Министерство здравоохранения Российской Федерации федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра биологической и общей химии им. В. В. Соколовского БЕЛКИ. ФЕРМЕНТЫ. ВИТАМИНЫ 4-е издание, переработанное и дополненное Учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов Под редакцией Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой Санкт-Петербург Издательство СЗГМУ им. И. И. Мечникова 2021 УДК 577. 1(076.8) ББК 28.902я7 Б43 Б43 Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. Составители — сотрудники кафедры биологической и общей химии им. В. В. Соколовского ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И. И. Мечникова» Мин­­ здрава России: канд. биол. наук, доцент Ж. В. Антонова, старший преподаватель Ч. Р. Бейшебаева, канд. биол. наук, доцент Ю. А. Власова, д-р мед. наук, профессор Л. Б. Гайковая, канд. биол. наук, доцент Н. Э. Голованова, канд. мед. наук, доцент Р. Н. Павлова, канд. биол. наук, доцент М. Н. Соколова, канд. хим. наук, доцент Е. А. Соколова. Рецензент: Марьянович А. Т. — д-р биол. наук, профессор, зав. кафедрой нормальной физиологии ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И. И. Мечникова» Минздрава России. Учебно-методическое пособие подготовлено для обучающихся лечебного факультета, выполняющих практические и лабораторные занятия по курсу биохимии. В пособии сформулированы цели, задачи, мотивация, актуальность изучаемых тем. Для каждого практического занятия приведены перечень основной и дополнительной литературы, вопросы и задания для самоподготовки, тестовые задания. Для проведения лабораторных занятий описаны методики выполнения лабораторных работ, клинико-диагностическое значение определяемых показателей. Для оценки освоения компетенций составлены профилированные ситуационные задачи и контрольные вопросы. Учебно-методическое пособие предназначено для обучающихся медицинских образовательных организаций высшего образования, обучающихся по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Рекомендовано в качестве учебно-методического пособия Методическим советом ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И. И. Мечникова Минздрава России, протокол № 9 от 22 декабря 2020 г. © Издательство СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021 СОДЕРЖАНИЕ Список сокращений....................................................................................4 Предисловие................................................................................................5 Инструкция по технике безопасности и противопожарной безопасности при работе в химической лаборатории...............................8 Раздел I. Строение, свойства и функции белков........................................14 Тема 1. Строение и свойства аминокислот. Методы исследования аминокислот.......................................14 Тема 2. Протеомика. Структурная организация белковых молекул. Методы количественного определения белка.........27 Тема 3. Определение белка биуретовым методом...............................36 Тема 4. Физико-химические свойства белков. Анализ белкового состава сыворотки крови. Методы протеомного анализа......50 Тема 5. Осадочные реакции, диализ. Электрофорез белков плазмы крови...........................................................................63 Раздел II. Энзимология.........................................................................75 Тема 6. Строение и механизм действия ферментов. Влияние неспецифических факторов на активность ферментов.........75 Тема 7. Влияние неспецифических факторов на активность ферментов. Специфичность действия ферментов.................83 Раздел III. Витамины.................................................................................93 Тема 8. Нутриентология. Витамины водорастворимой группы.........93 Раздел II. Энзимология............................................................................ 109 Тема 9. Активация и ингибирование ферментов. Количественное определение активности сывороточной холинэстеразы, сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.................. 109 Тема 10. Белки и ферменты в медицинской практике. Диагностическое использование ферментов и белков плазмы крови. Энзимотерапия............................................ 134 Коллоквиум по разделам I–III. Строение, свойства и функции белков. Энзимология. Витамины....... 154 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АК — аминокислота АТФ — аденозинтрифосфат АХЭ — ацетилхолинэстераза АЛТ — аланинаминотрансфераза АСТ — аспартатаминотрансфераза ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография ГАГ — гликозаминогликаны ГПО — глутатионпероксидаза ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ИМ — инфаркт миокарда КБГ — кумасси бриллиантовый голубой (краситель) КФК — креатинфосфокиназа ЛДГ — лактатдегидрогеназа МАО — моноаминооксидаза ММП — матриксные металлопротеиназы РНК — рибонуклеиновая кислота СД — сахарный диабет СДГ — сукцинатдегидрогеназа СОД — супероксиддисмутаза ФЭК — фотоэлектроколориметр ХПН — хроническая почечная недостаточность ЦПЭ — цепь переноса электронов 4 ПРЕДИСЛОВИЕ Учебно-методическое пособие к практическим и лабораторным занятиям «Белки. Ферменты. Витамины», наряду с пособиями по другим разделам «Обмен углеводов. Энергетический обмен. Гормональная регуляция обмена веществ», «Химия и обмен липидов, Обмен белков», «Тканевая биохимия», является составной частью комплекса учебно-методических изданий, написанных преподавателями кафедры биологической и общей химии для аудиторной и самостоятельной работы обучающихся. Биохимические исследования проводятся в современной клинике в широком масштабе при постановке диагноза и выбора тактики лечения. Они играют фундаментальную роль в разработке новых методов лечения, соответствующих лекарственных препаратов и создания природных рецептур лечебно-профилактического действия, а также разработке современных схем лечебного питания. Поскольку развитию функциональных изменений, характерных для патогенного фактора, предшествуют метаболические сдвиги, их выявление с помощью разнообразных биохимических методов в большой мере способствует успешной диагностике и лечению различных заболеваний. Для рациональной подготовки к практическим и лабораторным занятиям приведены вопросы и задания для самоподготовки, перечень основной и дополнительной литературы, тестовые задания для самоконтроля, описаны методики выполнения лабораторных работ, клинико-диагностическое значение определения биохимических показателей. В учебно-методическое пособие включены практические занятия по базовому курсу дисциплины «Биохимия» и вариативному курсу «Медицинская химия, биохимия». 5 Для контроля освоения общекультурных, общепрофессиональных и профессиональных компетенций в пособии приводятся контрольные вопросы к коллоквиумам и ситуационные задачи по всем изучаемым разделам. Большинство ситуационных задач профессио­ нально ориентированы, отражают взаимосвязь между биохимическими процессами, протекающими в норме и при патологии. Обучение предмету «Биохимия» является обязательной частью медицинской подготовки будущего врача и выполняет задачи образовательного, воспитательного, развивающего направления, что отражено в профессиональных стандартах и формируемых компетенциях. Учебно-методическое пособие «Белки. Ферменты. Витамины» позволяет решить основные задачи дисциплины «Биологическая химия». 1. Приобретение знаний об основных биохимических превращениях органических соединений и механизмах их регуляции, определяющих функции организма человека. 2. Формирование умений использования знаний для выяснения причин, условий и механизмов развития патологических процессов при различных заболеваниях и прогнозирования их течения. 3. Освоение методов лабораторной диагностики, необходимых для выбора оптимальных методов обследования пациента и для оценки информативности результатов анализа. 4. Формирование умений и навыков интерпретации результатов биохимических исследований для оценки нарушений при различных патологиях и для контроля эффективности лечения. 5. Формирование умений и навыков использования научно-­ медицинской литературы и постоянного самосовершенствования в приобретении профессиональных знаний. Формируемые компетенции, необходимые для будущей профессиональной деятельности Общекультурные компетенции: ОК-1 — способность к абстрактному мышлению, анализу, синтезу; ОК-7 — готовность использовать приемы оказания первой помощи, методы защиты в условиях чрезвычайных ситуаций; 6 ОК-8 — готовность к работе в коллективе, толерантно воспринимать социальные, этнические, конфессиональные и культурные различия. Общепрофессиональные компетенции: ОПК-2 — готовность к коммуникации в устной и письменной формах на русском и иностранном языках для решения задач профессиональной деятельности; ОПК-7 — готовность к использованию основных физико-химических, математических и иных естественно-научных понятий и методов при решении профессиональных задач; ОПК-8 — готовность к медицинскому применению лекарственных препаратов и иных веществ и их комбинаций при решении профессиональных задач. Профессиональные компетенции: ПК-1 — способность и готовность к осуществлению комплекса мероприятий, направленных на сохранение и укрепление здоровья и включающих в себя формирование здорового образа жизни, предупреждение возникновения и (или) распространения заболеваний, их раннюю диагностику, выявление причин и условий их возникновения и развития, а также направленных на устранение вредного влияния на здоровье человека факторов среды его обитания; ПК-5 — готовность к сбору и анализу жалоб пациента, данных его анамнеза, результатов осмотра, лабораторных, инструментальных, патологоанатомических и иных исследований в целях распознавания состояния или установления факта наличия или отсутствия заболевания; ПК-6 — способность к определению у пациента основных патологических состояний, симптомов, синдромов заболеваний, нозологических форм в соответствии с Международной статистической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем, Х пересмотра; ПК-21 — способность к участию в проведении научных исследований. 7 ИНСТРУКЦИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ И ПРОТИВОПОЖАРНОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В ХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Техника безопасности — раздел охраны труда, обеспечивающий использование приемов и методов работы, правильную организацию рабочего места, внедрение в практику средств защиты от опасных производственных факторов. Допущенная в работе небрежность может не только исказить результаты выполненных анализов, но и явиться причиной возникновения несчастных случаев и травм (ожогов, отравлений, заражений и др.). Поэтому овладение элементами техники лабораторных работ представляет собой задачу первостепенной важности. I. Общие требования охраны труда 1.1. Настоящим инструкция определяет требования охраны труда для обучающихся при проведении лабораторных работ на кафедре биологической и общей химии. К выполнению лабораторных работ допускаются обучающиеся: • прошедшие инструктаж по охране труда на рабочем месте (повторный инструктаж не реже одного раза в 6 месяцев); • по расписанию или согласно индивидуальному плану; • под контролем преподавателя. 1.2. Опасными и вредными факторами, действующими на обучающихся при работе в учебной лаборатории, являются: • повышенное напряжение в электрической сети, замыкание которой может произойти через тело человека; • недостаточный уровень освещенности; 8 • опасность травмирования осколками посуды, используемой в процессе работы; • повышенная запыленность воздуха рабочей зоны; • термические ожоги при неаккуратном обращении с электричеством и нагревательными приборами; • химические ожоги при попадании на кожу, в глаза, дыхательные пути химических жидкостей. 1.3. Обучающийся должен: • соблюдать установленный в Университете режим труда и отдыха; • выполнять правила личной гигиены; • надевать санитарную одежду (халат), сменную обувь; • не принимать пищу на рабочем месте; • знать номера телефонов медицинской службы и пожарной охраны; • соблюдать правили пожарной безопасности, знать места расположения средств пожаротушения. II. Требования охраны труда перед началом работы 2.1. Перед началом работы обучающиеся должны убедиться в: • безопасности рабочего места и исправности рабочего оборудования; • отсутствии розлива жидкости, наличия на полу битого стекла и других посторонних предметов; 2.2. Обучающиеся должны освободить рабочее место от предметов, ненужных для предстоящей работы. 2.3. Обучающиеся должны ознакомиться с устройством и руководством по эксплуатации фотоэлектроколориметров. 2.4. Обучающиеся должны ознакомиться с порядком проведения лабораторной работы. III. Требования охраны труда во время работы 3.1. При проведении лабораторной работы обучающиеся не должны допускать спешки. Проведение лабораторной работы следует выполнять с учетом безопасных приемов и методов работы. 3.2. При включении электрооборудования в сеть необходимо проверить соответствие напряжения прибора, указанного в паспорте, напряжению в сети. 9 3.3. Все нагревательные приборы должны иметь гладкую поверхность, быть доступными для легкой очистки и установлены на подставки из теплоизолирующих материалов. 3.4. Запрещается: • пробовать реактивы на вкус; • использовать в работе разбитые предметы (необходимо следить за целостностью стеклянных приборов, оборудования и посуды); • принимать пищу в учебной лаборатории. 3.5. При эксплуатации центрифуг необходимо соблюдать следующие правила: • при загрузке центрифуги стаканами или пробирками соблюдать правила строгого попарного уравновешивания; • перед включением центрифуги в электрическую сеть необходимо проверить, хорошо ли привинчена крышка к корпусу; • включать центрифугу в электрическую сеть плавно при помощи реостата, после отключения надо дать возможность ротору остановиться, тормозить ротор рукой запрещается; • после работы центрифугу нужно осмотреть и протереть. 3.6. При эксплуатации термостата необходимо соблюдать следующие требования: • запрещается в термостат загружать легко воспламеняющиеся вещества; • очистку термостата производить только после отключения его от сети. 3.7. Для слива отходов использовать специально предназначенную емкость с маркировкой «Для слива». 3.8. При проведении исследований с материалом, представляющим биологические жидкости, должны соблюдаться следующие правила: • перед работой тщательно проверить целостность стеклянной посуды; • запрещается: а) прикасаться к исследуемому материалу руками без перчаток; б) переливать растворы реактивов из сосуда в сосуд через край без воронки; в) принимать пищу, пользоваться косметикой на рабочем месте. 10 3.9. В помещении лаборатории запрещается: • оставлять без присмотра нагревательные приборы; • убирать случайно пролитые огнеопасные жидкости при зажженных горелках и включенных электронагревательных приборах; • наливать в горячую спиртовку горючее, пользоваться спиртовкой, не имеющей металлической трубки и шайбы для сжатия; • держать голову под тягой при работе в вытяжном шкафу; • пробовать на вкус и вдыхать неизвестные вещества; • наклонять голову над сосудом, в котором кипит какая-либо жидкость; • хранить: а) запасы ядовитых, сильнодействующих, взрывоопасных веществ на рабочих столах и стеллажах; б) применять реактивы без этикеток; в) использовать какие-либо вещества без этикеток; г) принимать пищу, а также курить; • выполнять работы, не связанные с заданием и не предусмотренные методиками проведения исследований; • загромождать и захламлять проходы и коридоры, а также подходы к средствам пожаротушения. IV. Требования охраны труда в аварийных ситуациях 4.1. При возникновении ситуаций, которые могут привести к авариям или несчастным случаям, необходимо: • немедленно прекратить работы, известить о произошедшем преподавателя и действовать в соответствии с его указаниями. 4.2. Во всех случаях при возникновении угрожающей ситуации преподаватель должен обеспечить выход обучающихся в безопасное место. Преподаватель и обучающиеся должны действовать быстро и решительно, не поддаваясь панике. 4.3. При несчастном случае: • организовать первую помощь; • сообщить о случившемся заведующему кафедрой; • при необходимости обеспечить доставку пострадавшего в медицинское учреждение; • принять меры по предотвращению развития аварийной или иной чрезвычайной ситуации. 11 4.4. В случае разлива кислот, щелочей, других агрессивных реагентов принять необходимые меры для ликвидации последствий: открыть окна, проветрить помещение, осторожно убрать пролитую жидкость: • при разливе щелочи ее засыпать песком (опилками), затем поместить в двойной-тройной полиэтиленовый пакет пропитанный щелочью песок (опилки) и залить это место сильно разбавленной соляной или уксусной кислотой. После этого удалить кислоту тряпкой, вымыть поверхность стола водой; • при разливе кислоты ее засыпать песком (опилками засыпать нельзя), затем c помощью совка поместить в двойной-тройной полиэтиленовый пакет пропитанный кислотой песок, засыпать место разлива содой, соду удалить и промыть это место большим количеством воды. 4.5. В случае воспламенения горючей жидкости требуется немедленно: а) выключить нагревательные приборы и тягу, если возгорание произошло под тягой или возле нее; б) быстро отставить в безопасное место все сосуды с легковоспламеняющимися веществами; в) закрыть пламя куском асбестовой ткани или другими подручными негорючими материалами или засыпать песком, который находится в лаборатории в ящиках; г) запрещается заливать водой не смешивающиеся с ней жидкости (бензин, бензол и другие углеводороды), так как это только способствует распространению пламени; д) запрещается открывать окна, так как это увеличит приток кислорода, что вызовет увеличение размера пламени. 4.6. Если загорятся провода электрической сети, в первую очередь следует отключить напряжение, запрещается применять воду и огнетушители, не предназначенные для работы с проводкой, не выключив ток. Пробовать сбить пламя сухими тряпками или песком. V. Требования охраны труда по окончании работы 5.1. Привести в порядок рабочее место. 5.2. При завершении всех работ отключить приборы и аппараты, которые были использованы в процессе работы. 12 5.3. Обо всех выявленных в процессе работы нарушениях поставить в известность преподавателя. VI. Меры первой помощи при несчастных случаях в лаборатории 6.1. При попадании на кожу кислот пораженный участок кожи нужно немедленно обмыть большим количеством воды, а затем —3% раствором двууглекислой соды. 6.2. При попадании на кожу щелочей начале также нужно обмыть пораженный участок кожи большим количеством воды, а затем 2% раствором уксусной кислоты. 6.3. При попадании брызг реактивов в глаза — промыть глаз, раскрыв глазную щель пальцами и набирая воду в ладонь, сделав ее «лодочкой», затем немедленно отправить потерпевшего для оказания помощи в глазную клинику. 6.4. При ожогах горячими предметами или паром пораженное место смазать мазью от ожогов или смочить раствором марганцовокислого калия. 6.5. При ожогах веществом в виде жидкости или массы прежде всего вещество нужно снять ватой или смыть водой, а затем обсушить пораженное место ватой и смазать мазью. 6.6. В случае попадания в ротовую полость или желудок реактивов следует немедленно прополоскать рот, вызвать рвотный рефлекс и отправить пострадавшего к врачу. 13 Раздел I СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ Тема 1 СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АМИНОКИСЛОТ Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: практическое занятие. Место проведения: аудитории кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 180 мин. Актуальность/мотивация. Знания и навыки, приобретенные на занятии, необходимы для оценки результатов в клинико-диагностической практике врача и санитарно-гигиенических исследованиях. Изучение данной темы направлено на формирование у обучающихся следующих компетенций: ОК-1, ОПК-2, ОПК-7, ОПК-8, ПК-21. Цели занятия Образовательная цель. Систематизировать знания обучающихся о строении, свойствах и роли аминокислот, необходимые для оценки физико-химических свойств и биологической роли белков. Обсудить 14 различные методы исследования и идентификации аминокислот. Ознакомить обучающихся с основными правилами техники безопасности при работе в химической лаборатории. Воспитательная цель. Воспитание профессиональной ответственности, понимание основного принципа деятельности врача «Не навреди». Развивающая цель. Развитие способностей анализировать, систематизировать информацию о свойствах и роли аминокислот в биохимических процессах организма человека; развитие способностей логического мышления и применения методов исследования аминокислот для решения профессиональных задач. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • правила техники безопасности при работе в химической лаборатории; • классификацию и строение аминокислот; • физико-химические свойства аминокислот; • роль аминокислот в организме; • примеры и роль производных аминокислот; • примеры и роль биологически активных пептидов; • применение аминокислот и их производных в качестве лекарственных препаратов; • методы исследования аминокислот. Обучающийся должен уметь: • писать формулу пептида и представить характеристику пептида; • анализировать строение аминокислот и их участие в биохимических реакциях; • выбрать методы идентификации аминокислот (производных аминокислот) для решения профессиональных задач; • интерпретировать результаты различных методов исследования аминокислот (производных аминокислот) для диагностики патологических состояний. Обучающийся должен владеть: способностью логического мышления, использования научно-естественных понятий и методов в биохимических исследованиях. 15 Внутрипредметные связи Энзимодиагностика, белки плазмы крови, энзимотерапия Белки Ферменты Типы ингибирования Биохимия крови Межпредметные связи Детские болезни Фармакология Патофизиология Аминокислоты Органическая и неорганическая химия Лабораторная диагностика Внутренние болезни Физиология Биология Вопросы для самоподготовки 1. Какова роль аминокислот в организме? 2. На чем основана классификация аминокислот? Приведите примеры и напишите структурные формулы аминокислот; дайте характеристику функциональных групп аминокислот. 3. Что такое радикал аминокислоты, и какова его роль в формировании белковой молекулы? 4. Какие физико-химические свойства присущи аминокислотам? 5. Что такое заменимые и незаменимые аминокислоты. Приведите примеры. 6. Приведите примеры производных аминокислот и охарактеризуйте их роль. 7. Напишите формулу пептида, содержащего полярные и неполярные радикалы аминокислот. 8. Приведите примеры биологически важных пептидов и охарактеризуйте их роль в организме? 16 9. Методы идентификации аминокислот и пептидов. 10. Использование цветных реакций в практике лечащего врача. 11. Какие виды хроматографии вам известны? 12. Использование различных видов хроматографии в диагностических и исследовательских целях. Задание для самоподготовки 1. Изучите рекомендуемую литературу, используя вопросы для самоподготовки. 2. Напишите в рабочей тетради формулы аминокислот и дайте характеристику их радикалов (по растворимости в воде, наличию полярных групп и заряда). Глоссарий Аминокислота — органическая молекула, производное карбоновой кислоты, у которой водород у α-углеродного атома замещен на аминогруппу. Аминоацидурия — повышенное содержание аминокислот в моче. Гипераммониемия — увеличение уровня аммиака в крови. Заменимые аминокислоты — аминокислоты, которые синтезируются в организме. Масс-спектрометрия (масс-спектроскопия, масс-спектрография, масс-спектральный анализ, масс-спектрометрический анализ) — метод исследования вещества, основанный на определении отношения массы к заряду ионов, образующихся при ионизации компонентов пробы. Метод качественной идентификации веществ и количественного определения. Почти все масс-спектрометры — это вакуумные приборы, поскольку ионы очень нестабильны в присутствии посторонних молекул. Незаменимые аминокислоты — аминокислоты, которые не синтезируются в организме. Олигопептид — пептид, содержащий до 10 аминокислот. Полипептид — пептид содержащий, до 50 аминокислот. Радикал аминокислоты — группировка атомов молекулы, локализованная у α-углеродного атома и не участвующая в формировании пептидной связи. 17 Скрининг (от англ. screening — «отбор, сортировка») может означать (в здравоохранении) — система первичного обследования групп клинически бессимптомных лиц с целью выявления случаев заболевания. Секвенирование белков набор методов выяснения первичной структуры белков (аминокислотной последовательности), определение их конформации, установление небелковых молекул, связанных с белком. Нейротрансмиттер (нейромедиатор) — химическое вещество, выделяющееся в синаптическую щель, соединяющееся с постсинаптическим рецептором и участвующее в проведении нервного импульса. Хроматография — метод разделения компонентов смеси между двумя несмешивающимися фазами, подвижной и неподвижной. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ) — разновидность ВЭЖХ, в которой подвижная фаза — полярная, а неподвижная — неполярная. Рекомендуемая литература Основная: 1. Биохимия: учебник для вузов / под ред. Е. С. Северина. — М.: ­ГЭОТАР-­Медиа, 2015. — С. 9–22. 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (раздел 1, тема 1). Дополнительная: Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 27–43, 53–56, 74–77. Электронные ресурсы: 1. Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http:// www.studmedlib.ru/book/ ISBN9785970433126.html (раздел 1, п. I–VI). 2. Биологическая химия с упражнениями и задачами [Электронный ресурс] / под ред. С. Е. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. — http:// www.studmedlib.ru/book/ ISBN9785970433126.html. 18 Роль аминокислот в организме Аминокислоты и их метаболиты участвуют в различных обменных процессах в организме: • являются структурными компонентами белков и пептидов; • являются источниками азота для синтеза небелковых азотсодержащих соединений (гема, азотистых оснований, холина, креатина, карнитина и др.); • являются предшественниками для синтеза биогенных аминов, например, гистамина, серотонина, ДОФ-амина, гамма-аминомасляной кислоты и др.; • используются в реакциях детоксикации; • применяются для энергообеспечения клетки; • используются для синтеза углеводов и липидов; • выполняют роль нейромедиаторов (глицин, глутаминовая кислота). Методы разделения и идентификации аминокислот: 1. Цветные реакции. 2. Хроматография. 3. Электрофорез. 4. Спектральные методы. Методы разделения и идентификации аминокислот основаны на свойствах радикалов аминокислот. С практической точки зрения разделения аминокислот наиболее популярными являются хроматографические методы. Цветные реакции Проведение цветных реакций основано на образовании окрашенных соединений в результате взаимодействия того или иного реактива с определенными функциональными группами аминокислот или белка. Существуют два типа цветных реакций: 1. Универсальные: • биуретовая (характерна для всех белков и основана на наличии пептидной связи. Реакцию дают все соединения, содержащие в молекуле две и больше двух близко расположенных пептидных 19 связей. Реакция характерна для всех белков (как полипептидов), но не специфична для них. Используется для обнаружения белка в растворе и количественного определения белка; • нингидриновая (определяет наличие NH2 — группы в α-поло­ жении у аминокислот и белков. Используется для обнаружения аминокислот и их количественного определения). 2. Специфические реакции, характерные для отдельных аминокислот, содержащих специфические функциональные группы в радикалах. Но метод имеет ограничения — не все аминокислоты можно обнаружить с помощью цветных реакций. Клинико-диагностическое значение цветных реакций 1. Цветные реакции используют как скрининг-тесты для диагностики заболеваний, при которых происходит: • наследственное нарушение метаболизма отдельных аминокислот, например, фенилкетонурия, гомоцистинурия (методы см. ниже); • нарушение реабсорбции аминокислот в почках. 2. С помощью цветных реакций можно оценить качественный и количественный состав белков и пептидов в биологических жидкостях, а также полноценность белков в пищевых продуктах. 3. В санитарно-гигиенической практике цветные реакции используют для количественного и качественного определения белковых веществ (загрязнений) во внешней среде (атмосферном воздухе, сточных водах и т.д.). Скрининг-тесты для выявления наследственных и приобретенных нарушений обмена аминокислот Дефект ферментов различных этапов метаболизма аминокислот может приводить к накоплению аминокислот и продуктов их превращения и оказывать отрицательное влияние на состояние организма. Нарушения метаболизма аминокислот могут быть первичными (врожденными) или вторичными (приобретенными). Первичные аминоацидопатии обычно наследуются аутосомно-рецессивно или сцеплено с Х-хромосомой и проявляются в раннем детском возрасте. В литературе описано более 30 вариантов аминоацидопатий. 20 Клинические проявления могут варьироваться от легких доброкачественных нарушений до тяжелых метаболических нарушений, сопровождающихся рвотой, задержкой умственного развития и роста, остеомаляцией и остеопорозом, комой, вплоть до внезапной смерти новорожденных. Вторичные нарушения обмена аминокислот могут быть связаны с заболеваниями печени, желудочно-кишечного тракта, почек, неполноценным питанием, новообразованиями. Ранняя диагностика и своевременное лечение позволяют предупредить развитие и прогрессирование симптомов заболевания. 1. Обнаружение аминокислот цистина и гомоцистеина Принцип метода. Азид натрия при реакции с йодом образует комплекс бурого цвета, который обесцвечивается в присутствии цистина и гомоцистеина. Ход определения. Каплю мочи наносят на фильтровальную бумагу и после высушивания добавляют 1 каплю раствора азида натрия. В течение 5 мин наблюдают за исчезновением бурой окраски. Исчезновение бурой окраски через 2–3 мин после добавления азида натрия указывает на нормальные величины. Клиническое значение: тест положителен при наследственной гомоцистинурии (дефицит синтеза фермента цистатионинсинтазы) или приобретенной (дефицит витаминов В6, В9, В12), в этом случае окраска остается более 5 мин. Повышенное содержание гомоцистеина в крови приводит к формированию тромбов и развитию атеросклероза. Для диагностики наследственных заболеваний белкового обмена также используют скрининг-тесты на обнаружение кетокислот, так как нарушения обмена аминокислот сопровождаются образованием и накоплением соответствующих кетокислот и экскрецией их с мочой в большом количестве. 2. Обнаружение кетокислот: А. По реакции с треххлористым железом. Ход определения. К 0,5 мл мочи добавляют 0,25 мл раствора треххлористого железа. О наличии кетокислот судят по характеру окраски (проба положительна); сине-зеленое окрашивание указывает на наличие фенилпировиноградной кислоты, а желтое — на 21 избыток пирувата в моче. Тест положителен при фенилкетонурии (фенилпировиноградной олигофрении) — нарушении превращения фенилаланина в тирозин. Б. Обнаружение кетокислот по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. Ход определения. Смешивают 1 мл раствора 2,4 ДНФГ и 0,25 мл мочи. При положительной пробе развивается окраска от желтой до оранжево-коричневой. В норме проба отрицательная, окраска не развивается. Хроматография Хроматография — метод разделения компонентов смеси между двумя несмешивающимися фазами. Одной из них является неподвижная фаза, которая бывает твердой, жидкой или представляет собой смесь твердой и жидкой фаз. Вторая, подвижная, фаза может быть жидкой или газообразной; она обычно течет по неподвижной фазе или пропускается через нее. Поэтому в зависимости от агрегатного состояния фаз хроматографию разделяют на жидкостную, газовую и газожидкостную. В зависимости от механизма разделения веществ и природы неподвижной фазы хроматография бывает нескольких видов: • адсорбционная — основана на различной способности отдельных компонентов смеси адсорбироваться на поверхности твердой фазы сорбента; этот метод предложен М. С. Цветом в 1903 г.; • распределительная — основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух мало смешивающихся жидкостях; • ионообменная — основана на различной способности разделяемых веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной фазы; • осадочная — основана на образовании трудно растворимых осадков в определенной последовательности; • диффузионная — основана на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента в зависимости от размера молекул неподвижной фазы (к данному типу относится гель-фильтрация); • аффинная — основана на сродстве компонентов смеси к лигандам неподвижной фазы. 22 Хроматографические методы анализа различают и по технике выполнения: • колоночная (используется для разделения высокомолекулярных соединений); • капиллярная (основана на продвижении веществ в тонком капилляре); • плоскостная (на бумаге или в тонком слое силикагеля). По направлению движения растворителя (подвижной фазы) различают: восходящую, нисходящую, двухмерную и радиальную. Ионообменная хроматография Радикалы аминокислот имеют положительный и отрицательный заряд, поэтому для их разделения применяют ионообменную хроматографию. Принцип метода: смесь аминокислот разделяют в колонке с использованием катионообменной (или анионообменных) смолы в качестве неподвижной фазы, которая содержит прочно связанные с ней отрицательно (SO3–) или положительно заряженные группы. Ход определения. В катионообменник вносят смесь аминокислот в кислой среде (рН 3,0). Положительно заряженные аминокислоты присоединяются к отрицательно заряженным частицам смолы. Лизин, аргинин и гистидин наиболее прочно связываются с катионообменником, а аспарагиновая и глутаминовая кислоты — наиболее слабо. Высвобождение аминокислот из колонки осуществляется вымыванием (элюированием) их буферным раствором с увеличением концентрации NaCI и рН. Каждая аминокислота выходит из колонки при определенном значении рН и ионной силы. Собирая с нижнего конца колонки раствор (элюент) в виде небольших порций, можно получить фракции, содержащие отдельные аминокислоты. Газожидкостная хроматография Газожидкостная хроматография — разделение газовой смеси вследствие различной растворимости компонентов пробы в жидкости или различной стабильности образующихся комплексов. Неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на инертный носитель, подвижной — газ. Разделение основано на различиях в летучести и 23 растворимости (или адсорбируемости) компонентов разделяемой смеси. Этот метод можно использовать для анализа газообразных, жидких и твердых веществ с молекулярной массой меньше 400, которые должны удовлетворять определенным требованиям, главные из которых — летучесть, термостабильность, инертность, легкость получения. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют, как правило, органические вещества, поэтому газовую хроматографию широко используют как серийный метод анализа органических соединений. В зависимости от типа используемой неподвижной фазы газовую хроматографию подразделяют на газоадсорбционную (в зарубежной научной литературе ее принято обозначать как газотвердофазная) и газожидкостную хроматографию. В первом случае неподвижной фазой является твердый носитель (силикагель, уголь, оксид алюминия), во втором — жидкость, нанесённая на поверхность инертного носителя. В настоящее время наибольшее распространение получила высокоэффективная жидкостная хроматография [ВЭЖХ, или НРLC (от англ. high performance liquid chromatography)]. Методом ВЭЖХ разделение ведется при высоком давлении (до 400 бар) и с использованием мелкозернистых сорбентов (обычно 3–5 мкм, но бывает и менее 2 мкм). Применение хроматографии в биологии и медицине: • установление аминокислотного состава и первичной структуры белков (например, анализ первичной структуры гемоглобина для диагностики гемоглобинозов; при серповидно-клеточной анемии, при которой произошла мутация и в первичной структуре β-цепей гемоглобина в 6 положении глутаминовая кислота заменена на валин); • количественное определение аминокислот; • изучение аминокислотного состава плазмы крови и других биологических жидкостей; • в гигиене и экологии для определения содержания вредных примесей в воздухе, воде и пищевых продуктах; • в токсикологии и судебной медицине для диагностики отравлений техническими жидкостями (например, хлорпроизводными углеводородов, алкоголем и его суррогатами) и пестицидами самой различной структуры; 24 • в фармакологии и фармации для контроля качества препаратов, анализа компонентов растительного сырья, исследования метаболизма лекарственных препаратов; • в спорте для допинг-контроля. Применение хроматографии в клинико-диагностической практике Методы высокоэффективной газожидкостной хроматографии аминокислот биологических жидкостей применяют: • при диагностике наследственных и приобретенных заболеваний, связанных с нарушением метаболизма аминокислот. Подозрение на наличие генетических нарушений обмена аминокислот возникает при наличии следующих клинических проявлений: нарушение умственного развития; метаболический ацидоз; особый запах; окраска пеленок, обнаруженная при скрининг-тесте; • при отягощенном семейном анамнезе, наличии врожденных аминоацидопатий у родственников; • для дифференциальной диагностики наследственных нарушений азотистого обмена при гипераммониемии; • для обнаружения (или оценки количества) метаболита (аминокислоты), предшествующего дефектному ферменту; • для мониторинга эффективности диетотерапии и медикаментозного лечения. Электрофорез Принцип метода. Аминокислоты как заряженные частицы способны двигаться в электрическом поле. На практике применяют методы капиллярного электрофореза для анализа аминокислот в биологических жидкостях, лекарственных препаратах, продуктах питания. Метод спектроскопии Принцип метода основан на поглощении аминокислотами УФ-излучения. Ароматические аминокислоты — фенилаланин, тирозин и трип­ тофан поглощают свет в ультрафиолетовой области спектра, все 25 остальные аминокислоты — в инфракрасной области спектра, это свойство широко используется для аналитического определения белков. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) Каждый аминокислотный остаток в составе белка имеет характерный спектр ЯМР. Высокая разрешающая способность этого метода используется для выяснения пространственной структурной организации белков. 26 Тема 2 ПРОТЕОМИКА. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: практическое занятие. Место проведения: аудитории кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 90 мин. Актуальность/мотивация. Знания и навыки, приобретенные на занятии, важны для понимания роли белков в жизнедеятельности организма; понимания зависимости между химическим строением и биологической ролью важнейших представителей белков в организме; понимания причин патологических состояний, сопровождающихся гипер- или гипопротеинемией; необходимы в клинико-­ диагностической практике врача для оценки метаболизма и его нарушений; понимания принципов основных физико-химических методов исследования белков и аминокислот. Цели занятия Образовательная цель. Систематизировать знания по строению, классификации и биологической роли белковых молекул: рассмотреть уровни организации белковых молекул, охарактеризовать связи, стабилизирующие каждый вид структуры, объяснить биологическое значение формирования разных структурных уровней белков для их функциональной активности. 27 Воспитательная цель. Воспитание у обучающихся навыков: • аргументированного обоснования своей точки зрения и уважительного отношения к мнению коллег; • культуры поведения и коллективной профессиональной этики. Развивающая цель. Развитие логического мышления, способности получать, анализировать, обобщать, интерпретировать и передавать информацию в устной и письменной формах. Формирование широкого профессионального кругозора, повышение интеллектуального потенциала, мотивация к самообразованию. Развитие у обучающихся способности и готовности к постановке предварительного диагноза. Формируемые компетенции: изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-1, ОК-8) и общепрофессиональных и профессиональных (ОПК-2, ОПК-7, ПК-5, ПК-21) компетенций. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • структурные уровни организации белковых молекул, причины и условия их формирования, стабилизирующие связи, биологическую роль; • количественные методы определения белков в биологических жидкостях. Обучающийся должен уметь: • писать структуру фрагмента полипептидной цепи, состоящую из нескольких аминокислотных остатков; • объяснять образование ковалентных и нековалентных связей меж­­ду определенными аминокислотными радикалами при формировании вторичной, третичной, четвертичной структуры белка; • пользоваться биохимической терминологией по теме занятия; • объяснять применение методов исследования белков в диагностике; • излагать материал по теме в понятной, убедительной, логичной речевой форме. Обучающийся должен владеть: • биохимической терминологией по теме занятия; • навыками грамотной публичной речи; 28 • информацией об изменениях биохимического показателя (общий белок сыворотки крови) при развитии ряда патологий. Вопросы для самоподготовки: 1. Что такое белки? Какие функции они выполняют в организме человека? 2. Первичная структура белковой молекулы. Напишите фрагмент полипептидной цепи, укажите пептидный остов, N- и С-концы. За счет каких связей формируется первичная структура белка? Выделите их на пептидной цепи и охарактеризуйте. Какова биологическая роль первичной структуры? 3. Вторичная структура белка. Модель Поллинга–Кори. Назовите виды вторичной структуры и связи, ее стабилизирующие. Биологическая роль вторичной структуры. 5. Третичная структура белка: виды третичной структуры и связи, которые ее стабилизируют. Биологическая роль. 6. Четвертичная структура белка. Назовите связи, ее стабилизирующие. Биологическая роль. 8. Какие существуют количественные методы определения белка в растворах? Сравнительная характеристика методов. Задание для самоподготовки 1. Изучить рекомендуемую литературу, используя вопросы для самоподготовки. 2. Написать в рабочей тетради название работы, принцип метода и краткую таблицу с описанием алгоритма выполнения лабораторной работы. 3. Изучить устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра по методическому пособию для обучающихся и по материалам стенда в учебной лаборатории. 4. Подготовиться к тестовому контролю. Рекомендуемая литература Основная: 1. Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015 — С. 10–30, 35–38, 66–73. 29 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 111 с. (раздел 1, тема 2). Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия: учебник. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 33–43, 49–77, 661–665. 2. Ленинджер А. Основы биохимии. — М.: Мир, 2012. — Т. 1. — С. 165–186. 3. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 2 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2018. — С. 364–365. 4. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — С. 61–62, 64–65, 68–70. Электронные ресурсы: 1. Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. —http:// www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970433126.html (раздел 1, п. I–VI). 2. http://studopedia.org 3. http://window.edu.ru 4. http://studFiles.net 5. http://biohimist.ru Глоссарий Аминокислота (АК) — производные карбоновых кислот, у которых один или несколько атомов водорода замещены аминогруппой. Белок (протеин) — биополимер, содержащий α-L-аминокислоты, соединенные между собой пептидными связями. Простой белок — белок, содержащий в своем составе только полипептидные цепи, представленные остатками аминокислот. Сложный белок — белок, содержащий в своем составе кроме полипептидных цепей и небелковую часть. Первичная структура белка — линейная последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Вторичная структура белка — регулярная пространственная упорядоченная укладка полипептидной цепи молекулы белка в виде α-спирали или β-складчатой структуры. 30 Третичная структура белка — трехмерная пространственная структура, образующаяся за счет взаимодействий между радикалами аминокислот, представлена в форме глобулы или фибриллы. Четвертичная структура белка — надмолекулярная структура, представляющая укладку определенного количества полипептидных цепей, взаимодействующих между собой в функционально активной молекуле белка. Протомер (субъединица) — отдельная полипептидная цепь белка, уложенная в третичную структуру. Олигомерный белок — белок, содержащий в своем составе несколько протомеров (субъединиц). Домен — участок полипептидной цепи, которому свойственна определенная автономия структурной организации. Нормопротеинемия — нормальное содержание общего белка в сыворотке крови (65–85 г/л). Гипопротеинемия — сниженное содержание общего белка в сыворотке крови (ниже 65 г/л). Гиперпротеинемия — повышенное содержание общего белка в сыворотке крови (выше 85г/л). Фотоэлектроколориметр (ФЭК) — прибор, предназначенный для измерения оптической плотности (или коэффициентов пропускания) окрашенных растворов при биохимическом анализе с целью количественного определения различных веществ. Пример билета проверочного контроля 1. Напишите формулу трипептида: Ала-Цис-Тир. 2. Какие связи стабилизируют третичную структуру белка? Биологическая роль третичной структуры. Количественные методы определения белков 1. Азотометрический метод Къельдаля — основан на полном разрушении белка под действием серной кислоты в присутствии катализатора. Высвобождаемое количество аммиака определяется титрометрически, либо способом колориметрии, либо с использованием электродов, чувствительных к аммиаку. Результаты определения концентрации азота умножают на 6,25 (100:16), так 31 как среднее содержание азота в общем белке составляет примерно 16%. Недостаток метода: одновременно определяются и небелковые азотсодержащие компоненты, что приводит к получению результатов, превышающих содержание белка. Используется в санитарно-гигиенической практике для определения белков в пищевых продуктах, имеющих природную окраску. 2. Гравиметрические (весовые) методы — основаны на предварительном осаждении белков, их обезвоживании, высушивании и взвешивании на аналитических весах; применим только при отсутствии в пробе других соединений. 3. Рефрактометрические методы — основаны на определении коэффициента преломления монохроматического луча света раствором. В сыворотке крови величина рефракции зависит от количества и качества белков. Определив значение показателя преломления, по таблице находят величину концентрации белка. Недостаток метода: на величину рефракции влияют небелковые компоненты крови (минеральные вещества, углеводы, липопротеины). 4. Спектрофотометрические методы — основаны на измерении степени светопоглощения белковых растворов в ультрафиолетовой области (200–220 или 280 нм). Из аминокислот, входящих в состав белков, лишь триптофан, тирозин и в меньшей степени фенилаланин обладают заметным поглощением в ультрафиолетовой области спектра. Оптическая плотность растворов белков, содержащих эти аминокислоты, при 280 нм прямо пропорциональна концентрации белка в растворе. Поскольку большинство белков содержит остатки тирозина, измерение поглощения при 280 нм с помощью спектрофотометра представляет собой быстрый и удобный способ определения содержания белков в растворе. Этот метод дает хорошие результаты с гетерогенной смесью белков, а также с препаратами индивидуальных белков. 5. Фотоколориметрические методы — основаны на измерении степени поглощения окрашенных продуктов реакции в видимой области спектра. Для этого используются цветные реакции белков с определенными реактивами либо неспецифическое связывание белка с красителем: а) Метод Лоури; б) биуретовый метод; в) методы, основанные на связывании белка с органическими красителями [кумасси, бриллиантовым голубым (КБГ) G-250 — метод 32 Брэдфорда; бромкрезоловым зеленым (БКЗ)]. В настоящее время методы, основанные на связывании с БКЗ, используют для определения альбумина в крови. В клинической и санитарно-гигиенической практике наиболее востребованы спектрофотометрические и фотоколориметрические методы количественного определения белка. 6. Преципитационные методы. Данные методы определения основаны на снижении растворимости белков и образовании суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. Метод применяют для определения многих индивидуальных белков с использованием специфических антител. Сначала образуются иммунные комплексы «антитело-антиген», потом из них формируются крупные агрегаты, которые визуализируются как преципитаты. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния (нефелометрический метод), определяемого числом светорассеивающих частиц, либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод). Поскольку турбидиметрия и нефелометрия основаны на регистрации проходящего или рассеянного света через мутные растворы, то использование света монохроматических лазерных источников значительно повышает чувствительность этих методов анализа. Лазерная нефелометрия применяется для определения белков в низкой концентрации. Нефелометрия и турбидиметрия относятся к основным методам, используемым для определения содержания белков острой фазы в крови. Также этими методами с высокой точностью определяют в крови концентрацию IgG, IgA, IgM, подклассов IgG и других сывороточных белков. Тестовые задания Выберите правильный ответ. 1. Аминокислота, имеющая отрицательно заряженный радикал: а) ала; б) сер; в) фен; г) глу. 33 2. Аминокислота, содержащая бензольное кольцо: а) тир; б) три; в) гис; г) про. 3. Линейная последовательность аминокислотных остатков, связанных пептидными связями, — это структура белка: а) третичная структура; б) первичная структура; в) четвертичная структура; г) вторичная структура. 4. Первичная структура стабилизирована: а) водородными связями; б) гидрофобными связями; в) ионными связями; г) пептидными связями. 5. Вторичная структура стабилизирована: а) водородными связями; б) гидрофобными связями; в) ионными связями; г) пептидными связями. 6. Гидрофобные, ионные, водородные и дисульфидные связи стабилизируют: а) третичную структуру; б) первичную структуру; в) четвертичную структуру; г) вторичную структуру. 7. α-Спираль и β-складчатый слой характерны для следующей структуры: а) третичной; б) первичной; в) четвертичной; г) вторичной. 8. Радикалы лизина и аспартата соединяются при помощи следующего типа связей: а) водородными связями; б) гидрофобными связями; 34 в) ионными связями; г) пептидными связями. 9. Радикалы серина и тирозина соединяются при помощи следующего типа связей: а) водородными связями; б) гидрофобными связями; в) ионными связями; г) пептидными связями. 10. Эффект кооперативности характерен для: а) третичной структуры; б) первичной структуры; в) четвертичной структуры; г) вторичной структуры. Ответы на тестовые задания 1—г 2—а 3—б 4—г 5—в 6—а 7—г 8—в 9—а 10 — в 35 Тема 3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ Лабораторная работа № 1 Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: лабораторное занятие. Место проведения: аудитории для лабораторных исследований кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 90 мин. Актуальность/мотивация. Определение концентрации белка в сыворотке крови представляет для врача практический интерес с точки зрения лабораторной диагностики патологических состояний и оценки эффективности лечебных мер. Знания и навыки, приобретенные на занятии, необходимы в клинико-диагностической деятельности врача и могут быть использованы в практической работе с больными. Цели занятия Образовательная цель. Изучение устройства и принципа работы фотоэлектроколориметра. Освоение правил пользования автоматическими дозаторами переменного/фиксированного объема. Освоение метода количественного определения белка в сыворотке крови и изучение возможности его использования для диагностики патологических состояний. Воспитательная цель. Воспитание у обучающихся навыков: • совместной работы в команде на принципах равноправного партнерства при выполнении поставленной учебной задачи; 36 • аргументированного обоснования своей точки зрения и уважительного отношения к мнению коллег. • культуры поведения и коллективной профессиональной этики. Развивающая цель. Развитие у обучающихся способности к участию в проведении научных исследований. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • правила техники безопасности при работе в химической лаборатории; • устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра; • возможности использования фотоколориметрического метода в клинико-биологических исследованиях; • принципы биохимических методов количественного определения белка в биологических жидкостях; • клинико-диагностическое значение определения белка в сыворотке крови. Обучающийся должен уметь: • пользоваться автоматическими дозаторами переменного/фиксированного объема; • отмерять необходимые объемы биологического материала и реактивов с помощью автоматических дозаторов; • пользоваться фотоэлектроколориметром для определения оптической плотности проб; • в команде выполнять определение общего белка в биологической жидкости; • проводить типовые расчеты при обработке полученных данных; • самостоятельно делать заключения (выводы) по результатам исследования; • коллективно обсуждать клинико-диагностическое значение полученных результатов. Обучающийся должен владеть: • навыками работы с автоматическими дозаторами; • навыками работы на фотоэлектроколориметре; • способностью оценки полученных результатов; 37 • навыками оформления результатов лабораторных исследо­ ваний. Формируемые компетенции: изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-1, ОК-8) и общепрофессиональных и профессиональных (ОПК-2, ОПК-7, ПК-5, ПК-21) компетенций. Задание для самоподготовки 1. Изучите основную и дополнительную литературу, используя вопросы для самоподготовки и тестовые задания. Вопросы для самоподготовки 1. Какие методы используются для количественного определения белка? 2. Принцип биуретового метода количественного определения общего белка. 3. Нормопротеинемия. Причины гипо- и гиперпротеинемии. 4. Клинико-диагностическое значение определения общего белка в сыворотке крови. 5. Основные понятия фотоколориметрии. 6. Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра. Рекомендуемая литература Основная: 1. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 111 с. (раздел 1, тема 3). Дополнительная: 1. Методы клинических лабораторных исследований / под ред. В. С. Камышникова. — 9-е изд. — М.: МЕДпресс-информ, 2018. — С. 407– 413, 442–446. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — С. 305–311. 38 Глоссарий Амилоидоз почек — проявление системного амилоидоза, характеризующееся нарушением белково-углеводного обмена с внеклеточным отложением в почечной ткани амилоида — сложного белково-полисахаридного соединения, приводящего к нарушению функции органа, развитию нефротического синдрома и хронической почечной недостаточности. Белки Бенс-Джонса — легкие цепи иммуноглобулинов, синтезируемые опухолевыми клетками множественной миеломы (злокачественная опухоль). Гломерулонефрит — воспаление гломерул (клубочков) почек аутоиммунного или инфекционно-аллергического характера, которое проявляется отеками, повышением артериального давления, снижением выделения мочи, гипопротеинемией, гипоальбуминемией, гематурией, протеинурией. Макроглобулинемия Вальденстрема — В-клеточная лимфоплазмоцитарная лимфома с преимущественным поражением костного мозга и секрецией моноклонального иммуноглобулина М (IgM). Нефротический синдром — клинический синдром, характеризующийся тяжелой протеинурией, гипоальбуминемией, гиперлипидемией и отеками. Характерен для поражения клубочкового аппарата почек. Профузный понос — один из видов диареи, характеризующийся сильными водянистыми выделениями и частой дефекацией, при котором происходит избыточная секреция воды и электролитов (ионов натрия и хлора) в просвет кишки. Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом (унифицированный метод) Необходимое оснащение: приборы для колориметрирования (ФЭК), устройства для автоматического отмеривания реагентов (дозаторы), биохимический набор для определения общего белка (фирмы «Вектор-Бест»). Принцип метода: белок реагирует в щелочной среде с сульфатом меди, при этом образуются соединения, окрашенные в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Оптическая плотность окрашенного раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется колориметрически. 39 Материал для исследования — сыворотка крови. Расчет ведут методом сравнения с калибровочным (эталонным, стандартным) раствором белка или по калибровочному графику. Нормальные величины — 65–85 г/л. Метод специфичен, отличается хорошей воспроизводимостью. На правильность метода влияет качество калибровочного материала. Некоторые вещества оказывают интерферирующее действие в данной реакции: билирубин при концентрации больше 85 мкм/л, триглицериды — больше 11,4 ммоль/л. Ход работы представлен в табл. 1 Ход определения Калибратор Проба 1. Опытная проба (сыворотка) 2. Калибровочная проба 3. Контрольная проба – 20 мкл – 20 мкл – Вода Рабочий реагент (биуретовый реактив) Таблица 1 20 мкл 1000 мкл 1000мкл 1000 мкл Примечания: 1) мкл — микролитр, является единицей измерения жидкости; 2) 1000 мкл равно соответственно 1,0 мл; 3) калибратор (эталон, стандартный раствор) — это раствор с известной концентрацией исследуемого компонента (в данном случае с концентрацией белка 70 г/л) — используется для расчета; 4) плазма крови — жидкая часть крови, образовавшаяся после осаждения центрифугированием форменных элементов крови, (кровь берется с антикоагулянтом); 5) сыворотка крови — плазма крови, лишенная фибриногена (кровь берется без антикоагулянта), образуется сгусток, на формирование которого используется фибриноген, превратившийся в фибрин; 6) контрольная проба содержит все реактивы, но вместо исследуемого компонента (в данном случае сыворотки крови, содержащей белок) добавляется вода. Контрольная проба используется для настройки ФЭКа. Алгоритм действий: 1. Подписать пробирки согласно названию проб. 2. Разлить необходимые реактивы с помощью автоматических пипеток — дозаторов. 40 3. Содержимое пробирок перемешать. 4. Выдержать 15 мин при комнатной температуре. 5. Измерить оптическую плотность опытной (Dоп) и калибровочной (Dк) проб против контрольной пробы, по которой настраивался ФЭК. Светофильтр 550 (540–570) нм. 6. Рассчитать концентрацию белка в пробе (С) в г/л по формуле: С = Dоп/Dк × 70 г/л, где 70 — концентрация белка в калибровочной пробе (г/л). Вывод ________________________________________________ ______________________________________________________ Клинико-диагностическое значение определения общего белка в плазме крови В сыворотке крови здорового человека содержится 65–85 г/л белка. В плазме крови за счет фибриногена белка на 2–4 г больше. Это — нормопротеинемия. Изменения общего белка не являются специфическими, а отражают общий патологический процесс (воспаление, некроз, новообразование), динамику и тяжесть заболевания. Изменения концентрации общего белка плазмы крови могут носить относительный и абсолютный характер. Так, нагрузка водой, гидремия приводит к относительной гипопротеинемии. Причины гипопротеинемии 1. Недостаточное потребление белка с пищей и несбалансированный аминокислотный состав пищи (голодание, ограничение приема пищи у курильщиков, алкоголиков). 2. Нарушение переваривания и всасывания белковых компонентов пищи при различных заболеваниях желудочно-кишечного тракта (диспепсия, дизентерия, гастриты, гастроэнтериты, энтероколиты, сужение пищевода). 3. Понижение синтеза белка в печени (альбуминов, фибриногена, части глобулинов) вследствие хронических и острых гепатитов, циррозов, длительных воспалительных процессов. 41 4. Врожденное отсутствие или недостаточное содержание какого-­ либо белка в плазме крови. 5. Потери белка вследствие кровотечений, ожогов, образования экссудатов, транссудатов, асцита. 6. Выделение белка (в основном альбумина) с мочой при нефрозе, нефрите, амилоидозе. Содержание белка при этом может снижаться до 25–30 г/л. 7. Повышенный процесс распада белков в организме (злокачественные новообразования, кахексия, сепсис, обширные травмы, тиреотоксикоз). 8. Понижение содержания белка в крови у женщин в период лактации и в последние месяцы беременности. При снижении содержания в плазме крови общего белка в организме развиваются отеки вследствие падения онкотического давления и задержки воды в тканях (менее 50 г/л). Причины гиперпротеинемии Абсолютная гиперпротеинемия — явление редкое. Стойкая гиперпротеинемия (до 120 г/л и выше) отмечается при: • миеломной болезни (синтез парапротеинов при онкологии — патологических белков Бенс-Джонса); • макроглобулинемии Вальденстрема в связи с возникновением патологических очагов синтеза белков; • аутоиммунных заболеваниях. Незначительная гиперпротеинемия встречается при некоторых хронических воспалительных заболеваниях (хронический полиартрит). Относительная гиперпротеинемия наблюдается при обезвоживании организма (неукротимая рвота, профузные поносы, усиленное потоотделение). Основные понятия фотоколориметрии Фотоколориметрия — один из самых распространенных методов исследования в биохимии и медицине. Основан на измерении поглощения света окрашенным веществом в видимой области спектра от 400 до 800 нм. Метод может быть использован для определения кон42 центрации окрашенного вещества в растворе путем измерения поглощения света при одной или нескольких длинах волн, а также для определения активности ферментов, если субстраты или продукты ферментативной реакции могут быть окрашены с помощью реагентов и поглощать свет в видимой области спектра. В основе количественных фотоколориметрических методов исследования лежит закон светопоглощения Бугера–Ламберта–Бера: «Оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества и толщине слоя раствора»: D = ξC × l, где D — оптическая плотность раствора, характеризует поглощение света веществом, D = lgI0/I; C — молярная концентрация раствора (моль/л); l — толщина слоя раствора, численно равная рабочему расстоянию кюветы (см); xξ — молярный коэффициент светопоглощения вещества для определенной длины волны света, или молярная экстинкция. Она равна оптической плотности 1 М раствора, помещенного в кювету с толщиной слоя 1 см (при С = 1 моль/л и I = 1 см, D = xξ), является для данного вещества величиной постоянной. Определяется по справочнику или экспериментальным путем. Кроме оптической плотности (D), на практике часто используется величина светопропускания (Т), характеризующая способность окрашенного раствора пропускать световой поток: Т = I/I0, или T(%) = (I × 100%)/I0. (Обозначения см. выше.) Оптическая плотность и величина светопропускания связаны между собой логарифмической зависимостью: D = lg(1/T). Отклонения от закона Бугера–Ламберта–Бера могут быть обусловлены присутствием посторонних примесей в растворе, процессами электролитической диссоциации, гидратации, гидролиза и другими причинами. Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра Фотоэлектроколориметр (ФЭК) предназначен для измерения коэффициентов пропускания или оптической плотности окрашенных 43 растворов при биохимическом анализе с целью количественного определения различных компонентов биологических жидкостей. Диапазон измерений коэффициента пропускания от 5 до 100%, значений оптических плотностей — от 0 до 2,0. Для выбора светофильтров (табл. 2) используют две пробы исследуемого вещества различной концентрации и измеряют их оптические плотности с различными светофильтрами. Светофильтр, при котором разность оптических плотностей двух исследуемых проб максимальна, обеспечивает наибольшую чувствительность метода. Выбранный светофильтр пропускает лишь тот диапазон длин волн, который максимально поглощается исследуемым веществом. Таблица 2 Таблица для выбора светофильтров Цвет раствора Область максимального поглощения лучей раствором Цвет светофильтра Желто-зеленый 400–500 Фиолетовый Желтый 450–480 Синий Оранжевый 480–490 Зелено-синий Пурпурный 500–560 Зеленый Фиолетовый 560–575 Желто-зеленый Синий 575–590 Желтый Зелено-синий 590–625 Оранжевый Сине-зеленый 625–700 Красный ФЭК измеряет оптическую плотность (D) или коэффициент пропускания (T,%) исследуемого раствора относительно контрольного раствора. В качестве контрольного раствора используется кювета с дистиллированной водой или контрольным раствором, оптическая плотность которой принимается равной нулю (коэффициент пропускания 100%). Концентрация раствора определяется при помощи калибровочного графика зависимости оптической плотности раствора от его концентрации (по таблице, составленной по данным такого графи44 ка) или путем сравнения с эталонным (калибровочным) раствором с известной концентрацией вещества. На лицевой панели прибора расположены: • микроамперметр с двумя шкалами: шкалой коэффициентов пропускания (Т,%) и шкалой оптических плотностей (D); • диод светоизлучающий, сигнализирующий о наличии напряжения питания; • переключатель СЕТЬ для включения микроколориметра; • ручка переменного резистора УСТАНОВКА НУЛЯ; • ручка переменного резистора УСТАНОВКА 100% Т. Перед лицевой панелью на горизонтальной плоскости съемной крышки находятся: • гнездо для установки рабочих светофильтров; • кюветное отделение и гнездо для установки заглушки, закрывающей световой поток к фотоэлементу. Под съемной крышкой укреплена в патроне лампа накаливания — источник света, элементы оптической схемы, а также преобразователь. Оптическая схема фооэлектроколориметра Оптическая схема ФЭКа представлена на рис. 1. Световой поток от лампы накаливания (1), проходя через оптическую систему (2), затем через светофильтр (3) и исследуемый раствор в кювете (4), попадает на светочувствительный слой вакуумного фотоэлемента (5), который является элементом отсчетно-измерительной схемы. В зависимости от значения коэффициента пропускания исследуемого раствора изменяется световой поток, прошедший через раствор и падающий на фотоэлемент. При этом изменяется ток фотоэлемента, а, следовательно и электрический сигнал, подаваемый на микроамперметр. Перед фотоэлементом может быть установлена заглушка для перекрытия светового потока. Концентрация вещества в пробе определяется путем сравнения с эталонным (калибровочным) раствором с известной концентрацией вещества. При отсутствии эталонного (калибровочного) раствора для определения концентрации вещества в пробе необходимо построение калибровочного графика. 45 1. Лампа накаливания (источник потока света) 2. Оптическая система из линз (конденсация луча света) 3. Светофильтр (пропускание луча определенной длины волны) 4. Сменная кувета (поглощение света окрашенным веществом) 5. Вакуумный фотоэлемент (регистрация и измерение) Рис. 1. Устройство фотоэлектроколориметра Алгоритм работы на приборе: 1. Включить в электросеть, прогреть 15 мин. 2. Установить в гнездо фильтр, соответствующий методике. 3. В чистую и сухую кювету налить дистиллированную воду или контрольный раствор (используется, если исходные реактивы имели окрашивание). 4. Установить кювету в кюветное отделение. 5. В гнездо для установки заглушки поместить заглушку, предохраняющую фотоэлемент. 6. Закрыть крышку кюветного отделения, заглушка закрыта. 7. Привести отклонившуюся стрелку к нулю (по нижней шкале), используя ручку резистора «установка 0». 8. Убрать заглушку, предохраняющую фотоэлемент. 9. Привести отклонившуюся стрелку к 100% светопропускания (по верхней шкале), используя ручку резистора «установка 100% Т». 10. Повторить процедуру дважды. 11. Приступить к измерению оптической плотности опытных и калибровочных проб. Для этого заменить в кювете контрольную пробу на опытную или калибровочную, поставить в кюветное отделение, открыв заглушку, 46 закрыть крышку и после остановки стрелки по нижней шкале оптической плотности отметить полученное значение. Построение калибровочного графика для определения белка: 1. Готовят стандартный раствор белка с концентрацией 100 мг/мл. Для приготовления стандартного раствора используют альбумин бычий лиофилизированный. 2. Из стандартного раствора готовят путем разбавления серию рабочих растворов (обычно 5–7) с известной концентрацией белка (табл. 3). 3. Готовят не менее 3 параллельных проб для каждой концентрации белка. Таблица 3 Построение калибровочного графика № Объем стандартного Объем 154 мМ Концентрация Оптическая раствора раствора альбумина, мл раствора NaCl, мл белка, мг/мл (г/л) плотность 0 0,0 1,0 0,00 1 0,1 0,9 10 2 0,2 0,8 20 3 0,3 0,7 30 4 0,4 0,6 40 5 0,6 0,4 60 6 0,8 0,2 80 7 1,0 0,0 100 Контроль 4. Из подготовленных растворов (1–7) и контрольной пробы берут по 20 мкл, добавляют 1000 мкл рабочего реагента. Пробы снова перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 15 мин. 5. Колориметрируют на фотоэлектроколориметре в кюветах с рабочим расстоянием 1 см. Светофильтр 550 (540–570) нм против контрольной пробы. 6. Полученные растворы используют для построения калибровочного графика зависимости оптической плотности (D) от концентрации белка в растворе (С): D = f(C). 47 Метод дает хорошие результаты при соблюдении закона Бугера– Ламберта–Бера. Тестовые задания Выберите правильный ответ. 1. Цветная реакция, используемая при определении общего белка: а) нингидриновая; б) ксантопротеиновая; в) Фоля; г) биуретовая. 2. Повышение концентрации общего белка в крови называется: а) парапротеинемией; б) нормопротеинемией; в) гипопротеинемией; г) гиперпротеинемией. 3. Понижение концентрации общего белка в крови называется: а) гиперпротеинемией; б) нормопротеинемией; в) гипопротеинемией; г) парапротеинемией. 4. Метод определения общего белка, основанный на измерении поглощения окрашенных продуктов реакции в видимой области спектра, называется: а) спектрофотометрическим; б) азотометрическим; в) фотоколориметрическим; г) рефрактометрическим. 5. Количественное определение белка в биологических жидкостях методом фотоколориметрии основано на измерении: а) оптической плотности; б) изоэлектрической точки; в) показателя светопреломления; г) молекулярной массы. 6. Количественное определение белка в биологических жидкостях методом рефрактометрии основано на измерении: а) оптической плотности; б) показателя светопреломления; 48 в) молекулярной массы; г) изоэлектрической точки. 7. Нормальные значения общего белка в сыворотке крови: а) 100–120 г/л; б) 35–50 г/л; в) 65–85 г/л; г) 25–30 г/л. 8. Метод определения общего белка, основанный на измерении показателя светопреломления, называется: а) спектрофотометрическим; б) азотометрическим; в) фотоколориметрическим; г) рефрактометрическим; 9. Стойкая гипорпротеинемия отмечается при: а) миеломной болезни; б) врожденном нефротическом синдроме; в) макроглобулинемии Вальденштрема; г) острых и хронических воспалениях. 10. Стойкая гиперпротеинемия (до 120 г/л и более) отмечается при: а) хроническом и остром гепатите; б) врожденном нефротическом синдроме; в) макроглобулинемии Вальденштрема; г) острых и хронических кровопотерях. Ответы на тестовые задания 1—г 2—г 3—в 4—в 5—а 6—б 7—в 8—г 9—б 10 — в 49 Тема 4 ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. АНАЛИЗ БЕЛКОВОГО СОСТАВА СЫВОРОТКИ КРОВИ. МЕТОДЫ ПРОТЕОМНОГО АНАЛИЗА Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: практическое занятие. Место проведения: аудитории кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 90 мин. Актуальность/мотивация. Знания и навыки, приобретенные на занятии, необходимы для понимания физико-химических свойств белков и механизмов действия факторов среды на нативную конформацию и биологическую активность белков тканей и жидкостей организма. Знания принципов основных физико-химических и других естественно-научных методов исследований и идентификации белков необходимы для оценки метаболизма и его нарушений. Знакомство с методами протеомики необходимо для системного подхода к анализу белков тканей и органов, что имеет высокую диагностическую ценность. Цели занятия Образовательная цель. Изучение физико-химических свойств белков и белковых растворов, видов осаждения белков, механизмов действия денатурирующих и высаливающих агентов, принципов основных физико-химических методов разделения и очистки белков, применение этих методов в медицине. 50 Воспитательная цель. Воспитание у обучающихся навыков: • аргументированного обоснования своей точки зрения и уважительного отношения к мнению коллег; • культуры поведения и коллективной профессиональной этики. Развивающая цель. Развитие логического мышления, способности получать, анализировать, обобщать, интерпретировать и передавать информацию в устной и письменной формах. Формирование широкого профессионального кругозора, повышение интеллектуального потенциала, мотивация к самообразованию. Развитие у обучающихся способности и готовности к постановке предварительного диагноза. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • физико-химические свойства белков и белковых растворов; • факторы, влияющие на растворимость белков в воде; • виды осаждения белков; • факторы осаждения белков и механизм их действия; • принципы основных методов разделения белков; • состав белковых фракций крови в норме. Обучающийся должен уметь: • объяснять влияние различных факторов на растворимость белков в воде; • писать схемы ионизаций белков при различных рН среды, определять область рI (рНi); • объяснять механизмы действия денатурирующих и высаливающих агентов; • объяснять принципы методов разделения белков; • пользоваться медико-биологической терминологией; • излагать материал по теме в понятной, убедительной, информативной речевой форме; • интерпретировать данные лабораторных исследований при решении ситуационных задач. Обучающийся должен владеть: • биохимической терминологией по теме занятия; • навыками грамотной публичной речи; • навыками самостоятельного формирования заключений (выводов) по вопросам нормы и патологии (ситуационные за­дачи). 51 Формируемые компетенции: изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-1, ОК-8) и общепрофессиональных и профессиональных (ОПК-2, ОПК-7, ПК-5, ПК-21) компетенций. Задание для самоподготовки 1. Изучите основную и дополнительную литературу, используя вопросы для самоподготовки. 2. Напишите в рабочей тетради схемы ионизации нейтрального, основного и кислого белков при различных рН среды. Отметьте тот диапазон рН среды, при котором белки будут находиться в изоэлектрическом состоянии. При каких рН среды каждый из этих белков будет иметь максимальный заряд и растворимость? 3. Решите тестовые задания по теме: «Физико-химические свойства белков». Вопросы для самоподготовки 1. Физико-химические свойства белков (молекулярная масса, форма молекулы, амфотерность, электрофоретическая подвижность, растворимость в воде и образование гидратной оболочки). 2. Свойства белковых растворов как растворов высокомолекулярных соединений (ВМС). 3. Факторы, влияющие на растворимость белков в воде. 4. Виды осаждения белков. Обратимое осаждение белков. Высаливающие агенты и механизм их действия, использование в медицинской практике. 5. Необратимое осаждение белков. Денатурирующие агенты и механизм их действия. Приведите примеры физических и химических денатурирующих факторов, используемых в медицинской практике (табл. 5), объясните механизм их действия (табл. 4). 6. Принцип метода очистки белков от низкомолекулярных соединений — диализ, использование гемодиализа. 7. Принципы методов разделения и очистки белков (ультрацентрифугирование, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, афинная хроматография; фракционное высаливание, электро52 форез белков плазмы крови). Практическое использование этих методов в медицине. Таблица 4 Механизмы действия денатурирующих и высаливающих факторов Денатурирующие факторы Механизм действия Физические факторы Высокие температуры, давление, ультрафиолетовое облучение, ультразвук Усиление колебательных движений молекул, разрыв гидрофобных и водородных связей Химические факторы 1. Неорганические: окислители кислородосодержащие Н2О2 — пероксид водорода, КМnO4 — перманганат калия, О3 — озон 2. Окислители галогеносодержащие. 1. Хлоргексидин, хлорамин, хлорная известь, спиртовой раствор йода Окисление функциональных групп белков, в первую очередь SH-групп R — SH → R–S — S–R 2. Органические: группа фенолов С6Н(6-n) (ОН)n Связывание функциональных групп белков Альдегиды HCOH — формальдегид Восстанавливают функциональные группы белка, забирая атом кислорода; связывают аминогруппы белков Алифатические спирты С2Н5ОН — этиловый спирт более 70° Являясь водоотнимающими, веществами изменяют гидратацию оболочку и конформацию белков Кислоты Органические и неорганические Изменяют рН среды, нарушают ионизацию групп —СОО–, что приводит к разрушению ионных связей в белках Щелочи Изменяют рН среды, нарушают ионизацию групп —NH3+-групп, что приводит к разрушению ионных связей в белках Тяжелые металлы Связывание функциональных групп белков, в первую очередь SH-групп Высаливающие факторы Соли аммония, нейтральные соли щелочных и щелочноземельных металлов, этиловый спирт (меньше 70°), ацетон Являясь водоотнимающими веществами, уменьшают гидратацию оболочку белка, что приводит к выпадению белка в осадок 53 Таблица 5 Практическое применение денатурации и высаливания в медицине Характер осаждения Применение в гигиенической и лечебной практике Факторы Физические факторы Денатурация Температура 70–80 °C Пастеризация пищевых продуктов, бактериологических питательных сред, лекарственных препаратов Температура 100 °C Кулинария, термическая обработка воды и пищи. Дезинфекция и дезинсекция одежды и белья Ультрафиолетовое облучение Дезинфекция воздуха в операционных и палатах Ультразвук Ультразвуковые установки для обработки корневых каналов и кариозных полостей; снятия зубных отложений и отбеливания зубов; лечения пародонтоза Химические факторы Соли тяжелых металлов (Hg Ag, Cd, Pb, Cu) Дератизация. Удаление доброкачественных кожных новообразований (Ag) Сильные минеральные и органические кислоты (сульфосалициловая, азотная, ТХУ и др.) Осаждение белка из биологических жидкостей при биохимических анализах. Качественные пробы на белок и количественное определение белка (в моче) Окислители кислородосодержащие: а) О3 — озон б) Н2О2, в) KMnO4, 54 а) озон обладает антисептическим действием в отношении бактерий, вирусов, грибов, цист и мгновенным дезинфицирующим действием; б) антисептика, обработка инструментов, кожи; в) промывание желудка. Окончание табл. 5 Характер осаждения Применение в гигиенической и лечебной практике Факторы Окислители галогеносодержащие: а) NH2Cl — хлорамин (содержит до 30% активного хлора; б) спиртовой раствор йода; в) [3Ca(OH)2 * 2Cl2] — хлорная известь (содержит до 26–35% активного хлора); г) C22H30Cl2N10 — хлоргексидин Высаливание а) обработка рабочих поверхностей столов, стен и клеенчатых фартуков; б) обработка кожи; в) 20% раствор применяется для замачивания плевательниц, одноразового мелкого инструментария перед выбрасыванием; обработка выгребных ям, скотомогильников; г) антисептик Органические: группа фенолов С6Н(6-n) (ОН)n Используются как компоненты сложных дезинфицирующих средств Альдегиды: формальдегид HCOH Используются как компоненты сложных дезинфицирующих средств Алифатические спирты: С2Н5ОН — этиловый спирт более 70° Используются как компоненты сложных дезинфицирующих средств, например, для обработки кожи Соли аммония и щелочных металлов Приготовление кристаллических белковых препаратов. Разделение белковых фракций Из методов хроматографии для разделения белка часто используются гель-фильтрация, ионообменная хроматография и аффинная хроматография. Аффинная хроматография — разновидность лигандной хроматографии. В основе последней лежит реакция взаимодействия разделяемых примесей с лигандом, связанным с инертным носителем. В случае аффинной хроматографии в роли примесей выступают биологически активные вещества (белки, ферменты, гормоны, антигены), вступающие с лигандом (тоже, как правило, органическим) в специ55 фическое биохимическое взаимодействие. Например: «антитело-­ антиген», «гормон-рецептор» и т.д. Именно высокая специфичность подобного взаимодействия обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии и ее широкое (по сравнению с другими видами лигандной хроматографии) распространение в медицинской практике. Для обнаружения малых количеств специфических белков используют иммунохроматографический анализ. Иммунохроматографический анализ (ИХА) — иммунохимический метод анализа, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест-полосок, панелей или тест-кассет. Принцип действия состоит в том, что при погружении тест-полоски в биологическую жидкость (или нанесение крови на специальное приемное отверстие с фильтром для форменных элементов на тест-полоске) плазма (или другая биологическая жидкость) начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-­ полоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом. Различают два формата ИХА: прямой и конкурентный метод. В схеме прямого (сэндвичного) ИХА используется конъюгат антитела-метки, нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы антитела, специфические к данному аналиту, а на контрольной линии — антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего анализируемое вещество, при попадании образца на мембрану с конъюгатом происходит связывание аналита с конъюгатом Ат-метки. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя «сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. Избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление двух линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске. Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений — вирусов, 56 Образец Конъюгат Тестовая линия Контрольная линия Капиллярный поток Подушка образца Подушка конъюгата Нитроцеллюлозная мембрана Адсорбирующая подушка Тестовая линия (положительно) Контрольная линия Рис. 2. Схема иммунохроматографического определения тропонина в плазме крови в том числе ВИЧ; различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей инфекционных заболеваний, обнаружения наркотиков, кардиомаркера тропонина при диагностике инфаркта миокарда. На рис. 2 представлена схема иммунохроматографического определения тропонина в плазме крови. Рекомендуемая литература Основная: 1. Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 28–30, 35–38, 66–73. 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (раздел 1, тема 4). 57 Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 23–32, 44–49, 568–574, 577–578. 2. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа. — М.: Высшая школа, 1991. — 288 с. Электронные ресурсы: 1. Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http:// www.studmedlib.ru/book/ ISBN9785970433126.html (раздел 1, п. I–VI). 2. http://studopedia.org 3. http://window.edu.ru 4. http://studFiles.net 5. http://biohimist.ru 6. http://biohimist.ru Глоссарий Антисептика (лат. anti — против, septicus — гниение) — система мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов в ране, патологическом очаге, органах и тканях, а также в организме больного в целом, использующая механические и физические методы воздействия, активные химические вещества и биологические факторы. Асептик — совокупность методов и приемов работы, направленных на предупреждение попадания инфекции в рану, в организм больного, создание безмикробных, стерильных условий для хирургической работы путем использования организационных мероприятий, активных обеззараживающих химических веществ, а также технических средств и физических факторов. Биочип — матрица (платформа), стеклянная или пластиковая пластинка со стороной 5–10 мм, на которую нанесено большое количество ячеек (диаметром менее 100 микрон каждая), содержащих известные маркеры (ДНК, пептиды, белки, ферменты, клетки), способные избирательно связывать компоненты в анализируемом 58 растворе. При взаимодействии биочипа с исследуемым образцом, предварительно обработанным флюоресцентным красителем, в соответствующих ячейках происходит реакция, сопровождающаяся свечением, которое тем сильнее, чем интенсивнее процесс. Метод используется в диагностике заболеваний, сравнительном анализе геномов, позволяет идентифицировать нуклеиновые кислоты, белки, опухолевые клетки и др. Белковые чипы — технология, основанная на взаимодействии между белками, то есть на специфическом связывании антитела и антигена. Используется для анализа крови, ликвора, амниотической жидкости, мочи, слюны и т.д. Высаливание — обратимое выделение в осадок растворенного белка, вызываемое добавкой к раствору достаточных количеств другого вещества, обладающего дегидратирующим действием, например, сульфата натрия, сульфата аммония, хлорида кальция, хлорида натрия или калия, органических растворителей (ацетона, этанола). Гель-фильтрация — метод разделения смеси веществ с различными молекулярными массами путем фильтрации через ячеистые гели (с различным размером ячеек), так называемые молекулярные сита (сефадексы). Гидратная оболочка — слой молекул воды, определенным образом ориентированных на поверхности белковой молекулы. Дезинфекция — это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение возбудителей инфекционных заболеваний и разрушение токсинов на объектах внешней среды. Денатурация (от лат. де — удаление и лат. natura — природные свойства) — необратимые изменения природной (нативной) структуры молекулы белка, приводящие к изменению его физических и биологических свойств. Диализ (от греч. diálysis — разложение, отделение) — удаление из коллоидных систем и растворов высокомолекулярных соединений примесей низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран. Изоэлектрическая точка — значение рН среды, при котором заряд белка равен нулю. Изоэлектрическое состояние — состояние белка, при котором его суммарный заряд равен нулю. 59 Протеомный анализ — часть аналитических технологий с применением чувствительных и высокотехнологичных методов, позволяющих определить количество того или иного белка в образце, идентифицировать белок, установить его первичную структуру и посттрансляционные модификации. Стерилизация — комплекс мероприятий, направленных на уничтожение вегетативных и споровых форм патогенных и непатогенных микроорганизмов на изделиях медицинского назначения. Тяжелые металлы — группа химических элементов со свойствами металлов и значительной атомной массой (более 50) либо плотностью (более 8 г/см2), например, ртуть (Hg), свинец (Pb), кадмий (Cd), медь (Cu), серебро (Ag). Ультрацентрифугирование — метод разделения и осаждения частиц размером менее 100 нм под действием центробежных сил (~100 000 g, где g — ускорение силы тяжести). Электрофорез — метод разделения смеси белков, основанный на их способности двигаться под действием электрического постоянного поля в зависимости от величины заряда белка. Тестовые задания Выберите правильный ответ. 1. Механизм осаждающего действия температуры 100 °С: а) изменение гидратации молекул белка; б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН; в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH); г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S—S-­ связей; д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи. 2. Механизм осаждающего действия хлорида ртути: а) изменение гидратации молекул белка; б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН; в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH); г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S—S-­ связей; д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи. 60 3. Механизм осаждающего действия сульфата аммония: а) изменение гидратации молекул белка; б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН; в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH); г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S—S-­ связей; д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи. 4. Механизм осаждающего действия перманганата калия (KMnO4): а) изменение гидратации молекул белка; б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН; в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH); г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S—S-­ связей; д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи. 5. Механизм осаждающего действия натрия хлористого (NaCl): а) изменение гидратации молекул белка; б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН; в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH); г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S—S-­ связей; д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи. 6. Механизм осаждающего действия ацетона: а) изменение гидратации молекул белка; б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН; в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH); г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S—S-­ связей; д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи. 7. Механизм осаждающего действия сульфосалициловой кислоты: а) изменение гидратации молекул белка; б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН; в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH); г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S—S-­ связей; 61 д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи. 8. Механизм осаждающего действия кадмия сернокислого: а) изменение гидратации молекул белка; б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН; в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH); г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S—S-­ связей; д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи. 9. Механизм осаждающего действия соляной кислоты: а) изменение гидратации молекул белка; б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН; в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH); г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S—S-­ связей; д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи. 10. Механизм осаждающего действия вибрации: а) изменение гидратации молекул белка; б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН; в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH); г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S—S-­ связей; д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи. Ответы на тестовые задания 1—д 2—в 3—а 4—г 5—а 6—а 7—б 8—в 9—б 10 — д 62 Тема 5 ОСАДОЧНЫЕ РЕАКЦИИ, ДИАЛИЗ. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ Лабораторная работа № 2 Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: лабораторное занятие. Место проведения: аудитории для лабораторных исследований кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 90 мин. Актуальность/мотивация. Изучение методов очистки и разделения белков представляет для врача практический интерес с точки зрения клинической практики и лабораторной диагностики. Важным аспектом является применение денатурирующих агентов в биохимическом анализе, асептике, антисептике, стерилизации, дезинфекции, а также при лечении стоматологической патологии. Цели занятия Образовательная цель. Освоение методов очистки и разделения белков. Изучение использования методов диализа и электрофореза в клинической практике и диагностике. Изучение белкового состава фракций крови. Обсуждение применения осадочных реакций в различных областях медицины, в том числе стоматологии. Воспитательная цель. Воспитание у обучающихся навыков: • совместной работы в команде на принципах равноправного партнерства при выполнении поставленной учебной задачи; 63 • аргументированного обоснования своей точки зрения и уважительного отношения к мнению коллег; • культуры поведения и коллективной профессиональной этики. Развивающая цель. Развитие у обучающихся способности к участию в проведении научных исследований. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • принцип диализа как метода очистки белковых растворов; • применение диализа в клинической практике; • использование высаливающих и денатурирующих факторов в медицине; • принцип метода электрофореза, этапы его проведения, использование с целью диагностики; • состав белковых фракций крови в норме и роль индивидуальных белков. Обучающийся должен уметь: • отмерять необходимые объемы биологического материала и реактивов с помощью автоматических дозаторов; • фильтровать через складчатый фильтр; • проводить качественные химические реакции (биуретовую и др.); • проводить очищение раствора белка методом диализа; • в команде проводить осадочные реакции; • выбирать метод разделения белков с учетом цели разделения; • объяснять выбор условий при проведении электрофореза; • самостоятельно делать заключения (выводы) по результатам исследования; • коллективно обсуждать полученные результаты. Обучающийся должен владеть: • навыками работы с автоматическими дозаторами; • способностью оценки полученных результатов; • навыками оформления результатов лабораторных исследований. Формируемые компетенции: ОК-1, ОК-8, (ОПК-2, ОПК-7, ПК-5, ПК-21). 64 Задание для самоподготовки 1. Изучите основную и дополнительную литературу, используя вопросы для самоподготовки. Рекомендуемая литература Основная: 1. Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ­ГЭОТАР-­Медиа, 2015. — С. 28–30, 35–38, 66–73. 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (раздел 1, темы 4, 5). Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия: учебник. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 23–32, 44–49, 568–574, 577–578. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — С. 311–322. 3. Методы клинических лабораторных исследований / под ред. В. С. Камышникова. — 9-е изд. — М.: МЕДпресс-информ, 2018. — С. 448– 450, 451–461. Электронные ресурсы: 1. Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http:// www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970433126.html (раздел 1, п. I–VI). 2. http://studopedia.org 3. http://window.edu.ru 4. http://studFiles.net 5. http://biohimist.ru 6. http://biohimist.ru Вопросы для самоподготовки 1. Диализ, принцип метода, его практическое использование. 2. Принцип метода электрофореза, факторы, влияющие на скорость процесса, этапы проведения. 65 3. Анализ состава белковых фракций в норме, роль индивидуальных белков. 4. Использование осадочных реакций на белок в биохимическом анализе. Обратимое и необратимое осаждение белка. Диализ. Электрофорез Необходимое оснащение Приборы для электрофореза на ацетатцеллюлозных мембранах и в полиакриламидном геле; штативы для пробирок; водяная баня; диализатор стеклянный с целлофановой мембраной; химические пробирки; стеклянные воронки; автоматические дозаторы с фиксированным/переменным объемом. Учебные фильмы и таблицы по технике проведения электрофореза. Реактивы и оборудование: 1) раствор яичного белка; 2) раствор сульфата меди-II — 5%; 3) раствор гидроксида натрия — 10%; 4) раствор ацетата свинца-II — 5%; 5) раствор сульфосалициловой кислоты — 20%; 6) азотная кислота концентрированная; 7) раствор сульфата аммония — 5%; 8) сульфат аммония кристаллический; 9) раствор нитрата серебра 1%; 10) штативы для пробирок; 11) водяная баня; 12) диализатор стеклянный с целлофановой мембраной; 13) химические пробирки; 14) стеклянные воронки; 15) автоматические дозаторы с фиксированным/переменным объемом. Обратимое и необратимое осаждение белков (высаливание и денатурация) Ход работы. Возьмите штатив с 5 пробирками и в каждую отмерьте по 100 мкл раствора яичного белка. Первую пробирку поместите на 66 2–3 мин в кипящую водяную баню. Во вторую пробирку добавьте по каплям (5–6 капель) соль тяжелого металла (ацетата свинца). В третью пробирку — раствор азотной кислоты. В четвертую — раствор сульфасалициловой кислоты. В пятую пробирку — раствор сульфата аммония. Во всех пробирках появляется осадок. Затем во все пробирки добавьте дистиллированную воду в объеме, равном содержимому пробирок, встряхните и посмотрите, растворились ли осадки, после этого сделайте выводы о типе осаждения белка в каждой пробирке (денатурации или высаливании). Результаты работы и выводы занесите в табл. 6. Таблица 6 Действие осаждающих растворов № Осаждающий пробирки фактор Результат: появление или отсутствие осадка Растворим осадок или нет Вывод (указать характер осаждения) 1 2 3 4 5 Диализ Ход работы. Подготовьте четыре пробирки для исследования до диализа и четыре после. В две пробирки налейте раствор яичного белка, содержащего примесь хлорида натрия; в одной проведите биуретовую реакцию. Проведение биуретовой реакции: к 4–5 каплям раствора белка добавляют 5 капель 10% раствора NaOH и 1 каплю (избыток мешает чтению результатов реакции!) 1% раствора CuSO4. В другой пробирке — реакцию на ионы хлора с (нитратом серебра в присутствии уже добавленной в раствор азотной кислоты) — 5 капель белка + 3 капли AgNO3. В двух других пробирках сделайте те же реакции с дистиллированной водой. Раствор яичного белка налейте в диализатор, который погружают в стакан с дистиллированной водой. (Уровень воды 67 в стакане не должен превышать уровень нитки полупроницаемой мембраны диализатора) Через 1 ч вынимают диализатор из стакана и вновь проделывают биуретовую реакцию и реакцию на ионы хлора с диализатом и раствором яичного белка (диализируемой жидкостью). Результаты работы занесите в табл. 7 и сделайте вывод. Таблица 7 Результаты диализа Название реакции Диализируемая жидкость (солевой раствор белка — содержимое внутреннего стакана) до опыта Диализат (содержимое наружного стакана) после опыта до опыта до опыта Биуретовая На ионы хлора Электрофорез В сыворотке крови человека содержится 65–85 г/л белка, представленного различными по своему происхождению и свойствам фракциями. При различных острых и хронических заболеваниях, а также в результате действия многих повреждающих факторов внешней среды, таких как органические растворители, хлорпроизводные, фосфорорганические соединения, вибрация, ультразвук и др., происходит изменение содержания в крови не только общего белка, но и белковых фракций (диспротеинемия). Выявление таких изменений имеет существенное клинико-диагностическое значение. В разделении белковых фракций сыворотки крови основное значение принадлежит электрофорезу. Принцип метода электрофореза основан на способности заряженных частиц (в том числе белков) перемещаться под действием электрического поля в зависимости от знака их заряда. Скорость движения частиц в электрическом поле зависит от: 1) величины суммарного заряда частиц; 2) размера и формы частиц; 3) силы электрического тока и напряжения; 4) свойств носителя, на котором проводят разделение; 68 5) рН буферного раствора; 6) температуры. Виды электрофореза: 1. По направлению движения частиц основными являются два вида электрофореза — горизонтальный и вертикальный. 2. По приборному оформлению: • на пластинках; • в трубочках; • в колонках; • капиллярный. 3. По используемому носителю: • на бумаге; • на ацетатцеллюлозных мембранах; • в геле (крахмальном, агарозном, полиакриламидном); • без поддерживающей среды. 4. По интенсивности электрического поля: • низковольтный (при используемом напряжении менее 500 В); • высоковольтный (при напряжении более 500 В). Техника электрофореза впервые была предложена А. Тизелиусом в 1937 г. Для проведения электрофореза требуются: источник постоянного тока и камера, заполненная буфером. Камера состоит из двух сообщающихся отделений: в одном находится электрод, в другом — конец поддерживающей среды, на которую наносится исследуемый материал (сыворотка крови). Выбор буферного раствора определяется характером заряда исследуемых веществ. Для разделения сывороточных белков используют буферы с рН 8,6 (например, мединал-вероналовый). При такой величине рН молекулы белка заряжены отрицательно, и их движение направлено к аноду. В качестве поддерживающей среды для электрофореза используются: 1. Фильтровальная бумага: разделение проводится при низком напряжении поля, поэтому длится 16–18 ч, границы между отдельными фракциями получаются нечеткими, можно получить 5 основных белковых фракций сыворотки крови. 2. Пленки из ацетатцеллюлозы: дорогостоящие, разделение занимает меньше времени (30–40 мин), более эффективно. Получают 69 также 5 фракций. Широко применяются для разделения и идентификации липопротеинов, изоферментов, гемоглобинов и для разделения белков мочи. 3. Агар и агарозный гель: представляют собой гетерополисахариды, менее дорогостоящие, чем ацетатцеллюлозные пленки, по эффективности не уступают им, разделение занимает около 90 мин; используются также при иммуноэлектрофорезе. 4. Крахмальный гель: обладает всеми преимуществами других гелей, характерен эффект молекулярного сита; используется в основном для предварительного разделения смеси белков. 5. Полиакриламидный гель: наиболее широко применяется; обладает высоким эффектом молекулярного сита; высокая эффективность разделения; можно получить до 20 белковых фракций сыворотки крови и более. Этапы электрофореза 1. На смоченную в буфере поддерживающую среду (носитель) наносят исследуемые пробы и помещают в камеру, заполненную буфером. 2. Подключают электроды и пропускают электрический ток, в течение определенного времени (зависит от поддерживающей среды) проводят разделение. 3. Фиксация проб с помощью ацетона, метанола или высокой температуры. 4. Окрашивание проб с помощью красителей (амидо черный, бромфеноловый синий, пунцовый S). 5. Удаление избытка красителя. Промывка электрофореграмм. 6. Определение процентного содержания фракций белка: • сканирование электрофореграмм с помощью денситометра. В денситометре свет проходит через гель, поглощение света прямо пропорционально количеству белка; • элюирование окраски из основы с последующим колориметрическим измерением поглощения растворов. Но этот метод более трудоемкий и менее точный, в настоящее время не используется в клинической практике. 7. Оценка полученных результатов. В плазме крови человека в норме содержится альбуминов — 55–65%; глобулинов α1 — 2–5%; 70 глобулинов α2 — 6–11%; глобулинов β — 11–15%; глобулинов γ — 15–25%. Белки, входящие в эти фракции, выполняют различные функции (табл. 8). Функции белков плазмы крови Белковые фракции плазмы крови Примеры белков Таблица 8 Функции Альбумины Альбумины, преальбумины Транспорт гидрофобных веществ, поддержание онкотического давления. Резерв аминокислот α1-Глобулины α1-Антитрипсин Кислый α1-гликопротеин Тироксинсвязывающий глобулин Протромбин Ингибитор протеиназ. Транспорт прогестерона. Транспорт Т3 и Т4. Фактор свертывания крови α2-Глобулины Церулоплазмин Гаптоглобин α2-Макроглобулин Транспорт ионов меди. Связывание гемоглобина. Ингибитор протеиназ β-Глобулины Трансферрин С-реактивный белок Транспорт ионов железа. Активатор системы комплимента. Фактор свертывания крови Фибриноген γ-Глобулины IgG IgA Поздние антитела. Антитела, защищающие слизистые оболочки. Ранние антитела. Рецепторы В-лимфоцитов. Антитела к аллергенам IgM IgD IgE При различных заболеваниях наблюдается изменение соотношения белковых фракций крови (диспротеинемия). Исследование протеинограмм с диспротеинемией имеет клинико-диагностическое значение. Осадочные пробы на белок Поскольку количественное исследование фракционного состава белков плазмы трудоемко и нуждается в сложной аппаратуре, его ча71 сто заменяют качественными диспротеинемическими тестами. Они основаны на разной чувствительности отдельных белков плазмы крови к действию осаждающих агентов. Такие тесты позволяют оценить тяжесть патологического состояния и эффективность лечения, проследить динамику заболевания. Установлено, что положительный результат коллоидно-химических проб чаще вызывается количественными изменениями в глобулиновых фракциях или изменением соотношения альбумины/глобулины, то есть он связан с увеличением содержания глобулинов либо уменьшением уровня альбуминов. К коагуляционным (коллоидоустойчивым) осадочным пробам относятся реакции с сульфатом кадмия и цинка, тимоловая проба, реакция Гросса с хлоридом ртути (сулемовая проба), реакция Вельтмана с хлоридом кальция. Наиболее часто используется тимоловая проба. Она основана на определении степени помутнения с помощью ФЭКа при взаимодействии сыворотки с насыщенным раствором тимола в вероналовом буфере. Причиной помутнения является взаимодействие молекул тимола и некоторых крупнодисперстных белков: γ-глобулинов и β-липопротеинов. Эта реакция связана с образованием глобулино-тимол-липидного комплекса. Норма: 0–4 ед. помутнения. Тимоловая проба положительная у больных с воспалительным процессом в паренхиме печени: у больных с воспалительным синдромом поражения печени, с синдромом цитолиза — 90–100% больных болезнью Боткина (гепатит А), токсическим гепатитом, а также у больных с постгепатитным и постнекротическим циррозом печени, коллагенозами, малярией и вирусными инфекциями. При синдроме холестаза —механической (обтурационной) желтухе проба в 75% случаев отрицательная. Она становится положительной лишь в том случае, если процесс осложняется паренхиматозным гепатитом. Тестовые задания Выберите правильный ответ. 1. Обратимое осаждения белков из растворов — это: а) высаливание; б) ренатурация; 72 в) денатурация; г) фильтрация. 2. Метод очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей: а) диализ; б) высаливание; в) электрофорез; г) нефелометрия. 3. Признак коллоидных растворов, характерный для растворов белков: а) высокое осмотическое давление; б) при стоянии выпадают в осадок; в) эффект Тиндаля (опалесценция); г) низкое онкотическое давление. 4. Метод разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандами: а) ультрацентрифугирование; б) ионообменная хроматография; в) фракционное высаливание; г) аффинная хроматография. 5. Метод разделения белков, основанный на различии в размерах гидратной оболочки: а) ультрацентруфугирование; б) гель-фильтрация; в) высаливание; г) аффинная хроматография. 6. Признак истинного раствора, характерный для растворов белков: а) высокое онкотическое давление; б) эффект Тиндаля (светорассеяние); в) термодинамическая устойчивость; г) низкое осмотическое давление. 7. Эффект Тиндаля лежит в основе количественного определения белка методом: а) электрофореза; б) нефелометрии; в) турбидиметрии; г) спектрофотометрии. 73 8. Метод очистки растворов белков, лежащий в основе работы аппарата «Искусственная почка»: а) диализ; б) электрофорез; в) гель-фильтрация; г) высаливание. 9. Метод разделения и очистки белков, основанный на различной способности молекул разных размеров проходить через «молекулярные сита»: а) ультрацентрифугирование; б) электрофорез белков; в) ионообменная хроматография; г) гель-фильтрация. 10. Физико-химический метод, основанный на взаимодействии заряженных групп белка с ионными группами полимеров-ионообменников: а) фракционное высаливание; б) афинная хроматография; в) ионообменная хроматография; г) электрофорез белков. Ответы на тестовые задания 1—а 2—а 3—в 4—г 5—в 6—в 7—б 8—а 9—г 10 — в 74 Раздел II ЭНЗИМОЛОГИЯ Тема 6 СТРОЕНИЕ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ. ВЛИЯНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: практическое занятие. Место проведения: аудитории кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 90 мин. Актуальность/мотивация. Знания и навыки, полученные на занятии, необходимы для понимания условий работы ферментов для обеспечения оптимальных скоростей протекания биохимических процессов, возможных причин и механизмов изменения ферментативной активности. Воздействие на организм человека вредных факторов (различных видов излучений, вибрации, высоких температур, тяжелых металлов, окислителей, изменений рН среды и др.) может привести к снижению активности ферментов и развитию патологического процесса. Знания и навыки, полученные на занятии, необходимы для понимания использования ферментов в энзимодиагностике и энзимотерапии. 75 Цели занятия Образовательная цель. Изучение особенности строения простых и сложных ферментов, видов специфичности, механизма ферментативного катализа, классификации ферментов, изоферментов различных органов и тканей, влияния на ферментативную активность неспецифических факторов. Воспитательная цель. Воспитание у обучающихся навыков: • аргументированного обоснования своей точки зрения и уважительного отношения к мнению коллег; • культуры поведения и коллективной профессиональной этики. Развивающая цель. Развитие логического мышления, способности получать, анализировать, обобщать, интерпретировать и передавать информацию в устной и письменной формах. Формирование широкого профессионального кругозора, повышение интеллектуального потенциала, мотивация к самообразованию. Развитие у обучающихся способности и готовности к постановке предварительного диагноза. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • сходство и отличие ферментов и небиологических катализаторов; • виды специфичности ферментов; • строение простых и сложных ферментов; • понятия кофактор, кофермент, простетическая группа и их роль; • понятие изоферментов (примеры); • строение регуляторных ферментов; • понятия активный и регуляторный центры, их функции; • строение активного центра; • основные положения теории ферментативного катализа; • условия протекания ферментативной реакции; • классификацию ферментов; • использование ферментного спектра крови в диагностике; • причины изменения биохимических показателей по сравнению с нормой. 76 Обучающийся должен уметь: • пользоваться медико-биологической терминологией; • излагать материал по теме в понятной, убедительной, информативной речевой форме; • интерпретировать данные лабораторных исследований по определению активности АЛТ и АСТ. Обучающийся должен владеть: • биохимической терминологией по теме занятия; • навыками грамотной публичной речи; • навыками самостоятельного формирования заключений (выводов) по вопросам нормы и патологии. Формируемые компетенции: изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-1, ОК-8), общепрофессиональных и профессиональных (ОПК-2, ОПК-7, ПК-5, ПК-21) компетенций. Задания для самоподготовки 1. Изучите основную и дополнительную литературу, используя вопросы для самоподготовки. 2. Заполните табл. 9. Таблица 9 Классы ферментов и основные типы катализируемых реакций Класс фермента Тип катализируемой реакции Пример реакции 3. Решите тестовые задания по темам: «Общие свойства и механизм действия ферментов», «Использование ферментов в медицине». Рекомендуемая литература Основная: 1. Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 74–100. 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного фа77 культета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (раздел 2, тема 6). Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия: учебник. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 114–144, 165–168. 2. Ленинджер А. Основы биохимии. — М.: Мир, 2012. — Т. 1. — С. 226– 301. Электронные ресурсы: 1. Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http:// www.studmedlib.ru/book/ ISBN9785970433126.html (раздел 2). 2. http://studopedia.org 3. http://window.edu.ru 4. http://studFiles.net 5. http://biohimist.ru 6. http://biohimist.ru Вопросы для самоподготовки 1. Понятие о ферментах, дайте определение. 2. В чем заключается сходство и отличие ферментов и неорганических катализаторов? 3. Какие виды специфичности ферментов вы знаете? Приведите примеры. 4. На какие группы делят ферменты по строению? 5. Каковы особенности строения сложных ферментов? Что такое холофермент, апофермент, небелковая часть? 6. Что такое кофактор? Приведите примеры. 7. Что такое кофермент? Назовите известные вам коферменты и витамины, входящие в их состав. 8. Когда используется термин «простетическая группа»? Приведите примеры. 9. Какие центры выделяют в молекуле фермента? Какова их роль? 10. Каковы особенности строения активного центра? Какие участки в нем выделяют и какова их роль? 78 11. За счет каких связей образуется фермент-субстратный комплекс? Что такое многоцентровое связывание? В чем суть теории индуцированного соответствия Кошланда? 12. Механизм действия ферментов. Объясните понятия «энергетический барьер» и «энергия активации». Начертите график хода реакции без фермента и в присутствии фермента. 13. Теория фермент-субстратного комплекса Михаэлиса–Ментен. Начертите график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. 14. Напишите уравнение Михаэлиса–Ментен. Что такое максимальная скорость реакции и константа Михаэлиса? Практическое значение константы Михаэлиса? 15. Какой принцип лежит в основе классификации ферментов? Назовите классы ферментов, приведите примеры ферментов из каждого класса. Что такое шифр или код фермента? Приведите пример(ы). 16. Перечислите факторы, от которых зависит скорость реакции? Какие условия необходимы для оптимального проведения ферментативной реакции? Глоссарий Активный центр — участок молекулы фермента, осуществляющий связывание субстрата и его каталитическое превращение. Оптимум рН для работы фермента — узкий диапазон значений рН, при котором ферменты наиболее активны и отклонение от которого сопровождается резким снижением их каталитической активности. Температурный оптимум для работы фермента — диапазон значений температуры, при котором ферменты проявляют максимальную активность. Изоферменты — ферменты, синтезирующиеся в разных органах, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся по набору субъединиц и по физическим и химическим свойствам (сродству к субстрату, скорости катализируемой реакции, электрофоретической подвижности, различной чувствительности к ингибиторам и активаторам, термостабильности, оптимуму рН). Энзимодиагностика — направление медицинской энзимологии, связанное с исследованием активности ферментов в биологических 79 жидкостях или биоптатах тканей с целью постановки диагноза или мониторинга терапии. Ферменты — биологически активные вещества белковой природы, выполняющие в организме роль катализаторов. Сходство ферментов и неорганических катализаторов • Не сдвигают равновесия реакции, а только ускоряют ее. • Активны в малых количествах. • Не входят в состав конечных продуктов реакции. • Не вызывают новых реакций, а ускоряют реакции, возможные по термодинамическим условиям. Отличие ферментов от неорганических катализаторов: • Обладают очень высокой каталитической активностью. • Высокоспецифичны. • Обладают регулируемостью скорости работы. • Работают в мягких условиях, то есть термолабильны; подвержены влиянию рН среды; активность зависит от ионной силы раствора. • Изменяют свою активность под действием ингибиторов и активаторов. • Характеризуются высокой кооперативностью и запрограммированностью этапов действия. Пример билета проверочного контроля 1. Как влияет температура на скорость ферментативной реакции? Приведите соответствующий график. 2. Какой тип реакции катализируют ферменты класса трансфераз? Приведите пример. Тестовые задания Выберите правильный ответ. 1. Часть сложного фермента, определяющая его специфичность, — это: а) апофермент; б) кофермент; в) кофактор; г) простетическая группа. 80 2. Каждый фермент содержит в своей структуре: а) кофермент; б) простетическую группу; в) активный центр; г) аллостерический центр. 3. Ферменты классифицируются на основе: а) типа катализируемой реакции; б) химической природы продукта; в) химической природы субстрата; г) условий протекания реакции. 4. Константа Михаэлиса (KM) определяет: а) сродство фермента к субстрату; б) максимальную скорость реакции; в) начальную скорость реакции; г) сродство фермента к продукту. 5. Механизм действия ферментов заключается в том, что они: а) повышают энергетический барьер; б) меняют направление реакции; в) повышают энергию активации; г) понижают энергию активации. 6. Уравнение Михаэлиса–Ментен отражает зависимость скорости ферментативной реакции от: а) концентрации субстрата; б) накопления продукта; в) концентрации фермента; г) температурных условий. 7. Температурный оптимум ферментативной реакции соответствует: а) максимальной скорости реакции; б) максимальной концентрации субстрата; в) минимальной концентрации субстрата; г) максимальной концентрации продукта. 8. НАД+ является коферментом фермента: а) аланинаминотрансфераза; б) лактатдегидрогеназа; в) сахараза; г) сукцинатдегидрогеназа. 81 9. ФАД является коферментом фермента: а) аланинаминотрансфераза; б) лактатдегидрогеназа; в) сахараза; г) сукцинатдегидрогеназа. 10. ФП является коферментом фермента а) аланинаминотрансфераза; б) лактатдегидрогеназа; в) сахараза; г) сукцинатдегидрогеназа. Ответы на тестовые задания 1—а 2—в 3—а 4—а 5—г 6—а 7—а 8—б 9—г 10 — а 82 Тема 7 ВЛИЯНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ Лабораторная работа № 3 Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: лабораторное занятие. Место проведения: аудитории для лабораторных исследований кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 90 мин. Актуальность/мотивация. Методы определения активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) широко используются в клинической лабораторной диагностике. Важным медицинским аспектом энзимологии является изучение действия различных факторов физической и химической природы, приводящих к ингибированию ферментов и развитию патологических состояний. Цели занятия Образовательная цель. Освоение метода определения активности АЛТ и АСТ в крови, обсуждение клинико-диагностического значения изменения активности этих трансаминаз, исследование влияния неспецифических факторов (высокой температуры, изменений рН, тяжелых металлов) на активность ферментов, доказательство наличия у ферментов специфичности действия. 83 Воспитательная цель. Воспитание у обучающихся навыков: • совместной работы в команде на принципах равноправного партнерства при выполнении поставленной учебной задачи; • аргументированного обоснования своей точки зрения и уважительного отношения к мнению коллег; • культуры поведения и коллективной профессиональной этики. Развивающая цель. Развитие у обучающихся способности к участию в проведении научных исследований. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • механизм действия неспецифических факторов на активность ферментов; • принцип метода определения активности аминотрансфераз (АЛТ и АСТ); • клинико-диагностическое значение определения активности АЛТ и АСТ; • виды специфичности ферментов. Обучающийся должен уметь: • объяснять взаимосвязь нативной конформации молекулы фермента с проявлением биологической активности; • отмерять необходимые объемы биологического материала и реактивов с помощью автоматических дозаторов; • проводить ферментативную реакцию в стандартных условиях; • пользоваться фотоэлектроколориметром для определения оптической плотности проб; • в команде выполнять определение активности и специфичности действия АЛТ; • проводить типовые расчеты при обработке полученных данных; • самостоятельно делать заключения (выводы) по результатам исследования; • коллективно обсуждать клинико-диагностическое значение полученных результатов. Обучающийся должен владеть: • навыками работы с автоматическими дозаторами; • навыками работы на фотоэлектроколориметре; 84 • способностью оценки полученных результатов; • навыками оформления результатов лабораторных исследований. Формируемые компетенции: изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-1, ОК-8), общепрофессиональных и профессиональных (ОПК-2, ОПК-7, ПК-5, ПК-21) компетенций. Задание для самоподготовки 1. Изучить основную и дополнительную литературу, используя вопросы для самоподготовки. Рекомендуемая литература Основная: Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (раздел 2, тема 7). Дополнительная: 1. Методы клинических лабораторных исследований / под ред. В. С. Камышникова. — 9-е изд. — М.: МЕДпресс-информ, 2018. — С. 487– 489, 493. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — С. 333–335. Вопросы для самоподготовки 1. Принцип метода определения активности аминотрансфераз (АЛТ и АСТ). 2. Клинико-диагностическое значение определения активности АЛТ и АСТ. 3. Какие условия необходимы для оптимального проведения ферментативной реакции? 4. Как зависит активность фермента от температуры? Что такое температурный оптимум? Начертите график, объясните характер кривой. 85 5. Как влияет рН среды на скорость ферментативной реакции? Что такое оптимум рН? Начертите график и объясните характер кривой. 6. Влияние тяжелых металлов на активность ферментов. Какой механизм этого воздействия? 7. Виды специфичности ферментов, примеры. Количественное определение активности аланинаминотрансферазы. Влияние неспецифических факторов на активность аланинаминотрансферазы Необходимое оснащение: ФЭК, термостат, водяная баня, автоматические дозаторы, пробирки, подставки для пробирок. Калибровочный график необходим для определения активности фермента АЛТ. Реактивы и оборудование: 1) сыворотка крови — источник фермента аланинаминотрансферазы; 2) субстратная смесь, содержащая аланин и α-кетоглутарат; 3) раствор гидроксида калия —10% (вещество, меняющее рН среды); 4) раствор хлорида кадмия 1% (ионы тяжелого металла); 5) 2,4-динитрофенилгидразин — 0,5% раствор; 6) 0,4 н. раствор гидроксида натрия; 7) фотоэлектроколориметр; 8) термостат 38° С; 9) водяная баня; 10) штативы для пробирок; 11) автоматические дозаторы с фиксированным/переменным объ­ емом. Принцип метода. Аминотрансферазы или трансаминазы катализируют межмолекулярный перенос аминогруппы с аминокислот на кетокислоты. Коферментом трансаминаз является пиридоксальфосфат (производное витамина В6), который служит непосредственным переносчиком аминогрупп. Определение концентрации кетокислот, образующихся в процессе трансаминирования из аминокислот, составляет основу методов количественного определения трансами86 назной активности и проводится путем спектрофотометрических или фотоколориметрических измерений. Аланинаминотрансфераза (КФ 2.6.1.2) катализирует реакцию трансаминирования между L-аланином и α-кетоглутаровой кислотой (рис. 3). Количество образующейся в данной реакции пировиноградной кислоты (ПВК) определяют по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, в ходе которой развивается красно-бурое окрашивание в щелочной среде (рис. 4). Ход работы. В 4 пробирки налейте по 0,05 мл сыворотки крови, содержащей фермент аланинаминотрансферазу. В первую пробирку добавьте 0,5 мл воды и нагрейте на кипящей водяной бане в течение 5 мин, во вторую — добавьте 0,5 мл 10% раствора КОН, в третью — 0,5 мл 1% СdСl2, в четвертую — 0,5 мл физиологического раствора (эту пробирку используют для определения активности нативного фермента), в пятую — 0,5 мл воды (в эту пробирку сыворотку крови СН3 СН2–—СН2–—COOH СН3 СН2–—СН2–—COOH СН–—NH2 + С== O С== O + СH—NH2 Аланинаминотрансфераза (АЛТ) COOH COOH COOH COOH Аланин α-кетоглутаровая Пировиноградная Глутаминовая кислота кислота кислота Рис. 3. Реакция трансаминирования СН3 NH2—NH NO2 С== O + COOH Пировиноградная кислота HOOC—C== N—NH NO2 СН3 NO2 NO2 2,4-динитрофенилгидразин 2,4-динитрофенилгидразон (красно-бурого цвета) Рис. 4. Химизм реакции взаимодействия пировиноградной кислоты с 2,4-динитрофенилгидразином 87 не добавляют, она служит контролем на реактивы). Через 5 мин во все пробирки добавьте по 0,5 мл раствора субстратной смеси в буфере и поставьте их в термостат при 38° С 20 мин. После этого во все пробирки добавьте по 0,2 мл 2,4-динитрофенилгидразина, встряхните и оставьте стоять 5 мин при комнатной температуре, затем во все пробирки добавьте по 2,5 мл 0,4 н. раствора гидроксида натрия, встряхните и проколориметрируйте против пробы 5 в кюветах с рабочим расстоянием 10 мм с зеленым светофильтром (λ = 560 нм) после 10 мин инкубации при комнатной температуре. Активность фермента определите по калибровочному графику. Результаты исследования занесите в табл. 10 и сделайте вывод. Таблица 10 Результаты эксперимента по изучению влияния неспецифических факторов на активность АЛТ Сыворотка № крови, пробы 0,05 мл Воздействие неспецифических факторов 100 °С Вода, 0,5 мл Результаты Физ. р-р, 0,5 мл D (оптич. Активплотность ность) + + – + – – + – – Субстр. смесь, 10% КОН, 1% СdCl2, 0,5 мл 0,5 мл 0,5 мл 1 + + 2 + 3 + 4 + + – + 5 – + + – + + Вывод: ________________________________________________ ______________________________________________________ ______________________________________________________ ______________________________________________________ ______________________________________________________ Специфичность действия ферментов проявляется в их способности катализировать строго определенные реакции. В данной работе специфичность действия аланинаминотрансферазы исследуют пу88 тем инкубации ее с двумя субстратами: D-аланином и L-аланином в буферном растворе субстратной смеси (ферменты организма специфичны к L-аминокислотам). После добавления реактивов проведите инкубацию в течении 20 мин при температуре 37 °С. После 20 мин инкубации в термостате во все пробирки добавьте по 0,20 мл 2,4-динитрофенилгидразина, встряхивают и оставляют стоять 5 мин при комнатной температуре, затем во все пробирки добавьте по 2,5 мл 0,4 н. раствора гидроксида натрия, встряхните и проколориметрируйте против контроля в кюветах с рабочим расстоянием 10 мм с зеленым светофильтром (λ = 560 нм) после 10 мин инкубации при комнатной температуре. Активность фермента определяют по калибровочному графику. Результаты исследования занесите в табл. 11 и сделайте вывод. Таблица 11 Результаты эксперимента по изучению специфичности действия АЛТ № пробы Субстратная смесь, Условия Сыворотка содержащая опыта крови Физ. D (оптич. Активα-кетоглутарат (источник Вода р-р, плотность фермента), мл ность) фермента D-аланин, L-аланин, Время, мл Т °С мин мл мл 1 (контр.) – 2 0,05 3 0,05 – 1,0 – 38 20 0,5 – 0,5 – 38 20 – 0,5 – 0,5 38 20 Вывод: ________________________________________________ ______________________________________________________ ______________________________________________________ Клинические аспекты влияния различных факторов на активность ферментов. Диагностическое значение определения аминотрансфераз В клинике определяют активность двух трансаминаз — аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ). В норме в крови активность этих ферментов незначительна (7– 89 40 Ед/л или 0,2–0,68 ммоль/л•ч), но при повреждении клеток (цитолизе) соответствующего органа ферменты выходят в кровь, поэтому активность их в крови резко возрастает. Так как наиболее высокая активность АЛТ и АСТ обнаруживается в клетках печени, сердца и, в меньшей степени, скелетных мышц, то их определение в крови используется для диагностики заболеваний этих органов. В клетках сердечной мышцы количество АСТ значительно превышает количество АЛТ, а в печени — наоборот, поэтому особенно информативно одновременное определение в крови активности этих ферментов. При заболеваниях печени, сопровождающихся цитолизом гепатоцитов, активность АЛТ повышается в 8–10 раз по сравнению с нормой, а АСТ в 2–4 раза. При инфаркте миокарда активность АСТ в крови возрастает в 8–10 раз, а АЛТ в 1,5–2,0 раза. Поэтому методы определения аминотрансфераз широко используются при диагностике гепатитов, изучении действия гепатотропных ядов на организм человека, а также для диагностики инфаркта миокарда. Тестовые задания Выберите правильный ответ. 1. Колориметрический метод, основанный на образовании 2,4-динитрофенилгидразона, используется для определения активности ферментов: а) холинэстераз; б) аминотрансфераз; в) α-амилаз; г) фосфатаз. 2. Вид специфичности фермента, при которой он катализирует реакции с группой родственных субстратов: а) абсолютная специфичность; б) стереоспецифичность; в) каталитическая специфичность; г) относительная специфичность. 3. Вид специфичности фермента, при которой он катализирует реакцию только с одним субстратом: а) абсолютная специфичность; б) стереоспецифичность; в) каталитическая специфичность; г) относительная специфичность. 90 4. Неспецифический фактор, влияющий на активность ферментов: а) активатор; б) рН среды; в) ингибитор; г) регулятор. 5. Неспецифический фактор, влияющий на активность ферментов: а) температура; б) ингибитор; в) регулятор; г) активатор. 6. Фермент АЛТ проявляет стереоспецифичность по отношению к: а) D-глицину; б) L-аланину; в) D-аланину; г) L- глицину. 7. Витамин В6 входит в состав ферментов: а) ацетихолинэстеразы; б) лактатдегидрогеназы; в) гексокиназы; г) аминотрансфераз. 8. Активность АЛТ в крови повышается больше, чем активность АСТ при цитолизе клеток: а) почек; б) сердца; в) печени; г) легких. 9. Активность АСТ в крови повышается больше, чем активность АЛТ при цитолизе клеток: а) сердца; б) почек; в) легких; г) печени. 10. Витамин В6 входит в состав кофермента: а) ТДФ; б) НАД; в) ФАД; г) ФП. 91 Ответы на тестовые задания 1—б 2—г 3—а 4—б 5—а 6—б 7—г 8—в 9—а 10 — г 92 Раздел III ВИТАМИНЫ Витамины — вещества, которые не синтезируются в организме человека, или синтезируются в недостаточных количествах, относятся к жизненно важным и незаменимым пищевым факторам. Они нужны живым организмам лишь в очень небольших количествах для синтеза коферментов, образования сигнальных молекул, выполнения антиоксидантных и других функций. Тема 8 НУТРИЕНТОЛОГИЯ. ВИТАМИНЫ ВОДОРАСТВОРИМОЙ ГРУППЫ Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: практическое занятие. Место проведения: аудитории кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 180 мин. Актуальность/мотивация. Знания и навыки, полученные на занятии, необходимы для понимания работы ферментов, использования витаминов в терапевтических и профилактических целях при лечении и профилактике гиповитаминозов. 93 Цели занятия Образовательная цель. Изучение строения, биохимической роли и механизма действия витаминов водорастворимой группы: В1, В2, В3, В6, С. Изучение клинических проявлений гиповитаминозов с позиций участия витаминов в биохимических процессах. Воспитательная цель: • воспитание у обучающихся навыков аргументированного обоснования своей точки зрения и уважительного отношения к мнению коллег; • культуры поведения и коллективной профессиональной этики. Развивающая цель. Развитие логического мышления, способности получать, анализировать, обобщать, интерпретировать и передавать информацию в устной и письменной формах. Формирование широкого профессионального кругозора, повышение интеллектуального потенциала, мотивация к самообразованию. Развитие у обучающихся способности и готовности к постановке предварительного диагноза. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • эндо- и экзогенные причины гиповитаминозов; • строение, классификацию витаминов; • название витамина: буквенное, по химической структуре, по биологическому действию; • участие витамина в биохимических реакциях (название кофермента и фермента, в состав которого входит витамин, название биохимического процесса, катализируемого этим ферментом); • название и характеристику авитаминоза; • суточную потребность витамина; • основные пищевые продукты, содержащие данный витамин; • основные методы количественного определения витаминов в биологическом материале. Обучающийся должен уметь: • по клиническим проявлениям определить, какой гиповитаминоз развился, какие биохимические процессы при этом нарушаются; 94 • пользоваться медико-биологической терминологией; • излагать материал по теме в понятной, убедительной, информативной речевой форме. Обучающийся должен владеть: • информацией о биологической роли витаминов водорастворимой группы; • биохимической терминологией по теме занятия; • навыками грамотной публичной речи. Формируемые компетенции: изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-8) и профессиональных (ПК-5, ПК-21) компетенций. Вопросы для самоподготовки 1. Понятие о витаминах как незаменимых пищевых факторах. 2. Классификация и номенклатура витаминов. 3. Понятия «провитамины» и «антивитамины». 4. Что такое гипо- и авитаминозы, экзо- и эндогенные причины их возникновения, меры профилактики. 5. Характеристика группы водорастворимых витаминов: а) витамины В1, В2, В3, В6, С. Номенклатура, химические формулы витаминов и активные группы в молекуле витамина; формулы и названия коферментов; название ферментов с участием этих коферментов; биохимические функции (участие в реакциях), суточная потребность, содержание в продуктах, характеристика (гипо-)авитаминоза, факторы, влияющие на устойчивость витаминов; б) биохимические функции витаминов В5, В9, В12, В14, Н, Р, проявления гиповитаминозов. 6. Какие методы используют для количественного определения аскорбиновой кислоты и других водорастворимых витаминов? Задание для самоподготовки 1. Изучите основную и дополнительную литературу, используя вопросы для самоподготовки и тестовые задания. 2. Заполните табл. 12 для витаминов, В1, В2, В3, В5, В6, В9, В12, Н, С, Р. 95 Водорастворимые витамины Буквенное обозначение витамина Названия витамина (по химической структуре и биологическому действию) Формула витамина Формула и название кофермента Таблица 12 Название ферментов, Биохимические функции работающих (участие с этим в реакциях) коферментом Рекомендуемая литература Основная: 1. Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 28–30, 35–38, 66–73. 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (раздел 3, тема 8). Дополнительная: Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия: учебник. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 23–32, 44–49, 568–574, 577–578. Электронные ресурсы: 1. Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http:// www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970433126.html (раздел 3). 2. http://studopedia.org 3. http://window.edu.ru 4. http://studFiles.net 5. http://biohimist.ru 6. http://biohimist.ru Глоссарий Нутриентология — научная дисциплина, которая занимается изучением питания населения в зависимости от разных факторов 96 97 Гиповитаминоз В2 В9 В9 Акрихин, хинин Метотрексат Сульфаниламиды (фталазол, норсульфазол, стрептоцид), ПАСК В3 Изониазид (туба- В6 зид, фтивазид, салюзид, метазид) Лекарственные препараты Применение лекарственного препарата Противоопухолевое, антибактериальное действие, для лечения острых лейкозов Противомалярийное, противопаразитарное, антибактериальное действие Структурные аналоги парааминобензойной Антибактериальное действие, для лечения кислоты, которая необходима для синтеза В9 в инфекционных заболеваний, в том числе клетке бактерий, что ведет к торможению роста туберкулеза бактерий, но при этом нарушают микрофлору кишечника, снижают всасывание витамина Встраиваются в активный центр фолатзависимых ферментов и блокируют синтез нуклеиновых кислот (цитотоксическое действие), угнетают деление клеток и другие эффекты витамина В9 Конкурирует с витамином В2 при синтезе флавиновых коферментов и ферментов Снижает активность ферментов, содержащих пиридиновый цикл и образование никотинамида из аминокислоты триптофана 1. Изониозид как антикофермент замещает Антибактериальное действие, для лечения пиридоксалевые коферменты в ферментатив- туберкулеза ных реакциях и вызывает состояние пиридоксиновой недостаточности. 2. Изониазид связывается с альдегидной группой пиридоксальфосфата, превращая его в неактивную форму Механизм действия лекарственного препарата на обмен витамина Побочное действие некоторых лекарственных препаратов, приводящее к развитию витаминной и минеральной недостаточности у человека Таблица 13 98 Аспирин, ибупрофен, ибуклин и другие нестероидные противовоспалительные препараты Антибиотики Вследствие индукции фермента цитохрома Р450 Противосудорожное, антиаритмическое, могут снижать содержание витамина D, влиять анальгетическое, миорелаксантное дейна минеральный обмен костной ткани ствие. При длительном применении (более 10 лет) приводит к повышенному риску Снижают всасывание витамина остеомаляции, переломов, остеопороза Жаропонижающее, противовоспалительное, анальгезирующее, антиагрегантное действие. При длительном приеме: диспепсические расстройства и желудочные кровотечения Снижают выработку витамина К микрофлорой кишечника К С, В9, В12, Снижают всасывание витаминов и минералов Zn и других минералов Снижают всасывание витаминов, подавляют Антибактериальное действие жизнедеятельность микрофлоры, необходимой для синтеза витамина В6 В1, В5, В6, В9, В12, В12 D, А Мочегонное действие, для лечения гипертонической болезни, хронических отеков различного происхождения Гипогликемическое действие, для лечения сахарного диабета 2-го типа Дифенин (фенитоин) Снижают всасывание витамина Применение лекарственного препарата Увеличивают выведение с мочой витаминов и микроэлементов В12, В1, В9, D, Mg2+, Бигуаниды (метформин, глиформин, новоформин) Механизм действия лекарственного препарата на обмен витамина Фуросемид, гипо- В1, В3, В6, тиазид, верошпи- С, Na+, K+, рон и др. Mg2+, Cu+, Fe2+ Гиповитаминоз Лекарственные препараты Окончание табл. 13 99 Гиполипидемическое действие Применяют как противосудорожное средство; при возбуждении, бессоннице. При длительном приеме: дефицит фолатов, гипокальциемия, остеомаляция Снижают всасывание витамина. Кроме этого, являются индукторами цитохрома Р450 и глюкуронилтрансферазы и цитохром-Р450-редуктазы, следовательно, влияют на метаболизм гидрофобных ксенобиотиков, блокируют Ц.П.Э. — снижают выработку АТФ Обладают высокой сорбционной способностью по отношению к холестерину пищи и снижают всасывание жирорастворимых витаминов Барбитураты (фе- B9 нобарбитал) А, D, Е, K Холестирамин (квестран), метамуцил Вызывают индукцию синтеза цитохрома Р450 Контрацептивное действие (подавляют и ферментов синтеза гема, в данных процессах овуляцию и уменьшают способность яйцеучаствуют В2, В3, В6, В9, В12, Zn2+ Fe2+, Сu2+. клетки к оплодотворению) Для антиоксидантной системы, сопряженной с цитохромом Р450, необходимы А, С, Е, Zn2+, Se2- Снижают кислотность желудочного сока Снижают кислотность желудочного сока (обволакивают стенки желудка) Кумарины блокируют образование протромби- Противосвертывающее действие; для прона, проконвертина и других факторов свертыва- филактики и лечения тромбозов ния крови в печени В2, В3, В6, В9, В12, А, С, Е, Zn2+, Se2-, Mg2+ Гормональные противозачаточные препараты (контрацептивы) Снижают всасывание витамина С и микроэлементов Нарушают выработку фактора Касла в желудке и снижают всасывание витамина Снижают всасывание витаминов и содержание фосфора в организме Дикумарол, вар- K фарин, тромексан Вит С, Ca, Mg, Fe, фосфаты Омепразол Антациды (Al-со- А, D держащие препараты) В12 (­возраста, пола, особенностей трудовой деятельности, климатических и других условий), вопросами сбалансированного питания, научного обоснования норм питания, изучением и разработкой принципов лечебно-профилактического питания. Изучается возможность использования пищевых веществ для мобилизации защитных систем организма и повышения его устойчивости к неблагоприятным факторам. Провитамины — предшественники витаминов, которые путем химических модификаций в организме человека превращаются в витамины. Антивитамины — химические соединения, имеющие структурное сходство с витаминами, которые могут встраиваться вместо витамина в кофермент, но не способны выполнять необходимую функцию. Длительное применение некоторых лекарственных препаратов может приводить к нарушению обмена витаминов, вызывая клиническую картину гиповитаминозов (табл. 13). Методы исследования витаминов водорастворимой группы. Диагностика витаминной недостаточности При определении витаминов в биологических жидкостях возникает ряд сложностей, связанных с тем, что: а) многие витамины в них находятся в связанном состоянии в виде комплексов с белками или пептидами. Эти комплексы предварительно необходимо разрушить, используя кислотный, щелочной или ферментативный гидролиз, автоклавирование; б) почти все витамины легко подвергаются окислению, изомеризации и полному разрушению под воздействием высокой температуры, кислорода воздуха, света. Необходимо избегать этих воздействий. Аналитические методы исследования обеспеченности организма витаминами Эти методы можно условно разделить на две группы. 1. Методы прямого определения содержания витаминов и продуктов их обмена в биологических средах организма (кровь, моча). При первом подходе исследуют: а) содержание в крови и моче, слюне самих витаминов; 100 б) содержание в крови коферментных и иных биологически активных форм витаминов (тиаминдифосфата, никотинамидных коферментов в эритроцитах, 25-оксихолекальциферола (активная форма витамина D); в) экскрецию с мочой продуктов катаболизма витаминов (В12-метилмалоновой кислоты, В3 (РР) — N-метилникотинамида и др.). 2. Фунцкциональные методы — косвенное определение, основанное на оценке тех метаболических процессов, в которых непосредственно участвуют витамины. Из числа функциональных методов наиболее распространено исследование активности витаминзависимых ферментов в эритроцитах (или гемолизатах) крови до и после внесения в среду инкубации коферментной формы исследуемого витамина. При недостаточной обеспеченности витамином степень активации фермента при добавлении экзогенного кофермента оказывается выше, чем в случаях с адекватной обеспеченностью исследуемым витамином. При этом чем больше степень недостаточности витамина, тем выше степень активации фермента. Подобные ферментные тесты нашли применение при оценке обеспеченности организма витамином В1 (исследование активности транскетолазы в эритроцитах и ее стимуляции добавленным тиаминдифосфатом — ТДФ-эффект). Обеспеченность витамином В2: исследование активности глутатионредуктазы и ее стимуляции под влиянием ФАД — ФАД-эффект). Обеспеченность витамином В6 (исследование активности аминотрансфераз и их стимуляции под влиянием пиридоксальфосфата — ПАЛФ-эффект). Недостаток метода — активность фермента может зависеть от ряда других причин: присутствие ингибиторов, активаторов, генетических дефектов фермента и т.д. Количественное определение содержания витаминов в пищевых продуктах и биологических жидкостях Для этой цели используют физико-химические аналитические методы: • фотоколориметрические; • спектрофотометрические; • флюорометрические; 101 • высокоэффективную жидкостную хроматографию • вольтамперометрию; • твердофазный иммуноферментный анализ. Фотоколориметрические методы. При взаимодействии витаминов с рядом химических соединений наблюдаются характерные цветные реакции, интенсивность окраски при которых пропорциональна концентрации данных соединений в исследуемом растворе. Например, содержание тиамина регистрируют при помощи диазореактива. Эти методы позволяют судить как о наличии витаминов, так и о количественном содержании их в исследуемом пищевом продукте или органах и тканях животных и человека. Для выяснения обеспеченности живого организма каким-либо витамином часто определяют соответствующее соединение или продукт его обмена в сыворотке крови, моче или биопсийном материале. Однако эти методы могут быть применены не во всех случаях. Спектрофотометрические методы. Многие витамины можно определять спектрофотометрически. Например, никотиновую кислоту и ее амид можно также определять спектрофотометрически благодаря их собственному поглощению в УФ-области. Никотиновая кислота характеризуется максимумом поглощения при 262 нм, а никотинамид — при 215 нм. Пиридоксина гидрохлорид характеризуется собственным поглощением при 292 нм при Н = 5. Тиамин характеризуется собственным поглощением в УФ-области (240 нм в водном растворе, 235 нм — в этаноле). Флюорометрический метод. Данный метод широко используется, например, для определения тиамина в пищевых продуктах. Метод основан на окислении тиамина в щелочной среде гексацианферратом калия с образованием сильно флюоресцирующего в ультрафиолетовом свете соединения тиохрома. Интенсивность его флюоресценции прямо пропорциональна содержанию тиамина [(длина волны возбуждающего света 365 нм, испускаемого — 460–470 нм (синяя флюоресценция)]. Высокоэффективная газожидкостная хроматография. В настоящее время является «золотым стандартом» в количественном определении многих веществ, в том числе витаминов. Как правило, время анализа занимает от 3–5 до 30 мин. Этим методом можно разделить до 14 водорастворимых витаминов одновременно. 102 Вольтамперометрия. Метод основан на исследовании вольтамперных кривых, полученных при электролизе раствора анализируемого вещества и фиксировании силы тока, в моменты повышения напряжения. Электролиз проводится с использованием легко поляризуемого электрода с маленькой поверхностью, на которой происходят электроокисление и электровосстановление исследуемого вещества. Электродом сравнения чаще всего служит поляризуемый электрод. Например, часто используется метод вольтамперометрического определения витамина В1, основанный на способности тиамина хлорида восстанавливаться на индикаторном ртутно-пленочном электроде при определенном потенциале, характерном для данного органического вещества. Недостаток метода — в биологической ткани есть другие вещества, способные к восстановлению. Иммуноферментный анализ (ИФА). Одним из точных и простых способов определения витаминов в биологических жидкостях служит твердофазный конкурентный иммуноферментный анализ с использованием моноклональных антител против определяемых соединений. Метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и скоростью выполнения. Поскольку витамины — низкомолекулярные соединения и поэтому не являются гаптенами (иммуногенными веществами), но в комплексе с иммуногенами (например, белками или пептидами), способными вызывать образование антител, для проведения анализа требуется получение конъюгатов с каким-либо белком, чаще бычьим сывороточным альбумином. Предел обнаружения данного метода составляет 0,5 мкг/мл. Из водорастворимых витаминов этим методом определяют витамин В9 и В12. Биологические методы Основаны на определении того минимального количества витамина, которое при добавлении к искусственной диете, лишенной только данного вещества, предохраняет животное от развития гиповитаминоза или излечивает его от уже развившейся болезни. Полученные величины условно принимают за единицу (в научной литературе встречаются «голубиные», «крысиные» единицы). 103 Микробиологические методы Важное место в выяснении насыщенности витаминами биологических жидкостей занимают микробиологические методы. Подавляющее большинство их основано на изучении скорости роста микробов, которая зависит от наличия витаминов в среде. При этом требуется точно знать условия роста и размножения индикаторного штамма: необходимый состав питательной среды, потребность в готовых витаминах. В настоящее время широкое распространение получают готовые микробиологические планшетные тест-системы для определения широкого спектра витаминов: В1, В3, В5, В9, В12, С, Н. Принцип метода. Предварительно обработанные и разведенные буфером образцы крови вносят в лунки микропланшета, покрытые штаммом ауксотрофных молочнокислых бактерий. Добавление витамина, присутствующего в стандартах или образцах, приводит к витаминзависимому росту до тех пор, пока витамин не израсходуется. После инкубации при 37 °C в течение 44–48 ч рост лактобактерий измеряется турбидиметрически на микропланшетном фотометре. По полученным значениям оптической плотности (ОП) строится калибровочная кривая. Количество витамина в образце прямо пропорционально считанному значению ОП образца и вычисляется по калибровочной кривой. Определение витаминов микробиологическим методом имеет большие преимущества по сравнению с аналогами: дешевле, чем ВЭЖХ; короче (нет промывок), чем ИФА, но самое главное преимущество по сравнению с хроматографическими и иммунологическими методами — этот метод определяет только биологически активные формы витамина, так как без биологически активного витамина не будет роста культуры лактобактерий. В ряде случаев в медико-профилактической практике проводят ориентировочное определение витаминной обеспеченности рационов по перечню продуктов и их содержанию с использованием средних табличных значений содержания витаминов в продуктах. Количественное определения витамина С В настоящее время существуют разные методы определения витамина С и его производных в крови, тканях, слюне, пищевых про104 дуктах и фармакопейных препаратах. Могут быть использованы спектрофотометрическое определение, капиллярный электрофорез, флюоресцентный метод и определение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии; кроме того, в клинико-диагностических лабораториях широкое распространение получил полуколичественный метод — метод сухой химии (тест-полоски). Одним из наиболее широко распространенных методов количественного определения витамина С является оксидометрический, основанный на способности аскорбиновой кислоты (АК) восстанавливать 2,6-дихлорфенол (краска Тильианса), который при этом переходит в бесцветную лейкоформу. Этот метод определяет только восстановленную форму АК. С его помощью можно получить сведения о содержании витамина С в пищевых продуктах, а также в сыворотке крови, моче и других биологических тканях, и на основе полученных данных судить об обеспеченности им организма. В гигиенических исследованиях использование данного метода позволяет контролировать сохранность витамина С в пищевых продуктах в зависимости от способов и сроков хранения, характера технологической и, в частности, кулинарной обработки пищи, дает возможность выявить изменения в обмене витамина С при воздействии химических веществ на организм в производственных условиях. Определение содержания витамина С в моче оксидометрическим титрометрическим методом Реактивы и оборудование: 1) натриевая соль 2,6-дихлорфенолиндофенола 0,001 н. раствор; 2) хлороводород 10% раствор; 3) дозаторы; 4) колбочка или широкие пробирки для титрования; 5) бюретки Исследуемый материал: моча. Принцип метода. Определение витамина С основано на его сильной редуцирующей способности. При определении используют окислительно-восстановительную реакцию между аскорбиновой кислотой и 2,6-дихлорфенолиндофенолом (2,6-ДХФИФ) — краской Тильманса в кислой среде. Раствор 2,6-ДХФИФ в нейтральной среде 105 окрашен в синий цвет. Пока в растворе есть аскорбиновая кислота, названный реактив восстанавливается ею и при этом обесцвечивается. После окисления им всей аскорбиновой кислоты избыток реактива окрашивает раствор в кислой среде в слабо-розовый цвет. При появлении розовой окраски титрование прекращают и отмечают количество раствора 2,6-ДХФИФ, затраченного на титрование. В колбочку отмеряют 5 мл мочи, добавляют 19 мл воды и 1 мл 10% раствора хлорводорода. Перемешивают и титруют раствором 2,6-ДХФИФ до слабо-розовой окраски. Расчет содержание витамина С (Х) в суточном количестве мочи (1500 мл): Х = 0,088 ∙ а ∙ 1500/5, где 5 — это количество мочи в миллилитрах, взятой для исследования; а — количество 2,6-ДХФИФ, пошедшее на титрование; 1500 — суточный объем мочи; молекулярная масса аскорбиновой кислоты равна 176. Находят грамм-эквивалент аскорбиновой кислоты. В реакции с 2,6-ДХФИФ она двухосновная, следовательно, грамм-эквивалент равен М/2 = 176/2 = 88 г, а 1 мл 0,001 н. раствора 2,6-ДХФИФ, соответственно, равен 0,088 г аскорбиновой кислоты. Содержание витамина С в моче в норме — 20–30 мг в норме•• в суточном объеме. Результаты ____________________________________________ _____________________________________________________ Вывод ________________________________________________ ______________________________________________________ Тестовые задания Выберите правильный ответ. 1. К экзогенным причинам гиповитаминозов относится: а) нарушения синтеза апофермента; б) недостаток работы ферментов, превращающих витамин в кофермент; 106 в) нарушение транспорта витамина в организме; г) неправильная термическая обработка пищи. 2. К эндогенным причинам гиповитаминоза относится: а) загрязнение окружающей среды; б) работа в горячих цехах; в) недостаточное поступление витаминов с пищей; г) синдром мальабсорбции (нарушение всасывания). 3. Витамины и их производные не являются: а) сигнальными молекулами; б) коферментами; в) нейромедиаторами; г) антиоксидантами. 4. Антивитамином для витаминов В3 и В6 являются: а) изониазид; б) аспирин; в) дикумарол; г) глицин. 5. Витамин С участвует в гидроксилировании: а) аланина; б) пролина и лизина; в) глицина; г) токоферола. 6. Основные проявления авитаминоза витамина В2: а) полиневриты, нарушения работы ССС и ЖКТ; б) задержка роста, кератит, катаракта, глоссит; в) дерматиты, анемия, повышенная возбудимость ЦНС; г) макроцитарная анемия, лейкопения. 7. Основные проявления авитаминоза витамина В1: а) полиневриты, нарушения работы ССС и ЖКТ; б) задержка роста, кератит, катаракта, глоссит; в) дерматиты, анемия, повышенная возбудимость ЦНС; г) макроцитарная анемия, лейкопения. 8. Основные проявления авитаминоза витамина РР (В3): а) полиневриты, нарушения работы ССС и ЖКТ; б) дерматит, анемия, повышенная возбудимость ЦНС; 107 в) макроцитарная анемия, лейкопения; г) дерматиты, диарея, деменция. 9. Основные проявления авитаминоза витамина В6: а) полиневриты, нарушения работы ССС и ЖКТ; б) задержка роста, кератит, катаракта, глоссит; в) дерматиты, анемия, повышенная возбудимость ЦНС; г) макроцитарная анемия, лейкопения. 10. Биотин входит в состав фермента: а) изоцитратдегидрогеназа; б) глутаматдекарбоксилаза; в) пируватдегидрогеназа; г) пируваткарбоксилаза. Ответы на тестовые задания 1—г 2—г 3—в 4—а 5—б 6—б 7—а 8—г 9—в 10 — г 108 Раздел II ЭНЗИМОЛОГИЯ Тема 9 АКТИВАЦИЯ И ИНГИБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТОЧНОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ, СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: практическое занятие. Место проведения: аудитории кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 180 мин. Актуальность/мотивация. Знания и навыки, полученные на занятии, необходимы для понимания основных механизмов регуляции ферментативной активности, механизмов действия активаторов и ингибиторов, протекторов и антидотов. Воздействие на организм человека вредных факторов может привести к снижению активности ряда ферментов и развитию патологического процесса. Изучаемая тема обосновывает необходимость проведения контроля за состоянием здоровья лиц, связанных с производством и использованием фосфорорганических соединений (ФОС), окислителей, тяжелых ме109 таллов, алкилирующих агентов для выявления признаков и оценки тяжести острого и хронического отравления этими веществами; для контроля патогенетической терапии интоксикаций. Знания и навыки, полученные на занятии, необходимы для понимания использования ферментов в энзимодиагностике и энзимотерапии. Цели занятия Образовательная цель. Изучение механизмов действия ингибиторов и активаторов на примере дегидрогеназ (СДГ и др.) и гидролаз (сывороточной ХЭ, АХЭ); изучение действия протекторов и антидотов; механизмов быстрой и медленной регуляции активности ферментов; Воспитательная цель. Воспитание у обучающихся навыков: • аргументированного обоснования своей точки зрения и уважительного отношения к мнению коллег; • культуры поведения и коллективной профессиональной этики. Развивающая цель. Развитие логического мышления, способности получать, анализировать, обобщать, интерпретировать и передавать информацию в устной и письменной формах. Формирование широкого профессионального кругозора, повышение интеллектуального потенциала, мотивация к самообразованию. Развитие у обучающихся способности и готовности к постановке предварительного диагноза. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • виды и механизм ингибирования ферментов; • виды и механизм активации ферментов; • единицы ферментативной активности; • виды и механизм быстрой регуляции; • принципы медленной регуляции ферментов; • причины изменения биохимических показателей по сравнению с нормой. Обучающийся должен уметь: • писать реакции взаимодействия тиоловых ферментов, содержащих —SH-группы, с «тиоловыми ядами»: солями тяжелых металлов, окислителями, алкилирующими агентами; 110 • объяснять механизм действия ингибиторов на примере дегидрогеназ и холинэстераз; • объяснять выбор антидотов и протекторов в зависимости от типа ингибирования; • объяснять активацию ферментов ионами металлов и путем ограниченного протеолиза; • объяснять принципы быстрой и медленной регуляции активности ферментов; • пользоваться медико-биологической терминологией; • излагать материал по теме в понятной, убедительной, информативной речевой форме; • изучать и осваивать информационные источники для самостоятельного решения учебных ситуационных задач; • интерпретировать данные лабораторных исследований при решении ситуационных задач. Обучающийся должен владеть: • биохимической терминологией по теме занятия; • навыками грамотной публичной речи; • навыками самостоятельного формирования заключений (выводов) по вопросам нормы и патологии. Формируемые компетенции: изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-1, ОК-8), общепрофессиональных и профессиональных (ОПК-2, ОПК-7, ПК-5, ПК-21) компетенций. Задание для самоподготовки 1. Изучите основную и дополнительную литературу, используя вопросы для самоподготовки. 2. Заполните табл. 14. Ингибирование ферментов является ведущим звеном биохимического механизма патологических состояний, вызванных действием на организм токсических веществ и различных физических факторов (ионизирующая и ультрафиолетовая радиация, шум, вибрация и др.) внешней среды или как результат развития патологии при многих соматических и инфекционных заболеваниях. 111 Поскольку все ферменты имеют белковую природу, их ингибирование может быть следствием конформационных и денатурационных изменений фермента, вызванных химическим или физическим фактором, и рассматривается как неспецифическое. Вместе с тем многие химические вещества обладают высоким сродством к активным центрам ферментов, блокируют их и вызывают специфическое ингибирование ферментов. Поэтому определение ферментативной активности крови, других тканей и жидкостей широко используется в лечебной и гигиенической практике с целью выявления признаков действия на организм вредных факторов среды, для изучения патогенеза заболеваний, оценки эффективности способов их профилактики и лечения. Таблица 14 Типы ингибирования ферментов Пример ингибитора Участок молеСвязи Ферменты, кулы фермента ингибитора Тип на которые и группы, и фермента ингиби­ воздействует с которым (ковалентные рования ингибитор связывается или нековаингибитор лентные) 1. Малонат 2. Четвертичные аммониевые соединения 3. Соли ртути (HgCl2) 4. Диизопропилфторфосфат и др. ФОС Рекомендуемая литература Основная: 1. Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 100–118. 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного фа112 культета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (раздел 2, тема 9). Дополнительная Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия: учебник. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 145–158, 165–168, 637–641. Электронные ресурсы: 1. Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http:// www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970433126.html (раздел 2). 2. http://studopedia.org 3. http://window.edu.ru 4. http://studFiles.net 5. http://biohimist.ru 6. http://biohimist.ru Вопросы для самоподготовки 1. Какие существуют виды ингибирования ферментов? 2. Что такое обратимое ингибирование ферментов? Приведите пример, подтвердите уравнением реакции в общем виде. 3. Что такое необратимое ингибирование ферментов? Приведите пример, подтвердите уравнением реакции в общем виде. 4. Что такое конкурентное ингибирование ферментов? Приведите пример, подтвердите уравнением реакции в общем виде. 5. Что такое неконкурентное ингибирование ферментов, Приведите пример, подтвердите уравнением реакции в общем виде. 6. Что такое тиоловые ферменты? Назовите особенности строения их активного центра. Приведите пример тиоловых ферментов, назовите класс и подкласс. 7. Какие вещества и почему являются ингибиторами дегидрогеназ? Что такое «тиоловые яды»? Ответ подтвердите соответствующими уравнениями реакции. 8. Какие существуют виды активации ферментов? 9. Как происходит активация ферментов ионами металлов? 113 10. Как происходит активация ферментов путем ограниченного протеолиза? 11. Каков механизм действия протекторов? Обоснуйте выбор протекторов для тиоловых ферментов. 12. Виды быстрой регуляции активности ферментов. Приведите примеры. 13. Как осуществляется медленная регуляция активности ферментов? 14. Диагностическое использование ферментов. 15. Методы определения активности ферментов, принципы, лежащие в их основе. 16. Единицы активности ферментов, дайте определение каждой единицы активности. Глоссарий Индуцибельные ферменты — это такие ферменты, которые вырабатываются в необходимом количестве только в присутствии определенных индукторов. Индукторами часто являются субстраты данного фермента, гормоны, лекарственные препараты, ксенобиотики и др. К числу индуцибельных ферментов, синтез которых стимулируют субстраты, относится цитохром Р450. Конститутивные ферменты — определенная часть ферментов, вырабатывающихся в организме человека постоянно, скорость синтеза которых избирательно не регулируется и не зависит от наличия соответствующих субстратов. Ковалентная модификация — это такой механизм быстрой регуляции, при котором происходит ковалентное присоединение определенной химической группы (фосфатной, метильной и др.) к молекуле фермента, приводящее к изменению ферментативной активности. Ковалентная модификация, как правило, обратима. Регуляция активности фермента по принципу отрицательной обратной связи — механизм быстрой регуляции, при которой конечный продукт метаболического пути является аллостерическим ингибитором первого (или определяющего скорость процесса) фермента этого пути. Эффекторы, или регуляторы — разнообразные по химической природе вещества, влияющие на активность ферментов и изменяющие скорость ферментативной реакции. 114 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТОЧНОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТКАНЕВЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ Вопросы для самоподготовки 1. Какие биохимические функции выполняют сывороточная ХЭ и АХЭ? 2. Какие вещества являются обратимыми и необратимыми ингибиторами холинэстераз? Каков механизмы их действия? 3. Какие функции выполняют тканевые дегидрогеназы? 4. Какие вещества являются обратимыми и необратимыми ингибиторами дегидрогеназ, механизм их действия? 5. Принципы методов определения активности ХЭ и дегидрогеназ. 6. Клинико-диагностическое значение определения активности холинэстераз и дегидрогеназ. 7. Принцип определения активности ферментов. 8. Методы определения активности ферментов. 9. Единицы активности ферментов. Методы определения активности ферментов По способу измерения скорости ферментативной реакции различают: 1. Измерение по конечной точке. При этом определяют содержание продуктов реакции в инкубационной среде после фиксированного времени инкубации и остановки ферментативной реакции. 2. Кинетическое измерение с непрерывным (многоточечным) измерением оптической плотности в ходе ферментативной реакции. 3. Двухточечное измерение. При этом способе выбирают линейный участок кривой, определяют оптическую плотность дважды — в начале измерения и в конце. 4. Измерение по начальной скорости, когда скорость реакции нелинейна и снижается во времени, так как возможна инактивация фермента во времени или продукты реакции влияют на ее скорость. По технике исполнения методы определения активности ферментов зависят от химической природы субстрата или продукта. 115 1. Спектрофотометрический метод Многие субстраты или продукты ферментативных реакций поглощают свет либо в видимой, либо в ультрафиолетовой области спектра. Принцип метода заключается в измерении концентрации субстрата или продукта на определенной длине волны по величине оптической плотности раствора. 2. Фотоколориметрический метод Позволяет измерить оптическую плотность окрашенного раствора, который поглощает свет в видимой области. Если субстрат или продукт ферментативной реакции сам не имеет окраски, то используется его химическая модификация с получением окрашенных производных (или добавляется вещество, дающее окрашенный комплекс с субстратом или продуктом). 3. Флюоресцентный метод Флавиновые соединения (а также НАД+) сильно флюоресцируют при воздействии на них светом определенной длины волны в окисленной форме и теряют эту способность при восстановлении. В методе часто используются специальные флюоресцентные метки и красители. Флюоресцентный метод позволяет существенно повысить чувствительность и расширить диапазон измерения по сравнению с оптическими методами измерения абсорбции. 4. Газометрический метод Используется для наблюдения за ходом реакций, в которых один из компонентов находится в газообразном состоянии. Наиболее современным является газометрический метод О. Варбурга, основанный на применении предложенного им аппарата с встроенным манометром для измерения давления газа. Метод используется для изучения оксидаз (поглощение О2), декарбоксилаз (выделение СО2) и др. 5. Титрометрический метод Титрометрический метод существует в алкалиметрическом или ацидометрическом варианте, то есть определении титра кислоты или щелочи, образовавшейся в ходе реакции. Например, один из методов определения активности ацетилхолинэстеразы основан на титровании количества уксусной кислоты, образовавшейся при ферментативном расщеплении ацетилхолина. 116 6. Поляриметрический метод Принцип метода основан на определении изменения удельного угла вращения плоскости поляризованного света в растворе по мере протекания ферментативной реакции. Реакция проводится в трубке поляриметра. Локализация и биологическая роль холинэстераз. Специфические факторы, влияющие на активность холинэстераз Различают два типа холинэстераз (ХЭ): ацетилхолинэстеразу (АХЭ, истинная ХЭ, холинэстераза I, КФ 3.1.1.7) и бутирилхолинэстеразу (БуХЭ, сывороточная ХЭ, псевдохолинэстераза, холинэстераза II, КФ 3.1.1.8). Ферменты являются простыми белками, относятся к классу гидролаз и подклассу эстераз. Ацетилхолинэстераза содержится преимущественно в нервно-мышечных синапсах скелетной мускулатуры, центральной нервной системе и в эритроцитах. Ацетилхолинэстераза катализирует расщепление ацетилхолина на одноатомный азотсодержащий спирт холин и уксусную кислоту. Ацетилхолин участвует в передаче нервных импульсов в качестве химического медиатора в синапсах центральной и периферической нервной системы, выделяясь в синаптическую щель в момент проведения импульса. Ацетилхолинэстераза играет ключевую роль в процессах нейрогуморальной и синаптической передачи: в холинэргических синапсах АХЭ катализирует гидролиз ацетилхолина (рис. 5) и тем самым прекращает воздействие этого медиатора на холинорецептор, отвечающий за проницаемость постсинаптической мембраны для ионов. Его ферментативное расщепление необходимо для подготовки постсинаптической мембраны к проведению следующего нервного импульса. Ацетилхолинэстераза нервной ткани связана с наружной стороной постсинаптической мембраны, состоит из однородных глюкопротеиновых субъединиц, чаще из четырех. Система «ацетилхолин-холинэстераза» участвует в регуляции возбудимости и сократимости гладкой и сердечной мышц, в осуществлении процессов активного и пассивного переноса ионов через мембраны. Сывороточная ХЭ (псевдохолинэстераза) находится в сыворотке (плазме) крови, печени, гладкой мускулатуре, поджелудочной же117 лезе, слизистой оболочке кишечника, легких и других органах. Сывороточная ХЭ синтезируется в печени в наибольшем количестве и выходит в кровь, поэтому ее содержание в крови отражает белок-синтезирующую функцию печени. Возможно, что постоянное присутствие чрезвычайно активной ХЭ в плазме крови является защитным приспособлением и предотвращает распространение по тканям ацетилхолина при его попадании в кровяное русло. Показано, что в небольших количествах ХЭ содержится и в центральной нервной системе. Существует предположение, что роль ХЭ (псевдохолинэстеразы) нервной системы сводится к защите АХЭ от угнетающего действия таких эфиров холина, которые практически не разрушаются АХЭ, но могут образоваться в организме (пропионилхолин, бутирилхолин, валерилхолин и др.), а ХЭ их разрушает. Возможно также, что в отдельных участках мозга могут создаваться ненормально высокие концентрации ацетилхолина, избыток которого тормозит АХЭ, но не влияет на активность ХЭ, которая его разрушает. На активность фермента могут влиять специфические факторы: ингибиторы и активаторы. К специфическим необратимым ингибиторам ацетилхолинэстеразы относятся фосфорорганические соединения (ФОС) — эфиры кислот фосфора (фосфорной, пирофосфорной, фосфористой, фосфоновой, фосфиновой, тио- и дитиофосфорной, тиофосфористой) и их сернистые, азотистые и другие производные. ФОС нашли применение как инсектициды (метафос, меркаптофос, хлорофос, карбофос, фосдрин, лептофос и др.), а также как лекарственные препараты (хлорофтальм, фосфакол, армин и т.д.). Наиболее токсичные представители группы ФОС — это боевые отравляющие веществ (зарин, зоман, табун) нервно-паралитического действия. Результатом действия ингибиторов ацетилхолинэстеразы является накопление ацетилхолина в синаптической цели, что приводит к повышению интенсивности мышечного сокращения вплоть до перехода в судорожное, и может наступить летальный исход от удушья вследствие спазма мышц гортани. Антагонисты ФОС, способные восстанавливать активность холинэстераз путем дефосфорилирования молекулы инактивированного фермента, получили название реактиваторов холинэстераз. По характеру своего фармакологического действия они являются антидотами ФОС. Восстанавливая активность холинэстераз в ор118 ганах, функция которых была нарушена в результате прекращения гидролиза синаптического ацетилхолина, реактиваторы холинэстераз способствуют восстановлению синаптической передачи. К реактиваторам холинэстераз принадлежат оксимы (RR1C == N—OН), содержащие четвертичные ониевые группы (пралидоксим йодид, пралидоксим хлорид, дипироксим, тримедоксим, токсогонин и др.), и оксимы, не содержащие четвертичных ониевых групп (моноизонитрозоацетон, изонитрозин, диэтиксим и др.). При проведении специфической антидотной терапии ведется постоянный контроль активности холинэстеразы. К обратимым ингибиторам АХЭ относятся: четвертичные аммониевые основания (лекарственные препараты: прозерин, эдрофоний, пиридостигмин, амбенония хлорид) и третичные аммониевые основания (физостигмин, галантамин, ипидакрин); гетероциклические соединения, содержащие третичный или четвертичный атомы азота. Ингибиторы холинэстеразы используются для лечения заболеваний ЦНС воспалительного и дегенеративного характера. При миастении (повышенная утомляемость и слабость скелетных мышц в результате нарушения нервно-мышечной передачи) применяют ингибиторы холинэстеразы: неостигмина метилсульфат, пиридостигмина бромид, амбенония хлорид. Эти лекарственные средства при миастении за счет ингибирования АХЭ и как следствие повышения концентрации ацетилхолина в синаптической щели увеличивают объем движений, мышечную силу, двигательную активность, жизненную емкость легких и др. Ингибиторы холинэстеразы применяют при атонии гладких мышц пищевода, кишечника, мочевого пузыря и др. Также ингибиторы холинэстеразы применяют для устранения миопаралитического действия антидеполяризующих миорелаксантов. Активируют ацетилхолинэстеразу ионы кальция и магния. Методы количественного определения сывороточной холинэстеразы Чаще всего методы химического определения холинэстеразной активности в крови основаны на определении скорости образования уксусной кислоты — то есть одного из продуктов реакции (см. рис. 5), и различаются по способам этого определения. 119 Методы делятся на титриметрические, колориметрические и спектрофотометрические. Существует экспресс-метод определения активности ХЭ в сыворотке крови с использованием индикаторных тест-полосок. В них имеется зона, пропитанная раствором ацетилхолина и индикатора, меняющая цвет в зависимости от рН среды. После контакта сыворотки и с индикаторной бумагой под влиянием ХЭ наступает гидролиз ацетилхолина и высвобождается уксусная кислота, которая изменяет рН и цвет индикатора. Реакция должна длиться до тех пор, пока рН не достигнет определенного уровня, а соответствующий этому цвет индикаторной бумаги не станет таким же, как цвет эталона. Мерой активности ХЭ является время (мин), на протяжении которого произошло изменение цвета индикаторной бумаги. Стационарные методы определения холинэстераз также основаны на измерении количества образовавшейся уксусной кислоты титрометрически с использованием рН-метра, фотоколориметрически с использованием индикатора, интенсивность окраски которого зависит от количества уксусной кислоты. Фотоколориметрический метод определения активности сывороточной холинэстеразы Цель работы. Освоить метод определения активности холинэстеразы; изучить действие на активность холинэстеразы ингибиторов и активаторов. Принцип метода: основан на смещении рН буферного раствора уксусной кислотой, образующейся в результате гидролитического ферментативного расщепления ацетилхолина, что устанавливают с помощью индикатора. Схема реакции (рис. 5). Cl– CH3COOCH2CH2N+ (CH3)3 + H2O Cl– CH3COOH + НOCH2CH2N+(CH3)3 Ацетилхолинхлорид Уксусная кислота Холинхлорид Рис. 5. Схема реакции гидролиза ацетилхолина 120 Реактивы и оборудование: 1) боратный буфер, рН 8,4; 2) ацетилхолинхлорид 3% раствор; 3) индикатор фенолрот; 4) кальций хлорид — 0,1 н. раствор; 5) карбофос — 1% раствор; 6) дистиллированная вода; 7) термостат 37 °С; 8) пробирки для реактивов; 9) штативы для пробирок; 10) фотоэлектроколориметр; 11) автоматические дозаторы с фиксированным/переменным объемом. Ход работы. В 4 пробирки отмеривают по 0,1 мл сыворотки крови (источник фермента), добавляют по 1 мл боратного буферного раствора рН 8,4. Затем в соответствии с таблицей в пробирки добавляют дистиллированную воду, СаС12 и карбофос, перемешивают содержимое пробирок встряхиванием и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Через 5 мин в пробирки № 2, 3, 4 добавляют по 0,5 мл ацетилхолина и помещают все пробы в термостат при 37 °С на 15 мин. Исследование проводится в соответствии с данными табл. 15. Результаты работы заносят в табл. 16 и записывают вывод. После инкубации в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл дистиллированной воды и по 50 мкл раствора индикатора. Затем пробы колориметрируют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (λ = 540 нм) в кюветах с толщиной слоя жидкости 10 мм, в качестве контроля используют дистиллированную воду. Результаты измерений вносят в табл. 16. Из показателей оптической плотности стандартной (1) пробы вычитают значения оптичеТаблица 15 Ход работы по изучению влияния карбофоса и ионов кальция на активность сывороточной холинэстеразы Реагенты, мл № пробирки 1 2 3 4 Сыворотка 0,1 0,1 0,1 0,1 Буфер 1,0 1,0 1,0 1,0 Вода дист. 1,0 0,5 – – СаС12 – – 0,5 – Карбофос – – – 0,5 Ацетилхолин – 0,5 0,5 0,5 121 Таблица 16 Результаты исследования действия карбофоса и ионов кальция на сывороточную холинэстеразу Показатели № пробирки Опт. плотность, D Разность опт. плотностей D1 D1–D2 D1–D3 D1–D4 Активность ХЭ, моль/(л·ч) 1 2 3 4 ской плотности опытной (2, 3, 4). Рассчитывают активность ХЭ по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика используют разведения 0,1 н. уксусной кислоты с ее содержанием в пробе от 4 до 18 мкмоль в пробе, что соответствует активности ХЭ от 80 до 360 ммоль/(л∙ч). Активность ХЭ в сыворотке в норме составляет 160–340 ммоль/(л∙ч). Вывод: ________________________________________________ ______________________________________________________ Клиническое значение определения активности сывороточной ХЭ Анализ холинэстераз, особенно сывороточного фермента, имеет большое диагностическое значение. Активность ХЭ в группе здоровых лиц колеблется в широких пределах, но у одного и того же человека она довольно постоянна. Отчетливое снижение активности ХЭ в сыворотке крови отмечается при заболеваниях печени, связанных с нарушением синтеза холинэстеразы, или при генетически обусловленном варианте врожденной недостаточности фермента, а также при отравлении фосфорорганическими инсектицидами и другими ФОС. Проведение мониторинга ХЭ обязательно для людей, работа которых связана с производством отравляющих веществ, получением, 122 использованием и транспортировкой инсектицидов, пестицидов и лекарственных препаратов — ингибиторов фермента. Метод может быть использован для выявления признаков и оценки тяжести острого и хронического отравления ФОС, для контроля эффективности патогенетической терапии интоксикаций. Угнетение активности ХЭ в сыворотке крови наступает при низких дозах яда и выявляется значительно раньше других симптомов интоксикации. Поскольку активность сывороточной ХЭ отражает белоксинтетическую функцию печени, ее определение может проводиться с целью выявления действия гепатотропных ядов. Определение ХЭ необходимо у пациентов в предоперационный период для выявления у них атипичных форм фермента. Нормальные формы сывороточной ХЭ быстро гидролизуют используемый в анестезии миорелаксант сукцинилхолин, который вызывает кратковременную задержку дыхания. Атипичные формы фермента гидролизуют сукцинилхолин медленно, и это может привести к длительному апноэ. Анализ ХЭ позволяет контролировать в крови обследуемых лиц уровень ряда ее ингибиторов, в число которых входят лекарственные препараты, применяемые для лечения глаукомы, миастении, атонии мышц кишечника и др. Активность холинэстераз также снижена при применении миорелаксантов (при интубации больных), при гипотиреозе, бронхиальной астме, суставном ревматизме, ожогах, онкологических заболеваниях. Количественное определение активности тканевых дегидрогеназ и изучение действия их ингибиторов Непосредственным источником энергии, необходимой для процессов жизнедеятельности, являются химические вещества: глюкоза, аминокислоты, жирные кислоты и другие органические соединения. Внутримолекулярная энергия этих веществ освобождается при их окислении, которое в биологических условиях происходит путем дегидрирования углеводов, липидов и аминокислот и катализируется субстратспецифичными ферментами — дегидрогеназами, относящимися к классу оксидоредуктаз. Коферменты дегидрогеназ — никотинамидадениндинуклеотид и флавинадениндинуклеотид (НАД+, НАДФ+, ФАД), выполняют функции акцепторов водорода, отще123 пляемого при окислении субстрата, который далее поступает в цепь переноса электронов, где идет образование АТФ. Определение концентрации восстановленных акцепторов (коферментов) составляет основу многих методов количественного определения дегидрогеназной активности и проводится путем спектрофотометрических или фотоколориметрических измерений. Методы определения активности дегидрогеназ подразделяются на две основные группы. 1. Кинетические, базирующиеся на оптическом тесте Bapбypга (оптическом эффекте — появление нового пика на другой длине волны), связанном с превращением НАД+ в НАДН + Н+, и наоборот); при кинетическом методе определяют прирост оптической плотности за единицу времени (мин) на длине волны 340 нм или снижение оптической плотности на длине волны 260 нм; 2. Методы конечной точки — методы, в которых определяется количество образовавшегося продукта или потребляемого субстрата после фиксированного инкубационного периода. Коферменты НАДФ+ (НАД+) с апоферментом связаны непрочно и поэтому могут в клетке находиться как в связанном с апоферментом состоянии, так и быть отделенными от белковой части. Восстановление никотинамидных коферментов в процессе ферментативной реакции сопровождается появлением нового максимума поглощения в ультрафиолетовой части спектра. Оба кофермента — НАД+ (НАДФ+) до присоединения протона имеют полосу поглощения с максимумом при 260 нм, после восстановления кофермента в спектре НАД·H появляется вторая полоса поглощения с максимумом при 340 нм. Данный метод является специфичным, легко воспроизводимым и точным. Обычно именно он используется при работе с чистыми ферментами. ФАД прочно связан с белковой частью молекулы, поэтому методы определени ФАД-зависимых дегидрогеназ другие. По строению активного центра дегидрогеназы принадлежат к группе «тиоловых ферментов», каталитическое действие которых обусловлено сульфгидрильными (тиоловыми) НS-группами, входящими в состав активного центра молекул фермента или ответственными за поддержание каталитически активной конформации. Поэтому ингибиторами дегидрогеназ являются вещества, блокирующие 124 HS-группы (тиоловые яды). К ним относятся окисляющие, меркаптидобразующие алкилирующие вещества, такие, например, как пероксид водорода (окислитель), хлорид кадмия и другие соли тяжелых металлов (соли Hg, Pb, Ag, Cu — меркаптидобразующие агенты), йодуксусная кислота (алкилирующий агент). Ингибирование протекает по уравнению реакций 1, 2, 3: S SH 1. Белок < + H2O2 Белок < + 2H2O. SH S 2. а) белок — SH + CdCl2 Белок — S — Cd — Cl + HCl; б) белок — S — Cd — Cl + Белок — SH Белок — S — Cd—S — Белок + НСl. 3. Белок — SH + IСН2СООН Белок — S — СН2СООН + HI. Метод определения активности дегидрогеназ может быть использован в клинических и гигиенических исследованиях при производственных и пищевых отравлениях окислителями, солями тяжелых металлов, алкилирующими агентами. Активность дегидрогеназ определяется при экспериментальных и клинических исследованиях, направленных соответственно либо на изучение биохимических механизмов действия на организм химических и физических факторов среды (ионизирующая и ультрафиолетовая радиация, шум, вибрация), либо на выявление признаков интоксикаций и других заболеваний. Количественное определение активности дегидрогеназы янтарной кислоты (сукцинатдегидрогеназы, КФ 1.3.99.1) тетразолиевым методом Цель работы: освоить метод количественного определения сукцинатдегидрогеназы. Исследовать действие ингибиторов на ее активность (УИРС). Принцип метода. В результате окисления янтарной кислоты образуется фумаровая кислота и восстановленный ФАД (рис. 6). Кофермент ФАД прочно связан с тканевой дегидрогеназой, то есть плохо экстрагируется, поэтому для определения количества образовавшегося ФАД·2Н используется соль тетразолия. Водород, отщепляемый от субстрата дегидрогеназой, восстанавливает бесцветную соль тетразолия в яркоокрашенное соединение 125 COOH COOH СН2 ФАД СН Фад-2Н СН2 СН Сукцинатдегидрогеназа COOH Янтарная кислота COOH Фумаровая кислота Рис. 6. Окисление янтарной кислоты формазан. Образующаяся окраска экстрагируется растворителем и ее интенсивность определяется фотоколориметрически. Для исследования используется навеска определенной ткани животного, содержащая фермент сукцинатдегидрогеназу. Навеска помещается в пробирку, к ней добавляют буфер, субстрат (сукцинат), окисленный ФАД, соль тетразолия. Пробу ставят на инкубацию в термостат, затем проводят определение оптической плотности образовавшегося формазана. Активность фермента характеризуется величиной оптической плотности раствора формазана, эквивалентного количеству (моль) отщепленного от субстрата водорода ферментом (ФАД·2Н) за 1 с в расчете на 1 г ткани, то есть катал на 1 г ткани. Данные анализа и выводы: ________________________________ ______________________________________________________ ______________________________________________________ ______________________________________________________ ______________________________________________________ ______________________________________________________ Определение общей активности лактатдегидрогеназы (КФ 1. 1. 1. 27) и ее изоферментов Лактатдегидрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза) — гликолитический (цитозольный цинкосодержащий) фермент (молекулярная масса 135 000 Д), обратимо катализирующий окисление L-лак126 СН3СНОНСООН + НАД+ Лактат СН3СОСООН + НАДН · Н+ Лактатдегидрогеназа Пируват Рис. 7. Схема реакции тата в пировиноградную кислоту. Окисленный НАД+ используется в качестве кофермента и является акцептором водорода (рис. 7). Фермент широко распространен в организме человека. По степени убывания активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько различных изоферментов, обладающих одинаковыми каталитическими свойствами. Каждый из изоферментов представляет собой тетрамер, образованный субъединицами Н (heart) и М (muscle). Полипептидная цепь обеих субъединиц содержит 330 аминокислотных остатков; различия в их последовательности в субъединицах обнаружены на протяжении более чем 25% длины полипептидной цепи. Свойства ферментов ЛДГ определяются особенностями входящих в них субъединиц. Изменения в строении белковой части изоферментов обусловливают их различные физико-химические свойства, в частности, неодинаковую электрофоретическую подвижность. В плазме (сыворотке) крови выявлено пять изоферментов лактатдегидрогеназы, они располагаются в геле в порядке убывания электрофоретической подвижности: ЛДГ1 (HHHH) — 14–26%, ЛДГ2 (НННМ) — 29–39%, ЛДГ3 (ННММ) — 20–26%, ЛДГ4 (НМММ) — 8–16%, ЛДГ5 (ММММ) — 6–16%. Субъединица М обнаруживается главным образом в тканях с анаэробным метаболизмом, в то время как субъединица Н присутствует в тканях с преобладанием аэробных процессов. Изофермент ЛДГ1 осуществляет окисление лактата в пируват в тканях с аэробным типом метаболизма (миокард, мозг, почки, эритроциты, тромбоциты), а ЛДГ5, напротив, пирувата в лактат в тканях с высоким уровнем гликолиза (скелетные мышцы, печень). Шестой изофермент лактат127 дегидрогеназы (ЛДГ-Х) встречается в яичках взрослых особей наряду с пятью изоферментами, которые обнаруживаются в других тканях. ЛДГ-Х является тетрамером, состоящим из 4 идентичных Х-субъединиц, которые отличаются по аминокислотному составу от Н- и М-субъединиц. Этот изофермент, видимо, связан со сперматогенезом, так как 80% активности лактатдегидрогеназы сперматозоидов обусловлено этим изоферментом. Определение общей активности ЛДГ проводится кинетическим методом или методом «по конечной точке». Для изучения изоферментного спектра лактатдегидрогеназы используются способы, базирующиеся на: • фракционировании методом зонального электрофореза или хроматографии (изоферменты ЛДГ нумеруются соответственно электрофоретической подвижности по отношению к аноду) с последующим окрашиванием фракций и денситометрическим учетом картины разделения; • дифференцированном неселективном и селективном ингибировании изоферментов ЛДГ: пируватом (ЛДГ1 более чувствительна к его влиянию, чем ЛДГ5), лактатом, оксалатом (больше ингибирует ЛДГ1, чем ЛДГ5), мочевиной (инактивирует ЛДГ5); • различии в тепловой стабильности изоферментов ЛДГ; • применении антител (к ЛДГ1 и ЛДГ5): иммунохимические тесты и некоторые другие. Клиническое значение определения активности лактатдегидрогеназы В связи с тем, что фермент ЛДГ содержится практически во всех тканях, констатация повышения общей активности лактатдегидрогеназы не имеет большого значения для дифференциальной диагностики заболеваний внутренних органов. Активность ЛДГ в сыворотке крови возрастает у больных, страдающих анемией, обширным карциноматозом, лейкозами, лимфомой, вирусным и невирусным гепатитом, обтурационной желтухой, циррозом печени, различными заболеваниями почек, опорно-двигательного аппарата, инфарктом миокарда и легкого, а также при любом другом повреждении клеток, приводящем к цитолизу (этот фер128 мент, широко представленный в тканях организма, легко переходит в плазму крови при некробиотических процессах в клетках). Относительная активность изоферментов ЛДГ4 и ЛДГ5 повышена у всех больных инфекционным гепатитом в первые 10 сут. Характерно, что степень повышения не зависит от тяжести заболевания. После наступления клинического выздоровления у трети пациентов увеличение относительной активности ЛДГ4 и ЛДГ5 является единственным показателем, свидетельствующим о незаконченном восстановительном процессе в печени. У больных с инфарктом миокарда активность изофермента ЛДГ1 в сыворотке крови повышается через 8–10 ч после начала болевого приступа, достигает максимума через 24–28 ч, остается увеличенной на протяжении первой недели заболевания, нормализуясь к 8–9-м суткам. Ценность данного теста особенно велика в неясных случаях заболевания, при нетипичной клинической и электрокардиографической картине инфаркта миокарда. К увеличению общей активности ЛДГ приводят прием алкоголя, кофеина, введение анаболических стероидов, тестостерона, обезболивающих препаратов, дикумарина, хинидина, сульфаниламидов, кодеина, клофибрата, мисклерона, гипоксическое состояние. Существуют две группы причин, обусловливающих снижение активности фермента в крови и тканях. Одна из них связана с наличием ингибитора в сыворотке (плазме) крови, вторая — с генетическими нарушениями. Тестовые задания Выберите правильный ответ. 1. Тип ингибирования, при котором избыток субстрата вытесняет ингибитор из активного центра фермента, называется: а) неконкурентное обратимое; б) неконкурентное необратимое; в) конкурентное обратимое; г) конкурентное необратимое. 2. Конкурентное обратимое ингибирование сукцинатдегидрогеназы вызывает: а) сукцинат; б) фумарат; 129 в) пируват; г) малонат. 3. Конкурентным обратимым ингибитором ацетилхолинэстеразы является витамин: а) В1; б) В5; в) В3; г) В6. 4. Конкурентное обратимое ингибирование ацетилхолинэстеразы вызывает: а) Pb(NO3)2; б) +N(CH3)4; в) KMnO4; г) JCH2COO. 5. Необратимое специфическое ингибирование холинэстераз вызывают: а) окислители; б) соли свинца; в) фторфосфаты; г) монойодацетат. 6. Низкая активность сывороточной холинэстеразы наблюдается при нарушении белковосинтетической функции: а) почек; б) сердца; в) печени; г) легких. 7. Вещества, которые защищают ферменты от инактивации и (или) восстанавливают утраченную активность, называются: а) протекторы; б) провитамины; в) проферменты; г) прооксиданты 8. Активация ферментов путем ограниченного протеолиза происходит за счет отщепления от молекулы фермента: а) ортофосфорной кислоты; б) простетической группы; в) небольшого пептида; г) углеводного фрагмента. 130 9. Регуляция активности ферментов путем ковалентной модификации осуществляется за счет реакции: а) декарбоксилирования; б) фосфорилирования; в) дезаминирования; г) гидроксилирования. 10. Аллостерическая регуляция активности ключевых ферментов метаболических путей по принципу отрицательной обратной связи осуществляется: а) исходным субстратом; б) вторичным посредником; в) конечным метаболитом; г) диссоциацией фермента. 11. Необратимое ингибирование возникает, если ингибитор присоединяется к ферменту связями: а) ковалентными; б) ионными; в) водородными; г) гидрофобными. 12. Активатором ацетилхолинэстеразы (АХЭ) являются ионы: а) натрия; б) бария; в) магния; г) калия. 13. Низкая активность сывороточной холинэстеразы наблюдается при отравлении: а) гидразином; б) дихлофосом; в) солями свинца; г) этиленгликолем. 14. Низкая активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы эритроцитов наблюдается при отравлении: а) гидразином; б) дихлофосом; в) окислителями; г) этиленгликолем. 131 15. Относительная активность изоферментов ЛДГ4 и ЛДГ5 повышена при: а) инфекционном гепатите; б) инфаркте миокарда; в) остром панкреатите; г) гемолизе эритроцитов. 16. Предшественником кофермента НАД является: а) витамин РР; б) витамин В1; в) витамин В2; г) витамин В6. 17. Снижение активности ХЭ в сыворотке крови отмечается при действии: а) окислителей; б) йодацетата; в) солей ртути; г) фосфонатов. 18. Снижение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы эритроцитов происходит при действии: а) цианидов; б) пестицидов; в) солей ртути; г) фосфонатов. 19. Дегидрогеназы относятся к классу: а) гидролаз; б) изомераз; в) оксидоредуктаз; г) трансфераз. 20. Холинэстеразы сыворотки и АХЭ относятся к классу: а) гидролаз; б) изомераз; в) синтетаз; г) трансфераз. Ответы на тестовые задания 1—в 2—г 3—а 132 4—б 5—в 6—в 7—а 8—в 9—б 10 — в 11 — а 12 — в 13 — б 14 — в 15 — а 16 — а 17 — г 18 — в 19 — в 20 — а 133 Тема 10 БЕЛКИ И ФЕРМЕНТЫ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ И БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ. ЭНЗИМОТЕРАПИЯ Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: практическое занятие (решение ситуационных задач). Место проведения: аудитории кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 180 мин. Актуальность/мотивация. Знания, полученные на занятии, необходимы врачу лечебного профиля в практической диагностической работе. Ситуационные задачи, составленные на базе биохимических анализов пациентов клиник, дают возможность работать с результатами лабораторного обследования пациента, позволяя сформулировать предварительный диагноз. Цели занятия Образовательная цель. Научить обучающихся самостоятельно анализировать данные специальной и справочной литературы по диагностическому использованию белков и ферментов, формулировке предварительного диагноза. Воспитательная цель. Воспитание у обучающихся навыков: • ответственного отношения к выполняемой работе; • аргументированного обоснования своей точки зрения и уважительного отношения к мнению коллег; • культуры поведения и коллективной профессиональной этики. 134 Развивающая цель. Развитие логического мышления, способности получать, анализировать, обобщать, интерпретировать и передавать информацию в устной и письменной формах. Формирование широкого профессионального кругозора. Формируемые компетенции: изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-1, ОК-8), общепрофессиональных и профессиональных (ОПК-2, ОПК-7, ПК-5, ПК-21) компетенций. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • строение и биологическую роль ферментов; • спектр ферментов крови для диагностики заболеваний; • изоферменты и их диагностическое значение; • применение ферментов в качестве лекарственных препаратов; • механизмы ингибирования ферментов; • белки плазмы крови, их биологическую роль; • диагностическое использование протеинограмм; • принципы лабораторных методов определения активности ферментов в сыворотке крови; • принципы лабораторных методов определения показателя общего белка и отдельных фракций в сыворотке крови; • правила ведения дискуссии. Обучающийся должен уметь: • проводить сравнительный анализ показателей крови в норме и при заболеваниях, рассматриваемых в предложенной задаче, и выявлять на основе этих результатов патологические процессы; • обосновывать выбор оптимальных биохимических методов для обследования пациента, • объяснять молекулярные механизмы действия лекарственных препаратов — ингибиторов ферментов; • объяснять молекулярные механизмы действия ферментов в качестве лекарственных препаратов; • обсуждать и аргументировать свои заключения. 135 Обучающийся должен владеть: • способностью анализа биохимических показателей в биологических жидкостях для постановки диагноза; • навыками использования ферментов и белков с диагностической целью; • навыками изложения самостоятельной точки зрения. Внутрипредметные связи Энзимодиагностика, белки плазмы крови, энзимотерапия Белки Ферменты Типы ингибирования Биохимия крови Межпредметные связи Терапия Пропедевтика внутренних болезней Кардиология Клиническая фармакология Энзимодиагностика, белки плазмы крови, энзимотерапия Анатомия Физиология Биология Неорганическая и органическая химия Вопросы для самоподготовки 1. Белки плазмы крови, их роль в организме. 2. Принцип метода разделения белковых фракций крови методом электрофореза. 3. Характеристика отдельных фракций белков крови (альбумины, глобулиновые фракции). Роль в организме. Причины изменения содержания в крови отдельных белковых фракций. 4. Белки острой фазы, состав, диагностическое значение. 136 5. Транспортные белки крови (альбумин, церулоплазмин, гаптоглобин, трансферрин, гемопексин). 6. Характеристика изменения протеинограмм при различных заболеваниях. 7. Понятие об индикаторных, секреторных и экскреторных ферментах сыворотки крови, их использование в диагностике заболеваний. 8. Изоферменты. Их диагностическое значение. 9. Энзимотерапия — использование ферментов в качестве лекарственных препаратов. 10. Ингибиторы ферментов. Виды ингибирования. 11. Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов. 12. Принципы современных технологий создания ферментных лекарственных препаратов (иммобилизованных ферментов). Задание для самоподготовки 1. Изучить рекомендуемую литературу, используя вопросы и тестовые задания для самоподготовки. Рекомендуемая литература Основная: 1. Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 118–124, 682–687. 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (раздел 2, темы 9, 10). Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия: учебник. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 163–168, 567–579. 2. Долгов В. В., Козлов А. В., Раков С. С. Лабораторная энзимология. — СПб.: Витал Диагностикс СПб., 2002. —160 с. 3. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. 137 Электронный ресурс: 1. Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http:// www.studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 2, п. VIII– IX, раздел IVX, п. IV). 2. http://studopedia.org 3. http://window.edu.ru 4. http://studFiles.net 5. http://biohimist.ru 6. http://biohimist.ru Ситуационные задачи Задача № 1 В отделение скорой помощи поступили три пациента с жалобами на боли в абдоминальной области. Результаты биохимического исследования позволили сформировать следующие спектры изменения активности ферментов крови: Пациент № 1 АЛТ >> АСТ >> ГлДГ >> КК >> α-амилаза Пациент № 2 КК >> АСТ >> АЛТ >> α-амилаза >> ГлДГ Пациент № 3 α-Амилаза >> АЛТ >> АСТ >> ГлДГ >> КК Вопросы: 1. Сравните ферментативные спектры. 2. О заболеваниях каких органов может идти речь при наличии данных ферментных спектров крови пациентов? 3. Объясните, почему спектры, характеризующие разные заболевания, имеют сходный состав, но различную последовательность ферментов в указанных рядах? 4. Что такое индикаторные ферменты? 5. Какие реакции катализируют данные ферменты? Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 118–124, 682–687. 138 Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 163–168, 567–579. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 2, п. VIII–IX, раздел 14, п. IV). Задача № 2 Больной А. жалуется на резкие опоясывающие боли в подложечной области. При исследовании ферментов крови оказалось, что активность амилазы равна 450 МЕ/л, липазы — 160 Ед/л. Больной Б. предъявляет те же жалобы, но активность амилазы в крови равна 18 МЕ/л, а липазы — 6 Ед/л. Вопросы: 1. Сравните биохимические показатели с нормой. 2. О патологии какого органа можно подумать в этих случаях? 3. Какие реакции катализируют исследуемые ферменты? 4. Чем объяснить различия в изменении активности амилазы и липазы крови у данных больных? 5. Почему необходимо определять активность двух ферментов в диагностике данного заболевания? Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 102, 118–124, 355, 374. Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 163–168, 567–579. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. 139 Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 2, п. VIII–IX, раздел 14, п. IV). Задача № 3 В клинической практике для повышения точности постановки диагноза кроме общей активности фермента определяют и активность отдельных изоферментных форм. Вопросы: 1. Что такое изоферменты? 2. Охарактеризуйте изоферментные спектры лактатдегидрогеназы (ЛДГ). 3. Дайте характеристику изоферментам аспартатаминотрансферазы (АСТ). 4. Расскажите об изоферментах креатинкиназы (КК) различных органов и тканей. 5.Какое значение имеет определение изоферментных спектров крови для дифференциальной диагностики заболеваний различных органов? Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 118–124. Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп — М.: Медицина, 1998. — С. 163–168, 567–579. 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (раздел 2, темы 9, 10). 3. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. 140 Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 2, п. VIII–IX, раздел 14, п. IV). Задача № 4 У рабочего полиграфического производства, имеющего контакт со свинцом, при поступлении на работу были следующие показатели активности ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы — 2850 Ед/л эритроцитов, лактатдегидрогеназы — 3200 Ед/л эритроцитов. Через 4 года во время ежегодного медицинского осмотра у него оказались следующие показатели активности ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы — 2090 Ед/л эритроцитов, лактатдегидрогеназы — 2500 Ед/л эритроцитов. Вопросы: 1. Сравните биохимические показатели с нормой. 2. Какие особенности строения дегидрогеназ вы знаете? 3. Какие вещества являются ингибиторами дегидрогеназ? Каковы возможные механизмы интоксикации на данном производстве? 4. Какие вещества являются протекторами при действии тиоловых ядов? 5. Оцените состояние рабочего и сделайте вывод о том, может ли он продолжать работу на данном производстве? Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 118–124, 355, 374. Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 143–168. 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павло141 вой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (раздел 2, темы 8, 9). Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 2, п. VIII–IX, раздел 14, п. IV). Задача № 5 Для диагностики инфаркта миокарда (ИМ) большое значение имеют время появления кардиомаркеров в сыворотке крови и время их выведения. В табл. 17 приведены результаты исследований трех пациентов, проведенных в разные временные интервалы. Используя материал учебника и дополнительный материал, ответьте на вопросы. Таблица 17 Результаты биохимического обследования пациентов Пациент Результаты анализа крови Время после приступа болей 1 Миоглобин — ↑ ­ , тропонины Т и I — норма, КК — норма, АСТ и ЛДГ — норма 2 часа 2 Миоглобин — норма, тропонины Т и I — ↑ ­ , КК — норма, АСТ — ↑ ­ , ЛДГ — ↑ ­ ­↑ 3 дня 3 Миоглобин — ↑ ­ , тропонины Т и I — ↑ ­ , КК — ­↑, АСТ — ↑ ­ , ЛДГ — чуть выше нормы 14 часов Вопросы: 1. Охарактеризуйте маркеры, используемые в диагностике ИМ. 2. Нарисуйте график динамики присутствия кардиомаркеров в сыворотке крови при ИМ. 3. Сравните кардиомаркеры по специфичности выявления ИМ. 4. Сравните результаты биохимического исследования крови трех пациентов, учитывая время повышения и время возвращения к норме различных кардиоиаркеров. 5. Выберите соответствующий диагноз и обоснуйте ваш выбор: 1) инфаркт миокарда; 2) миозит; 3) стенокардия; 4) вероятность инфаркта исключить нельзя. 142 Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 118–124. Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 163–168, 567–579. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 2, п. VIII–IX, раздел 14, п. IV). Задача № 6 В случаях острого инфаркта миокарда, тромбоэмболии легочной и периферических артерий, сосудов мозга, непроходимости центральной артерии сетчатки глаза показаны фибринолитические препараты, такие как стрептокиназа и стрептодеказа (I поколение препаратов), алтеплаза (II поколение), тенектеплаза (III поколение). Вопросы: 1. Какова природа и происхождение стрептокиназы и стрептодеказы? Что такое иммобилизованные ферменты? 2. Что такое фибрин, в ходе какого процесса он образуется? 3. Какие сложности возникают при назначении стрептокиназы? 4. Что положено в основу технологии получения препаратов II и III поколений? 5. Объясните механизм действия этих препаратов. Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 118–124. 143 Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 122, 567–579, 668–669. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 2, п. VIII–IX, раздел 14, п. IV). Задача №7 Большой спектр лекарственных препаратов оказывает свой эффект через изменение активностей ферментов различных метаболических путей в организме, например, при лечении острого панкреатита назначают препарат котрикал иди его аналоги, для уменьшения отеков назначают диакарб, как гемостатическое средсво применяется парааминометилбензойная кислота (ПАМБА). Используя предложенную литературу, ответьте на вопросы. Вопросы: 1. Какое действие на ферменты объединяет все эти препараты? 2. Объясните механизм и эффект действия парааминометилбензойной кислоты (ПАМБА). 3. Объясните механизм и эффект действия контрикала. 4. Объясните механизм и эффект действия диакарба. 5. Используя материалы занятий по теме «Витамины», «Ферменты» расскажите о механизме действия ряда сульфаниламидных препаратов. Рекомендуемая литература Основная: 1. Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 101–106, 118–124, 488–489. Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 122, 567–579, 668–669. 144 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 14, п. IV, раздел 6, раздел 2, п. VIII–IX). Задача № 8 Энзимотерапия — это лечение заболеваний с использованием ферментов в качестве лекарственных препаратов. Вопросы: 1. Какую ферментотерапию можно рекомендовать в случаях воспалительных заболеваний дыхательных путей (трахеит, бронхит, пневмония и др.) с целью облегчения удаления вязких экссудатов и мокроты? 2. Какие ферменты используют при лечении гнойных ран, ожогов, трофических язв? 3. Чем объясняется действие данных препаратов? 4. Что такое заместительная терапия? 5. Приведите примеры заместительной терапии с использованием протеолитических ферментов. Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 118–124, 488–489. Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 122, 567–579, 668–669. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. 145 studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 2, п. VIII–IX, раздел 6, раздел 14, п. IV). Задача № 9 При анализе протеинограммы больного с жалобами на недомогание, слабость, боли в области сердца и отдельных суставах, температура 37,8° в течение недели установлено следующее распределение белковых фракций: альбумины — 43%, aα1-глобулины — 8,3%, aα2-глобулины — 12,5%, bβ-глобулины — 14,2%, gγ-глобулины — 22%. Общий белок крови — 70 г/л. Вопросы: 1. Сравните с нормой каждую фракцию. 2. О каком типе патологических изменений в организме можно думать? 3. Чем объяснить отклонения в белковых фракциях? 4. Что такое белки «острой фазы»? 5. Приведите примеры конкретных белков из этой группы и назовите их функции в организме? Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 669–673, 682–687. Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 122, 567–579, 668–669. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 14, п. IV). Задача № 10 При анализе протеинограммы рабочего, длительно контактирующего с четыреххлористым углеродом (СС14), установлено следующее 146 распределение белковых фракций: альбумины — 43%, aα1-глобулины — 4,9%, aα2-глобулины — 10,1%, bβ-глобулины — 17,3%, gγ-глобулины — 24,9%. Общий белок крови — 59 г/л. Вопросы: 1. Сравните с нормой результаты анализа. 2. При патологии какого органа наиболее часто встречается такое распределение белковых фракций? 3. Как можно объяснить изменения в содержании белковых фракций? 4. Какие ферменты плазмы крови необходимо исследовать для подтверждения диагноза? 5. Где синтезируются альбумины и какова их биологическая роль? Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — С. 669–673, 682–687. Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 122, 567–579, 668–669. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 14, п. IV). Задача № 11 У больного в крови повышена активность двух изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ-1, ЛДГ-2), появилась трансамидиназа. Общий белок крови — 56 г/л. Отношение альбуминов к глобулинам равняется 0,9. Протеинограмма плазмы крови больного: альбумины — 45%, aα1-глобулины — 5%, aα2-глобулины — 25%, bβ-глобулины — 15%, gγ-глобулины — 10%. В моче больного также появилась трансамидиназа, выявлена протеинурия. 147 Вопросы: 1. Сравните с нормой результаты анализа. 2. О патологии какого органа следует думать в данном случае? 3. Чем объясняется изменение содержания общего белка плазмы крови и такое распределение белковых фракций? 4. Чем объяснить появление в моче трансамидиназы? К какой группе диагностических ферментов она относится? 5. Расскажите о транспортных белках плазмы крови. Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 669–673, 682–687. Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 122, 567–579, 668–669. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 14, п. IV). Задача № 12 При анализе протеинограммы больного с жалобами на кашель с обильным отделением мокроты, некоторые признаки одышки, периодически повторяющиеся пневмонии в течение последних 5 лет установлено следующее распределение белковых фракций: альбумины — 41%, aα1-глобулины — 5,5%, aα2-глобулины — 15,4%, bβ-глобулины — 8,9%, gγ-глобулины — 29,2%. Общий белок крови в норме. Вопросы: 1. Сравните с нормой результаты анализа. 2. Для какого типа патологического состояния характерна данная протеинограмма? 3. Чем можно объяснить изменения в составе белковых фракций? 148 4. Расскажите о γ-глобулиновой фракции. 5. Что такое парапротеины? Рекомендуемая литература Основная: Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 669–673, 682–687. Дополнительная: 1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 122, 163–168, 567–579, 668–669. 2. Клиническая лабораторная диагностика: в 2 т. Т. 1 / под ред. В. В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. — 464 с. Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (раздел 14, п. IV). Биохимические показатели крови Название Нормы α-Амилаза 28–100 МЕ/л Липаза 13–60 Ед./л Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа 2300–3280 Ед./л эритроцитов Лактатдегидрогеназа 4000±1000 Ед./л эритроцитов Общий белок 65–85 г/л Альбумины 55–65% α1-Глобулины 2–5% α2-Глобулины 6–11% β-Глобулины 11–15% γ-Глобулины 15–22% Альбумины/Глобулины 1,5–2,3 149 Тестовые задания Выберите правильный ответ. 1. Острый панкреатит сопровождается ростом активности амилазы в крови в результате: а) перехода неактивной формы фермента в активную; б) усиленного синтеза фермента клетками поджелудочной железы; в) изменения проницаемости клеточных мембран и выхода фермента в кровь; г) компенсаторной выработки фермента другими органами. 2. Амилаза является индикаторным ферментом: а) печени; б) слизистой оболочки желудка; в) поджелудочной железы; г) сердечной мышцы. 3. АЛТ является индикаторным ферментом: а) печени; б) почек; в) поджелудочной железы; г) тонкого кишечника. 4. Трансамидиназа является индикаторным ферментом: а) печени; б) почек; в) поджелудочной железы; г) сердца. 5. Креатинкиназа является индикаторным ферментом: а) печени; б) почек; в) поджелудочной железы; г) сердца. 6. Секреторным ферментом является: а) креатинкиназа; б) аспартатаминотрансфераза; в) холинэстераза; г) α-амилаза (панкреатическая). 150 7. Экскреторным ферментом является: а) креатинкиназа; б) аспартатаминотрансфераза; в) холинэстераза; г) α-амилаза (панкреатическая). 8. Диагностически значимым при инфаркте миокарда является изменение изоферментного спектра крови: а) ЛДГ1,2, КК — ВВ; б) ЛДГ4,5, КК — МВ; в) ЛДГ5, КК — МВ; г) ЛДГ1,2, КК — МВ. 9. Ферментный спектр крови: КК >> АСТ >> АЛТ >> амилаза наблюдается при патологии: а) поджелудочной железы; б) печени; в) миокарда; г) почек. 10. Ферментный спектр крови: АЛТ >> АСТ >> амилаза >> КК наблюдается при патологии: а) поджелудочной железы; б) печени; в) миокарда; г) почек. 11. Ферментный спектр крови: амилаза >> АЛТ >> АСТ >> КК наблюдается при патологии: а) поджелудочной железы; б) печени; в) миокарда; г) почек. 12. Кардиомаркером является: а) холинэстераза; б) миозин; в) трансамидиназа; г) тропонин Т. 13. Кардиомаркером является: а) холинэстераза; б) креатинфосфаткиназа; 151 в) трансамидиназа; г) гемоглобин. 14. Ранним, но неспецифическим маркером острого инфаркта миокарда является белок: а) миозин; б) альбумин; в) миоглобин; г) гемоглобин. 15. Диспротеинемия: альбумины — снижены; глобулины α1 — повышены, aα2 — повышены незначительно, β и γ — в норме — соответствует: а) острому воспалительному процессу; б) нарушению почечной фильтрации; в) хроническому гепатиту; г) хроническому воспалительному процессу. 16. Хронический воспалительный процесс характеризуется следующим распределением белковых фракций крови: а) альбумины снижены, aα1-глобулины значительно повышены; б) альбумины снижены, все фракции глобулинов в норме; в) aα1-глобулины резко снижены; г) aα2- и gγ-глобулиновые фракции повышены. 17. Острый воспалительный процесс характеризуется следующим распределением белковых фракций крови: а) альбумины и глобулины снижены; б) альбумины снижены, aα1-глобулины значительно повышены; в) aα1-глобулины снижены; г) значительно снижены альбумины, глобулины в норме. 18. Белок крови, транспортирующий медь: а) С-реактивный белок; б) церулоплазмин; в) гаптоглобин; г) трансферрин. 19. Белок крови, транспортирующий железо: а) С-реактивный белок; б) церулоплазмин; в) гаптоглобин; г) трансферрин. 152 20. Белком «острой фазы» сыворотки крови является: а) альбумин; б) α1-антитрипсин; в) калликреин; г) кератин. Ответы на тестовые задания 1—в 2—в 3—а 4—б 5—г 6—а 7—г 8—г 9—в 10 —б 11 — а 12 — г 13 — б 14 — в 15 — а 16 — г 17 — б 18 — б 19 — г 20 — б 153 КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛАМ I–III СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ. ЭНЗИМОЛОГИЯ. ВИТАМИНЫ Контингент обучающихся: обучающиеся 2-го курса по специальности 31.05.01 «Лечебное дело». Вид занятия: практическое занятие. Место проведения: аудитории кафедры биологической и общей химии. Продолжительность занятия: 180 мин. Актуальность/мотивация. Необходимость контроля освоения компетенций. Знания, умения и навыки, полученные на занятиях по разделам I–III, а также самостоятельную внеаудиторную работу необходимо проверить и оценить, осуществив для этого контрольное собеседование по вопросам к коллоквиуму и проведя тестирование по изученным разделам. Цели занятия Образовательная цель. Осуществить контроль освоения компетенций. Проверить знания, умения и навыки по изученным разделам, эффективность внеаудиторной самостоятельной работы с помощью контрольно-оценочных средств (вопросов к коллоквиуму, тестирования, ситуационных задач). 154 Воспитательная цель. Воспитание у обучающихся навыков: • аргументированного обоснования своей точки зрения и уважительного отношения к мнению коллег; • культуры поведения и коллективной профессиональной этики. Развивающая цель. Развитие у обучающихся логического мышления, способности получать, анализировать, обобщать, интерпретировать и передавать информацию в устной и письменной формах; формировать широкий профессиональный кругозор, повышать интеллектуальный потенциал; мотивировать обучающихся к самообразованию, готовности к постановке предварительного диагноза. Конкретные задачи Обучающийся должен знать: • уровни организации белковых молекул, виды и механизмы осаждения белков; использование феномена денатурации и высаливания в медицине, в том числе в стоматологии; • строение, механизм действия ферментов, влияние специфических и неспецифических факторов на активность ферментов, регуляцию активности; • строение, роль водорастворимых витаминов, проявления недостаточности в организме и ротовой полости; использование витаминов водорастворимой группы в стоматологии; • использование белкового и ферментного спектров крови в диагностике; • причины изменения биохимических показателей по сравнению с нормой (ситуационные задачи). Обучающийся должен уметь: • пользоваться медико-биологической терминологией; • излагать материал по теме в понятной, убедительной, информативной речевой форме; • изучать и осваивать дополнительные информационные источники для самостоятельного решения учебных заданий и ситуационных задач; • интерпретировать данные лабораторных исследований при решении ситуационных задач. 155 Обучающийся должен владеть: • биохимической терминологией в рамках изученных тем; • навыками ведения дискуссий и грамотной публичной речи; • навыками самостоятельного формирования заключений (выводов) по вопросам нормы и патологии (ситуационные задачи). Формируемые компетенции: участие в коллоквиуме должно способствовать формированию общекультурных (ОК-1, ОК-8) и общепрофессиональных и профессиональных (ОПК-2, ОПК-7, ПК-5, ПК-21) компетенций. Задания для самоподготовки 1. Изучите основную и дополнительную литературу, используя вопросы для коллоквиума. 2. Решите тестовые задания по разделам I–III. 3. Решите ситуационные задачи по разделам I–III, используя основную и дополнительную литературу. Рекомендуемая литература Основная 1. Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — С. 10–118. 2. Белки. Ферменты. Витамины: учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов / под ред. Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой. — 4-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Изд-во ­СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2021. — 160 с. (разделы 1, 2, 3, темы 1–10). Дополнительная: Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998. — С. 19–95, 114–168, 204–210, 220–247. Электронный ресурс: Биохимия [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Е. С. Северина. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. — http://www. studmedlib.ru/book/ISBN 978-5-9704-3312-6 (разделы 1–3, 6, 14). 156 Вопросы для подготовки к коллоквиуму 1. Перечислите роль белков в организме. Первичная структура белковой молекулы: определение понятия, напишите фрагмент полипептидной цепи (задает преподаватель), характеристика пептидной связи, биологическая роль первичной структуры. Назовите аминокислоты, которые наиболее часто встречаются в первичной структуре полипептидных цепей коллагенов. 2. Вторичная структура белка: определение понятия, типы вторичной структуры, причины образования спиральной структуры (мо­ дель Полинга–Кори), причины нарушения спирализации, приводящие к формированию бета-структуры и неупорядоченных участков; связи, стабилизирующие вторичную структуру белка; биологическая роль. 3. Третичная структура белка: определение понятия и связи, стабилизирующие третичную структуру. Понятие о доменной организации белковой молекулы. Глобулярные и фибриллярные белки. Роль третичной структуры. 4. Четвертичная структура белка: определение понятия, стабилизирующие связи, примеры белков, имеющих четвертичную структуру. Особенности функционирования белков с таким уровнем организации (регулируемость, кооперативный эффект на примере оксигенации гемоглобина в сравнении с миоглобином). 5. Норма содержания общего белка в крови, причины гипо- и гиперпротеинемии. 6. Характеристика белковых растворов, условия, способствующие растворению белковых частиц. Использование диализа в медицине. 7. Факторы и механизм обратимого осаждения белков. Практическое использование метода высаливания в медицине. 8. Денатурация белков: определение понятия, денатурирующие факторы и механизмы их действия. Приведите примеры практического использования феномена денатурации в медицине. 9. Характеристика методов разделения белков, принципы, лежащие в основе методов разделения: электрофореза, хроматографии (в том числе гельфильтрации и аффинной хроматографии), ультрацентрифугирования, изоэлектрофокусирования. 157 10. Белки плазмы крови. Биологические функции альбуминов и разных фракций глобулинов, диагностическая роль (протеинограммы). 11. Ферменты: определение понятия, классификация и шифр ферментов (примеры). Строение простых ферментов: структурная организация молекулы, строение активного центра и его роль в ферментативном катализе, типы связей фермента с субстратом, виды специфичности ферментов (приведите примеры). Небелковые части сложных ферментов: кофакторы, коферменты, простетические группы (приведите примеры). Структурная организация регуляторных ферментов. 12. Сходство и различия между ферментами и неорганическими катализаторами. 13. Механизм действия ферментов. Начертите график хода реакции без фермента и в присутствии фермента. Объясните понятия энергетического барьера и энергии активации. Перечислите основные положения теории фермент-субстратного комплекса Михаэлиса–Ментен. Напишите основное уравнение ферментативного катализа. Представления теории Кошланда об индуцированном соответствии фермент-субстрат. 14. Кинетика ферментативных реакций. Начертите график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Константа Михаэлиса и ее практическое использование. 15. Влияние неспецифических факторов на активность ферментов: температуры (график), рН (график), ионной силы раствора. Практическое значение этих зависимостей. 16. Влияние специфических факторов на активность ферментов. Ингибиторы обратимые (конкурентные и неконкурентные) и необратимые. Покажите действие таких ингибиторов на примере дегидрогеназ и холинэстераз. 17. Типы активации ферментов: ограниченный протеолиз (приведите пример), активация ионами металлов (пример), действие протекторов (приведите примеры). 18. Регуляция активности ферментов. Примеры и механизмы быстрой регуляции: аллостерической (по принципу отрицательной обратной связи), ковалентной модификации, ассоциации-диссоциации, белок-белкового взаимодействия. Примеры и механизмы 158 медленной регуляции: индукции и репрессии биосинтеза ферментов. Компартментализация ферментных систем в клетке (приведите примеры). 19. Изоферменты, особенности строения, роль в диагностике. Множественные формы ферментов. Клинико-диагностическое значение изоферментного спектра плазмы крови (на примере ЛДГ и креатинфосфаткиназы). 20. Энзимодиагностика. Гипоферментемия, дисферментемия, гиперферментемия. Секреторные, экскреторные, индикаторные ферменты. Причины изменения активности в крови при различных патологических состояниях. 21. Энзимотерапия. Ферменты как лекарственные препараты. Механизмы действия, показания к применению. Иммобилизованные ферменты. 22. Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов (приведите примеры). 23. Водорастворимые витамины В1, В2, В3, В6: названия витаминов, формулы, названия и формулы коферментов, которые они образуют; примеры ферментов, содержащих эти коферменты; участие в реакциях. Биологическая роль этих витаминов и основные клинические проявления недостаточности. 24. Биологическая роль и основные клинические проявления недостаточности витаминов С (формула), Р, В5, Н, В9, В12, В14. 159 БЕЛКИ ФЕРМЕНТЫ ВИТАМИНЫ 4-е издание, переработанное и дополненное Учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биохимии для обучающихся лечебного факультета медицинских вузов Под редакцией Л. Б. Гайковой, Р. Н. Павловой, Ж. В. Антоновой Редактор: Н. П. Першакова Технический редактор: Н. Г. Комова Подписано в печать __.__.2021 г. Формат бумаги 60×84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Nеwton. Печать офсетная. Уч.-изд. л. 5,8. Усл.-печ. л. 9,3. Тираж 100 экз. Заказ № . Санкт-Петербург, Издательство СЗГМУ им. И. И. Мечникова 191015, Санкт-Петербург, Кирочная ул., д. 41. Отпечатано в типографии СЗГМУ им. И. И. Мечникова 191015, Санкт-Петербург, Кирочная ул., д. 41.
