БЕССМЕРТНАЯ ВИКТОРИЯ СЕРГЕЕВНА МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОМЕТРИЯ ПРИ БЕСПЛОДИИ
advertisement
На правах рукописи БЕССМЕРТНАЯ ВИКТОРИЯ СЕРГЕЕВНА МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОМЕТРИЯ ПРИ БЕСПЛОДИИ 14.00.15 – Патологическая анатомия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Центральной клинической больнице РАН Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Научный консультант доктор медицинских наук, профессор Самойлов Михаил Владимирович Серебренникова Клара Георгиевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Зайратьянц Олег Вадимович доктор медицинских наук, профессор Коган Евгения Алтаровна Ведущая организация: ФГУ Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН Защита состоится «8» июня 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 Автореферат разослан «27» апреля 2009 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор А.И. Щеголев 2 Актуальность проблемы. Бесплодие представляет собой важную медико-социальную проблему. По данным ВОЗ бесплодными являются почти 15% супружеских пар (В.И. Кулаков, Т.В. Лопатина, 2006), Многим бездетным супружеским парам показано применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в том числе – программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (Б.В. Леонов, В.И. Кулаков, 2004). Однако эффективность методов искусственного оплодотворения до сих пор составляет лишь 10 – 15% на одну попытку (А.П. Лазарев, 2006). Таким образом, поиск причин и разработка методов повышения эффективности ВРТ является одной из актуальных задач современного российского здравоохранения, что отражено в национальном проекте «Здоровье» (Протокол №2 от 21 декабря 2005 г. Президиума Совета при Президенте РФ; Приказ Минздрава РФ № 220 от 29 марта 2006 г.). Решение этой проблемы имеет большое медицинское, социальное и демографическое значение. Роль патологии эндометрия в патогенезе бесплодия несомненна. Ведь именно адекватное морфофункциональное состояние эндометрия является одним из основных факторов, обеспечивающих успешную имплантацию оплодотворенной яйцеклетки и развитие эмбриона. Поскольку для успешного наступления беременности решающее значение имеет состояние эндометрия в 7-10 постовуляторные дни (ПОД), соответствующие 21-24 дням «классического» 28-дневного менструального цикла, особое внимание уделяют морфологической оценке эндометрия именно в этот период, часто называемый «окном имплантации» (Mazur M.T., Kurman R.J., 2005; Crum C.P., Hornstein M.D., 2006 и др.). Для этого, кроме рутинного гистологического исследования соскобов и биоптатов, в последние годы с разным успехом применялись многочисленные (иммуногистохимические) ИГХ маркеры, в том числе: Ki67, PCNA, MUK1, LIF, MAG, Р27, циклин E и другие (Pickartz H. et al., 1990; Li S., Nakayama K. et al., 1993; Hey N.A., Li T.C. et al., 1995; Kliman H.J. et al., 1995; Cullinan E.B. et al., 1996; Lessey B.A., Castelbaum A.J. et al., 2000; Ordi J., Creus M. et al., 2002; Dubowy R.L. et al., 2003 и др.). Особое место в этом ряду занимают показатели рецепции к стероидным гормонам. Но даже в «окне имплантации» естественного цикла данные об экспрессии стероидных рецепторов отличаются у разных исследователей, что во многом связано с использованием различных систем количественной оценки (И.И. Евдоченко, 2004; С.Ю. Ншанян, 2004; Acosta A.A. et al., 2000 и др.). Это еще в большей 3 степени относится к сведениям о стероидной рецепции при различных типах и факторах бесплодия. Состояние рецепторного аппарата эндометрия в условиях гормональной терапии и применения схем стимуляции суперовуляции у женщин, участвующих в циклах ЭКО, является отражением сложных и многофакторных процессов. С одной стороны, гормональные препараты оказывают существенное влияние на систему рецепторов. С другой – нарушения в рецепторном аппарате могут привести к недостаточной восприимчивости эндометрия к экзогенному гормональному воздействию (Acosta A.A. et al., 2000; Crum C.P., Hornstein M.D., 2006). В то же время, сведения о соотношениях между концентрациями гормонов в крови и показателями экспрессии рецепторов к эстрогенам (ЭР) и прогестерону (ПР) при бесплодии противоречивы и фрагментарны (Tuckerman E. et al., 2004). Важным показателем полноценности «окна имплантации» является пролиферативная активность эндометрия, основным маркером которой является белок Ki67. Гораздо менее изучена экспрессия в эндометрии белков Р27 и циклина Е. R.L. Dubowy и соавт. (2003) и S.Lahav-Baratz и соавт. (2004) исследовали Р27 и циклин Е в течение нормального менструального цикла и при стимуляции овуляции перед ЭКО. Однако детальное изучение экспрессии этих белков при различных формах бесплодия и при различной патологии эндометрия не проводилось. Как один из показателей полноценности «окна имплантации» отмечают поверхностную ультраструктуру эндометрия. По мнению G. Nikas и соавт. (1995; 1997) исследование поверхностной ультраструктуры эндометрия дает возможность согласовать время подсадки эмбриона с периодом максимального развития пиноподий и позволяет повысить шансы на успешную имплантацию. Но, в целом, сведения о поверхностной ультраструктуре эндометрия при бесплодии весьма фрагментарны. Таким образом, целостной морфологической и иммуногистохимической характеристики эндометрия при бесплодии, его разных типах и факторах пока не существует. Изучения также требуют многие клинико-морфологические и лабораторно-морфологические корреляции. В то же время, эти данные имеют большое теоретическое, диагностическое и прогностическое значение. Все вышесказанное обусловливает актуальность работы в данном направлении и позволяет обозначить цель и задачи исследования. Цель исследования: представить морфологическую характеристику эндометрия при первичном и вторичном бесплодии и при различных факторах бесплодия; оценить диагностическое и прогностическое значение 4 комплексного гистологического, иммуногистохимического и ультраструктурного исследования эндометрия при подготовке к лечению методами вспомогательных репродуктивных технологий. Задачи исследования 1. Изучить α- и β-эстрогеновую и прогестероновую рецепцию, экспрессию белков Р27 и циклина Е, пролиферативную активность и поверхностную ультраструктуру эндометрия периода нормального «окна имплантации». 2. Изучить патологию эндометрия в соскобах и биоптатах у пациенток с первичным и вторичным бесплодием и с различными факторами бесплодия. 3. Оценить экспрессию рецепторов к эстрогенам α и β и к прогестерону в эндометрии во время предполагаемого «окна имплантации» у пациенток с первичным и вторичным бесплодием, различными факторами бесплодия и различной патологией эндометрия, сопровождающей бесплодие. 4. Исследовать экспрессию фактора пролиферации белка Ki67, белков Р27 и циклина E, регулирующих клеточный цикл, в эндометрии во время предполагаемого «окна имплантации» у данного контингента пациенток. 5. Исследовать особенности поверхностной ультраструктуры эндометрия у пациенток с бесплодием. 6. Оценить соотношения между морфологическими и иммуногистохимическими проявлениями в эндометрии, клиническими типами и факторами бесплодия, показателями гормонального статуса. 7. Определить значение и место комплексного морфологического исследования эндометрия в алгоритме обследования пациенток в рамках программ ВРТ. Научная новизна. Получены новые данные о патологии эндометрия и рецепции к стероидным гормонам в период предполагаемого «окна имплантации» при первичном и вторичном бесплодии и при различных факторах бесплодия. Патология эндометрия (хронический эндометрит, гиперпластические процессы эндометрия, недостаточность лютеиновой фазы) выявлена у всех обследованных пациенток с бесплодием, без существенных различий при первичном и вторичном его типах. Выявлены очевидные отличия нозологического спектра в подгруппах с различными факторами бесплодия. Существенные изменения в экспрессии эстрогеновых рецепторов α и прогестероновых рецепторов обнаружены у пациенток с разными факторами 5 бесплодия и при различной патологии эндометрия, сопровождающей бесплодие. Показана разная степень выраженности повреждения стероидной рецепции в железах и строме эндометрия. Впервые получены количественные данные об экспрессии эстрогеновых рецепторов β. Снижение их количества при бесплодии и выраженные отличия при различной патологии эндометрия могут отражать роль эстрогеновых-β рецепторов в патогенезе бесплодия. Получены новые сведения о пролиферативной активности, регуляции клеточного цикла и поверхностной ультраструктуре эндометрия при бесплодии. Различия экспрессии белков Ki67, Р27 и циклина Е при различных факторах бесплодия объективно отражают неадекватность регуляции клеточного цикла и пролиферативных процессов. Степень отклонения показателей от нормы во многом связана с особенностями нозологического спектра. У всех пациенток с бесплодием и различной патологией эндометрия, сопровождающей его, отмечены существенные дефекты в развитии пиноподий. Практическая значимость. Полученные сведения о гистологических, иммуногистохимических и ультраструктурных особенностях эндометрия при бесплодии представляются важными для патологоанатомической диагностики и гинекологической практики. Данные об экспрессии стероидных рецепторов, белков, регулирующих клеточный цикл, и о развитии пиноподий представляют собой важные диагностические признаки, позволяющие на новом уровне формулировать патологоанатомические заключения по биопсийному материалу и соскобам эндометрия. Результаты исследования открывают новые аспекты в традиционных клинических классификациях и, соответственно, в создании групп пациенток с учетом морфологического и иммуногистохимического исследования биоптатов и соскобов эндометрия. Это дает возможность более точно контролировать эффективность гормонального лечения, обеспечить индивидуальный подход к пациентке, а, следовательно, оптимизировать схемы гормональной терапии. Установленные морфологические и иммуногистохимические особенности эндометрия подчеркивают значимость и необходимость комплексного исследования соскобов и биоптатов в алгоритме обследования пациенток в плане подготовки к лечению бесплодия методами ВРТ. Результаты исследования могут быть использованы в педагогическом процессе в соответствующих разделах курсов патологической анатомии и 6 гинекологии для студентов медицинских ВУЗов и при последипломном обучении патологоанатомов и гинекологов. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Эндометрий женщин с бесплодием в период предполагаемого «окна имплантации» характеризуется значительными гистологическими и иммуногистохимическими особенностями, существенными изменениями поверхностной ультраструктуры. 2. Стероидная рецепция, экспрессия фактора пролиферации, белков, регулирующих клеточный цикл, и поверхностная ультраструктура эндометрия являются важными показателями полноценности «окна имплантации». 3. Комплексное морфологическое и иммуногистохимическое исследование позволяет дополнить алгоритм обследования эндометрия в плане подготовки к лечению бесплодия методами ВРТ. Апробация результатов. Результаты диссертации доложены и обсуждены на объединенном заседании кафедр патологической анатомии лечебного факультета РГМУ, кафедры семейной медицины ММА им. И.М. Сеченова и ЦКБ РАН март 2009 г. Результаты работы, отражающие основные положения диссертации, были представлены на: VIII и XIX Всероссийских научных форумах «Мать и дитя»; Москва; октябрь 2006 г., октябрь 2007 г. XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»; Москва; апрель 2007 г. II Региональном научном форуме «Мать и дитя»; Сочи; апрель 2008 г. научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии»; Москва; февраль 2008 г. на XXVII Конгрессе Международной академии патологии; Афины; октябрь 2008 г. на 3-м съезде Российского общества патологоанатомов; Самара; май 2009 г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, 4 из них в центральной российской и зарубежной печати. Объем и структура диссертации. Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения; 4 глав, посвященных обзору литературы, материалу и методам, результатам собственных исследований и их обсуждению; выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 153 страницах, содержит 29 таблиц, иллюстрирована 41 рисунком, в том числе 33 гистологическими и электронными микрофотографиями. Список 7 литературы содержит 150 наименований (44 отечественных и 106 иностранных авторов). СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Исследование проводилось на клинической базе кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ в патологоанатомическом отделении ЦКБ РАН. В основе работы лежит материал 119 соскобов и биоптатов эндометрия от 102 женщин, поступивших в отделение ВРТ ЦКБ РАН и обратившихся в поликлиники №№ 1, 2, 3 ЦКБ РАН. Клиническая характеристика материала и лабораторные исследования. Обследовано 72 пациентки с бесплодием. Возраст их варьировал от 26 до 44 лет (в среднем 34,2±0,5 лет). Первичным бесплодием (Б1) страдали 38 (52,8%) пациенток, вторичным бесплодием (Б2) – 34 (47,2%). На основании клинического обследования пациентки были разделены на три группы в соответствии с общепринятыми в гинекологической практике факторами (причинами) бесплодия. В первую группу (n=39) вошли пациентки с трубно-перитонеальным фактором бесплодия (Т-пФ), во вторую (n=17) - с эндокринным фактором бесплодия (ЭФ), в третью (n=16) - с эндометриозом. Основной жалобой у всех пациенток было отсутствие беременности в течение более 1 года до обращения при регулярной половой жизни без применения средств контрацепции. Продолжительность бесплодия колебалась от 1 до 16 лет, 5,8±0,4 лет в среднем, а 49 (68,1%) пациенток имели ранее неудачные попытки лечения методами ВРТ (в том числе – внутриматочной инсеминации спермы и ЭКО) в разных клиниках. В ожидаемые 7-10 ПОД (в 21-24 дни 28-дневного менструального цикла (МЦ)) проводились гистероскопия с использованием аппаратуры «Каrl Storz» (Германия), Pipell биопсия эндометрия или, по показаниям, раздельное выскабливание слизистой оболочки цервикального канала и полости матки. Одновременно определялось содержание эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием оборудования и реактивов на твердофазной тест-системе («Hoffman La Roch», Швейцария). Перед введением в полость матки гистероскопа брали мазки для бактериологического исследования. Посев производили на желточно-солевой агар, кровяной агар, среду Эндо и среду MRS. Видовой состав микроорганизмов определяли с помощью систем фирмы «Лахема» (Чехия). 8 В качестве группы сравнения исследовали эндометрий от 30 женщин без гинекологической патологии. Исследован материал, полученный при контрольной биопсии эндометрия в 7-10 ПОД после удаления внутриматочных спиралей и при гистологическом исследовании расцененный как нормальный. Гистологическое исследование. Материал биоптатов и соскобов фиксировали в 10%-м нейтральном формалине. Дальнейшая обработка производилась по стандартной общепринятой унифицированной методике. Тканевые образцы подвергали спиртовой проводке в гистопроцессоре ТР 1020, по длинной программе в течение 23 часов, которая включала: один 10% нейтральный формалин – 2,5 часа, два спирта 75° по 2,5 часа, два спирта 80° по 2 часа, три ксилола по 1,5 часа, один парафин 2 часа, два парафина по 2,5 часа. Заливка в парафиновые блоки проводилась на заливочном центре EG 1160. Срезы толщиной 5 мкм готовили на роторных микротомах RM 2135 и RM 2235 и окрашивали гематоксилином и эозином. Все вышеперечисленное оборудование – фирмы «Leica Microsystems» (Германия). Исследование гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе при увеличениях от х50 до х400. Гистологические заключения формулировали в соответствии с современными стандартами, изложенными в общепринятых фундаментальных руководствах (Н.И. Кондриков 2008; Rosai J., 2004; Mazur M.T., Kurman R.J., 2005; Crum C.P., Lee K.L., 2006), и с учетом требований Международной классификации болезней 10 пересмотра (МКБ 10). Иммуногистохимическое исследование. ИГХ реакции проводили в ступенчатых парафиновых срезах пероксидазно-антипероксидазным методом с демаскировкой антигенов в СВЧ-печи. Для визуализации реакций применяли универсальный пероксидазный набор LSAB+kit («Dako», США). Негативные контрольные реакции проводили с мышиной и кроличьей сывороткой (нормальный мышиный и кроличий иммуноглобулин). Ядра докрашивали гематоксилином Майера. Использовали мышиные моноклональные антитела к эстрогеновым рецепторам α (ЭРα) (клон 1D5 «Dako», США) и прогестероновым рецепторам (ПР) (клон 1А6 «Dako», США), к эстрогеновым рецепторам β (ЭРβ) (клон PPG5/10 «Diagnostic BioSystems» США), к фактору пролиферации – белку Кi67 (клон MIB 1 «Dako», США), а так же антитела к белкам Р27 и Cyklin E, регулирующим клеточный цикл (клоны – DCS-72.F6 и HE12, соответственно, «Diagnostic BioSystems» США). Электронномикроскопическое исследование. Для изучения поверхностной ультраструктуры в сканирующем электронном микроскопе отдельные фрагменты эндометрия фиксировали в 2,5% растворе 9 глутаральдегида, дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. Проводили дегидратацию в растворе ацетона, сушку с СО2 в аппарате «Quorum Technologies» (Англия). Поверхность напыляли золотом в аппарате «Eiko» (Япония) Исследование проводили в сканирующем электронном микроскопе Hitachi S 500 (Япония). Исследование проводили совместно с сотрудниками отдела электронной микроскопии НИИ Морфологии человека РАМН. Количественная обработка материала. Количественный анализ результатов иммуногистохимических реакций проводили под увеличением объектива х400, в участках соскобов и биоптатов с преобладающими диагностическими проявлениями. ИГХ реакция в строме оценивалась только в ее резидентных клетках. Интенсивность ИГХ реакции к ЭРα, ЭРβ и к ПР в ядрах клеток эпителия желез и стромы оценивали по методу гистологического счета H-score по формуле – S=1a+2b+3c, где а – % слабо окрашенных ядер клеток, b – % умеренно окрашенных ядер клеток, с – % сильно окрашенных ядер клеток (McClelland R.A. et al., 1991). Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали: 0-10 баллов – отсутствие экспрессии, 11-100 – слабая экспрессия, 101-200 – умеренная экспрессия, 201-300 – выраженная экспрессия. Применение счета H-score по отношению к экспрессии ЭР β, по имеющимся у нас сведениям, было выполнено впервые. Интенсивность ИГХ реакции к белку Ki67 оценивали в процентах (количество окрашенных ядер на 100 клеток). Интенсивность реакции к белкам Р27 и циклину E оценивали в баллах – 1+ - слабая, 2+ - умеренная, 3+ - выраженная и в процентах (количество окрашенных ядер или цитоплазмы на 100 клеток). Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с использованием системы статистического анализа «Statistica v6.0» и программы «Excel». Описательная статистика включала подсчет среднего значения (М) и стандартной ошибки среднего (м), достоверность определяли по методу Стьюдента с использованием формулы t=M1-M2/√м1² +м2² (р<0,05), рассчитывали коэффициент вариации по формуле CV=σ/M. Проводили корреляционный анализ, при котором показатель корреляции менее 0,4 считали не значимым и не учитывали, если коэффициент был равен 0,4 - 0,5 – корреляционная связь считалась слабой, от 0,5 до 0,7 – средней, от 0,7 и выше – сильной (Г.Г. Автандилов, 1973). Результаты исследования и их обсуждение. Исследование эндометрия в группе сравнения показало, что в период 7-10 ПОД у обследованных женщин существовало открытое «окно 10 имплантации». Это, в первую очередь, подтверждают соответствующие данному периоду МЦ секреторные проявления, обнаруженные при гистологическом исследовании. Уровень экспрессии ЭРα в железах и в строме низкий (63,2+6,7 H-score), экспрессия ПР в железах эндометрия умеренная (132,5+9,5 H-score), в строме – выраженная (208,8+11,6 H-score). Пролиферативная активность клеток эпителия желез крайне низкая, в строме – слабая. Локализация Р27 и циклина Е в ядрах свидетельствует о блокировке клеточного цикла во всех клетках желез и в большей части клеток стромы. Наличие циклина Е в цитоплазме части клеток стромы свидетельствует о еще продолжающейся активности клеточного цикла. Так как, по общепринятым представлениям, именно строма играет важную роль в процессах имплантации и развития беременности, протекающие в части ее клеток процессы роста и дифференцировки вполне логичны. О том, что строма поддерживается в активном состоянии на протяжении всего «окна имплантации», свидетельствуют также высокий уровень в ней ПР и наличие слабой пролиферативной активности. Развитые пиноподии на поверхности эндометрия также отражают существование открытого «окна имплантации» у обследованных женщин группы сравнения. По некоторым официальным статистическим данным эндометриальная патология, как первопричина бесплодия, составляет всего 3,2% (Crum C.P., Hornstein M.D., 2006). В тоже время, патология эндометрия была обнаружена нами у всех обследованных пациенток с бесплодием. Это выглядит парадоксальным только на первый взгляд. В работе представлен материал биоптатов и соскобов эндометрия, которые выполнялись только по строгим клиническим показаниям, основными из которых являлись – подозрение на патологию эндометрия или цервикального канала, нарушения менструального цикла. Таким образом, был изучен лишь определенный «пласт» пациенток, обратившихся в отделение ВРТ. Охватить спектр патологии у всех бесплодных женщин практически невозможно, структура и частота патологии эндометрия в нем неизбежно будет отличаться от выявленной нами. Но, в любом случае, процент ее среди бесплодных женщин высок. Патология эндометрия может и не быть первоначальной причиной бесплодия, но она всегда принимает роль значимого самостоятельного фактора, дополняет и усугубляет первопричины заболевания. На основании данных объективного, инструментального и лабораторного обследования пациентки были разделены на подгруппы по принципу первичного и вторичного бесплодия и факторов бесплодия (рис.1). Это деление считается общепринятым в гинекологической практике (Назаренко Т.А. и др. 2004; И.В. Корнеева, Т.П. Лопатина, 2006), несмотря на 11 его определенную условность из-за сочетания разных факторов у многих женщин с бесплодием. Т-пФ считали основным при отсутствии маточных труб или их непроходимости, подтвержденной данными гистеросальпингографии, хромосальпингоскопии. ЭФ выделяли в связи с синдромом склерокистозных яичников, гиперпролактинемией, снижением овариального резерва, что было подтверждено данными инструментальных и лабораторных исследований при отсутствии патологии матки и маточных труб. Эндометриоз, выявленный при помощи гистероскопии и лапароскопии, считали основной причиной бесплодия при исключении (или минимальных проявлениях) другой патологии. Рисунок 1. Диаграмма. Распределение пациенток на группы с различными факторами при первичном и вторичном бесплодии. 40 35 30 25 Т-пФ % 20 ЭФ эндомет риоз 15 10 5 0 в се Б1 Б2 При Б1 по сравнению с Б2 преобладали пациентки с ЭФ и эндометриозом (в сумме 58%), в то же время при Б2 67% составили пациентки с Т-пФ. Средняя продолжительность бесплодия была наиболее высокой у женщин с эндокринным фактором, а наиболее низкой – при трубноперитонеальном. При изучении экстрагенитальных заболеваний в анамнезе обращает на себя внимание высокая частота перенесенных вирусных и бактериальных инфекций не только в детском, но и в старшем возрасте, причем практически без различий во всех подгруппах. Что, несомненно, могло сыграть важную роль в патогенезе бесплодия. Из соматических заболеваний у пациенток с Б1 преобладали заболевания органов дыхания и остеохондроз, а заболеваниями желудочно-кишечного тракта чаще страдали больные с Б2. Ожирение закономерно встречалось чаще у пациенток с ЭФ. При Т-пФ в анамнезе более частой была патология органов дыхания и мочевыводящей системы. Изучение спектра гинекологических заболеваний в анамнезе и при объективном обследовании выявило закономерные 12 особенности в подгруппах. Инфекции и воспалительные заболевания значительно преобладали у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием. Такие заболевания как миома и патология шейки матки чаще встречались у пациенток с бесплодием, обусловленным эндометриозом. Очевидной выглядит высокая частота оперативных вмешательств на внутренних половых органах в группе с Т-пФ. Однако частота операций на других органах не имела различий у обследованных пациенток. Так же не имел существенных отличий в подгруппах средний возраст становления менархе, продолжительность менструального кровотечения и длительность МЦ. Беременности в анамнезе имели 34 пациентки, более половины из них (55,9%) – только одну. Искусственные аборты и самопроизвольные выкидыши наиболее частыми были у больных эндометриозом. Внематочные беременности были у 10 пациенток, 9 из них страдали трубноперитонеальным бесплодием. 68,1% обследованных нами женщин имели ранее неудачные попытки лечения методами ВРТ в разных клиниках. В основном, ВРТ использовали пациентки с Б1 и Т-пФ. В качестве метода ВРТ чаще использовалось ЭКО. Обращает на себя внимание, что исследование гормонального профиля не показало существенных отличий в подгруппах. Средние показатели сывороточных гормонов в основном находились в пределах референсных значений. Незначительные отклонения в показателях сывороточного эстрадиола обнаружены у 4 пациенток (3 из них с Т-пФ), прогестерона – у 12 (6 из них с ЭФ). Причем достоверных отличий в спектре гистологически выявляемой патологии эндометрия, экспрессии стероидных рецепторов, фактора пролиферации и белков, регулирующих клеточный цикл, у этих женщин не обнаружено. Анализ клинических данных показал определенные различия между подгруппами. Однако клинико-лабораторные показатели были с одной стороны очень разнообразными и разнородными, а с другой – повторялись и пересекались у многих пациенток различных групп. Спектр патологии эндометрия при Б1 и Б2 представлял, естественно, одни и те же нозологические формы, но с рядом отличий по их частоте (рис.2). Недостаточность лютеиновой фазы (НЛФ) была преобладающим типом патологии в группе с Б1 и превосходила по частоте встречаемости НЛФ при Б2. Гистологически НЛФ проявлялась отставанием секреторных изменений в железах в среднем на 5 дней. В то же время, при Б2 по сравнению с Б1 на ведущей позиции оказываются полипы (ПЭ) и гиперплазия эндометрия (ГЭ). ГЭ имела вид простой неактивной очаговой гиперплазии, а ПЭ имели «классические» опорные диагностические признаки. Такие различия в 13 спектре патологии выглядят вполне логично, учитывая разные по частоте причины бесплодия при Б1 и Б2 (рис.2). Это наиболее четко видно при разделении пациенток на группы с различными факторами бесплодия. Рисунок 2. Диаграмма. Спектр патологии эндометрия при различных видах и факторах бесплодия. 60 50 40 НЛФ ГЭ % 30 ХЭ ПЭ 20 10 0 Б1 Б2 Т-пФ ЭФ Эндометриоз Спектр патологии эндометрия при различных факторах бесплодия существенно различался (рис.2). Так при Т-пФ преобладали ПЭ и ГЭ. При эндометриозе, по сравнению с другими группами, ведущей была НЛФ, а при ЭФ преобладал ХЭ. Эти отличия могут быть объяснены тем, что Т-пФ и эндометриоз в той или иной степени сопровождаются эндокринными нарушениями, но они не оказываются основными в патогенезе бесплодия, а ЭФ, являясь основным ведущим, в анамнезе заболевания неоднократно подвергался гормональной коррекции. Новые аспекты открываются при исследовании спектра патологии при различных факторах бесплодия у пациенток с Б1 и Б2. У пациенток с Т-пФ НЛФ преобладала при Б1 (35%), а ГЭ – при Б2 (29,2%), ХЭ и ПЭ обнаруживались с одинаковой частотой и при Б1 и при Б2. У пациенток с ЭФ ПЭ выявлялись только при Б1, НЛФ преобладала при Б1 (37,5%), а ХЭ значительно преобладал при Б2 (50%). В группе с эндометриозом ГЭ и ХЭ выявлены только при сочетании с Б1, а НЛФ и ПЭ преобладали при сочетании с Б2 (55,5% НЛФ и 44,4% ПЭ). В группах с Т-пФ и ЭФ вполне логичным оказывается преобладание НЛФ при Б1, а при эндометриозе НЛФ преобладала при Б2, что является вполне объяснимым и, в некоторой степени, отражает эндокринные нарушения при эндометриозе, не зависящие от типа бесплодия. 14 Стероидная рецептивность эндометрия при бесплодии существенно изменена. Эти изменения проявлялись и при Б1, и при Б2 в достоверном снижении количества ПР в стромальных клетках и достоверно повышенной экспрессией ЭРα и в клетках желез, и в клетках стромы. Достоверных отличий в показателях H-score ЭРα и ПР между Б1 и Б2 не обнаружено. И общая картина показателей в целом похожа. Однако уровни ПР и ЭРα в железах имели тенденцию к несколько более высоким показателям при Б 2 по сравнению с Б1, а в строме – к более низким (табл.1). Таблица 1. Рецепторы к эстрогенам (α) и прогестерону в эндометрии женщин с бесплодием, H-score. М+м. ПР в железах ПР в строме ЭРα в железах ЭРα в строме Норма (n=30) 132,5+9,5 208,8+11,6 63,2+6,7 89,8+4,1 Б1 и Б2 (n=72) 139,3+8,2 183,1+5,7 149,7+8,3* 121,9+6,7* Б1 (n=38) Т-пФ (n=39) 131,5+11,0 148,1+12,3 150,6+11,5 187,3+6,8 176,9+9,0* 179,8+8,9* 141,7+11,9* 158,6+11,4* 157,6+11,2* 126,6+9,4* 116,8+9,7* 123,6+9,6* ЭФ (n=17) 136,1+15,7 190,6+8,9 130,4+18,6* 129,2+13,9* Эндометриоз (n=16) Т-пФ приБ1(n=16) 115,3+16,9 180,0+8,5* 150,9+16,0* 110,3+12,8 140,3+17,4 186,8+11,4 161,9+17,6* 135,4+12,8* Т-пФ приБ2(n=23) 156,6+16,0 177,2+13,5 154,5+15,5* 119,4+13,5* 197,9+9,7 156,7+7,2* 167,3+13,3* 122,1+20,9* 169,0+39,5* 129,6+23,8* 129,0+16,3* 130,7+20,7* 79,9+20,6 Б2 (n=34) ЭФ при Б1 (n=14) 125,6+17,8 ЭФ при Б2 (n=3) 184,7+8,6* Эндометриоз при 121,7+25,4 Б1 (n=8) Эндометриоз при 110,2+23,8 189,9+10,3 166,1+21,7* Б2 (n=8) * - показатель статистически достоверно (р<0,05) отличается от нормы. 117,8+14,0* Нами впервые были получены количественные данные H-score, характеризующие экспрессию ЭРβ в ядрах клеток эпителия желез и стромы эндометрия. В нормальном эндометрии группы сравнения уровень ЭРβ и в железах, и в строме был средним и составил в железах – 110,3+3,6 баллов, в строме – 123,3+7,0 баллов. При бесплодии в целом экспрессия ЭРβ была ниже, чем в норме, что говорит о недостаточном количестве рецепторов этого класса и в железах и в строме. В свете данных о том, что ЭРβ в эндометрии ответственны за процессы секреции в железах и децидуальной трансформации в строме (Lecce G. et al., 2001; Taylor L.J. et al, 2005; Tessier C. et al., 2000) и, несомненно, играют не менее важную роль в формировании полноценного «окна имплантации», чем другие факторы, недостаток ЭРβ в 15 эндометрии пациенток с бесплодием приобретает особое значение. Уровень ЭРβ при Б1 был несколько выше, чем при Б2. При бесплодии выявлены достоверные отличия в экспрессии белков Р27 и циклина Е, регулирующих клеточный цикл. Исследование эндометрия группы сравнения показало, что в норме в период «окна имплантации» происходит активная блокировка клеточного цикла в большинстве клеток эпителия желез и стромы, о чем свидетельствует наличие Р27 в ядрах. Слабая окраска циклина Е в небольшой части ядер свидетельствует о необратимой инактивации комплекса циклин Е+циклинзависимая киназа 2. Однако небольшой части клеток стромы циклин Е обнаружен и в цитоплазме, что свидетельствует о еще продолжающихся процессах митотического цикла. Митотическая активность может быть отражением важной роли стромы эндометрия в процессе имплантации и развития беременности. При бесплодии Р27 выявлялся и в ядрах, и в цитоплазме, как в железах, так и в строме. Но основным отличием от нормы явилось наличие цитоплазматического окрашивания. При Б2 процент окрашенных ядер был достоверно выше нормы. В эпителии желез циклин Е выявлялся и в ядрах, и в цитоплазме, а количество ядер лишь немного превышало нормальные показатели. Цитоплазматическое же окрашивание выявлялось в большинстве клеток. В строме также выявлялось и ядерное, и цитоплазматическое окрашивание циклина Е, причем количество клеток с окрашенной цитоплазмой значительно превышало показатели группы сравнения. Отличия в экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл, у бесплодных женщин свидетельствуют об активности клеточного цикла (или предпосылках к ней) и в железах, и в строме эндометрия, что явно не соответствует нормальному «окну имплантации». Различий ИГХ реакции на белок Р27 при Б1 и Б2 не выявлено. В то же время, обнаружены различия в экспрессии циклина Е. И в железах, и в строме цитоплазматическое окрашивание преобладало при Б1 и по количеству клеток, и по интенсивности, а количество окрашенных ядер в строме при Б1 было достоверно ниже, чем при Б2. Это свидетельствует о том, что при Б1 митотический цикл активен в большем числе клеток, чем при Б2. Пролиферативная активность в эндометрии при бесплодии достоверно отличалась от нормы. Показатели экспрессии Ki67 во многих группах в разы превосходили таковые у здоровых пациенток. Стоит особо подчеркнуть, что митотическая активность в эндометрии при Б1 была достоверно выше, чем при Б2, что коррелирует с соответствующими особенностями экспрессии циклина Е. Такие различия в показателях можно объяснить, исходя из 16 предположения об изначально измененных свойствах ткани эндометрия у первично бесплодных женщин. Рецепция к эстрогенам и прогестерону в группах с различными факторами бесплодия не проявила существенных особенностей (табл.1). В железах количество ЭРα и ПР было несколько выше при Т-пФ, а в строме рецепция к эстрогенам и прогестерону имела тенденцию к более высоким показателям у женщин с ЭФ, чем в группах с Т-пФ и эндометриозом. Разделение на подгруппы пациенток с Б1 и Б2 по принципу факторов также не выявило существенных особенностей. Это можно объяснить только разнородностью групп пациенток, сформированных на сугубо клинической основе. Были обнаружены особенности в экспрессии регулирующих клеточный цикл белков – Р27 и циклина Е – при различных факторах бесплодия. Экспрессия Р27 при Т-пФ отличалась от нормы большим количеством окрашенных ядер в железах и наличием цитоплазматического окрашивания и в железах, и в строме. Циклин Е выявлялся в большем количестве ядер, а в цитоплазме с большей интенсивностью и в железах и в строме. При ЭФ показатели Р27 в железах практически не отличались от нормальных показателей группы сравнения, а в строме в ядрах белок выявлялся с большей интенсивностью, а цитоплазматическое окрашивание было слабой интенсивности. Экспрессия циклина Е в ядрах практически не отличалась от нормы, но, также как при Т-пФ, выявлено цитоплазматическое окрашивание в клетках желез. При эндометриозе в эпителии желез Р27 выявлен в большинстве ядер, в стромальных клетках Р27, как и при других факторах выявлен и в ядрах и в цитоплазме, но с большей интенсивностью. Экспрессия циклина Е при эндометриозе практически не отличалась от таковой при других факторах. Эти данные показывают, что при Т-пФ адекватная блокировка митотического цикла происходит в меньшем количестве клеток, чем при других факторах бесплодия. Закономерными выглядят особенности экспрессии Ki67 при различных факторах бесплодия (рис.3). Пролиферативная активность значительно преобладала при Т-пФ и в железах и в строме, в то время как, при ЭФ была выше, чем при эндометриозе. Особенности в пролиферативной активности обнаружены и между пациентками с одним и тем же фактором, но при различных типах бесплодия (Б1 и Б2). При всех факторах у пациенток с Б1 пролиферативная активность имела тенденцию к более высоким показателям и в железах, и в строме, чем при Б2. При эндометриозе экспрессия Кi67 в случае Б1 была достоверно выше, чем при Б2. 17 Рисунок 3. Диаграмма. Фактор пролиферации при различных типах и факторах бесплодия и при различной патологии эндометрия, сопровождающей их. 20 18 16 14 12 железы % 10 строма 8 6 4 2 0 норма Б1 Б2 Т-пФ ЭФ эндометриоз НЛФ ГЭ ХЭ ПЭ Достоверные и яркие различия пролиферативной активности в железистых и стромальных клетках при разных факторах бесплодия объективно отражают неадекватность пролиферативных процессов и степень их отклонения от нормы. Таким образом, эндометрий женщин с бесплодием в период предполагаемого «окна имплантации» характеризуется значительными гистологическими и иммуногистохимическими особенностями. Установлен ряд общих черт, характерных для групп, разделенных на основании сугубо клинических признаков (Б1, Б2, Т-пФ, ЭФ, эндометриоз). Это подчеркивает принципиальную правильность существующих стандартов группировки пациенток. Но так же очевидно, что традиционные «клинико-лабораторные» группы – весьма разнородны по состоянию эндометрия. При анализе особенностей патологических процессов в эндометрии, сопровождающих бесплодие, выявляются новые аспекты. Наибольшие отклонения в стероидной рецепции закономерно обнаружены при, ГЭ (табл.2), это касается в основном экспрессии ЭРα и ПР в железах эндометрия, она значительно (до 3 раз для ЭР) превышала показатели группы сравнения. При НЛФ отмечалась повышенная экспрессия ЭРα и в железах, и в строме. Экспрессия ПР в железах была несколько выше нормы, а в строме – ниже нормы. Эти изменения могут быть обусловлены недостаточным снижением уровня рецепции эстрогенов и в железах, и в строме, а также рецепции прогестерона в железах, которое должно закономерно происходить в секреторную фазу. Тем не менее ПР в строме 18 должны сохраняться на высоком уровне в период «окна имплантации», а у пациенток с бесплодием этого не происходит, что, вероятно, обусловлено их недостаточным синтезом в эндометрии, неадекватно подготовленном к «окну имплантации» в течение фолликулярной фазы МЦ. Наиболее низкие показатели ПР выявлены в железах и в строме ПЭ. В то же время экспрессия ЭРα в железах и в строме ПЭ, как и при другой патологии эндометрия, была выше нормальных значений. Это можно объяснить тем, что полип изначально является очагом, отличающимися неадекватной рецептивностью к стероидным гормонам. Закономерное повреждение рецепторного аппарата при хроническом воспалении с иммунным компонентом подтверждают выявленные нами изменения стероидной рецепции при ХЭ. Таблица 2. Рецепторы к эстрогенам (α) и прогестерону при различной патологии эндометрия, H-score. М+м. ПР в железах ПР в строме ЭРα в железах ЭРα в строме Норма (n=30) НЛФ (n=29) 132,5+9,5 158,3+11,4 208,8+11,6 191,6+6,9 63,2+6,7 149,4+13,8* 89,8+4,1 118,4+10,6* ГЭ (n=14) 193,9+8,3* 156,3+16,7* 196,9+14,6* 138,6+16,4* ХЭ (n=11) 154,4+23,4 165,5+9,6* 173,5+17,6* 112,5+17,1 ПЭ (n=27) 85,5+11,1* 187,2+8,8 121,0+11,5* 116,1+11,0* * - показатель статистически достоверно (р<0,05) отличается от нормы. Отмечены особенности экспрессии ЭРβ при различной патологии эндометрия, сопровождающей бесплодие. Они выражались в разной степени снижения экспрессии по сравнению с группой сравнения, наибольшей при ГЭ и ХЭ. При ГЭ и ХЭ Р27 в железах выявлялся только в цитоплазме, что свидетельствует о его неактивном состоянии. Циклин Е был выявлен в цитоплазме железистых клеток с высокой интенсивностью. Учитывая биологическую сущность белков Р27 и циклина Е, эти показатели свидетельствуют о выраженной активности клеточного цикла, характерной для пролиферативных процессов. При ГЭ и ХЭ Р27 и циклин Е также обнаружены в цитоплазме большого количества стромальных клеток с умеренной и высокой интенсивностью. Показатели регуляции клеточного цикла в ПЭ и при НЛФ отличались от нормы наличием, помимо ядерного, слабого цитоплазматического окрашивания Р27 в строме и наличием цитоплазматического окрашивания циклина Е высокой и средней интенсивности и в железах, и в строме. В свете этого, значительные отклонения пролиферативной активности при различной патологии эндометрия выглядят вполне логичными. Самые высокие показатели 19 пролиферативной активности и в железах, и в строме закономерно выявлены при ГЭ (табл.3, рис.3). При НЛФ экспрессия Ki67 в клетках эпителия желез была в 8 раза больше нормальных значений для «окна имплантации», а в клетках стромы – в 2 раза. Высокие показатели Ki67 при ХЭ отражают активность процессов пролиферации, связанных с воспалением. В ПЭ экспрессия белка Ki67 в клетках эпителия желез несколько ниже, чем при другой патологии эндометрия, а в клетках стромы – выше нормы в 2,3 раза. Это соответствует современным представлениям о полипе как о моноклональном стромальном пролиферате с относительно ареактивным железистым компонентом. Таблица 3. Пролиферативная активность (экспрессия белка Кi67) при различной патологии эндометрия, % окрашенных ядер. М+м. Эпителий желез Клетки стромы ГЭ (n=14) 0,7+0,3 5,1+1,2* 19,3+4,8* 3,5+0,6 6,9+0,8* 13,9+3,4* ХЭ (n=11) 7,3+4,6* 9,0+1,2* ПЭ (n=27) 2,1+1,3* 8,3+0,8* Норма (n=30) НЛФ (n=29) * - показатель статистически достоверно (р<0,05) отличается от нормы. Исследование корреляционных связей между стероидными рецепторами и фактором пролиферации при бесплодии выявило, наряду с ожидаемыми закономерностями, и некоторые особенности. Сильная положительная корреляция обнаружена между количеством ПР и ЭРα в железах и показателем пролиферации в железах, что выглядит вполне закономерным. Логичным представляется также тот факт, что ПР в строме и Ki67 в железах имеют слабую отрицательную корреляционную связь. Особенностью же явилось отсутствие каких-либо значимых корреляционных связей между значениями H-score стероидных рецепторов (и в железах, и в строме) и стромальной экспрессией Ki67. Это указывает на дисбаланс стероидной рецепции и пролиферативной активности при бесплодии, в первую очередь, в строме эндометрия, которая является наиболее важным компонентом полноценного «окна имплантации». При исследовании корреляционных связей между экспрессией белков, регулирующих клеточный цикл, фактором пролиферации и стероидной рецепцией получены ожидаемые отрицательные и положительные корреляционные коэффициенты в основном для блокирующего клеточный 20 цикл белка Р27. Его ядерное окрашивание, как в железах, так и в строме имеет сильные отрицательные связи с ЭРα и Ki67 и в железах, и в строме, а также с ПР в железах, а с ПР в строме – обнаружена положительная корреляция. В то же время цитоплазматическое окрашивание Р27 обнаруживает диаметрально противоположные корреляционные связи. Эти данные характеризуют закономерную связь экспрессии белка, блокирующего клеточный цикл со стероидной рецепцией и пролиферативной активностью, которая сохраняется в эндометрии у бесплодных пациенток. В отличие от Р27, экспрессия циклина Е не показала четких и закономерных корреляционных коэффициентов. Обнаружена только умеренная отрицательная корреляция между ядерным окрашиванием в железах и ЭРα в железах, слабая положительная корреляция между цитоплазматическим окрашиванием в железах и ЭРα в железах, а ядерное окрашивание в строме положительно коррелирует с ПР в железах и отрицательно – с ПР в строме. Отсутствие четких корреляционных связей для циклина Е является свидетельством дисбаланса между стероидной рецепцией, пролиферативной активностью и процессами активации клеточного цикла в эндометрии у бесплодных женщин. Важность морфологического и ИГХ исследования подчеркивается также своеобразием корреляционных связей между показателями экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии и уровнями соответствующих им гормонов в сыворотке крови у обследованных пациенток. В норме эстрадиол в фазе пролиферации усиливает синтез собственных рецепторов и рецепторов прогестерона. Во второй фазе менструального цикла прогестерон подавляет синтез как ПР, так и ЭР. Следовательно, закономерно должны выявляться существенные положительные и отрицательные корреляционные связи между концентрацией стероидных гормонов в крови и показателями рецепции в эндометрии (Tuckerman E. et al., 2004). В тоже время, у обследованных нами пациенток с бесплодием обнаружены только единичные отрицательные корреляционные коэффициенты между прогестероном крови и ЭРα в железах, а по остальным показателям не выявлено какой-либо статистически значимой корреляционной зависимости. Это касается, как больных с Б1, Б2 и с различными факторами бесплодия, так и пациенток с разной патологией эндометрия. При исследовании гормонального профиля пациенток средние показатели эстрадиола и прогестерона в группах не имели достоверных различий и находились в пределах референсных значений репродуктивного возраста. Некоторые отклонения показателей гормонального профиля закономерно отмечены в группе с ЭФ бесплодия. В свете этого, отсутствие 21 четких корреляционных связей выглядит особенно значимым, поскольку может отражать дисбаланс гормональной регуляции стероидного рецепторного аппарата на уровне эндометрия и свидетельствовать о его повреждении. Существенным представляется тот факт, что изменения в строме, касающиеся показателей стероидной рецепции, при бесплодии были более выражены, чем в железах. Это важно в свете современных представлений о том, что именно строма играет решающую роль в успешной имплантации (М.Х. Ашхаб, 2003; Ferenczy A., 2003; Mazur M.T., Kurman R.J., 2005). Повреждение стероидной рецепции стромы, с одной стороны, может отражать главное звено в патогенезе бесплодия, с другой – служить важным диагностическим маркером в плане количественной оценки экспрессии стероидных рецепторов именно в строме эндометрия. Дополнительным показателем полноценности «окна имплантации» является поверхностная ультраструктура эндометрия. Показано, что в этот период на поверхности клеток появляются характерные выросты цитоплазмы – пиноподии (Acosta A.A., et al. 2000). Значение пиноподий в процессе имплантации дискутабельно (Adams S.M. et al., 2002; Achache H., Revel A., 2006), но, как один из маркеров адекватного «окна имплантации», они вполне могут быть использованы. У пациенток с бесплодием отмечены дефекты в развитии пиноподий. Если в группе сравнения на поверхности эндометрия, гистологически соответствующего нормальному «окну имплантации», определяются многочисленные крупные пиноподии, практически скрывающие микроворсинки, то пиноподии при бесплодии, либо отсутствовали вовсе, либо были немногочисленными и находились на начальных этапах развития. При различной патологии эндометрия, сопровождающей бесплодие, изменения поверхностной ультраструктуры были наиболее показательны. При НЛФ обнаружены лишь единичные пиноподии на начальных стадиях развития. При ХЭ и ГЭ поверхность клеток практически гладкая, пиноподии отсутствуют. При полипах эндометрия поверхностная ультраструктура отличается «пестротой» в разных участках. Анализ клинико-лабораторных данных предоставляет много важной информации для диагностики бесплодия, распределения пациенток на группы в соответствии с его факторами и типами, а, значит, позволяет применять дифференцированный подход к лечению. Но полученные нами данные о многообразии патологии эндометрия при бесплодии, о нарушениях эстрогеновой и прогестероновой рецепции, об изменениях пролиферативной активности, регуляции клеточного цикла и поверхностной 22 ультраструктуры делают очевидной необходимость комплексного клинико-лабораторно-морфологического обследования. Оно, несомненно, может дать основания для более точного выбора тактики лечения каждой конкретной пациентки. Не менее важной является оценка состояния эндометрия перед назначением гормональной терапии, очень «жесткой», но, в то же время, неизбежной в программах ВРТ. Восприимчивость эндометрия к воздействию эндогенных гормонов и гормональных препаратов может быть достоверно определена только с применением соответствующих ИГХ маркеров. Рутинная гистология, иммуногистохимические реакции и изучение поверхностной ультраструктуры показывают, что у пациенток, страдающих бесплодием, «окно имплантации» неполноценно. Проведенное нами исследование дает новую, подчас неожиданную информацию, важную для подготовки пациенток к лечению ВРТ. Это по значимости вполне соответствует патологоанатомическому исследованию эндометрия в гинекологической практике вообще. На основании этого мы предлагаем алгоритм клиникоморфологического обследования эндометрия в плане подготовки к лечению бесплодия методами ВРТ (рис.4). Комплекс клинического, лабораторного и инструментального исследования должен включать: сбор жалоб и анамнеза, общее и специальное гинекологическое обследование, проведение функциональных проб, изучение гормонального профиля, УЗИ органов малого таза в динамике менструального цикла, допплерометрию и обследование на урогенитальные инфекции. Значимость этих данных неоценима на всех этапах обследования. Во-первых, они позволяют выявить факторы бесплодия; во-вторых, необходимы для правильной интерпретации морфологических феноменов, наконец, - представляют неотъемлемые аргументы при выборе способов коррекции обнаруженных в эндометрии нарушений. Но исполнение этого алгоритма требует существенной детализации и модернизации морфологического исследования тканевого материала эндометрия с использованием, как минимум, шести иммуногистохимических маркеров, отражающих состояние стероидной рецепции, пролиферативной активности и особенности клеточного цикла эпителиальных и стромальных клеток, а также, по возможности, сканирующей электронной микроскопии. 23 24 ВЫВОДЫ 1. Эндометрий периода нормального «окна имплантации» характеризуется гистологическими проявлениями 7-10 постовуляторного дня, низкой экспрессией эстрогеновых-α рецепторов (63,2+6,7 H-score), умеренной экспрессией эстрогеновых-β (110,3+3,6 H-score) и прогестероновых (132,5+9,5 H-score) рецепторов, низкой пролиферативной активностью. Локализация Р27 и циклина Е в ядрах клеток свидетельствует о блокировке клеточного цикла. Поверхностная ультраструктура эндометрия характеризуется наличием многочисленных развитых пиноподий. 2. Патология эндометрия была обнаружена во всех исследованных соскобах и биоптатах у пациенток с бесплодием. Спектр патологии при первичном и вторичном бесплодии не имел существенных отличий. Наиболее частыми были недостаточность лютеиновой фазы (35,8%) и полипы эндометрия (33,3%). Недостаточность лютеиновой фазы преобладала при эндокринном факторе и эндометриозе, а при трубно-перитонеальном факторе превалировали полипы. При трубно-перитонеальном бесплодии значительную долю патологии составила также гиперплазия эндометрия, а при эндокринном факторе – хронический эндометрит. 3. При бесплодии имело место значимое повышение экспрессии α-эстрогеновых рецепторов, без достоверных различий между первичным и вторичным типами бесплодия. Стромальная экспрессия была наибольшей при эндокринном факторе, а эстрогеновая рецептивность железистого эпителия – при трубно-перитонеальном факторе. В то же время, экспрессия α-эстрогеновых рецепторов при эндометриозе достоверно от нормы не отличалась. Количество ЭРα закономерно варьировало в соответствии с патологией эндометрия – от 196,9+14,6 баллов H-score при гиперплазии эндометрия до 112,5+17,1 баллов при хроническом эндометрите. 4. Экспрессия прогестероновых рецепторов при бесплодии была существенно понижена в строме, тогда как в железах она мало отличалась от нормы. Нарушенная прогестиновая рецептивность стромы, без достоверных различий между типами и факторами бесплодия, может отражать одно их центральных звеньев патогенеза этого заболевания. 5. Впервые полученные количественные данные об экспрессии эстрогеновых-β рецепторов выявляют достоверное снижение этого 25 показателя, особенно при вторичном бесплодии (91,4+12,8 H-score). Это может отражать роль ЭРβ в патогенезе бесплодия. Установлены достоверные различия числа эстрогеновых-β рецепторов при различной патологии эндометрия – от 144,7+7,9 баллов H-score в полипах до 40,5+11,5 баллов при гиперплазии. 6. Во всех исследованных соскобах и биоптатах эндометрия при бесплодии пролиферативная активность была достоверно выше, чем в нормальном «окне имплантации». При первичном бесплодии показатель Ki67 вдвое превосходил таковой при вторичном бесплодии. При трубно-перитонеальном факторе значение Ki67 и в железах, и в строме (8,8+2,9% и 9,8+1,6% соответственно) было выше, чем при других факторах бесплодия. 7. Белки Р27 и циклин Е, регулирующие клеточный цикл, обнаружены при бесплодии не только в ядрах, но и в цитоплазме железистых и стромальных клеток. Это отражает неполноценную блокировку клеточного цикла, необходимую для адекватного «окна имплантации». Максимальное цитоплазматическое окрашивание выявлено при трубно-перитонеальном и эндокринном факторе, особенно в сочетании с гиперплазией эндометрия. 8. Поверхностная ультраструктура эндометрия при бесплодии характеризуется существенными особенностями, касающимися, в первую очередь, развития пиноподий и зависящими от соответствующей патологии эндометрия. На поверхности полипов и эндометрия с недостаточностью лютеиновой фазы имеются островки с недоразвитыми пиноподиями диаметром 2-3 мкм, а при гиперплазии и хроническом эндометрите пиноподии отсутствуют вовсе. 9. При бесплодии отсутствуют четкие корреляции между экспрессией ИГХ маркеров и концентрациями сывороточных гормонов, характерные для нормального менструального цикла. Это может свидетельствовать о дисбалансе стероидной рецепции на тканевом эндометриальном уровне. 10. Существенные гистологические, иммуногистохимические и ультраструктурные особенности эндометрия при бесплодии дают ценную информацию, дополняющую традиционные клинические классификации. Оценка морфо-функционального состояния эндометрия открывает новые возможности для обеспечения индивидуального подхода при назначении схем ВРТ. 26 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ В алгоритм обследования пациенток с бесплодием при подготовке к ВРТ должно быть включено не только рутинное гистологическое, но и иммуногистохимическое исследование эндометрия с использованием, как минимум, шести ИГХ маркеров и, по возможности, сканирующая электронная микроскопия. Сведения о рецептивности эндометрия должны учитываться при назначении схем гормональной терапии. Результаты исследования могут быть использованы в педагогическом процессе в соответствующих разделах курсов патологической анатомии и гинекологии для студентов медицинских ВУЗов и при последипломном обучении патологоанатомов и гинекологов. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТРЦИИ 1. Самойлов М.В., Серебренникова К.Г., Бессмертная В.С., Чумакова Н.В., Бабиченко И.И., Духин А.О. Экспрессия рецепторов к эстрогену и прогестерону в эндометрии пациенток с бесплодием и при использовании вспомогательных репродуктивных технологий // Материалы VIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – М:2006. – С.505. 2. Серебренникова К.Г., Чумакова Н.В., Меняшева В.Ф., Самойлов М.В., Бессмертная В.С., Хачатрян Л.Т. Эффективность лечения бесплодия при комплесной подготовке эндометрия к циклам ВРТ // Материалы VIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – М:2006. С.515-516. 3. Серебренникова К.Г., Мирзоян Ж.В., Хмелевская В.Ф., Бессмертная В.С. Иммуногистохимическое и морфологическое состояние эндометрия у пациенток с бесплодием, готовящихся к экстракорпоральному оплодотворению // Материалы IX Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – М:2007. - С.516517. 4. Бессмертная В.С., Самойлов М.В., Бабиченко И.И., Серебренникова К.Г., Мусаева М.Г. Рецепторы к эстрогенам и прогестерону в эндометрии женщин при бесплодии // Вестник РУДН. Серия: Медицина. – 2007. – №2 – С.48-52. 5. Бессмертная В.С., Серебренникова К.Г., Самойлов М.В., Бабиченко И.И., Мусаева М.Г. Экспрессия эндометриальных рецепторов к эстрогенам и прогестерону у женщин с первичным и вторичным 27 бесплодием // Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – М:2007 – С.534. 6. Серебренникова К.Г., Бессмертная В.С., Самойлов М.В., Бабиченко И.И. Экспрессия рецепторов к стероидным гормонам и фактора пролиферации (белка Ki-67) в эндометрии женщин с первичным и вторичным бесплодием // Материалы IV Международного конгресса. «Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения)». – М: 2007. – С.10-11. 7. Бессмертная В.С., Самойлов М.В., Серебренникова К.Г., Бабиченко И.И. Морфологические и иммуногистохимические особенности эндометрия женщин с первичным и вторичным бесплодием // Архив патологии. – 2008. – Т.70,№4 – С.31-34. 8. Серебренникова К.Г., Бессмертная В.С., Самойлов М.В., Шульчина И.В., Хмелевская В.Ф. Современные подходы в оценке состояния эндометрия при подготовке к экстракорпоральному оплодотворению и переносу эмбрионов (ЭКО и ПЭ) // Материалы II Регионального научного форума «Мать и дитя». – Сочи 2008. – С.209. 9. Буравков С.В., Черников В.П., Бессмертная В.С., Буравкова Л.Б. Альтернативные методы подготовки препаратов для сканирующей электронной микроскопии // Материалы Научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». – М:2008. – С.20-21. 10.Samoylov M., Serebrennikova K., Bessmertnaya V., Shulchina I., Mishnev O. Endometrial window of implantation in infertility // Histopathology. – 2008 – Vol.53 – Suppl.1 – Р.200-201. 11.Самойлов М.В., Серебренникова К.Г., Бессмертная В.С., Лапшихин А.А., Черников В.П., Мишнёв О.Д. Алгоритм клиникоморфологического обследования эндометрия при подготовке к лечению бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий // Российский медицинский журнал. – 2009 – №2 – С.29-32. 28