Функциональное восстановление после фиброза при помощи галофугинона в...
advertisement
Функциональное восстановление после фиброза при помощи галофугинона в сердце и скелетных мышцах у mdx мышей. Фиброз в скелетных и сердечной мышцах приводит к значительному ухудшению функциональных свойств и снижению качества жизни при мышечной дистрофии Дюшенна (МДД). МДД является смертельным расстройством, которое приводит к повреждению мышц при физической нагрузке, воспалению, фиброза, и прогрессирующая дисфункция и слабость. Первоначальное повреждение происходит с последующей регенерацией, но в итоге мышцы заменяются коллагеном и жировой тканью. По мере прогрессирования болезни требуется инвалидное кресло и вентиляционная помощь , и у пациентов часто наблюдается дисфункция сердца и дыхательная недостаточность.МДД вызвана мутацией в гене дистрофина; MDX-мышиная модель МДД также имеет Х-хромосомную миопатию из-за мутации дистрофина. С возрастом у мышей MDX мышцы становятся все более похожими на те, которые наблюдаются при МДД. Значительный рост фиброз для замены поврежденных волокон происходит в скелетных мышцах и в кардиомиоцитах . В конечном счете, дистрофия имеет значительное негативное влияние на функциональную способность. Фиброз демонстрирует значительное увеличение коллагена типов I и III в мышцах. Фиброз регулируется через трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) и фактор роста гепатоцитов (HGF), который действует как TGF-β антагонист. HGF уменьшает фиброз за счет уменьшения активации фибробластов и переход их в миофибробласты. HGF также играет роль в развитии почечного и легочного фиброза. Интересно, что HGF играет важную роль в активации спутниковых клеток и их пролиферацию опосредованную через с-рецепторы. Окончательная роль HGF в миогенезе и фиброзе не были изучены в отношении фиброза мышц при мышечной дистрофии. Галофугинона гидробромид (Halo) обладает мощной антифиброзной активностью за счет ингибирования TGF-β-опосредованного синтеза коллагена и фосфорилирования и активации TGF-β-зависимых Smad3 (39), которые ингибируют экспрессию коллагена I без изменения содержание коллагена. Это помешало синтезу коллагена и фиброзу у мышей с хронической реакцией трансплантат против хозяина, и склеродермией и снижение фиброза у крыс с легочным фиброзом, фиброзом печени, стриктурой уретры, и спаечной болезнью. Таким образом, галофугинон имеет антифиброзный эффект при острых и хронических немышечных заболеваниях. Эти сообщения привели к нашим экспериментом у молодых мышей MDX, которые получают галофугинон в течение 8 недель (Тургеман и соавт., Неопубликованные данные). Галофугинон вызывал дозозависимое и обратимое сокращение содержания коллагена в диафрагме. Галофугинон также предотвращает вызванный циклоспорином фиброз в диафрагме мыши MDX, снижает Smad3 фосфорилирование, и частично предотвращает гипертрофию сердца, что является типичным признаком кардиомиопатии. Самое главное, что лечение галофугиноном облегчает прогрессирование дистрофии мышц диафрагмы и улучшает функции мышцы обеих конечностей (выносливость, координацию и баланс) и сердца. Эти исследования на животных поэтому предлагают галофугинон как предполагаемое антифибротическое средство для лечения ранних проявлений МДД. Тем не менее, результаты лечения по устранению дистрофии остается неизученным. На основании тяжелого функционального воздействия хронического фиброза на мышечную и сердечную функцию при МДД, эксперименты были разработаны, чтобы проверить гипотезу, что данный препарат был бы эффективен в уменьшении фиброза у пожилых мышей MDX. Результаты показали, что пониженное содержание SMA и экспрессии коллагена, повышенная HGF содержание, усиленное разрастание мышечных клеток были связаны с улучшением функционального результата в конечностях, дыхательной и сердечной мышцах мышей MDX . МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. Галофугинон поставили Biopharmaceuticals Collgard (Тель-Авив, Израиль). Поликлональных антиколлагеновые α1 (I)-антитела и антитела к HGF были получены из Sigma (St. Louis, MO), анти-GAPDH и анти-Ki67 антитела (ab15580, который реагирует на мышь Ki67) были получены из Abcam (Кембридж, Великобритания) и α-SMA антитела были получены от Санта-Крус (Santa Cruz, CA). Вторичные антитела были получены из Санта-Крус и Абкам. Последовательности плазмиды коллагена I и III были получены из ATTC (Manassas, VA). Животные и экспериментальное проектирование. Mdx дистрофическим мышам (8 9 месячных старых; Jackson) внутрибрюшинно вводили 3 раза / неделю галофугинон (3 мкг / г массы тела, середина диапазона ранее эффективной дозы). В контрольной группе были подобранные по возрасту MDX мыши, которые получали физиологический раствор внутрибрюшинно. Лечение продолжалось в течение 5, 10 или 12 недель (п = 4 5). Эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными. После эвтаназии диафрагма, сердце, четырехглавая мышца и передней большеберцовой (TA) мышцы были собраны и заморожены в пробирках для последующего анализа и гистологических исследований. Гистологические анализы экспрессии коллагена и фиброза. Экспрессия коллагена I и III в мононуклеарных клетках была использована в качестве общего показателя синтеза коллагена. Коллаген α1 был синтезирован из ATCC кДНК-клона (номер по каталогу 5876788, 3823337 и инвентарный номер GenBank BF662620) с использованием стандартных протоколов. Рибопроб (~ 400 пар оснований в длину) обнаружены последовательности генов из базы 143 до 408, до 0,005 нг РНК. Коллаген α3рибопроб был синтезирован из ATCC кДНК-клона (каталожный номер 1058119, 789709 обозначение и инвентарный номер GenBank AA387470). Это рибопроб имел 1337 и 1754 пар оснований и обнаружить последовательность коллагена III генов между базами 2053 и 3473, до <0,0187 нг РНК. Количество мононуклеарных клеток, окрашенных положительно на коллаген I и III, подсчитывали в пяти областях на × 400 по длинной оси каждой секции (по одной от каждого животного). Распределение ISH + клеток оценивали от 1 до 3 (1, отдельных клеток, 2, кластер из 2-4 клеток, а также 3, 5 или более клеток в группе) в соответствии с количеством ISH + ядер в регионе. В тех же областях, некоторые центральные ядра в регенерированных волоконах были отмечены ISH для транскриптов коллагена. Волокна, содержащие ISH + центральные ядра были подсчитаны и выражаются в виде доли всех центрально расположенных ядерных волокон. Центральный индекс зарождения (CNI) был также рассчитан в передней большеберцовой и четырехглавой мышцах при соблюдении трех полей в увеличении × 100 вдоль длинной оси участка (по одному на животных). Коллаген был визуализирован в разделах двумя способами. Сириус красная окраска была использована для изучения распределения коллагена в диафрагме (5 и 10 недель) и четырехглавой мышце (10 недель только), просмотрев поля в поляризованном свете (Zeiss Фото II микроскоп, Carl Zeiss, Thornwood, Нью-Йорк). Изображения были сканированы ПЗС-камерой (Sony) и анализировали с помощью вестерн блот анализа (Empix Imaging, Mississauga, ON, Канада). В целом средняя интенсивность рассчитывается как сумма средней интенсивности в четырех углах. Второй метод был использован для оценки соединительной ткани для окрашивания коллагена ECM. Другой набор срезов окрашивали трехцветным методом Массона, ECM оценивали в пяти полях на длинной оси каждой секции (1 на одно животное было проанализировано) с использованием 10 × 10 сетки. Площади заполнены синезелеными пятнами более 25% или более, считаются положительными, а фиброз был представлен рядом положительных квадратов в виде доли от 500 в каждой секции. Анализы на содержание коллагена, HGF, и SMA. Содержание коллагена определяли из экстрактов мышечных белков. Аликвоты равной концентрации белка (100 мкг) расщепляли (20 мин при 37 ° C) в 0,2% коллагеназы, реакция была остановлена буфером для образца и кипения (Хюбнер и Андерсон, не опубликовано). Образцы были погружены на 8% в гель. Одна полоса была загружена в Витроген (коммерческое решение 98% коллагена I и 2% коллагена III) в качестве положительного контроля (сплоченность, Пало-Альто, Калифорния). Коллаген (190 кДа) был обнаружен с использованием антитела против коллагена α1 (I) (1:4,000), соответствующими вторичными антителами, и хемилюминесценцию субстрата фенилфосфат динатрия (CSPD, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). HGF и SMA содержимое определяется из образцов белка четырехглавой мышцы с использованием стандартного вестерн блот анализа протоколов, использующих иммунодетекцию с анти-HGF (1:500) или анти-SMA (1:2500) антителами. Пятна коллагена α1 (I) были проверены на GAPDH. Для всех пятен оптическая плотность каждой группы была нормализована к оптической плотности GAPDH (коллаген) или на миллиграмм мышц (HGF и SMA) в той же полосе. Анализ пролиферации. Пролиферацию клеток определяли с помощью иммуногистохимических Ki67 (1:4,000), который определяет белок в ядрах от G1 фазы в фазе M. Ki67 + клеток были подсчитаны отдельно × 400 для регионов мышцы. Клетки подсчитывали (в поле), как миогенные спутниковые клетки (непосредственно примыкающих к волокнам) и в ECM (клеток в интерстиции между волокнами и в больших областях фиброза). Графы были сделаны в пяти областях вдоль длинной оси каждой секции (по одной от каждого животного) и были представлены как распределение пролиферирующих мышц и ECM клеток на пять полей. Функциональные меры исхода лечения. Силу захвата лапы измеряли еженедельно с помощью калиброванного тензодатчика. Производительность измерялась как пик средней тяги из пяти испытаний, как сообщалось ранее. Данные были нормированы на массу тела и по сравнению с течением времени между группами. Окончательное исследование было через 4 дня после предыдущего испытания, чтобы проверить функциональное воздействие повторяются упражнения. Степень физической нагрузки повреждения мышц была определена в финале 24-часового периода добровольного упражнения с использованием синего красителя Эванса (EBD), как описано. EBD + волокна были подсчитаны и выражается в виде доли от общих волокон для каждого раздела. Общая дыхательная функция была измерена в естественных условиях от 1 до 2 дней до эвтаназии с использованием барометрической плетизмографии (Buxco, Трой, штат Нью-Йорк).). Аэрозоль метахолина вводят с увеличением дозы ступенчато (3,1, 6,25, 12,5, 25 и 50 мг / мл), начиная с физиологическим раствором в качестве. Между дозами метахолина дыхательный объем вернулся к базовому или стабильному минимальному значению. ЭхоКГ исследования были проведены для оценки в естественных условиях сердечной функции мышей, как сообщалось ранее (17, 47). С помощью неинвазивного 13-МГц зонда (Vivid 7, General Electric Medical Systems, Milwaukee, WI) мыши были обследованы. Сердца были обследованы в двумерной парастернальной короткой оси зрения, и в три М-режиме эхокардиографии были записаны. Конечно-диастолической диаметр, конечный систолический диаметр, толщина задней стенки, и фракции укорочения были измерены. Конечный систолический и конечный диастолический объемы были измерены от парастернальной длинной оси зрения с использованием геометрической модели вытянутого эллипсоида, а фракция выброса ЛЖ была рассчитана. Сердечный выброс рассчитывается как произведение ударного объема и частоты сердечных сокращений было. Статистический анализ. Данные были проанализированы с помощью двух-дисперсионного анализа (ANOVA) или повторных измерений ANOVA, чтобы определить эффекты лечения и длительности лечения (5 или 10 недель), по мере необходимости. Группы сравнивали с помощью T-теста или теста Тьюки для оценки данных или с помощью χ2 статистики распределения частот. Данные (среднее ± SE) были собраны без каких-либо знаний о группе лечения. Уровень значимости был установлен на уровне вероятности Р <0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ Фиброз и экспрессия генов коллагена. Лечение галофугиноном не приводит к какой-либо токсичности или изменениям в массе тела. Транскрипты коллагена I и III были обнаружены в мышцах MDX мышей (рис. 1А). Большинство из ядер экспрессировавшие коллаген были расположены в промежуточном отсеке между мышечными волокнами. Существовало дифференциальная экспрессия коллагена между мышцами и для коллагенов: передняя большеберцовая содержала больше ISH + клеток, а затем диафрагма, четырехглавая мышца и сердце. Эта картина была такой же, в каждой группе. Распределение мононуклеарных клеток, экспрессирующих коллагена типа I и III во всех четырех тканях сократилось через 5 и 10 нед (P <0,001 и р <0,02 соответственно;. Рис. 1, B и C). Между 5 и 10 неделями лечения увеличение экспрессии коллагена в контрольных (необработанные мыши MDX); лечение уменьшено экспрессию коллагена. Центральные ядра в регенерирующих волокнах были также отмечены экспрессией коллагена I (рис. 1, внизу) и III (данные не представлены) в четырехглавой и пердней большеберцовой мышце. Количество коллагена экспрессируемое центральным ядром уменьшилась после лечения через 5 и 10 недель по сравнению с контрольными необработанными MDX-мышами (Р ≤ 0,02 для мышц) (табл. 1). Гистологические наблюдения показали, что переменный фиброз наблюдается в пределах каждого среза мышц, среди мышц у каждого животного, так и среди животных в каждой группе. Окрашивание отображает более интенсивную Сириус красную окраску, что свидетельствует о наличии фибриллярного коллагена больше в диафрагме, чем в четырехглавой мышце (рис. 2). Расчетная общая средняя интенсивность пятен окрашивания, на четырех углах отбора проб выявила увеличение фиброза диафрагмы в обеих обработанных и необработанных группах мышей MDX между 5 - и 10-недельными моментами времени. Были также аналогичные уровни двулучепреломляющего коллагена (средняя интенсивность на квадратный микрометр) в двух мышцах через 10недель. Некоторые из центральных миоядер в регенерированных волокнах окрашивались от розового до красного Сириусом красным, однако, ни одно из этих ядер не показало двулучепреломления при просмотре в поляризованном свете под любым углом (рис. 2В). Лечение галофугиноном в течение 10 недель вызывало скромное, но значительное снижение окрашивания Сириус красным как в диафрагме и четырехглавой мышце по сравнению с MDX-контролем (P <0,001;. Рис 2С).Оценка фиброза при трехцветном окрашивании Массона не показывают изменений при лечении (данные не показаны). Содержание коллагена, HGF, и SMA. Содержание коллагена значительно различаются в мышцах во всех группах необработанного контроля (P <0,001 в обоих 5 и 10 недель) и леченных мышей (P <0,05 в обоих 5 и 10 недель). Содержание белка коллагена было выше в сердце, чем в диафрагме и четырехглавой как для обработанной и необработанной MDX мышей после 5 (Р <0,001) и 10 недель (P <0,01). Лечение в течение 5 недель уменьшило содержание коллагена в четырехглавой, передней большеберцовой мышцах и сердце (P <0,01 за каждый) по сравнению с необработанным контролем MDX, но не было никаких существенных изменений в содержании коллагена в диафрагме в связи с лечением. Не существовало значительного влияния лечения на содержание коллагена в течение 10 недель, вероятно, из-за большой изменчивости внутри группы в этом возрасте. HGF был увеличен в четырехглавой мышце после 10 недель (P = 0,03; табл. 1). SMA содержание в четырехглавой был снижен после 10 недель (P = 0,01). Пролиферация клеток. Галофугинон сократил количество Ki67 +-пролиферирующих клеток в области ECM диафрагмы, четырехглавой мышцы, сердце по сравнению с необработанным контролем MDX (P <0,05, P <0,01, P <0,05 и р <0,05, соответственно) после 5 недель (рис. 4). Существовало одновременное увеличение мышечной клеточной пролиферации в четырехглавой и передней большеберцовой мышцах (P <0,01 и р <0,05, соответственно). После 10 недель из Halo, ECM пролиферации клеток в четырехглавой была увеличена (P <0,05). Функциональные результаты лечения. Производительность в силе захвата и других испытаний была меньше среди MDX мышей во время и после лечения, чем у необработанного контроля . Добровольный ход был использован, чтобы вызвать повреждение как отдельный показатель исхода лечения дистрофических мышц, восприимчивых к травмам от физических упражнений. В этом тесте мыши, получавшие лечение, бежали более чем в четыре раза дальше, чем контрольные мыши (P <0,01) (рис. 5а). Доля EBD + волокон (краситель проницаемые в результате повреждений при физической нагрузке) служила мерой лечения воздействия на стабильность мембраны. После 12 недель лечения в четырехглавой мышце выявлено меньше EBD + волокон, чем в четырехглавой MDX контроля (P <0,02) (рис. 5б). Мышцы от контрольных мышей показали, что доля поврежденных волокон (от 0,05 до 0,10) увеличилась в зависимости от пройденного расстояния. Атмосферная плетизмография показала общую реакцию органов дыхания (вдоха и выдоха экскурсия) как бронхоспазм. У леченных мышей отметили увеличение Penh при увеличении дозы метахолина. (P <0,01) (рис. 6). Леченные мыши также поддерживают больший базовый дыхательный объем при более высоких дозах метахолина (25-50 мг / мл), чем у контрольных MDX (6,25 мг / мл) (р <0,01). Результаты были идентичны для мышей после 10 и 12 недель лечения. Сердечно-сосудистая функция была измерена в естественных условиях у леченых и контрольных MDX мышей (n = 8 до 9/group) до лечения и после 5 и 10 нед лечения. Частота сердечных сокращений остается неизменной в течение всего периода лечения (базовый уровень: 649 ± 10, и 671 ± 9, 5 недель: 680 ± 14 и Halo678 ± 8 и 10 недель: 684 ± 10, и Halo 678 ± 9 уд / мин). Не существовало никаких существенных изменений в LV конечнодиастолическом диаметре, LV конечно- систолическом диаметре, межжелудочковой перегородки, задней стенки, фракции укорочения, или фракцией выброса между MDX контролем и группой лечения во всех трех моментов времени. Все мыши продемонстрировали значительную гипертрофию левого желудочка, что не изменилось при лечении. Тем не менее, лечение значительно улучшило пик систолической скорости (P <0,01) и скорости деформации (P <0,01). Кроме того, лечение вызвало значительное функциональное улучшение качественного измерения движения стенки желудочка (рис. 7). Эхокардиография показала LV WMAs у всех MDX мышей в начале исследования с гипокинетической дискинезией в стенках. Эффект галофугинона на функцию сердца был поддержан до 10 недель, и только гипокинезия наблюдалось по сравнению с широким спектром WMAs у необработанного контроля. ОБСУЖДЕНИЕ Лечение в течение 10-12 недель улучшило структурный характер и функциональные характеристики поперечнополосатых мышц у старых мышей с хорошо известными заболеваниями и дисфункцией (следуют в возрасте от 10 до 11 мес). После 5 недель лечения снизилась выражение коллагена типа I и III в четырех мышцах (передней большеберцовой, диафрагме, четырехглавой мышце, и сердце) и снижение содержания белка коллагена в трех мышцах (передней большеберцовой, сердце и четырехглавой мышце). Галофугинон также снизил ECM пролиферацию клеток и увеличению скелетной пролиферации клеток мышц после 5 недель лечения. После 10 недель лечения в дополнение к дальнейшему снижению экспрессии коллагена I и III во всех мышцах, фиброз был сокращен в диафрагме и четырехглавой мышце, и уровень HGF был увеличен и SMA была снижена в четырехглавой мышце. Эти изменения в мышцах старых мышей MDX не влияют на CNI, индекс общего прогрессирования дистрофии. Самое главное, что изменения в мышцах конечностей, дыхательной и сердечной мышце было достаточно для значительного улучшения производительности. Функциональные достижения в мышцах конечностей уменьшили восприимчивость к физической нагрузке и более быстрому восстановлению функции после упражнений. Дыхательные мышцы показали лучшую компенсацию при использовании метахолина, и сердечная мышца продемонстрировала заметное улучшение в желудочковой WMAs. Новый подход к измерению содержания коллагена с использованием предварительного переваривание коллагеназой образца, новые наблюдения экспрессии коллагена в центральных ядрах в регенерировавших мышечных волокнах, и новая информация о воздействии дифференциации между мышцами расширит наше понимание основных процессов мышечной дистрофии у мышей. В целом, галофугинон является мощным антифиброзным агентом, который вызывает функционально значимое ослабление существующего фиброза в скелетных и сердечной мышцах при одновременном снижении синтеза нового коллагена. Наши выводы имеют большое значение для перевода основных выводов исследования на животной модели для клинического применения в лечении МДД и, возможно, других состояниях, при которых мышечный фиброз ограничивает функции. Лечение снижало экспрессию генов для коллагена типа I и III во всех мышцах. Это согласуется с предыдущими докладами эффектов галофугинона при фиброзе в немышечных тканях и в мышцах дистрофических молодых мышей MDX. Поскольку взаимоотношения между дифференциацией мононуклеарных миогенных клеток и экспрессией и отложение коллагена в интерстиции клеток, которые расходятся с миогенной линией, распределение ISH + клеток было использовано в качестве индикатора синтеза коллагена (и последующая секреция) в различных мышцах. Аналогично, экспрессия коллагена отображает уровень фиброза развивается в мышцах мышей MDX. Поэтому, хотя механизмы эффектов галофугинона исследуются, текущие результаты снизили коллаген I и III у старых MDX мышей . У молодых мышей MDX, снижение экспрессии коллагена сопровождается снижением фосфорилирования Smad3 и снижение фиброза, предполагая, что подобные пути могут быть направлены на снижение выражения коллагена и содержание у старых мышей MDX. Mdx мышцы, как сообщается, проявляют признаки фиброза очень рано [начиная с 3 недель в диафрагме и становится заметным через 5 недель (49, 50)]. Фиброз растет с увеличением возраста и в результате большая мышечная активность травмирует волокна. Коллаген в диафрагме MDX постепенно увеличивается на протяжении всей жизни, как показано на мышцах диафрагмы в данном исследовании. Исследования о том, что MDX мышцы не имеют минимальных фиброзно-жировых изменений в соединительной ткани, как правило, интерпретируется по сравнению с тяжелыми изменениями, наблюдаемыми в МДД мышцах. Тем не менее, большинство исследований, в том числе исследования на молодых мышах MDX (Тургеман и соавт., Неопубликованные) показывают, что фиброз и экспрессия коллагена (коллагена I и III) увеличиваются с возрастом у многих MDX мышей, даже между 4 и 12 недель от роду. Изменчивость между и внутри групп мышц, возможно, были ниже, если коллаген был проанализирован путем изучения содержания оксипролина (который также связан с экспрессией коллагена), хотя коллаген содержит только 13,5% оксипролина, которое не может быть представителем общего содержания коллагена. Галофугинон вызывал снижение фиброза в диафрагме и четырехглавой мышце после 10 недель лечения, по данным исследования общей средней интенсивности окрашивания Сириус красным в полярных освещении. Эти изменения согласуются с исследованиями у молодых мышей MDX, несмотря на различные дозы галофугинона (5 мкг / г у молодых мышей по сравнению с 3 мкг / г у старых мышей).Новый протокол вестернблоттинга для обнаружения белка коллагена был разработан для дальнейшего исследования лечебного воздействия на мышцы у пожилых мышей. Изменение процедуры включило краткую обработку коллагеназой. Так как экспрессия коллагена и содержание 190-кДа белка коллагена и уменьшилось после 5 недель лечения, прежде чем фиброз наблюдается в 10 недель лечения, галофугинон может повлиять на молекулярные, фибриллярные конформации коллагена или предотвращения сшивания лизином перед изменением стабильной структуры коллагена, который определяется в полярном микроскопе. Галофугинон может также удалять поперечные связи, активируя металлопротеиназы: предварительное исследование матриксных металлопротеиназ (ММП) (анализировали зимографии) показал увеличение контроля над уровнями в мышцах диафрагмы у 7ми старых мышей MDX после 4 недель лечения (Pines и др.;. неопубликованные данные), в то время как MMP9 деятельность была обнаружена у молодых обработанных мышей MDX (Тургеман и др., неопубликованные данные.). Снижение белка коллагена у старых мышей MDX соответствовало бы такому же эффекту увеличения MMP9 деятельность у старых мышей. Здесь изменения могут представлять различия в созревании, стабильности или сшивки коллагена, а не общее содержание коллагена ECM. Это могло бы объяснить нахождение самого высокого уровня коллагена в передней большеберцовой мышце с использованием метода пищеварения: волокнистая соединительная ткань в передней большеберцовой мышце старых мышей может содержать наименее зрелые формы коллагена по сравнению с другими мышцами, такими как диафрагма, где фиброз обширной. Обширный фиброз в диафрагме более устойчив к перевариванию коллагеназы в подготовке одной культуры волокон (Anderson, неопубликованные данные). Кроме того, незрелый коллаген может быть более восприимчив к действию ММП. Поскольку уровень фиброза имеет сложное отношение к экспрессии коллагена, синтез, секреция, и деградация, активности ММП (или тканевых ингибиторов ММП) и TGF-β сигнализация может быть вовлечен в механизм, с помощью которого галофугинон уменьшает экспрессию коллагена и содержание в дистрофических мышцах. Новый подход к анализу белка коллагена был разработан для данного исследования с учетом изменений в экспрессии генов коллагена, что лишь незначительно уменьшить фиброз в соответствии с гистохимическим окрашиванием. Метод имеет потенциал, чтобы выявить ранее недоступные детали отложения коллагена и созревания и изменения в связи с болезнью или лечением в тканях с первичным и вторичным фиброзом. Снижение мышечной функции при прогрессировании МДД связано со значительным фиброзом, отмеченные аномально высокие уровни коллагена I и III (18), и контрактуры хронически ограничивают диапазон движений, постуральную стабильность, и дыхательную и сердечную функции. Фиброзная ткань накапливается в мышечной ткани, чья архитектура повреждена в результате воспалительных и дистрофических процессов. Действительно, нормальные мышцы также зависят от фиброза, который развивается во время и после травмы. В основе эффекта лечения для снижения содержания коллагена и экспрессии коллагена I и III в мышцах дистрофических мышей, ткани контрактуры при МДД и другие условия могут также реагировать на лечение галофугиноном, которые улучшили бы диапазон движения и функции мышц. Снижение SMA является еще одним свидетельством антифиброзных эффекта галофугинона. Поскольку клетки синтезируют SMA после активации, миофибробласты участвуют в механическом или биофизическом ремоделировании мышц, и миофибробласты SMA + исчезают, когда больше нет никаких активных сокращение ECM коллагена. После 10 недель лечения галофугиноном SMA был снижен до нормального уровня дикого типа четырехглавой мышцы мыши. Интересно, что HGF антифиброзный белок, который противодействует TGF-β и подавляет SMA. HGF лечению удалось сократить фиброз кожи, легких и почечной ткани с помощью TGF-β торможения. Хотя предыдущие работы показали, что галофугинон действует отрицательно по течению к TGF-β, увеличение четырехглавой мышцы после 10 недель предполагает, что галофугинон может также действовать вверх по течению к TGF-β, чтобы побудить HGF синтез перекрестных помех с другими сигнальными путями. Дальнейшее изучение HGF и пролиферации клеток в диафрагме и других мышцах, чтобы подтвердить о том, что регуляция HGF и пролиферация клеток в мышцах взаимосвязаны. Увеличение числа Ki67 + клеток в мышцах после 5 недель лечения и регенерации после тренировок, согласуется с высоким уровнем HGF, которые будут способствовать миогенной клеточной пролиферации и миграции. Кроме того, поскольку ущерб от упражнений был сокращен (EBD данных) без изменения CNI, галофугинон, возможно, способствовал более эффективному ремонту с помощью HGF: снижение экспрессии коллагена и накопление, и меньше миофибробластов облегчает механические нагрузки на мембрану волокна во время тренировки , несмотря на прогрессирование дистрофии. Удивительно, что центральные ядера в волокнах регенерирующих мышц от дистрофических травм были отмечены, чтобы выразить коллаген I и III. Примечательно, что галофугинон снизил выражение генов коллагена центральных миоядер. В недавнем докладе установлено, что пролиферирующие первичные миобласты и C2C12 клетки могут выразить коллаген I. Результаты заключительных испытаний хотьбой, следовательно, причастность галофугинона в улучшении восстановлении мышц, возможно, за счет снижения отложения коллагена и сшивания, что приведет к увеличению ECM гибкости и большей активации и миграции пролиферирующих миобластов в процессе лечения. Дистрофия приводит к тяжелому дефициту дыхательной функции. В настоящее время исследования использовали плетизмографию для изучения дыхательной функции у мышей MDX. Леченные мыши имели меньший ответ на метахолин, чем в контрольной группе, что свидетельствует о снижении коллагена I и III в диафрагме во время лечения была эффективной в улучшении дыхательной функции. Функциональные улучшения мышей, продемонстрировало с использованием плетизмографии, согласуется с пониженным уровнем фиброза в диафрагме тех же животных. Сердечная деятельность была значительно улучшена лечением. Мышиная эхокардиография эффективно продемонстрировала улучшение движения стенки желудочка, которая эволюционировала от тяжелой дискинезии к более синхронным, концентрическим сокращениям желудочков. Эхокардиография является очень чувствительным инструментом для оценки структурных и физиологических показателей, которые могут выявить начало заболевания и прогрессирования (53а, 60). Прогрессирование кардиомиопатии также было приостановлено, так как движение стенки не ухудшилось от 5-10 недель лечения (по наблюдениям движения стенки ЛЖ), как это было у контрольных мышей. Хотя не было никаких количественных изменений в типичных мерах систолической функции с лечением, в том числе индексы TDI скорости и скорости деформации были рассмотрены с целью обнаружить тонкие региональные WMAs, которые могут появиться перед снижением фракции выброса. TDI параметры были ненормальные на исходном уровне в обеих группах. У мышей MDX контрольной группы TDI остался ненормальным, тогда как у обработанных мышей TDI улучшились, что свидетельствует о вызванных лечением успехах систолической функции ЛЖ с помощью этих новых мер. Хотя не было никаких доказательств дилатационной кардиомиопатии, региональные движения стенки улучшилась при лечении. Примечательно, что у молодых мышей MDX галофугинон частично предотвращает гипертрофию ЛЖ (Тургеман и соавт., Не опубликовано), что характерно для кардиомиопатии мышей MDX, наряду с фиброзом и желудочковой дисфункцией. Хотя MDX мыши с сердечно-сосудистой патологией не могут регулировать миостатин, сердечные изменения, вызванные галофугиноном (улучшенная функция и пониженное содержание коллагена и экспрессию генов) согласуются с предотвращением TGF-β-зависимой кктивацией гена и воспаления, тем самым предотвращая дальнейшее прогрессирование кардиомиопатии. При высокой частоте дисфункции ЛЖ при МДД (20% на 10 лет возраста) и целей раннего предупреждения и эффективного разрешения фиброза при явной клинической кардиомиопатии галофугинон является весьма привлекательным для клинических испытаний. Это может быть особенно ценным для исследования относительно кардиомиопатии, которая может быстро прогрессировать и, кажется, даже у носителей МДД. Серьезное, в конечном счете, летальное воздействие МДД из-за слабости сердечной, дыхательной мускулатуры и мышц конечностей обусловлено прогрессирующим фиброзом. Настоящие результаты показывают, что галофугинон имеет значительный потенциал, чтобы стать успешным фармакологическим подходом к сердечной и дыхательной дисфункции, наблюдаемой при МДД. Положительные результаты клинических испытаний галофугинона, как антифиброзного агента при МДД, по крайней мере, развернули возможности для эффективной терапии с использованием противовоспалительных и регенераторных препаратов, прекурсоров и стволовых клеток, и / или генетических конструкций. В заключение, лечение галофугиноном пожилых мышей MDX способствовало значительному структурному ремоделированию уменьшению фиброза, который в свою очередь поддерживает важные функциональные выгоды в мышцах конечностей, диафрагмы и сердца. Функциональный износ был ослаблен или обращен вспять, и экспрессия коллагена был сокращен. Это повышает устойчивость к физической нагрузке и улучшение восстановления мышц, дыхательных функциональных возможностей и сердечной функции. Эти результаты особенно важны, потому что препарат действовал одновременно на существующие ограничения на функции, связанные с фиброзом и снижение синтеза нового коллагена. Ссылки 1.↵ Alexakis C, Partridge T, Bou-Gharios G. Implication of the satellite cell in dystrophic muscle fibrosis: a selfperpetuating mechanism of collagen overproduction. Am J Physiol Cell Physiol 293: C661–C669, 2007. Abstract/FREE Full Text 2.↵ Anderson JE, Liu L, Kardami E. The effects of hyperthyroidism on muscular dystrophy in the mdx mouse: greater dystrophy in cardiac and soleus muscle. Muscle Nerve 17: 64–73, 1994. CrossRef Medline 3.↵ Anderson JE, McIntosh LM, Poettcker R. Deflazacort but not prednisone improves both muscle repair and fiber growth in diaphragm and limb muscle in vivo in the mdx dystrophic mouse. Muscle Nerve 19: 1576–1585, 1996. CrossRef Medline 4.↵ Anderson JE, Weber M, Vargas C. Deflazacort increases laminin expression and myogenic repair, and induces early persistent functional gain in mdx mouse muscular dystrophy. Cell Transplant 9: 551–564, 2000. Medline 5.↵ Anderson JE, Wozniak AC. Satellite cell activation on fibers: modeling events in vivo—an invited review. Can J Physiol Pharmacol 82: 300–310, 2004. CrossRef Medline 6.↵ Archer JD, Vargas CC, Anderson JE. Persistent and improved functional gain in mdx dystrophic mice after treatment with l-arginine and deflazacort. FASEB J 20: 738–740, 2006. Abstract/FREE Full Text 7.↵ Brown SC, Lucy JA. Dystrophin as a mechanochemical transducer in skeletal muscle. Bioessays 15: 413–419, 1993. CrossRef Medline 8.↵ Bruck R, Genina O, Aeed H, Alexiev R, Nagler A, Avni Y, Pines M. Halofuginone to prevent and treat thioacetamideinduced liver fibrosis in rats. Hepatology 33: 379–386, 2001. CrossRef Medline 9.↵ Chan YS, Li Y, Foster W, Horaguchi T, Somogyi G, Fu FH, Huard J. Antifibrotic effects of suramin in injured skeletal muscle after laceration. J Appl Physiol 95: 771–780, 2003. Abstract/FREE Full Text 10.↵ Chiariello M, Ambrosio G, Cappelli-Bigazzi M, Perrone-Filardi P, Brigante F, Sifola C. A biochemical method for the quantitation of myocardial scarring after experimental coronary artery occlusion. J Mol Cell Cardiol 18: 283–290, 1986. CrossRef Medline 11.↵ Cleutjens JP, Verluyten MJ, Smiths JF, Daemen MJ. Collagen remodeling after myocardial infarction in the rat heart. Am J Pathol 147: 325–338, 1995. Medline 12.↵ Cohn RD, Liang HY, Shetty R, Abraham T, Wagner KR. Myostatin does not regulate cardiac hypertrophy or fibrosis. Neuromuscul Disord 17: 290–296, 2007. CrossRef Medline 13.↵ Coulton GR, Morgan JE, Partridge TA, Sloper JC. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol 14: 53–70, 1988. Medline 14.↵ Darby I, Skalli O, Gabbiani G. Alpha-smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound healing. Lab Invest 63: 21–29, 1990. Medline 15.↵ Deconinck N, Dan B. Pathophysiology of duchenne muscular dystrophy: current hypotheses. Pediatr Neurol 36: 1–7, 2007. CrossRef Medline 16.↵ Desmouliere A, Chaponnier C, Gabbiani G. Tissue repair, contraction, and the myofibroblast. Wound Repair Regen 13: 7–12, 2005. CrossRef Medline 17.↵ Doevendans PA, Daemen MJ, de Muinck ED, Smits JF. Cardiovascular phenotyping in mice. Cardiovasc Res 39: 34–49, 1998. Abstract/FREE Full Text 18.↵ Finsterer J, Stollberger C, Feichtinger H. Noncompaction in Duchenne muscular dystrophy: frustrated attempt to create a compensatory left ventricle? Cardiology 105: 223–225, 2006. CrossRef Medline 19.↵ Gal-Levi R, Leshem Y, Aoki S, Nakamura T, Halevy O. Hepatocyte growth factor plays a dual role in regulating skeletal muscle satellite cell proliferation and differentiation. Biochim Biophys Acta 1402: 39–51, 1998. Medline 20.↵ Gazdhar A, Fachinger P, van Leer C, Pierog J, Gugger M, Friis R, Schmid RA, Geiser T. Gene transfer of hepatocyte growth factor by electroporation reduces bleomycin-induced lung fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 292: L529– L536, 2007. Abstract/FREE Full Text 21.↵ Gnainsky Y, Kushnirsky Z, Bilu G, Hagai Y, Genina O, Volpin H, Bruck R, Spira G, Nagler A, Kawada N, Yoshizato K, Reinhardt DP, Libermann TA, Pines M. Gene expression during chemically induced liver fibrosis: effect of halofuginone on TGF-beta signaling. Cell Tissue Res 328: 153–166, 2007. CrossRef Medline 22.↵ Gnainsky Y, Spira G, Paizi M, Bruck R, Nagler A, Abu-Amara SN, Geiger B, Genina O, Monsonego-Ornan E, Pines M. Halofuginone, an inhibitor of collagen synthesis by rat stellate cells, stimulates insulin-like growth factor binding protein-1 synthesis by hepatocytes. J Hepatol 40: 269–277, 2004. CrossRef Medline 23.↵ Goldspink G, Fernandes K, Williams PE, Wells DJ. Age-related changes in collagen gene expression in the muscles of mdx dystrophic and normal mice. Neuromuscul Disord 4: 183–191, 1994. CrossRef Medline 24.↵ Gosselin LE, Williams JE, Deering M, Brazeau D, Koury S, Martinez DA. Localization and early time course of TGF-beta 1 mRNA expression in dystrophic muscle. Muscle Nerve 30: 645–653, 2004. CrossRef Medline 25.↵ Gosselin LE, Williams JE, Personius K, Farkas GA. A comparison of factors associated with collagen metabolism in different skeletal muscles from dystrophic (mdx) mice: impact of pirfenidone. Muscle Nerve 35: 208–216, 2007. CrossRef Medline 26.↵ Hahn A, Bach JR, Delaubier A, Renardel-Irani A, Guillou C, Rideau Y. Clinical implications of maximal respiratory pressure determinations for individuals with Duchenne muscular dystrophy. Arch Phys Med Rehabil 78: 1–6, 1997. CrossRef Medline 27.↵ Hamelmann E, Schwarze J, Takeda K, Oshiba A, Larsen GL, Irvin CG, Gelfand EW. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am J Respir Crit Care Med 156: 766–775, 1997. Abstract/FREE Full Text 28.↵ Herrero-Fresneda I, Torras J, Franquesa M, Vidal A, Cruzado JM, Lloberas N, Fillat C, Grinyo JM. HGF gene therapy attenuates renal allograft scarring by preventing the profibrotic inflammatory-induced mechanisms. Kidney Int 70: 265– 274, 2006. CrossRef Medline 29.↵ Hoffman EP, Brown RH Jr, Kunkel LM. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51: 919–928, 1987. CrossRef Medline 30.↵ Hoffman EP, Monaco AP, Feener CC, Kunkel LM. Conservation of the Duchenne muscular dystrophy gene in mice and humans. Science 238: 347–350, 1987. Abstract/FREE Full Text 31.↵ Iwasaki T, Imado T, Kitano S, Sano H. Hepatocyte growth factor ameliorates dermal sclerosis in the tight-skin mouse model of scleroderma. Arthritis Res Ther 8: R161, 2006. CrossRef Medline 32.↵ Kagan HM, Trackman PC. Properties and function of lysyl oxidase. Am J Respir Cell Mol Biol 5: 206–210, 1991. Abstract/FREE Full Text 33.↵ Keeling RM, Golumbek PT, Streif EM, Connolly AM. Weekly oral prednisolone improves survival and strength in male mdx mice. Muscle Nerve 35: 43–48, 2007. CrossRef Medline 34.↵ Leshem Y, Gitelman I, Ponzetto C, Halevy O. Preferential binding of Grb2 or phosphatidylinositol 3-kinase to the met receptor has opposite effects on HGF-induced myoblast proliferation. Exp Cell Res 274: 288–298, 2002. CrossRef Medline 35.↵ Levi-Schaffer F, Nagler A, Slavin S, Knopov V, Pines M. Inhibition of collagen synthesis and changes in skin morphology in murine graft-versus-host disease and tight skin mice: effect of halofuginone. J Invest Dermatol 106: 84–88, 1996. CrossRef Medline 36.↵ Liu Y. Hepatocyte growth factor and the kidney. Curr Opin Nephrol Hypertens 11: 23–30, 2002. CrossRef Medline 37.↵ Matsumoto K, Nakamura T. Hepatocyte growth factor: renotropic role and potential therapeutics for renal diseases. Kidney Int 59: 2023–2038, 2001. Medline 38.↵ McGaha TL, Kodera T, Spiera H, Stan AC, Pines M, Bona CA. Halofuginone inhibition of COL1A2 promoter activity via a c-Jun-dependent mechanism. Arthritis Rheum 46: 2748–2761, 2002. CrossRef Medline 39.↵ McGaha TL, Phelps RG, Spiera H, Bona C. Halofuginone, an inhibitor of type-I collagen synthesis and skin sclerosis, blocks transforming-growth-factor-beta-mediated Smad3 activation in fibroblasts. J Invest Dermatol 118: 461–470, 2002. CrossRef Medline 40.↵ McIntosh LM, Anderson JE. Hypothyroidism prolongs and increases mdx muscle precursor proliferation and delays myotube formation in normal and dystrophic limb muscle. Biochem Cell Biol 73: 181–190, 1995. Medline 41.↵ McNally EM. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annu Rev Med 58: 75–88, 2007. CrossRef Medline 42.↵ Morrison J, Lu QL, Pastoret C, Partridge T, Bou-Gharios G. T-cell-dependent fibrosis in the mdx dystrophic mouse. Lab Invest 80: 881–891, 2000. Medline 43.↵ Nagler A, Firman N, Feferman R, Cotev S, Pines M, Shoshan S. Reduction in pulmonary fibrosis in vivo by halofuginone. Am J Respir Crit Care Med 154: 1082–1086, 1996. Abstract/FREE Full Text 44.↵ Nagler A, Genina O, Lavelin I, Ohana M, Pines M. Halofuginone, an inhibitor of collagen type I synthesis, prevents postoperative adhesion formation in the rat uterine horn model. Am J Obstet Gynecol 180: 558–563, 1999. CrossRef Medline 45.↵ Nagler A, Gofrit O, Ohana M, Pode D, Genina O, Pines M. The effect of halofuginone, an inhibitor of collagen type I synthesis, on urethral stricture formation: in vivo and in vitro study in a rat model. J Urol 164: 1776–1780, 2000. CrossRef Medline 46.↵ Nagler A, Rivkind AI, Raphael J, Levi-Schaffer F, Genina O, Lavelin I, Pines M. Halofuginone—an inhibitor of collagen type I synthesis—prevents postoperative formation of abdominal adhesions. Ann Surg 227: 575–582, 1998. CrossRef Medline 47.↵ Neilan TG, Januzzi JL, Lee-Lewandrowski E, Ton-Nu TT, Yoerger DM, Jassal DS, Lewandrowski KB, Siegel AJ, Marshall JE, Douglas PS, Lawlor D, Picard MH, Wood MJ. Myocardial injury and ventricular dysfunction related to training levels among nonelite participants in the Boston marathon. Circulation 114: 2325–2333, 2006. Abstract/FREE Full Text 48.↵ Neilan TG, Jassal DS, Perez-Sanz TM, Raher MJ, Pradhan AD, Buys ES, Ichinose F, Bayne DB, Halpern EF, Weyman AE, Derumeaux G, Bloch KD, Picard MH, Scherrer-Crosbie M. Tissue Doppler imaging predicts left ventricular dysfunction and mortality in a murine model of cardiac injury. Eur Heart J 27: 1868–1875, 2006. Abstract/FREE Full Text 49.↵ Pastoret C, Sebille A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle Nerve 18: 1147–1154, 1995. CrossRef Medline 50.↵ Pastoret C, Sebille A. mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age. J Neurol Sci 129: 97– 105, 1995. CrossRef Medline 51.↵ Pines M, Nagler A. Halofuginone: a novel antifibrotic therapy. Gen Pharmacol 30: 445–450, 1998. CrossRef Medline 52.↵ Pines M, Snyder D, Yarkoni S, Nagler A. Halofuginone to treat fibrosis in chronic graft-versus-host disease and scleroderma. Biol Blood Marrow Transplant 9: 417–425, 2003. CrossRef Medline 53.↵ Quinlan JG, Hahn HS, Wong BL, Lorenz JN, Wenisch AS, Levin LS. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscul Disord 14: 491–496, 2004. CrossRef Medline 53a.↵ Ramunddal T, Lindbom M, Omerovic E. Native cardiac reserve predicts survival in acute post infarction heart failure in mice (Abstract). Cardiovasc Ultrasound 5: 46, 2007. CrossRef Medline 54.↵ Sausbier M, Zhou XB, Beier C, Sausbier U, Wolpers D, Maget S, Martin C, Dietrich A, Ressmeyer AR, Renz H, Schlossmann J, Hofmann F, Neuhuber W, Gudermann T, Uhlig S, Korth M, Ruth P. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. FASEB J 21: 812–822, 2007. Abstract/FREE Full Text 56.↵ Sebag IA, Handschumacher MD, Ichinose F, Morgan JG, Hataishi R, Rodrigues AC, Guerrero JL, Steudel W, Raher MJ, Halpern EF, Derumeaux G, Bloch KD, Picard MH, Scherrer-Crosbie M. Quantitative assessment of regional myocardial function in mice by tissue Doppler imaging: comparison with hemodynamics and sonomicrometry. Circulation 111: 2611–2616, 2005. Abstract/FREE Full Text 57.↵ Serini G, Bochaton-Piallat ML, Ropraz P, Geinoz A, Borsi L, Zardi L, Gabbiani G. The fibronectin domain ED-A is crucial for myofibroblastic phenotype induction by transforming growth factor-beta1. J Cell Biol 142: 873–881, 1998. Abstract/FREE Full Text 58.↵ Sheffer Y, Leon O, Pinthus JH, Nagler A, Mor Y, Genin O, Iluz M, Kawada N, Yoshizato K, Pines M. Inhibition of fibroblast to myofibroblast transition by halofuginone contributes to the chemotherapy-mediated antitumoral effect. Mol Cancer Ther 6: 570–577, 2007. Abstract/FREE Full Text 59.↵ Skrabek RQ, Anderson JE. Metabolic shifts and myocyte hypertrophy in deflazacort treatment of mdx mouse cardiomyopathy. Muscle Nerve 24: 192–202, 2001. CrossRef Medline 60.↵ Stansfield WE, Tang R, Moss NC, Baldwin AS, Willis MS, Selzman CH. Proteasome inhibition promotes regression of left ventricular hypertrophy. Am J Physiol Heart Circ Physiol 294: H645–H650, 2008. Abstract/FREE Full Text 61.↵ Stedman HH, Sweeney HL, Shrager JB, Maguire HC, Panettieri RA, Petrof B, Narusawa M, Leferovich JM, Sladky JT, Kelly AM. The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature 352: 536–539, 1991. CrossRef Medline 62.↵ Sweat F, Puchtler H, Rosenthal SI. Sirius Red F3BA as a stain for connective tissue. Arch Pathol 78: 69–72, 1964. Medline 63.↵ Tomasek JJ, Gabbiani G, Hinz B, Chaponnier C, Brown RA. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol 3: 349–363, 2002. CrossRef Medline 64.↵ Von der Mark K. Localization of collagen types in tissues. Int Rev Connect Tissue Res 9: 265–324, 1981. Medline 65.↵ Wess L, Eastwood MA, Wess TJ, Busuttil A, Miller A. Cross linking of collagen is increased in colonic diverticulosis. Gut 37: 91–94, 1995. Abstract/FREE Full Text 66.↵ Wozniak AC, Anderson JE. Nitric oxide-dependence of satellite stem cell activation and quiescence on normal skeletal muscle fibers. Dev Dyn 236: 240–250, 2007. CrossRef Medline 67.↵ Yang J, Liu Y. Delayed administration of hepatocyte growth factor reduces renal fibrosis in obstructive nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol 284: F349–F357, 2003. Abstract/FREE Full Text Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org Оригинал статьи: http://ajpheart.physiology.org/content/294/4/H1550.full