Современные микробиологические и молекулярно

Современные микробиологические и
молекулярно-генетические методы
диагностики туберкулеза
Проф. Л.Н. Черноусова
ФГБНУ «ЦНИИТ», Москва
• В условиях напряженной эпидемической
ситуации по туберкулезу в РФ остро стоит
проблема быстрой и качественной диагностики
туберкулеза.
Несмотря на снижение заболеваемости и
смертности от туберкулеза , регистрируется
увеличение числа случаев МЛУ ТБ.
67 СЕССИЯ ВСЕМИРНОЙ АССАМБЛЕИ
ЗДРАВООХРАНЕНИЯ май 2014 г.
определила Глобальную стратегию в области
профилактики, лечения и борьбы с туберкулезом
на период после 2015 г.
БАЗОВЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ
включают комплексное лечение и профилактику,
ориентированные на пациента, одним из основных
компонентов является ранняя диагностика
туберкулеза, включающая всеобщее тестирование
на лекарственную чувствительность МБТ
Культуральные методы
Рекомендованы ВОЗ
•
•
Выявление МБТ
Идентификация
Биохимические тесты
•
Определение ЛЧ
МБТ
•
•
Определение ЛЧ
НТМ
Культивирование на плотных
питательных средах
Культивирование на жидкой
питательной среде в
автоматизированной системе учета
роста микроорганизмов BACTEC MGIT
960 (BD, США)
Метод абсолютных концентраций на
плотной питательной среде
Левенштейна-Йенсена
Модифицированный метод пропорций
на жидкой питательной среде в
системе BACTEC MGIT 960 (BD, США)
Определение МИК в формате 96луночного планшета – панели
RAPMYCO и SLOWMYCO (TREK
Diagnostic Systems, Magellan
Biosciences Sensititre, Англия)
Применяются в РФ
Те же
Те же
Те же
Те же
Молекулярно-биологические тест-системы
Рекомендованы ВОЗ
Выявление МБТ
Идентификация
Определение ЛУ
к ПТП
1 ряда
Определение ЛУ
к ПТП
2 ряда
Применяются в РФ
•
•
Xpert MTB/RIF (Cepheid, США)
Изотермальная ПЦР «TB-LAMP»
(Eiken Chemical Co, Япония)
•
Иммунохроматографический
ID-тест (BD, США)
ДНК-стрипы GenoType®
Mycobacterium CM/AS,
GenoType Mycobacteria Direct
(HainLifescience, Германия)
Те же
•
•
Xpert MTB/RIF
ДНК-стрипы
-Genotype MTBDRplus
(HainLifescience,Германия)
R иH
- INNO-LiPA Rif.TB
(Innogenetics, Бельгия)
• Xpert MTB/RIF
• ДНК-стрипы
Genotype MTBDRplus
(HainLifescience,Германия)
• ТБ-биочип-МДР (Биочип-ИМБ, РФ)
• Амплитуб-МЛУ-РВ (Синтол, РФ)
R иH
•
ДНК-стрипы Genotype MTBDRsl
(Hain Lifescience, Германия)
все ПТП 2 ряда
•
•
•
•
•
Xpert MTB/RIF (Cepheid, США)
ПЦР в режиме реального времени
(Синтол, РФ)
ДНК-стрипы Genotype MTBDRsl
(Hain Lifescience, Германия)
ТБ-биочип-2 (Биочип-ИМБ, РФ)
Fq
Алгоритм микробиологической диагностики туберкулеза в ЦНИИТ
Диагностический материал
Выделение ДНК и постановка ПЦР(*)
‒
Микроскопия
ППС(**)
BACTEC MGIT 960
+
‒
+
МБТК
Определение ЛУ МГМ
- ДНК-стрипы
- АС-ПЦР
- Биочипы
Посев
Микроскопия
Ц/Н
+
(***)
Идентификация
- ID-test
+
МБТК
Определение ЛЧ
BACTEC MGIT 960
(ПТП 1 и 2 ряда)
ППС
(циклосерин)
‒
Посев на
кровяной агар
‒
НТМБ
Идентификация до вида
(GenoType® Mycobacterium CM/AS)
Определение ЛЧ НТМБ
(TREK Diagnostic Systems)
(*) для экспресс-диагностики МЛУ-ТБ возможна также одновременная постановка теста GeneXpert
(**) при отсутствии роста культуры в системе BACTEC MGIT 960, но положительном росте на ППС,
дальнейшая работа проводится с полученной на ППС культурой по той же схеме, что и для
культуры, полученной с BACTEC MGIT 960
(***) при невозможности постановки прямого теста из-за нехватки ДНК
Ускоренные методы
выявления возбудителя
Культуральные
Культивирование на жидких
питательных средах
с автоматической регистрацией
роста культуры
Bactec MGIT 960 7-14 дней
Молекулярногенетические
Выявление ДНК возбудителя
в диагностическом материале
ПЦР 1-2 дня
________________________________________________________________________
BACTEC™ MGIT™ 960
Автоматизированная система предназначена для
выявления микобактерий и определения
лекарственной чувствительности МБТ
1. Постоянный автоматический мониторинг роста
2.Автоматический контроль качества.
3.Производительность (до 8000 тестов в год)
Определение лекарственной чувствительности в
автоматизированной системе BACTEC MGIT 960
• автоматический мониторинг роста
микобактерий
• при достижении в контрольной
пробирке значения единиц роста
(growth units; GU=400) система
сообщает о завершении теста
• культура считается устойчивой,
если значение единиц роста
более 100.
Максимальное время исследования
На чувствительность к SIRE – 14 суток
набор SIRE Kit:
на 40 определений ЛЧ
На чувствительность к PZA – 21 сутки
набор PZA Kit:
на 50 определений ЛЧ
иммунохроматографический тест
Метод дифференциации МБТ от НТМБ
• Иммунохроматографический тест (ID-test)
отличается простотой выполнения и
обеспечивает идентификацию за 15 минут.
Источники заражения НТМБ
Идентификация НТМБ до вида (ДНК-стрипы
GenoType CM/AS, HAIN Lifescience, Germany)
•
GenoType® Mycobacterium CM
M. avium ssp.,
M. chelonae,
M. abscessus,
M. fortuitum,
M. gordonae,
M. intracellulare,
M. scrofulaceum,
M. interjectum,
M. kansasii,
M. malmoense,
M. peregrinum,
M. marinum/ M. ulcerans,
M. xenopi
M. tuberculosis complex
Время получения результата 1-2 дня
•
GenoType® Mycobacterium AS
M. simiae,
M. mucogenicum,
M. goodii,
M. celatum,
M. smegmatis,
M. genavense,
M. lentiflavum,
M. heckeshornense,
M. szulgai,
M. intermedium,
M. phlei,
M. haemophilum,
M. kansasii,
M. ulcerans,
M. gastri,
M. asiaticum
M. shimoidei
Результаты видовой идентификации 141 культуры НТМБ,
выделенных из диагностического материала больных, проходивших
обследование на туберкулез в ЦНИИТ в период с 2011 по 2014 гг
Группа
Вид
M.avium
M.intracellulare
M.gordonae
M.kansasii
Медленнорастущие
M.xenopi
M.malmoence
M.interjectum
M.intermedium
M.simae
Mycobacterium sp.
M.chelonae
M.abscessus
Быстрорастущие
M.fortuitum
M.peregrinum
M.smegmatis
Нетуберкулезные микобактерии резистентны
к большинству противотуберкулезных препаратов.
M.intracellulare
M.gordonae
M.kansasii
M.xenopi
1. Амикацин
2. Ципрофлоксацин
3. Кларитромицин
4. Доксициклин
5. Этамбутол
6. Этионамид
7. Изониазид
8. Линезолид
9. Моксифлоксацин
10. Рифабутин
11. Рифампицин
12. Стрептомицин
13. Триметоприм/ сульфаметоксазол
M.avium
МИК(90) в отношении:
>64
>16
8
>16
>16
>20
>8
64
8
1
>8
>64
>8
32
>16
2
>16
8
>20
>8
32
8
0,5
8
>64
>8
32
16
2
>16
>16
>20
>8
32
4
2
4
>64
>8
64
>16
0,5
>16
>16
5
>8
8
2
2
2
>64
>8
8
2
0,5
>16
>16
10
>8
4
1
0,5
>8
64
>8
Устойч.
Пограничн.
чувств..
Чувств.
Лекарственная чувствительность
для штаммов медленнорастущих НТМБ
Пациент 4184
M.avium
Пациент 4515
M.avium
Пациент 7165
M.gordonae
Пациент 10866
M.gordonae
Амикацин
Амикацин
Амикацин
Амикацин Res
Ципрофлоксацин Res
Ципрофлоксацин Res Ципрофлоксацин ResЦипрофлоксацин
Кларитромицин
Кларитромицин
Кларитромицин
Кларитромицин
Доксикциклин Res
Доксикциклин Res
Доксикциклин Res Доксикциклин
Этамбутол Res
Этамбутол
Этамбутол Res
Этамбутол Res
Этионамид Res
Этионамид Res
Этионамид Res
Этионамид Res
Изониазид Res
Изониазид Res
Изониазид Res
Изониазид Res
Линезолид
Линезолид
Линезолид Res
Линезолид
Моксифлоксацин Res
Моксифлоксацин
Моксифлоксацин Res Моксифлоксацин
Рифабутин
Рифабутин
Рифабутин
Рифабутин
Рифампицин Res
Рифампицин
Рифампицин Res
Рифампицин Res
Стрептомицин Res
Стрептомицин Res
Стрептомицин Res Стрептомицин
Триметоприм/
Триметоприм/
Триметоприм/
Триметоприм/
Сульфометаксазол Res Сульфометаксазол Сульфометаксазол Res Сульфометаксазол Res
Лекарственная чувствительность
штаммов быстрорастущих НТМБ
Пациент 4528
M.abscessus
Пациент 9845
M.abscessus
Амикацин
Амикацин
Амоксицилин/
Амоксицилин/
клавулановая кислота Resклавулановая кислота Res
Цефепим Res
Цефепим Res
Цефокситин Res
Цефокситин
Цефтриаксон Res
Цефтриаксон Res
Ципрофлоксацин
Ципрофлоксацин
Кларитромицин Res
Кларитромицин
Доксициклин Res
Доксициклин Res
Имипенем Res
Имипенем
Линезолид Res
Линезолид
Миноциклин Res
Миноциклин Res
Моксифлоксацин Res
Моксифлоксацин Res
Тайгециклин Res
Тайгециклин Res
Тобрамицин Res
Тобрамицин
Триметоприм/
Триметоприм/
сульфамтоксазол Res
сульфамтоксазол Res
Пациент 9329
M.fortuitum
Амикацин
Амоксицилин/
клавулановая кислота Res
Цефепим Res
Цефокситин
Цефтриаксон Res
Ципрофлоксацин
Кларитромицин
Доксициклин
Имипенем
Линезолид
Миноциклин
Моксифлоксацин
Тайгециклин
Тобрамицин Res
Триметоприм/
сульфамтоксазол Res
Выявление МБТ методом
ПЦР в реальном времени
•
•
Предпочтительными являются
тест-системы с детекцией
результата в режиме
реального времени.
Зарегистрированные в РФ
отечественные тест-системы:
–
–
–
АМПЛИТУБ-РВ (НПК Синтол);
Набор реагентов для
обнаружения ДНК МТК
АмплиСенс (ИнтерЛабСервис);
Комплект реагентов для
обнаружения ДНК МТК (ДНКтехнология)
Современные методы определения
лекарственной чувствительности микобактерий
МБТК
Культуральные
Абс.конц. на ППС
ВACTEC MGIT 960
ПТП 1-го и 2-го ряда
НТМБ
Молекулярногенетические
(1-3 дня)
Культуральные
• Мультиплексная ПЦР (Синтол)
RIF, INH, Fq
Sensititre TREK Diag
• ТБ-биочип, ТБ-биочип-2
(Magellan Biosciences)
RIF, INH, Fq
• ДНК-стрипы (Hain-test)
- GenoType® MTBDRplus
RIF, INH
- GenoType® MTBDRsl
фторхинолоны
аминогликозиды/циклические пептиды
этамбутол
• Секвенирование гена pncA (ЦНИИЭ)
PZA
Критические концентрации (мкг/мл) для определения ЛЧ в зависимости
от используемого метода и питательной среды
Противотуберкулезный
препарат
Среда, используемая
для определения ЛЧ
изониазид
Среда Левенштейна–
Йенсена (метод абсолютных
концентраций)
Среда
Левенштейна–
Йенсена (метод
пропорций)
Система BACTEC MGIT
960/320
плотная, жидкая
1
0,2
0,1
рифампицин
плотная, жидкая
40
40
1
этамбутол
плотная, жидкая
2
2
5
пиразинамид
жидкая
--
--
100
стрептомицин
плотная, жидкая
10
4
1
канамицин
плотная, жидкая
30
30
2,5
амикацин
плотная, жидкая
--
30
1
капреомицин
плотная, жидкая
30
40
2,5
офлоксацин
плотная, жидкая
2
4
2
левофлоксацин
плотная, жидкая
--
--
1,5
моксифлоксацин
плотная, жидкая
--
--
0,5/2,0
этионамид
плотная, жидкая
30
40
5
протионамид
плотная, жидкая
30
40
2,5
циклосерин
плотная
30
30
--
Pаминосалициловая
кислота
плотная, жидкая
1
1
4
клофазимин
жидкая
--
--
--
амоксициллин/клав
уланат
отсутствует
--
--
--
линезолид
жидкая
--
--
1
Группа препаратов
Группа 1 (пероральные
противотуберкулезные
препараты первой линии)
Группа 2 (инъекционные
противотуберкулезные
препараты)
Группа 3 (фторхинолоны)
Группа 4 (пероральные
бактериостатические
противотуберкулезные
препараты второго ряда)
Группа 5
(противотуберкулезные
препараты с неясной
эффективностью, не
рекомендованные ВОЗ
для рутинного
использования при
лечении больных с МЛУ-
Методы, основанные на гибридизации
Микрочиповая технология
(ТБ-биочип, ТБ-биочип-2,
«Биочип», Россия) уст к R,H, Fq
Технология ДНК-стрипов
(GenoType MTBDRplus, MTBDRsl, HAIN
lifescience, Германия) уст. к ПТП 1и 2
ряда
Амплификация участка целевого гена
(только биочипы)
(2 часа)
Вложенная ПЦР
(Nested)
Амплификация участков гена с известными
(2 часа)
(2 часа)
альтерациями
Гибридизация
(4 часа)
(2 часа)
Визуализация
Мультиконкурентная аллель-специфичная методика
ПЦР в режиме реального времени
« Амплитуб-МЛУ-РВ»
СИНТОЛ, Россия
уст. к R и H
•
•
•
-снижен риск контаминации
-нет этапа гибридизации, что
ускоряет получение
результатов
- оценка результатов в
режиме реального времени
Картриджная технология GeneXpert MTB/RIF
(Cepheid,Inc.) позволяет одновременно
• выявлять возбудителя
• определять принадлежность к МТК
• определять чувствительность к рифампицину
• в течение 2-х часов
Использование ускоренных молекулярно-генетических
методов позволяет в течение 2-3 дней определять устойчивость
МБТ к основным ПТП рифампицину, изониазиду и
фторхинолонам прямо из диагностического материала и
назначать стартовый режим химиотерапии, который
корректируется в последующем по результатам культуральных
исследований чувствительности ко всем ПТП.
Адекватный лекарственной чувствительности МБТ режим
химиотерапии в интенсивную фазу лечения значительно
повысил эффективность лечения, особенно МЛУ ТБ, что нашло
отражение в
« Федеральных клинических рекомендациях по организации и
проведению микробиологической и молекулярно-генетической
диагностики туберкулеза» и было закреплено Приказом МЗ РФ
от 29 декабря 2014 г. «Об утверждении методических
рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения
туберкулеза органов дыхания»
Развитие технологий, направленных на
снижение трудозатрат
• В ФГБНУ «ЦНИИТ» внедрена автоматическая станция фирмы
TECAN (Швейцария) и совместно с фирмой СИНТОЛ разработана
программа для выделения ДНК из мокроты больных
туберкулезом и внесения ее в амплификационную смесь для
дальнейшего проведения ПЦР на выявление ДНК МБТ и
определения устойчивости к R и H (МЛУ ТБ)
ОБРАЗЦЫ
Обработка NALC-NaOH,
получение осадка
Микроскопия
Посев на
плотные или
жидкие среды
Нативный материал
Обработка инактивирующим реагентом А
(в ШББ 2 кл биобезопасности)
Выделение ДНК в роботизированной системе Tecan
Freedom Evo и внесение ДНК в ПЦР-смесь
(набор для выделения М-Сорб-Туб-Автомат и
амплификации Амплитуб-РВ, «Синтол»)
Амплификация в термоциклере с
оптическим модулем, получение
результатов выявления ДНК МБТ
Внесение ДНК МБТ в ПЦР-смесь для
определения мутаций в системе Tecan
Freedom Evo (набор Амплитуб-МЛУ-РВ,
«Синтол» и амплификация
Анализ и выдача результатов врачам
Трудозатраты –
1,5 дня
Диагностика туберкулеза
Возможности диагностики туберкулеза в
традиционных бактериологических лабораториях
Бактериоскопия
Культуральные
методы
•Световая
•Люминесцентная
•LED - микроскопия
•На плотных средах
•Bactec MGIT 960
•ID – тест
•Посев на кровяной
агар
Выявление
Определение ЛУ
к ПТП I и II ряда
Дифференциация
МТК от НТМ
Отправка образца
в лаборатории более
высокого уровня
Мол-ген
методы
Технология
GeneXpert
•Выявление
•Определение ЛУ к R
Диагностика туберкулеза
Возможности диагностики туберкулеза в лабораториях
с комплексом бактериологических и ПЦР исследований
Бактериоскопия
Культуральные
методы
Мол-ген
методы
•Световая
•Люминесцентная
•LED - микроскопия
•На плотных средах
•Bactec MGIT 960
Выявление
Определение ЛУ
к ПТП I и II ряда
•ID – тест
•Посев на кровяной
агар
Дифференциация
МТК от НТМ
•Sensititre TREK Diag
Определение ЛУ
НТМ
•ПЦР
•ДНК-стрипы
•Биочипы
•GeneXpert
•Секвенирование
Видовая
идентификация
микобактерий
• Перспективы в совершенствовании диагностики
лекарственно-устойчивого туберкулеза и
микобактериоза заключаются в разработке
ускоренных отечественных ПЦР-систем ,
детектирующих устойчивость к ПТП 1 и 2 ряда,
• в том числе и новейших,
• доступных для всех ПТУ РФ и каждого больного.
Благодарю за внимание