Лабораторное занятие № 1. Тема практического занятия: Галеновые и новогаленовые препараты (настойки, экстракты). Фармакопейные требования к настойкам, общая технологическая схема производства настоек. Основные фармакопейные требования к экстрактам. Медицинские масла (Olea medicata) Оценка качества настоек: валерианы, календулы, пастушей сумки. Определение плотности и сухого остатка настоек календулы и валерианы ВАЛЕРИАНЫ НАСТОЙКА Описание. Жидкость коричневого цвета. ИДЕНТИФИКАЦИЯ Тонкослойная хроматография (2.2.27). Испытуемый раствор. 5 мл настойки разбавляют 5 мл 70 % (об/об) этанола Р. Раствор сравнения. 5 мг кислоты ацетоксивалереновой Р и 5 мг кислоты валереновой Р растворяют в 20 мл метанола Р. На линию старта ТСХ пластинки со слоем силикагеля Р (5-40 мкм) или силикагеля Р (2-10 мкм) наносят в виде полосок длиной 10 мм (или 8 мм) по 20 мкл испытуемого раствора и раствора сравнения. Пластинку помещают в камеру с системой растворителей кислота уксусная ледяная Р – этилацетат Р – циклогексан Р (2:38:60). Когда фронт растворителей пройдет 10 см (или 8 см) от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе. Пластинку опрыскивают раствором альдегида анисового Р, нагревают при температуре 100-105 ºС в течение 5-10 мин и просматривают при дневном свете. ИСПЫТАНИЯ Этанол (2.9.10). От 95 % до 105 % от количества, указанного на этикетке. Определяется с помощью подходящего по плотности спиртометра или ареометра. Сухой остаток (2.8.16). Не менее 3.0 %. о 5,0 мл настойки помещают в предварительно высушенную при температуре 100 — 105 С до постоянной массы и точно взвешенную фарфоровую чашку диаметром 5 см или бюкс, взвешенный с точностью до 0,0001 г, выпаривают на водяной бане досуха, сушат в о сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре (102,5 ± 2,5) С, охлаждают в эксикаторе (над безводным силикагелем, кальция хлоридом безводным или другим подходящим осушителем) в течение 30 мин и взвешивают. Результат выражают в процентах. Содержание сухого остатка должно соответствовать пределам, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации. Тяжелые металлы (2.4.8, метод А). Не более 10 млн-1. 5.0 мл настойки упаривают досуха, прибавляют 1.0 мл кислоты серной Р, осторожно сжигают и прокаливают. К полученному остатку прибавляют при нагревании 5.0 мл раствора 615 г/л аммония ацетата Р, фильтруют через беззольный фильтр, промывая фильтр 5.0 мл воды Р, доводят объем фильтрата водой Р до 50.0 мл и перемешивают. 12.0 мл полученного раствора должны выдерживать испытание на тяжелые металлы. Раствор сравнения готовят, используя 10.0 мл стандартного раствора свинца (1 млн-1 Pb2+) Р. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Испытуемый раствор. К 10.0 мл настойки прибавляют 50.0 мл воды Р, предварительно нейтрализованной по фенолфталеину до слабо розовой окраски, 1.0 мл раствора 10 г/л фенолфталеина, перемешивают и титруют 0.1 М раствором натрия гидроксида до малиновой окраски. Содержание кислоты изовалериановой в препарате в процентах рассчитывают по формуле: где: V – объем 0.1 М раствора натрия гидроксида, израсходованный на титрование испытуемого раствора, в миллилитрах; K – поправочный коэффициент к титру 0.1 М раствора натрия гидроксида. 1 мл 0.1 М раствора натрия гидроксида соответствует 10,20 мг С5Н10О2. КАЛЕНДУЛЫ НАСТОЙКА ИДЕНТИФИКАЦИЯ Ультрафиолетовый спектр поглощения (2.2.25) эфирного извлечения, полученного для количественного определения, в области от 400 нм до 450 нм должен иметь максимум поглощения при длине волны 405 нм (каротиноиды). 2 мл настойки упаривают досуха на водяной бане, не охлаждая к остатку прибавляют 0.10.25 мл кислоты серной Р; через 1-2 мин на фоне темно-бурого цвета появляется сиреневато-красное окрашивание (флавоноиды). ИСПЫТАНИЯ Относительная плотность (2.2.5, метод 2). Не более 0.910 г/см3. Определение плотности проводят с помощью пикнометра, ареометра или плотномера. 3 Применяют для определения плотности жидкостей с точностью до 0,001 г/cм с помощью пикнометра. Чистый сухой пикнометр взвешивают с точностью до 0,0002 г, заполняют с помощью маленькой воронки водой очищенной немного выше метки, закрывают пробкой и выдерживают в течение 20 мин в термостате при температуре (20 ± 0,1) ºС. При этой температуре уровень воды в пикнометре доводят до метки, отбирая излишек воды при помощи пипетки или свернутой в трубку полоски фильтровальной бумаги. Пикнометр снова закрывают пробкой и выдерживают в термостате еще 10 мин. Затем пикнометр вынимают из термостата, проверяют положение мениска воды, который должен находиться на уровне метки. Вытирают фильтровальной бумагой внутреннюю поверхность горлышка и весь пикнометр снаружи, закрывают пробкой. Выдерживают пикнометр под стеклом аналитических весов в течение 10 мин и взвешивают с той же точностью. Пикнометр освобождают от воды, высушивают, ополаскивая последовательно спиртом и эфиром (сушить пикнометр нагреванием не допускается), удаляют остатки эфира продуванием воздуха, заполняют пикнометр испытуемой жидкостью и проводят те же операции, что и с водой. + 0.0012 А. где m – масса пустого пикнометра, г; m1 – масса пикнометра с водой очищенной, г; m2 – масса пикнометра с испытуемой жидкостью, г; 3 0,99703 – значение плотности воды при 20 °С, г/см (с учетом плотности воздуха); 0,0012 – значение плотности воздуха при 20 °С и барометрическом давлении 101,1 кПа (760 мм рт. ст.). Этанол (2.9.10). Не менее 65 %. Определяется с помощью подходящего по плотности спиртометра или ареометра. Сухой остаток (2.8.16). Не менее 2.1 %. -1 Тяжелые металлы (2.4.8, метод А). Не более 10 млн . 5.0 мл настойки упаривают досуха, прибавляют 1.0 мл кислоты серной Р, осторожно сжигают и прокаливают. К полученному остатку прибавляют при нагревании 5.0 мл раствора 615 г/л аммония ацетата Р, фильтруют через беззольный фильтр, промывая фильтр 5.0 мл воды Р, доводят объем фильтрата водой Р до 50.0 мл и перемешивают. 12.0 мл полученного раствора должны выдерживать испытание на тяжелые металлы. Раствор сравнения готовят, используя 10.0 мл стандартного раствора свинца (1 млн-1 Pb2+) Р. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ Испытуемый раствор. 25.0 мл настойки помещают в делительную воронку вместимостью 250 мл, прибавляют 25 мл эфира петролейного Р, встря-хивают в течение 1 мин. Органический слой отделяют и фильтруют через стеклянный фильтр ПОР 40 со слоем натрия сульфата безводного Р в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию эфиром петролейным Р повторяют дважды пор-циями по 15 мл и переносят в ту же мерную колбу. Объем полученного извлечения доводят эфиром петролейным Р до 100.0 мл. Через 15 мин измеряют оптическую плотность (2.2.25) испытуемого раствора при длине волны 405 нм, используя в качестве раствора сравнения эфир петролейный Р, предварительно профильтрованный через стеклянный фильтр ПОР 40 со слоем натрия сульфата безводного Р. Содержание суммы каротиноидов в пересчете на β-каротин в миллиграмм/процентах рассчитывают по формуле: где D – оптическая плотность испытуемого раствора; V – объем препарата в миллилитрах. Удельный показатель поглощения β-каротина в эфире петролейном Р равен 2500. Контроль качества и анализ жидкого экстракта коры крушины Подлинность. 0,5 мл препарата смешивают с 1 мл спирта и 10 мл воды, кипитят в течение 1 минуты и по охлаждении фильтруют. Фильтрат взбалтывают с 10 мл эфира, отстаивают и отделяют эфирный слой, окрашенный в интенсивно желтый цвет (хризофаноловая кислота). 5 мл эфирного раствора взбалтываю в течение 1 минуты с 5 мл раствора аммиака. Раствор аммиака должен быть окрашен в интенсивный вишнево-красный цвет, цвет эфирного слоя не изменяется (оксиметилантрахиноны). Спирт не менее 54%. Тяжелые металлы. Как указано в статье «Extracta». 1 мл жидкого экстракта выпаривают досуха, прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты, осторожно сжигают и прокаливают. Полученный остаток обрабатывают при нагревании 5 мл насыщенного раствора ацетата аммония. Фильтруют через беззольный фильтр, промывают 5 мл воды и доводят объем фильтрата до 200 мл. 10 мл поученного раствора должны выдерживать испытание на тяжелые металлы (не более 0,01% в препарате). Количественное определение. В точной навеске около 0,15 г препарата помещают в колбу емкостью 100 мл, прибавляют 7,5 мл ледяной уксусной кислоты и смесь кипятят в течение 15 минут с обратным холодильником, избегая пригорания. После остывания в колбу добавляют через холодильник 30 мл эфира и кипятят на водяной бане 15 минут. Затем извлечение охлаждают, процеживают через вату в делительную воронку емкостью 300 мл вату промывают 20 мл эфира. Вату переносят обратно в колбу, добавляют 30 мл эфира и кипятят 10 минут. Охлажденное эфирное извлечение процеживают через вату в ту же делительную воронку. Колбу дважды ополаскивают эфиром (по 10 мл) и процеживают через ту же вату. К объединённым эфирно-уксусным извлечениям осторожно по стенкам добавляют 100 мл 5% раствора едкого натра, содержащего 2% аммиак, и осторожно покачивают 5-7 минут, охлаждая воронку. После полного расслоения прозрачный красный нижний слой, не фильтруя, сливают в мерную колбу емкостью 250 мл, а эфирный слой обрабатывают порциями по 20 мл щелочно-аммиачного раствора до прекращения окрашивания жидкости и доводят объем раствора до метки щелочно-аммиачным раствором. 25 мл полученной жидкости помещают в колбу и нагревают 15 минут на кипящей водяной бане с обратным холодильником. После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре ФЭК-М с зеленым светофильтром в кювете с толщиной слоя 1 см (нулевую точку устанавливают по воде очищенной). При получении слишком интенсивной окраски раствор перед колориметрированием разбавляют щелочно-аммиачным раствором. Концентрацию производных антрацена в колориметрическом растворе, выраженных в истизине, определяют по калибровочному графику, построенному по растворам хлорида кобальта (CoCl2H2O). Для этого аналогично испытуемому раствору измеряют оптическую плотность 10-12 раствора хлорида кобальта в пределах концентраций от 0,2% до 3,0%. По оси ординат откладывают значения оптической плотности, а по оси абцисс концентрации производных антрацена в миллилитрах на 100 мл, исходя из того, что 1% раствор хлорида кобальта по оптической плотности соответствует раствору 0,36 мг истизина в 100 мл щелочно-аммиачного раствора. Приготовление эталонных растворов и определение их оптической плотности производят не менее 3 раза. Содержание производных антроцена в препарате в процентах вычисляют по формуле: где С – концентрация производных антроцена в мл на 100 мл, найденная по калибровочному графику; V – первоначальный объем щелочного извлечения; K – коэффицент разбавления после нагревания; а – количество препарата, взятое на определение, в миллилитрах. Содержание производных антрацена в препарате должно быть не менее 1,2 %. Хранение. В хорошо укупоренных сосудах, в защитном от света месте. Слабительное средство. Получение жидкого экстракта валерианы методом мацерации и контроль качества Получение извлечения при производстве жидкого экстракта корневищ с корнями валерианы проводили методом перколяции. Метод мацерация предусматривает проведение трех стадий: намачивание (набухание) сырья, настаивание и собственно мацерация. Методом мацерация можно получить извлечение в соотношении 1:1, что является характерным для жидких экстрактов. В качестве экстрагента использовали спирт этиловый 70%. Сбор извлечения проводили в два этапа. Таким образом, получали спиртоводное извлечение из корневищ с корнями валерианы в соотношении 1:1. Проводили очистку полученного извлечения путем отстаивания при температуре 8°С в течение двух суток и последующей фильтрации. Была проведена оценка качества полученного жидкого экстракта валерианы по показателям: описание, относительная плотность, содержание этанола, сухой остаток, количественное определение. Определение сухого остатка. 5 мл жидкого экстракта помещают во взвешенный бюкс, выпаривают на водяной бане и сушат 3 ч при (102,5 +/-2,5) град. С, затем охлаждают в эксикаторе 30 мин и взвешивают. Определение относительной плотности, содержания этанола, сухого остатка проводили в соответствии с ГФ РК. Количественное определение содержания суммы сложных эфиров в пересчете на этиловый эфир валереновой кислоты в жидком экстракте валерианы проводили по следующей методике: 5,0 мл жидкого экстракта валерианы помещали в делительную воронку вместимостью 100 мл, прибавляли 100 мл смеси хлороформа Р и 96% спирта Р (5:1, об/об) и экстрагировали в течение 60 мин. Сливали хлороформный экстракт и доводили смесью из хлороформа Р и 96% спирта Р (5:1, об/об) до объема 100,0 мл (раствор А). Далее готовили испытуемый раствор. 5,0 мл раствора А помещали в круглодонную колбу вместимостью 50 мл и выпаривали в вакууме при температуре от 40°С до 50°С досуха. К полученному сухому остатку прибавляли 5,0 мл гидроксиламина раствора щелочного Р3, выдерживали в течение 20 мин, прибавляли 10,0 мл 1М раствора хлористоводородной кислоты, 5,0 мл раствора 10 г/л железа (III) хлорида Р в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты, перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр, смоченный водой Р. Затем готовили компенсационный раствор. К 0,5 мл гидроксиламина раствора щелочного Р3 прибавляли 10,0 мл 1М раствора хлористоводородной кислоты и 0,5 мл раствора 10 г/л железа (III) хлорида Р в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты. Измеряли оптическую плотность полученного извлечения с помощью фотоэлектроколориметра КФК-2МП при длине волны 512 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Содержание суммы сложных эфиров в пересчете на этиловый эфир валереновой кислоты в процентах рассчитывали по формуле: А · 400 / v · 10,5 где 10,5 – удельный показатель поглощения гидроксамата валереновой кислоты; А – оптическая плотность испытуемого раствора; v – объем раствора, взятого для анализа, мл. Реактивы: Приготовление гидроксиламина раствора щелочного Р3. Готовили раствор А: 10 г гидроксиламина гидрохлорида Р растворяли в воде Р и доводили до объема 100,0 мл этим же растворителем. Готовили раствор В: 10 г гидроксида натрия Р растворяли в воде Р и доводили до объема 100,0 мл этим же раство-рителем. Непосредственно перед испытанием смешивали растворы А и В в соотношении 1:2 (об/об). Срок годности раствора 3 суток. Приготовление раствора 10 г/л железа (III) хлорида Р в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты Р. 1,0 г железа (III) хлорида Р растворяли в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты Р в мерной колбе вместимостью 100,0 мл и доводили объем раствора этой же кислотой до метки. Срок годности раствора 1 месяц. Изучены показатели качества жидкого экстракта корневищ с корнями валерианы: описание, плотность, относительная плотность, содержание этанола, сухой остаток, количественное определение. Плотность жидкого экстракта корневищ корнями валерианы составила 0,892 г/см3, относительная плотность – 0,894. Содержание этанола в процентах (об/об) при 20°С в жид-ком экстракте валерианы составило 67,5%. Сухой остаток жидкого экстракта валерианы составил 9,18±0,04%. Количественное определение суммы сложных эфиров в пересчете на этиловый эфир валереновой кислоты в жидком экстракте валерианы проводилось с помощью спектрофотометрической методики. Установлено, что содержание суммы сложных эфиров в пересчете на этиловый эфир валереновой кислоты в пяти сериях жидкого экстракта валерианы находится в пределах 2,61±0,05%. Лабораторное занятие №2 Тема практического занятия: Эфирные масла. Общее понятие. Химия и технология получения эфирных масел. Анализ лекарственного растительного сырья, содержащие эфирные масла Химический анализ эфирных масел Задание 1. Определите количественное содержание эфирного масла в лекарственном растительном сырье. Методика. 10-20 г измельченного сырья помещают в круглодонную колбу вместимостью 1000 мл, приливают 300 мл воды и встряхивают, чтобы смочить сырье водой. В верхней части колбы укрепляют градуированный приемник. Приемник должен свободно помещаться в горле колбы, не касаясь стенок, и отстоять от уровня воды не менее чем на 50 мм. Колбу соединяют с вертикальным шариковым холодильником, нагревают до кипения и выдерживают при слабом кипении в течение времени, указанного в соответствующей фармакопейной статье на сырье. Пары воды и эфирного масла конденсируются в холодильнике, и смесь жидкостей стекает в приемник. Эфирное масло отстаивается в градуированном приемнике на поверхности воды. После окончания перегонки и охлаждения измеряют объем слоя эфирного масла и рассчитывают его содержание в сырье: а) объемно-весовую долю Х, %, в пересчете на воздушно-сухое сырье: где: А - объем эфирного масла, мл, Б - навеска сырья, г. б) массовую долю, % (полученный результат умножить на плотность эфирного масла). Содержание эфирного масла как объемно-весовую долю (Х, %) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле: где: V - объем эфирного масла, мл; m- масса сырья, г; W - потеря в массе при высушивании, г. Задание 2. Проведите органолептический анализ образца эфирного масла. 1. Цвет и прозрачность. 10 мл эфирного масла помещают в цилиндр (или пробирку) из прозрачного бесцветного стекла, диаметром 2-3 см. Наблюдение проводят в проходящем свете. 2. Запах. 0,1 мл (2 капли) масла наносят на полоску фильтровальной бумаги длиной 12 см и шириной 5 см так, чтобы масло не смачивало края бумаги, и сравнивают запах испытуемого образца через каждые 15 минут с запахом контрольного образца, нанесенного таким же путем на фильтровальную бумагу. В течение 1 часа запах должен быть одинаков с запахом контрольного образца. 3. Вкус. 1 каплю эфирного масла смешивают с 1 г сахарной пудры и пробуют на язык. 4. Растворимость в спирте. В мерный цилиндр вместимостью 10 мл наливают 1 мл эфирного масла и постепенно приливают из бюретки при тщательном взбалтывании по 0,1 0 мл спирта определенной концентрации (указанной в частной статье) при 20 до полного растворения масла. 5. Примесь воды. 10 капель эфирного масла смешивают с 1 мл углерода дисульфида. 6. Примесь жирных масел и смол. На полоску фильтровальной бумаги наносят 1 каплю эфирного масла и оставляют на 2 часа. 7. Примесь чужеродных сложных эфиров. 1 мл эфирного масла нагревают на водяной бане в течение 2 минут в 3 мл свежеприготовленного 100 г/л раствора калия гидроксида в спирте. Задание 3. Установите чистоту образца эфирного масла (отсутствие спирта, жирных и минеральных масел). 1. Спирт. Несколько капель эфирного масла наносят на воду, налитую на часовое стекло. 1 мл эфирного масла наливают в пробирку, закрывают его рыхлым комочком ваты, в середину которого помещен кристаллик фуксина, и доводят до кипения. 2. Жирные и минеральные масла. 1 мл эфирного масла взбалтывают в пробирке с 10 мл спирта. Задание 4. Определите физические показатели образца эфирного масла (показатель преломления). Методика. Показатель преломления определяют в рефрактометре. Перед началом работы необходимо проверить с помощью воды, имеющей показатель преломления n = 1,3330 при 20 °С. Рефрактометр имеет две призмы, одна из которых (верхняя) приподнимается. Перед проведением измерения на нижнюю призму наносят 1-2 капли жидкости, после чего опускают верхнюю призму и плотно ее прижимают. Пучок света с помощью зеркала направляют в верхнее окошко призмы. Вращая рукоятку, совмещают три черточки, нанесенные по диаметру круга, с границей светотени. Вращением ручки компенсатора добиваются совпадения границы темной и светлой частей поля с тремя черточками. Отсчет показателя преломления производится по левой шкале с точность до четвертого знака. Наблюдения: __n = Задание 6. Проведите качественные реакции на компоненты эфирных масел в исследуемом образце. Сделайте вывод о качественном составе анализируемого масла. 1. Реакция на альдегиды и кетоны. Получение оксимов. К 1-2 каплям эфирного масла прибавляют 3 капли спиртового раствора гидроксиламина хлористоводородного (15 г гидроксиламина хлористоводородного в 100 мл 80 % спирта) и несколько капель метилового оранжевого. Нитропруссидная реакция. 5-10 капель эфирного масла смешивают с таким же количеством раствора натрия нитропруссида и 3 каплями 5 % раствора щелочи. Наличие двойной связи, размещенной вблизи карбонильной группы, способствует реакции. Карвон, пулегон, цитраль дают красное окрашивание. Камфора, фенхон, ментон, цитронеллаль в реакцию не вступают. 2. Реакция на азуленогены. Реакция Эрлиха-Мюллера. 5-10 капель эфирного масла смешивают в пробирке с 1-2 мл реактива и подогревают на водяной бане. Лабораторное занятие № 3 Тема практичекого занятия: Витамины. Общая характеристика, классификация, методы выделения. Анализ лекарственного растительного сырья, содержащие витамины Проведите хроматографическое определение кислоты аскорбиновой в плодах шиповника в сравнении со стандартным образцом витамина С. Сравните величины Rf, характер окраски пятен исследуемого извлечения и вещества сравнения. Методика. 0,5 г измельченного сырья помещают в колбу. Прибавляют 5 мл дистиллированной воды, перемешивают, настаивают 15 минут и отфильтровывают. Капилляром наносят фильтрат на пластинку, покрытую слоем силикагеля, рядом с раствором кислоты аскорбиновой и помещают хроматограмму в камеру с системой растворителей: этилацетат-кислота уксусная ледяная (8:2). После хроматографирования пластинку высушивают на воздухе в вытяжном шкафу (NB!). Хроматограмму обработывают 0,04 % раствором натрия 2,6-дихлорфенолиндофенолята в воде. Кислота аскорбиновая обнаруживается в виде белого пятна на синем фоне. Проведите хроматографическое определение каротиноидов в плодах шиповника. Сравните величины Rf, характер окраски пятен исследуемого извлечения и β-каротина. Методика. 0,5 г измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл хлороформа, настаивают в течение 1,5 часа при периодическом перемешивании и фильтруют. Фильтрат наносят на пластинку, покрытую слоем силикагеля, рядом с раствором β-каротина и хроматографируют в системе растворителей гексан-ацетон (8:2). Пластинку высушивают на воздухе в вытяжном шкафу (NB!), обрабатывают 10 % раствором кислоты фосфорно-молибденовой в этаноле и нагревают в сушильном шкафу при температуре 60-80 °С в течение 3-5 минут. Каротиноиды проявляются в виде синих пятен на желто-зеленом фоне. Количественное определение витамина С в плодах шиповника Методика. Из грубо измельченной аналитической пробы плодов берут навеску массой 20 г, помещают в фарфоровую ступку, где тщательно растирают со стеклянным порошком (около 5 г), постепенно добавляя 300 мл воды очищенной очищенной, и настаивают 10 минут. Затем смесь размешивают и извлечение фильтруют. В коническую колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл полученного фильтрата, 1 мл 2 % раствора кислоты хлористоводородной, 13 мл воды очищенной очищенной, перемешивают и титруют из микробюретки раствором натрия 2,6-дихлорфенолиндофенолята (0,001 моль/л) до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30-60 с. Титрование продолжают не более 2 мин. Если в пробном титровании расход титранта более 2 мл, что указывает на высокое содержания в фильтрате аскорбиновой кислоты, исходное извлечение разбавляют водой в 2 раза или более. Содержание аскорбиновой кислоты в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: где: V - объем 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, израсходованный на титрование, мл; m - масса навески, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %. 1 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия соответствует 0,000088 г аскорбиновой кислоты. Лабораторное занятие № 4 Тема практического занятия: Общая характеристика алкалоидов, общая классификация, физико-химические свойства и общие методы выделения алкалоидов, анализа, разделение и распространенность алкалоидов в лекарственных растениях Проведение общих и частных реакций на содержание в лекарственном сырье алкалоидов Методика выделения БАВ. 1,0 г сырья, измельченного и просеянного сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещают в колбу со шлифом, заливают 25 мл 1 % раствора кислоты хлороводородной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут, периодически помешивая. Охлажденное извлечение фильтруют и используют для проведения качественных реакций. 1. Проведение общих осадочных и цветных реакции на алкалоиды. Методика. На предметное стекло наносят каплю полученного фильтрата и каплю реактива и смешивают их с помощью стеклянной палочки. Общие осадочные реакции 1. С реактивом Вагнера-Бушарда (раствор йода в растворе калия йодида). 2. С реактивом Майера (смесь растворов ртути дихлорида и калия йодида). 3. С реактивом Драгендорфа (раствор нитрата висмута основной, калия йодида и уксусной кислоты). 4. С реактивом Шейблера (1 % водный раствор кислоты фосфорно-вольфрамовой). 5. С реактивом Бертрана (1 % водный раствор кислоты кремне-вольфрамовой). 6. С реактивом Зонненштейна (1 % водный раствор кислоты фосфорно-молибденовой). 7. С 1 % водным раствором кислоты пикриновой. 8. С 0,1 % водным раствором танина. Цветные реакции 9. С концентрированной серной кислотой. 10. С концентрированной азотной кислотой. 11. С реактивом Эрдмана (смесь концентрированных серной и азотной кислот). 12. С реактивом Фреде (раствор аммония молибдата в концентрированной серной кислоте). 13. С реактивом Марки (раствор формальдегида в концентрированной серной кислоте). 14. С 1 % водным раствором натрия нитропруссида. Проведение частных реакций на содержание в ЛС алкалоидов Методика. 1 г измельченных листьев красавки взбалтывают с 10 мл 0,05 % кислоты серной в течение 2 минут, фильтруют, добавляют 1 мл концентрированного раствора аммиака и 5 мл воды очищенной очищенной, тщательно взбалтывают с 15 мл эфира, отделяют эфирный слой и фильтруют его через слой безводного натрия сульфата. Эфирное извлечение помещают в фарфоровую чашку, эфир упаривают на кипящей водяной бане в вытяжном шкафу. Остаток растворяют в 0,5 мл кислоты азотной концентрированной и упаривают досуха на водяной бане. Добавляют 10 мл ацетона и по каплям 3 % спиртовый раствор калия гидроксида. Лабораторное занятие №5. Тема практического занятия: Флавоноиды, общее понятие, классификация Анализ лекарственного растительного сырья, содержащие флавоноиды Качественный анализ ЛРС, содержащий флавоноидов (трава череды, плоды боярышника) 1. Выделение Методика. 3-5 г измельченного растительного сырья заливают 30-50 мл 70 % спирта в колбе с обратным холодильником и проводят экстракцию на водяной бане в течение 20-30 минут. Извлечение охлаждают, фильтруют через 4 слоя марли или фильтровальную бумагу. Полученный фильтрат наносят на колонку диаметром 1 см, заполненную 1,0 г полиамидного сорбента, промывают 50 мл воды очищенной и элюируют флавоноиды с колонки 70 % этанолом, отбирая фракцию, окрашенную в желтый цвет. Полученный фильтрат упаривают до 1/2 объема и используют для проведения качественных реакций. 2. Проведение качественных реакции на флавоноиды. В качестве образца сравнения используйте 0,1 % спиртовый раствор рутина. 1. Цианидиновая реакция. К 1 мл извлечения прибавляют 2-3 капли концентрированной хлороводородной кислоты и 1-2 стружки металлического магния. Наблюдают образующуюся окраску. 2. Цианидиновая реакция по Брианту. К окрашенному продукту цианидиновой реакции добавляют 1/3 часть октанола или бутанола по объему, разбавляют водой до разделения слоев, встряхивают и отмечают переход пигментов в водную или органическую фазы. 3. Реакция со щелочью. К 1 мл извлечения прибавляют 1-2 капли 10 % спиртоводного раствора калия или натрия гидроксида. 4. Реакция с алюминия хлоридом. К 1 мл извлечения прибавляют 1 мл 2 % спиртового раствора алюминия хлорида. 5. Реакция с железа (III) хлоридом. К 1 мл извлечения прибавляют 2-3 капли 1 % спиртового раствора железа хлорида. 6. Реакция Вильсона. К 2 мл извлечения прибавляют 1 мл 2 % раствора кислоты борной и 1 мл 2 % спиртового раствора кислоты лимонной (или щавелевой). 7. Реакция с ванилином в концентрированной хлороводородной кислоте. К 1 мл прибавляют несколько капель 1 % раствора ванилина в кислоте хлороводородной концентрированной. Лабораторное занятие №6 Тема практического занятия: Анализ лекарственного растительного сырья, содержащие сапонины, распространенность сапонинов в лекарственном растительном сырье Химический анализ лекарственного растительного сырья, содержащего сапонины Задание 1. Выделите сумму сапонинов из лекарственного растительного сырья для проведения качественных реакций. Методика. 5,0 г измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, приливают 50 мл 50 % спирта; нагревают содержимое колбы с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Извлечение охлаждают и фильтруют. 20 мл фильтрата упаривают на водяной бане до 10 мл для удаления спирта. Полученное водное извлечение используют для проведения пробы пенообразования, некоторых осадочных реакций и определения химической природы сапонинов; спирто-водное извлечение – для других качественных реакций и хроматографического анализа. Задание 2. Проведите качественные реакции, позволяющие обнаружить сапонины в растительном экстракте. Сделайте заключение о химической природе сапонинов. Проба пенообразования 1. 2-3 мл водного извлечения энергично встряхивают в течение 1 минуты. Реакции осаждения 2. К 1 мл водного извлечения в пробирке прибавляют 3-4 капли баритовой воды. 3. К 1 мл водного извлечения прибавляют 3-4 капли 10 % раствора свинца ацетата. 4. К 1 мл спирто-водного извлечения прибавляют 1 мл 1 % спиртового раствора холестерина. Цветные реакции 5. Реакция Лафона. К 2 мл спирто-водного извлечения в пробирке прибавляют 1 каплю 10 % раствора меди сульфата, 1 мл кислоты серной концентрированной и осторожно нагревают. 6. Реакция Сальковского. К 2 мл спирто-водного извлечения в пробирке прибавляют 1 мл хлороформа и 5-6 капель кислоты серной концентрированной. 7. Реакция с раствором сурьмы (V) хлоридом. К 1 мл спирто-водного извлечения в пробирке прибавляют 0,5 мл насыщенного раствора сурьмы (V) хлорида в хлороформе. 8. Реакция Санье. К 2 мл спирто-водного извлечения в пробирке прибавляют 1 мл 0,5 % спиртового раствора ванилина, 3-4 капли кислоты серной концентрированной и нагревают на 0 водяной бане с температурой 60 С. Определение химической природы сапонинов 9. Берут 2 мерные пробирки одинакового диаметра с притертыми пробками. В одну из них наливают 5 мл кислоты хлористоводородной 0,1 моль/л, в другую - 5 мл раствора натрия гидроксида 0,1 моль/л. В обе пробирки прибавляют по 0,5 мл водного извлечения и встряхивают обе пробирки с одинаковой интенсивностью в течение 1 минуты. Задание 4. В образце лекарственного растительного сырья, содержащего сапонины, определите пенное число. По величине пенного числа отнесите исследуемое сырье к одной из трех групп: свыше 5000 – высокое пенное число; 2000-5000 – среднее; меньше 2000 – низкое. Методика. Навеску исследуемого сырья высушивают до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 60 °С, растирают в порошок и просеивают через сито 355. Из 1,0 г порошка готовят 1 % настой. 10 мл настоя наливают в мерный цилиндр с притертой пробкой, который от отметки 10 мл должен иметь свободную длину 7-8 см до края цилиндра. Цилиндр с натоем энергично взбалтывают в течение 15 с. Определяют минимальную концентрацию настоя, которая дает пену, не исчезающую в течение 1 минуты. Лабораторное занятие № 7 Тема практического занятия: Общее понятие сердечных гликозидов, классификация. Анализ лекарственного растительного сырья, содержащие сердечные гликозиды Фитохимический анализ лекарственного сырья, содержащие сердечные гликозиды Проведение качественных реакции 1. Выделение кардиогликозидов из ЛРС. Методика. 5,0 г измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл, приливают 50 мл 80 % спирта и настаивают 24 часа. Спирт отгоняют под вакуумом, водный остаток переносят в делительную воронку и липофильные вещества экстрагируют четыреххлористым углеродом 6 раз по 10 мл. Остаток в делительной воронке обрабатывают хлороформом 4 раза по 10 мл. Хлороформные фракции объединяют, фильтруют через 2 г безводного натрия сульфата и используют для проведения качественных реакций 2. Проведение качественные реакции обнаружения кардиогликозидов в образце сырья, полученном для анализа. Для проведения качественных реакций используют сухой остаток, полученный после упаривания 5 мл хлороформного извлечения. NB! Все опыты проводят в вытяжном шкафу. Реакции на стероидную часть кардиогликозидов 1. Реакция Либермана-Бурхарда. Сухой остаток растворяют в 1 мл уксусного ангидрида, переносят в сухую пробирку и осторожно по стенке добавляют 2-3 капли кислоты серной концентрированной. 2. Реакция Розенгейма. К 1 мл хлороформного экстракта добавляют 1 мл трихлоуксусной кислоты в метаноле (или этаноле). Реакции на g-лактонное кольцо 3. Реакция Кедде. Сухой остаток растворяют в 2 мл 3 % раствора кислоты 3,5динитробензойной и добавляют 1 мл раствора натрия гидроксида (1 моль/л). 4. Реакция Раймонда. Сухой остаток растворяют в 1 мл 3 % раствора м-динитробензола в бензоле и добавляют 2-3 капли спиртового раствора калия гидроксида. 5. Реакция Легаля. Сухой остаток растворяют в 1 мл 5 % раствора натрия нитропруссида, переносят в пробирку и по стенкам добавляют 2-3 капли 10 % раствора натрия гидроксида. Реакции на углеводную часть молекулы 6. Реакия Келлера - Килиани на дезоксисахара. Сухой остаток растворяют в 1 мл кислоты уксусной со следами железа сульфата (ІІІ), осторожно по стенкам пробирки приливают 1 мл кислоты серной концентрированной. Содержимое пробирки не взбалтывают! Реакция протекает во времени. 7. Реакция с ксантгидролом. Сухой остаток растворяют в 3 мл раствора ксантгидрола и нагревают на водяной бане 3 минуты. Идентификация кардиотонических гликозидов методом ТСХ из листьев наперстянки пурпуровой или шерстистой Методика. К 1,0 г измельченного сырья (сито 180) прибавляют смесь 20 мл 50 % этанола и 10 мл 10 % раствора свинца ацетата, кипятят 2 минуты, охлаждают и центрифугируют. Надосадочную жидкость помещают в делительную воронку и взбалтывают с 20 мл хлороформа. Если образуется стойкая эмульсия, раствор центрифугируют. Хлороформный слой отделяют и пропускают через безводный натрия сульфат. 10 мл фильтрата упаривают досуха на водяной бане. Сухой остаток растворяют в 1 мл смеси равных объемов хлороформа и метанола. 20 мкл полученного извлечения наносят на пластинку в виде полосы длиной 2 см и шириной 0,3 см. Хроматографируют в системе растворителей этилацетат-метанол-вода очищенная очищенная (75:10:7,5), в качестве реактива для обработки хроматограммы используют смесь 2 мл 1 % раствора хлорамина и 8 мл 25 % спиртового раствора кислоты трихлоруксусной. Обработанную хроматограмму нагревают при 100-105 °С в течение 5-10 минут. Просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм. Могут наблюдаться зоны со светло-голубой флюорисценцией (пурпуреагликозид В, гитоксин), голубой или голубовато-зеленой (ланатозиды А, В, С) и коричневато-желтой (пурпуреагликозид А, дигитоксин).
