22_Âèäèìààáñîðá. ñïåêòð

Электромагнитные колебания
Длина волны
λ
E
E=hν
H
E=hc/λ
H
E
Направление
распространения
Длина волны в Å
1
10
Рентгеновское
излучение
102
103
УФ- и видимое
излучение
104
105
Инфракрасное
излучение
106
107
Микроволновое Радиоволны
излучение
Уменьшение энергии падающего излучения
Электронные переходы
Абсорбционная
спектроскопия
Колебательные и вращательные
Инфракрасная
спектроскопия и рассеяние
Мандельштама-Рамана
Ядерные
ЯМР
1
Электронные и колебательные переходы в атоме или молекуле
УФ-излучение
ИФ-излучение
hc

E2  E1
Диаграмма типичных уровней энергии, показывающая основное состояние и
первое возбужденное состояние в атоме или молекуле. Колебательные уровни
основного состояния показаны тонкими горизонтальными линиями. Переход между
двумя колебательными уровнями показан короткой стрелкой. Возможный переход
между нижним уровнем основного состояния и четвертым уровнем первого
возбужденного состояния показан длинной стрелкой.
2
Закон Бера-Ламберта
Величина поглощения при данной длине волны характеризуется молярным
коэффициентом экстинкции ε. Если свет интенсивности I0 проходит через
раствор толщины d и молярной концентрации C, то интенсивность I
прошедшего света подчиняется закону Бера-Ламберта :
I  I 010 dC
OП = 2
I 
log 10    dC
 I0 
I 
log 10    OП (d  1)
 I0 
где ε- молярный коэффициент экстинкции.
Поглощение измеряется в % (100 I/I0), но
чаще всего в поглощении A, (log I/I0). Когда
d = 1 cм, A называется оптической
плотностью ОП, где  есть длина волны ,
при которой производятся измерения.
Оптическая плотность равна ε× C
3
N.B. Обозначение концентрации как С = OП/мл не имеет физического смысла
Применение абсорбционной спектроскопии для измерения концентрации
белков и нуклеиновых кислот
λ=280 nm
Поглощение ближнего ультрафиолета
для ароматических аминокислот в
водных растворах при pH 6. Отметьте,
по оси ординат молярное поглощение
отложено в логарифмической шкале.
λ=258 nm
Поглощение ближнего ультрафиолета для
пуриновых и пиримидиновых оснований
в водных растворах при pH 7. Отметьте,
по оси ординат молярное поглощение
отложено линейной шкале.
Примеры, оптическое поглощение для tRNA ОП258 = 1 соответствует концентрации 44 г/мл;
oптическое поглощение для рибосом ОП258 = 1 соответствует концентрации 66 г/мл. 4
Применение абсорбционной спектроскопии для определения
концентрации белков.
0.6
S6
0.4
S13
0.18
0.3
0.38
Absorbance
0.5
Пример белка в растворе,
не образующего истинного
молекулярный раствор
Absorbance
Пример белка в растворе,
образующего истинный
молекулярный раствор
0.7
0.2
0.1
0.0
24 0
26 0
28 0
30 0
32 0
Wavelength (nm)
34 0
36 0
24 0
26 0
28 0
30 0
32 0
34 0
36 0
Wavelength (nm)
Отношение оптических плотностей при 280 и 260 нм
5
Применение абсорбционной спектроскопии для определения
конформационных переходов в ДНК.
Оптическая плотность трех образцов
ДНК как функция температуры: E.
Coli (50% GC) при ионной силе 0.01
и 0.1. Pseudomonas aeroginosa DNA
(68% GC). Отметьте, что
температура перехода (денатурации)
зависит как от ионной силы, так и от
содержания ГЦ пар.
Кривая плавления раствора ДНК фага Т7. При прогревании
раствора ДНК до температуры денатурации с последующем
охлаждением кривая обратима. При прогревании раствора ДНК
выше температуры денатурации кривая необратима. Поглощение
раствора падает до величины 1.12 и ДНК выпадает в осадок.. Но
если эти повысить температуру (до 76оС), и выдержать ДНК при
высокой ионной силе (от 0.5 до 1.0) в течение нескольких часов, то
ДНК ренатурирует и возвращается к исходной двухцепочечной
структуре. Такой процесс называется отжигом ДНК. 6