1) Бактериальной петлёй засеваем pJ69-4A (MATa trp1-901 leu2-3,112 ura3-52 his3-200 gal4Δ gal80Δ GAL2-ADE2 LYS2::GAL1-HIS3 met2::GAL7-lacZ) в 5-10 мл жидкой YPDA. Лучше в маленькую коническую колбу на 50 мл. 2) Инкубируем ночь при 30°C 250 RPM. 3) Добавляем YPDA до 50 мл. 4) Инкубируем 2-3 часа при 30°C 250 RPM. 5) Пока инкубируется раскапываем плазмиды по 1-2 µl в 1.5 мл пробирки согласно плану эксперимента. Пробирки скручиваем, чтобы обе капли упали на дно. 6) Переносим клетки в новую 50 мл пробирку. центрифугируем при 1800G 2 минуты. 7) Супернатант заменить на 10 мл LiAc 0.1M. Ресуспендировать. 8) Инкубируем в той же пробирке 30 минут при 30°C 250 RPM. 9) Центрифугируем при 1800G 2 минуты. 10) Супернатант заменить на PEG:LiAc из расчёта ~ 9 мл PEG:LiAc на 1 мл клеточного осадка. При необходимости следует масштабировать. 11) Ресуспендировать. Перенести серологической пипеткой по 4-5 капель (желательно, суммарно не более 200 µl, при избытке клеток они начинают расти ковром за счёт погибших клеток) суспензии в пробирки со смесью плазмид. 12) Инкубировать 30-40 минут при 30°C 250 RPM (можно на ротаторе при RT). 13) Центрифугируем при 1800G 30 секунд. 14) Супернатант заменить на 80-120 µl стерилизованной H2O. Если чашки свежие, то по нижней границе, если не очень – по верхней. 15) Ресуспендировать. Перенести на чашки SD-2. Распределить шпателем. Лучше использовать несколько шпателей попеременно: пока одни остывают, другим работать. 16) Инкубировать 3-4 суток 30°C. 17) По 2-3 колонии с каждой чашки расштриховать истончающим штрихом на чашки с SD-3. 18) Инкубировать 2-3 суток 30°C. 19) Записать результат. PEG:LiAc PEG 50% 45мл LiAc 1M 5 мл
