2003. –Vol.38. – P.13-22.
129. Butts,
C.L.
Progesterone regulation of uterine dendritic cell function in rodents is
dependent on the stage of estrous cycle / C.L. Butts, K.M. Candando, J. Warfel, E.
Belyavskaya, F. D′Agnillo , E.M. Sterberg //
Mucosal Immunol.
–
2010. – Vol. 3, N
55. – P. 496-505.
130. Calderone, R.A. Recognition between Candida albicans and host cells. /R.A.
Calderone// Trends Microbiol. – 1993. – Vol.1. – P255-258.
131. Oral candida: clearance, colonization, or candidiasis? / Cannon R.D., A.R. Holmes,
A.B. Mason, B.C. Monk // J Dent Res. –1995. –Vol. 74, N 5. Р. 1152–1161.
132. Commensal-associated molecular patterns induce selective toll-like receptortrafficking from apical membrane to cytoplasmic compartments in polarized
intestinal epithelium / E. Cario, D. Brown, M. McKee, K. Lynch-Devaney, G.
Gerken, D.K. Podolsky// Am J Pathol. – 2002. –Vol. – 160. –P.165.
133.
Caamano, J. NF-κB family of transcription factors: central regulators of innate and
adaptive immune functions / J. Caamano, C.A. Hunter // Clin. Microbiol. Rev. –
2002. –Vol. 15. – P. 414-429.
134. Coleman,
H
The effects of thyroid and reproductive hormones on the viability of
human buccal epithelium / H.Coleman, H. Benghuzzi, M. Tucci, Z. Cason// Biomed
Sci Instrum. –2001. –Vol.37. – P. 143-148.
135. IB overexpression in cardiomyocytes prevents NF-B translocation and provides
cardioprotection in trauma / D.L. Carlson, J.D. White, D.L. Maass [et al.] // Am. J.
Physiol. Heart. Circ. Physiol. –2003. –Vol. 284, N 3. – P. 804-814.
136. Cellular interactions of Candida albicans with human oral epithelial cells and
enterocytes / F.
Labruère,
Dalle,
B.
Wächtler,
C.
L'Ollivier,
G.
Holland,
N.
Bannert,
D.
A. Bonnin, B. Hube // Cell Microbiol. – 2010. –Vol.12 (2). –P.248-271.
Wilson,
C.
128
137. Enterohemorrhagic Escherichia coli infection induces interleukin-8 production via
activation of mitogen-activated protein kinases and the transcription factors NF-B
and AP-1 in T84 Cells / S. Dahan, V. Busuttil, V. Imbert [et al.] // Infect. Immun. –
2002. –Vol. 70, N. 5. – P. 2304-2310.
138. Eberhard, J. Leucotriene A (4)-hydrolase expression and leucotriene B(4) levels in
chronic inflammation of bacterial origin: immunohistochemistry and reverse-phase
high-performance liquid chromatography analysis of oral mucosal epithelium / J.
Eberhard, S. Jepsen, M. Tiemann et al. // Virchows Arch. –2002. –Vol. 440. –
P.627-634.
139.
Ellmerich, S. Production of cytokines by monocytes, epithelial and endothelial cells
activated by Streptococcus bovis / S. Ellmerich, N. Djouder, M. Scholler //
Cytokine. – 2000. –Vol. 12. – P.26-31.
140. Fahey, J.V. Sex hormone regulation of anti-bacterial activity in rat uterine secretions
and apical release of anti-bacterial factor(s) by uterine epithelial cells in culture. /
J.V.
Fahey,
R.M.
Rossoll,
C.R.
Wira
.//J
Steroid Biochem Mol Biol.
–2005. –Vol. 93(1). –
P.59-66.
141. Farmer, I. Expression of adhesion and activation molecules in human buccal
spithelial cell lines and normal human buccal epithelium in situ / I. Farmer, J.
Freysdottir, A. Dalghous//J.Oral. Pathol. Med. –2001. –Vol.30. –P.113-120.
142. Ferrucci L.. Inflammation, hormones, and body composition at a crossroad. / L.
Ferrucci, J.M. Guralnik //Am.J.Med – 2003. –Vol.15. –№115 (6) –P.501-502.
143. Forsythe P., Bienenstock J. Immunomodulation by commensal and probiotic
bacteria /Immunol. Invest. . – 2010.- Vol. 39.- N 4-5.- P.429-48.
144. Gilmore, B.J. An iC3b receptor on Candida albicans: structure, function, and
correlates for pathogenicity/ B.J. Gilmore, E.M. Retsinas, J.S. Lorenz // J. Infec. Dis.
–1988. –Vol. 157, № 1. –P.38-46.
145. Hadden, J. W. Immunostimulants. / J. W. Hadden// Immunol Today. – 1993. –№
14. – Р. 275–280.
146. Hayden M.S. NF-kB in immunology /M.S. Hayden, S.Ghosh. // Cell Research.–
2014. –Vol.21. –P.223-244.
129
147. Hirata, T. Evidence for the presence of Toll-like receptor 4 system in the human
endometrium/ T. Hirata, Y. Osuga, Y. Hirota et al. //Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism. – 2005. –Vol.90 (1) –P.548–556.
148. Hirata, T. Expression of TLR 2, 3, 4 and 9 genes in the human endometrium during
the menstrual cycle/ T. Hirata, Y. Osuga, Y. Hirota et al. // J Reprod Immunol. –
2007. – 74. – p.53-60.
149. Jacob, H. S. Complement-induced granulocyte aggregation/ H.S.Jacob, P.R.
Craddock, D.E. Hammerschmidt // N. Engl. J. Med. –1980. –Vol.302, №14. –
P.769-794.
150. Characterization of the structure and function of the fourth member of p38 group
mitogenactivated protein kinases, p38delta / Jiang Y., Gram H., Zhao M. [et al.] // J.
Biol. Chem. –1997. –Vol. 272. –P. 30122-30128.
151. Jobin, Ch. The IκB/NF-κB system: a key determinant of mucosal inflammation and
protection / Ch. Jobin, R.B. Sartor // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2000. – Vol.
278. – P. C451-C462.
152. Kalinin A.E.., Epithelial barrier function: assembly and structural features of the
cornified cell envelope./ A.E. Kalinin A.V. Kajava Steinert PM.Bioessays –2002. –
Vol.24 (9). –P.789-800.
153. Lawson,C. ICAM-1 signaling in endothelial cells / C. Lawson, S.Wolf //Pharmacol
Rep. –2009. –61(1). –P.22-32.
154. Gene expression levels of cytokines in peripheral blood mononuclear cells from
patients with pulmonary embolism/. W. Lv, Q.Duan, L. Wang, Z. Gong, F. Yang, Y.
Song// Mol Med Rep – 2013. –Vol.7 (4). – P.1245-1250.
155. Maier, E. Understanding how commensal obligate anaerobic bacteria regulate
immune functions in the large intestine / E. Maier, R.C. Anderson, N.C. Roy.//
Nutrients. – 2014. –Vol.7 (1). –P. 45-73.
156. Mantovani, A., Cytokine regulation endothelial cell function: from molecular level
to bedside / A. Mantovani, F. Bussolino, M.Intora // Immunology Today. – 1997. –
Vol. 18, No 5. – P.231-239
130
157. Mannhardt, W. The interaction of mucosal epithelial cells with E.coli bacteria
enhances the intraepithelial calcium flux and the release of prostaglandin E2 / W.
Mannhardt, K. Beutel, P. Habermehl // Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunct. —
1999. - Vol.10. -P.308-315.
158. Matthew, E Rapid activation of nuclear factor-κB in airway epithelium in a murine
model of allergic airway inflammation / E. Matthew, M. E. Poynter , C. G. Irvin, Y.
M. W. Janssen-Heininger // American Journal of Pathology. – 2002. –vol. 160,№ 4.
– P. 1325–1334.
159. Mariotti A.. Endocrinology of sex steroid hormones and cell dynamics in the
periodontium / A. Mariotti, M. Mawhinney// Periodontol 2000 –2013. –Vol.61, №1.
– P. 69-88.
160. The influence of sex hormones on proinflammatory cytokines in gingiva of
periodontally healthy premenopausal women / E. Markou E. Boura L. Tsalikis A.
Deligianidis A. Konstantinidis //J Periodontal Res – Vol.46,№ 5.P.528-532.
161. McClure R.. TLR-Dependent Human Mucosal Epithelial Cell Responses to
Microbial Pathogens / R. VcClure P. Massari // Front Immunol – 2014. Vol. 12, №
5. – P.386.
162. Differential activation of NF-κB and gene expression in oral epithelial cells by
periodontal pathogens /
Matthews,
M. R. Milward, I. L. C. Chapple, H. J. Wright, J. L. Millard, J. B.
and P. R. Cooper // Clin Exp Immunol. –2007. Vol.148, №2. –P. 307–324.
163. Cenci MMP inhibitors on dentin stability: a systematic review and meta-analysis /
A.F. Montagner, R. Sarkis-Onofre, T. Pereira-Cenci, M.S. // Den. Res.-2014.Vol.112.-P.1121-1129.
164. Naglik,
Moyes
J.R.
Epithelial Cell Innate Response to Candida albicans / J.R. Naglik
D.
// Adv Dent Res. – 2011. –Vol. 23, №1. –P. 50–55 А
165. Candida albicans interactions with epithelial cells and mucosal immunity / J. R
Naglik, D. L Moyes, B. Wächtler H. Bernhard // Microbes Infect. – 2011. Vol.13(1213). –P. 963–976. Б
166. Nester, E. Microbiology: a human perpective. 6th edition / E. Nester., et all. //
McGraw-Hill Science. –2009. –P.884.
131
167. Progestogens and brain: an update / Pluchino N., et al. //Maturitas. — 2009. —V.
62(4). — P. 349-355.
168. Innate Immunity in the Female Reproductive Tract: Role of Sex Hormones in
Regulating Uterine Epithelial Cell Protection Against Pathogens. / D.O. Ochiel, J.V.
Fahey M. Ghosh, S.N. Haddad, C.R .Wira// Curr Womens health Rev –2008.
Vol.4(2). –P.102-117.
169. Rouabhia, M. Interleukin-18 and gamma interferon production by oral epithelial
cells in response to exposure to Candida albicans or lipopolysaccaride stimulation/
M. Rouabhia, G. Ross, N. Page // Infect Immun. - 2002. - Vol. 70. – P.7073-7080.
170. Sasai, M Yamamoto M. Pathogen recognition receptors: ligands and signaling
pathways by toll-like receptors / Sasai, M Yamamoto M. // Int Rev Immunol. 2013. – Vol.32. –P.116–3310.
171. Smith, J.K. Effect of interferon alpha on HLA-DR expression by human buccal
epithelium / J.K. Smith, D.S.Chi, G. Krishnaswamy //Arch Immunol Ther Exp
(Warsz). - 1996. -Vol. 44. - P.83-88.
172. Steele, C. Cytokine and chemokine production by human oral and vaginal epithelial
cells in response to Candida albicans / C. Steele, P.L. Fidel // Infect immune. - 2002.
–Vol. 2. – P.577-83.
173. Takeda, K. Toll-like receptors in innate immunity / K.Takeda, S. Akira // Int.
Immunol. –2005. –17(No1). – P. 1-14.
174. Takizawa, H. Airway epithelial cells as regulators of inflammation / H. Takizawa //
Int J Mol Med. -1998. -Vol. 1. -P.367-78.
175. Inhibition of monocytic interleukin-12 production by Candida albicans via
selective activation of ERK mitogen-activated protein kinase / N. Tang, L. Liu, K.
Kang [et al.] // Infect. Immun.- 2004. - Vol. 72, N. 5. - P. 2513-2520.
176. Tato, C. M. Host-Pathogen Interactions: Subversion and Utilization of the NF-kB
Pathway during Infection / C. M. Tato, C. A. Hunter // Infect. Immun. – 2002. –
Vol. 70, No. 7. – P. 3311–3317.
177. Tian, W. MAPK signaling and the kidney / W. Tian, Z. Zhang, D. M. Cohen // Am.
J. Physiol. Renal. Physiol. –2000. – Vol. 279. – P. 593–604.
132
178. Villena,
J.
Regulation
of
toll-like
receptors-mediated
inflammation
by
immunobiotics in bovine intestinal epitheliocytes: role of signaling pathways and
negative regulators / J. Villena, H. Aso, H. Kitazawa // Front. Immunol. –2014. –
Vol.2 (5). –P.421.
179. Wan, L.Y. Modulation of intestinal epithelial defense responses by probiotic
bacteria / L.Y. Wan, Z.J. Chen, N.P.Shah, H.El-Nezami.// Crit. Rev. Food. Sci. Nutr.
–2015. – Jan.28:
180. Weindl, G. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through
TLR4-mediated signaling / G. Weindl, J.R. Naglik, S. Kaesler, T. Biedermann, B.
Hube, H.C. Korting, M.J. Schaller // Clin Invest. – 2007. –Vol. 117(12). –P. 36643672.
181. Weindl, G. Epithelial cells and innate antifungal defens / G. Weindl, J.Wagener,
M.Schaller // J Dent Res. –2010. –Vol. 89(7). –P.666-675.
182. Sex hormone regulation of innate immunity in the female reproductive tract: the role
of epithelial cells in balancing reproductive potential with protection against
sexually transmitted pathogens / C.R.
Hickey,
Wira,
J.V.
Fahey,
M.
Ghosh
, M.V.
Patel,
D.K.
D.O Ochiel // Am J Reprod Immunol. – 2010. –Vol.63 (6). P. 544-565.
183. Zhang, G. Toll-like receptor-mediated NF-kB activation: a phylogenetically
conserved paradigm in innate immunity / G. Zhang, S.Ghosh // J Clin Invest. –
2001. Vol 107, No1. – P. 13-19.
184. Zhu, W. Interactions of Candida albicans with Epithelial Cells / Zhu
Weidong
Filler
Scott //Cell Microbiol. –2010. Vol. 12(3). –P. 273–282.
185. The role of estrogen in osteogenetic cytokine expression in human periodontal
ligament cells / Y.Zhou Y. Fu, J.P. Li, L.Y. Qi// Int J Periodontics –2009. –Vol. 5.
–P.507-513.
Благодарности
Автор
выражает
искреннюю
благодарность
научному
руководителю
Заславской М.И. за ценные советы на различных этапах выполнения работы, а
133
также огромную признательность доценту кафедры микробиологии и иммунологии
ГБОУ НижГМА Минздрава РФ к.м.н. Махровой Т.В. за консультации и помощь в
организации экспериментов. Автор благодарит директора
филиала ГНЦДК Минздрава РФ,
Нижегородского
д.м.н. Клеменову И.А за организацию
совместных лабораторных исследований биоматериала, полученного от пациентов
с микробной экземой и онихомикозом. Автор выражает благодарность в.н.с.
Маянской И.В. за предоставление возможности выполнения исследований на
проточном цитофлюориметре в ФГУ