1 введение - НИИ питания
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт питания» Российской академии медицинских наук На правах рукописи ШИПЕЛИН ВЛАДИМИР АЛЕКСАНДРОВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ТКАНЕВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФУЛЛЕРЕНОВ И ИХ ВЛИЯНИЯ НА НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРЫС 14.02.01 — гигиена ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, Гмошинский И.В. Москва – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................... 4 1.1 АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ .................................................................................................................... 4 1.2 НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ .......................................................................................................... 8 1.3 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ........................................................................................................ 9 1.4 АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ ...................................................................................................................... 9 1.5 ПУБЛИКАЦИИ ............................................................................................................................... 10 1.6 ЛИЧНЫЙ ВКЛАД СОИСКАТЕЛЯ ...................................................................................................... 10 1.7 ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ ............................................................................................ 10 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................................. 12 2.1 ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФУЛЛЕРЕНОВ ......................................................................... 12 2.2 ХАРАКТЕРИСТИКА ТОКСИЧНОСТИ И БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФУЛЛЕРЕНОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN SILICO ................................................................................................ 15 2.3 ХАРАКТЕРИСТИКА ТОКСИЧНОСТИ И БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФУЛЛЕРЕНОВ IN VIVO .......... 26 2.4 ИЗУЧЕНИЕ БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕТАБОЛИЗМА ФУЛЛЕРЕНОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO ..... 37 2.5 КРАТКОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................ 44 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................................................... 47 3.1 ЖИВОТНЫЕ, СОСТАВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РАЦИОНОВ ............................................................ 47 3.2 ХАРАКТЕРИСТИКА ИСПОЛЬЗУЕМЫХ МАТЕРИАЛОВ И РЕАКТИВОВ ............................................... 49 3.2.1 Фуллерен С60 и фуллеренол С60(ОН)24 ................................................................................ 49 3.2.2 Прочие материалы и реактивы ......................................................................................... 50 3.3 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОГО ОБОРУДОВАНИЯ ............................................................................. 51 3.4 СХЕМЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ ................................................................................................................................ 52 3.4.1 Токсикологический эксперимент с фуллереном С60 продолжительностью 28 дней ... 53 3.4.2 Токсикологический эксперимент с фуллереном С60 продолжительностью 92 дня ..... 55 3.4.3 Токсикологический эксперимент с фуллеренолом С60(ОН)24 продолжительностью 28 дней ................................................................................................................................................ 56 3.4.4 Методика острого эксперимента по введению дисперсии фуллерена С60 в изолированную петлю тонкой кишки крысы ............................................................................ 58 3.4.5 Исследование стабильности фуллерена С60 в биологических субстратах с использованием модельных систем in vitro ............................................................................... 59 3.5 МЕТОДЫ ОТБОРА СУБСТРАТОВ И ПРОБОПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПОДОСТРЫХ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ ........................................ 61 3.6 ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .......................................................................... 62 3.7 БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................................................... 62 3.8 МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ КИШЕЧНОЙ СТЕНКИ ДЛЯ АНТИГЕННОГО БЕЛКА ОВА 64 3.9 МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ .............................................. 66 3.10 МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФУЛЛЕРЕНА С60 ПО ОРГАНАМ И ТКАНЯМ ЖИВОТНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЭЖХ ................................................................................................................. 67 3.11 МЕТОД ОЦЕНКИ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ НА ДНК ........................................................... 70 3.12 МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СЕЛЕНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ ........................... 70 3.13 МЕТОД ЛАЗЕРНОЙ КОНФОКАЛЬНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ ................................... 72 3.14 МЕТОДЫ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ ............................... 73 4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ............................................................................................. 75 4.1 ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗМЕРА ЧАСТИЦ ФУЛЛЕРЕНА С60 И ФУЛЛЕРЕНОЛА С60(ОН)24 .................... 75 4.2 ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕМОДИФИЦИРОВАННОГО ФУЛЛЕРЕНА С60 В ЭКСПЕРИМЕНТЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬЮ 28 ДНЕЙ ............................................................................ 79 4.2.1 Влияние фуллерена С60 на интегральные показатели и массу внутренних органов .... 79 3 4.2.2 Влияние фуллерена С60 на гематологические показатели крови ................................... 82 4.2.3 Влияние фуллерена С60 на биохимические показатели крови ......................................... 82 4.2.4 Влияние фуллерена С60 на содержание цитохромов Р-450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков ...................................................... 86 4.2.5 Влияние фуллерена С60 на состояние системы антиоксидантной защиты и значения показателей ПОЛ ......................................................................................................................... 88 4.2.6 Влияние фуллерена С60 на содержание цитокинов в сыворотке крови......................... 90 4.2.7 Влияние фуллерена С60 на содержание небелковых тиолов печени ............................... 91 4.2.8 Влияние фуллерена С60 на проницаемость кишечного барьера для ОВА ...................... 92 4.2.9 Влияние фуллерена С60 на экскрецию 8-oxo-G .................................................................. 93 4.3 ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕМОДИФИЦИРОВАННОГО ФУЛЛЕРЕНА С60 В ЭКСПЕРИМЕНТЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬЮ 92 ДНЯ .............................................................................. 93 4.3.1 Влияние фуллерена С60 на интегральные показатели и на массу внутренних органов 93 4.3.2 Влияние фуллерена С60 на гематологические показатели .............................................. 97 4.3.3 Влияние фуллерена С60 на показатели, характеризующие иммунный статус и содержание цитокинов в сыворотке крови ............................................................................ 101 4.3.4 Влияние фуллерена С60 на биохимические показатели крови ....................................... 102 4.3.5 Влияние фуллерена С60 на содержание цитохромов Р-450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков .................................................... 103 4.3.6 Влияние фуллерена С60 на состояние системы антиоксидантной защиты и значения показателей ПОЛ ....................................................................................................................... 106 4.3.7 Влияние фуллерена С60 на содержание небелковых тиолов печени ............................. 108 4.3.8 Влияние фуллерена С60 на проницаемость кишки для ОВА .......................................... 109 4.3.9 Влияние фуллерена С60 на экскрецию 8-oxo-G ................................................................ 110 4.3.10 Влияние фуллерена С60 на содержание селена в организме крыс .............................. 111 4.3.11 Изучение биомаркеров токсического действия фуллерена С60 методом конфокальной флуоресцентной микроскопии ......................................................................... 112 4.4 ИЗУЧЕНИЕ БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФУЛЛЕРЕНА С60 ПО ОРГАНАМ И ТКАНЯМ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ ........................................................................................ 120 4.5 ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФУЛЛЕРЕНОЛА С60(ОН)24 В ЭКСПЕРИМЕНТЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬЮ 28 ДНЕЙ .................................................................................................... 123 4.5.1 Влияние фуллеренола на интегральные показатели и на массу внутренних органов 123 4.5.2 Влияние фуллеренола на гематологические показатели крови .................................... 127 4.5.3 Влияние фуллеренола на биохимические показатели крови .......................................... 130 4.5.4 Влияние фуллеренола на содержание цитохромов Р-450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков .................................................... 130 4.5.5 Влияние фуллеренола на состояние системы антиоксидантной защиты и значения показателей ПОЛ ....................................................................................................................... 132 4.5.6 Влияние фуллеренола на содержание небелковых тиолов печени ............................... 132 4.5.7 Влияние фуллеренола на экскрецию 8-oxo-G .................................................................. 135 4.5.8 Влияние фуллеренола на содержание цитокинов в сыворотке крови и показатели, характеризующие иммунный статус ...................................................................................... 135 4.5.9 Влияние фуллеренола С60ОН24 на проницаемость кишечного барьера для ОВА ........ 137 4.6 ЭКСПЕРИМЕНТ ПО ИССЛЕДОВАНИЮ СТАБИЛЬНОСТИ ФУЛЛЕРЕНА С60 В БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ IN VITRO .................................................. 138 5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .............................................................................................. 142 6 ВЫВОДЫ ........................................................................................................................................ 155 7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................................... 158 8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................................... 159 4 1 ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность темы Развитие нанотехнологий способствует появлению новых ультравысокодисперсных форм веществ (наноматериалов), многие свойства которых, в том числе действие на живые системы, отличает их от соединений в виде сплошных фаз или дисперсий с частицами макроскопических размеров. Поскольку человек не сталкивался с подавляющим большинством продуктов современной нанотехнологии в ходе своей предшествующей биологической эволюции, их влияние на здоровье человека может быть непредсказуемым, в том числе, возможны проявления острой и хронической токсичности [20]. В этой связи, характеристика потенциального риска полученных искусственным путём наночастиц и наноматериалов для здоровья человека и состояния окружающей среды обитания является обязательной [20; 28]. Важность оценки потенциальных рисков наноматериалов для здоровья человека отмечается в приказе Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 340 от 30.11.2007 г. Систематические исследования безопасности нанотехнологий и продуктов наноиндустрии были проведены за последние годы в Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 годы» и программы РАМН «Нанотехнологии и наноматериалы в медицине» [21]. За рубежом безопасности нанотехнологий и наноматериалов уделяется большое внимание в рамках исследований, проводимых под эгидой Европейской комиссии, US FDA, OECD, ФАО-ВОЗ, ILSI и других правительственных и международных органов [74]. Среди разнообразных видов продукции наноиндустрии особое место занимают фуллерены, представляющие собой новую аллотропическую форму углерода [25]. Молекулы фуллеренов образованы строго определённым (обычно 60 или 70) числом атомов углерода, соединённых в замкнутый симметричный каркас с формой, близкой к сферической. После открытия фуллеренов в 1985 5 году, их химические свойства были изучены самым подробным образом и синтезировано значительное число их модифицированных производных, включая фуллерены с привитыми боковыми алкильными цепями, гидроксилированные и карбоксилированные, эндоэдральные (с внедренными атомами металла) фуллерены, аддукты фуллеренов с аминокислотами и многое другое. Области практического применения фуллеренов постоянно расширяются и включают химический синтез и катализ, электронику, оптику, полиграфическую, лакокрасочную промышленность, фармакологию, производство парфюмернокосметической продукции, биосенсоров, упаковочных материалов, средств защиты растений и т.д [120]. Поиск среди производных фуллеренов новых биологически-активных соединений, обладающих антиоксидантным, гепатопротекторным, радиопротекторным и другими видами защитного действия на организм человека послужил целью для разработки водорастворимых форм фуллеренов на основе поливинилпироллидоном, их а также комплексов с γ-циклодекстрином, полигидроксилированного фуллерена - фуллеренола С60(ОН)24. Сравнительная простота и технологичность производства фуллеренов, возможность их получения в высокоочищенной (99% чистоты и выше) форме делает их одним из наиболее популярных продуктов современной наноиндустрии. С другой стороны, это приводит к постепенному превращению фуллеренов в значимые контаминанты окружающей среды и к постоянному возрастанию рисков экспозиции человека фуллеренами при различных путях их поступления (кожном, пероральном, ингаляционном), на этапах их производства, использования и утилизации образующихся отходов. Актуальным на сегодняшний день является вопрос экотоксичности фуллеренов и возможности их переноса по трофическим цепям в биосфере [134, 198]. К сожалению, все эти опасения до настоящего времени не сопровождаются нигде в мире какими-либо попытками регуляции фуллеренов; в частности, полностью отсутствует их гигиеническое нормирование в продукции и объектах окружающей среды. Сведения о возможной токсичности фуллеренов и их действии на биологические системы в настоящее время неполны и противоречивы. Главная 6 причина этого – сложности при проведении токсикологических экспериментов, связанные с введением фуллеренов в организмы экспериментальных животных, что определяется очень низкой растворимостью немодифицированных фуллеренов в воде и физиологических жидкостях, а также проблема их идентификации, связанная с их возможной биоконверсией под действием ферментных систем организма [142, 129] Вместе с тем, имеется ряд данных, указывающих на возможность поглощения фуллеренов клетками живых организмов и в культурах, их накопление в субклеточных структурах, влияние на ряд метаболических процессов и возможном кумулятивном эффекте [172, 91]. Согласно некоторым работам, фуллерены, выступая в роли ловушек свободных радикалов, могут обладать мощным антиоксидантным действием [88, 156]. Вместе с тем, в условиях внешнего освещения фуллерены могут выступать в качестве агентов фотокаталитической генерации свободных радикалов, то есть прооксидантов [44]. Сравнительная значимость этих противоположно направленных эффектов для биологических систем изучена недостаточно. Особо существенным является тот факт, что практически полностью отсутствуют экспериментальные данные, полученные после продолжительного воздействия фуллеренов на организм животных. Оценка безопасности новых наноматериалов в Российской Федерации осуществляется по единому плану в соответствии с утверждёнными Роспотребнадзором нормативно-методическими документами. При этом ни один из представителей семейства фуллеренов до настоящего времени не был тестирован в достаточном объёме. Наибольшую значимость и актуальность в свете возможных сценариев воздействия фуллеренов на организм человека имеет их токсиколого-гигиеническая оценка при естественных путях поступления в организм, то есть, в первую очередь, через желудочно-кишечный тракт, а также при ингаляции и эпикутанном воздействии. В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась оценка возможных воздействий важнейших представителей семейства фуллеренов – немодифицированного фуллерена С60 и его водорастворимого производного 7 фуллеренола С60(ОН)24, на показатели состояния организма лабораторных животных при естественном пути поступления через желудочно-кишечный тракт. В задачи работы входило: 1. Разработка методов введения фуллерена животным в составе коллоидных систем, стабилизированных биологически совместимыми полимерами и поверхностно-активными веществами. 2. Адаптация метода количественного определения фуллерена в составе биологических образцов с использованием ВЭЖХ. 3. Изучение поступления фуллерена во внутреннюю среду организма через пищеварительный тракт, биораспределение и бионакопление в условиях острых и подострых экспериментов. 4. Изучение в подостром эксперименте на лабораторных животных продолжительностью от 1 до 3 месяцев возможного токсического действия фуллерена С60 и фуллеренола С60(ОН)24, в том числе на интегральные показатели организма, состояние защитного барьера желудочно-кишечного тракта, биохимические, гематологические, иммунологические показатели, состояние системы антиоксидантной защиты. 5. Изучение в модельных экспериментах возможности биодеградации и биотрансформации фуллелерена С60 под действием ферментных систем организма лабораторных животных. В качестве практически объектов изучения были выбраны наиболее используемые в настоящее время представители широко семейства фуллеренов - немодифицированный фуллерен С60 и его полигидроксилированное производное фуллеренол С60(ОН)24 . В качестве основой биологической модели при исследовании использовали лабораторных крыс линии Вистар. Применяемые жидкостную методы хроматографию исследования (ВЭЖХ), включали высокоэффективную токсикологические, биохимические, энзимологические, иммунохимические, иммунологические, гематологические и цитологические. 8 1.2 Научная новизна работы Впервые проведена систематическая токсиколого-гигиеническая оценка фуллерена С60 в подостром 28- и 92-дневном эксперименте на лабораторных животных с определением широкого круга показателей, характеризующих возможное общетоксическое интегральные, действие физиологические, данного соединения, биохимические, включая гематологические и иммунологические показатели. Впервые показано, что при пероральном введении наноразмерной дисперсии фуллерена С60 в дозе от 0,1 до 10 мг/кг массы тела в течение 28 и 92 дней данное соединение обладает общетоксическим действием на организм животных, что проявляется в частности в дозозависимом повышении проницаемости стенки тонкой кишки для макромолекул белка и увеличении числа CD106+ гранулярных клеток в паренхиме печени. На основании полученных данных определена максимальная недействующая доза фуллерена С60 при подостром пероральном поступлении, находящаяся в интервале от 1 до 10 мг/кг массы тела/сут. В подостром эксперименте продолжительностью 28 дней впервые в нанотоксикологии проведена токсиколого-гигиеническая оценка перорально вводимого фуллеренола С60(ОН)24 с определением широкого спектра показателей, характеризующих предполагаемое общетоксическое действие этого соединения. На основании полученных результатов исследований фуллерена С60 и фуллеренола С60(ОН)24 впервые определена величина максимальной недействующей дозы этого вещества при многократном поступлении через желудочно-кишечный тракт, находящаяся в интервале от 0,1 до 1 мг/кг массы тела/сут. В модельных экспериментах in vitro, воспроизводящих условия биотрансформации и биодеградации фуллерена С60 в организме, впервые установлена быстрая деградация этого вещества под действием ферментных систем организма с образованием недетектируемых при хроматографическом анализе производных. С использованием этих данных объяснены причины противоречий в имеющихся данных литературы относительно процессов бионакопления, биотрансформации и физиологического действия фуллеренов в организме. 9 1.3 Практическая значимость С использованием разработаны, утверждены результатов проведенных исследований Главным государственным санитарным были врачом Российской Федерации и внедрены в работу учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека следующие нормативно-методические документы: - МУ 1.2.2876-11 «Порядок выявления и идентификации наноматериалов в растениях»; - МР 1.2.0048-11 «Порядок и методы определения органотропности и токсикокинетических параметров искусственных наноматериалов в тестах на лабораторных животных»; - МР 1.2.0052-11 «Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета; - МР 1.2.0054-11 «Порядок и методы оценки воздействия искусственных наночастиц и наноматериалов на токсическое действие химических веществ»; - МР 1.2.0053-11 «Оценка воздействия наноматериалов на протеомный профиль и биосинтетические процессы в тестах на лабораторных животных». 1.4 Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: - XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2010); - XIII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» с международным участием (Москва, 2011); - XIV Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» с международным участием (Москва, 2012); - IV Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье. Молодые ученые за устойчивое развитие страны в глобальном мире» с международным участием (Москва, 2012); 10 - Пленуме по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации «Научно-методологические совершенствования и законодательные нормативно-правовой базы основы профилактического здравоохранения: проблемы и пути их решения» (Москва, 2012); - X научно-практической конференции с международным участием «Экспертиза, оценка качества, подлинности и безопасности пищевых продуктов» на базе ГОУ ВПО МГУПП (Москва, 2012); - IX научно-практической конференции «Нанотехнологии производству» (Фрязино, 2013); - 4 съезде токсикологов России (Москва, 2013). 1.5 Публикации По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 1 методические указания и 4 методических рекомендаций. 1.6 Личный вклад соискателя Планирование, организация, проведение экспериментов и исследований на лабораторных животных, работа с методами гравиметрии, спектрофотомерии, ВЭЖХ, ИФА, лазерной спектроакусического конфокальной исследования, флуоресцентной динамического микроскопии, рассеяния света, статистическая обработка полученных данных и их интерпретация. Все изложенные в диссертации материалы получены непосредственно самим соискателем, или при его участии. 1.7 Объём и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, разделов материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит 210 источников, из них 28 11 российских и 182 зарубежных источников. Объем работы составляет 179 страниц машинописного текста, содержит 19 рисунков и 50 таблиц. 12 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Физико-химические свойства фуллеренов Фуллерены и их производные, обладающие рядом уникальных и потенциально полезных свойств, относятся к числу наиболее интенсивно изучаемых наноматериалов. Фуллерены впервые были получены в 1985 г. путём электродугового пиролиза графита в среде инертного газа [25]. Они представляют собой индивидуальные однослойные сферические углеродные структуры, содержащие 60, 70 (Рисунок 1) и более (до 540) атомов углерода, заключенных в замкнутый каркас. Диаметр молекул низших фуллеренов составляет около 0,7 нм, высших – до 15 нм [8]. В настоящее время большой интерес во всем мире вызывают перспективы использования фуллерена С60; его молекула представляет собой усеченный икосаэдр, состоящий из 20 шестиугольников и 12 пятиугольников, внутри которого располагается полость диаметром около 0,5 нм. Благодаря этому уникальному свойству получают такие топологические соединения как эндоэдральные фуллерены, группы атомов в которых расположены именно внутри молекулы фуллерена С60 [147]. Фуллерены являются высоко реакционно-способными молекулами, у которых атомы углерода в составе сферического каркаса находятся в гибридизации sp2, чем достигается высокая стерическая напряженность молекулы и значительная склонность к вступлению в реакции присоединения нуклеофилов [82]. С6 0 С7 0 Рисунок 1. Фуллерены С60, С70 и фуллеренол С60(ОН)24 С60(ОН)24 13 Для немодифицированных фуллеренов характерна практически полная нерастворимость в воде и биологических жидкостях и существенная (или даже высокая) растворимость в малополярных органических растворителях (толуол, бромбензол и др.) [25], а также достаточно неплохая растворимость в эфирах жирных кислот [51]. Но даже в растворенном состоянии, молекулы фуллеренов имеют высокую склонность к агрегации, что усложняет любые исследования их свойств [197]. Для решения этих задач существуют подходы к подготовке стоковых растворов фуллерена С60 [149] (Таблица 1), не содержащих органических растворителей. Последнее обстоятельство существенно при проведении экспериментов на живых организмах, поскольку следы органического растворителя, прочно связанные агрегатами частиц фуллерена, способны проявлять собственное токсическое действие, что затрудняет корректную интерпретацию получаемых результатов. Таблица 1 Обзор подходов к подготовке стоковых растворов фуллерена С60 [149], не содержащих органических растворителей Приготовление Метод приготовления Фильтрация стоковой суспензии 1 2 Измельчение: фуллерен С60 + деионизованная Нет данных вода + SDS + УЗ обработка Обмен растворителями: Этанол/C60 + деионизованная вода + УЗ обработка + отгонка на роторном испарителе 0,45 мкм Характеристика Определение количества Размер частиц (нм) Заряд (Мв) Конц. (мг/л) Метод анализа 3 4 5 6 235 −39,0±1,4 473 Нет данных 4,20±0,86 Жидкостная хроматомассспектрометрия с жидкостной экстракцией 121,8±0,8 −31,6±2,3 14 1 Длительное перемешивание, 2 недели - 11 месяцев: С60 + деионизованная вода Перемешивание 13 дней: С60 в 10 мМ NaCl, pH=4,7, 10 Перемешивание 4 недели: С60 + деионизованная вода + SDS Перемешивание 5 недель: С60 + деионизованная вода Перемешивание 40 дней: С60 + деионизованная вода УЗ-обработка: С60 + кукурузное масло УЗ-обработка: С60 + солевой раствор УЗ-обработка: С60 + деионизованная вода В ряде 2 3 4 5 6 0,45 мкм 178,6±1,2 211,8±1,9 −13,5±1,1 −44,5±0,4 0,22±0,07 0,23±0,05 1.УФ-спектроскопия по светорассеянию испарённого образца 2.УФ-спектроскопия с ультрафильтрацией Нет данных 513–1270 −61,8 до −43 250 Нет данных Отстаивание + 10 мкм 380 Нет данных 50 Взвешенная масса вещества на добавленный объем растворителя Нет данных 360±210 Нет данных Нет данных Нет данных 0,45 и 0,22 мкм 83,1 −60 до −30 (при pH 5,5) 3,34 Общий органический анализ углерода Нет данных 234–3124 Нет данных Нет данных Нет данных Нет данных 407–5117 Нет данных Нет данных Нет данных 1.7±0.12 Жидкостная хроматомассспектрометрия с жидкостной экстракцией 0,45 мкм 130±1 −40±1 исследований были предприняты попытки повышения растворимости фуллеренов в воде для их введения в биологические системы. Этого можно было достичь за счёт использования поверхностных модификаций, растворителей, длительного перемешивания и механических воздействий (механоактивации). Однако способность этих процессов также влиять на токсичность использования фуллеренов требует растворителей, оценки, которые особенно сами по при себе рассмотрении могут обладать токсичностью. В качестве примера можно привести работу [57], выполненную на E.coli, в которой для проведения тестов осуществляли подборку комбинации 15 органического растворителя/ПАВ для солюбилизации фуллерена. Среди шести комбинаций растворителя, сочетание диметилсульфоксида с Твин-80 было оптимальным для определения отношения «доза-эффект», с целью оценки его воздействия на кишечную палочку. Для изучения свойств фуллеренов в биологических системах используют их стабильные коллоидные растворы в воде [35, 125, 126, 127, 130, 116], мономолекулярные плёнки, нанесённые на поверхности различного вида [55, 75, 144, 153], водорастворимые комплексы с γ-циклодекстрином или синтетическими полимерами [4, 26, 43, 108, 109, 148, 194, 202, 44], включение фуллеренов в липосомы [63]. В настоящее время модифицированных получено производных значительное число фуллеренов, химически включая их полигидроксилированные формы или фуллеренолы С60(ОН)n (Рисунок 1) [162], модифицированные фуллерены с «привитыми» боковыми органическими группами [185], аддукты с γ-циклодекстрином [184], соединения включения, представляющие собой фуллерены с заключенным в полости молекулы атомом металла [65], и многие другие. Исследования, посвященные биологическому действию химически модифицированных водорастворимых производных фуллеренов, также довольно многочисленны. 2.2 Характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов в экспериментах in vitro и in silico Опасности для здоровья человека, связанные с воздействием фуллеренов, в данный момент недостаточно охарактеризованы, и необходимы дальнейшие исследования для того, чтобы количественно охарактеризовать эти эффекты в целях полноценной оценки риска. Характеристика токсических свойств фуллеренов и их разнообразных химически модифицированных производных имеет большое значение в свете существующих попыток использования фуллеренов в качестве пищевых добавок и ингредиентов [170], в косметической продукции [102], перспектив применения фуллеренов в медицине [37, 121], в 16 частности, в качестве радиопротекторных агентов [94, 47], антиоксидантов и акцепторов свободных радикалов [25, 88, 156, 169, 100], в качестве компонентов лекарственных препаратов, обладающих в некоторой степени антипролиферативными [72, 206], противоопухолевыми [89, 87, 86, 196, 199], противовирусными [166, 155] и нейропротекторными свойствами [164, 165, 200], а также для эффективной доставки лекарственных средств [110, 119, 61]. Следует также иметь в виду, что по мере расширения производства и промышленного применения фуллеренов их определённые количества смогут поступать в окружающую среду и становиться значимыми контаминантами экосистем и пищевой продукции [32]. Как показали исследования на клетках E.coli, фуллерен С60 не был генотоксичен в SOS-хромотесте [11]. Этим результатам, однако, противоречат данные работы [66], в которой воздействие водных дисперсий С60 на клетки бактерий Pseudomonas putida и Bacillus subtilis в концентрации 0,01 - 0,5 мг/л, вызывало значительную модификацию свойств клеточных мембран и значимое ингибирование их роста. Согласно [44] солюбилизированный поливинилпирролидоном фуллерен вызывал повреждение клеток E.coli по механизму развития оксидантного стресса. В основе наблюдаемой токсичности фуллерена лежат фотоиндуцированные физико-химические и клеточные процессы, включая окислительные, генотоксические [112, 191] и цитотоксические реакции, одной из главных причин которых является образование фуллеренами активных форм кислорода [105]. В исследовании [44] на бесклеточных системах немодифицированный фуллерен С60, солюбилизированный поливинилпирролидоном, обладал способностью генерировать синглетный кислород и супероксид анион, но не радикалы гидроксила. Аналогичная активность установлена для фуллеренола. Для выяснения параметров токсичности коллоидных частиц фуллерена С60 и С70 [97] проводили эксперименты в бесклеточной системе, содержащей фуллерен и молекулы белков (БСА). С использованием метода ядерного магнитного резонанса с импульсным градиентом магнитного поля, метода 17 асимметрического фракционирования течением под влиянием поля (AFFFF) и метода динамического лазерного светорассеяния (фотонная корреляционная спектроскопия, ФКС) показано, что наночастицы комплексов фуллеренов с белком в культуральной среде не принимают жесткую сферическую структуру, а имеют скорей гибкую структуру. Поскольку углеродные наноматериалы одинакового химического состава, но с различными геометрическими структурами обладают абсолютно разной биологической активностью и цитотоксичностью, это может оказывать разнообразные воздействия на процессы поглощения этих частиц клетками, что имеет немаловажное значение для оценки токсичности in vitro. В исследовании [107] с использованием методов пространственного компьютерного моделирования показано, что фуллерены могут выступать в качестве блокаторов или модуляторов мембранных K+ каналов. Данный эффект, сопряжённый с возможным цитотоксическим действием, послужил основанием для другого исследования методом компьютерного моделирования, где были выявлены наиболее благоприятные белки-мишени для производных фуллерена [79]. По современным представлениям для фуллеренов характерна способность к взаимодействию с биологическими макромолекулами с возможной модификацией их свойств. Путем компьютерного моделирования в работе [205] установили, что молекулы С60 могут препятствовать репарации ДНК. Для взаимодействия фуллеренов с белками характерен, по-видимому, эффект их солюбилизации в гидрофобном ядре глобулы таких крупных белков, как сывороточный альбумин (M=67кД). По данным [59] в растворе сывороточного альбумина удалось получить стабильную дисперсию С60 концентрацией 9,3*10-6 М (6,7 мкг/мл). Этот результат может означать, что, несмотря на практически полную нерастворимость фуллеренов в воде, во внутриклеточной среде в определенных условиях концентрация этих веществ в молекулярной форме может быть довольно значительной. 18 Существует показывающих, значительное что число экспериментальных немодифицированные фуллерены, результатов, как в виде индивидуальных молекул, так и мультимолекулярных коллоидных частиц, могут поглощаться различными клетками высших животных в культуре. Так, кератиноциты человека быстро захватывали 14 С-меченный фуллерен С60, вводимый в виде мультимолекулярных ассоциатов диаметром 3 мкм [161]. По мнению авторов работы после адгезии этих ассоциатов (не относящихся с точки зрения их размера к НЧ) к плазматической мембране клетки может происходить диффузия отдельных молекул фуллерена C60 через липидный би-слой. Согласно данным [125] наблюдается активный фагоцитоз полиморфноядерными нейтрофилами мультимолекулярных коллоидных частиц фуллерена C60. Авторы исследования [178] наблюдали поступление молекул фуллерена С60 в клетки зачатков конечностей эмбриона крысы; в качестве формы введения использовали дисперсию частиц фуллерена C60, стабилизированную поливинилпирролидоном. Как показано в работах [145, 146] агрегированные частицы фуллерена С60 захватываются макрофагами человека и выявляются затем методом просвечивающей электронной микроскопии в цитоплазме, лизосомах и, что наиболее существенно, в ядре клеток. Таким образом, высокая гидрофобность фуллеренов, с одной стороны, ограничивает возможность их контакта с клетками ввиду малой растворимости в воде и, с другой стороны, является причиной высокой мембранотропности этих веществ. В модельной системе показано [150], что фуллерен С60 способен проходить через липидный бислой мембраны в течение нескольких миллисекунд, в то время, как водорастворимый фуллеренол С60(ОН)20 через мембрану практически не проникает [168]. Судя по результатам представленных выше работ, следует предполагать наличие двух механизмов проникновения фуллеренов в клетки: 1) трансмембранная диффузия молекул фуллеренов из состава мультимолекулярных поверхности плазматической комплексов, «прилипающих» мембраны, и 2) к внешней фагоцитоз крупных 19 мультимолекулярных агрегатов с их последующей дезинтеграцией внутри клетки [25]. В большом числе исследований было показано, что фуллерены обладают низкой цитотоксичностью для различных клеточных культур in vitro. Так, авторами работы [125] показано, что коллоидная дисперсия C60 не проявляла цитотоксического действия в отношении лейкоцитов человека. Этот же препарат согласно данным [161] не влиял на скорость синтеза ДНК и пролиферацию кератиноцитов человека. Фагоцитоз частиц фуллерена микронного размера не вызывал увеличения секреции провоспалительного интерлейкина 1β [127]. При действии на бычьи альвеолярные макрофаги фуллерен С60 проявлял значительно меньшую цитотоксичность в сравнении с референтными НЧ кварца (кристаллического диоксида кремния) DQ12 [35]. В культуре J774 макрофагов крысы фуллерен не стимулировал выделение окиси азота, не вызывал апоптоза и гибели клеток [68]. Инкорпорированный в липосомы фуллерен не проявлял фотоцитотоксичности в отношении фибробластов мыши [100]. Аналогично не было выявлено токсичности C60 в виде мультимолекулярной дисперсии в отношении человеческих моноцитов, лейкоцитов и макрофагов [56]. В этой же работе установлено, что фуллерен не влиял на рост в культуре ряда видов прокариот, включая E.coli, P.aeruginosa, S.typhimurium, S.aureus, L.monocytogenes, E.hirae, B.cereus, B.subtilis, B.pumilus, а также дрожжей C.albicans. В работе [189] не наблюдали угнетающего действия фуллерена для E.coli или B.subtilis при концентрации 340 мкг/мл в течение 16 ч. На клеточной линии мыши BALB/3T3 показано, что раствор поливинилпирролидоном, не фуллерена мутагенен С60, и не солюбилизированного оказывает на клетки трансформирующего действия [157]. Фуллерены, нанесённые на твёрдую поверхность в количестве 10, 20 и 30 мкг/см2, не влияли на скорость роста почечного эпителия зелёной мартышки линии МА-104 [25]. В работе [172] сообщается об исследованиях агрегации, клеточного поглощения и цитотоксичности фуллеренола. Выявлено, что C60(OH)х показал высокую токсичность для клеток легких и яичника китайского хомяка, но почти 20 не повлиял на культуру клеток L929, в связи с чем можно предполагать, что цитотоксичность фуллеренола проявляется избирательно, в зависимости от конкретного типа клеток. Эти данные не подтверждается результатами работы [131], в которой фуллеренол С60(ОН)24 не проявлял цито- и генотоксических свойств в отношении яйцеклеток хомяка даже при заведомо агравированной дозе, составившей 2 мМ (более 2 мг/мл культуральной среды). В работе [48], выполненной на клетках гемолимфы мидий, отмечали усиление под действием наночастиц фуллерена выделения из клеток лизоцима и реакционноспособных соединений кислорода, включая оксид азота, в разной степени в зависимости от концентраций и размера применяемых наночастиц. Провоспалительное действие наночастиц было опосредовано быстрой активацией стресс-активированного р38 и митоген-активированной протеин киназы. Результаты показывают, что у двустворчатых моллюсков иммунная система является, по-видимому, мишенью воздействия наночастиц фуллерена. Таким образом, представленные данные указывают в основном на отсутствие у немодифицированных фуллеренов цитотоксичности. Однако, большинство из цитированных выше работ проводились с клеточными культурами в темноте. Учитывая наличие у немодифицированного фуллерена сильно выраженных фотосенсибилизирующих свойств [25, 204], следует ожидать, что характер цитотоксического действия этих соединений при освещении может быть принципиально иным. Действительно, в исследовании [177] показано светозависимое цитотоксическое действие фуллерена C60, солюбилизированного поливинилпирролидоном. Механизмом токсического действия фуллеренов в условиях освещения является окислительный стресс [95, 138, 140, 158, 163, 203]. Это подтверждается тем фактом, что цитотоксичность фуллерена C60 в условиях освещённости блокируется антиоксидантом гипоксеном [25]. Авторы работы указывают на то, что у фуллерена, адсорбированного на твёрдой поверхности, появлялись цитотоксические свойства, если эксперимент проводился при освещении. В исследовании [204] крупные агрегаты фуллерена не проявляли фотоцитотоксических свойств, тогда как мономерный фуллерен C60, 21 солюбилизированный циклодекстрином, проявлял на свету высокую цитотоксичность для клеток хрусталика человека. Процесс гибели клеток протекал по типу апоптоза и опосредовался образованием синглетного кислорода. Авторы работы [31] оценили безопасность водорастворимых фуллеренов, включенных в поливинилпирролидон (ПВП/фуллерены) в качестве антиоксидантов в косметических и фармацевтических препаратах путем изучения генотоксичности, фуллеренов. фототоксичности Полученные авторами и прооксидантных работы эффектов самих солюбилизированные формы фуллерена не обладали мутагенными свойствами при тестировании на любых штаммах бактерий и не вызывали хромосомных аберраций в культурах клеток млекопитающих. ПВП/фуллерены не проявляли цитотоксичности при облучении ультрафиолетом или при симулировании альтернативных испытаний на фототоксичность. Кроме того, они не демонстрировали какого-либо прооксидантного эффекта в присутствии Fe2+ или Cu2+. По мнению авторов ПВП/фуллерены являются безопасными для использования в косметической и фармацевтической промышленности. Авторы работы [99] растворяли фуллерен C60 в сквалене и изучали его защитные эффекты против воздействия 2,4-нонадиеналя (НДН) на HaCaT кератиноцитах и оценивали образование морщин в трехмерной 3D-модели кожи человека. НДН является аналогом 4-гидроксиноненаля, являющегося одним из основных веществ, создающих запах человеческого тела, свидетельствующий о старении, и, одновременно, липофильным фактором повреждения клеток. Жизнеспособность кератиноцитов, выраженная в % от контроля, снизилась до 31,6% при обработке НДН в концентрации 40 мкМ, но увеличилась до 66,0-97,5%, когда раствор фуллерена в сквалене вводили за 5 часов до добавления НДН. Защитный эффект препарата был значительно большим, чем от одного только сквалена в тех же дозах. Раствор фуллерена в сквалене также защищал клетки от повреждения ДНК и апоптоза. На основании этих данных предполагается, что фуллерен C60, растворенный в сквалене, малотоксичен для клеток кожи и его 22 можно использовать в качестве косметического ингредиента против формирования морщин. В дискуссионной работе [70] сопоставлено взаимодействие двух химически модифицированных производных фуллерена, гексакарбоксильного аддукта фуллерена (гекса-C60) и трискарбоксильного аддукта фуллерена (трис-C60) с чистым фуллереном C60, инкапсулированным в γ-циклодекстрин (CD-C60), на модели клеток эпителия кожи человека для моделирования возможных последствий профессиональной кожной экспозиции. Исследовали жизнеспособность клеток, внутриклеточную генерацию реакционноспособных форм кислорода (РСК), клеточную пролиферацию и изменения клеточного цикла. В частности показано, что трис-C60 индуцировал ответы, связанные с консервацией клеток на G(0)/G(1) фазах клеточного цикла и клеточным старением. Механизмы наблюдаемых эффектов могут быть связаны с воздействием фуллерена на активность клеточной убиквитин лигазы из семейства HERC, принимающей участие во врожденном иммунном ответе на вирусные и бактериальные инфекции. Авторы работы [100] наносили липосомы, содержащие фуллерен, на поверхность трехмерной модели ткани человеческой кожи, затем промывали и облучали УФ-излучением при 4 Дж/см2, а затем повторяли обработку еще в 19циклах в течение 4 дней (в сумме 76 Дж/см2). С помощью сканирующего электронного микроскопа были обнаружены последствия УФ облучения, такие как увеличение и нарушение рогового слоя эпидермиса, разрушение коллагена типа I / IV, расщепление ДНК нити и пикноз/кариорексис. Эти повреждения были частично подавлены ненагруженными липосомами, но в значительно большей степени липосомами, содержащими фуллерен, в концентрации до 0,75 мг/л C 60эквивалента. В этих условиях фуллерен C60 проникал в эпидермис при концентрации 1,86 нмоль/г ткани (1,34 ppm), что соответствует 0,3 % от применяемого количества. экспериментах не был Важно обнаружен отметить, в дерме что фуллерен C60 в с помощью ВЭЖХ, этих что свидетельствует, по мнению авторов, об отсутствии необходимости рассмотрения 23 токсичности этого вещества при его поступления в системный кровоток через кровеносные сосуды кожи. На основании полученных данных в работе был сделан вывод, что фуллерен, включенный в липосомы, имеет обширный потенциал для безопасного использования в качестве компонента косметических средств для защиты от УФ-излучения. О сходных результатах сообщается в работе [189], где коллоидные наночастицы фуллерена С60 со средним размером около 43,8 нм проявляли антиоксидантную активность in vitro, сравнимую с водорастворимым витамином Е. Отсутствие смертности кератиноцитов эпидермиса человека наблюдали при концентрации фуллерена в 170 раз большей, чем ранее установленные величины LD50 фуллерена С60 для некоторых других клеточных линий человека. По мнению авторов, фуллерен С60 нетоксичен, и ранее выявленные проявления его токсического действия объясняются эффектами со стороны применявшихся носителей (главным образом, органических растворителей). Согласно работе [186] водорастворимые наночастицы гидроксилированного фуллерена (фуллеренол C60(OH)22-26) обладают одновременно цитотоксическим и фототоксическим действием на эпителиальные клетки хрусталика глаза человека (HLE B-3), причём эндогенный антиоксидант лютеин блокирует в некоторой степени эту фототоксичность. По мнению авторов в условиях in vivo воздействие фуллеренола на глаз, особенно в присутствии солнечного света, может привести к повреждению сетчатки. В высоких дозах фуллеренол in vitro проявлял цитотоксичекое действие в отношении клеток эндотелия человека [193]. И, напротив, авторы работы [117] наблюдали выраженное антиоксидантное действие в условиях ангиотензин-2-индуцированного оксидантого стресса на культуре клеток эндотелия пупочной вены человека для калиевой соли пентафенилфуллерена, образующей в воде мицеллярные растворы. Указанное соединение, по мнению авторов, может также быть эффектором процессов, связанных с высвобождением ангиотензина II. При оценке этих данных следует учитывать, что ангиотензин II это не просто физиологически активное вещество с гемодинамическим и почечным действием, а скорее биологически активный 24 посредник, который напрямую воздействует на эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов [78]. Этот пептид играет ключевую роль в инициации и усилении патофизиологических процессов, приводящих к сосудистым заболеваниям. Кроме того, ангиотензин II является главным медиатором окислительного стресса и снижает активность оксида азота путем активации НАДН/НАДФН-оксидазы, тем самым, генерируя супероксид-анион. Фототоксичность для кератиноцитов человека фуллерена С60 в виде аддукта с γ-циклодекстрином и фуллеренола С60(ОН)24 была охарактеризована в сравнительном аспекте [204] с использованием модели оценки токсичности, индуцированной УФ и видимым светом. При этом было показано, что полигидроксилирование фуллерена сопровождается снижением токсического действия в 60 раз, несмотря на то, что обе формы наноструктур были способны генерировать супероксид и синглетный кислород под действием светового излучения. Применительно к фуллеренолу эти данные подтверждаются также работой [154], выполненной на эпителиальных клетках хрусталика человека. Фототоксичность фуллеренола опосредовалась продукцией синглетного кислорода; данный эффект ингибировался антиоксидантным каротиноидом лютеином. Хотя, как отмечают авторы, фототоксичность фуллеренола была низкой, его высокий тропизм к клеткам хрусталика и длительное пребывание в их составе могут привести in vivo к нежелательным последствиям. Известно, что немодифицированный в зависимости фуллерен С60 от способен условий проявлять эксперимента, не только прооксидантные, но и антиоксидантные свойства [71]. В частности, авторами исследования [190] показано, что дисперсии фуллерена, стабилизированные полиэтиленгликолем, изостеаратаом, поливинилпирролидоном и γ- циклодекстрином, а также растворимый фуллеренол могут выступать в роли ловушки свободных радикалов супероксид-аниона и гидроксила. Полученные по указанной технологии фуллеренсодержащие препараты оказывали протективное действие на кератиноциты человека в отношении УФ-облучения [133, 76, 77]. 25 В исследовании [92] в сравнительном аспекте охарактеризованы механизмы цитотоксичности фуллерен C60 и его полигидроксилированного производного фуллеренола в отношении различных клеточных культур: мышиных клеток фибросаркомы L929, крысиных клеток глиомы tC6, человеческих клеток глиомы U251. Цитотоксичность фуллерена была выше, чем у фуллеренола, на 3 порядка величины. С60 вызывал быстрый некроз (по механизму фотореактивного окисления) клеток без фрагментации ДНК, в то время как фуллеренол индуцировал апоптоз, фрагментацию ДНК, нарушения клеточной мембраны. Использование антиоксидантов (N-ацетилцистеина) приводило к нивелированию токсического эффекта фуллерена С60, но не фуллеренола, действие которого блокировал ингибитор каспазы. Можно предположить, что в отличие от фуллерена, для которого основным механизмом воздействия на клетки является фотоиндуцированная продукция свободных радикалов, гидроксилированное производное в высоких дозах оказывает, по-видимому, влияние на внутриклеточные молекулярные механизмы апоптоза, связанные с процессами ограниченного протеолиза, запускаемыми активацией каспаз. Интересные результаты были получены в работе [200]. Авторы показали, что направленность биологического действия и возможная токсичность фуллеренола, связаны с его локальной концентрацией в месте его действия. Эти данные были получены в исследовании влияния различных концентраций фуллеренола на культивируемые нейроны гиппокампа крысы. При этом фуллеренол в зависимости от концентрации либо способствовал гибели клеток, либо защищал их от повреждения. Причина этого, по мнению авторов, состоит в том, что при высоких и при низких концентрациях фуллеренол по-разному действует на окислительно-восстановительные процессы в клетке. Таким образом, результаты исследований цитотоксических свойств фуллеренов и их производных в системах in vitro противоречивы. Имеется достаточно большое количество работ, в которых фуллерены практически не проявляли цитотоксического действия, и не меньшее число исследований, показавших способность фуллеренов вызывать гибель клеток, оксидантный 26 стресс, апоптоз и другие нежелательные эффекты. В свете имеющихся данных о физико-химических свойствах фуллеренов и их производных очевидно, что расхождение этих результатов обусловлено как условиями проведения опыта (вид клеточной линии, концентрация, способ введения, проведение эксперимента в темноте либо при освещении), так и различиями в интерпретации данных, полученных на основе определения различающихся, часто не сопоставимых параметров. При этом необходимо отметить, что возможность экстраполяции данных о токсичности для клеточных культур in vitro на условия in vivo, отвечающие естественному пути поступления токсикантов в организм (с пищей, водой, вдыхаемым воздухом, через неповрежденную кожу) вообще, как правило, затруднена при отсутствии надёжных данных о всасывании, биодоступности, биоаккумуляции, биотрансформации и кинетике выведения этих веществ из организма. В случае же фуллеренов и их производных при этом возникают и специфические трудности, связанные с разным характером их биологического действия в темноте и на свету, возможными немонотонными зависимостями выявляемых эффектов от концентрации, высокой реакционной способостью фуллеренов, неопределенностью в вопросе о составе и возможной биологической активности продуктов их метаболизации в организме. 2.3 Характеристика токсичности и биологического действия фуллеренов in vivo При исследовании фуллеренов в системах in vivo форма их введения в организм животных может оказывать значительное влияние на результат. В ранних исследованиях по токсичности фуллерена C60 его перевод в водные растворы осуществляли, растворяя это вещество в тетрагидрофуране (ТГФ) с последующим разбавлением системы водой и отгонкой органического растворителя на роторном испарителе [25]. При действии таких дисперсий фуллерена на биологические системы часто наблюдались негативные эффекты. Примером может служить работа [138], в которой изучали воздействие водно- 27 органической дисперсии фуллерена С60 на личинок окуня Micropterus salmoidus. Признаками токсического эффекта явились значительное окисление липидов в мозгу, истощение пула тканевого восстановленного глутатиона, при этом гибель организмов не наблюдалась. В настоящее время доказано, что указанная методика перевода фуллерена в водорастворимую форму является неудовлетворительной, поскольку даже при самой интенсивной отгонке растворителя определённые его количества остаются связанными в составе мультимолекулярных фуллереновых мицелл. К тому же, особенно в условиях проведения экспериментов на свету, следует учитывать реакцию генерации РСК, катализатором которой является С60, с последующим окислением ТГФ, дающим высокотоксичные производные, такие, как гидроперекись ТГФ, γ-бутиролактон и тетрагидро-2-фуранол [81, 201]. Для подтверждения этого в цитируемой работе изучали in vivo в сравнительном аспекте токсичность фуллерена С60 в форме чисто водной дисперсии (полученной под действием ультразвука) и в виде «раствора», полученного с применением ТГФ. Экспериментальной моделью послужили личинки аквариумной рыбки Danio rerio (зебрафиш). В результате показано, что под воздействием системы ТГФ-C60 наблюдалась значительная гибель рыбок, а у выживших была отмечена повышенная экспрессия генов ферментов, участвующих в антиоксидантной защите. В отличие от этого, чисто водная дисперсия фуллерена С60 никакого воздействия на рыбок в данных условиях не оказывала. Аналогичные результаты, свидетельствующие о высокой токсичности продуктов фотоокисления ТГФ, находящегося в прочном комплексе с фуллереном, были получены на модели дафний [167]. В работе [91] поглощение фуллеренов (гомологов от С60 до С98) личинками зебрафиш из водной дисперсии изучали с помощью стабильноизотопной метки 13 С. Интенсивную абсорбцию фуллеренов рыбками наблюдали на протяжении 12 часов. Поглощенные фуллерены вызывали дозозависимую гибель рыбок, на основании чего была рассчитана LD50, которая составила 0,079 мг/кг массы тела. На основании этих данных можно сделать вывод, что фуллерены следовало бы 28 отнести к высоко токсичным веществам. Можно предположить, что причиной такого результата могла явиться методика перевода фуллерена в «водорастворимую» форму, для чего использовали диметилсульфоксид (ДМСО). По данным авторов работы суспензии фуллерена С60 в ДМСО готовили добавлением 0,5 мг фуллерена к 10 мл ДМСО; полученную суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 1 недели для достижения номинальной концентрации 0,05 мг/мл. Водные растворы для обработки гидробионтов готовили путём последовательного разведения полученных коллоидных дисперсий до нужной концентрации; в определённых случаях при приготовлении «растворов» фуллерена применяли также толуол. Очевидно, что в этих условиях определённые собственное количества токсическое применяемых действие на растворителей гидробионты, могли которое оказывать никак не контролировалось. В исследовании [210] токсичность водных дисперсий фуллерена С60 для зебрафиш была изучена в хроническом эксперименте. В результате длительного для данного вида организмов (96 ч) воздействия С60 в концентрации 1,5 мг/л наблюдали замедление развития личинок, снижение двигательной и поисковой активности, отёк перикарда. Эксперименты проводили на свету, токсическое действие фуллерена подавлялось восстановленным глутатионом, из чего сделан вывод, что механизм токсичности фуллерена, по-видимому, состоит в фотоиндуцированном образовании РСК, вызывающих in vivo каскад реакций перекисного окисления. В отличие от немодифицированного фуллерена С60, его полигидроксилированное производное было не токсично. Как показали [181, 182] при обработке личинок зебрафиш фуллереном С60 в темноте смертность снижалась на 30%, уродства на 40%, а перикардиальный отек на 85% по сравнению с аналогичным воздействием при освещении. При повышении уровня внутриклеточных антиоксидантов (восстановленного глутатиона) токсичность также снижалась. Инкубация личинок с глутатионом не изменяла токсичности, возможно, ввиду отсутствия проникновения трипептида в клетки, однако инкубация с N-ацетилцистеином привела к снижению смертности на 30%, 29 перикардиального отека на 50%. Инкубация с аскорбиновой кислотой также вызывала снижение токсичности. Воздействие совместно с бутадионином сульфоксимином и диэтилмалеатом (ингибиторы синтеза глутатиона) приводило к резкому повышению токсичности фуллерена С60. Аналогичные результаты были получены [209, 208], которые выявили наличие фотоиндуцированной токсичности фуллерена С60 для пресноводного карася. Полученные результаты наглядно иллюстрируют то опосредуется положение, что фотоиндуцированная свободнорадикальными процессами токсичность С 60 перекисного окисления, механизм защиты от которых реализуется при участии системы восстановленного глутатиона (возможно, посредством действия глутатионпероксидазы). В работах [115, 207, 104] сообщается о токсичности обработанных ТГФ и ультразвуком водных дисперсий фуллерена для дафний. При этом авторы исследования [115] не наблюдали выраженного дозозависимого эффекта (наиболее токсичными были растворы низкой концентрации). Токсичность распределенных в воде мультимолекулярных частиц фуллерена для личинок рыбы Fundulus heteroclitus исследована в статье [41]. При воздействии на эмбрионы и взрослых особей, в возрастающих концентрациях водная дисперсия агрегированных наночастиц фуллерена С60 (наноC60) смертность организмов отмечалась в очень малой степени, вследствие чего LD50 не может быть точно рассчитана; её величина, во всяком случае, превышала 10 мг/л в расчёте на фуллерен С60. Агрегаты наноC60 скапливались у хориона, но не влияли на развитие эмбрионов или успешность процесса их выведения из икринок. Таким образом, наноC60 практически не обладал эмбриотоксичностью в отношении Fundulus heteroclitus. Немодифицированные фуллерены обладали эмбриотоксическим эффектом у мышей согласно данным [177]. В отличие от этого, в работе [103] эмбриотоксическое действие чисто водной дисперсии фуллерена С60 (но не его дисперсии, полученной с использованием толуола) не было подтверждено на модели эмбрионов рыбы Oryzias latipes. Среди особенностей цитируемой работы следует указать на то, что авторами исследовалось влияние на токсические 30 свойства водных дисперсий различных углеродных наноматериалов (фуллеренов, многослойных нанотрубок) органического вещества донных отложений, что важно для оценки экотоксичности при реальных сценариях воздействия на гидробионты в природных условиях. Применительно к водной дисперсии фуллерена С60 никакого влияния на его эмбриотоксические свойства органические вещества донных отложений не оказывали, тогда как в случае дисперсий, полученных с использованием толуола, отмечалось выраженное снижение интенсивности выявляемых эффектов. В работе [104] не наблюдали гибели Daphnia rulex, подвергнутых воздействию водных дисперсий мультимолекулярных частиц фуллерена С60, но отмечали повышение активности каталазы и глутатион-S-трансферазы в организме рачков, что свидетельствовало об известном «перенапряжении» функционирования системы антиоксидантной защиты. Авторы работы [49] исследовали возможные последствия воздействия различных наночастиц, в том числе фуллеренов, в естественных условиях на мидий. Мидий подвергали воздействию различной концентрации (0,05-0,2-1-5 мг/л) суспензий наночастиц в течение 24 часов, после чего различные биомаркеры были оценены в гемоцитах, пищеварительных железах и жабрах. В пищеварительной железе все виды наночастиц индуцировали лизосомальное накопление липофусцина только при высоких концентрациях в различной степени в зависимости от типа тестируемых наночастиц. В отличие от наночастиц серебра, TiO2 и SiO2, фуллерены не индуцировали накопление нейтральных лизосомальных липидов. По остальным параметрам токсического действия наночастицы фуллерена занимали, как правило, промежуточное положение между наиболее токсичными наночастицами серебра и относительно менее токсичными оксидными наночастицами. В целом, эти данные показывают, что беспозвоночные-фильтраторы являются значимой мишенью для наночастиц в водной среде. Как показано [47] фуллеренол С60(ОН)24 защищает мышей от ионизирующего излучения, индуцирующего иммунную и митохондриальную 31 дисфункцию. В этих исследованиях мышам предварительно вводили внутрибрюшинно раствор фуллеренола C60(OH)24 в течение 2 недель (ежедневно, в дозе 40 мг/кг массы тела), затем подвергали облучению всего тела смертельной дозой гамма-облучения (от источника 60Co). Выживание наблюдали в течение 30 дней после облучения. Было установлено, что введение C60(OH)24 перед ионизирующим облучением фактически спасает организм от его детерминированных эффектов без какой-либо видимой токсичности в данной дозе. Предварительная обработка животных фуллеренолом C60(OH)24 в более высоких дозах, вызывающих снижение иммунной функции и функции митохондрий, также показала значительный защитный эффект от ионизирующего излучения. Эти результаты показывают, что полигидроксилированные производные фуллерена являются эффективными радиопротекторами, что совпадает по существу с данными работ, представленных в обзоре [76]. В работе [160] изучали действие фуллерена С60 и фуллеренола на лёгкие крысы in vivo при интрарахеальном введении. Изучаемыми показателями были содержание клеток, окислителей и глутатиона в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), клеточная пролиферация и гистопатологическое исследование лёгких через 1 день, 1 и 3 месяца после введения предполагаемых токсикантов. В результате показано, что как фуллерен, так и фуллеренол оказывали только транзиторное воспалительное действие, в то время как для контрольного образца – НЧ кристаллического SiO2 (кварца) отмечался выраженный стойкий токсический эффект по всем изучаемым показателям. Авторы исследования [123] изучали in vivo в легких крыс воспалительные реакции и экспрессию генов цитокин-индуцированных факторов хемотаксиса нейтрофилов HNP -1, -2αβ и -3, после ингаляционных воздействий немодифицированного фуллерена С60. Использовали наноразмерные дисперсии, стабилизированные путем измельчения в агитационной мельнице в среде азота, после чего проводили исследования при интратрахеальных инстилляциях и ингаляционном воздействии. В первом случае фуллерены диспергировали в дистиллированной воде содержащей 0,1% Твин 80, диаметр агрегатов фуллеренов 32 составил 33 нм. Полученные суспензии вводили интратрахеально крысам самцам линии Вистар в дозах 0,1 мг, 0,2 мг, или 1 мг, после чего их забивали через 3 дня, 1 неделю, 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев. Во втором случае, при исследовании ингаляционного воздействия крыс подвергали воздействию агрегатов фуллерена диаметром 96±5 нм в концентрации 0,12±0,03 мг/м3 на протяжении 6 часов в сутки, по 5 сут в неделю, в течение 4 недель, после чего их умерщвляли через 3 сут, 1 и 3 мес по окончании экспозиции. В результате, после интратрахеальных инстилляций в дозе 0,1 и 0,2 мг, в легких крыс не было выявлено значительного увеличения общего числа клеток и нейтрофилов в БАЛ, а также отсутствовала экспрессия генов HNP-1, -2αβ и -3. Однако, в группе, получавшей фуллерен в высокой дозе (1 мг), было обнаружено временное значительное увеличение содержания нейтрофилов и экспрессия генов HNP-1, -2αβ и -3. При ингаляционном воздействии не было выявлено изменений в изучаемых показателях во всех применявшихся концентрациях. Авторы предположили, что хорошо диспергированные немодифицированные фуллерены не обладают значительным потенциалом активации нейтрофильного воспаления в легких. В работе [36] изучали ингаляционную токсичность фуллерена С60 для крыс в форме мультимолекулярных НЧ (диаметром 55 нм) или микрочастиц (930 нм). Ингаляцию проводили на протяжении 10 сут по 3 ч в сут в концентрации 2,2-2,3 мг/м3. Исследование БАЛ от животных, экспонированных фуллеренами, продемонстрировало накопление углеродистого материала в вакуолях макрофагов, которое было более выраженными под воздействием НЧ, чем микрочастиц. С другой стороны, биохимические показатели, характеризующие токсичность, изменялись у животных опытной группы незначительно, что дало основание авторам сделать вывод о низкой ингаляционной токсичности фуллерена. В отличие от данных, полученных в предыдущих экспериментах по изучению ингаляционной токсичности, результаты работы [143] показали, что фуллерены C60 могут вызывать воспалительные реакции в легких мышей. В результате ингаляции, фуллерен C60 индуцировал увеличение числа клеток в 33 фазах митоза subG1 и G1 в клетках БАЛ. Было отмечено увеличение выработки противоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1, фактор некроза опухоли-α и ИЛ-6, и увеличение Th1 цитокинов, таких как ИЛ-12 и IFN-. Кроме того, уровень IgE достигал максимума через день после экспозиции как в БАЛ, так и в крови. Экспрессия генов молекул МНС класса II (H2-Eb1) под действием С60 была сильнее, чем у молекул класса MHC I (H2-T23). Кроме того, во время эксперимента постоянно наблюдалась клеточная инфильтрация и экспрессия генов, связанных с поврежденными тканями легких. Исходя из этого, считают, что ингалируемый фуллерен C60 может вызвать воспалительные реакции в легких мышей. Внутрибрюшинное введение мышам и крысам суспензии мультимолекулярных частиц фуллерена диаметром менее 2 микрон в очень высокой дозе (2,5 г/кг) не приводило к гибели животных и изменениям в их поведении на протяжении 8 недель [71, 130]. После забоя животных, подвергнутых воздействию, в их внутренних органах не было выявлено характерных для токсического действия морфологических изменений. Частицы фуллерена активно захватывались селезёнкой, а также Купферовскими макрофагами, гепатоцитами и адипоцитами печени. Выявленная у мышей (но не у крыс) гипертрофия этих клеток, обусловленная их абсорбирующей активностью, не сказывалась, однако, на морфологии органов в целом. В исследовании [130] не выявлено некроза и других признаков повреждения гепатоцитов при парентеральном введении фуллерена животным. В работе [180] определяли острую токсичность фуллеренола для мышей при внутрибрюшинном введении. Значение LD50 составило 1,2 г/кг. Введение фуллеренола в сублетальных дозах от 0,5 до 1,0 г/кг снижало содержание цитохромов Р450 и b5, а также активности НАДФН-цитохром-Р450-редуктазы, бенз[а]пирен гидроксилазы, 7-этоксикумарин-О-дитилазы, анилингидроксилазы и эритромицин-N-деметилазы в микросомах печени. Введение фуллеренола в дозах от 0,01 до 0,1 г/кг не оказывало никаких эффектов на эти монооксигеназы. 34 Водорастворимые полиарилсульфированные фуллерены были способны вызывать фаголизосомальную форму нефропатии у крыс после однократной внутрибрюшинной инъекции в дозе 500 мг/кг или внутривенно в дозе 100 мг/кг. Ультраструктурное исследование показало многочисленные мембранные конгломераты, характерные фаголизосомальные и/или лизосомальные включения в цитоплазме клеток эпителия почечных канальцев. При внутрибрюшинном и внутривенном, но не пероральном введении было отмечено также поражение печени [54]. Достаточно велико число работ, в которых на различных моделях было показано практическое отсутствие у фуллеренов токсических свойств in vivo. Так, авторами исследования [11] проводилась оценка генотоксичности фуллерена C60 для личинок мухи Drosophila melanogaster. При концентрации фуллерена до 0,45 мкг/мл культурального субстрата он не вызывал каких-либо изменений в частоте мутаций, слабый эффект был выявлен только при максимально возможной концентрации 2,24 мкг/мл. В работе [135] изучали активность орнитиндекарбоксилазы и скорость синтеза ДНК в эпидермисе мыши после 72-часового накожного нанесения фуллерена С60 в виде раствора в бензоле в общей дозе 0,2 мг. В результате каких-либо значимых эффектов выявлено не было. Хронические исследования, проведённые на данной модели, показали, что фуллерен не вызывает у животных опухоли кожи. Нанесение фуллерена на кожу мышей в виде раствора в толуоле в течение 20 недель в условиях освещения также не приводило к образованию опухолей [122]. Наблюдавшаяся в месте воздействия препарата эритема может быть объяснена действием растворителя. Большое количество исследований, опубликованных в недавнем обзоре [195] было направлено на изучение у фуллеренов в условиях in vivo антиоксидантых свойств. Обзору ранних работ в этом направлении посвящена статья [30], в которой обобщены результаты тестирования дисперсии фуллерена в различных системах in vivo. В диапазоне концентраций от 10-9 до 10-4 моль/л и суммарной дозе до 25 мг/кг фуллерен не проявлял каких-либо токсических свойств, но демонстрировал выраженное антиоксидантное действие. В настоящее 35 время антиоксидантные свойства изучаются преимущественно для дериватизированных фуллеренов, растворимость которых в воде позволяет вводить их в значимых количествах в биологические объекты. Так, сообщается о наличии антиоксидантных свойств у аддукта фуллерена С60 с β-аланином [84] и цистеином [83]. Что же касается антиоксидантных свойств водорастворимого фуллеронола С60(ОН)24 [175], то они были изучены при воздействии данного соединения на организм крыс, причём установлено также выраженное радиопротекторное действие в отношении внешнего рентгеновского облучения, что было подтверждено гистологическими и гематологическими данными. Согласно [113] фуллеренол предотвращает развитие вызванного ионами Fe(II) перекисного окисления липидов в мозге крыс. Перекисное окисление в мозге крыс, вызванное действием перекиси водорода или перекиси кумола, могло быть блокировано фуллеренолом [176]. Для модифицированного разветвленными боковыми алифатическими цепями, несущими 18 карбоксильных остатков производного фуллерена (дендрофуллерен, ДФ1), показано выраженное радиопротекторное действие в отношении личинок зебрафиш [42], что согласуется с результатами исследования [174], где также была изучена способность ДФ-1 защищать чувствительные к облучению клетки от эффектов высоких доз гамма излучения. Были подтверждены данные об отсутствии токсичности в клетках при использовании ДФ-1, притом, что ДФ-1 защищал лимфоциты человека и кишечные крипты клеток крыс от радиационно-индуцированной гибели клеток. Авторы большинства исследований сходятся во мнении о том, что перевод фуллеренов в гидрофильные, водорастворимые формы, например, путём их гидроксилирования, значительно снижает их токсичность. Так, в исследовании in vivo на крысах, получавших интратрахеальные инстилляции фуллерена и фуллеренолов в сопоставимых дозах от 0,2 до 3,0 мг/кг [159] установлено, что перевод фуллеренов в высокорастворимые производные снижает их токсичность в 7 и более раз. По данным [25] LD50 для фуллеренола при внутрибрюшинном введении мышам составила 1,2 г/кг массы тела, что сравнимо с величиной для 36 такого считающегося малоопасным соединения, как хлористый натрий. В работе [192] водорастворимое производное фуллерена С60 не вызывало гибели мышей в течение 1 недели после его парентерального введения в дозе до 500 мг/кг. Аналогично, в работе [2] показано отсутствие токсического действия аддукта фуллерена с аминокислотой серином при парентеральном введении мышам. Для фуллеренкарбоновых кислот, производных фуллеренов С60 и С70 не выявлено цитотоксичности в отношении В-лимфоцитов и изменений в дофаминергической системе чёрной субстанции при введении непосредственно в мозг [90]. Авторы работы [53] отмечают высокую эффективность гидроксилированного соединения включения С82(ОН)22@Gd как противоракового средства, притом, что данное соединение обладает низкой токсичностью. На механизм этого эффекта проливают свет результаты работы [114], где в системах in vitro и in vivo данный металлофуллеренол был охарактеризован как иммуномодулятор, вызывающий сдвиг Т-клеточного ответа в сторону повышения функциональной активности Th1 клеток, что выражалось в увеличении продукции лимфоцитами цитокинов TNF-α, IFN-γ и ИЛ-2 и снижении – ИЛ-4,5,6. Значительный объём данных о перспективах использования металлосодержащих соединений включения на основе фуллеренолов в качестве противоопухолевых средств приведён в работе [196]. Аналогично сообщается об использовании фотодинамических свойств химически модифицированных фуллеренов для уничтожения раковых клеток [132] и клеток, инфицированных вирусами [26]. В единственном исследовании [33] была охарактеризована острая, подострая и субхроническая токсичность фуллерена С60 при пероральном пути поступления. Внутрижелудочное зондовое введение фуллерена С60, диспергированного в оливковом масле, осуществляли в дозе 1,7 мг/кг ежедневно в течение недели, затем раз в неделю до конца второго месяца и далее каждые две недели до конца 7-го месяца. При этом не только не выявлено признаков токсичности, но и отмечено продление жизни животных, подвергнутых экспериментальной интоксикации CCl4 на фоне введения фуллерена C60. Авторы предполагают, что влияние на продолжительность жизни в основном связано с 37 ингибированием под действием фуллерена ассоциированного с возрастом окислительного стресса. Подводя итог вышеизложенному, необходимо отметить, что объем исследований, проведенных в условиях in vivo не позволяет сделать выводы о безопасности воздействия фуллеренов и их многочисленных разнообразных производных на живые организмы, во-первых, ввиду противоречивости полученных данных. Во-вторых, недостаточно количество работ, в которых охарактеризованы эффекты, связанные с поступлением фуллеренов при естественном (пероральном) пути поступления, в том числе в течение длительного времени, в подострых, субхронических и хронических экспериментах в широком интервале доз. Необходимо также учитывать недостаточно изученные эффекты возможного потенцирования фуллеренами токсичности различных ксенобиотиков [39]. Всё это позволяет заключить, что проблема токсикологической приближенных к сценариям оценки фуллеренов естественной in vivo, экспозиции в условиях, человека этими соединениями (с пищей, водой, вдыхаемым воздухом, косметическими и лекарственными средствами) в настоящее время далека от разрешения. 2.4 Изучение биораспределения и метаболизма фуллеренов в экспериментах in vivo Изучение фармакокинетики фуллеренов в условиях in vivo после воздействия через легкие, кишечник и кожу, представляет собой актуальную, отдельную и весьма сложную задачу необходимую для полноценной характеристики биологического действия этих веществ на живые организмы, включая выявление потенциальных органов-мишеней, установление возможности проникновения через барьеры организма, накопления, и метаболизма. Поскольку поступление фуллеренов в органы-мишени, такие как печень или почки, подразумевает их трансфер кровью, то вероятностью их доступа в другие части организма также нельзя, по-видимому, пренебрегать. Задача усложняется тем, что путь поступления, форма введения (состав и доза носителя), структура фуллерена, 38 а, самое главное, размеры его частиц, имеют немаловажное значение для оценки биологического действия, в т.ч. распределения фуллерена по органам и тканям [24]. В работе производных [192] была фуллеренов с изучена целью фармакокинетика оценки их водорастворимых потенциала в качестве лекарственных средств. Для получения данных о пероральной абсорбции, распределении и выведении этих соединений в реакции с замещенным метиленциклопропаном и ангидридом янтарной кислоты было синтезировано 14Смеченное растворимое в воде сукцинильное производное фуллерена С60. После перорального введения крысам, это соединение было относительно мало биодоступно. Всасывание из единичной введенной дозы составило около 3%; основная часть метки накапливалась в печени. До 97% модифицированного фуллерена выводилось из организма с калом. При внутривенном введении [14С]фуллерен распределялся в различных тканях, и большая его часть сохранялась в организме спустя неделю. Наибольшее накопление метки установлено в печени - до 91% через 16 часов после введения. Очень небольшие количества радиоизотопного индикатора (не более 0,9% через 8 часов) выявлялись в мозгу, что, по мнению авторов, означало проникновение через гематоэнцефалический барьер. Однако, учитывая возможность присутствия меченного фуллерена в просвете кровеносных сосудов мозга, данное предположение нельзя рассматривать как надёжно доказанное. Выведение парентерально введенного [14C]фуллерена, как и в случае перорального введения, происходило почти исключительно с калом. В моче животных метка была выявлена только в следовых количествах. Даже через 160 часов после однократной инъекции [14C]фуллерена более 2% от введенной дозы сохранялось в организме (главным образом, в печени и почках). Это указывает на явное наличие эффекта кумуляции, что вызывает обеспокоенность по поводу хронических токсических эффектов. Метод получения водорастворимого радиоизотопно меченного металлофуллерена представлен в работе [46]. Использовали эндоэдральный 39 аддукт фуллерена с гольмием Hox@C82 (где х=1,2), который очищали и дериватизировали с получением водорастворимого производного Ho x@C82(OH)у. После проведения нейтронной активации этого соединения был получен радиоактивный Hox@C82(OH)y, 166 распределение которого изучали после внутривенного введения мышам линии BALBc в течение 48 часов. Результаты сравнивали с контрольным соединением – низкомолекулярным металлохелатным комплексом 166 Na2[166Ho(DTPA)(H2O)]. Показана селективная локализация Hox@C82(OH)y в печени с медленным выведением, а также его поступление в кости без элиминации. В противоположность этому, экскреция с мочой и калом контрольного соединения была количественной через 1 час. В этой же работе был также изучен метаболизм 166 Hox@C82(OH)у на крысах линии Фишер. Результаты показали, что до 20% [166Ho]меченного эндоэдрального фуллерена выводится в неизмененном виде, что было подтверждено хроматографическим методом. Авторы работы [71] изучали влияние фуллерена С60 на острую токсичность CCl4, а также исследовали кинетику накопления и выделения, а также распределения фуллерена С60 в печени крыс. Животным интраперитонеально вводили водную суспензию измельченного до размера от 60 до 1650 нм (рис. 2A). немодифицированного фуллерена С60 в дозе 0,5 г/кг массы тела. Каждый день первой недели с начала введения, а затем каждую неделю до 21 дня опыта, по три крысы умерщвляли для гистологического обследования, проведения биохимических тестов и анализа содержания C60 в печени. Было показано, что максимум накопления, который составил около 24% от введенного количества, произошел в течение первой недели после инъекции. На 14 и 21 день, медианы концентрации снизились до 5% и 1% от значений, измеренных на 7 день, соответственно. По мнению авторов, это указывает, что фуллерен C60 элиминируется и/или биодеградирует в печени крыс. Максимальная элиминация с фекалиями происходила на 7 день, однако общее максимальное количество, выведенное в течение первых 2 недель, составило менее 14% от максимального количества фуллерена, содержащегося в печени на тот же момент времени. Таким образом, основная часть введенного фуллерена, вероятно, была метаболизирована 40 в печени. Характерные частицы фуллерена C60 были обнаружены с помощью ПЭМ во всех срезах печени, в том числе внутри клеток Купфера (рис. 2B и 2С) и капсулах некоторых гепатоцитов, а также внутри редких звездчатых клеток, локализованных в пространствах Диссе. Большинство агрегатов, выявленных внутри клеток печени, представляли собой кристаллы фуллерена С60 со средним размером менее 50 нм (рис.2В). В ряде случаев отмечали появление фуллерена внутри капелек липидов (рис. 2D). В целом, по мнению авторов, полученный результат свидетельствует о том, что фуллерен хорошо поглощается органами. Однако, для получения достаточного и воспроизводимого накопления фуллерена в печени, было необходимо его введение в больших дозах (2 г/кг массы тела). Рисунок 2. Электронная микроскопия (по данным работы [71]). (A,A’) Сканирующие электронные микрофотографии водной суспензии микронизированного C60 используемые в данном исследовании; (B-D) ПЭМ микрофотографии срезов печени крыс, получавших С60: B - кластеры C60 (указано 41 стрелками) внутри клеток Купфера; С - кластеры C60 в клетках Купфера, размер около 50 нм; D - растворение С60 внутри липидных капель. Авторы работы [36] не обнаружили фуллерены в крови, после их ингаляции крысам, предполагая, что это происходило из-за потенциальной биотрансформации этих веществ в легких и недостаточной чувствительности метода обнаружения. Исследование [137] описывает впервые процедуру введения радиоактивной метки в нанокристаллы фуллерена С60 (наноC60) с использованием Na125I, а также биологическое распределение меченного [125I]-наноC60 после внутривенной инъекции крысам. Одновременно, с использованием метода фотонно- корреляционной спектроскопии и ПЭМ была идентифицирована кристаллическая структура частиц [125I]-наноC60 со средним диаметром 200-250 нм. [125I]-наноC60 имел особенно высокое сродство к человеческому сывороточному альбумину, 95% степень связывания с которым достигалась уже через 1 час после введения. Исследования биораспределения [125I]-наноC60 на крысах показали значительные различия в накоплении в тканях [125I]-наноC60 и используемого в качестве контроля низкомолекулярного радиоактивного индикатора Na125I. Наибольшее накопление радиоактивной метки наноC60 наблюдалось в печени и селезенке, в то время как накопление в щитовидной железе, желудке, легких и кишечнике было значительно ниже по сравнению с Na125I . В работе [33] для исследования биораспределения были взяты 4 группы по 3 крысы (массой 200±20 г), которым в течение 7 дней вводили суспензию С 60 в оливковом масле (0,8 мг/мл) в одинаковой дозе (4 мг/кг массы тела) либо интраперитонеально (2 группы), либо через желудочный зонд (2 группы). На 1-й и 8-й день после введения, содержание фуллерена определяли методом ВЭЖХ в крови и органах. В результате содержание фуллерена С60 в печени и селезенке составило на 1-й день 0,14% и 0,18% от введенной дозы при пероральном пути и 4,73% и 1,55% при интраперитонеальном пути введения, соответственно. После 7 дней ежедневного приема, содержание фуллерена C60 в печени и селезенке составило 0,39% и 0,51% от общей дозы при введении пероральным путем, и 42 5,54% и 2,39% при введении интраперитонеальным путем, соответственно. На 1-й и 8-й день содержание фуллерена C60 в головном мозге составило менее 0,01% от принятой дозы при введении перорально, в то время как это значение превосходило 0,12% после интраперитонеального введения. Микроскопическое исследование ретикуло-эндотелиальной системы селезенки на 8-й день показало наличие некоторых скоплений фуллерена C60, которые больше по размеру и многочисленнее после введения интраперитонеально, чем после перорального приема. Таким образом, концентрация фуллерена С60, достигавшаяся в селезенке, была выше предела его растворимости. Напротив, в печени во всех случаях не наблюдали отложений фуллерена, то есть его концентрация в этом органе была недостаточно высока, чтобы вызвать отложения кристаллов. В недавнем исследовании [173], для получения данных о возможной пероральной токсичности фуллерена C60 и изучения его биораспределения, крысам линии ежедневно Sprague-Dawley вводили диспергированный в кукурузном масле фуллерен C60, через желудочный зонд в дозах 1, 10, 100 и 1000 мг/кг/день в течение 29 дней с последующим 14-дневным периодом восстановления. Ни в одной из групп не наблюдалась смертность животных, а также отсутствовали различия с контролем в результатах клинических наблюдений, приростах массы тела и потреблении пищи. Более того, отсутствовали гистопатологические изменения во всех исследованных органах в конце периода введения фуллерена, а также в конце периода восстановления. Как у самцов, так и у самок в группе получавшей 1000 мг/кг/день наблюдались черноватые фекалии, черное содержимое желудка и толстой кишки. Отсутствовали достоверные различия масс печени и селезенки в конце периода введения, кроме крыс-самцов, получавших фуллерен в дозе 1000 мг/кг/день, у которых в конце периода восстановления эти массы достоверно увеличились. С использованием метода жидкостной хроматографии в тандеме с масс- спектрометрией, фуллерен С60 не был обнаружен в печени, селезенке и почках в конце периода введения, а также в конце периода восстановления. 43 В исследовании [52] использовали C стабильную изотопную метку для 13 количественного определения фуллерена in vivo. 13 C меченый фуллерен C60 диспергировали в воде c Твин 80 для внутривенной инъекции животным, затем количественно определяли фуллерен с помощью изотопного отношения при массспектрометрии. Результаты кровообращения с показали, периодом что С60 полувыведения быстро 14 минут выводится и из селективно накапливается в печени, селезенке и легких, с небольшим снижением содержания в течение 24 часов. Фармакокинетика фуллерена C60 может быть оценена с помощью двухкамерной модели, в которой происходит его быстрая элиминация из кровотока и медленное выведение с поглощением тканями. В ряде работ был исследован вопрос о возможных продуктах биотрансформации и метаболизма фуллеренов. Авторы работы [129] установили, что фуллерен С60 образует в печени крыс комплексы с витамином А. Эти данные подтверждаются в работе [71], где на хроматографических профилях экстрактов печени крыс получавших фуллерен С60, были идентифицированы некоторые дополнительные пики, элюирующиеся между пиками, соответствующими ретиниловым эфирам и пиком фуллерена С60, которые отсутствуют в экстрактах печени контрольных крыс. Эти результаты свидетельствуют о возможном выведении фуллерена С60 при участии продуктов обмена ретинола. В уже упоминавшейся работе [36], в эксперименте с ингаляционным воздействием, авторы исследования не обнаружили фуллерен С 60 в крови, но не исключают возможность его биотрансформации под действием альвеолярных макрофагов или при мукоцилиарном транспорте. В работе [142] была показана возможность метаболизации немодифицированного фуллерена С60 клетками низших грибов Epicoccum nigrum и Pestalotia heteromorpha в культуре. Точный состав образующихся гидрофилизованных производных фуллерена авторами работы определен не был. Вместе с тем, как можно судить по данным изучения процессов окисления фуллерена в модельных системах in vitro [73], в числе преобладающих продуктов этого процесса могут быть его гидроксилированные производные. 44 Таким образом, вопрос о биотрансформации фуллеренов и о составе образующихся производных в литературе исследован недостаточно, что связано с большими методическими сложностями, возникающими при решении данной проблемы. 2.5 Краткое заключение Таким образом, данные о воздействии фуллеренов и их модифицированных аналогов на биологические системы в разных экспериментальных моделях в условиях in silico, in vitro и in vivo продолжают оставаться противоречивыми. На этом фоне отмечается значительное число работ, в которых не выявлены какиелибо негативные последствия воздействия фуллеренов на биологические системы в условиях проявления этими веществами ценных полезных свойств антиоксидантов, радиопротекторов и многих других. При этом данные отдельных исследований часто бывает трудно сравнивать ввиду наличия ряда несопоставимых, трудноконтролируемых факторов, таких как размеры частиц в дисперсии фуллерена, применяемые носители (ПАВ, растительные масла, полисахариды, растворители с собственной токсикологической характеристикой). Источником расхождения результатов, что весьма существенно, также могут быть тип применяемой экспериментальной модели, путь, форма введения препарата и условия освещённости. Несмотря на большой объём данных по токсичности фуллеренов и их различных производных, эти сведения всё ещё нельзя признать исчерпывающими. Так, практически не изучено в хроническом эксперименте влияние фуллеренов на функциональное состояние и морфологию внутренних органов (кроме печени), биохимические и гематологические показатели крови. Кроме того, обсуждая перспективы использования фуллеренов и фуллеренсодержащих препаратов в различных областях техники и медицины, нельзя не учитывать, что производство фуллеренов, состоящее в электродуговом распылении графита с последующим фракционированием продуктов пиролиза, представляет собой экологически вредный процесс с возможностью выброса во внешнюю среду побочных продуктов, таких, как НЧ сажи (аморфного углерода), обладающие доказанной 45 высокой токсичностью, а также нанотрубок и других графеновых структур неопределённого состава. Результаты, указывающие на возможную экотоксичность и ингаляционную токсичность аэрозолей фуллеренов in vivo, необходимо принимать во внимание при их оценке в качестве промышленных загрязнителей. При этом данных для установления ПДК для фуллеренов в объектах окружающей среды по-прежнему недостаточно. Относительно немногочисленные исследования, посвященные биораспределению фуллеренов дали противоречивые результаты. Можно с большей или меньшей степенью достоверности только утверждать, что фуллерены весьма ограниченно биодоступны при пероральном пути введения. В гораздо большей степени – при парентеральном, причём органами, в наибольшей степени накапливающими фуллерены, являются печень и почки; в меньшей степени - селезёнка. Убедительых данных в пользу проникновения фуллерена через гематоэнцефалический барьер получено не было. При этом в подавляющем большинстве экспериментов, где для изучения биокинетики фуллеренов применяли изотопные метки (как стабильные, так и радиоактивные) молекулярная форма накапливающихся в органах и экскретируемых веществ не была изучена. Приведённые результаты, в частности, не позволяют с уверенностью отличить накопление нативных фуллеренов или каких-либо из их производных. Имеет место практически полное отсутствие данных о биокинетике и метаболизме фуллеренов в хронических экспериментах, которые могли бы подтвердить гипотезы о безопасности фуллеренов и способствовать установлению ПДК для этого класса соединений. Вне зависимости от всего вышеперечисленного, объемы производств фуллеренов во всем мире нарастают с каждым днем, ввиду возникающей потребности и открытия новых возможностей для применения фуллеренов. Такое использование сдерживается практически полным отсутствием систематической информации о токсикологической характеристике фуллеренов, выполненной по определенному плану - тип фуллерена, дозозависимость, определенный путь 46 поступления, контроль носителя, размера частиц и максимально широкий круг изучаемых показателей, способных быть индикаторами токсического действия. 47 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3.1 Животные, состав экспериментальных рационов Эксперименты по токсиколого-гигиенической характеристике фуллеренов проводили на крысах самцах линии Вистар, полученных из питомников лабораторных животных ГУ НЦБМТ РАМН филиал «Столбовая» (Московская область, Чеховский район, пос. Столбовая) и «Пущино» (Московская область, г. Пущино). Всего в исследованиях было использовано 227 крыс. После поступления из питомника животные находились в карантине в течение не менее 10 дней. Крыс содержали в условиях клиники лабораторных животных ФГБУ НИИ питания РАМН группами по 3-4 животных в прозрачных пластмассовых клетках из поликарбоната, в кондиционированном помещении (23-25 °С) со световым циклом 12 ч. и кормили на протяжении всего эксперимента сбалансированным полусинтетическим рационом на основе казеина. Доступ к корму и питьевой воде не ограничивали. Состав полусинтетического рациона, соответствующий МУ 1.2.2520-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов» и совпадающий, в основном, с составом рациона для крыс AIN93 [151] представлен в таблицах 2 - 5. Таблица 2 Состав полусинтетического рациона Компоненты Крахмал кукурузный Казеин Масло растительное (подсолнечное) Лярд Солевая смесь Микрокристаллическая целлюлоза Сухая смесь водорастворимых витаминов Смесь жирорастворимых витаминов (масляный раствор) Масса компонентов (г/100 г рациона) 63,5 20 5 5 3,5 2,0 0,9 0,1 48 Таблица 3 Состав солевой смеси Минеральные соли Кальций фосфорнокислый, Ca3(PO4)2 Натрий хлористый, NaCl Калий лимонокислый моногидрат, C6H5O7K3 H2O Калий сернокислый, K2SO4 Магний окись, MgO Марганец углекислый, (Mn 43-48%) Железо лимоннокислое, С6H5O7Fe (Fe 16-17%) Цинк углекислый, ZnCO3 (Zn 70%) Медь углекислая, (Cu 53-55%) Йодистокислый калий, KIO3 Селенистокислый натрий Na2SeO3 Хромовокалиевые квасцы, CrK(SO4)212H2O Сахароза (высокоочищенная) Содержание, г/100 г смеси 50 7,4 22 5,2 2,4 0,35 0,6 0,16 0,03 0,001 0,001 0,058 11,8 Таблица 4 Смесь водорастворимых витаминов Витамины Тиамин гидрохлорид Рибофлавин Пиридоксин гидрохлорид Никотинамид Кальция пантетонат Фолиевая кислота Биотин Викасол Цианкобаламин Сахароза Содержание, мг/100 г смеси 500 500 500 2000 2000 200 10 100 1,5 До 100 г Таблица 5 Смесь жирорастворимых витаминов Витамины Витамин Е (токоферол 50 мг/мл) Витамин А (ретинол-100000 МЕ/мл) Витамин D (эргокальциферол 50000 МЕ/мл) Рыбий жир Объем, мл/100 мл смеси 10 1,4 1,4 87,2 49 3.2 Характеристика используемых материалов и реактивов 3.2.1 Фуллерен С60 и фуллеренол С60(ОН)24 В экспериментах использовали немодифицированный фуллерен С60 и его водорастворимое производное - фуллеренол С60(ОН)24, производства ЗАО «Фуллерен-Центр», г. Нижний Новгород (Россия). Фуллерен С60. Качественный и количественный анализ, проведенный, согласно МР 1.2.2641-10 и [74], методом обращеннофазовой ВЭЖХ, показал, что чистота используемого образца фуллерена С60 составляет не менее 99,8%. Для приготовления водной коллоидной дисперсии фуллерена С60 его размельчали в керамической ступке для предотвращения слипания частиц и их агрегации в растворе, изначально представленных в виде кристаллов субмикронного размера. Затем добавляли дисперсионную среду, представляющую собой 2% раствор кукурузного крахмала пищевого в дистилированной воде с 0,5 % неионогенного поверхностно-активного вещества твин 80 (пищевая добавка E433), перемешивали на вортексе при 3000 об/мин 10 минут и обрабатывали в течение 3 мин на погружном ультразвуковом процессоре с водяным охлаждением, при мощности импульса 30 Вт/мл и частоте 20 кГц. Исследование размеров частиц в полученной дисперсии было проведено спектроакустическим методом [64] под руководством ведущего эксперта Метрологического центра РОСНАНО А.А.Лошкарева на спектроакустическом анализаторе «DT-1202» («Dispersion technology Inc.», США). Фуллеренол С60(ОН)24. Использовали препарат фуллеренола, полученный путём гидроксилирования фуллерена С60 в растворе ароматического углеводорода под действием водного раствора щёлочи в присутствии катализатора. Фуллеренол гигроскопичен и может содержать до нескольких процентов по массе влаги; возможна примесь этанола менее 0,1%. Препарат неограниченно растворим в воде. В инфракрасном спектре фуллеренола в области 4000 - 500 см-1 проявляются полосы валентных (3430 см-1) и деформационных (1390 см-1) колебаний групп ОН, валентных колебаний групп С-О (1070 см-1) и С=С (1600 см-1). По данным 13 C 50 ЯМР-спектроскопии в образце имеются атомы углерода, связанные с гидроксильными группами не менее чем 2 типов, и не связанные с гидроксильными группами. По данным термогравиметрии потеря массы при нагревании от 200 до 350 оС составляет 18,37% с выделяющейся водой, что соответствует содержанию 36,74% гидроксильных групп по массе в молекуле фуллеренола. По этим данным формула фуллеренола отвечает С60(ОН)24 с возможным присутствием небольшого количества (до 1%) гомологов – фуллеренолов С60(ОН)22 и С60(ОН)26. Немодифицированный фуллерен С60 в препарате отсутствует. Чистота препарата составляет около 98%. После растворения в воде размер частиц имеет истинно молекулярные размеры. Средний размер частиц фуллеренола С60(ОН)24 и распределение по размерам измеряли методом динамического лазерного светорассеяния на приборе Nanotrac Wave (Microtrac Inc, США) с использованием программного обеспечения Microtrac FLEX. Образец анализировали шесть раз с получением среднего размера частиц. Испытания проводились при постоянной температуре 22 °С. 3.2.2 Прочие материалы и реактивы В работе использовали следующие реактивы: крахмал кукурузный пищевой (производства КЗ "Гулькевичский", Россия ГОСТ Р 51985-2002); моноспецифические антитела кролика и крысы к ОВА, очищенные с помощью метода аффинной хроматографии, лиофилизованные; моноспецифические антитела кролика против ОВА, меченные пероксидазой, лиофилизованные; антитела кролика против иммуноглобулинов G (IgG) крысы, меченные пероксидазой, лиофилизованные Минздравсоцразвития России, производства НИИЭМ им. гамма-глобулин кролика; ОВА Н.Ф.Гамалеи пятикратно перекристаллизованный, лиофилизованный; лиофилизованный белок куриного яйца, полученный из столового яйца согласно ГОСТ Р 52121-2003 на лиофильной сушке «Christ» (Германия), сыворотка крови интактных крыс; нормальная лошадиная сыворотка (НЛС); твин-20 (полиоксиэтиленсорбитан монолаурат) реактив "Analytical Grade" производства "SERVA", Германия; твин-80 51 (полиоксиэтилен 20 сорбитан моноолеат), производства Sigma-Aldrich, США; офенилендиамин, реактив "Analytical grade"; желатина пищевая марки П-11 ГОСТ 11293-89; планшеты полистирольные плоскодонные со "средней" степенью связывания; этиловый спирт ректификат медицинский по ГОСТ Р 51652-2000. Остальные использованные реактивы (органические растворители, кислоты, щелочи, соли и др.) имели квалификацию «химически чистый» («Х.Ч.»), «особо чистый» («О.С.Ч.») и «для хроматографии». Деионизованную воду получали с помощью системы для очистки воды «Milli-Q Advantage A10 System» («Millipore Corporation», США). 3.3 Список использованного оборудования При проведении исследований использовано следующее основное оборудование: система для ВЭЖХ «Agilent 1200» оснащенная вакуумным дегазатором, градиентным насосом на 4 подвижные фазы, автосемплером, термостатированным колоночным отделением с колонкой «ZORBAX C18» (размер 4,6×150 мм, заполненной С18 фазой с размером гранул 5 мкм) и детектором с диодной матрицей («Agilent Technologies», США); конфокальный флуоресцентный микроскоп «LSM 710» («Zeiss», Германия); микроскоп «AxioImager Zl» (производства фирмы «Zeiss», Германия); установка для заливки парафиновых блоков «ЕС 350» («Microm», Германия); микротом «Leica RM2235» («Leica», Германия); анализатор размеров частиц «Nanotrack Wave» («Microtrac inc», США); гематологический анализатор «Coulter AC TTM 5 diff OV» («Beckman Coulter», США); проточный цитофлуориметр «FC 500» («Beckman Coulter International S.A.», Австрия); однолучевой спектрофотометр УФ – видимого диапазона «СФ-46» (Россия); фотометр планшетный автоматический двухволновой "ЭФОС 9305" («ОАО МЗ Сапфир» Россия); 52 УЗ-ванна VGT-1000A, мощность 40 Вт, рабочая частота 40 кГц («NIKSY», Китай); УЗ-ванна «Сапфир» объем 12 л, мощность 550 Вт, рабочая частота 35 кГц (ЗАО «ПКФ Сапфир», Россия); баня водяная многоместная «GFL-1031» («GFL», Германия); персональный вортекс BioVortex V1 Plus, диапазон оборотов 250-3000 об/мин («BIOSAN», Латвия); устройство перемешивающее «ПЭ-6410М» (ЗАО НПО «ЭКРОС», Россия); магнитная мешалка «ES-6120» с подогревом, скорость вращения 100-1700 об/мин (ЗАО НПО «ЭКРОС», Россия); весы аналитические лабораторные электронные «Mettler Toledo AL104» с верхним пределом взвешивания 110 г 1-го класса точности по ГОСТ 24104-2001, цена деления 0,0001 г («Mettler Toledo», Швейцария/США); весы лабораторные электронные «GX-6100» с верхним пределом взвешивания 6100 г и ценой деления 0,01 г («A&D», Япония); лабораторная мешалка «POLYMIX® PX-SR 50E» («KINEMATICA», Швейцария); центрифуга «SIGMA 3-18K», макс. 18000 об/мин («SIGMA Laborzentrifugen», Германия); иономер «Mettler Toledo Seven Easy» («Mettler Toledo», Швейцария/США); испаритель ротационный «ИР-1М2» (ОАО «ХИМЛАБОРПРИБОР», Россия); погружной УЗ процессор «Ultrasonic processor СР 130» мощность 130 Вт, частота 20 кГц («Cole-Parmer», США). Все средства измерений прошли поверку в установленном порядке. 3.4 Схемы экспериментальных моделей использованные в биологических экспериментах Дизайны соответствии токсикологических с МУ экспериментов 1.2.2520-09 были разработаны «Токсиколого-гигиеническая в оценка 53 безопасности наноматериалов». Условия содержания и работы с животными соответствовали «Правилам лабораторной практики» (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23.08.2010 г. № 708н). 3.4.1 Токсикологический эксперимент с фуллереном С60 продолжительностью 28 дней Исследование проведено на 60 крысах исходной массой тела 111±2 г (M±m). Животные были разделены на 4 группы по 15 крыс в каждой. Группа 1 (контроль) получала на протяжении всего эксперимента ежедневно внутрижелудочно дистиллированную воду. Животные группы 2 получали дисперсионную среду (носитель) (см. п. 3.2.1). Крысам группы 3 вводили дисперсию фуллерена С60 в указанной дисперсионной среде в дозе 1 мг/кг массы тела в расчёте на С60, а крысам группы 4 – в дозе 10 мг/кг массы тела (Таблица 6). Энергетическая ценность носителя фуллерена (дисперсионной среды), с учётом возможности частичной ферментации его углеводного компонента микроорганизмами толстой кишки, не превышала в группах 2 − 4 0,2 % от энергетической ценности дневного рациона животных. После приготовления дисперсии фуллерена и на протяжении всего времени её введения животным препарат перемешивали с помощью магнитной мешалки. В ходе эксперимента крыс всех групп взвешивали на электронных весах с точностью ±0,5 и оценивали динамику прироста массы тела. Продолжительность эксперимента составила 28 суток. Интегральные показатели (внешний вид, поведение, двигательная активность, состояние шерстяного покрова, потребление корма) изучали на протяжении всего эксперимента и по его окончании. За 3 часа до окончания эксперимента 9 животным из каждой группы внутрижелудочно через зонд вводили по 2 г/кг массы тела крысы лиофилизированный белок куриного яйца в виде 10% раствора в 0,15 М NaCl. Затем этих крыс умерщвляли путем глубокого обескровливания под эфирной анестезией. Всех остальных животных после 54 окончания эксперимента (через 28 суток опыта) умерщвляли путем декапитации под легким эфирным наркозом и подвергали патологоанатомическому вскрытию. На секции согласно методам забора в ходе эксперимента биологических образцов (согласно МУ 1.2.2745-10) отбирали кровь и внутренние органы (печень, почки, сердце, легкие, селезенку, надпочечники, семенники, тимус, головной мозг, внутрибрюшинную исследования жировую следующих клетчатку). показателей: После вскрытия интегральных (массы проводили тела крыс, относительной массы внутренних органов), биохимических (в печени содержание микросомальных цитохрома Р-450, цитохрома b-5, активность ферментов Р-450 метоксирезоруфин-О-деметилазы - CYP 1A2 и пентоксирезоруфин-О-деалкилазы - CYP 1В2, глутатионтрансферазы, UDP глюкуронозилтрансферазы, глутатион-S-трансферазы, арилсульфатаз А и В, βгалактозидазы, β-глюкуронидазы, лизосомальных гидролаз - арилсульфатаз А и В, β-галактозидазы, окислительного β-глюкуронидазы, повреждения ДНК дезоксигуанозина с мочой; в небелковых по тиолов, величине интенсивность экскреции 8-оксо-2- плазме крови - содержание общего белка, альбумина, глюкозы, креатинина, мочевой кислоты, мочевины, активность ферментов аланинаминотрасферазы (АЛТ) и аспарагинаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы, показателей интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) - содержание диеновых коньюгатов полиненасыщенных жирных кислот ПНЖК, малонового альдегида, активность глютатионредуктазы, супероксиддисмутазы, каталазы в эритроцитах), гематологических (число лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, концентрация в крови гемоглобина, объем эритроцита, содержание гемоглобина в иммунологических (в крови - содержание цитокинов одном эритроците) и IL-6, IL-10, TNF-α). У животных, которые получали куриный белок, кроме перечисленных выше показателей, с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного метода определяли в сыворотке крови антигенный овальбумин. Кроме отмеченных исследований, в органах и тканях крыс с помощью системы Agilent 1200 для ВЭЖХ (с колонкой «ZORBAX C18», размер 4,6×150 мм, 55 заполненной С18 фазой с размером гранул 5 мкм) в органах и тканях крыс проводили количественное определение фуллерена С60. Таблица 6 Схема 28-суточого токсикологического эксперимента с фуллереном С60 Группы крыс, №№ Доза фуллерена С60, мг/кг массы тела/сутки 1 (контроль) 0 2 (контроль носителя) 0 3 1,0 4 10 3.4.2 Токсикологический эксперимент с фуллереном С60 продолжительностью 92 дня Исследование проведено на 75 крысах исходной массой тела 100±5 г (M±m). Животные были разделены на 5 групп по 15 крыс в каждой. Животным 1 группы (контроль) на протяжении всего эксперимента (92 дня) ежедневно вводили внутрижелудочно дистиллированную воду. Животные 2 опытной группы в течение того же времени ежедневно внутрижелудочно получали 1 мл раствора дисперсионной среды (носителя) фуллерена (см. п.3.2.1) эксперименте, расчётная энергетическая ценность Как и в 1-ом носителя, с учётом возможности частичной ферментации его углеводного компонента в толстой кишке, не превышала 0,2 % от энергетической ценности дневного рациона животных. Крысы 3, 4 и 5 опытных групп получали ежедневно внутрижелудочно через зонд фуллерен С60 в виде дисперсии в носителе в дозе 0,1; 1,0 и 10,0 мг/кг массы соответственно. Объем вводимого раствора фуллерена С60 для всех животных 3 – 5 групп равнялся 1 мл раствора на каждые 100 г массы тела животного. На протяжении всего времени введения животным дисперсии фуллерена перемешивали с помощью магнитной мешалки. Вводимые дозы фуллерена С60 по 56 группам животных представлены в таблице 7. Общая продолжительность введения составила 92 суток. Таблица 7 Схема 92-дневного токсикологического эксперимента с фуллереном С60 Группы крыс, №№ Доза фуллерена С60, мг/кг массы тела/сутки 1 (контроль) 0 2 (контроль носителя) 0 3 0,1 4 1,0 5 10 Перечень изучаемых у животных показателей совпадал с приведенным в п. 3.4.1 В дополнение к этому проводили определение содержания селена в образцах крови, печени и мозга, а также содержания в крови лимфоцитов CD45RA+, CD161a+, процент лимфоцитов CD3 +CD4+ и CD3+ CD8+ в общем числе Тлимфоцитов, соотношение CD4 к CD8. Методом лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии изучали изменения в органах-мишенях (слизистая оболочка тонкой кишки и печень). 3.4.3 Токсикологический эксперимент с фуллеренолом С60(ОН)24 продолжительностью 28 дней Исследование проведено на 60 крысах самцах линии Вистар исходной массой 122±2 г (M±m). Животные были разделены на 4 группы по 15 крыс в каждой: 1-я группа животных (контрольная) получала деионизованную воду; группы со 2-ой по 4-ую – фуллеренол С60(ОН)24, растворенный в деионизованной воде, в дозах 0,1, 1 и 10 мг/кг массы тела крысы соответственно (Таблица 8). Препарат в указанных дозах вводили ежедневно внутрижелудочно через зонд. Общая продолжительность введения составила 28 суток. 57 Таблица 8 Схема 28-дневного подострого токсикологического эксперимента с фуллеренолом С60(ОН)24 Группы крыс, №№ Доза фуллеренолаС60(ОН)24, мг/кг массы тела/сутки 1 (контроль) 0 2 0,1 3 1,0 4 10 Перечень изучаемых у животных показателей совпадал с приведенным в п. 3.4.1. В дополнение к этому проводили определение содержания в крови лимфоцитов CD45RA+, CD161a+, процент лимфоцитов CD3 +CD4+ и CD3+ CD8+ в общем числе Т-лимфоцитов, соотношение CD4 к CD8. Биораспределение фуллеренола С60(ОН)24 не было изучено ввиду отсутствия метода его экстракции из проб биологических образцов и, соответственно, анализа экстрактов при помощи ВЭЖХ. 58 3.4.4 Методика острого эксперимента по введению дисперсии фуллерена С60 в изолированную петлю тонкой кишки крысы Эксперимент выполнен под руководством проф., д.м.н. Л.С. Василевской. Использовали 12 крыс средней массой 194±4 г (M±m). В исследовании применяли фуллерен С60, в составе дисперсионной среды, представленной 2% раствором крахмала в физиологическом растворе. Твин-80 из состава дисперсионной среды был исключен для предотвращения его возможного раздражающего действия в высокой концентрации на слизистую оболочку кишки. Для получения дисперсионной среды данного состава 5 мл физиологического раствора нагревали на электроплитке до закипания, после чего в него вносили равный объём физиологического раствора, содержащего 250 мг пищевого крахмала (предварительно размешанного до получения гомогенной взвеси) и также доводили до кипения. Затем полученный раствор охлаждали до комнатной температуры и вносили во флакон с навеской фуллерена С60, который предварительно растирали в ступке. Концентрация фуллерена С60 в дисперсионной среде составляла 3 мг/мл. Перед введением раствор обрабатывали в течение 3 мин. на погружном УЗ процессоре Ultrasonic processor, при мощности импульса 30 Вт/мл и частоте 20 кГц. Для наркоза использовали раствор 1 г гексенала в 20 мл физиологического раствора, который вводили внутрибрюшинно в количестве 1,5 мл/кг массы тела. Наркоз наступал спустя 5-7 мин после введения препарата. Производили вскрытие брюшной полости путём небольшого разреза вдоль белой линии живота. Осторожно выделяли участок подвздошной кишки длиной 5-5,5 см, который изолировали путём наложения шелковых лигатур, вначале на проксимальную часть взятого участка (затягивается полностью), а затем на дистальную (затягивалась после введения раствора дисперсии фуллерена С60 или контрольного раствора крахмала). Объем вводимого раствора составил 1 см3, что соответствует дозе фуллерена 15 мг/кг массы тела. После зашивания брюшной полости, крыс выдерживали 3 часа, после чего вводили гексенал (3 мл/кг массы тела) и после наступления наркоза обескровливали из нижней полой вены. На 59 электронных весах определяли абсолютную массу органов. На анализ методом ВЭЖХ для определения содержания фуллерена С60 в органах, забирали печень, селезенку и почки. Для исследования содержания и активности продуктов ПОЛ (малоновый диальдегид, глутатионредуктаза, диеновые конъюгаты, супероксиддисмутаза, каталаза) глутатионпероксидаза, отбирали кровь, с последующим центрифугированием и отбором сыворотки на анализ. 3.4.5 Исследование стабильности фуллерена С60 в биологических субстратах с использованием модельных систем in vitro Исследование проводили на 12 крысах массой около 300 г. За 12 часов до забоя у животных забирали всю пищу, доступ к воде не ограничивали. Весь инструмент и используемую посуду стерилизовали в течение 12-часов в 96% растворе этилового спирта. Животных обескровливали из нижней полой вены под эфирной анестезией; в асептических условиях отбирали кровь в пробирки, содержащие Трилон Б из расчета 1,6 мг/мл крови [22] в физиологическом растворе и печень, которую немедленно взвешивали на весах с точностью ±0,1 г и охлаждали до 0 оС. Все использованные растворы реактивов были стерилизованы пропусканием через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Печень перфузировали на холоду стерильным 0,154 М KCl на 0,05 М Трис-НCl буфере рН 7,4 и готовили гомогенат ткани в этом буфере в отношении 1:4 по массе в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком. Гомогенаты объединяли в пул, который делили на 2 части. 1-ую часть гомогената использовали в опыте непосредственно, а из второй выделяли микросомальную фракцию. В гомогенаты перед проведением инкубации с фуллереном добавляли 1 таблетку ингибитора протеаз Complete Protease Inhibitor Cocktail (производства фирмы Roche, Германия) на каждые 50 мл гомогената и хлороформ 1 мкл/мл гомогената для предотвращения бактериальной контаминации. Количества фуллерена С60, вносимые в биологические образцы, выбирали с учетом использованных в подострых экспериментах доз 10, 1 и 0,1 мг/кг массы 60 тела крысы. Например, для крысы массой 300 г средний объем циркулирующей крови составляет ~18 мл [124], а средняя масса печени ~11 г (данные получены из результатов предыдущих исследований в рамках данной диссертации), однократно вводимые дозы фуллерена 3,0 мг; 0,3 мг и 0,03 мг на крысу. В соответствии с этим, к 6 мл крови было добавлено 1,0 мг; 0,1 мг и 0,01 мг фуллерена С60; к 2 мл гомогената печени (из расчета содержания 0,4 г печени) было добавлено 0,108 мг; 0,011 мг и 0,0011 мг фуллерена С60; к 2,2 мл микросомальной фракции печени (из расчета содержания 1,1 г печени) добавляли 0,3 мг; 0,03 мг и 0,003 мг фуллерена С60. Использовали немодифицированный фуллерен С60, из которого готовили раствор в толуоле с концентрацией 1 мг/мл. Рассчитанные в соответствии с вышеуказанными дозами объемы этого раствора вносили в пустые пробирки и оставляли на ночь под тягой при комнатной температуре для испарения толуола. Введение фуллерена С60 в биологические образцы проводили, внося в эти пробирки по 2 мл гомогената или 2,2 мл микросомальной фракции печени. Содержимое пробирок перемешивали на вортексе при 3000 об/мин в течение 5 минут и обрабатывали в течение 30 минут в ультразвуковой ванне «Сапфир» мощностью 200 Вт, с рабочей частотой 35 кГц и удельной звуковой мощностью 20 Вт.дм-3. Для внесения фуллерена в образец крови ее предварительно центрифугировали при 3000 об/мин в центрифуге с охлаждением. Отбирали плазму и вносили в пробирки с рассчитанными концентрациями фуллерена С60, после чего обрабатывали аналогично пробам микросом и гомогената. Затем отмеренные количества плазмы с диспергированным фуллереном С60 добавляли в пробирки с цельной кровью, аккуратно перемешивали и вносили по 1 мл в пробирки для инкубации. Содержимое контрольных (без инкубации) пробирок подвергали экстракции немедленно сразу после добавления фуллерена С60 к биологическим образцам. Остальные пробирки инкубировали в темноте при температуре +37 оС в воздушном термостате в течение 3, 6, 12 и 24 часов; после каждого временного промежутка часть образцов подвергали экстракции, с последующим 61 количественным анализом фуллерена С60 методом ВЭЖХ. Все образцы выполняли в 2-х повторах. 3.5 Методы отбора субстратов и пробоподготовки биологических образцов используемые в подострых токсикологических экспериментах Отбор органов у лабораторных животных, осуществляли в соответствии с МУ 1.2.2745-10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных». За 3-4 дня до окончания эксперимента животных помещали на 15 часов в обменные клетки для сбора мочи, в которой далее определяли продукт окислительной деструкции ДНК 8оксо-2-дезоксигуанозин (8-oxo-G). Животные из каждой группы на 29-й или 92-й день за 3 часа до окончания эксперимента, получавшие внутрижелудочно через зонд ОВА производства «Fluka» (Швейцария) в виде 10% раствора, впоследствии подвергались анестезии эфиром, вскрытию брюшной полости и обескровливанию через нижнюю полую вену. Часть крови собирали для последующего гематологического исследования и изучения содержания продуктов ПОЛ, а часть – в сухую пробирку для получения сыворотки. Отдельно для определения гемоглобина цианидным методом отбирали образец цельной крови. После этого у крыс выделяли внутренние органы (печень, почки, селезенку, сердце, семенники, тимус, легкие, надпочечники, головной мозг, внутрибрюшинную жировую клетчатку), определяли их абсолютную и относительную массу. Часть печени и подвздошную кишку, немедленно фиксировали в 10% формалине на натрийфосфатном буфере рН 7,4 для анализа методом лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии. После коагуляции крови сыворотку отделяли центрифугированием при 3000 g. В сыворотке определяли концентрацию ОВА иммуноферментным методом. Печень отбирали на льду и готовили её гомогенат в 0,1 М Трис-HCl буфере рН 7,4 охлаждённом до 0 - +2оС в соотношении 1:4 по массе. Гомогенат ткани печени делили на 2 порции. В одной из них проводили определение концентрации небелковых тиолов. Другую часть гомогената подвергали фракционированию 62 методом дифференциального центрифугирования ультрацентрифуге «Beckman» с выделением на препаративной микросомальной и цитозольной фракции. В случаях невозможности проведения немедленного анализа проб после их получения, транспортировку и хранение осуществляли в условиях «холодовой цепи» согласно МУ 1.2.2745-10. Длительное хранение проб осуществляли в условиях «глубокого холода» при температуре -70оС в морозильной камере. 3.6 Гематологические методы исследования Гематологические показатели (количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу, относительное содержание незрелых гранулоцитов, количество тромбоцитов, средний объем тромбоцитов, тромбокрит, общее количество эритроцитов, объем эритроцита, гематокрит, среднее концентрация гемоглобина в одном эритроците, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах) определяли стандартными методами на гематологическом анализаторе «Coulter AC TTM 5 diff OV». Экспрессию антигенов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD16a на лимфоцитах периферической крови определяли методом проточной цитофлуориметрии с прямым иммунофлуоресцентным окрашиванием клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител. Исследования проведены в лаборатории спортивного питания ФГБУ «НИИ питания» РАМН старшим научным сотрудником, к.м.н. Э.Н. Трушиной. Концентрацию гемоглобина в крови определяли цианидным спектрофотометрическими методом [14]. 3.7 Биохимические методы исследования Определение биохимических показателей сыворотки крови (общий белок, альбумин, глюкоза, креатинин, мочевая кислота, активность АЛТ, АСТ, ЩФ) проведено с использованием стандартных методик на биохимическом анализаторе ФП-901 (производства фирмы «Labsystems OY», Финляндия) в лаборатории обмена веществ и энергии ФГБУ «НИИ питания» РАМН старшим научным сотрудником, к.м.н. Сото Х.С. 63 Содержание небелковых тиолов печени (в пересчете на восстановленный глутатион) определяли методом [23] с реактивом Эллмана (ДТНБ, 5,5'-дитиобис2-нитробензойная кислота). 1 мл цельного гомогената печени смешивали при 0 +2оС с 3 мл 6% трихлоруксусной кислот (ТХУ), выдерживали 10 мин на холоду и центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин. Осторожно, не захватывая осадка, отбирали 0,5 мл супернатанта, смешивали с 2 мл 0,4 М Трис-HCl буфера рН 8,9 и 0,05 мл 0,4% раствора ДТНБ в этиловом спирте. Пробы немедленно спектрофотометрировали при длине волны 412 нм против раствора перечисленных реагентов, содержащего вместо супернатанта 4,5% ТХУ. При построении стандартных графиков использовали восстановленный глутатион квалификации «Ч.Д.А.». Активности ферментов лаборатории энзимологии руководством ведущего печени питания научного были ФГБУ определены «НИИ сотрудника, сотрудниками питания» к.м.н. РАМН под Л.В.Кравченко. В микросомальной фракции печени определяли концентрацию цитохромов Р-450 и b5 спектрофотометрическим методом [141]. Активность изоформ микросомальных моноксигеназ (7-Этоксирезоруфин-О-деэтилазная активность для CYP1A1; 7-Метоксирезоруфин-О-деметилазная активность для CYP1A2; 7Пентоксирезоруфин-О-деалкилазная активность для CYP2В1) определяли в соответствии с методами, изложенными в работах [60, 111]. Активность цитозольных конъюгирующих ферментов глутатионтрансферазы и УДФ- глюкуронозилтрансферазы определяли согласно методикам Burchell B. et al., Habig W.H. et al. [45, 80]. Исследования показателей системы ПОЛ в эритроцитах и плазме крови проводили на биохимическом анализаторе ФП-901 производства фирмы «Labsystems OY» (Финляндия) в лаборатории клинической биохимии, иммунологии и аллергологии ФГБУ «НИИ питания» РАМН под руководством проф., д.м.н. Т.Б.Сенцовой. Активность глутатионредуктазы определяли методом Tillotson J.A. et al. [17]. Определение активности каталазы проводили на основе метода Oshino N. et al. [16]. Активность глутатионпероксидазы в гомогенатах 64 печени определяли методом Mills G.C. [18]. Содержание диеновых коньюгатов ПНЖК в гомогенатах печени изучали классическим спектрофотометрическим методом Placer (1968) в модификации Гаврилова [5]. Определение активности супероксиддисмутазы эритроцитов осуществляли на основе метода Niashikimi M. et al. [16]. 3.8 Метод определения проницаемости кишечной стенки для антигенного белка ОВА Проницаемость тонкой кишки для макромолекул ОВА изучали по его концентрации в сыворотке периферической крови у крыс, получавших внутрижелудочно белок куриного яйца. Анализ ОВА проводили с помощью твёрдофазного двухвалентного иммуноферментного теста согласно официальному методу ВОЗ [171] с незначительными модификациями. Сенсибилизация антител. В каждую лунку полистирольной планшеты со средней степенью связывания вносили по 2 мкг моноспецифических антител кролика к ОВА, очищенных методом аффинной хроматографии, в 0,1 мл 0,1 М Na-бикарбонатного буфера рН 9,2. Адсорбцию антител проводили в течение 16 ч при +4оС в холодильнике. Затем лунки планшеты трижды отмывали раствором PBS с 0,1% Твин-20 (производства фирмы “Sigma-Aldrich”, Германия), вносили по 0,2 см3 блокирующего реагента - 1% раствора желатины в 0,01 М Naфосфатном буфере рН 7,3 с 0,15 М NaCl (PBS) и помещали на 0,5 ч на встряхиватель. В части лунок планшеты по аналогичной методике вместо антител к ОВА иммобилизировали нормальный гамма-глобулин кролика. Окончательно лунки планшет троекратно отмывали PBS с 0,1% по объёму Твин-20 «Analytical grade» (Твин-PBS). Приготовление стандарта ОВА. Навеску 3-5 мг пятикратно кристаллизованного ОВА взвешивали на аналитических весах с точностью ±0,1 мг. Белок помещали в пенициллиновый флакон и добавляли PBS из расчета, чтобы концентрация белка составила 1 мг/см3. В коническую пробирку автоматической пипеткой вносили 0,99 см3 PBS c 1% по объёму нормальной 65 лошадиной сывороткой (НЛС-PBS) и 0,01 см3 раствора ОВА. Раствор перемешивали, отбирали аликвоту 0,025 см3 и переносили в пробирку с 0,975 см3 нормальной крысиной сыворотки. Полученный раствор титровали в серии двоичных разведений с помощью полуавтоматической пипетки в ряду из 10 пробирок в нормальной крысиной сыворотке. При этом концентрация ОВА в растворах стандарта составляла от 0,5 до 250 нг/ см3. После отмывки от блокирующего реагента в лунки планшеты, сенсибилизированные антителами к ОВА, вносили в 2 повторах следующие растворы в объеме 0,1 см3: 1) бланк раствора (0 нг/см3 ОВА) в нормальной крысиной сыворотке; 2) стандартные растворы ОВА в последовательности от S1 (0,5 нг/см3) до S10 (250 нг/см3) в двух повторах; 3) исследуемые пробы сыворотки крыс в двух повторах (также в лунки, сенсибилизированные нормальным гаммаглобулином кролика); 4) раствор яичного белка, которым кормили животных в день забоя, в разведении 1:2 000 000 в нормальной крысиной сыворотке. Планшету инкубировали 2 часа на встряхивателе при комнатной температуре, после этого лунки отмывали 4-кратно Твин-PBS и вносили моноспецифические кроличьи антитела к ОВА, меченные пероксидазой, в НЛСPBS в экспериментально подобранном разведении (от 1:2000 до 1:8000 для различных серий препарата). Инкубацию и отмывку повторяли, после чего активность пероксидазы в лунках выявляли по реакции с 0,04% о- фенилендиамином и 0,04% Н2О2 в 0,1 М Na-цитратно-фосфатном буфере рН 6,0. Реакцию останавливали через 10 минут добавлением равного (0,1 мл) объема 1н H2SO4 и фотометрировали планшету на автоматическом иммуноферментном анализаторе «ЭФОС 9305» (Россия) по двухволновой схеме (1=492 нм; 2=620 нм). Для каждого образца сыворотки рассчитывали связывание Вп = (D1 + D2)/2 (NSB1 - NSB2)/2, где D - оптическая плотность в лунке образца, сенсибилизированной антителами к ОВА, в двух повторах, NSB - оптическая плотность в лунке образца, сенсибилизированной нормальным гамма-глобулином кролика, в двух повторах. По стандартному графику для каждой данной находили концентрацию ОВА в пробе, в нг/см3. В случае если эта концентрация 66 оказывалась ниже 0,5 нг/см3, результат считался не значимым (ОВА не обнаружен). В случае, если концентрация ОВА превышала 500 нг/ см3, пробу разбавляли в 10 раз нормальной крысиной сывороткой и анализ повторяли. Величину всасывания ОВА в % от скормленной дозы в расчёте на весь кровоток рассчитывали, исходя из предположения, что масса крови крысы составляет 6% от массы тела [10] при гематокрите около 50% и что проникновением ОВА в эритроциты можно пренебречь. Метрологические характеристики теста. Чувствительность метода составляла 0,5 нг/см3; тест на открытие 92%, коэффициент корреляции для параллельных проб в пределах одного анализа составил +0,983, коэффициент вариации для одного анализа - 28%, а для разных анализов (по разным стандартным кривым) 39%. 3.9 Метод определения уровня цитокинов в сыворотке крови Определение содержания цитокинов IL-6, IL-10 и TNFα в сыворотке крови крыс проводили методом ИФА с использованием готовых наборов («Bioscience», производства «Bender MedSystems GmbH», Австрия). Принцип метода (двухвалентный твердофазный биотин-стрептавидиновый иммуноферментый тест) заключался в последовательном нанесении на планшету с иммобилизованными моноклональными антителами к определяемому цитокину исследуемых сывороток крови и стандартных образцов (IL-6, IL-10, TNFα), а затем конъюгата антител против крысиных IL-6, IL-10 или TNFα с биотином. После 2-х часовой инкубации и отмывки PBS c 1% Твин 20, сформировавшиеся на поверхности полистирола тройные иммунные комплексы антитело(1)-цитокинантитело(2)-биотин определяли внесением на 1 час конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (Streptavidin-HRP). Затем повторяли процедуру отмывки PBS c 1% Твин 20 и вносили раствор субстрата (0,04% Н2О2+0,04% тетраметилбензидин). Цветную реакцию останавливали с использованием 1М H3PO4, оптическую плотность определяли при 450 нм и 620 нм на автоматическом планшетном спектрофотометре «ЭФОС 9605» (Россия). Концентрацию цитокинов 67 в сыворотке крови определяли по стандартной кривой с использованием программного обеспечения прибора методом «кусочной аппроксимации». Исследования проведены в лаборатории обмена веществ и энергии ФГБУ «НИИ питания» РАМН под руководством научного сотрудника, к.б.н. Шарановой Н.Э. 3.10 Метод изучения биораспределения фуллерена С60 по органам и тканям животных с использованием ВЭЖХ Экстракцию немодифицированного фуллерена С60 проводили согласно [149] с некоторыми модификациями. Для этого из исследуемых образцов при комнатной температуре на один объем образца добавляли 2,25 объема ледяной уксусной кислоты Х.Ч., смесь интенсивно перемешивали на персональном вортексе при 3000 об/мин и помещали на 30 мин в ультразвуковую ванну с мощностью генератора 200 Вт, с рабочей частотой 35 кГц и удельной звуковой мощностью 20 Вт.дм-3. Затем добавляли 4-кратный объем толуола (квалификации «для хроматографии») и интенсивно перемешивали в течение 1 часа. Центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут и отбирали толуольную фракцию в колбу. Экстракцию содержимого пробирки повторяли еще 2 раза, все толуольные экстракты объединяли в одной колбе. Затем её содержимое упаривали на роторном испарителе, осадок перерастворяли в 1 мл толуола. Экстракт фильтровали через фильтр PTFE 13 мм с диаметром пор 45 мкм. Отбирали 200 мкл на анализ методом ВЭЖХ. Количественное определение фуллерена С60 проводили согласно [74, 128] с использованием системы ВЭЖХ Agilent 1200 на колонке «ZORBAX C18». Оптическую плотность регистрировали при длине волны 340 нм. Пик фуллерена идентифицировали по его УФ-спектру, количественное определение проводили по предварительно полученному стандартному графику. Объем наносимого на колонку образца составлял 10, 50 и 100 мкл. Использовали изократическую элюцию подвижной фазой с соотношением толуол:ацетонитрил – 55:45. Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин. В таких условиях время удерживания немодифицированного фуллерена С60 составляет от 7,5 до 8,0 минут, 68 при времени выхода растворителя от 1,8 до 2,0 мин. Точность калибровки проверяли как минимум по одному стандартному образцу перед каждым циклом измерений. Для построения стандартного графика были приготовлены растворы фуллерена в толуоле следующих концентраций: 0,1 мг/мл, 0,075 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,02 мг/мл, 0,01 мг/мл, 0,005 мг/мл, 0,002 мг/мл, 0,001 мг/мл, 0,0005 мг/мл, 0,0002 мг/мл, 0,0001 мг/мл. Объем вводимого стандартного образца составлял 10 мкл. Стандартные графики для высоких и низких концентраций фуллерена представлены на рисунках 3 и 4 соответственно. Калибровочная кривая, фуллерен R2 = 0,9995 4000 3726,6 3500 площадь пика 3000 2864 2500 2000 1942,4 1500 1000 749,67 500 420,27 208,02 90,299 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Содерж ание фуллерена,нг Рисунок 3. Калибровочный график фуллерена в толуоле с концентрацией фуллерена от 0,1 мг/мл до 0,002 мг/мл. Построение графика методом наименьших квадратов (линейная регрессия) 69 90 80 площадь пика 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Содерж ание фуллерена, нг Рисунок 4. Калибровочный график фуллерена в толуоле с концентрацией фуллерена от 0,001 мг/ мл до 0,0001 мг/мл Согласно МР 1.2. 2641–10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах», использованный в данной работе ВЭЖХ-метод анализа фуллерена С60 в биологических образцах характеризуется точностью определения ±16 %, полнота извлечения составляет не менее 80%. Минимальное определяемое количество составило 0,001 мкг/мл биологического образца. Как видно представленных данных, стандартный график, полученный в интервале концентраций фуллерена от 1 до 10 нг/10 мкл является нелинейным с «изломом» в окрестности концентрации 5 нг /10 мкл. Имеет место, таким образом, кажущееся отклонение от закона Ламберта-Бера, связанное, как можно предположить, с образованием при концентрации более 5 нг/10 мкл мультимолекулярных агрегатов (мицелл) фуллерена в подвижной фазе, имеющих меньший коэффициент экстинкции при выбранной длине волны, чем истинный (молекулярный) раствор фуллерена, стабильный при меньших концентрациях. Для высоких концентраций фуллерена С60 (от 20 и до 1000 нг в образце) стандартный график является линейным, то есть закон Ламберта-Бера в точности соблюдается. 70 3.11 Метод оценки повреждающего действия на ДНК Окислительное повреждение ДНК оценивали по уровню экскреции с мочой специфического продукта 8-оксо-2-дезоксигуанозина (8-oxo-G), образование которого характерно для этого процесса [9, 62]. Исследование выполнено в лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУ «НИИ питания» РАМН, под руководством младшего научного сотрудника Селифанова А.В. Предварительно гомогенизированный образец мочи объемом 3 мл наносили на картридж «ТФЭ», конденсированный 3×3 мл ацетонитрила, метанола и 25 мМ буфера дигидрофосфата калия (рН=5,5). После промывки 3 мл 25 мМ буфера и 2 мл воды картридж высушивали в токе азота. Далее промывали 2 мл ацетонитрила. Затем 8-oxo-G элюировали 2 мл метанола. Элюат упаривали досуха и перерастворяли в 300 мкл 10 мМ ацетата аммония, содержащего 2% метанола (рН=4,3). 10 мкл экстракта вводили в систему ВЭЖХ (колонка Supersphere 100 RP18 (125×2 мм, 4 мкм); предколонка Supersphere 100 RP18 (10×2 мм), все производства «Merck», Германия), снабжённую автосамплером и двумя насосами (фирма «Perkin Elmer», Uberlingen, Германия). Разделение проводили в градиенте 10 мМ ацетатаммонийного буфера рН=4,3 и метанола, начиная с 1% метанола, с возрастанием до 80% в течение 15 мин. Скорость элюирования составила 0,2 мл в минуту. В качестве детектора использовали трехуровневый квадрупольный массспектрометр API 3000 (фирма «PE Biosystems», Langen, Германия), с помощью которого отслеживали ион с M/Z=168 м/з, образуемый распадом иона – предшественника c M/Z=284 м/з. Время удерживания пика 8-oxo-G составило 7,2 мин. Концентрацию анализируемого вещества определяли по стандартному графику, который строили с использованием метода численного интегрирования хроматограмм. 3.12 Метод определения содержания селена в биологических образцах Содержание селена микрофлуориметрическим в составе методом [7]. биологических Принцип проб метода определяли заключается в 71 образовании в слабокислой среде флуоресцирующего комплекса селенистой кислоты с 2,3-диаминонафталином с последующим спектрофлуориметрическим определением. При проведении минерализации образцов сыворотки крови и печени их помещали в пробирки из жаропрочного стекла со шлифом № 14, добавляли по 2 см3 смеси 15:8 концентрированной азотной и 52% хлорной кислот и оставляли при комнатной температуре на 16 - 18 часов. Затем пробирки помещали в блок сжигания и осуществляли минерализацию в температурном режиме: 120°С - 1 час, 150°С - 1 час, 200°С - 4 часа. Для удаления следов азотной кислоты блок сжигания охлаждали до 150°С, добавляли к пробам 100 - 200 мкл 33% перекиси водорода и выдерживали при указанной температуре в течение 30 минут. После этого блок сжигания охлаждали до 110° С.Для восстановления шестивалентного селена до Se(IV) к пробам добавляли по 1 см3 6 М соляной кислоты и выдерживали при 110°С в течение 10 минут. По окончании процесса пробы сразу же вынимали из блока сжигания и добавляли по 1 см 3 дистиллированной воды, смывая при этом остатки минерализата со стенок пробирок. Готовили раствор 1 мг/см3 2,3-диаминонафталина (ДАН) в 0,1 М соляной кислоте при нагревании до температуры не выше 50°С. Полученный раствор переносили в делительную воронку, трижды экстрагировали 1:3 по объёму гексаном (Х.Ч.), органический слой отбрасывали. Водный слой фильтровали через фильтровальную бумагу. Реактив хранили до проведения анализа не более 7 суток при температуре -20оС в темноте. Все операции с 2,3-ДАН проводили при рассеянном свете. Не допускали использование смазки шлифов пробирок и делительной воронки. В каждую пробирку с минерализатом добавляли по 0,5 см 3 раствора тетранатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и по 1,5 см3 разбавленного 1:1 водой раствора 25% аммиака. Быстро доводили рН проб до 1,5 – 2,0 по универсальному индикатору до перехода пурпурный – оранжевый цвет, добавляя в случае необходимости по каплям разбавленный аммиак или 0,1 М соляную кислоту. К полученным растворам добавляли по 1,0 см3 заранее приготовленного реактива 2,3-диаминонафталина и выдерживали 30 минут в 72 водном термостате в темноте при 50°С. По окончании процесса пробы вынимали из термостата, охлаждали до комнатной температуры и каждую интенсивно экстрагировали 1 см3 гексана в течение 50 - 60 секунд. Определяли величину флуоресценции органического экстракта при λ возбуждения = 376 нм и λ эмиссии = 520 нм. Из определённых значений флуоресценции вычитали значение флуоресценции «холостой» пробы, полученной в тех же условиях без добавления анализируемого биологического материала. Содержание в образцах селена в мкг/кг (мкг/дм3) продукта определяли по стандартному графику, полученному с использованием раствора образцы подвергали анализируемые Na2SeO3 всем пробы. За тем известной же концентрации. Стандартные процедурам окончательный минерализации, результат принимали что и среднее арифметическое значение двух определений. Полноту открытия селена проверяли с использованием стандартного образца селена сыворотки крови, аттестованного по международному стандарту микроэлементного состава сыворотки крови человека “Seronorm” (Дания). 3.13 Метод лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии После фиксации печени и подвздошной кишки в 10% формалине на натрийфосфатном буфере рН 7,4, образцы тканей обезвоживали в серии растворов этилового спирта восходящей концентрации, смесей этилового спирта и ксилола и в чистом ксилоле, после чего пропитывали парафином и заливали в парафиновые блоки на установке «ЕС 350» (фирмы «Microm», Германия). С блоков изготовляли тонкие (5-7 мкм) срезы на микротоме Leica RM2235 (фирмы «Leica», Германия), монтировали на предметные стёкла, прогревали 10-15 мин при температуре 58оС для фиксации образца на стекле и удаляли парафин путем последовательной промывки в 2 сменах ксилола, 95%, 80% и 70% этиловом спирте и 2 сменах деионизованной воды. Далее проводили пермеабилизацию ткани на срезе путем обработки протеиназой К (фирмы «Sigma», США) активностью 0,6 ед/см3 в 0,2M Tris-HCl буфере с добавлением 0,05% по массе Твин-20, после чего выполняли 73 окрашивание специфическими флуоресцентными красителями. Применяли следующие виды флуоресцентных меток: 1. DAPI (4',6-диамидино-2-фенилининдол); 2. фаллоидин, конъюгированный с флуорохромом CF568; 3. антитела к клаудину-1 и вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромом DyLight™ 488; 4. антитела к CD106 (VCAM-1), конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor® 488; 5. антитела к CD31, меченные Alexa Fluor® 647. Окрашивание микропрепаратов флуорохромами проводили в водных средах в соответствии с протоколами, рекомендуемыми производителями соответствующих флуоресцентных меток. Окончательно препараты после окрашивания заключали под покровные стёкла в нефлуоресцирующую среду «Mowiol» и оконтуривали маникюрным лаком для предотвращения высыхания. Окрашенные микропрепараты просматривали на конфокальном флуоресцентном микроскопе «LSM 710» (фирмы «Zeiss», Германия). Часть микропрепаратов тонкой кишки после монтажа на предметные стёкла окрашивали красителями гематоксилином и эозином по стандартной методике [19] и просматривали в проходящем свете в микроскопе «AxioImager Zl» (производства фирмы «Zeiss», Германия), оборудованном цветной камерой. Исследования проведены под руководством научного сотрудника лаборатории пищевой токсикологии с группой оценки безопасности наноматериалов ФГБУ «НИИ питания» РАМН Смирновой Т.А. 3.14 Методы статистической обработки экспериментальных данных Статистический анализ данных выполняли с использованием компьютерной программы SPSS 19,0 (Statistical Package for Social Sciences, США), согласно данным описательной статистики (М - среднее арифметическое, Ме - медиана, Sd - стандартное отклонение, m – стандартная ошибка среднего), критерию ANOVA (в целях оценки однородности распределения показателей в группах) и критерию 74 Крускала-Уоллиса (односторонний дисперсионный анализ, для проверки равенства медиан нескольких выборок), тесту Стьюдента и непараметрическому тесту Манна-Уитни, а также факторному анализу (проводилась проверка однородности распределения тестируемого показателя в группах по факторам а) наличия фуллерена, б) наличия носителя с помощью теста на остаточную дисперсию (ANOVA). Различия между группами животных признавали достоверными при уровне значимости p0,05. 75 4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 4.1 Характеристика размера частиц фуллерена С60 и фуллеренола С60(ОН)24 Фуллерен С60. Результаты исследований показали, что коллоидная дисперсия на 75% состоит из частиц фуллерена С60 размером ~30 нм и 25% из частиц ~600 нм (Рисунок 5, 6, 7). На рисунке 5 представлен график затухания УЗ сигнала, в зависимости от частоты сигнала (MHz) и типа модели статистического распределения. Объемная доля частиц в дисперсии в зависимости от их размера представлена на рисунке 6. Разница результатов определения размеров частиц при одно- и бимодальном распределении показана рисунке 7. Как видно из представленных данных, опытная зависимость лучше аппроксимируется бимодальной моделью распределения частиц по размерам, чем одномодальной. Рисунок 5. График затухания УЗ сигнала. Ось абсцисс - частота сигнала (МГц); ось ординат - затухание сигнала (дБ/см/МГц). 76 Рисунок 6. Отношение объемной доли частиц к их диаметру Ось абсцисс - доля частиц (вес); ось ординат - диаметр частиц (мкм). Рисунок 7. Размеры частиц фуллерена С60 при одномодальном (Unimodal) и бимодальном (Bimodal) распределении частиц. Фуллеренол С60(ОН)24. Результаты исследований показали (Рисунок 8), что раствор фуллеренола С60(ОН)24 с концентрацией 4 мг/мл на 75,1% представлен частицами со средним диаметром 2,89 нм и на 24,9% частицами 1,05 нм, 10-й перцентиль составил 1,12 нм, 90-й перцентиль составил 4,68 нм (Рисунок 9). Как видно из рисунка 10, в растворе содержатся как частицы фуллеренола С60(ОН)24 размером от 0,95 нм, так и их агломераты, размером до 7,6 нм. 77 Рисунок 8. Распределение размеров частиц в зависимости от интенсивности светорассеяния. Ось абсцисс средний гидродинамический диаметр (размер) частиц (нм); ось ординат: слева - % доля числа частиц с размером не больше данного (график); справа % числа частиц в интервале размеров (гистограмма). Рисунок 9. Средний диаметр частиц фуллеренола С60(ОН)24 (Dia, nm), процент содержания во фракции (Vol%), ширина пиков (Width) и распределение перцентиля числа частиц по размерам (нм) 78 Рисунок 10. Распределение числа фуллеренола по размерам. 79 4.2 Токсиколого-гигиеническая характеристика немодифицированного фуллерена С60 в эксперименте продолжительностью 28 дней 4.2.1 Влияние фуллерена С60 на интегральные показатели и массу внутренних органов Как показало еженедельное взвешивание животных, крысы контрольной группы достоверно отставали в развитии от крыс из групп 2, 3, 4 только в первую неделю эксперимента; в дальнейшем средние приросты массы различались недостоверно (Таблица 9). Таблица 9 Масса тела (M±m) крыс, получавших фуллерен С60 или его носитель, и динамика её изменения (в абсолютном и относительном выражении) при внутрижелудочного введении на протяжении 28 дней. Численность групп животных – по 15 особей Дни эксперимента 1 Груп пы №№ Масса Масса г г 1 2 3 4 р, ANO VA 8 15 Прирост за 7 дней г % Масса г 22 Прирост за неделю г % Масса г 28 Прирост за неделю г % Масса г Прирост за неделю г % 104,9± 2,9 113,7± 2,2 * 113,7± 2,3 * 112,4± 2,0 * 159,1± 54,2± 51,7± 193,9± 34,8± 22,2± 236,4± 42,5±2 22,1± 262,1± 25,7± 11,0± 4,6 2,3 1,8 5,0 2,1 1,5 5,6 ,4 1,3 6,0 1,0 0,4 0,028 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 158,0± 44,3± 39,3± 205,9± 47,9± 30,6± 245,9± 39,9±4 19,9± 274,7± 28,8± 12,1± 3,3 3,0 3,1 5,7 4,8 3,2 6,2 ,9 2,8 6,6 5,5 2,5 157,7± 44,0± 39,2± 202,9± 45,2± 30,3± 239,7± 36,8±1 20,1± 268,5± 28,8± 12,6± 4,9 4,8 4,5 6,6 8,1 5,7 8,0 1,4 5,9 8,6 6,7 2,9 160,1± 47,7± 43,1± 205,0± 44,9± 29,2± 233,5± 28,5±9 14,8± 269,6± 36,1± 17,1± 4,0 4,6 4,5 5,6 6,9 4,7 8,1 ,1 4,6 6,5 7,2 4,3 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 * Различие с группой 1 достоверно при уровне значимости р<0,05 Прирост массы тела крыс за 28 дней (в %% от исходного уровня) представлен в таблице 10, все различия между группами недостоверны (p>0,05). 80 Таблица 10 Сравнение абсолютных и относительных (в %) приростов массы тела крыс групп 1-4, получавших фуллерен С60 и его носитель за 28 дней эксперимента Группы №№ Число крыс Прирост массы за 28 дня, абсолютный, г M±m Прирост массы за 28 дня, относительный, % M±m 1 15 157,3±4,2 151,0±4,6 2 15 160,1±5,5 141,7±4,5 3 15 154,8±8,5 137,1±8,0 4 15 157,2±7,0 141,0±7,6 >0,05 >0,05 гр.2 >0,05 >0,05 гр.3 >0,05 >0,05 гр.4 >0,05 >0,05 гр.1 – гр.3 >0,05 >0,05 гр.1 – гр.4 >0,05 >0,05 гр.2 – гр.3 >0,05 >0,05 гр.2 – гр.4 >0,05 >0,05 Наличие С60 >0,05 >0,05 Наличие >0,05 носителя * непараметрический критерий Манна-Уитни >0,05 Однородность распределения, группы 1–5, ANOVA, p Достоверность* различия при попарном сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность* различия при попарном сравнении групп Факторный анализ, ANOVA, p, по фактору: Масса внутренних органов (селезенка, почки, гонады, сердце, тимус, легкие, надпочечники, мозг), выраженная в % от массы тела, не различалась достоверно между группами и находилась в пределах нормальных значений для крыс данного возраста (Таблица 11). Исключение составила относительная масс печени, которая составила в группе 4, получавшей фуллерен в высокой дозе, 3,25±0,06 %, что было достоверно меньше (р<0,05, критерий Манна-Уитни) чем в группах 1-3 (3,53±0,05; 3,56±0,05 и 3,61±0,13 % соответственно). 81 Таблица 11 Относительные массы внутренних органов крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель, на 29-й день эксперимента Группы №№ Число крыс 1 Органы, относительная масса %, M±m Печень Почки Селезенка Сердце Семенники Тимус Легкие Надпочечники 9 3,53±0,05 0,71±0,02 0,70±0,05 0,39±0,01 1,06±0,05 0,21±0,01 0,63±0,02 0,05±0,01 2 9 3,56±0,05 0,71±0,02 0,73±0,05 0,40±0,01 1,10±0,02 0,24±0,02 0,62±0,01 0,03±0,01 3 9 3,61±0,13 0,68±0,02 0,65±0,04 0,40±0,01 1,10±0,10 0,21±0,01 0,62±0,01 0,03±0,01 4 9 3,25±0,06 0,70±0,02 0,68±0,05 0,40±0,01 1,12±0,02 0,20±0,01 0,60±0,02 0,03±0,01 Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p 0,016 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр. 2 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр.3 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр.4 0,003 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Достоверность* различия при сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность* гр.3 >0,05 различия при сравнении с группой 2, гр.4 0,002 для групп №№ * непараметрический критерий Манна-Уитни 82 4.2.2 Влияние фуллерена С60 на гематологические показатели крови Содержание гемоглобина цельной крови составило у животных групп 1-4, соответственно, 140,9±4,0; 129,3±2,4; 130,0±2,5 и 134,3±3,9 г/л и было достоверно (р<0,05) снижено в группах 2 и 3 по сравнению с контролем. Однако, различие групп, получавших фуллерен, от группы 2, было недостоверно. Аналогично, показатели эритроцитов крови животных, представленные в таблице 12, не претерпевали изменений, которые могли бы быть соотнесены собственно с воздействием фуллерена, но не его носителя. Таким образом, специфических эффектов воздействия фуллерена на системы эритропоэза выявлено не было. Изучение лейкоцитарной формулы крови выявило у животных групп 3 и 4 (Таблица 13) достоверное повышение относительного числа эозинофилов и нейтрофилов на фоне снижения количества лимфоцитов в группе 4 по сравнению с группой 2. При этом изменения первых двух показателей были отчётливо дозозависимыми. Ввиду этого, следует заключить, что введение фуллерена в обеих использованных дозах влияет на некоторые гематологические показатели. 4.2.3 Влияние фуллерена С60 на биохимические показатели крови Изученные у животных биохимические показатели сыворотки крови включали активности печеночных ферментов (АЛТ, АСТ), общей ЩФ, концентрация общего белка, альбумина, креатинина, мочевой кислоты, глюкозы (Таблица 14). Во всех группах значения этих биохимических параметров, не различались ни с контролем, ни между собой и находились в пределах нормы. Какого-либо влияния перорально вводимого фуллерена при этом выявлено не было. 83 Таблица 12 Средние (M±m) значения гематологических показателей, характеризующих состояние эритроцитов, у крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель на протяжении 28 дней Показатели, ед.изм. Общее количество эритроцитов, 106/мкл Гематокрит, % Средний объем эритроцита, мкм3 Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах, пг Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, г/л Группы №№ Число крыс 1 6 7,09±0,23 38,80±0,85 55,0±1,65 19,30±0,51 351,5±2,5 2 8 7,19±0,13 41,58±0,57 58,0±0,85 19,98±0,29 344,9±2,5 3 7 7,12±0,14 40,19±0,68 56,57±1,04 19,23±0,32 340,4±2,8 4 7 7,18±0,14 42,41±0,80 59,0±0,53 20,07±0,15 339,9±1,3 Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p >0,05 0,011 >0,05 >0,05 0,01 Достоверность* различия при сравнении с группой 1, для групп №№ гр. 2 >0,05 0,039 >0,05 >0,05 >0,05 гр.3 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,022 гр.4 >0,05 0,012 >0,05 >0,05 0,004 Достоверность* различия при сравнении групп гр2-гр.3 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр.2-гр.4 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 * – непараметрический критерий Манна-Уитни 84 Таблица 13 Средние (M±m) значения гематологических показателей, характеризующих состояние лейкоцитов и тромбоцитов, у крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель на протяжении 28 дней Показатели, ед.изм. Общее количество лейкоцитов, 103 /мкл Нейтрофилы, % Эозинофилы, % Лимфоциты, % Моноциты, % Тромбоциты, 109/л Группы №№ Число крыс 1 6 17,1±1,77 14,73±1,49 0,75±0,18 72,92±2,70 9,73±0,69 643,0±31,8 2 8 23,14±2,27 13,09±0,97 0,93±0,20 74,81±1,51 10,99±0,63 661,4±21,5 3 7 20,14±2,16 17,81±1,18 1,29±0,12 69,91±1,83 10,39±0,78 610,7±33,2 4 7 18,91±2,43 21,23±1,99 1,57±0,21 65,21±2,53 11,81±0,66 631,6±56,3 >0,05 0,02 0,022 0,019 >0,05 >0,05 Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Достоверность* различия при сравнении с группой 1, для групп №№ гр. 2 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр.3 >0,05 >0,05 0,026 >0,05 >0,05 >0,05 гр.4 >0,05 0,032 0,015 >0,05 >0,05 >0,05 Достоверность* различия при сравнении групп гр2-гр.3 >0,05 0,013 >0,05 0,049 >0,05 >0,05 гр.2-гр.4 >0,05 0,011 0,02 0,021 >0,05 >0,05 * – непараметрический критерий Манна-Уитни 85 Таблица 14 Средние (M±m) значения биохимических показателей сыворотки крови у крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель в течение 28 дней Показатели, ед.изм. Белок Глюкоза, Креатинин, общий, г/л ммоль/л мкмоль/л Группы №№ Число крыс АЛТ, ед/л АСТ, ед/л Альбумин, г/л 1 15 58,3±2,7 166,2±7,0 30,9±0,3 62,1±0,7 7,17±0,22 2 15 62,0±2,6 157,8±4,8 31,7±0,3 63,3±0,6 3 15 54,3±4,6 148,6±6,7 31,3±0,4 4 15 54,6±2,9 145,2±4,5 >0,05 гр. 2 Моч. к-та, Мочевина мкмоль/л мкмоль/л ЩФ, ед/л 30,1±0,8 112,1±6,6 7,89±0,23 267,3±10,8 7,27±0,43 29,8±0,6 119,0±6,0 8,13±0,45 267,4±13,0 62,6±0,6 7,40±0,57 31,1±0,7 108,5±3,9 8,36±0,52 237,8±15,7 31,7±0,3 63,4±0,6 7,77±0,48 30,3±0,3 104,6±4,1 7,22±0,39 249,2±12,3 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр.3 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр.4 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр2-гр.3 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр.2-гр.4 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр.3-гр.4 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Достоверность* различия при сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность* различия при сравнении групп * – непараметрический критерий Манна-Уитни 86 4.2.4 Влияние фуллерена С60 на содержание цитохромов Р-450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков Как следует из данных таблицы 15, большая часть показателей активности микросомальной системы детоксикации ксенобиотиков печени различалась между группами животных статистически недостоверно (p>0,05). Исключение составила, во-первых, активность изоформы СYР 1А2, которая была достоверно снижена в группах 3 и 4 в сравнении с группами 1 и 2. Данный эффект был приблизительно одинаковым по величине в группах, получавших фуллерен в обеих дозах то есть не имел отчётливого дозо-зависимого характера. Тем не менее, эти данные показывают, что даже при низкой дозе фуллерена отмечается снижение активности этого фермента системы детоксикации ксенобиотиков, что особенно заметно в сравнении со второй группой, получавшей носитель. 87 Таблица 15 Среднее (M±m) содержание цитохромов Р-450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков у крыс, получавших фуллерен С60 или его носитель в течение 28 дней Показатели, ед.изм. Группы №№ Число Цитохром Р-450, крыс нмоль/мг белка Цитохром b5, нмоль/мг белка Активность СYР1А1, нмоль/мин*мг белка Активность СYР1А2, нмоль/мин*мг белка Активность CYP2B1 нмоль/мин*мг белка Глутатион-Sтрансфераза, мкмоль/мин*мг белка UDPГлюкуронозилтрансфе раза нмоль/мин*мг белка 1 6 0,60±0,04 0,53±0,03 3,83±0,51 28,38±2,82 17,68±0,85 0,71±0,02 23,28±2,17 2 6 0,53±0,03 0,48±0,02 5,15±0,32 39,15±8,80 17,75±0,48 0,59±0,03 20,43±2,13 3 6 0,53±0,06 0,48±0,02 4,37±0,10 17,73±2,33 15,08±1,14 0,65±0,04 21,10±1,59 4 6 0,58±0,07 0,51±0,04 4,18±0,38 16,25±3,37 15,33±0,99 0,67±0,02 20,43±1,59 >0,05 >0,05 >0,05 0,001 >0,05 0,041 >0,05 гр. 2 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 гр.3 >0,05 >0,05 >0,05 0,036 >0,05 >0,05 >0,05 гр.4 >0,05 >0,05 >0,05 0,025 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Достоверность* различия при сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность* гр.3 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,01 различия при сравнении с гр.4 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,013 группой 2, для групп №№ * - Числитель дроби – t-тест Стьюдента; знаменатель – непараметрический критерий Манна-Уитни 88 4.2.5 Влияние фуллерена С60 на состояние системы антиоксидантной защиты и значения показателей ПОЛ Как следует из данных таблицы 16, такой показатель интенсивности ПОЛ, как уровень образования малонового диальдегида в плазме крови, достоверно не различался во всех группах животных, тогда как образование диеновых конъюгатов было практически равномерно повышено в группах 2-4 по сравнению с контролем. Такой же характер имело снижение активности каталазы в эритроцитах, в то время как активность глутатионпероксидазы была, напротив, повышена в опытных группах, причём, наиболее выражено в группе 2, получавшей носитель. Следовательно, указанные эффекты можно рассматривать как неспецифические, обусловленные воздействием, скорее, раствора-носителя, чем собственно фуллерена. Вместе с тем, активность глутатионредуктазы была повышена в группах 3 и 4, приблизительно, в равной степени по сравнению с контролем и с группой, получавшей носитель, то есть приём фуллерена влиял на этот показатель, но не дозозависимо. Особого внимания заслуживает изменение активности супероксиддисмутазы, которая была достоверно снижена в группе 3 как по сравнению с контролем, так и с группой 4. Таким образом, есть основание полагать, что приём фуллерена в низкой дозе может влиять на этот важный фермент антиоксидантной защиты, но наблюдаемый эффект является не только не дозозависимым, но и немонотонным. 89 Таблица 16 Средние (M±m) значения показателей перекисного окисления липидов и активность антиоксидантной системы в плазме крови и эритроцитах крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель в течение 28 дней Показатели, ед.изм. Группы №№ Содержание Содержание Активность Активность Число диеновых малонового Активность глютатионпероксидазы глютатионредуктазы крыс коньюгатов диальдегида супероксиддисмутазы ПНЖК в эритр.,мкмоль/мин мл эритр.,мкмоль/мин в плазме, эритр.,усл.ед./ мл эр плазме, эр мл эр нмоль/мл нмоль/мл Активность каталазы эритр.,кU/ мл эр 1 6 3,44±0,09 6,25±0,08 17,8±1,8 1,31±0,12 1506±46 345,3±8,8 2 6 3,90±0,15 6,12±0,17 25,2±1,7 1,13±0,15 1393±50 276,3±10,8 3 6 4,18±0,12 5,62±0,38 21,3±1,1 1,74±0,12 1307±54 247,5±13,1 4 6 4,04±0,16 6,13±0,20 22,5±1,7 1,94±0,10 1485±27 269,3±15,5 0,005 >0,1 0,029 0,001 0,02 <0,001 гр. 2 0,027 >0,05 0,014 >0,05 >0,05 0,004 гр.3 0,001 >0,05 >0,05 0,044 0,024 0,004 гр.4 0,008 >0,05 >0,05 0,013 >0,05 0,004 >0,05 0,013 >0,05 >0,05 >0,05 0,004 >0,05 >0,05 Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Достоверность* различия при сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность* гр2>0,05 >0,05 гр.3 различия при сравнении гр.2>0,05 >0,05 групп гр.4 * - непараметрический критерий Манна-Уитни 90 4.2.6 Влияние фуллерена С60 на содержание цитокинов в сыворотке крови Как следует из данных, представленных в таблице 17, уровни цитокинов в сыворотке крови животных, получавших фуллерен С60 на протяжении 28 дней, не показывают достоверных различий с группой, получавшей носитель фуллерена, и с контрольной группой. 28-дневное введение фуллерена, по-видимому, не влияет на выработку изученных цитокинов. Таблица 17 Средние значения (M±m) и интервалы изменения уровней исследованных цитокинов в сыворотке крови крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель на протяжении 28 дней Группы Количество крыс 1. Контроль 8 2.Контроль носителя 8 3.Фуллерен 1 мг/кг 8 4.Фуллерен 10 мг/кг 8 Критерий Краскала и Уоллиса, группы 1-4 Достоверность* различия при попарном сравнении с группой 1, для групп №№ гр. 2 гр.3 гр.4 гр.3 Достоверность* различия при попарном сравнении с группой гр.4 2, для групп №№ *непараметрический критерий Манна-Уитни Показатели, ед. изм. TNFIL-10, IL-6, pg/ml pg/ml pg/ml 46,4±46,4 72,0±29,0 0 (0 – 371,1) (24,8 – 264,0) 323,2±250,3 70,1±26,9 7,6±7,6 (0 – 2000,0) (13,2 – 251,7) (0 – 61,1) 278,5±278,5 102,5±59,9 0 (0 – 2228,3) (20,3 – 509,3) 56,9±21,6 0 0 (15,8 – 192,7) >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 91 4.2.7 Влияние фуллерена С60 на содержание небелковых тиолов печени Как следует из данных таблицы 18, какие-либо статистически достоверные различия между группами животных, получавших на протяжении 28 дней фуллерен С60, его носитель, и животными контрольной группы, по показателю пула небелковых тиолов печени отсутствуют. Это свидетельствует об отсутствии напряженности функционирования системы регуляции ред-окс потенциала в печени у животных, получавших фуллерен в обеих дозах. Таблица 18 Величина пула небелковых тиолов печени у крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель на протяжении 28 дней Содержание небелковых тиолов в Группы №№ Число крыс пересчёте на восстановленный глутатион, мкмоль/печень, M±m. 1 6 27,30±3,61 2 6 31,94±4,73 3 6 24,32±2,21 4 6 26,10±3,56 Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Достоверность* различия при сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность* различия при сравнении групп >0,05 гр. 2 >0,05 гр.3 >0,05 гр.4 >0,05 гр2-гр.3 >0,05 гр.2-гр.4 >0,05 гр.3-гр.4 >0,05 * - непараметрический критерий Манна-Уитни 92 4.2.8 Влияние фуллерена С60 на проницаемость кишечного барьера для ОВА Как следует из данных рисунка 11, определение показателя всасывания в кишке животных макромолекул куриного овальбумина показало достоверное снижение этого показателя во всех трёх опытных группах по сравнению с контрольной, в которой он хотя и был максимальным, но находился в пределах ,12 ,10 ,08 ,06 ,04 ,02 ,00 1 2 3 4 Рисунок 11. Проницаемость кишечного барьера для овальбумина у крыс опытных групп 1-4. Ось абсцисс - №№ групп; ось ординат - всасывание овальбумина в кровь через 3 часа, % от введенной дозы антигенного белка103, M±m. Численность групп – по 9 животных физиологической нормы для животных данного возраста. Таким образом, неблагоприятное воздействия фуллерена, вводимого в желудочно-кишечный тракт на протяжении 28 дней, на всасывание там макромолекул белка отсутствует, а наблюдаемое изменение, по-видимому, связано с эффектом применяемого носителя. 93 4.2.9 Влияние фуллерена С60 на экскрецию 8-oxo-G Как следует из данных, представленных на рисунке 12, введение фуллерена в дозах 1 и 10 мг/кг массы тела и его носителя на протяжении 28 дней в пределах разбросов экспериментальных данных не оказывает достоверного воздействия на экскрецию с 16-часовой мочой 8-oxoG. 0,900 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 1 2 3 4 Рисунок 12. Результаты определения экскреции 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина с 16-часовой мочой у крыс, получавших в течение 28 дней фуллерен С 60 и его носитель. Ось абсцисс - № групп; ось ординат - экскреция 8-oxo-G, нг/мг экскретируемого креатинина, M±m; Численность групп – по 8 животных. 4.3 Токсиколого-гигиеническая характеристика немодифицированного фуллерена С60 в эксперименте продолжительностью 92 дня 4.3.1 Влияние фуллерена С60 на интегральные показатели и на массу внутренних органов На протяжении всего 3-месячного эксперимента животные всех опытных групп имели нормальный внешний вид, какие-либо изменения в состоянии шерстяного покрова и поведения, выявлены не были; летальность среди животных отсутствовала. Как следует из данных рисунка 13, крысы контрольной 94 и всех опытных групп прибавляли в массе тела одинаково. По окончании периода кормления животных, каких либо различий между группами по показателю абсолютного прироста массы тела за всё время эксперимента выявлено не было (Таблица 19). Относительная масса внутренних органов крыс всех опытных групп находилась в пределах интервала нормальных значений и достоверно не отличалась от контроля (Таблица 20). Таким образом, 3-месячное внутрижелудочное введение фуллерена С60 во всех дозах не выявило признаков токсического действия по изученным интегральным показателям. Рисунок 13. Прирост массы тела крыс, получавших препараты фуллерена С60 или носителя, на протяжении 92 дней. Ось абсцисс – дни эксперимента, ось ординат – масса тела, г. 95 Таблица 19 Сравнение абсолютных приростов массы тела крыс групп 1-4, получавших фуллерен С60 и его носитель за 92 дня эксперимента Группы №№ Число крыс Прирост массы тела за 92 дня, г 1. Контроль 16 444,4±17,1 2.Контроль носителя 16 458,5±13,6 3.Фуллерен 0,1 мг/кг 15 436,8±14,2 4.Фуллерен 1,0 мг/кг 14 423,9±20,3 5.Фуллерен 10,0 мг/кг 15 430,9±13,4 Однородность распределения, группы 1-5, ANOVA, p Достоверность* различия при попарном сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность* различия при попарном сравнении групп Факторный анализ * - непараметрический критерий Манна-Уитни >0,05 гр.2 >0,05 гр.3 >0,05 гр.4 >0,05 гр.5 >0,05 гр2-гр.3 >0,05 гр.2-гр.4 >0,05 гр.2-гр.5 >0,05 Фуллерен С60 >0,05 Носитель >0,05 96 Таблица 20 Относительная масса внутренних органов крыс групп 1-5 на 92-ой день эксперимента (%) Относительная масса органов, % от массы тела (M±m) Группы Надпоче- Печень Селезенка Почки Гонады Сердце Тимус Лёгкие 1.Контроль 2,36±0,04 0,20±0,01 0,69±0,02 0,68±0,04 0,28±0,01 0,12±0,01 0,40±0,01 0,03±0,00 0,40±0,01 2.Контроль носителя 2,43±0,09 0,20±0,01 0,68±0,01 0,66±0,04 0,27±0,01 0,10±0,01 0,38±0,01 0,03±0,00 0,38±0,01 3.Фуллерен 0,1 мг/кг 2,59±0,10 0,21±0,01 0,70±0,02 0,73±0,03 0,26±0,01 0,10±0,01 0,41±0,01 0,03±0,00 0,39±0,01 4.Фуллерен 1,0 мг/кг 2,49±0,04 0,20±0,01 0,69±0,03 0,72±0,04 0,26±0,01 0,10±0,01 0,39±0,01 0,03±0,00 0,37±0,03 5.Фуллерен 10,0 мг/кг 2,52±0,06 0,20±0,01 0,66±0,02 0,70±0,02 0,26±0,01 0,10±0,01 0,40±0,02 0,03±0,00 0,38±0,01 Группы 1-5, ANOVA, p >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 чники Мозг Достоверность различия с группой 1 для групп 2-5 Достоверность различия с группой 2 для групп 3-5 97 4.3.2 Влияние фуллерена С60 на гематологические показатели Гематологические показатели, (количество эритроцитов, средний объем эритроцита, концентрация гемоглобина в крови и в отдельных эритроцитах) не отличались у животных групп 3 - 5, получавших различные дозы фуллерена от тех же показателей, которые выявлялись у контрольных животных и животных, получавших носитель (Таблица 21). Показатель гематокрита был достоверно (p<0,05), но незначительно по абсолютной величине (на 4%) повышен у животных группы 5 по сравнению с контрольными животными, но не с животными, получавшими носитель. Анализ лейкоцитарной формулы крови животных (Таблица 22) выявил достоверные изменения в уровне общих лейкоцитов (рост на 30% у животных группы 4 по сравнению с животными группы 1, p<0,05), лимфоцитов (рост на 10-11% у животных группы 3 по сравнению с животными групп 1 и 2, p<0,05) и нейтрофилов (снижение на 11-16% у животных групп 3-5 в сравнении с животными группы 1, p<0,05). Средний объём тромбоцита незначительно по абсолютной величине, но достоверно снижался в группе 4 в сравнении с контролем (Таблица 23). Все эти изменения, однако, не демонстрировали зависимость от дозы фуллерена С60 и не были достоверными по сравнению с таковыми у животных группы 2, получавшими носитель, то есть, возможно, имели неспецифический характер. Таким образом, какого-либо токсического действия фуллерена С60 на кровь животных опытных групп фактически не было выявлено. 98 Таблица 21 Средние (M±m) значения гематологических показателей, характеризующих состояние эритроцитов, у крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель на протяжении 92 дней Показатели, ед. изм. Группы Количество крыс Гемоглобин, г/л 1. Контроль 8 151,6±2,2 2.Контроль 10 154,1±1,6 носителя 3.Фуллерен 0,1 8 153,1±2,2 мг/кг 4.Фуллерен 1,0 8 152,6±1,5 мг/кг 5.Фуллерен 10,0 8 156,6±1,4 мг/кг Однородность распределения, >0,05 группы 1-5, ANOVA, p Достоверность* гр. 2 >0,05 различия при гр.3 >0,05 сравнении с гр.4 >0,05 группой 1, для гр. 5 >0,05 групп №№ Достоверность* гр.3 >0,05 различия при гр.4 >0,05 сравнении с группой 2, для гр. 5 >0,05 групп №№ Фуллерен >0,05 Факторный анализ Носитель >0,05 * – непараметрический критерий Манна-Уитни Общее количество эритроцитов, 106/мкл 8,43±0,13 Гематокрит, % Средний объем эритроцита, мкм3 Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах, пг 44,36±0,62 52,63±0,53 341,13±2,17 Средняя концентрация гемоглобина в эритроците,г/дл 17,98±0,13 8,40±0,13 45,80±0,62 54,50±0,52 336,60±1,73 18,35±0,20 8,55±0,14 45,29±0,80 53,00±0,80 338,50±1,65 17,93±0,24 8,34±0,09 45,15±0,57 54,13±0,44 338,25±1,99 18,30±0,19 8,70±0,10 46,30±0,35 53,25±0,56 338,50±1,05 18,00±0,21 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,009 >0,05 >0,05 0,026 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,049 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 99 Таблица 22 Средние (M±m) значения гематологических показателей, характеризующих состояние лейкоцитов, у крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель на протяжении 92 дней Показатели, ед. изм. Группы Количество крыс Общее количество лейкоцитов, 103 /мкл 7,64±0,46 1. Контроль 8 2.Контроль 10 8,02±0,91 носителя 3.Фуллерен 0,1 8 9,31±0,50 мг/кг 4.Фуллерен 1,0 8 9,96±0,84 мг/кг 5.Фуллерен 10,0 8 8,31±0,79 мг/кг Однородность распределения, >0,05 группы 1-5, ANOVA, p Достоверность* гр. 2 >0,05 различия при гр.3 0,016 сравнении с гр.4 0,035 группой 1, для гр. 5 >0,05 групп №№ Достоверность* 3 >0,05 различия при 4 >0,05 сравнении с группой 2, для 5 >0,05 групп №№ Фуллерен 0,05 Факторный анализ Носитель >0,05 * – непараметрический критерий Манна-Уитни Нейтрофилы % Эозинофилы % Базофилы % Лимфоциты % Моноциты % Незрелые клетки, % 26,04±1,68 2,89±0,34 0,275±0,108 57,89±1,85 12,91±1,03 0,813±0,159 25,39±1,64 3,47±0,30 0,250±0,067 58,91±1,73 11,50±0,78 1,070±0,236 21,65±0,97 3,31±0,43 0,225±0,045 64,24±1,44 11,11±0,52 0,713±0,130 22,85±0,69 2,75±0,23 0,263±0,060 61,85±1,20 12,29±1,01 0,763±0,148 22,85±0,69 2,86±0,15 0,263±0,063 58,24±2,67 12,83±1,12 0,650±0,102 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,027 0,027 0,027 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,027 >0,05 >0,05 0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,006 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 100 Таблица 23 Средние (M±m) значения гематологических показателей, характеризующих состояние тромбоцитов, у крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель на протяжении 92 дней Показатели, ед.изм. Группы Число крыс 1. Контроль 7 2.Контроль носителя 9 3.Фуллерен 0,1 мг/кг 9 4.Фуллерен 1,0 мг/кг 8 5.Фуллерен 10,0 мг/кг 8 Однородность распределения, группы 1-5, ANOVA, p гр. 2 Достоверность* гр. 3 различия при сравнении с группой 1, гр. 4 для групп №№ гр. 5 Достоверность* гр. 3 различия при гр. 4 сравнении с группой 2, гр. 5 для групп №№ Фуллерен Факторный анализ, ANOVA, р, по фактору: Носитель *- непараметрический критерий Манна-Уитни Общее количество тромбоцитов, 109 дм-3 Средний объем тромбоцита, мкм3 754,6±26,6 737,7±19,5 764,4±25,3 717,1±18,8 726,3±26,5 6,71±0,08 6,58±0,06 6,65±0,07 6,45±0,14 6,46±0,14 Относительный объём тромбоцитов в цельной крови, % 0,507±0,019 0,485±0,014 0,508±0,014 0,463±0,017 0,469±0,015 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,044 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 101 4.3.3 Влияние фуллерена С60 на показатели, характеризующие иммунный статус и содержание цитокинов в сыворотке крови С данными гематологических показателей согласуется отсутствие изменений в количестве субпопуляций лимфоцитов (CD45RA+ и CD161a+, доли CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в общем числе Т-лимфоцитов, соотношение CD4/CD8). Единственным выявленным эффектом было снижение доли Т-лимфоцитов (CD3+) с 49,55±3,03% у животных группы 1 до 40,13±2,90% у животных группы 5 (p<0,05). Однако эти изменения были, возможно, неспецифическими, так как не выявлялись при сравнении животных группы 5 и группы 2 (p>0,05). Уровни цитокинов IL-6, IL-10 и TNF-α в сыворотках крови животных групп 3-5 (таблица 24) достоверно не отличались от контроля. В группе 4 (доза фуллерена 1 мг/кг массы тела) имелась недостоверная тенденция к снижению продукции цитокина IL-6 по сравнению с животными, получавшими носитель (группа 2). Поскольку, как известно, IL-6 является одним из основных медиаторов острой фазы воспаления, понижение его уровня, по-видимому, не может рассматриваться как признак токсического действия НЧ на организм животных. 102 Таблица 26 Средние значения (M±m) и интервалы изменения уровней исследованных цитокинов в сыворотке крови крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель на протяжении 92 дней Группы Количество крыс 1. Контроль 8 2.Контроль носителя 8 3.Фуллерен 0,1 мг/кг 8 0 4.Фуллерен 1,0 мг/кг 8 0 5.Фуллерен 10,0 мг/кг 8 0 Критерий Краскала и Уоллиса, группы 1-5 Достоверность* различия при попарном сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность* различия при попарном сравнении с группой 2, для групп №№ гр. 2 гр. 3 гр. 4 гр. 5 гр. 3 гр. 4 гр. 5 TNF-α, pg/ml 0,9±0,9 (0 – 7,3) 0,7±0,7 (0 – 5,4) Показатели, ед. изм. IL-10, IL-6, pg/ml pg/ml 57,0±26,8 13,4±5,9 (0 – 154,7) (0 – 52,7) 52,5±28,1 16,1±5,0 (0 – 195,1) (0 – 41,3) 11,0±5,1 15,7±4,5 (0 – 29,1) (0 – 37,5) 48,3±24,4 7,5±2,4 (0,8 – 172,7) (0 – 20,0) 78,9±37,2 13,9±5,9 (0 – 291,2) (0 – 45,5) >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 * - непараметрический критерий Манна-Уитни 4.3.4 Влияние фуллерена С60 на биохимические показатели крови Анализ биохимических показателей сыворотки крови животных, приведенных в таблице 27, свидетельствует об отсутствии дозо-зависимых изменений у крыс, длительно получавших фуллерен С60. Активность ферментов АЛТ и АСТ у животных групп 3 и 4 остается в пределах тех колебаний, которые характерны для контрольных животных (группа 1), а у животных группы 5 оказываются даже несколько ниже, чем у контрольных. Это указывает на отсутствие токсического действия фуллерена С60 на печень. Небольшое и не являющееся дозо-зависимым повышение концентрации глюкозы в крови у животных групп 3-5 по сравнению с таковой у животных группы 2, получавших носитель, находится, тем не менее, в пределах вариабельности нормы (группа 1) и 103 не свидетельствует об ухудшении толерантности к глюкозе под действием фуллерена С60. При наиболее высокой из доз у животных в группе 5 отмечаются незначительные сдвиги в показателях азотистого обмена (рост уровня мочевины и снижение мочевой кислоты) по сравнению с контролем, однако эти изменения невелики по абсолютной величине (около 20%) и не показывают четкой зависимости от дозы вводимого фуллерена С60. Остальные приведенные в таблице показатели азотистого обмена и активность ЩФ на фоне приёма фуллерена С 60 не претерпевают каких-либо изменений. 4.3.5 Влияние фуллерена С60 на содержание цитохромов Р-450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков Введение фуллерена С60 животным не оказывало влияния на уровень содержания в печени цитохромов Р-450 и b5, а также на активность UDPглюкуронозилтрансферазы (Таблица 28). В то же время активность глутатион-Sтрансферазы была повышена на 26-28% у животных группы 4 по сравнению с животными групп 1 и 2. При более высокой дозе фуллерена С 60 (группа 5) данный эффект не выявлялся. Активность изоформы Р-450 CYP 1A2 была также одинаковой у животных опытных и контрольной групп. Можно предположить, что ранее выявленный эффект воздействия фуллерена С60 на этот фермент при 28дневном введении фуллерена С60 является нестойким. Однако активность изоформы Р-450 CYP 2B1 была достоверно повышена у животных в группах 4 и 5 по сравнению с животными групп 1 и 2. При этом повышение составляло только 21-35% по абсолютной величине и свидетельствовало о физиологической активации системы детоксикации в условиях длительного поступления фуллерена С60 в организм, что, по-видимому, нельзя рассматривать как признак токсического действия. 104 Таблица 27 Средние (M±m) значения биохимических показателей сыворотки крови у крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель в течение 92 дней Группы КоличеАЛТ, ед/л ство крыс АСТ, ед/л 1. Контроль 6 41,7±2,9 148,4±13,7 2.Контроль 6 38,4±1,3 147,3±10,0 носителя 3.Фуллерен 0,1 6 42,5±2,9 140,3±12,6 мг/кг 4.Фуллерен 1,0 6 44,6±2,0 133,4±8,8 мг/кг 5.Фуллерен 10,0 6 37,5±1,9 128,6±9,1 мг/кг Однородность распределения, группы 1-5, >0,05 >0,05 ANOVA, p Достоверность* 2 >0,05 >0,05 различия при 3 >0,05 >0,05 сравнении с 4 >0,05 >0,05 группой 1, для 5 >0,05 >0,05 групп №№ Достоверность* 3 >0,05 >0,05 различия при 4 >0,05 0,016 сравнении с группой 2, для 5 >0,05 >0,05 групп №№ Фулле>0,05 >0,05 Факторный рен анализ Носитель >0,05 >0,05 * – непараметрический критерий Манна-Уитни Альбумин, г/л 34,5±0,8 Показатели (M±m), ед. изм. Белок Глюкоза, Креатинин, общий, г/л ммоль/л мкмоль/л 64,2±2,4 6,19±0,31 44,6±0,6 Моч. к-та, мкмоль/л 91,3±5,8 Мочевина мкмоль/л 5,05±0,26 ЩФ, ед/л 66,4±2,9 34,7±0,3 63,6±0,6 5,28±0,26 46,0±0,9 88,6±7,1 4,96±0,24 60,5±4,4 34,5±0,4 62,5±1,1 6,14±0,22 45,3±1,2 74,8±5,8 5,63±0,28 69,0±6,9 34,3±0,7 63,8±0,9 6,22±0,22 45,9±1,0 77,4±4,2 5,54±0,34 71,3±4,3 34,7±0,5 65,4±1,6 5,99±0,21 46,0±1,4 75,2±2,1 5,98±0,66 62,2±4,4 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,037 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,016 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,025 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,037 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,005 0,046 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 105 Таблица 28 Среднее (M±m) содержание цитохромов Р-450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков у крыс, получавших фуллерен С60 или его носитель в течение 92 дней Группы Количество крыс 1. Контроль 2.Контроль носителя 3.Фуллерен 0,1 мг/кг 4.Фуллерен 1,0 мг/кг 5.Фуллерен 10,0 мг/кг Группы 1-5, ANOVA, p 6 6 6 6 6 Достоверность* различия при сравнении с группой 1, для групп №№ 2 3 4 5 3 4 5 Достоверность* различия при сравнении с группой 2, для групп №№ Факторный анализ (ANOVA) Показатели (M±m), ед. изм. Активность Активность Глутатион-SСYР 1А2, CYP2B1 трансфераза, нмоль/мин*мг нмоль/мин*мг мкмоль/мин*мг белка белка белка 39,26±3,49 8,37±0,40 0,925±0,043 52,48±7,20 7,64±0,41 0,935±0,023 55,91±7,77 8,73±0,56 0,975±0,045 47,04±5,79 10,35±0,45 1,198±0,127 49,38±2,51 10,12±0,31 0,975±0,019 >0,05 0,001 0,025 Цитохром Р-450, нмоль/мг белка 0,635±0,037 0,675±0,022 0,701±0,027 0,676±0,033 0,720±0,062 >0,05 Цитохром b5, нмоль/мг белка 0,550±0,016 0,602±0,030 0,566±0,022 0,596±0,031 0,580±0,038 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,025 0,006 >0,05 0,004 0,004 >0,05 >0,05 0,028 >0,05 >0,05 0,006 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,001 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 C60 >0,05 Носитель >0,05 *- непараметрический критерий Манна-Уитни UDPГлюкуронозилтрансфераза нмоль/мин*мг белка 13,63±0,99 12,92±1,02 13,26±1,37 14,12±0,93 14,58±2,12 >0,05 106 4.3.6 Влияние фуллерена С60 на состояние системы антиоксидантной защиты и значения показателей ПОЛ Показатели ПОЛ и состояния системы антиоксидантной защиты, определенные в эритроцитах и плазме крови животных (Таблица 29), свидетельствуют об отсутствии каких-либо неблагоприятных эффектов при введении животным фуллерена C60. Содержание диеновых конъюгатов ПНЖК достоверно не различается у животных различных групп, а уровень малонового диальдегида у животных, получавших высокие дозы фуллерена С60 (группы 4 и 5), даже имеет тенденцию к снижению, по сравнению с контрольными животными. Однако данный эффект, по-видимому, является неспецифическим для фуллерена С60, т.к. он проявляется также и у животных группы 2, получавшей носитель (факторный анализ по наличию носителя даёт значение p<0,05 в тесте ANOVA). Это же, скорее всего, имеет место и в случае эффекта повышения активности глутатионредуктазы у крыс, получавших фуллерен С60 и носитель (2 группа животных). Следует отметить, что возрастание активности этого фермента под действием фуллерена С60 было выявлено также у животных, получавших препарат в течение 28 дней. Что же касается других ферментов антиоксидантной защиты - глутатионпероксидазы, супероксидисмутазы, каталазы, то их активность в условиях введения фуллерена С60 не претерпевает каких-либо изменений. 107 Таблица 29 Средние (M±m) значения показателей перекисного окисления липидов и активность антиоксидантной системы в плазме крови и эритроцитах крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель в течение 92 дней Группы 1. Контроль 2. Контроль носителя 3. C60 0,1 мг/кг 4. C60 1,0 мг/кг 5. C60 10,0 мг/кг Группы 1-5, ANOVA, p Достоверность* различия при сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность* различия при сравнении с группой 2, для групп №№ Факторный анализ Количество крыс 6 6 6 6 6 2 3 4 5 3 4 5 Содержание диеновых коньюгатов ПНЖК в плазме, нмоль/мл 3,33±0,38 2,91±0,17 3,42±0,35 2,85±0,10 3,28±0,39 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 C60 >0,05 Носитель >0,05 * - непараметрический критерий Манна-Уитни Содержание малонового диальдегида в плазме, нмоль/мл Показатели (M±m), ед. изм. Активность Активность глютатионперо- глютатионредукксидазы эритр., тазы эритр., мкмоль/мин мл мкмоль/мин мл эр эр Активность супероксиддисмутазы эритр., усл.ед./ мл эр Активность каталазы эритр., кU/ мл эр 6,44±0,79 4,52±0,40 6,26±0,72 4,43±0,53 4,87±0,32 0,046 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 25,22±3,33 27,43±4,91 28,15±5,63 32,23±4,61 25,18±4,01 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 1,82±0,07 2,19±0,13 2,31±0,14 2,31±0,31 2,50±0,27 >0,05 0,019 0,019 >0,05 0,012 >0,05 >0,05 >0,05 1670,7±66,3 1648,7±35,7 1708,8±55,6 1755,0±40,6 1650,7±52,7 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 264,0±24,3 335,2±40,6 379,2±73,0 268,5±35,4 279,2±56,0 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,047 >0,05 >0,05 >0,05 0,03 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 108 4.3.7 Влияние фуллерена С60 на содержание небелковых тиолов печени Содержание в печени крыс небелковых тиолов, представленных, в основном, восстановленным глутатионом представлено в таблице 30. Единственная тенденция, состоящая в некотором снижении этого показателя у животных в группе 4, оказывалось недостоверной (p>0,05) при сравнении с тем же показателем, который обнаруживается у животных групп 1 и 2. Таким образом, фуллерен С60, по-видимому, не влияет при длительном приёме на этот важный показатель тканевого окислительно-восстановительного гомеостаза. Таблица 30 Величина пула небелковых тиолов печени у крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель на протяжении 92 дней Содержание небелковых Группы №№ Число крыс тиолов в пересчёте на восстановленный глутатион, мкмоль/печень, M±m. 1. Контроль 6 2.Контроль носителя 6 3.Фуллерен 0,1 мг/кг 6 4.Фуллерен 1,0 мг/кг 6 5.Фуллерен 10,0 мг/кг 5 Однородность распределения, группы 1-5, ANOVA, p Критерий Краскала и Уоллиса, группы 1-5 гр. 2 Достоверность* различия при гр.3 сравнении с группой 1, для групп гр.4 №№ гр. 5 гр2-гр.3 гр.2-гр.4 гр.2-гр.5 Достоверность* различия при сравнении групп гр.3-гр.4 гр.3-гр.5 гр.4-гр.5 Фуллерен Факторный анализ Носитель * - непараметрический критерий Манна-Уитни 70,73±6,92 61,90±4,14 69,55±6,73 53,35±4,51 64,37±7,75 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 109 4.3.8 Влияние фуллерена С60 на проницаемость кишки для ОВА Что касается величины всасывания в желудочно-кишечном тракте антигенного ОВА куриного яйца, определяемая по его концентрации в сыворотке крови, то она была достоверно повышена у животных группы 5 по сравнению с животными группы 2 (Рисунок 14). Все остальные различия были недостоверны. Таким образом, фуллерен С60 способен, по-видимому, оказывать определённое влияние на степень всасываемости в кишечнике макромолекул белка только при наибольшей из изученных нами доз (10 мг/кг). В 28-дневном исследовании Всасывание ОВА,% от введенной дозы, 103 введение фуллерена С60 в такой дозе не оказывало влияние на данный показатель. 0,14 * 0,12 0,1 0,08 * 0,06 0,04 0,02 0 1 2 3 4 5 Группы Рисунок 14. Всасывание в кишке антигенного ОВА у крыс, получавших фуллерен С60 и его носитель на протяжении 92 дней. Ось абсцисс - №№ групп; ось ординат всасывание овальбумина в кровь через 3 часа, % от введенной дозы антигенного белка103, M±m. Численность групп – по 9 животных 110 4.3.9 Влияние фуллерена С60 на экскрецию 8-oxo-G В таблице 31 приведены результаты определения экскреции 8-oxo-G у крыс, получавших фуллерен С60 на протяжении 92 дней. Как видно из представленных данных, достоверных различий с контролем для показателя в группах животных, получавших фуллерен (с 3-ю по 5-ю), не наблюдается. Различие с животными группы 2, получавшей носитель, оказывается на уровне тенденции (p>0,05). Таким образом, при введении в желудок крыс фуллерена С60 в течение периода времени до 92 дней не отмечается усиления окислительного повреждения ДНК ни при одной из доз. Таблица 31 Средние (M±m) относительные значения удельной экскреции 8-гидрокси-2дезоксигуанозина с 16-часовой мочой у крыс, получавших в течение 92 дней фуллерен С60 и его носитель Группы Количество крыс Экскреция 8-oxo-G, нг/мг экскретируемого креатинина 1. Контроль 2. Контроль носителя 3. Фуллерен 0,1 мг/кг 4. Фуллерен 1,0 мг/кг 5. Фуллерен 10,0 мг/кг 5 5 5 5 5 0,205±0,091 0,096±0,084 0,281±0,138 0,224±0,102 0,245±0,042 Однородность распределения, группы 1-5, ANOVA, p >0,05 Критерий Краскала и Уоллиса, группы 1-5 >0,05 гр.2 Достоверность* различия гр.3 при сравнении с группой 1, гр.4 для групп №№ гр.5 гр.3 Достоверность* различия при сравнении с группой 2, гр.4 для групп №№ гр.5 Фуллерен Факторный анализ Носитель * – непараметрический критерий Манна-Уитни >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 111 4.3.10 Влияние фуллерена С60 на содержание селена в организме крыс В таблице 32 приведены данные о содержании селена в органах и тканях крыс, получавших фуллерен С60 на протяжении 92 дней. Они свидетельствуют о выраженном, дозозависимом потенцировании накопления этого микроэлемента в мозгу крыс под воздействием приёма фуллерена С60. Поскольку применяемый препарат фуллерена С60 и носителя не являются источниками селена сами по себе, можно предположить, что механизм данного явления состоит в воздействии фуллерена на проницаемость гематоэнцефалического барьера для производных селена, таких как селеноводород и селеносодержащие аминокислоты, в норме присутствующие в организме у животных, нормально обеспеченных эим микроэлементовм в составе диеты. Необходимо отметить, что выявленный эффект нет оснований интерпретировать как неблагоприятный (токсический) с учетом роли соединений селена как антиоксидантов непрямого действия. Таблица 32 Содержание селена в органах и тканях крыс групп 1-5 на 92-ой день эксперимента Группы Количество крыс 1. Контроль 10 2.Контроль носителя 10 3.C60 0,1 мг/кг 9 4.C60 1,0 мг/кг 8 5.C60 10,0 мг/кг 9 Однородность распределения, группы 1-5, ANOVA, p Достоверность* различия при 2 сравнении с группой 1, для 3 групп №№ 4 5 Достоверность* различия при 3 сравнении с группой 2, для 4 групп №№ 5 C60 Факторный анализ Носитель * - непараметрический критерий Манна-Уитни Показатели (M±m), ед. изм. Кровь, Мозг, Печень, мкг/кг сырой мкг/кг сырой мкг/кг сырой массы массы массы 130,8±6,3 329,4±7,7 1025,9±28,9 165,8±9,2 324,1±7,3 945,4±20,6 165,0±9,0 442,1±7,5 975,7±14,5 165,4±14,0 473,5±6,3 1084,0±26,8 171,3±10,2 535,9±7,1 1113,6±23,2 >0,05 <0,001 0,001 0,021 0,009 >0,05 0,017 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,003 >0,05 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,028 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,003 <0,001 0,009 >0,05 112 4.3.11 Изучение биомаркеров токсического действия фуллерена С60 методом конфокальной флуоресцентной микроскопии На рисунке 15 приведены флуоресцентные микрофотографии срезов печени и подвздошной кишки контрольных животных (группа 1), совместно окрашенные DAPI, маркирующем ядра клеток [96], антителами к клаудину-1 и фаллоидином. Красно-оранжевая флуоресценция образцов с максимумом возбуждения при λ=562 нм, а эмиссии – при λ=583 нм маркировала связывание фаллоидина с Fактином, что позволяло, в частности, локализовать скопление актиновых филаментов цитоскелета клеток [67, 85]. При этом по более яркому, по сравнению с гепатоцитами свечению в канале флуоресценции данного индикатора могли быть предположительно выявлены немногочисленные в сравнении с гепатоцитами печеночные резидентные макрофаги – клетки Купфера (Рисунок 15а,б). Антитела к клаудину-1 (зеленая флуоресценция) маркировали данный белок, функция которого состоит в блокировании парацеллюлярной проницаемости межклеточных плотных контактов (tight junction) [179]. На представленных препаратах (Рисунок 15а,б), в печени крысы антитела к клаудину-1 выявляли плотные контакты между гепатоцитами, отграничивающими желчные канальцы. На флуоресцентных микрофотографиях срезов стенки подвздошной кишки контрольных животных (Рисунок 15в) видно, что клаудин-1 был локализован исключительно в плотных соединениях, запирающих барьер между энтероцитами. Другой вариант обработки микропрепаратов включал окрашивание DAPI, антителами к CD106 (зеленая флуоресценция) и антителами к CD31 (красная флуоресценция). Поскольку спектр эмиссии метки антител к CD106 частично перекрывался со спектром флуоресцирующих антител к клаудину, одновременно оба эти индикаторов на одном препарате не применяли. 113 а г С б пк д Ж # в е я # в пк г Рисунок 15. КФМ препаратов от крысы контрольной группы (№1): а,б – печень, в-е – подвздошная кишка. Окраска DAPI (синий), фаллоидином (красный) и АТ к клаудину (голубой) (а-в); DAPI, АТ к CD31 (красный) и АТ к CD106 (голубой) (г-е). Увеличение ×400 (а,г-е); ×1000 (б,в). Обозначения: я – ядра; пк – плотные контакты, ж- желчные канальцы, в – ворсинка, г – гладкомышечный слой, с- сосуд, *- резидентные печеночные макрофаги (клетки Купфера), # флуоресцирующие клетки с зернистостью, экспрессирующие CD31 (предположительно нейтрофилы). 114 Как показали данные исследования (Рисунок 15г-е), антитела к CD106 на препаратах подвздошной кишки контрольных животных не дали окраски (редкое исключение – сосуд в стенке кишечника, рисунок 15г). Антитела к CD31 помимо контактов между клетками эндотелия (Рисунок 15е) окрашивали гладкомышечные клетки в стенках крупных сосудов, а также зернистые клетки неправильной формы в области собственной пластинки ворсинок кишечника, предположительно нейтрофилы (Рисунок 15д,е). Наибольшее количество этих клеток было сосредоточено вблизи крипт, но они встречались и в соединительной ткани по всей длине ворсинки. При окраске срезов печени контрольных животных антителами к CD106 (Рисунок 16а) у небольшого числа клеток обнаруживался повышенный уровень флуоресценции в цитоплазме. Такие клетки выявлялись в небольшом числе преимущественно в центральной части долек, в первом ряду вблизи центральных вен и крупных сосудов. При этом они располагались преимущественно поодиночке и не образовывали скоплений. Среди клеток с повышенным уровнем флуоресценции большинство составляли клетки с вытянутым или неровным ядром, морфологически сходные с клетками Купфера. Животные опытных групп Как показали результаты КФМ в препаратах печени подвздошной кишки от крыс группы 2, их морфологическая картина практически не отличалась от препаратов животных 1-ой, контрольной группы (данные не показаны). 115 б а * * в г * * Рисунок 16. Сравнение КФМ срезов печени крыс группы 1 (а) и групп 2-4 (б-г, соответственно), окрашенных АТ к CD106. Положение CD106+ клеток, морфологически сходных с Купферовскими макрофагами, отмечено *. Увеличение ×400 116 При проведении окрашивания комплексом DAPI+фаллоидин+ антитела к клаудину 1 (Рисунок 17а,б) распределение клаудина-1 в печени животных групп 3 и 4 не изменилось, то есть целостность межклеточных контактов желчных протоков не была нарушена. В то же время в печени животных этих групп возрастало количество клеток с повышенным содержанием актина, с вытянутым или неровным ядром, предположительно, являющихся клетками Купфера – резидентными печеночными макрофагами. При окраске срезов печени антителами к CD106 в препаратах животных опытных групп, так же, как и в контроле, наблюдались клетки с повышенной флуоресценцией в цитоплазме (Рисунок 16б-г). По мере увеличения дозы фуллерена, количество таких клеток возрастало. Общее число клеток с повышенным уровнем флуоресценции изменялось, как указано в таблице 33. Таблица 33 Оценка содержания экспрессирующих CD106 клеток в паренхиме печени крыс контрольной и опытных групп Группа 1 Доза Проанализированная Общее число Число клеток в фуллерена площадь срезов, мм2 клеток расчёте на 1 мм2 22,5 878 39 Контроль (носитель) 2 0,1 мг/кг 4,0 206 51 3 1 мг/кг 5,5 802 146 4 10 мг/кг 4,0 517 130 В группах 3 и 4 скопления CD106+ клеток вблизи центральных вен становились массивными; клетки чаще располагались в несколько рядов вблизи центральных вен. В других областях они были разбросаны поодиночке или образовывали скопления из 2-5 клеток. Как показано на рисунке 17 (в,г), при одновременном анализе участка образца в режиме конфокальной микроскопии и в проходящем свете с использованием дифференциального интерференционного контраста в цитоплазме почти всех таких клеток встречались контрастные гранулы. Наличие клеток с гранулами на микропрепаратах печени крыс опытных групп 3 и 4 было подтверждено также методом светооптической микроскопии с 117 б а я пк ж в Км г 1 2 1 2 3 3 кс д * Рисунок 17. КФМ печени крысы группы № 4 (фуллерен, 10 мг/кг): а,б – окраска DAPI, фаллоидином и АТ к клаудину; в – окраска АТ к CD106; г – тот же участок препарата при дифференциальном интерференционном контрасте в проходящем свете, д – окраска гематоксилин-эозином. Обозначения: я – ядра, пк – плотные контакты, Км- клетки Купфера, 1,2,3,* – CD106+ клетки, морфологически сходные с Купферовскими макрофагами. Увеличение ×400 (а), ×1000 (б-д). 118 с использованием окраски гематоксилин-эозином (Рисунок 17д). Чтобы исключить вероятность того, что свечение в зеленом канале является автофлуоресценцией липофусцина, было проведено спектрометрическое исследование. Анализ спектров эмиссии сильно- и слабофлуоресцирующих клеток печени при длине волны возбуждения 488 нм выявил идентичность этих спектров по форме и положению максимума эмиссии (540 нм), что соответствует красителю Alexa488, с которым конъюгированы антитела к CD106. Этот результат позволяет сделать вывод о специфичности окраски к маркеру воспаления CD106 и об отсутствии в значимой степени эффекта автофлуоресценции. Результаты исследования подвздошной кишки животных групп 3 и 4 представлены на рисунке DAPI+фаллоидин+клаудин-1 18 и 2) при двух способах DAPI+CD31+CD106. окраски: Как следует 1) из полученных данных (Рисунок 18а,б), антитела к клаудину-1 окрашивали во всех препаратах плотные контакты между клетками кишечного эпителия, причем каких-либо различий в распределении и интенсивности окрашивания между животными контрольной (Рисунок 15в) и опытных (Рисунок 18а) групп выявлено не было, что свидетельствовало об отсутствии изменений в состоянии плотных контактов энтероцитов под воздействием нано- и микрочастиц фуллерена С60. Окрашивание фаллоидином, маркирующим в клетке актиновые микрофиламенты, выявило их ортодоксальное распределение преимущественно в области щеточной каёмки энтероцитов, а также в миоцитах мышечной оболочки кишки. Этот результат свидетельствовал об отсутствии выраженных эффектов фуллерена в отношении цитоскелета клеток кишечного эпителия. Окраска на CD106 на микропрепаратах кишки крыс групп 3 и 4, как правило, не выявлялась. При этом антитела к CD31 маркировали, так же, как и у контрольных животных, экспрессию этого антигена на клетках неправильной формы, обладающих выраженной зернистостью (Рисунок 18в-д) локализованных в соединительной ткани ворсинок и стенки кишечника (Рисунок и 119 а б б к пс бк пс я щ в д г е ж Рисунок 18. Микрофотографии стенки подвздошной кишки крыс опытных групп: а- крыса группы 3, аксиальный срез, б- крыса группы 4, латеральный срез, КФМ с окраской DAPI, фаллоидином и АТ к клаудину; в,г,д – CD31+ клетки в стенке кишки при дифференциальном интерференционном контрасте в проходящем свете, КФМ и наложении двух этих изображений, соответственно; е-ж КФМ среза стенки кишки крыс групп 3 и 4 соответственно при окраске DAPI, АТ к CD31 и АТ к CD106. Увеличение ×1000 (а-д), ×400 (е,ж). 120 18е,ж). Окраска на CD106 на микропрепаратах кишки крыс групп 3 и 4, как правило, не выявлялась. При этом антитела к CD31 маркировали, так же, как и у контрольных животных, экспрессию этого антигена на клетках неправильной формы, обладающих выраженной зернистостью (Рисунок 18в-д) и локализованных в соединительной ткани ворсинок и стенки кишечника (Рисунок 18е,ж). Полуколичественный анализ содержания этих клеток (Таблица 34) выявил только тенденцию в снижении их численности в группе № 4 в сравнении с животными группы 1. Морфологически CD31+ клетки в слизистой оболочке подвздошной кишки проявляли сходство с нейтрофилами. Таблица 34 Оценка содержания экспрессирующих CD31 клеток в подвздошной кишке крыс контрольной и опытных групп Группа Число крыс Число клеток в расчёте на 1 мм2 среза , M±m 3 Доза фуллерена контроль (носитель) 0,1 мг/кг 1 6 2 3 3 1 мг/кг 220±117 316±126 275±66 4 3 10 мг/кг 156±35* *Различие с группой 1 на уровне тенденции, P=0,1, критерий Стьюдента 4.4 Изучение биораспределения фуллерена С60 по органам и тканям в токсикологических экспериментах Для изучения биораспределения и накопления фуллерена С60 в органах и тканях опытных животных были исследованы печень, почки, головной мозг, селезенка и жировая ткань, выделенная из брюшной полости. В двух экспериментах с ежедневным внутрижелудочным введением фуллерена С60 продолжительностью 28 дней (в дозах 1 и 10 мг/кг массы тела крысы) и 92 дня (в дозах 0,1, 1,0 и 10 мг/кг массы тела крысы) было проанализировано с использованием метода ВЭЖХ 385 проб биологического материала. Из полученных данных можно отметить, что фуллерен С60 был обнаружен после внутрижелудочного введения животным на протяжении 28 дней в почке одной крысы, получавшей его в концентрации 10 мг/кг массы тела, из 30 крыс 121 получавших фуллерен С60 в изученных дозах. Количество фуллерена С60 обнаруженное в 1 мл гомогената составило 300 нг и, исходя из объема гомогената к массе почки, содержание в данном органе составило около 450 нг. В остальных исследованных органах животных, полученных из обоих экспериментов, в пределах чувствительности метода неизменённый фуллерен С60 выявлен не был, как на протяжении 28, так и 92-х дней. С учётом негативного по существу характера результатов, полученных в подострых экспериментах, нами была предпринята дополнительная попытка выявления бионакопления и бираспределения фуллерена С60 по органам и тканям крыс при его введении в изолированную петлю кишки в остром опыте. Условия эксперимента соответствовали очень значительной аггравации, как дозы фуллерена, так и его локальной концентрации в просвете кишки. При этом в ходе оперативного вмешательства микроциркуляция в сосудах брыжейки и иннервация кишечной стенки не были нарушены, что даёт основание предполагать, что физиологический характер кишечного всасывания при этом сохранялся. Однако и в этих условиях, исследование 36 образцов печени, селезенки и почек животных показало отсутствие фуллерена С60 во всех случаях в пределах чувствительности применяемого метода. Характерно, что на фоне полного кажущегося отсутствия фуллерена во внутренних органах в условиях острого введения, в данном эксперименте отмечается выраженное антиоксидантное действие, стоящее в достоверно снижении концентрации малонового диальдегиа в плазме крови крыс, которым внутрикишечно вводили фуллерен, в сравнении с контрольными животными (таблица 35). Практически полное отсутствие накопления фуллерена С60 во внутренних органах, несмотря на значительную липофильность этого соединения и его выраженное влияние на ряд изучаемых показателей, как при 28-, так и при 92дневном введении, представляет собой проблему, не нашедшую разрешения в рамках проведённых токсикологических экспериментов. Кажущееся отсутствие фуллерена во внутренней среде организма, даже при его введении в высокой дозе, 122 Таблица 35 Средние (M±m) значения показателей ПОЛ и активность антиоксидантной системы в плазме крови и эритроцитах крыс, после острого введения фуллерена С60 в изолированную петлю тонкой кишки Показатели, ед.изм. Группы №№ Содержание диеновых Число крыс коньюгатов ПНЖК в плазме, нмоль/мл Содержание малонового диальдегида в плазме, нмоль/мл 1 4 2,82±0,08 3,85±0,10 (контроль, вода) 2 (контроль, 4 3,12±0,12 3,76±0,20 носитель) 3 (фуллерен С60 в 4 2,92±0,23 3,06±0,24 носителе) Однородность распределения, группы >0,05 0,031 1-4, ANOVA, p Достоверность* гр. 2 >0,05 >0,05 различия при сравнении с гр.3 >0,05 0,029 группой 1, для групп №№ * - непараметрический критерий Манна-Уитни Активность глютатионпероксидазы эритр.,мкмоль/мин мл эр Активность глютатионредуктазы эритр.,мкмоль/мин мл эр Активность супероксиддисмутазы эритр.,усл.ед./ мл эр Активность каталазы эритр.,кU/ мл эр 20,8±0,87 2,66±0,21 1187±25 309,0±51,6 20,7±1,50 2,48±0,22 1281±96 369,8±36,4 20,1±0,43 3,25±0,43 1165±34 290,3±24,4 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 123 возможно связано с его биотрансформацией, приводящей к образованию его гидрофилизованных производных, не экстрагируемых толуолом в условиях эксперимента или значительно отличающихся от него по времени удержания на колонке при анализе на ВЭЖХ. Изучению этой возможности будет посвящен один из следующих разделов работы. 4.5 Токсиколого-гигиеническая характеристика фуллеренола С60(ОН)24 в эксперименте продолжительностью 28 дней 4.5.1 Влияние фуллеренола на интегральные показатели и на массу внутренних органов На протяжении всего эксперимента животные всех групп развивались равномерно, поведение, внешний вид, двигательная активность, потребление корма и состояние шерстяного покрова у крыс опытных групп не имели различий с животными контрольной группы. Летальность отсутствовала. Масса тела на протяжении всего эксперимента (Таблица 36) и абсолютные и относительные значения приростов массы тела за 28 дней (Таблица 37) у крыс, получавших фуллеренол, (группы 2, 3, 4), статистически достоверно не различались (критерий ANOVA, p>0,05) от аналогичных значений у крыс контрольной группы. Различий в абсолютных массах органов крыс (Таблица 38), а также в отношении массы органов к массе тела у животных всех групп на 29 день эксперимента выявлено не было, за исключением массы надпочечников у животных группы 4, где этот показатель по абсолютной величине был достоверно выше на 12,5% (непараметрический критерий Манна-Уитни, р=0,04) в сравнении со значениями у контрольных животных. 124 Таблица 36 Масса тела (M±m) крыс групп 1-4 и динамика её изменения (в абсолютном и относительном выражении) с 1 по 29 день эксперимента Дни эксперимента 8 15 22 29 Прирост за Прирост за Прирост за Прирост за неделю неделю неделю неделю Масса, г Масса, г Масса, г Масса, г Масса, г г % г % г % г % 121,4±2,7 182,8±4,9 61,4±4,8 51,3±4,6 227,0±5,1 44,2±4,5 25,0±3,1 250,5±6,7 49,8±5,2 22,3±2,4 296,1±8,8 21,3±5,8 8,1±2,2 1 Группы 1. Контроль 2. Фуллеренол 124,2±3,9 185,7±6,0 61,5±7,1 51,6±6,7 231,5±6,4 45,7±8,3 26,4±5,5 252,1±3,6 50,0±6,1 22,3±3,1 300,5±4,4 22,9±9,8 9,0±3,7 0,1 мг/кг 3. Фуллеренол 122,2±2,4 181,6±5,2 59,4±4,2 48,7±3,7 224,2±6,7 42,6±6,8 24,4±4,4 262,5±5,0 41,5±4,7 18,8±2,1 301,7±7,6 19,2±8,3 7,8±3,1 1 мг/кг 4. Фуллеренол 122,7±2,2 188,1±3,6 65,4±3,5 53,8±3,3 235,4±4,2 47,3±3,3 25,4±2,0 252,5±5,3 48,6±5,6 21,1±2,7 293,5±7,6 19,7±5,1 7,1±1,8 10 мг/кг p, ANOVA >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 * - Числитель дроби – t-тест Стьюдента; знаменатель – непараметрический критерий Манна-Уитни >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 125 Таблица 37 Сравнение абсолютных и относительных (%) приростов массы тела крыс за 28 дней эксперимента (M±m) Группы №№ Число крыс 1. Контроль Прирост массы тела за 28 дней Абс., г Относит., % 15 176,7±5,5 146,8±6,0 2. Фуллеренол 0,1 мг/кг 15 180,2±9,2 148,9±10,5 3. Фуллеренол 1 мг/кг 15 162,6±8,1 133,6±7,0 4. Фуллеренол 10 мг/кг 15 181,0±4,4 148,3±4,8 >0,05 >0,05 гр. 2 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 гр.3 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 гр.4 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 гр2-гр.3 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 гр.2-гр.4 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 гр.3-гр.4 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Достоверность* различия при попарном сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность* различия при попарном сравнении групп * - Числитель дроби – t-тест Стьюдента; знаменатель – непараметрический критерий МаннаУитни 126 Таблица 38 Отношение массы органов к массе тела у крыс групп 1-4 на 29 день эксперимента, в % (M±m) Группы Масса тела, г (M±m) 307,1±7,6 Масса органов, % от массы тела (M±m) Печень 1. Контроль 3,57±0,18 2.Фуллеренол 0,1 303,6±10,6 3,61±0,16 мг/кг 3.Фуллеренол 1 мг/кг 295,1±11,6 3,27±0,16 4.Фуллеренол 10 309,0±5,7 3,36±0,10 мг/кг Однородность распределения, >0,05 >0,05 группы 1-4 ANOVA, p Критерий Крускала и >0,05 >0,05 Уоллиса, группы 1-4 1_2 >0,05 1_3 >0,05 Непараметрический 1_4 >0,05 критерий МаннаУитни 2_3 >0,05 2_4 >0,05 3_4 >0,05 Селезенка Почки Гонады Сердце 0,58±0,05 0,68±0,03 1,00±0,03 0,34±0,01 НадпочечМозг ники 0,22±0,02 0,58±0,01 0,024±0,0018 0,59±0,01 0,66±0,06 0,66±0,04 0,95±0,03 0,34±0,01 0,22±0,03 0,57±0,03 0,025±0,0018 0,58±0,01 0,55±0,04 0,65±0,03 0,99±0,04 0,31±0,01 0,20±0,02 0,56±0,02 0,027±0,0018 0,57±0,01 0,53±0,04 0,66±0,01 0,92±0,09 0,34±0,03 0,24±0,02 0,56±0,02 0,030±0,0019 0,58±0,01 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,02 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,04 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,01 >0,05 0,03 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Тимус Лёгкие 127 4.5.2 Влияние фуллеренола на гематологические показатели крови В ряду гематологических показателей (Таблица 39) воздействие фуллеренола приводило к снижению среднего содержания гемоглобина в эритроцитах у крыс всех опытных групп (p<0,05). Однако данные изменения составили всего 2-3% по абсолютной величине и находились в пределах физиологической нормы. Количество эритроцитов, показатели гематокрита, содержание гемоглобина и др. показатели не претерпевали изменений под действием фуллеренола во всем диапазоне концентраций. Изменения в процентном содержании моноцитов, у животных групп 3 и 4 (на 39% и 42%) и относительном содержании незрелых гранулоцитов (на 96% и 145% в тех же группах животных) были достоверными (p<0,05) и дозозависимыми (Таблица 40). Можно предположить, что данный эффект обусловлен неспецифической активацией фагоцитарной системы животных в ответ на введение фуллеренола по аналогии с тем, как это имеет место при бактериальном сепсисе, воспалении, некрозе тканей или воздействии различных токсических факторов [29]. 128 Таблица 39 Средние гематологические показатели, характеризующие состояние эритроцитов, (M±m) у крыс групп 1-4 Показатели, ед. изм. Группы Количество крыс 1. Контроль 8 2.Фуллеренол 8 0,1 мг/кг 3.Фуллеренол 1 8 мг/кг 4.Фуллеренол 9 10 мг/кг Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Критерий Крускала и Уоллиса, группы 1-4 Достоверность* гр. 2 различия при гр.3 попарном сравнении с гр.4 группой 1, для групп №№ Достоверность* гр2-гр.3 различия при гр.2-гр.4 попарном сравнении гр.3-гр.4 групп Общее количество эритроцитов (RBC), 106/мкл 7,13±0,14 Гемоглобин Гематокрит Средний объем (HGB), (HCT), эритроцита (MCV), г/л % мкм3 Среднее содержание Средняя концентрация гемоглобина в гемоглобина в эритроцитах (MCHC), эритроците (MCH), пг пг 143,88±2,29 41,58±0,67 58,38±1,02 346,50±2,43 20,24±0,31 7,29±0,21 143,38±3,26 42,15±0,82 58,13±0,77 339,63±1,98 19,69±0,29 7,40±0,15 147,50±1,10 43,50±0,42 59,00±0,82 339,25±1,86 19,96±0,37 7,49±0,15 146,78±2,18 43,33±0,57 57,89±0,79 338,44±1,60 19,61±0,32 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,027 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,046/0,045 0,033/0,050 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,013/0,026 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 * - Числитель дроби – t-тест Стьюдента; знаменатель – непараметрический критерий Манна-Уитни 129 Таблица 40 Средние гематологические показатели, характеризующие состояние лейкоцитов и тромбоцитов, (M±m) у крыс групп 1-4 Показатели, ед. изм. Группы Количест -во крыс 1. Контроль 8 2.Фуллеренол 8 0,1 мг/кг 3.Фуллеренол 1 8 мг/кг 4.Фуллеренол 9 10 мг/кг Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Критерий Крускала и Уоллиса, группы 1-4 Достоверность * различия при попарном сравнении с группой 1, для групп №№ Достоверность * различия при попарном сравнении групп гр.2 гр.3 гр.4 Гр.2-гр.3 гр.2-гр.4 гр.3-гр.4 Общее количество лейкоцитов (WBC), 103 /мкл Эозинофилы (EO), % Нейтрофилы (NE), % Базофилы (BA), % Лимфоцит ы (LY), % Моноциты (MO), % Отн. содерж. незрелых гранулоцито в (IMM), % 15,35±0,79 1,04±0,10 23,55±2,36 0,13±0,02 69,00±2,68 6,29±0,37 0,33±0,06 15,93±2,53 1,18±0,13 21,88±2,57 0,14±0,03 69,83±2,20 6,99±0,91 0,61±0,19 17,16±1,41 1,36±0,12 20,96±1,59 0,16±0,03 68,74±1,86 8,78±0,61 0,65±0,08 17,44±1,03 1,20±0,12 22,42±2,09 0,22±0,04 67,23±2,18 8,92±0,70 0,81±0,11 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,022 0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,026 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,05 Тромбоциты (PLT), 10^9/л 564,00±28,3 6 582,50±25,9 6 623,75±25,9 0 616,89±22,8 5 Средний объем тромбоцито в (MPV), мкм3 Тромбокрит (PCT), % 6,58±0,12 0,37±0,02 6,84±0,13 0,40±0,01 6,69±0,14 0,42±0,02 6,72±0,11 0,42±0,02 >0,05 >0,05 >0,05 0,021 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,004/0,016 0,004/0,009 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,006/0,008 0,002/0,005 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 * - Числитель дроби – t-тест Стьюдента; знаменатель – непараметрический критерий Манна-Уитни >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 >0,05/>0,0 5 130 4.5.3 Влияние фуллеренола на биохимические показатели крови Практически полное отсутствие воздействия на биохимические показатели сыворотки крови (Таблица 41), указывает на отсутствие выраженного токсического действия фуллеренола на организм животных, получавших фуллеренол в исследованных дозах. Единственное исключение составляет достоверное увеличение уровня мочевой кислоты у животных 3 и 4 групп (на 17% и 19% соответственно). При этом, как было показано ранее, введение немодифицированного фуллерена С60 оказывает противоположное по своей направленности влияние на этот показатель. Применительно к фуллеренолу данный эффект не может рассматриваться как однозначно негативный с учетом известной роли мочевой кислоты как эндогенного антиоксиданта. 4.5.4 Влияние фуллеренола на содержание цитохромов Р-450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков Введение фуллеренола во всех концентрациях не оказывало влияния на уровни содержания цитохромов Р450 и b5 в микросомальной фракции печени крыс (Таблица 42), активность UDP-глюкуронозилтрансферазы, а также на активность изоформы цитохрома Р450 CYP2B1, изменение активности которой было обнаружено при 3-х месячном внутрижелудочном введении крысам немодифицированного фуллерена С60. При этом активность изоформы цитохрома Р450 CYP1A1 была снижена у животных второй группы на 34% по сравнению с крысами контрольной группы (p<0,05, критерий Манна-Уитни). В группах 3 и 4 этот эффект не был выявлен. Активность другой изоформы цитохрома P450 CYP1A2 снижалась при низкой дозе фуллеренола (группа 2) на 50% (p<0,05), а при наибольшей (группа 4) – повышалась на 30% (p<0,05). Немонотонный характер зависимости доза-эффект косвенно указывает на наличие нескольких конкурирующих механизмов влияния фуллеренола на активность данного фермента, входящего в состав 1 фазы системы детоксикации ксенобиотиков [3, 13]. Выявленное воздействие может реализоваться как на уровне экспрессии гена [69, 58], так и за счёт посттрансляционных эффектов воздействия на 131 Таблица 41 Средние (M±m) биохимические показатели сыворотки крови у крыс групп 1-4 Группы Количество крыс 1. Контроль 6 2. Фуллеренол 6 0,1 мг/кг 3. Фуллеренол 6 1 мг/кг 4. Фуллеренол 6 10 мг/кг Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Критерий Крускала и Уоллиса, группы 1-4 Достоверность* гр.2 различия при гр.3 попарном сравнении с гр.4 группой 1, для групп №№ Достоверность* гр.2-гр.3 различия при гр.2-гр.4 попарном сравнении гр.3-гр.4 групп Показатели, ед. изм. 50,88±1,33 Моч. к-та 73,49±2,71 11,64±0,18 Щелоч. ф-за 260,43±20,20 5,05±0,15 49,90±0,79 70,71±1,44 12,01±0,66 240,99±19,47 64,77±2,05 5,04±0,26 50,97±1,24 86,40±7,45 13,12±0,91 216,99±10,20 31,73±0,56 63,57±0,71 5,53±0,41 50,29±0,85 87,82±3,88 12,51±0,96 206,69±11,20 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,026 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,034 >0,05 >0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,05/0,025 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,035/0,03 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 АЛТ АСТ Альбумин Белок общ. Глюкоза Креатинин 84,09±10,0 146,87±29,56 32,30±0,25 65,15±0,92 4,58±0,20 79,59±7,80 161,43±12,46 31,79±0,23 61,60±0,73 82,94±4,99 174,34±12,86 31,37±0,54 69,76±2,29 151,36±3,33 >0,05 * - Числитель дроби – t-тест Стьюдента; знаменатель – непараметрический критерий Манна-Уитни Мочевина 132 конформацию белка и структуру биологических мембран [180]. Для выяснения деталей этих процессов необходимо проведение дополнительных исследований с привлечением геномных и протеомных методов. Стоит также отметить, что в 92-х дневном исследовании также было выявлено изменение активности этого фермента, под действием немодифицированного фуллерена С60. Активность глутатион-S-трансферазы достоверно (p<0,05, ANOVA) увеличивалась у крыс, получавших фуллеренол, на 16-18%, однако четкой зависимости этого эффекта от дозы также не было выявлено. 4.5.5 Влияние фуллеренола на состояние системы антиоксидантной защиты и значения показателей ПОЛ При определении показателей ПОЛ (Таблица 43) выявлено достоверное снижение содержания диеновых коньюнгатов ПНЖК в плазме у животных 2-й и 3-й групп на 12-13% (p<0,05), что может свидетельствовать о наличии у фуллеренола антиоксидантных свойств; однако в 4-й группе подобные изменения отсутствовали. Введение фуллеренола приводило к дозозависимому (p<0,05, ANOVA) снижению активности глутатионредуктазы в эритроцитах у животных опытных групп (максимум на 35% у животных 4-й группы). 4.5.6 Влияние фуллеренола на содержание небелковых тиолов печени В таблице 44 представлены данные о содержании небелковых тиолов печени у крыс, получавших фуллеренол на протяжении 28-ми дней. Видно, что различия в значениях между группами 1-4 отсутствуют (p>0,05). Таким образом, фуллеренол на величину пула небелковых тиолов достоверного воздействия не оказывает, что свидетельствует об отсутствии влияния на состояние red/ox гомеостаза. 133 Таблица 42 Среднее (M±m) содержание цитохромов Р-450 и b5 и активность ферментов 1-й и 2-й фазы детоксикации ксенобиотиков у крыс групп 1-4 Показатели, ед. изм. Группы Количество крыс 1. Контроль 6 2. Фуллеренол 6 0.1 мг/кг 3. Фуллеренол 6 1 мг/кг 4. Фуллеренол 6 10 мг/кг Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Критерий Крускала и Уоллиса, группы 1-4 Достоверность* гр.2 различия при гр.3 попарном сравнении с гр.4 группой 1, для групп №№ Достоверность* гр.2-гр.3 различия при гр.2-гр.4 попарном сравнении гр.3-гр.4 групп Содержание цитохрома Р450 в микросомах печени крыс, нмоль/мг белка 0,55±0,03 Содержание цитохрома b5 в микросомах печени крыс, нмоль/мг белка 0,48±0,01 0,49±0,03 Этоксирезоруфиндеалкилазная активность (CYP1A1), пмоль/мин*мг белка 7МетоксирезоруфинО-деметилазная активность (CYP1A2), пмоль/мин*мг белка 6,33±0,89 36,03±2,42 7Пентоксирезоруфин-Одеалкилазная активность (CYP2B1), пмоль/мин*мг белка 8,81±0,38 0,44±0,02 4,17±0,10 18,12±2,0 0,52±0,04 0,42±0,02 5,48±0,48 0,54±0,02 0,45±0,02 >0,05 Активность глутатион-Sтрансферазы, мкмоль/мин*мг белка Активность UDPглюкуронозил трансферазы, нмоль/мин*мг белка 1,04±0,04 22,15±1,64 8,00±1,91 1,23±0,05 21,57±1,97 48,10±8,86 10,51±1,06 1,10±0,05 22,12±1,63 5,27±0,35 47,40±4,05 8,96±0,67 1,21±0,05 23,93±2,49 >0,05 >0,05 0,002 >0,05 0,040 >0,05 >0,05 >0,05 0,05 0,002 >0,05 0,037 >0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,05/0,024 <0,001/0,004 >0,05/>0,05 0,014/0,016 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,037/0,037 >0,05/>0,05 0,037/0,025 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/0,037 0,019/0,004 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/0,037 0/0,004 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 * - Числитель дроби – t-тест Стьюдента; знаменатель – непараметрический критерий Манна-Уитни. 134 Таблица 43 Средние (M±m) значения показателей перекисного окисления липидов у крыс групп 1-4 Показатели, ед. изм. Группы Количество крыс 1. Контроль 6 2. Фуллеренол 6 0,1 мг/кг 3. Фуллеренол 6 1 мг/кг 4. Фуллеренол 6 10 мг/кг Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p Критерий Крускала и Уоллиса, группы 1-4 Достоверность* гр.2 различия при гр.3 попарном сравнении с гр.4 группой 1, для групп №№ Достоверность* гр.2-гр.3 различия при гр.2-гр.4 попарном сравнении гр.3-гр.4 групп Содержание диеновых коньюгатов ПНЖК в плазме, нмоль/мл 3,35±0,11 Содержание малонового диальдегида в плазме, нмоль/мл Активность глютатионпероксидазы эритр., мкмоль/мин мл эр Активность глютатионредуктазы эритр., мкмоль/мин мл эр Активность супероксиддисмутазы эритр., усл.ед./ мл эр Активность каталазы эритр., кU/ мл эр 5,14±0,44 17,38±1,83 3,06±0,41 1431,5±37,6 324,67±15,66 2,92±0,10 4,27±0,14 22,62±2,08 2,70±0,30 1487,2±34,9 332,17±21,32 2,95±0,06 5,16±0,40 22,98±1,82 2,02±0,10 1470,0±30,6 344,33±15,60 3,07±0,13 4,51±0,23 22,60±0,55 1,99±0,18 1478,5±20,7 374,67±29,44 0,034 >0,05 >0,05 0,030 >0,05 >0,05 0,05 >0,05 >0,05 0,033 >0,05 >0,05 0,018/0,025 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,013/0,009 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,05/0,025 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,035/0,030 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 * - Числитель дроби – t-тест Стьюдента; знаменатель – непараметрический критерий Манна-Уитни 135 Таблица 44 Средние (M±m) значения содержания небелковых тиолов печени у крыс групп 1-4 Группы Количество крыс 1. Контроль 2. Фуллеренол 0,1 мг/кг 3. Фуллеренол 1 мг/кг 4. Фуллеренол 10 мг/кг 6 6 6 6 Показатели, ед. изм. ПУЛ GSH мкмоль 39,76±2,98 42,98±2,76 34,30±1,71 36,73±1,83 Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p >0,05 Критерий Крускала и Уоллиса, группы 1-4 >0,05 гр.2 >0,05/>0,05 гр.3 >0,05/>0,05 гр.4 >0,05/>0,05 гр.2-гр.3 >0,05/>0,05 Достоверность* различия при гр.2-гр.4 >0,05/>0,05 попарном сравнении групп гр.3-гр.4 >0,05/>0,05 * - Числитель дроби – t-тест Стьюдента; знаменатель – непараметрический критерий МаннаДостоверность* различия при попарном сравнении с группой 1, для групп №№ Уитни 4.5.7 Влияние фуллеренола на экскрецию 8-oxo-G Различия в величине экскреции 8-oxo-G (Таблица 45) у животных групп 1-4 были недостоверны (p>0,05). Таким образом, внутрижелудочное введение фуллеренола крысам в дозе до 10 мг/кг массы тела на протяжении 28 дней, повидимому, не влияет у них на окислительное повреждение ДНК. 4.5.8 Влияние фуллеренола на содержание цитокинов в сыворотке крови и показатели, характеризующие иммунный статус Отсутствие токсического действия при введении фуллеренола во всех изученных дозах было установлено при анализе показателей, характеризующих иммунный статус крыс (количество субпопуляций лимфоцитов CD45RA+, CD3+ и CD161a+, доли CD3+CD4+ и CD3+CD8+ в общем числе Т-лимфоцитов, соотношение CD4/CD8), распределение всех значений однородно (p>0,05, ANOVA). Это свидетельствует об отсутствии неблагоприятного воздействия 136 Таблица 45 Средние значения показателей характеризующих экскрецию 8-oxo-G, (M±m) у крыс групп 1-4 Показатели, ед. изм. Количество крыс С(8-oxo-G) нг/100 мкл Креатинин мг/100 мкл 1. Контроль 5 2. Фуллеренол 0,1 мг/кг 5 3. Фуллеренол 1 мг/кг 5 4. Фуллеренол 10 мг/кг 5 Однородность распределения, группы 1-4, ANOVA, p 0,17±0,03 0,23±0,03 0,13±0 0,17±0,03 0,99±0,09 1,38±0,28 0,64±0,18 0,53±0,18 нг 8-oxo-G на мг креатинина 0,16±0,02 0,21±0,06 0,29±0,09 0,48±0,14 >0,05 0,029 >0,05 Критерий Крускала и Уоллиса, группы 1-4 >0,05 0,045 >0,05 Группы гр.2 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 гр.3 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 гр.4 >0,05/>0,05 0,05/>0,05 >0,05/>0,05 гр.2-гр.3 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 Достоверность* различия при гр.2-гр.4 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,035/0,028 попарном сравнении групп гр.3-гр.4 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 * - Числитель дроби – t-тест Стьюдента; знаменатель – непараметрический критерий МаннаДостоверность* различия при попарном сравнении с группой 1, для групп №№ Уитни фуллеренола на Т- и В-клеточное звено иммунитета животных, при 28-ми дневном пероральном поступлении. Как следует из данных, представленных в таблице 46, частоты выявления TNF-a в сыворотках крыс всех групп были низкими и какого-либо достоверного различия между группами не наблюдается. Уровни IL-10 у животных групп 2-4 также достоверно не отличались от контроля. Однако, содержание IL-6 в сыворотках крыс групп 1 и 3 было достоверно выше, чем у животных групп 2 и 4. Отсутствие выраженной зависимости этого показателя от дозы, однако, не позволяет на этом основании сделать вывод о наличии у фуллеренола выраженного иммунотоксического действия. 137 Таблица 46 Средние значения содержания цитокинов в сыворотке крови, (M±m) у крыс групп 1-4 Группы Количество крыс 1. Контроль 9 2. Фуллеренол 0,1 мг/кг 3. Фуллеренол 1 мг/кг 4. Фуллеренол 10 мг/кг 9 9 9 Показатели, ед. изм. TNF-a, IL-6, pg/ml pg/ml IL-10, Выявлено Выявлено pg/ml Значения из общего Значения из общего числа числа 4,47±1,57 0 0/9 24,9±2,9 6/9 (0 – 12,2) 1,95±1,95 0,51±0,51 1/9 45,0±14,1 1/9 (0 –17,6) (0 – 4,7) 1,1±1,1 6,17±3,12 1/9 35,3±5,5 5/9 (0 – 10,3) (0 – 24,5) 1,1±0,9 0,51±0,51 2/9 30,3±4,3 1/9 (0 – 8,6) (0 – 4,63) Статистический анализ Критерий Крускала и Уоллиса, группы 1-4 Достоверность гр.2 >0,05** различия при гр.3 >0,05** попарном сравнении с гр.4 >0,05** группой 1, для групп №№ Достоверность гр2-гр.3 >0,05** различия при попарном сравнении с гр.2-гр.4 >0,05** группой 2, для групп №3 и №4 * - непараметрический критерий Манна-Уитни ** - критерий Хи-квадрат >0,05 - >0,05* >0,05* 0,015** >0,05** >0,05* 0,015** >0,05* 0,045** >0,05* >0,05** 4.5.9 Влияние фуллеренола С60ОН24 на проницаемость кишечного барьера для ОВА Величина всасывания в желудочно-кишечном тракте антигенного ОВА куриного яйца, определяемая по его концентрации в сыворотке крови, не имела достоверных различий между группами 1-4 (Рисунок 19). Таким образом, в 28дневном эксперименте, фуллеренол С60 не оказывает негативное влияние на степень всасываемости в кишечнике макромолекул белка, аналогично с результатом, полученным в 28-дневном исследовании с немодифицрованным фуллереном С60. 138 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 1 2 3 4 Рисунок 19. Всасывание в кишке антигенного ОВА у крыс, получавших фуллеренол С60ОН24. Ось абсцисс - №№ групп; ось ординат - всасывание овальбумина в кровь через 3 часа, % от введенной дозы антигенного белка103, M±m. Численность групп – по 9 животных. 4.6 Эксперимент по исследованию стабильности фуллерена С60 в биологических субстратах с использованием модельных систем in vitro Как показано в таблице 47, фуллерен С60, вносимый в образцы цельной крови, в ходе ее инкубации при температуре тела животного подвергается быстрой деградации. При максимальной начальной концентрации его содержание в крови снижается через 3 часа в 25 раз по сравнению с исходным уровнем, при больших временах инкубации фуллерен в крови не выявляется. При меньших концентрациях наблюдается его полная (в пределах чувствительности метода ВЭЖХ) элиминация в образце крови уже через 3 часа. При добавлении фуллерена в цельный гомогенат ткани печени, как следует из данных, представленных в таблице 48, наблюдается также снижение его концентрации, хотя и не такое быстрое, как в случае образцов цельной крови. При 139 наибольшей из доз фуллерена достоверное (в пределах погрешности определения) снижение его содержания отмечается только при 24 часа опыта, а при меньших дозах – значительно быстрее, при 3 часах инкубации. Результаты анализа, приведенные в таблице 49, показывают, что зависимость концентрации фуллерена в объёме микросомальной фракции печени от времени оказывается немонотонной (отмечается как снижение, так и возрастание этого показателя). С целью анализа этих зависимостей проведён их регрессионный анализ в соответствии с уравнением C=Co-t, где Со – исходная, С – текущая концентрация фуллерена, t – время, – эмпирический угловой коэффициент. Результаты (Таблица 49) показывают, что для среднего и низкого добавляемого количества фуллерена коэффициент достоверно не отличается от нуля, что свидетельствует об отсутствии зависимости объёмной концентрации фуллерена от времени в пределах погрешности данных эксперимента. Однако, при наибольшем из добавляемых количеств отмечается статистически достоверное возрастание концентрации фуллерена в объёме водной фазы (p<0,05). Причиной этого, возможно, является неспособность микросомальной фракции обеспечить диспергирование значительной части вносимого фуллерена, так как, в отличие от гомогената ткани и цельной крови, фракция микросом содержит мало растворенного (не связанного с мембранными везикулами) белка, выполняющего функцию стабилизатора дисперсии фуллерена [59]. По мере инкубации, дополнительные количества фуллерена, адгезированного к стенкам пластиковых пробирок, могут постепенно переходить в объём водной фазы, что, в отсутствие его значимой биодеградации создаёт эффект кажущегося увеличения концентрации. Таким образом, использованная нами экспериментальная модель не позволила выявить эффект биотрансформации фуллерена С60 под действием микросомальной фракции печени. 140 Таблица 47 Средняя концентрация фуллерена С60 в образцах цельной крови Время инкубации (ч) 0 Цельная кровь 3 6 12 24 Измеренная концентрация фуллерена С60, мкг/проба Концентрация 1 179,1±19,1 7,22±0,12 0 0 0 Концентрация 2 11,8±1,1 0 0 0 0 Концентрация 3 0,57±0,83 0 0 0 0 Таблица 48 Средняя концентрация фуллерена С60 в образцах гомогенатов печени Время инкубации (ч) Гомогенат печени 0 3 6 12 24 Измеренная концентрация фуллерена С60, мкг/проба Концентрация 1 10,11±0,99 5,44±2,97 5,09±0,69 4,36±0,27 0,46±0,16 Концентрация 2 0,59±0,14 0,12±0,17 0,017±0,023 0,014±0,020 0,011±0,016 Концентрация 3 0,075±0,008 0,029±0,001 0 0 0 141 Таблица 49 Средняя концентрация и параметры регрессионной зависимости от времени содержания фуллерена С60 в образцах микросомальной фракции печени Время инкубации (ч) Микросомальная 0 фракция 3 6 Параметры линейной 12 24 Измеренная концентрация фуллерена С60, мкг/проба (M±m) регрессии (M±m) Со P для Концентрация 1 92,46±0,06 122,0±0,3 121,4±2,2 166,7±4,7 189,4±12,9 103±9 3,90,7 0,012 Концентрация 2 3,62±0,57 7,0±8,2 1,8±2,0 2,47±0,08 11,7±2,5 2,7±2,3 0,29±0,19 0,222 Концентрация 3 0,062±0,001 0,052±0,040 0 0,19±0,23 0,19±0,18 0,03±0,04 0,007±0,003 0,122 5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В задачи настоящей работы входило систематическое изучение по единому плану возможных токсических эффектов, вызываемых пероральным введением фуллерена С60 и фуллеренола С60ОН24 лабораторным животным (крысам), в подостром эксперименте длительностью 28-92 суток с осуществлением контроля максимально широкого набора показателей, разносторонне характеризующих состояние организма животного в соответствии с действующими в Российской Федерации методическими указаниями по оценке безопасности наночастиц и наноматериалов, утверждёнными в установленном порядке (МУ 1.2.2520-09). Первая проблема, которую следовало разрешить при проведении исследований, относилась к выбору формы введения и доз фуллерена С60 и фуллеренола С60ОН24. Как показал анализ данных литературы, различные методические подходы, основанные на получении дисперсий фуллерена с использованием систем вода-органические растворители, являются непригодными для целей настоящего исследования, поскольку не позволяют гарантировать отсутствие грубого токсического воздействия носителя, содержащего практически неудаляемые примеси органического растворителя, на организм животных. Альтернативные подходы, стоящие в получении чисто водных «растворов» фуллерена с помощью длительного перемешивания, растирания, ульразвуковой обработки были также признаны непригодными, поскольку не позволяли получить на практике дисперсии фуллерена достаточно высокой концентрации и в достаточно больших количествах, а также не исключали возможности неконтролируемых окисления и химической модификации обрабатываемого фуллерена. В результате был сделан выбор в пользу сравнительно простой, воспроизводимой и высокопроизводительной методики получения стабильных дисперсий фуллерена в растворе биополимера кукурузного крахмала, являющегося нутриентом (частично расщепляемый под действием амилаз ферментируемый слюны кишечной и панкреатического микрофлорой сложный секрета и углевод), частично а также 143 малотоксичным, разрешенным к применению в составе пищевых продуктов в качестве пищевой добавки, поверхностно-активным веществом твин 80. Доза фуллерена С60 и фуллеренола С60ОН24 в проведенных исследованиях составляла до 10 мг/кг массы тела лабораторного животного, что в пересчёте на массу тела человека соответствует приёму 0,7-0,9 г этих веществ в день и является значительной аггравацией в условиях реально возможных сценариев экспонирования человека этими веществами в составе пищевых продуктов или косметических средств (при их случайном приёме внутрь). Анализ размеров частиц фуллерена С60, получаемых путём его диспергирования в системе крахмал - твин 80 был проведен методом спектроакусического исследования и показал, что основная часть частиц дисперсной фазы фуллерена представлена частицами в нанометровом диапазоне размеров средним диаметром около 31 нм. Следует отметить, что каждая такая частица состоит из значительного числа молекул фуллерена, средний диаметр которых составляет около 0,7 м. Приблизительный подсчёт показывает, что число молекул фуллерена С60 в объёме одной частицы при условии их плотной сферической упаковки может составлять прядка (5-8)×104 штук. Тем не менее, для наночастиц такого размера имеется значительный объём данных литературы, свидетельствующий о возможности и трансэпителиального транспорта (проникновения) через слизистую оболочку тонкой кишки, по механизмам эндоцитоза и персорбции [183, 93, 40, 152]. На основе анализа данных литературы, полученных с использованием преимущественно радиоизотопных меток можно было предположить, что биодоступность нанодисперсной (мицеллярной) формы фуллерена С60 является сравнительно низкой (повидимому, около 3% от однократно введённой дозы), что, тем не менее, является физиологически значимым, особенно с учётом липофильности этого соединения и возможности его кумуляции в различных органах и тканях (в первую очередь, в печени). Что же касается фуллеренола С60(ОН)24, то это соединение было хорошо растворимо в воде, что не создавало проблем при его пероральном введении. Тем 144 не менее, анализ его растворов методом динамического лазерного светорассеяния показал, что фуллеренол представлен в водной фазе не только свободными молекулами, но и мультимолекулярными ассоциатами (кластерами) в нанометровом диапазоне размеров, состоящими, оценочно, из 10-50 молекул. Переходя к результатам проведённых исследований необходимо констатировать, что были получены данные о том, что фуллерен С 60 при внутрижелудочном введении крысам в условиях 28- и 92- дневного эксперимента, оказывал воздействия на ряд показателей, характеризующих состояние организма животных, включая интегральные, биохимические, гематологические, а также морфологические показатели. При токсикологической оценке значимости этих изменений следует принимать во внимание, во-первых, специфичность этих изменений, то есть возможность однозначно соотнести их с эффектом действия фуллерена, а не применявшегося носителя. Во-вторых, необходимо учитывать абсолютную величину направленность этих сдвигов, а также соотносить их с интервалами естественной вариабельности физиологической нормы изучаемых показателей. Это позволяет в каждом конкретном случае установить, можно ли считать выявленный статистически достоверный эффект как однозначно вредный (неблагоприятный), либо он может рассматриваться как адаптивная реакция здорового организма. В-третьих, существенно, является ли выявленный эффект дозозависимым, поскольку только в этом случае возможно однозначное установление максимальной недействующей дозы (МНД), которая могла бы быть в дальнейшем использована при разработке гигиенического норматива предела допустимого поступления наноматериала в организм. Соответствующие сводки выявленных эффектов фуллерена С60 и фуллеренола С60(ОН)24 на организм крыс представлены в таблицах 49 и 50. Как показали результаты экспериментов, при 28-дневном введении фуллерена С60 отмечается дозозависимое снижение относительной массы печени. Данный эффект, однако, был нестойким, поскольку отсутствовал у животных, получавших те же дозы фуллерена в течение более длительного времени (92 дня) и, поэтому, не может рассматриваться как свидетельство подострого токсического 145 действия. В числе других эффектов, специфически характеризующих пероральное введение фуллерена С60 в организм животных, следует отметить воздействие на лейкоцитарную формулу крови (возрастание числа нейтрофильных лейкоцитов максимально на 62%, эозинофилов на 69%, снижение общего числа лимфоцитов на 12%). Однако, эти изменения также оказались нестойкими во временном аспекте, то есть не были выявлены у животных, получавших фуллерен С 60 в течение более длительного времени (92 дня) или даже имели при этом противоположную направленность (как в случае общего числа лимфоцитов). Характерно, что при 92-дневном введении фуллерена С60 не было найдено значимых специфических изменений показателей Т- и B-клеточного звена иммунитета, фиксируемых методом проточной цитофлуориметрии. Таким образом, обнаруженные «токсические» воздействия фуллерена С60 на кровь животных имеют транзиторный характер и свидетельствуют, по-видимому, о протекании в первый месяц эксперимента процессов нормальной физиологической адаптации организма к введению этого ксенобиотика, которые, по всей вероятности, завершаются к концу 3-го месяца эксперимента. Необходимо далее остановиться на выявленных воздействиях фуллерена С60 на ферменты 1-ой и 2-ой стадии системы детоксикации ксенобиотиков в печени. При 28-дневом введении этого вещества отмечается дозозависимое снижение активности изоформы CYP1A2 максимально на 58%, что могло бы свидетельствовать об относительном снижении эффективности защиты в отношении гидрофильных ксенобиотиков. Данный эффект, однако, также является транзиторным и не проявляется при 92-дневном введении. Более того, в этом случае отмечается дозозависимое увеличение активности изоформы CYP2B2, отвечающей за гидроксилирование липофильных ксеобиотиков, а также признаки повышения активности глутатион-S-трансферазы (данный эффект не проявлял отчётливой зависимости от дозы). В совокупности это может означать, что 92-дневное пероральное введение фуллерена приводит к адаптивной активации защитной системы печени в отношении липофильных ксенобиотиков, одним и представителей которых является сам изучаемый фуллерен С60. 146 Как следует из анализа данных литературы, фуллерен С60 может проявлять в биологических системах свойства как про- и антиоксиданта, в зависимости от условий эксперимента (в частности, от наличия освещения). Ввиду этого особо важным представлялось изучить возможность влияния этого вещества на показатели перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной системы. Сразу необходимо отметить, что по условиям проведения эксперимента препараты фуллерена С60 вводили животным внутрь, содержали их при рассеянном дневном или искусственном освещении, в пластмассовых клетках, экранирующих значительную часть жёсткого УФ-компонента естественного освещения. Это позволяет предположить, что вероятность токсических эффектов, связанных с фотосенсибилизирующим действием фуллерена в условиях настоящего эксперимента была сведена к минимуму. Результаты проведённых экспериментов показали, что каких-либо свидетельств усиления процессов ПОЛ, связанных с воздействием фуллерена С60 нами выявлено не было. Отсутствовали также какие-либо свидетельства усиления другого типа оксидантных процессов в организме, оцениваемых по показателю окислительного повреждения ДНК (в тесте экскреции 8-oxo-G) и уровню тканевых тиолов. С другой стороны, введение фуллерена С60 в течение как 28, так и 92 ней приводило к повышению активности одного из ключевых ферментов Red/Ox гомеостаза - глутатионедуктазы (флавопротеина, отвечающего за регенерацию восстановленной формы глутатиона из окисленной). Таким образом, никаких свидетельств усиления оксидантных процессов в организме животных при введении фуллерена С60 не было обнаружено ни в одной из его доз. Исследование биохимических показателей сыворотки крови у животных, получавших фуллерен С60, показало наличие таких потенциально неблагоприятных специфических для этого вещества изменений, как рост активности печеночной АЛТ (в группе 4, на 16%) и повышение активности глюкозы (максимально на 13,4% в группе 5). Следует однако учитывать, что все эти изменения были небольшими по абсолютной величие и полностью укладывались в известные для лабораторной крысы по данным ряда работ 147 интервалы физиологической нормы (см., в частности, работы [12, 27, 1]). Таким образом, выявленные изменения не могут рассматриваться как признаки токсического действия фуллерена С60 на животных во всех изученных дозах. Ряд других эффектов, специфически связанных с воздействием фуллерена С60 на животных (влияние на показатели эритроцитов и тромбоцитов, уровень мочевины, мочевой кислоты сыворотки крови, содержание селена в мозгу) по своей величине и/или направленности также не могут однозначно рассматриваться как признаки неблагоприятного воздействия на организм. Отдельно следует остановиться на выявленных дозозависимых изменениях, которые со значительной степенью вероятности свидетельствуют о возможном токсическом действии фуллерена С60 на организм. Это, во-первых, выявленное повышение проницаемости стенки тонкой кишки для макромолекул белка (ОВА) при 92-суточном введении фуллерена. Данный эффект следует рассматривать как безусловно неблагоприятный, т.к. ослабление барьерной функции тонкой кишки в отношении макромолекул способно привести к усилению транспорта во внутреннюю среду организма антигенов пищевых продуктов, токсинов микрофлоры белковой и липополисахаридной природы, что способно в дальнейшем привести к запуску каскада процессов, результатом которых может быть как аллергическая сенсибилизация, так и, в наиболее неблагоприятном случае - утрата барьерной функции в отношении кишечных микроорганизмов и развитие системного сепсиса [179, 15]. Доза фуллерена С60, при котором достоверно фиксируется этот эффект, составляет 10 мг/кг массы тела, в условиях 92-суточного введения. Во-вторых, необходимо проанализировать результаты изучения экспрессии клеточных маркеров воспаления в ткани печени, полученные с использованием метода конфокальной микроскопии. При интерпретации полученных данных, следует учитывать, что CD106 или VCAM-1 представляет собой белок суперсемейства иммуноглобулинов, участвующий в адгезии лейкоцитов с клетками эндотелия и в передаче клеточных сигналов, служащий посредником при адгезии лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов к клеткам 148 эндотелия сосудов в подострой фазе воспаления [38]. Обычно он экспрессируется в стенках и крупных, и мелких кровеносных сосудов после стимуляции эндотелиоцитов цитокинами; таким образом, он может служить маркёром активации эндотелия цитокинами [50, 106]. CD31 или PECAM-1 – это мембранный гликопротеин суперсемейства иммуноглобулинов, относящийся к классу молекул клеточной адгезии и к подгруппе белков с ингибиторным ITIMучастком [136]. Он является общим маркёром нормального эндотелия [118, 187, 188]; в меньших количествах обнаруживается на циркулирующих тромбоцитах, моноцитах, нейтрофилах и на некоторых популяциях Т-лимфоцтов. CD31 участвует в трансэндотелиальной миграции лейкоцитов в острой фазе воспаления, ангиогенезе и активации интегринов. Кроме того, будучи клеточным механорецептором, CD31 запускает каскад реакций эндотелиоцитов в ответ на растяжение под воздействием потока крови. Проведенное методом конфокальной микроскопии исследование морфологии предполагаемых органов-мишеней воздействия фуллерена показало, что в дозе до 10 мг/кг массы тела в течение 3 месяцев какие-либо изменения в слизистой оболочке подвздошной кишки отсутствовали. Сохранялась нормальная морфология ворсинок, признаков воспаления не было отмечено, повышения уровня нейтрофилов в ткани не наблюдалось, межклеточные контакты и система актиновых микрофиламентов энтероцитов не были нарушены. Вместе с тем, по крайней мере, в наибольшей из использованных доз фуллерена С60, 10 мг/кг массы тела, с использованием метода конфокальной микроскопии были выявлены изменения в печени, состоявшие в увеличении численности и изменении распределения CD106+ клеток с накоплением гранул в цитоплазме (Рисунок 16бг, Рисунок 17в-д), что свидетельствовало, по-видимому, об активации клеток, предположительно отсутствие идентифицируемых видимого воспаления и как зон Купферовские некроза. Этот макрофаги, эффект в может свидетельствовать о развитии ранних стадий токсической реакции и является, тем самым, чувствительным биоиндикатором повреждающего действия вводимого фуллерена С60 на ткань печени. 149 Практически полное отсутствие накопления фуллерена С60 в органах крыс, было подтверждено также в остром эксперименте по введению дисперсии фуллерена С60 в изолированную петлю тонкой кишки крысы. При естественном (пероральном) пути поступлении фуллерена, возможна его биодеградация, происходящая на разных этапах его метаболизма, что создает дополнительные сложности для точной оценки содержания фуллерена в том или ином органе живого организма. Возможной причиной тому является переход немодифицированной формы фуллерена, в его полигидрокисилировнные или другие производные, точный состав которых до сих пор не установлен. Задачами эксперимента было изучение всасывания, оценка влияния фуллерена С60 на показатели ПОЛ в печени, определение возможных путей распространения (биораспределения) фуллерена при введении в заведомо аггравированной дозе в изолированную петлю тонкого кишечника крыс, тем самым, избегая влияния ферментных систем желудка и двенадцатиперстной кишки, которые также могут служить причиной биоконверсии фуллерена С60. В этой связи был проведен эксперимент по исследованию стабильности фуллерена С60 в биологических субстратах с использованием модельных систем in vitro, задачами которого являлось подтверждение биологических средах гипотезы с о нестабильности использованием модельных фуллерена систем С60 in в vitro, воспроизводящих, с некоторой долей приближения, процессы, происходящие в организме после перорального введения этого соединения, с целью устранения противоречия в имеющихся экспериментальных данных о выраженном системном биологическом действии этого соединения, с одной стороны, и отсутствии его накопления в значимых количествах в органах и тканях, с другой. Полученные экспериментальных результаты работ объясняют неудачу попыток имевшую место количественного в ряде выявления фуллерена C60 in vivo после его перорального введения лабораторным животным и неоднозначность таких результатов при парентеральном и интратрахеальном введении. Одной из возможных причин является отсутствие унифицированного протокола диспергирования, что снижает всасывание фуллерена в желудочно- 150 кишечном тракте и ухудшает воспроизводимость детектируемых эффектов. Подавляющая часть фуллерена, всасывающегося в пищеварительном тракте (предположительно в составе смешанных мицелл жира и желчных кислот), подвергается быстрой биотрансформации с образованием метаболитов, не детектируемых методом ВЭЖХ. Данный процесс, как показали результаты проведенных тестов in vitro, является достаточно быстрым и, по-видимому, практически полностью завершается приблизительно через 1 сутки после введения вещества. По этим причинам выявить накопление фуллерена С60 в органах и тканях методом ВЭЖХ с толуольной экстракцией не удается. Данные проведенных экспериментов не позволяют точно установить ферментные системы, ответственные за биотрансформацию фуллерена в организме. Можно предположить только, что к их числу не относится система микросомальных монооксигеназ, локализованных преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме и содержащихся in vitro в микросомальной фракции [3]. По этому показателю фуллерен С60, как можно предположить, отличается от липофильных ксенобиотиков родственной структуры, таких, например, происходит как полициклические главным образом углеводороды, именно под метаболизация действием которых микросомальных монооксигеназ [13]. Ввиду низких концентраций фуллерена, достигаемых в биологических тканях, выявление и идентификация этих предполагаемых метаболитов является сложной задачей, которая в перспективе может быть решена с использованием метода меченых атомов, а также масс-спектрометрии и других, современных метаболомных технологий. 151 Таблица 49 Сводка эффектов, наблюдаемых при 28 и 92-дневном внутрижелудочном зондовом введении фуллерена С60 №№ Исследованный п/п показатель 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 Прирост массы тела Относительная масса органов: -печень -прочие Проницаемость кишечного барьера Система детоксикации ксенобиотиков: -цитохром Р-450 -цитохром b5 -CYP 1A1 -CYP 1A2 -CYP 2B1 -глутатион-S-трасфераза -УДФ-глюкуронозилтрансфераза Неседиментируемая активность лизосомальных гидролаз ПОЛ и система антиоксидантной защиты: -глутатионредуктаза Обмен селена Небелковые тиолы печени Биохимия крови: -АЛТ -АСТ -альбумин -белок общий -глюкоза -креатинин -мочевая кислота -мочевина -щелочная фосфатаза Гематологические показатели (эритроциты) Эффект выявлен (+) или не выявлен (-) Эффект может (+) или не может (-) быть соотнесён с действием фуллерена С60? Эффект дозозависимый (+) или не дозозависимый (-) 4 - Эффект может (+) или не может (-) быть интерпретирован как вредный 5 - 3 - + + + + + + + + + + + - + + + + - + + - - - - - + + - + + - - + + - + + + + + + + + + + - - 6 - 152 1 11 12 13 14 15 2 Гематологические показатели (лейкоциты): -общее количество лейкоцитов -нейтрофилы -лимфоциты Тромбоциты Окислительное повреждение ДНК (8-oxoG) Иммунный статус: -цитокины -клеточные маркеры Поиск биомаркеров токсического действия методом конфокальной микроскопии: -изменения в слизистой оболочке подвздошной кишки -увеличение численности и изменение распределения CD106+ клеток в печени (доза 10 мг/кг) 3 4 5 6 + + - + + + + - + + + - + - + - + - - - - - - - + + + - В 28-дневном эксперименте с фуллеренолом С60ОН24 следует отметить, что его ежедневное, пероральное поступление в дозе 0,1 мг/кг массы тела и более вызывает ряд достоверных изменений в показателях организма крыс (таблица 50) таких как снижение активности изоформы цитохрома Р450 CYP1A1 при дозе 0,1 мг/кг массы тела; снижение при дозе 0,1 мг/кг массы тела и увеличение при дозе 10 мг/кг массы тела активности изоформы цитохрома Р450 CYP1A2; увеличение активности глутатионтрансферазы при дозах 1 и 10 мг/кг массы тела; снижение содержания диеновых конъюнгатов ПНЖК в плазме и активности глютатионредуктазы в эритроцитах при дозах 0,1 и 1 мг/кг массы тела. Дозозависимую тенденцию имеют увеличение уровня мочевой кислоты, процентного содержания моноцитов и относительного содержания незрелых гранулоцитов при дозах 1 и 10 мг/кг массы тела, а также снижение среднего содержания гемоглобина в эритроцитах во всем диапазоне изученных доз фуллеренола С60ОН24. Таким образом, на основании проведенных исследований 153 можно заключить, что изменения, происходящие в организме крыс при дозе фуллеренола С60ОН24 0,1 мг/кг массы тела, невелики по абсолютной величине и находятся в пределах вариабельности физиологической нормы. Следовательно, можно предположить, что доза менее чем 0,1 мг/кг массы тела крысы может рассматриваться как максимальная недействующая, в месячном эксперименте. Таблица 50 Сводка эффектов, наблюдаемых при 28-дневном внутрижелудочном зондовом введении фуллеренола С60ОН24 №№ Исследованный п/п показатель 1 1 2 3 4 2 Прирост массы тела Относительная масса органов: -печень -прочие (надпочечники) Проницаемость кишечного барьера Система детоксикации ксенобиотиков: -цитохром Р-450 -цитохром b5 -CYP 1A1 -CYP 1A2 -CYP 2B1 -глутатион-S-трасфераза -УДФ-глюкуронозилтрансфераза Эффект выявлен (+) или не выявлен (-) Эффект может (+) или не может (-) быть интерпретирован как вредный 5 - Эффект дозозависимый (+) или не дозозависимый (-) 3 - Эффект может (+) или не может (-) быть соотнесён с действием фуллеренола С60ОН24? 4 - + - + - + - + - + + + - + + + - + - + - 6 - 154 1 5 6 7 8 9 10 11 12 13 2 Неседиментируемая активность лизосомальных гидролаз ПОЛ и система антиоксидантной защиты: -ПНЖК -глутатионредуктаза Небелковые тиолы печени Биохимия крови: -АЛТ -АСТ -альбумин -белок общий -глюкоза -креатинин -мочевая кислота -мочевина -щелочная фосфатаза Гематологические показатели (эритроциты) Гематологические показатели (лейкоциты) -относительное содержание незрелых гранулоцитов -моноциты Тромбоциты Окислительное повреждение ДНК (8-oxoG) Иммунный статус: -цитокины (IL-6) -клеточные маркеры 3 - 4 - 5 - 6 - + + - + + - + - + - + + + + - + + + + + + + - + - + - + - + - + - - - 155 6 ВЫВОДЫ 1. Впервые разработан способ биосовместимого внутрижелудочного введения наноразмерных мультимолекулярных частиц фуллерена С60 лабораторным животным в токсикологическом эксперименте, состоящий в механическом и ультразвуковом диспергировании фуллерена С60 в растворе пищевого вещества - 2% крахмала пищевого и 0,5% неионогенного поверхностноактивного вещества Твин-80 (Е433). Спектроакустическим методом показано, что основная часть частиц фуллерена сосредоточена во фракции со средним размером 31 нм. 2. Адаптирован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с неподвижной обращённой фазой С18 и подвижной фазой толуолацетонитрил со спектрофотометрическим детектированием к определению фуллерена С60 в биологических образцах, получаемых от лабораторных животных и в системах in vitro. Чувствительность метода составляет 1 нг фуллерена в пробе биологического материала, линейность стандартного графика сохранялась в интервале масс 5 – 1×104 нг фуллерена в пробе. 3. В результате внутрижелудочного введения крысам наноразмерной дисперсии фуллерена С60 в течение 28 и 92 дней в дозах от 0,1 до 10 мг/кг массы тела ежедневно выявлены изменения ряда показателей, свидетельствующих о наличии у этого соединения общетоксического действия на организм животных, включая дозозависимое снижение относительной массы печени, возрастание числа нейтрофильных лейкоцитов на 62%, эозинофилов на 69%, снижение общего числа лимфоцитов на 12%, снижение активности изоформы CYP1A2 на 58%, повышение проницаемости стенки тонкой кишки для макромолекул белка на 100%, увеличение числа CD106+ гранулярных клеток в паренхиме печени. На основании анализа полученных данных максимальная недействующая доза фуллерена С60 при подостром пероральном поступлении находится в интервале 110 мг/кг массы тела/сут. 156 4. В условиях подострого эксперимента продолжительностью 28 и 92 дня при дозе фуллерена С60 до 10 мг/кг массы тела и в остром эксперименте при введении этого соединения в изолированную петлю тонкой кишки крыс в дозе 15 мг/кг массы тела методом ВЭЖХ изучено поступление фуллерена С60 из желудочно-кишечного тракта во внутреннюю среду организма и его распределение по органам и тканям. В пределах чувствительности метода в подавляющем большинстве биологических образцов немодифицированный фуллерен С60 не был обнаружен. 5. В модельных системах in vitro (цельная кровь, гомогенат и микросомальная фракция печени интактных крыс) впервые изучена кинетика биодеградации фуллерена С60. Показано, что это вещество в количествах, существенно аггравированых в сравнении с возможными сценариями пероральной экспозиции, полностью деградирует в цельной крови за 6 часов инкубации и в гомогенате печени на 95% за 24 часа с образованием недетектируемых при ВЭЖХ производных. С позиции этого результата объяснены безуспешные попытки количественного определения бионакопления фуллерена в органах и тканях животных при естественных путях поступления in vivo. 6. При внутрижелудочном введении крысам водного раствора фуллеренола С60(ОН)24 в течение 28 дней в дозах от 0,1 до 10 мг/кг массы тела ежедневно впервые установлены признаки общетоксического действия этого соединения на организм животных, в том числе увеличение массы надпочечников на 12,5%, немонотонные изменения активности изоформ CYP1A1 и CYP1A2, возрастание числа моноцитов на 42% и незрелых гранулоцитов на 145%, снижение продукции интерлейкина-6. На основании анализа полученных данных рассчитана максимальная недействующая доза фуллеренола С60(ОН)24 при подостром пероральном поступлении, находящаяся в интервале 0,1 1,0 мг/кг массы тела/сут. 7. Результаты токсиколого-гигиенической оценки фуллерена С60 и фуллеренола С60(ОН)24 свидетельствуют о наличии рисков, связанных с 157 воздействием этих соединений на организм человека при пероральном пути поступления и указывают на необходимость гигиенического нормирования этих соединений в потребительской продукции (включая пищевые продукты) и объектах окружающей среды. 158 8-oxo-G 7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 8-оксо-2-дезоксигуанозин АЛТ Аланинаминотрасфераза АСТ Аспартатаминотрансфераза ИФА Иммуноферментный анализ МР Методические рекомендации МС Масс-спектрометрия МУ Методические указания НЧ Наночастица ОВА Овальбумин куриного яйца ПАВ Поверхностно-активное вещество ПВП Поливинилпирролидон ПОЛ Перекисное окисление липидов ПЭМ Просвечивающая электронная микроскопия РСК Реакционно-способные формы кислорода СЭМ Сканирующая электронная микроскопия Трис Трис-гидроксиметиламинометан ТХУ Трихлоруксусная кислота УЗ Ультразвук УФ Ультрафиолетовый ЩФ Щелочная фосфатаза C18 Силикагель, химически модифицированный октадецилсиланом CYP Изоформа цитохрома P450 GSH Глутатион (восстановленный) IL-6 Интерлейкин 6 IL-10 Иинтерлейкин 10 PBS Раствор фосфатного буфера SDS Додецил сульфат натрия TNFα Фактор некроза опухоли альфа 159 8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Ананич И.В., Дерхо М.А. Биохимические показатели крови крыс // Ветеринар. клиника. – 2008. – № 10. – С.18–19 2. Андреев С.М., Бабахин А.А., Петрухина А.О. и др. Иммуногенные и аллергенные свойства коньюгатов фуллерена с аминокислотами и белком // ДАН. – 2000. – Т.370, № 2 . – С.261–264. 3. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. – М.: Наука. – 1975. – С.327. 4. Виноградова Л.В., Меленевская Е.Ю., Хачатуров А.С и др. Водорастворимые комплексы фуллерена С60 с поли–N–инилпирролидоном // Высокомол. соед.– 1998. – Т.40. – С.1854–1862. 5. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. Дело. – 1983. – № 3. – С.33–35. 6. Гмошинский И.В., Смирнова В.В., Хотимченко С.А. Современное состояние проблемы оценки безопасности наноматериалов //Российские нанотехнологии. – 2010. – Т.5, № 9–10. – С.6–10. 7. Голубкина Н.А. Флуориметрический метод определения селена // Журн. аналитической химии. – 1995. – Т.50, № 8. – С.492–497. 8. Елецкий А.В., Смирнов Б.М. Фуллерены и структуры углерода // Успехи физических наук. – 1995. – Т.165, № 9. – С.977–1009. 9. Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Перспктивы определения 8– гидрокси–2–дезоксигуанозина в качестве биомаркера окислительного стресса в эксперименте и клинике // Вестник РАМН. – 2002. – № 2. – С.45–49. 10. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные, их разведение, содержание и использование в эксперименте. – Киев: Медгиз УССР. – 1962. – 180 с. 11. Захаренко Л.П., Захаров И.К., Васюнина Е.А. и др. Определение генотоксичности фуллерена C60 и фуллерола методом соматических озаиков на 160 клетках крыла Drosophila melanogaster и в SOS–хромотесте // Генетика. – 1997. – Т.33. – С.405–409. 12. Кавешникова С.В., Иванов В.М. Биохимические особенности крови крыс линии Вистар в постнатальном онтогенезе при интоксикации их оксидами азота // Вестн. Ставропольского гос. университета. – 2011. – Т.74, № 1. – С.100–105. 13. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журн. – 1999. – № 1. – С.2–7. 14. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. – М.: Медицина. – 1987. – 368 с. 15. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Саблина В.В. и др. Проницаемость стенки тонкой кишки для белковых антигенов у человека и лабораторных животных // Вопросы питания. – 2008. – Т.77, № 2. – С.10–21. 16. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа // Вопр. мед. химии. – 1994. – N.2. – С.56–58. 17. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. Оптимизация определения активности глутатионредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе // Вопр.мед.химии. – 1994. – № 2. – С.59–61. 18. Мальцев Г.Ю., Тышко Н.В. Методы определения содержания глютатиона и активности глутатионпероксидазы в эритроцитах // Гигиена и санитария. – 2002. – N.2. – С.69–72. 19. Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Саркосова Д.Л. и Перова Ю.Л. – М.: Медицина, 1996. – 544 с. 20. Онищенко Г.Г., Тутельян исследований, методологии В.А. оценки О риска, концепции методов токсикологических идентификации и количественного определения наноматериалов // Вопросы питания. – 2007. – Т.76, № 6. – С.4–8. 161 21. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А., Гмошинский И.В. и др. Развитие системы оценки безопасности и контроля наноматериалов и нанотехнологий в Российской Федерации // Гигиена и санитария. – 2013. – № 1. – С.4–11. 22. Первушин Ю.В., Рогова С.Ш., Ковалевич Н.И. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза и диагностика нарушений системы гемокоагуляции. Учебное пособие. Ставрополь–Москва. Издательство Москва. – 2009. – 60 с. 23. Пестова М.И., Гмошинский И.В., Мазо В.К. Влияние потребления молока на активность системы детоксикации формальдегида при сенсибилизации этим соединением // Вопросы питания. – 1992. – № 5–6. – С.41–44. 24. Пиотровский Л.Б., Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М. и др. Механизмы биологического действия фуллеренов – зависимость от агрегатного состояния // Психофармакология и биологическая наркология. – 2007. – № 2. – С.1548–1554. 25. Пиотровский Л.Б., Киселёв О.И. Фуллерены в биологии // СПб: ООО Издательство «Росток». – 2006. – 336 с. 26. Пиотровский Л.Б., Киселев О.И., Кезелецкая К.Н. и др. Противовирусная активность фуллерена С60 в комплексе с поли(N–винилпирролидоном) // ДАН. – 1998. – Т.361, № 4. – С.547– 549. 27. Толстикова Т.Г. , Жукова Н.А., Семенов Д.Е. и др. Биохимические показатели крови и количество гепатоцитов в печени крыс с токсическим гепатитом при действии аланинамида бетулоновой кислоты // Фундаментальные исследования (Fundamental Research). – 2012. – № 5. – С.120–123. 28. Хотимченко С.А., Гмошинский И.В., Тутельян В.А. Проблема обеспечения безопасности наноразмерных объектов для здоровья человека // Гигиена и санитария. – 2009. – № 5. – С.7–11. 29. Ali Ansari–Lari M., Kickler T.S., Borowitz M.J. Immature granulocyte measurement using the Sysmex XE–2100. Relationship to infection and sepsis // Am. J. Clin Pathol. – 2003. – Vol.120. – P.795–799. 30. Andrievsky G., Klochkov V., Derevyanchenko L. Is C60 fullerene molecule toxic? // Fullerenes, Nanotubes, Carbon Nanostruct. – 2005. – V.13. – P.363–376. 162 31. Aoshima H., Yamana S., Nakamura S. et al. Biological safety of water–soluble fullerenes evaluated using tests for genotoxicity, phototoxicity, and pro–oxidant activity // J Toxicol Sci. – 2010. – Vol.35, N.3. – P.401–409. 32. Avanasi R., Jackson W.A., Sherwin B. et al. C60 fullerene soil sorption, biodegradation, and plant uptake // Environ Sci Technol. – 2014. – Vol.48, N.5. – P.2792–7. 33. Baati T., Bourasset F., Gharbi N. et al. The prolongation of the lifespan of rats by repeated oral administration of [60]fullerene // Biomaterials. – 2012. – Vol.33, N.19. – P.4936–46. 34. 35. Baierl Т., Drosselmeyer E., Seidel A., Hippeli S. Comparison of immunological effects of fullerene C60 and raw soot from fullerene production on alveolar macrophages and macrophage like cells in vitro // Exp. Toxicol. Pathol. – 1996. – V.48. – P.508–511. 36. Baker G.L., Gupta A., Clark M.L. et al. Inhalation toxicity and lung toxicokinetics of C60 fullerene nanoparticles and microparticles // Toxicol. Sci. – 2008. – V.101, N.1. – P.122–131. 37. Bakry R., Vallant R.M., Najam–ul–Haq M. et al. Medicinal applications of fullerenes // Int. J. Nanomedicine. – 2007. – N. 2(4). – P.639–649. 38. Baron J.L., Reich E.P., Visintin I. et al. The pathogenesis of adoptive murine autoimmune diabetes requires an interaction between alpha 4-integrins and vascular cell adhesion molecule-1 // The Journal of clinical investigation. – 1994. – V.93. – N.4. – P.1700-1708. 39. Baun A., Sørensen S.N., Rasmussen R.F. et al. Toxicity and bioaccumulation of xenobiotic organic compounds in the presence of aqueous suspensions of aggregates of nano–C60 // Aquat. Toxicol. – 2008. – V.86, N.3. – P.379–387. 40. Behrens I., Pena A.I., Alonso M.J. et al. Comparative uptake studies of bioadhesive and non-bioadhesive nanoparticles in human intestinal cell lines and rats: the effect of mucus on particle adsorption and transport // Pharm. Res. – 2002. – Vol.19, N.8. – P.1185-1193. 163 41. Blickley T.M., McClellan–Green P. Toxicity of aqueous fullerene in adult and larval fundulus heteroclitus // Environ. Toxicol. Chem. – 2008. – V.24, N.1. 42. Borbala D., Gabor K., McAleer F.M. et al. In vivo radioprotection by the fullerene nanoparticle DF–1as assessed in a Zebrafish model // Clin. Cancer Res. – 2006. – V.12, N.23. 43. Braun Т., Buvari–Barcza A., Barcza L. et al. Mechanochemistry: a novel approach to the synthesis of fullerene compounds. Water soluble buckminster–fullerene–y– cyclodextrin inclusion complexes via a solid–solid reaction // Solid State Ionics. – 1994. – V.74. – P.47–51. 44. Brunet L., Lyon D.Y., Hotze E.M. et al. Comparative photoactivity and antibacterial properties of C60 fullerenes and titanium dioxide nanoparticles. Environ Sci Technol. – 2009. – Vol.43, N.12. – P.4355–4360. 45. Burchell B., Weatherill P. 4–Nitrophenol UDPglucuroniltransferase (rat liver) // Meth.Enzymol. – 1981. – Vol.77. – P.169–176. 46. Cagle D.W., Kennel S.J., Mirzadeh S. et al. In vivo studies of fullerene–based materials using endohedral metallofullerene radiotracers // Proc Natl Acad Sci USA. – 1999. – Vol.96, N.9. P.5182–7. 47. Cai X., Hao J., Zhang X. et al. The polyhydroxylated fullerene derivative C60(OH)24 protects mice from ionizing–radiation–induced immune and mitochondrial dysfunction // Toxicol Appl Pharmacol. – 2010. – Vol.243, N.1. – P.27–34. 48. Canesi L., Ciacci C., Vallotto D. et al. In vitro effects of suspensions of selected nanoparticles (C60 fullerene, TiO2, SiO2) on Mytilus hemocytes. // Aquat Toxicol. – 2010. – Vol.96, N.2. – P.151–158. 49. Canesi L., Fabbri R., Gallo G. et al. Biomarkers in Mytilus galloprovincialis exposed to suspensions of selected nanoparticles (Nano carbon black, C60 fullerene, Nano–TiO(2), Nano–SiO(2)) // Aquat Toxicol. – 2010. – Vol.100, N.2. P.168–77. 50. Carter R.A., Wicks I.P. Vascular cell adhesion molecule 1 (CD106): a multifaceted regulator of joint inflammation // Arthritis and rheumatism. – 2001. – V.44. – N.5. – P.985–94. 164 51. Cataldo F. Solubility of fullerenes in fatty acids esters: a new way to deliver in vivo fullerenes. Theoretical calculations and experimental results // Carbon Materials: Chemistry and Physics. – 2008. – Vol.1. – P.317–335. 52. Chang X., Ruan L., Yang S. et al. Quantification of carbon nanomaterials in vivo: direct stable isotope labeling on the skeleton of fullerene C60 // Environ. Sci. – 2014. – Vol.1. – P.64–70. 53. Chen C., Xing G., Wang J. et al. Multihydroxylated [Gd@C82(OH)22]n nanoparticles: antineoplastic activity of high efficiency and low toxicity // Nano. Lett. – 2005. – V.5, N.10. – P.2050–2057. 54. Chen H.H., Yu C., Ueng T.H. et al. Acute and subacute toxicity study of water– soluble polyalkylsulfonated C60 in rats // Toxicol. Pathol. – 1998. – V.26, N.1. – P.143– 151. 55. Cheng X., Каn А. Т., Tomson M. B. Naphthalene adsorbtion and desorption from aqueous C60, fullerene // J. Chem. Eng. Data. – 2004. – V.49. – P.675–683. 56. Chiron J., Lamande J., Moussa F. et al. Effect of «micronized» C60 fullerene on the microbial growth in vitro // Ann. Pharm. Fr. – 2000. – V.58. – P. 170–175. 57. Cook S.M., Aker W.G., Rasulev B.F. et al. Choosing safe dispersing media for C60 fullerenes by using cytotoxicity tests on the bacterium Escherichia coli // J Hazard Mater. – 2010. – Vol.176, N.1–3. – P.367–373. 58. Dhawan A., Taurozzi J.S., Pandey A.K. et al. Stable colloidal dispersions of C60 fullerenes in water: evidence for genotoxicity // Environ. Sci. Technol. – 2006. – Vol.40, N.23. – P.7394–401. 59. Deguchi S., Yamazaki T., Mukai S.A. et al. Stabilization of C60 nanoparticles by protein adsorption and its implications for toxicity studies // Chem. Res. Toxicol. – 2007. – V.20, N.6. – P.854–858. 60. Dehnen W., Tomingas R., Roos J. A modified method for the assay of benzo(a)pyrene hydroxylase // Anal. Biochem. – 1977. – Vol. 53, N.2. – P. 373–383. 61. Dellinger A., Zhou Z., Connor J. et al. Application of fullerenes in nanomedicine: an update. // Nanomedicine (Lond). – 2013. – Vol.8, N.7. – P.1191–208. 165 62. De Martinis B.S., Bianchi M.L.P. Methodology for urinary 8–hydroxy–2’– deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detection // Pharmacol. Res. – 2002. – Vol.46, N.2. – P.129–131. 63. Doi Y., Ikeda A., Akiyama M. et al. Intracellular uptake and photodynamic activity of water–soluble [60] and [70]fullerenes incorporated in liposomes // Chemistry. – 2008. – V.12. 64. Dukhin A.S., Goetz P.J. Characterization of liquids, nano– and microparticulates and porous bodies using ultrasound // Studies in interface science, Vol.24. – 2010. – Amsterdam et al.: Elsevier. – 518 p. 65. Dunk P.W., Adjizian J.J., Kaiser N.K. et al. Metallofullerene and fullerene formation from condensing carbon gas under conditions of stellar outflows and implication to stardust // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2013. – Vol.110, N.45. – P.18081–18086. 66. Fang J., Lyon D.Y., Wiesner M.R. et al. Effect of a fullerene water suspension on bacterial phospholipids and membrane phase behavior // Environ Sci. Technol. – 2007. – V.41, N.7. – P.2636–2642. 67. Faulstich H., Zobeley S., Rinnerthaler G. et al. Fluorescent phallotoxins as probes for filamentous actin // Journal of muscle research and cell motility. – 1988. – Vol. 9, N.5. – P. 370-383. 68. Fiorito S., Serafino A., Andreola F., Bernier P. Effects of fullerenes and single wall carbon nanotubes on murine and human macrophages // Carbon. – 2006. – Vol.44. – P.1100–1105. 69. Fujita K., Morimoto Y., Endoh S. et al. Identification of potential biomarkers from gene expression profiles in rat lungs intratracheally instilled with C(60) fullerenes // Toxicology. – 2010. – Vol.274, N.1–3. – P.34–41. 70. Gao J., Wang H.L., Shreve A. et al. Fullerene derivatives induce premature senescence: a new toxicity paradigm or novel biomedical applications // Toxicol Appl Pharmacol. – 2010. – Vol.244, N.2. – P.130–143. 166 71. Gharbi N., Pressac M., Hadchouel M. et al. [60]Fullerene is an in vivo powerful antioxidant with no acute or sub acute toxicity // Nano Letters. – 2005. – V.5. – P.2578– 2585. 72. Gelderman M.P., Simakova O., Clogston J.D. et al. Adverse effects of fullerenes on endothelial cells: fullerenol C60(OH)24 induced tissue factor and ICAM–I membrane expression and apoptosis in vitro // Int. J. Nanomedicine. – 2008. – N.3. – P. 59–68. 73. Gitsov I., Simonyan A., Wang L. et al Polymer-Assisted Biocatalysis: Unprecedented Enzymatic Oxidation of Fullerene in Aqueous Medium // J. Polymer Sci. Part A. – 2011. – Vol.50. – №1. – P.119-126. 74. Gmoshinski I.V., Khotimchenko S.A., Popov V.O. et al. Nanomaterials and nanotechnologies: methods of analysis and control // Russian Chemical Reviews. – 2013. – Vol.82, N.1. – P.48–76. 75. Golub A., Matyshevska O., Prylutska S. et al. Fullerenes immobilized at silica surface: topology, structure and bioactivity // J. Mol. Liquids. – 2003. – V.105, N.2–3. – P.141–147. 76. Grebowski J., Kazmierska P., Krokosz A. Fullerenols as a New Therapeutic Approach in Nanomedicine // Biomed Res Int. – 2013. – ID 751913. 77. Grębowski J., Kaźmierska P., Krokosz A. Fullerenol – properties and applications in biomedical sciences // Postepy Hig Med Dosw (Online). – 2013. – N.67. – P.859– 872. 78. Griendling K.K., Minieri C.A., Ollerenshaw J.D. et al. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells // Circ Res. – 1994. – Vol.74. – P.1141–1148. 79. Gupta S.K., Dhawan A., Shanker R. In silico approaches: prediction of biological targets for fullerene derivatives // J Biomed Nanotechnol. – 2011. – Vol.7, N.1. P.91–2. 80. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. Glutathione–S–transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J.Biol.Chem. – 1974. – Vol.249. – P.7130–7139. 167 81. Henry T.B., Menn F.M., Fleming J.T. et al. Attributing effects of aqueous C60 nano–aggregates to tetrahydrofuran decomposition products in larval zebrafish by assessment of gene expression // Environ. Health. Perspect. – 2007. – V.115, N.7. – P.1059–1065. 82. Hirsch A. Principles of Fullerene Reactivity // Topics in Current Chemistry. – Vol.199. – 1999. – P.1–65. 83. Hu Z., Guan W., Wang W. et al. Protective effect of a novel cystine C60 derivative on hydrogen peroxide–induced apoptosis in rat pheochromocytoma PC12 cells // Chem. Biol. Interact. – 2007. – V.167, N.2. – P.135–144. 84. Hu Z., Guan W., Wang W. et al. Synthesis of beta–alanine C60 derivative and its protective effect on hydrogen peroxide–induced apoptosis in rat pheochromocytoma cells // Cell Biol. Int. – 2007. – V.31, N.8. – P.798–804. 85. Huang Z.J., Haugland R.P., You W.M. et al. Phallotoxin and actin binding assay by fluorescence enhancement // Analytical biochemistry. – 1992. – Vol.200, N.1. – P. 199204. 86. Injac R., Boskovic M., Perse M. et al. Acute doxorubicin nephrotoxicity in rats with malignant neoplasm can be successfully treated with fullerenol C60(OH)24 via suppression of oxidative stress // Pharmacol. Rep. – 2008. – Vol.60, N.5. – P.742–749. 87. Injac R., Perse M., Cerne M. et al. Protective effects of fullerenol C60(OH)24 against doxorubicin–induced cardiotoxicity and hepatotoxicity in rats with colorectal cancer // Biomaterials. – 2009. – N.30. – P.1184–1196. 88. Injac R., Radic N., Govedarica B. et al. Bioapplication and activity of fullerenol C60(OH)24 // African J. of Biotechnology. – 2008. – Vol.7, N.25. – P.4940–4050. 89. Injac R., Radic N., Govedarica B. et al. Acute doxorubicin pulmotoxicity in rats with malignant neoplasm is effectively treated with fullerenol C60(OH)24 through inhibition of oxidative stress // Pharmacol. Rep. – 2009. – N.61. – P. 335–342. 90. Irie K., Nakamura Y., Ohigashi H. et al. Photocytotoxicity of water–soluble fullerene derivatives // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 1996. – V.60. – P.1359–1361. 168 91. Isaacson C.W., Usenko C.Y., Tanguay R.L., Field J.A. Quantification of fullerenes by LC/ESI–MS and its application to in vivo toxicity assays // Anal. Chem. – 2007. – V.79, N.23 – P.9091–9097. 92. Isakovic A., Markovic Z., Todorovic–Markovic B. et al. Distinct cytotoxic mechanisms of pristine versus hydroxylated fullerene // Toxicol. Sci. – 2006. – V.91, N.1. – P.173–83. 93. Jani P., Halbert G.W., Langridge J. et al. Nanoparticle uptake by the rat gastrointestinal mucosa: quantitation and particle size dependency // Pharm. Pharmacol. – 1990. – Vol.42. – P.821–826. 94. Johnston H.J., Hutchison G., Christensen F.M. et al. A review of the in vivo and in vitro toxicity of silver and gold particulates: particle attributes and biological mechanisms responsible for the observed toxicity. // Crit Rev Toxicol. – 2010. – Vol.40, N.4. – P.328–346. 95. Kamat J.P., Devasagayam T.P., Priyadarsini K.I. et al. Oxidative damage induced by the fullerene C60 on photosensitization in rat liver microsomes // Chem. Biol. Interact. – 1998. – V.114, N.3. – P.145–159. 96. Kapuscinski J. // Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. – 1995. – Vol.70, N.5. – P. 220-233. 97. Kato H., Shinohara N., Nakamura A. et al. Characterization of fullerene colloidal suspension in a cell culture medium for in vitro toxicity assessment // Mol Biosyst. – 2010. – Vol.6, N.7. – P.1238–1246. 98. Kato S., Aoshima H., Saitoh Y. et al. Biological safety of liposome–fullerene consisting of hydrogenated lecithin, glycine soja sterols, and fullerene–C60 upon photocytotoxicity and bacterial reverse mutagenicity // Toxicol. Ind. Health. – 2009. – Vol.25, N.3.– P.197–203. 99. Kato S., Aoshima H, Saitoh Y. et al. Defensive effects of fullerene–C60 dissolved in squalane against the 2,4–nonadienal–induced cell injury in human skin keratinocytes HaCaT and wrinkle formation in 3D–human skin tissue model // J Biomed Nanotechnol. – 2010. – Vol.6, N.1. – P.52–58. 169 100. Kato S., Aoshima H., Saitoh Y. et al. Fullerene–C60/liposome complex: Defensive effects against UVA–induced damages in skin structure, nucleus and collagen type I/IV fibrils, and the permeability into human skin tissue // J Photochem Photobiol B. – 2010. – Vol.98, N.1. – P.99–105 101. Kato S., Aoshima H., Saitoh Y. et al. Highly hydroxylated or gamma–cyclodextrin– bicapped water–soluble derivative of fullerene: the antioxidant ability assessed by electron spin resonance method and beta–carotene bleaching assay // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2009. – Vol. 19, N.18. – P.5293–5296. 102. Kato S., Taira H., Aoshima H. et al. Clinical evaluation of fullerene–C60 dissolved in squalane for anti–wrinkle cosmetics // J Nanosci Nanotechnol. – 2010 – Vol.10, N.10. – P.6769–74. 103. Kim K.T., Jang M.H., Kim J.Y. et al. Embryonic toxicity changes of organic nanomaterials in the presence of natural organic matter // Sci Total Environ. – 2012. – Vol.426. – P.423–9. 104. Klaper R., Crago J., Barr J. et al. Toxicity biomarker expression in daphnids exposed to manufactured nanoparticles: changes in toxicity with functionalization // Environ. Pollut. – 2009. – Vol.157, N.4. – P.1152–1156. 105. Kong L., Zepp R.G. Production and consumption of reactive oxygen species by fullerenes // Environ Toxicol Chem. – 2012. – Vol.31, N.1. – P.136–143. 106. Koni P.A., Joshi S.K., Temann U.A. et al. Conditional vascular cell adhesion molecule 1 deletion in mice: impaired lymphocyte migration to bone marrow // The Journal of experimental medicine. – 2001. – V.193. – N.6. – P.741–754. 107. Kraszewski S., Tarek M., Treptow W. et al. Affinity of C(60) neat fullerenes with membrane proteins: a computational study on potassium channels // ACS Nano. – 2010. – Vol.4, N.7. – P.4158–4164. 108. Kuroda Y., Nozawa H., Ogoshi H. Kinetic behavior of solubilization of C60, into water by complexation with γ–cyclodextrin // Chem. Lett. – 1995. – P.47–48. 109. Kutner W., Boulas P., Kadish K.M. Solubilization of buckminsterfullerene, C60, in water and some polar organic solvents by cytodextrin inclusion chemistry // J. Electrochem. Soc. – 1992. – V.139. – P.243. 170 110. Labuzek K., Gorki K., Jaroszek H. et al. Highly Organized Nanostructures for Brain Drug Delivery – New Hope or Just a Fad? // CNS Neurol Disord Drug Targets. – 2013 Aug. 27 [Epub ahead of print]. 111. Lake B.G. Preparation and characterization of microsomal fractions for studies on xenobiotic metabolism / Snell K., Mullock B.–eds.–Biochem.Toxicol.: Oxford, UK: IRL Press. – P. 183– 215. 112. Landa P., Vankova R., Andrlova J. et al. Nanoparticle–specific changes in Arabidopsis thaliana gene expression after exposure to ZnO, TiO2, and fullerene soot. // J. Hazard Mater. – 2012. – Vol.30, N.241– 242. – P.55–62 113. Lin A.M., Chyi B.Y., Wang S.D. et al. Carboxyfullerene prevents iron–induced oxidative stress in rat brain // J. Neurochem. – 1999. – V.72, N.4. – P.1634–1640. 114. Liu Y., Jiao F., Qiu Y. et al. The effect of Gd@C82(OH)22 nanoparticles on the release of Th1/Th2 cytokines and induction of TNF–alpha mediated cellular immunity // Biomaterials. – 2009. – Vol.30, N.23– 24. – P.3934–3945. 115. Lovern S.B., Klaper R. Daphnia magna mortality when exposed to titanium dioxide and fullerene (C60) nanoparticles // Environ Toxicol. Chem. – 2006. – V.25, N.4. – P.1132–1137. 116. Ma X., Bouchard D. Formation of aqueous suspensions of fullerenes // Environ. Sci. Technol. – 2009 . – Vol.43, N.2.– P.330–336. 117. Maeda R., Noiri E., Isobe H. et al. A water–soluble fullerene vesicle alleviates angiotensin II–induced oxidative stress in human umbilical venous endothelial cells // Hypertens. Res. – 2008. – V.31, N.1. – P.141–151. 118. McQualter J.L., Brouard N., Williams B. et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction // Stem cells. – 2009. – V.27. – N.3. – P.623-633. 119. Medrek M., Pluciński F., Mazurek A.P. Endohedral complexes of fullerene C60 with small convalent molecules (H2O, NH3, H2, 2H2, 3H2, 4H2, O2, O3) in the context of potential drug transporter system // Acta Pol. Pharm. – 2013. – Vol.70, N.4. – P.659–65. 171 120. Michalitsch R., Kallinger C., Verbandt Y. et al. The Fullerene Patent Landscape in Europe // Nanotechnology Law & Business. – 2008. – Vol.5, N.1. – P.85–94. 121. Montañez M.I., Ruiz–Sanchez A.J., Perez–Inestrosa E. A perspective of nanotechnology in hypersensitivity reactions including drug allergy // Curr Opin Allergy Clin. Immunol. – 2010. – Vol.10, N.4. – P.297–302. 122. Moriguchi Т., Yano K., Hokari S., Sonoda M. Effect of repeated application of C60 combined with UVA radiation onto hairless mouse back skin // Full. Sci. Technol. – 1999. – V.7. – P.195–202. 123. Morimoto Y., Hirohashi M., Ogami A. et al. Inflammogenic effect of well– characterized fullerenes in inhalation and intratracheal instillation studies // Part Fibre Toxicol. – 2010. – Vol.7, N.4. 124. Morton D.B., Abbot D., Barelay R. et al. Removal of blood from laboratory mammals and birds // Laboratory animals. – 1993. – Vol. 27. – P.1–22. 125. Moussa F., Chretien P., Dubois P. et al. The influence of C60 powders on cultured human leukocytes // Full. Sci. Techno. – 1995. – V.3. – P.333–342. 126. Moussa F., Chretien P., Pressac M., et al. Preliminary study of the influence of cubic С60 on cultured human monocytes: lack of interleikin–1B secretion // Full. Sci. Technol. – 1997. – V.5. – P.503–510. 127. Moussa F., Pressac M., Chretien P. et al. C60 fullerene toxicity: preliminary account of an in vivo study // Abstracts of Joint International Meeting the Electrochemical Society and the International Society of Electrochemistry. – 1997. – V.97, N.2. – P.1589. 128. Moussa F., Pressac M., Genin E. et al. Quantitative analysis of C60 fullerene in blood and tissues by high– performance liquid chromatography with photodiode–array and mass spectrometric detection // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. – 1997. – Vol. 696, N.1. – P.153–159. 129. Moussa F., Roux S., Pressac M. et al. In vivo reaction between [60] fullerene and vitamin A in mouse liver // New J. Chem. – 1998. – Vol.22. – P.989–992. 172 130. Moussa F., Trivin F., Ceolin R. et al. Early effects of C60 administration in Swiss mice: a preliminary account for in vivo C60 toxicity // Full. Sci. Technol. – 1996. – V.4. – P.21–29. 131. Mrđanović J., Solajić S., Bogdanović V. et al. Effects of fullerenol C60(OH)24 on the frequency of micronuclei and chromosome aberrations in CHO–K1 cells // Mutat. Res. – 2009. – Vol.680, N.1– 2. – P.25–30. 132. Mroz P., Pawlak A., Satti M. et al. Functionalized fullerenes mediate photodynamic killing of cancer cells: Type I versus Type II photochemical mechanism // Free Radic. Biol. Med. – 2007. – V.43, N.5. – P.711–719. 133. Murakami M, Hyodo S, Fujikawa Y et al. Photoprotective effects of inclusion complexes of fullerenes with polyvinylpyrrolidone // Photodermatol Photoimmunol Photomed. – 2013. – V.29, N.4. – P.196–203. 134. Navarro D.A., Kookana R.S., Kirby J.K. Behaviour of fullerenes (C60) in the terrestrial environment: potential release from biosolids-amended soils // J Hazard Mater. – 2013. – Vol.262. – P.496–503. 135. Nelson M.A., Domann F.E., Bowden G.T. et al. Effects of acute and subchronic exposure of topically applied fullerene extracts on the mouse skin // Toxicol. Ind. Health. – 1993. – V.9, N.4. – P.623–630. 136. Newman P.J. The biology of PECAM-1 // The Journal of clinical investigation. – 1997. – V.99. – N.1. – P.3-8. 137. Nikolić N., Vranješ– Ðurić S., Janković D. et al. Preparation and biodistribution of radiolabeled fullerene C60 nanocrystals // Nanotechnology. – 2009. – Vol. 20, N.38. – P.385102. 138. Oberdörster E. Manufactured nanomaterials (fullerenes, C60) induce oxidative stress in the brain of juvenile largemouth bass // Environ. Health. Perspect. – 2004. – V.112, N.10. – P.1058–1062. 139. Oberdörster E., Zhu S., Blickley T.M. et al. Ecotoxicology of carbon–based engineered nanoparticles: Effects of fullerene (C60) on aquatic organisms // Toxicology of Carbon Nanomaterials. – 2006. – Vol.44, N.6. – P.1112–1120. 173 140. Oberdörster G., Sharp Z., Elder A.P. et al. Translocation of inhaled ultrafine particles to the brain // Inhal. Toxicol. – 2004. – V.16, N.4. – P.437–445. 141. Omura T., Sato R. The carbon monoxide binding pigment of liver microsomes. Evidence for its hemoprotein nature // Biol.Chem. – Vol. 239. – P. 2370–2377. 142. Panina L.K., Kurochkin V.E., Bogomolova E.V. et al. Biotransformation of Fullerenes // Doklady Biological Sciences. – 1997. – Vol.357. – N.2. – P.530–532. 143. Park E.J., Kim H., Kim Y. et al. Carbon fullerenes (C60s) can induce inflammatory responses in the lung of mice. // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2010. – Vol.244, N.2. – P.226–233. 144. Piotrovsky L.B. Biological activity of pristine fullerene C60 // Carbon Nanotech. / Ed. L. Dai: Elsevier. – 2006. – P.235–253. 145. Porter A., Gass M., Muller K. et al. Visualizing the uptake of C60 to the cytoplasm and nucleus of human monocytederived macrophage cellsusing energy– filtered transmissionelectron microscopy and electrontomography // Environ. Sci. Technol. – 2007. – V.41, N.8. – Р.3012–3017. 146. Porter A.E., Muller K., Skepper J. et al. Uptake of C60 by human monocyte macrophages, its localization and implications for toxicity: studied by high resolution electron microscopy and electron tomography // Acta. Biomater. – 2006. – V.2, N.4. – P.409–419. 147. Popov A.A., Shangfeng Y., Dunsch L.. Endohedral Fullerenes // Chem. Rev. – 2013. – 113(8). – P.5989–6113 148. Priyadarsini K.I., Monan H., Tyagi A.K., Mittai J.P. Inclusion complex of γ– cyclodextrin–C60: formation, characterization, and photo–physical properties in aqueous solution // J. Phys. Chem. – 1994. – V.98. – P.4756–4759. 149. Pycke B.F., Benn T.M., Herckes P. et al. Strategies for quantifying C(60) fullerenes in environmental and biological samples and implications for studies in environmental health and ecotoxicology // Trends Analyt. Chem. – 2011. – Vol.30, N.1. – P.44–57. 150. Qiao R., Roberts A.P., Mount A.S. et al. Translocation of C60 and its derivatives across a lipid bilayer // Nano Lett. – 2007. – V.7, N.3. – P.614–619. 174 151. Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. AIN–93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN–76A rodent diet // J Nutr. – 1993. – Vol.123, N.11. – P.1939–51. 152. Rieux A., Fievez V., Théate I. et al. An improved in vitro model of human intestinal follicle-associated epithelium to study nanoparticle transport by M cells // Eur. J. Pharm. Sci. – 2007. – Vol.30, N.5. – P.380– 391. 153. Richmond R. C., Gibson U.J. Fullerene coated surfaces and uses thereof. – US Patent № 5.310.669. – 1994. 154. Roberts J.E., Wielgus A.R., Boyes W.K. et al. Phototoxicity and cytotoxicity of fullerol in human lens epithelial cells // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2008. – V.228, N.1. – P.49–58. 155. Rud Y., Buchatskyy L., Prylutskyy Y. et al. Using C60 fullerenes for photodynamic inactivation of mosquito iridescent viruses // J Enzyme Inhib Med Chem. – 2012. – Vol.27, N.4. – P.614–617. 156. Saitoh Y., Miyanishi A., Mizuno H. et al. Super-highly hydroxylated fullerene derivative protects human keratinocytes from UV-induced cell injuries together with the decreases in intracellular ROS generation and DNA damages // J. Photochem. Photobiol. – 2011. – Vol.102, N.1. – P.69–76. 157. Sakai A., Yamakoshi Y.N., Miyata N. The effects of fullerenes on the initiation and promotion stages of BALB/3T3 cell transformation // Full. Sci. Technol. – 1995. – V.3. – P.377–388. 158. Sayes C.M., Gobin A.M., Ausman K.D. et al. Nano–C60 cytotoxicity is due to lipid peroxidation // Biomaterials. – 2005. – V.26, N.36. – P.7587–7595. 159. Sayes C.M., Marchione A.A., Reed K.L., Warheit D.B. Comparative pulmonary toxicity assessments of C60 water suspensions in rats: few differences in fullerene toxicity in vivo in contrast to in vitro profiles // Nano. Lett. – 2007. – V.7, N.8. – P.2399–2406. 175 160. Sayes C.M., Reed K.L., Warheit D.B. Assessing toxicity of fine and nanoparticles: comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles // Toxicol. Sci. – 2007. – V.97, N.1. – P.163–180. 161. Scrivens W.A., Tour J.M., Creek K.E., Pirisi L. Synthesis of 14C–labeled C60, its suspension in water and its uptake by human keratinocytes // J. Am. Chem. Soc. – 1994. – V.116. – P.4517–4518. 162. Semenov K.N., Charykov N.A., Keskinov V.N. Fullerenol synthesis and identification. Properties of the fullerenol water solutions // J. Chem. Eng. Data. – 2011. – Vol.56, N.2. – P.230–239. 163. Sera N., Tokiwa H., Miyata N. Mutagenicity of the fullerene C60–generated singlet oxygen dependent formation of lipid peroxides // Carcinogenesis. – 1996. – V.17, N.10. – P.2163–2169. 164. Silva G.A. Neuroscience nanotechnology: progress, opportunities and challenges // Nat. Rev. Neurosci.– 2006. – N.7. – P. 65–74. 165. Silva G.A. Nanotechnology approaches for the regeneration and neuroprotection of the central nervous system // Surg. Neurol. – 2005. – N.63. – P.301–306. 166. Shoji M., Takahashi E., Hatakeyama D. et al. Anti–Influenza Activity of C60 Fullerene Derivatives // PLoS ONE. – 2013. – Vol.8, N.6. – P.e66337. 167. Spohn P., Hirsch C., Hasler F. et al. C60 fullerene: a powerful antioxidant or a damaging agent? The importance of an in–depth material characterization prior to toxicity assays // Environ. Pollut. – 2009. – Vol.157, N.4. – P.1134–1139. 168. Spurlin T.A., Gewirth A.A. Effect of C60 on solid supported lipid bilayers // Nano Lett. – 2007. – V.7, N.2. – P.531–535. 169. Srdjenovic B., Milic–Torres V., Grujic N. et al. // Toxicol. Mech. Methods. – 2010. – Vol. 20, N.6. – P.298–305. 170. Steffensen I.L., Alexander J., Binderup M.L. et al. Opinion of the Panel on Food Additives, Flavourings, Processing Aids, Materials in Contact with Food and Cosmetics of the Norwegian Scientific Committee for Food Safety. Evaluation of an application to use fullerene C60 as a food additive. [Электронный ресурс] 17.12.2010. Doc. no.: 10– 176 406–5 final. ISBN: 978–82–8259–010–5. URL: http://www.vkm.no/dav/732f564c58.pdf 171. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K. et al. Passage of cow’s milk proteins in breast milk // Clin.Allergy. – 1984. – Vol.14, N6. – P.533–535. 172. Su Y., Xu J.Y., Shen P. et al. Cellular uptake and cytotoxic evaluation of fullerenol in different cell lines // Toxicology. – 2010. – Vol.269, N.2–3. – P.155–159. 173. Takahashi M., Kato H., Doi Y. et al. Sub–acute oral toxicity study with fullerene C60 in rats // The Journal of Toxicological Sciences. – 2012. – Vol.37, N.2. – P.353– 361. 174. Theriot C.A., Casey R.C., Moore V.C. et al. Dendro[C(60)]fullerene DF–1 provides radioprotection to radiosensitive mammalian cells // Radiat Environ Biophys. – 2010. – Vol.49, N.3. – P.437–445. 175. Trajković S., Dobrić S., Jaćević V. et al. Tissue–protective effects of fullerenol C60(OH)24 and amifostine in irradiated rats // Colloids. Surf B. Biointerfaces. – 2007. – V.58, N.1. – P.39–43. 176. Tsai M.C., Chen Y.H.., Chiang L.Y. Polyhydroxylated C60, fullerenol, a novel free–radical trapper, prevented hydrogen peroxide– and cumene hydroperoxide– elicited changes in rat hippocampus in vitro // J. Pharm. Pharmacol. – 1997. – V.49, N.4. – P.438–445. 177. Tsuchiya T., Oguri I., Yamakoshi Y.N., Miyata N. Novel harmful effects of [60]fullerene on mouse embryos in vitro and in vivo // FEBS Lett. – 1996. – V.393, N.1. – P.139–145. 178. Tsuchiya T., Yamakoshi Y.N., Miyata N. A novel promoting action of fullerene C60 on the chondrogenesis in rat embryonic limd bud cell culture system // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1995. – V.206. – P.885–894. 179. Turner J.R. Molecular Basis of Epithelial Barrier Regulation: From Basic Mechanisms to Clinical Application // The American Journal of Pathology. – 2006. – V.169, N.6. – P.1901-1909. 180. Ueng T.H., Kang J.J., Wang H.W. et al. Suppression of microsomal cytochrome P450–dependent monooxygenases and mitochondrial oxidative phosphorylation by 177 fullerenol, a polyhydroxylated fullerene C60 // Toxicol. Lett. – 1997. – V.93, N.1. – P.29–37. 181. Usenko C.Y., Harper S.L., Tanguay R.L. Fullerene C60 exposure elicits an oxidative stress response in embryonic зебрафиш // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2008. – V.229, N.1. – P.44–55. 182. Usenko C.Y., Harper S.L., Tanguay R.L. In vivo evaluation of carbon fullerene toxicity using embryonic zebrafish // Carbon N.Y. – 2007. – V.45, N.9. – P.1891–1898. 183. Volkheimer G. Persorption of particles: physiology and pharmacology // Adv. Pharmacol. Chemother. – 1977. – Vol.14. – P.163–187. 184. Wang H.M., Wenz G. Molecular solubilization of fullerene C60 in water by γ– cyclodextrin thioethers // Beilstein J. Org. Chem. – 2012. – Vol.8. – P.1644–1651. 185. Wang N., Bao X., Yang C. et al. Design and synthesis of indole–substituted fullerene derivatives with different side groups for organic photovoltaic devices // Organic Electronics. – 2013. – Vol.14, N.2. – P.682–692. 186. Wielgus A.R., Zhao B., Chignell C.F. et al. Phototoxicity and cytotoxicity of fullerol in human retinal pigment epithelial cells // Toxicol Appl Pharmacol. – 2010. – Vol.242, N.1. – P.79–90. 187. Wiewrodt R., Thomas A.P., Cipelletti L. et al. Size-dependent intracellular immunotargeting of therapeutic cargoes into endothelial cells // Blood. – 2002. – V.99. – N.3. – P.912-922. 188. Wyder L., Vitaliti A., Schneider H. et al. Increased Expression of H/T-Cadherin in Tumor-penetrating Blood Vessels // Cancer Research. – 2000. – V.60. – N.17. – P.4682-4688. 189. Xia X.R., Monteiro– Riviere N.A., Riviere J.E. Intrinsic biological property of colloidal fullerene nanoparticles (nC60): lack of lethality after high dose exposure to human epidermal and bacterial cells // Toxicol Lett. – 2010. – Vol.197, N.2. – P.128– 134. 190. Xiao L., Takada H., Maeda K. et al. Antioxidant effects of water–soluble fullerene derivatives against ultraviolet ray or peroxylipid through their action of scavenging the 178 reactive oxygen species in human skin keratinocytes // Biomed. Pharmacother. – 2005. – V.59. – P.351–358. 191. Xu X., Wang X., Li Y. et al. A large–scale association study for nanoparticle C60 uncovers mechanisms of nanotoxicity disrupting the native conformations of DNA/RNA // Nucleic Acids Res. – 2012. – Vol. 40, N.16. P.7622–32. 192. Yamago S., Tokuyama H., Nakamura E. et al. In vivo biological behavior of a water– miscible fullerene: 14C labeling, absorption, distribution, excretion and acute toxicity // Chem. Biol. – 1995. – V.2, N.6. – P.385–389. 193. Yamawaki H., Iwai N. Cytotoxicity of water–soluble fullerene in vascular endothelial cells // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. – 2006. – V.290, N.6. – P.1495–1502. 194. Yamakoshi Y.N., Yagami Т., Fukuhara K. et al. Solubilization of fullerenes into water with polyvinyl–pyrrolidone applicable to biological tests // J. Chem. Soc. – 1994. – P.517–518. 195. Yang X., Ebrahimi A., Li J. et al. Fullerene–biomolecule conjugates and their biomedicinal applications // Int J Nanomedicine. – 2014. – Vol.9. – P.77–92. 196. Yin J.J., Lao F., Meng J. et al. Inhibition of tumor growth by endohedral metallofullerenol nanoparticles optimized as reactive oxygen species scavenger // Mol. Pharmacol. – 2008. – N. 74. – P.1132–1140. 197. Yizhak M., Smith A.L., Korobov M.V. et al. Solubility of C60 Fullerene // J. Phys. Chem. – 2001. – Vol.105. – N.13. – P.2499–2506. 198. Yue F.N., Luo S.M., Zhang C.D. Degradation and transformation of engineering carbon nanomaterials in the environment: A review // Ying Yong Sheng Tai Xue Bao. – 2013. – Vol.24, N.2. – P.589–96. 199. Yumita N., Iwase Y., Imaizumi T. et al. Sonodynamically–induced anticancer effects by functionalized fullerenes. // Anticancer Res. – 2013. – Vol. 33, N.8. – P.3145–51. 200. Zha Y.Y., Yang B., Tang M.L. et al. Concentration–dependent effects of fullerenol on cultured hippocampal neuron viability. // Int. J. Nanomedicine. – 2012. – Vol.7. – P.3099–109. 179 201. Zhang B., Cho M., Fortner J.D. et al. Delineating oxidative processes of aqueous C60 preparations: role of THF peroxide // Environ. Sci. Technol. – 2009. – Vol.43, N.1. – P.108–113. 202. Zhang D.D., Liang Q., Chen J.W. et al. Studies of γ–cyclodextrin inclusion complexes with C60. Supramolec // Chem. – 1994. – V.3. – P.235–239. 203. Zhao B., He Y.Y., Bilski P.J. et al. Pristine (C60) and hydroxylated [C60(OH)24] fullerene phototoxicity towards HaCaT keratinocytes: type I vs type II mechanisms // Chem. Res. Toxicol. – 2008. – V.21, N.5. – P.1056–1063. 204. Zhao B., He Y.Y., Chignell C.F. et al. Difference in phototoxicity of cyclodextrin complexed fullerene [(gamma–CyD)2/C60] and its aggregated derivatives toward human lens epithelial cells //Chem. Res. Toxicol. – 2009. – Vol.22, N.4. – P.660–667. 205. Zhao X., Striolo A., Cummings P. C60 binds to and deforms nucleotides // Biophys. J. – 2005. – V.89, N.6. – P.3856–3862. 206. Zhao Q.F., Zhu Y., Ran T.C. et al. Cytotoxicity of fullerenols on Tetrahymena pyriformis // Nucl. Sci. Techniq. – 2006. – N.17. – P.280–284. 207. Zhu S., Oberdörster E., Haasch M.L. Toxicity of an engineered nanoparticle (fullerene, C60) in two aquatic species, Daphnia and fathead minnow // Mar. Environ. Res. – 2006. – 62 Suppl. – P.S5–9. 208. Zhu X.S., Zhu L., Lang Y.P. et al. Oxidative damages of long–term exposure to low level fullerenes (C60) in Carassius auratus // Huan. Jing. Ke. Xue. – 2008. – Vol. 29, N.4. – P.855–861. 209. Zhu X., Zhu L., Lang Y. et al. Oxidative stress and growth inhibition in the freshwater fish Carassius auratus induced by chronic exposure to sublethal fullerene (C60) aggregates // Environ. Toxicol. Chem. – 2008. – Vol. 27, N.9. – P.1979–1985. 210. Zhu X., Zhu L., Li Y. et al. Developmental toxicity in zebrafish (Danio rerio) embryos after exposure to manufactured nanomaterials: buckminsterfullerene aggregates (nC60) and fullerol // Environ Toxicol. Chem. – 2007. – Vol. 26, N.5. – P.976–979.