Целевой пептид влияет на системный пропуск экзона в гене дистрофина... восстановление у дистрофин-дефицитных mdx мышей.
advertisement
Целевой пептид влияет на системный пропуск экзона в гене дистрофина и функциональное восстановление у дистрофин-дефицитных mdx мышей. HaiFang Yin1,2, Hong M. Moulton3, Corinne Betts1, Yiqi Seow1, Jordan Boutilier3, Patrick L. Iverson3 and Matthew J.A. Wood1,* Author Affiliations 1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, South Parks Road, Oxford OX1 3QX, UK, 2Tianjin Research Centre of Basic Medical Science, Tianjin Medical University, Qixiangtai Road, Heping District, Tianjin 300070, China and 3AVI Biopharma Inc., Corvallis, OR 97333, USA *To whom correspondence should be addressed. Tel: +44 1865272419; Fax: +44 1865272420; Email: matthew.wood@dpag.ox.ac.uk Received July 20, 2009. Accepted August 14, 2009. Введение Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) - тяжелое дегенеративное заболевание мышц, характеризющиеся мутациями, которые разрушают рамку считывания в гене дистрофина, приводящими к отсутствию функциональных белков. AO(антисмысловые олигонуклеатиды) - опосредованный пропускающий экзона предлагает потенциальную терапию МДД, восстанавливая открытую рамку считывания в мутантных транскриптах, приводя к производству более коротких функциональных форм дистрофина, которые сохраняют критические терминальные аминокислоты, необходимые для функцианальной активности. Терапевтический потенциал этого метода успешно подтвержден у людей при местной внутримышечной инъекции. Чтобы полностью эксплуатировать АО-опосредованную коррекцию сплайсинга как, эффективную терапию у пациентов с МДД необходимо системное исправление фенотипа МДД. Системная внутривенная поставка 2 ′-Oметил фосфоротиоат РНК и фосфородиамидат морфолино олигомеров, как показали, восстановила экспрессию дистрофина в периферических мышцах у mdx мышей. Однако, исправление имело низкую эффективность при использовании различных типов AO, и требует многократного режима дозирования, включающего семь еженедельных доз РMO 100 мг/кг, при этом достигали умеренного восстановления дистрофина. Недавно, мы и другие исследователи сообщили, что ФMO конъюгированный с короткими богатыми аргинином, проникающими через клетку пептидами (CPPs) может вызвать эффективный системный пропуск экзона в гене дистрофина, включая сердечную мышцу, показывая, что потенциал РMO-пептида может привести к разработке терапевтического средства для лечения МДД. Немного исследований до настоящего времени исследовали возможность нацеленных пептидов увеличивать поставку нуклеиновой кислоты и ее активность. Хотя недавний отчет продемонстрировал успешную транссосудистую поставку нуклеиновой кислоты в мозгу используя нейронный пептид, полученный из гликопротеида вируса бешенства в комплексе с двухспиральной РНК. Мы выдвигаем гипотезу, что такой нацеленный на клетки подход может увеличить поставку АО в мышцы при МДД. В данном исследовании мы проверяем эту гипотезу, конъюгируя определенный для мышцы пептид (MSP) или химерный пептид, включающий MSP и CPP (B пептид) с РMO, и оцениваем их у mdx мышей. Впервые наше исследование показывает, что химерный пептид (B-MSP-PMO), вызывает очень эффективный системный пропуск экзона у mdx мышей в дозах всего 6 мг/кг с восстановлением дистрофина во всем теле и восстановление функции без признаков токсичности. Это исследование демонстрирует, что такой подход обеспечивает безопасный и эффективный метод для системной поставки АО для терапии МДД. Результаты Чтобы проверить способность нацеленного на клетку пептидов увеличить системное исправление дистрофина у mdx мышей, мы исследовали нацеленный на мышцы гептапептид (MSP), ранее идентифицированный в естественных условиях бактериофагом, для возможности коррекции сплайсинга в мышцах. Мы сравнили MSP-РMO конъюгированный непосредственно с ранее изученным B-РMO (см. Рис. 1A для олигонуклеатидов и последовательностей пептида) у mdx мышей при единственной внутривенной инъекции 25 мг/кг, поскольку BPMO, как ранее показывали, восстановил экспрессию дистрофина в передней большеберцовой мышце (ПББМ) при единственной внутримышечной инъекции Через три недели после единственной инъекции, все группы скелетных мышц проанализировали, и обнаружили содержание дистрофина сравнимое с нормальными уровнями при иммунным окрашиванием после лечения B-РMO, (Рис. 1B), данные сопоставимы с предыдущими докладами. Удивительно, что активность МSР-РMO была низка, хотя более эффективна, чем РMO один в той же самой дозе (данные, не показанны). Высокие уровни пропуска экзона и восстановление белка было обнаружено в задней конечности, передней конечности, брюшной стенке и мышцах диафрагмы и также в кардиальной ткани у mdx мышей, получавших B-РMO, показано при ОТ–ПЦР и вестерн-блотт анализом (Дополнительный Материал, Рис. S1a и b). Увеличенные уровни восстановления дистрофина в сердце с помощью B-РMO были замечены при более высоких внутривенных дозах- 30 и 40 мг/кг (Дополнительный Материал, Рис. S2a), которые показали приблизительно 20 и 50% нормальных уровней, соответственно, как показано при вестерн-блотт анализе (Дополнительный Материал, Рис. S2b). Кроме того B-PMO также восстановил компоненты дистрофин-связанного белкового комплекса (DAPC), которые в отсутствие функционального дистрофина не присутствуют в сарколемме(Дополнительный Материал, Рис. S1c). Как результат- при использовании функционального анализа силы у mdx мышей получавших B-ФMO значительно улучшились показатели в пределах нормального диапазона по сравнению с невылеченными mdx мышами (Дополнительный Материал, Рис. S1d). Химерный B- MSP -ФMO вызывает эффективное исправление сплайсинга дистрофина. Так как MSP обладает высоким аффинитетом к скелетной и сердечной мышечной ткани, мы выдвинули гипотезу, что плохая активность MSP-PMO могла быть из-за его слабой способности облегчить интернализацию PMO после его проникновения в ткани. Мы поэтому проверили, могло ли слияние MSP с B-пептидом произвести химерный пептид, улучшающий свою активность после системной поставки. Мы проверили две формы этого пептида, B-MSPPMO, в которой область MSP была помещена между B и последовательностями PMO и MSP-B-PMO, в который область MSP была помещена далеко от PMO (Рис. 1A). Чтобы обнаружить, может ли любой из них обеспечить увеличенную активность, мы исследовали низкую дозу - 3 мг/кг после курса из шести еженедельных внутривенных инъекций, рассуждая, что различия в эффективности будут самыми очевидными при более низких дозах. Удивительно, что B-MSP-PMO,а не MSP-B-PMO оказался очень эффективным при своей способности восстановить экспрессию дистрофина в скелетных мышцах в этой низкой дозе по сравнению с B-PMO. Широко распространенная, однородная экспрессия дистрофина была найдена всюду в поперечных сечениям мышцы при лечении B-MSP-PMO, тогда как меньше дистрофина-положительных волокон было обнаружено после лечения BPMO в этой же дозе (Дополнительный Материал, Таблица S1). Фактически экспрессия дистрофина не обнаружена при лечении альтернативным химерным пептидом PMO (MSP-B-PMO) (Рис. 2A). Экспрессия дистрофина в сердце не найдена во всех трех группах, при лечении этой же дозой. Самое поразительное различие между B-MSP-PMO и B-PMO было замечено в мышцах диафрагмы и брюшной полости: продукты пропуска экзона не найдены при лечении B-PMO в этих двух тканях, тогда как обнаружено ∼20% транскриптов с пропуском экзона 23 при лечении B-MSP-PMO, как показано при ОТ-ПЦР (Рис. 2B) и подтверждено анализом последовательности (Рис. 2C). Нужно отметить, что ОТ-ПЦР, вероятно, оценит слишком высоко пропорцию транскриптов с пропуском экзона, учитывая, что транскрипты во всю длину, содержащие мутацию, подвергнутся распаду. Вестерн-блот-анализ показал, что ∼5% нормального уровня дистрофина было восстановлено в ПББМ и квадрицепсе при лечении B-MSP-PMO, тогда как только ∼1% наблюдались в тех же самых тканях при лечении B-PMO (2-ой Рис.). Совместимая с данными иммунного окрашивания, минимальная активность пропуска экзона и белковое восстановление были найдены при лечении MSP-B-PMO (данные, не показанные). Эфективность расширенного системного пропуска экзона при лечении B-MSP-PMO во всех скелетных мышцах. Чтобы полностью исследовать исправляющий сплайсинг потенциал B-MSP-PMO, мы оптимизировали режим дозирования, применяя ту же самую суммарную дозу 18 мг/кг в три еженедельных внутривенных инъекции 6 мг/кг каждая. Когда проведено сравнение непосредственно с B-PMO, B-MSP-PMO оказался очень эффективным в этой дозе, дающей интенсивное исправление во всем теле экспрессии дистрофина в периферических скелетных мышцах, и только на низких уровнях в сердце (Рис. 3A и Дополнительный Материал, Таблица S2). Небольшие изменения в эффективности пропуска экзона наблюдалось между различными группами мышц, при лечении B-MSPPMO, как было сообщено ранее после лечения только PMO. Расширенная эффективность пропуска экзона B-MSPPMO была замечена при ОТ-ПЦР, с незначительным количеством неисправленных транскриптов во всю длину, поддающимися обнаружению в бицепсе, брюшной полости и диафрагме (Рис. 3B). До 25% нормального уровня дистрофина было восстановлено в скелетных мышцах mdx мышей, получавших B-MSP-PMO по сравнению с BPMO, который показал ∼10% нормальных уровней при вестерн-блотт анализом (Рис. 3C и D). Эти результаты ясно продемонстрировали, что B-MSP-PMO увеличивал исправление сплайсинга дистрофина по сравнению с B-PMO. Функциональные и фенотипические улучшения у mdx мышей, получавших B-MSP-PMO. Учитывая высокую активность B-MSP-PMO, мы исследовали его способность восстановить функцию и уменьшать патологию у mdx мышей. Во-первых, мы оценили экспрессию DAPC у mdx мышей, в соотношении с режимом дозы 6 мг/кг. Последовательное иммунное окрашивание показало восстановленную экспрессию и правильную локализацию составляющих белков DAPC β-дистрогликана, α-саркогликана и β-саркогликана при лечении B-MSPPMO, и B-PMO по сравнению с невылеченными mdx мышами (Рис. 4A). У DAPC также есть важные сигнальные функции через nNOS и его восстановление, и правильная локализация была также обнаружена после лечения BMSP-PMO (Рис. 4A). Физически функциональное выздоровление было измерено, используя анализ силы сжатия, который проверяет функциональное восстановление передней конечности. Леченные B-MSP-PMO животные показали значительное увеличение силы в пределах нормального диапазона по сравнению с невылеченными подобранными по возрасту контрольными группами, указывая степень функционального восстановления и близкой корреляции с процентом дистрофин-положительных волокон в бицепсе (Рис. 4B). Обычная гистология леченных BMSP-PMO мышц не приводила явного доказательства токсичности и фиброза (Дополнительный Материал, Рис. S3), и анализ числа центрально образованных ядер, индекса продолжающихся циклов дегенерации/регенерации показал значительно сниженный уровень дегенерации и регенерации в ПББМ, квадрицепсе и икроножной мышце mdx мышей, получавших B-MSP-PMO (P <0.001) по сравнению с невылеченными подобранными по возрасту мышами (Рис. 4C). Наконец, мы проанализировали серологические биохимические показатели включая креатинкиназу (КK). Обнаружено значительное снижение уровня КK после лечения B-MSP-PMO, чем у невылеченных контрольных мышей (Рис. 4D), демонстрируя защитные эффекты системного восстановления дистрофина. Биохимия сыворотки включая аспартатаминотрансферазу (AСT) и аланиновую аминотрансферазу (АЛТ) как индексы функции печени также показали значительные уменьшения по сравнению с невылеченными контрольными группами и находились в пределах нормального диапазона у леченных B-MSP-PMO животных (Рис. 4E). Изменения не наблюдались в моче, и креатинин у леченных B-MSP-PMO mdx мышей не указывал на очевидную почечную токсичность (данные, не показанные). Обсуждение. В этой статье мы впервые показали, что PMO олигомер конъюгированный с химерным пептидом (B-MSP-PMO) , включающим нацеленный на мышечные клетки домен и богатые аргинином последовательности, показал высокую эффективность в восстановлении экспрессии дистрофина, а также мышечной функции и коррекции фенотипа mdx мышей. Наши данные продемонстрировали, что B-MSP-PMO имеет значительный потенциал для восстановления экспрессии дистрофина и уменьшению патологии мышц при МДД в низких дозах, которые могут быть использованы у людей.. Предидущие исследования говорили об использовании нацеленных пептидов для доставки РНК в мозг. Настоящее исследование первое показало как такой подход к доставке АО может привести к генной коррекции у животных, моделей человеческихболезней. Мы совместно с другими исследователями недавно сообщили, что богатые аргинином CPP непосредственно конъюгированный с PMO может вызвать эффективную системную коррекцию сплайсинга у mdx мышей, обеспечивающую значительный прогресс по сравнению с первыми исследованиями с использованием системной доставки АО.В настоящем исследовании проверена гипотеза о том что конъюгированный с нацеленным на клетки пептидом PMO может вызвать увеличение доставки к мышцам и улучшить системную коррекцию сплайсинга. Доказана неэффективность MSP-PMO Дальнейшие исследования нуждаються в понимании механизмов доставки. Однако химерный пептид B-MSP имеет высокую эффективность при коррекции сплайсинга и восстанавлении экспресии дистрофина во всех скелетных мышцах. Используя низкие дозы B-MSP-PMO 6 мг\кг у mdx мышей мы показали высокую эффективность коррекции дистрофина в скелетных мышцах, восстановление структурной интеграции DAPC, значительное увеличение мышечной силы, которое коррелирует с числом дистрофин-положительных волокон. Высокая активность B-MSP-PMO конъюгированного с B-PMO для коррекции сплайсинга у mdx мышей также показана в более низких дозировках (3 мг/кг). В общем, эти данные показывают, что MSP нацеленный пептид потерпел неудачу в восстановлении сплайсинга в отсутствии богатого аргинином домена, но когда они связаны вместе в химерный пептид активность значительно повышается. Неожиданно, что химерный пептид с MSP-B c комбинацией показал низкую активность при восстановлении дистрофина (Рис.. 2A). Последующие исследования с флюорецентным PMO AO in vitro и in vivo показали, что интернализация PMO была облегчена при помощи B-MSP пептида, в то время как альтернативный пептид MSP-B потерпел неудачу. Однако механизм этого не ясен. Для того чтобы верифицировать роль MSP, мы количественно определили концентрацию PMO в мышцах мышей, получавших лечение B-MSP-PMO и B-PMO в дозе 6 мг\кг. Данные распределения в ткани показали высокое поглощение B-MSP-PMO сравнимое с B-PMO в большинстве мышечных групп, различия статистически не значимы. Не наблюдалось существенных различий в немышечных тканях, таких как печень и почки ( данные не показаны) Наша гипотеза состояла в том, что роль пептида заключается в увеличении интернализации АО в мышечные клетки. Данные исследований in vitro, подтверждающие этот факт, показали, что B-MSP-PMO имел самую высокую эффективность в индукции пропуска экзона в mdx мышечных клетках, сравнимую с B-PMO и MSPB-PMO (Wang и соавторы). Обнаруженные небольшие признаки исправления экспрессия дистрофина в сердце (для B-PMO так же как сопряженного B-MSP-PMO), наблюдались, наиболее вероятно, из-за низких доз, используемых в этом исследовании и уровню аффинитета в 2-3 раза ниже, который пептид MSP имеет к сердечной мышце по сравнению со скелетной мышцей. Это подтверждено обнаружением приблизительно 15-20% нормальных дистрофин-положительных волокон в сердце, когда была введена единственная доза 25 мг/кг B-MSP-PMO mdx мышам внутривенно при сравнении с 10% для B-PMO (данные, не показаны). Однако, исправление экспрессии дистрофина в сердце пептидом-PMOs (B-MSP-PMO так же как B-PMO), даже в более высоких дозах, менее эффективно, чем в периферических мышцах. В то время, возможно, что пропуск экзона из преМРНК при МДД менее эффективен в сердце, эффективное исправление дистрофина замечено в основном в культуре кардиомиоцитов, и поэтому наиболее вероятное объяснение в настоящее время состоит в том, что различия в кардиальном микроциркуляторном русле и эндотелиальном барьере предотвращают эффективный доступ PMO, чем в периферических группах мышц. Учитывая значительный потенциал B-MSP-PMO детализированный токсикологический анализ и долгосрочные исследования теперь определят, подходит ли он для клинических исследований у пациентов с МДД. Дальнейшие исследования химерного пептида B-MSP, включая исследование низкой эффективности MSP-B-PMO, поспособствуют синтезу улучшенных версий этого пептида. Материалы и методы Животные Во всех эксперементах использовались 6-8 недельные mdx мыши( 4 мыши в каждой группе) Все исследования согласованны с отделом по использованию животных Оксфордского университета. Все мыши убиты ингаляцией СО2, мышцы и другие ткани заморожены жидким азотом в изопентане. PMO и PMO-конъюгированный пептид Четыре конъюгированных пептида с PMO были синтезированы и очищены в AVI Biopharma Inc. (Корваллис, Орегон, США). Спецификацию и последовательности этих конструкций показаны на рисунке 1A. PMO AO был нацелен на мышиный сайт экзон23/интрон 23 гена дистрофина. Эти четыре пептида называны как MSP, B, B-MSP и MSP-B. Экстракция РНК и ОТ-ПЦР анализ. Полная РНК была извлечена с использованием Trizol (Invitrogen, Великобритания) и 200 нг шаблона РНК использовалось для ОТ-ПЦР с использованием OneStep комплекта (Qiagen, Великобритания). Последовательности праймеров использовались как ранее. Продукты были исследованы электрофорезом на 2%-ом геле агарозы. Системные инъекции. Различное количество PMO-пептида в солевом буфере в объеме 80 мкл были введены в вену хвоста mdx мышей в заключительной дозе 25, 30, 40, 3 и 6 мг/кг, соответственно. Животные были убиты в различные моментах времени после инъекции ингаляцией CO2, и ткани были удалены и заморожены жидким азотом в изопентане и сохранены при −80°C. Иммуногистохимия и гистология. Серии секций по 8 мкм были исследованы на экспрессию дистрофина и дистрофин-связанный белковый комплекс (DAPC) с серией поликлональных антител и моноклональных антител как описано. Окраска гематоксилином, эозином и Azan Mollary использовались, чтобы исследовать полную морфологию мышц и оценить уровень одноядерных клеток и фиброза. Количество волокон с центрально образованными ядрами ПББМ, квадрицепс и икроножные мышцы mdx мышей, получавших PMO-пептид, были исследованы. Чтобы установить число центрально образованных ядро в мышечных волокнах, секции были окрашены поликлональными антителами кролика против дистрофина 2166 и контрастно окрашены с DAPI для ядер клетки (Сигма, Великобритания). Приблизительно 500 дистрофин-положительных волокон для каждого образца ткани были посчитаны и оценено наличие центральных ядер, используя микроскоп AxioVision Zeiss. Волокна были оценены как волокна с центрально образованными ядрами, если одно или более ядер не были расположены в периферии волокна. Невылеченные подобранные по возрасту mdx мыши использовались в качестве контрольных групп. Экстракция белка и вестерн-блоттинг Экстракция белка и вестерн-блоттинг были выполнены как ранее описано. Использовалось различное количество, белков от нормальных мышей C57BL6 как положительный контроль и соответствующее количество белков от мышц леченных или невылеченных mdx мышей. Мембрана была исследована с DYS1 (моноклональное антитело против R8 повторения в дистрофине, 1:200, NovoCastra, Великобритания) для обнаружения дистрофина и α-актина как контроль (моноклональное антитело мыши, 1:3000, Сигма, Великобритания). Связанное основное антитело было обнаружено IgG козы против мыши , меченных пероксидазой и ECL (Amersham Pharmacia Biosciences, Великобритания). Интенсивность сигналов полученных у леченных mdx мышц, была измерена программным обеспечением Image J. Функциональный анализ силы. Леченные мыши и мыши контроля были проверены, используя коммерческий монитор измерения силы (Шатийон, Великобритания). Каждая мышь удерживалась в 2 см от основания хвоста, ей позволено захватить выдающуюся металлическую пластинку, приложенную к аппарату, передними лапами, пластинку мягко тянули, пока они не выпустили ее. Проявленная сила была зарегистрирована, и пять последовательных анализов были выполнены для каждой мыши. Клиническая биохимия. Сыворотка и плазма были немедленно взяты из вены мыши после ингаляции CO2. Анализ серологических КK, AСТ, АЛТ и уровней креатинина был выполнен клинической лабораторией (Центр Mary Lyon, Совет по медицинским исследованиям, Харуэлл, Оксфордшир, Великобритания). Статистический анализ. Все данные сообщены в виде значение± SEM. Статистические различия между группами определены с помощью SigmaStat (Systat Software, UK).. Оригинал статьи: http://hmg.oxfordjournals.org/content/18/22/4405.full?view=long&pmid=19692354 Переведено проектом МОЙМИО http://www.mymio.org/
