Методическое пособие Кинетические методы анализа 4 Файл

Ю.Ю. Петрова, О.Ю. Ветрова, Е.Ю.Бырина
КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Учебно-методическое пособие
Сургут
2013
ГБОУ ВПО «СУРГУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ ХАНТЫ-МАНСИЙСКОГО АВТОНОМНОГО
ОКРУГА – ЮГРЫ»
Кафедра химии
Ю.Ю. Петрова, О.Ю. Ветрова, Е.Ю.Бырина
КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Учебно-методическое пособие
Сургут
Издательский центр СурГУ
2013
УДК 543.5(072)
ББК 24.76А73
Г 695
Печатается по решению
редакционно-издательского совета СурГУ
Рецензент к.х.н, доцент Е.В.Севастьянова
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение………………………………………………………………..5
Глава I. Методы определения скорости реакции в кинетических методах………………………………………………………………………..6
Глава II. Каталитические методы анализа.…………………………..8
II.1. Определение катализаторов …………………………...9
II.2. Определение эффекторов катализа (активаторов и ингибиторов)………………………………………………………10
Лабораторный практикум…………………………………………...13
Лабораторная работа № 1. Определение меди(II) в растворах . . . .13
Лабораторная работа № 2. Определение молибдена(VI) в растворах…………………………………………………………………………..15
Лабораторная работа № 3. Определение йодид-ионов…………….16
Лабораторная работа № 4. Исследование активирующего действия
лимонной кислоты на каталитическую активность Мо(VI)…………...17
Глава III. Кинетические методы анализа в некаталитическом
варианте ………………………………………………………...………….19
Лабораторный практикум……………………………………………21
Лабораторная работа № 5. Определение концентрации тиосульфата
кинетическим методом……………………………………………………21
Глава IV. Гибридные и комбинированные методы с кинетическим
детектированием…………………………………………………………22
Лабораторный практикум…………………………………………25
Лабораторная работа № 6. Определение меди(II) и гистамина сорбционно-каталитическим методом на бумажных носителях…………….25
Лабораторная работа № 7. Определение меди(II) сорбционнокаталитическим методом в сочетании с тонкослойной хроматографией……………………………………………………………………………30
Лабораторная работа № 8. Определение гистамина и -аланина
сорбционно-каталитическим методом в сочетании с планарной хроматографией…………………………………………………………………31
Лабораторная работа № 9. Определение коллагена каталитическим
методом в сочетании с тонкослойной хроматографией………………33
Литература . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Введение
Кинетические методы основаны на использовании зависимости
скорости химической реакции от концентрации реагирующих веществ,
а в случае каталитических реакций от концентрации катализатора или
веществ, влияющих на каталитическую активность.
Аналитическим сигналом в кинетических методах является скорость процесса или пропорциональная ей величина. Реакция, положенная в основу определения вещества кинетическим методом, называется
индикаторной. Вещество, по изменению концентрации которого судят
о скорости индикаторного процесса, — индикаторным.
Если определяемым является одно из реагирующих веществ индикаторной реакции, то это — некаталитический вариант. Если определяют катализатор или соединения, взаимодействующие с катализатором, то это — каталитический вариант (каталитические методы).
Вещества, взаимодействующие с катализатором, (эффекторы) обычно
меняют его каталитическую активность, увеличивая ее (активаторы)
или уменьшая (ингибиторы). Тем самым активаторы увеличивают скорость индикаторной реакции, а ингибиторы – уменьшают ее.
Среди методов определения малых количеств веществ особое место занимают кинетические методы анализа. Возможность применения
достаточно простой и доступной аппаратуры, высокая чувствительность (в каталитических методах), экспрессность выполнения анализа
привлекает внимание к этим методам не только с точки зрения фундаментальных, но и практических задач мониторинга и аналитического
контроля в экологии, медицине, фармацевтической и пищевой промышленности, безопасности жизнедеятельности и т.д.
В целом в мире интерес к кинетическим методам анализа сохранился. Последние конференции по кинетике в аналитической химии
(Москва, 1995 г., Афины, 1998г., Бухарест, 2001г.) показали, что традиционная составляющая в тематике практически исчезла. Однако обозначились и получили развитие современные подходы: биосенсоры,
ферментативные реакции, гибридные методы и т.д.
Глава I. Методы определения скорости реакции в кинетических методах
В настоящее время наиболее распространенными являются три основных способа определения неизвестной концентрации по данным
кинетических измерений. Это способы тангенсов, фиксированного времени, фиксированной концентрации. Рассмотрим их применительно к
дифференциальному варианту кинетического метода анализа, когда
концентрация индикаторного вещества линейно зависит от времени в
начальный период реакции. Кинетической кривой в этом случае является зависимость концентрации индикаторного вещества x от времени t.
Способ тангенсов основан на определении тангенса угла наклона
кинетических кривых tg при известных концентрациях определяемого
вещества. При этом tg характеризует скорость индикаторной реакции
и зависит от концентрации определяемого вещества. Градуировочный
график строят в координатах: концентрация определяемого соединения
с — tg (рис. 1, а).
Способ фиксированного времени. При определенном, строго фиксированном интервале времени протекания реакции, измеряют концентрацию индикаторного вещества x в пробах с известными концентрациями определяемого компонента. Градуировочный график строят в координатах концентрация определяемого вещества с — концентрация индикаторного вещества при фиксированном времени протекания реакции
tфикс. (рис. 1, б). Часто при работе этим методом индикаторную реакцию
останавливают при tфикс.. Путем резкого охлаждения, изменения кислотности раствора, добавления ингибиторов.
Способ фиксированной концентрации. В отдельных пробах с известными концентрациями определяемого вещества проводят индикаторную реакцию до строго определенной (фиксированной) концентрации индикаторного вещества хфикс. и измеряют время достижения этой
концентрации. Градуировочный график строят в координатах: концентрация определяемого компонента с — величина, обратная времени достижения хфикс. (рис. 1, в).
Рис. 1. Способы определения неизвестной концентрации по данным кинетических измерений: а — тангенсов; б — фиксированного времени; в — фиксированной концентрации (х — концентрации индикаторного вещества, t — время, с3 > c2 > c1 — концентрации определяемого соединения)
В литературе описаны и другие способы определения неизвестной
концентрации вещества по данным кинетических измерений.
Каталиметрическое титрование — процесс титрования в присутствии катализатора, в котором точку конца титрования определяют по
резкому увеличению или уменьшению скорости реакции. С целью автоматизации каталиметрического метода анализа скорость реакции часто измеряют в открытых системах. Открытой называют систему, в которую по мере протекания реакции вводят реагенты и/или из которой
отводят продукты реакции. В ходе реакции растворы подаются в реакционную камеру с постоянной или регулируемой скоростью. Разработаны разные варианты открытых систем: на основе проточных методов и
«стат»-методов.
Проточные методы. К ним относится метод непрерывной струи,
основанный на смешении реагентов в струе и предложенный для быстро протекающих реакций с периодом полупревращения t1/2 = 0,01–10 с.
Другой вариант проточного метода применяют для измерения скоростей сравнительно медленно протекающих реакций с t1/2 = 1–10 мин. В
этом случае проточная ячейка одновременно является и смесительной
камерой. Исходные реагенты индикаторной реакции и анализируемый
раствор, содержащий катализатор с концентрацией скат, непрерывно
подаются насосами в смесительную камеру вместимостью около 10 мл,
продукты реакции и реагенты вытекают со скоростью 2–20 мл/мин. При
каждом значении скат устанавливается постоянная концентрация индикаторного вещества и фиксируется постоянный сигнал, соответствующий скат. Смена раствора в кювете происходит за 1–2 мин, что определяет производительность анализатора 30 проб в час.
Стат-метод предполагает введение реагентов со скоростью, равной скорости их расходования в реакции, так что концентрация индикаторного вещества остается постоянной. Скорость введения реагента
регулируется автоматически.
Глава II. Каталитические методы анализа
Каталитические методы отличаются высокой чувствительностью:
(сmin 10-6 – 10-5 мкг/мл, 10-12 – 10-10 М), которая ограничена колебаниями
«фона» матрицы. Чувствительность каталитических методов для многих
неорганических веществ сравнима с чувствительностью массспектральных и активационных методов анализа, для органических — с
наиболее чувствительными вариантами хроматографии (ВЭЖХ). В отдельных случаях, например, для серебра, хрома, кобальта, ртути каталитические методы — наиболее чувствительные из всех известных методов анализа. При этом преимуществом каталитических методов является сочетание высокой чувствительности с простотой аппаратурного
оформления и методики проведения анализа.
Среди каталитических методов высокую чувствительность и селективность имеют ферментативные методы, основанные на использовании
реакций, катализируемых ферментами. Ферментативными методами
определяют субстраты, сами ферменты и эффекторы ферментов (соединения, мешающие активности ферментов). Методы определения субстратов — веществ, на которые действуют ферменты — высокоселективны и даже специфичны, что позволяет определять субстраты непосредственно в матрице сложных объектов (кровь, биомассы и биожидкости, многокомпонентные технологические растворы). Чувствительность определения при этом обусловлена методом, выбранным для контроля за скоростью процессов. Часто в этих случаях используют фер-
ментные электроды. Методы определения эффекторов ферментов высокочувствительны, но не всегда селективны.
В кинетических методах наиболее часто используют метод тангенсов как наиболее точный (использует большое число экспериментальных данных) и универсальный (применим для реакций с индукционным
периодом). Реже применяют способ фиксированного времени и способ
фиксированной концентрации, хотя эти способы более просты и менее
трудоемки. Способ фиксированной концентрации используют обычно
при автоматизации контроля, способ фиксированного времени — при
проведении серийных анализов.
II.1. Определение катализаторов
В широком смысле слова катализатором можно назвать вещество,
увеличивающее скорость реакции не изменяя положение равновесия.
Моттола дал более точное определение: катализатором может быть
названо «вещество, понижающее свободную энергию активации без
изменения положения равновесия».
Реакции, катализируемые веществами, которые необходимо определить, называют индикаторными реакциями. Скорость индикаторной
реакции в отсутствие катализатора должна быть очень низкой или пренебрежимо малой по сравнению со скоростью катализируемой реакции.
Механизм действия катализатора (С), включающий образование
промежуточного переходного комплекса (СB):
𝑘1
→
←
𝐶+𝐵
𝐶𝐵 + 𝑌
𝑘−1
𝑘2
𝐶𝐵 + 𝐴 → 𝑃 + 𝐶,
где С — катализатор; В — реагент, присутствующий в избытке по
отношению к реагенту А и образующий промежуточный комплекс с
катализатором (СВ); Р и Y — продукты реакции; Р — индикаторное
вещество, по изменению концентрации которого ведут контроль за реакцией.
В момент времени, близкий к началу реакции, значение [Р] может
быть пренебрежимо малым по сравнению с [А]о и общая скорость каталитической реакции:
0 = (
𝑑[𝑃]
𝑑𝑡
)
набл,𝑡=0
= 𝐾 ′ [𝐶]0 + 𝐾"
(1),
где К' и К" — константы, при условии что [А]о и [В]о значительно
выше [C]0 и [B]0 » [A]0.
Это уравнение справедливо для времен t, близких к нулю, и вообще
до тех пор, пока ни обратная, ни побочные реакции не влияют на главную реакцию. Однако оно не применимо, если механизм процесса
включает цепные реакции.
Проинтегрируем выражение (1), считая, что концентрация [C]0 в
начальный момент реакции постоянна: [Р] = (K [C]0 + 𝐾")t.
Таким образом, на начальном участке кинетической кривой (зависимости [Р] от t) концентрация катализатора пропорциональна концентрации продукта Р. Обычно на такой кривой можно выделить начальный участок, который аппроксимируется прямой линией. Тангенс угла
наклона этой прямой является мерой начальной скорости реакции, которая в свою очередь пропорциональна концентрации катализатора.
Вариант каталитических (и в целом кинетических) методов анализа,
основанный на измерении начальной скорости реакции и зависимости
типа [Р] = k[C]0 t (или [Р] = k[A][B]t для реакции А + В  Р) называется
дифференциальным.
Если же время наблюдения за реакцией относительно велико, и
концентрация индикаторного вещества зависит от времени нелинейно,
применяют интегральный вариант. Интегрируя выражение (1) с учетом
первого порядка реакции, можно получить, что продукт Р в ходе реакции должен накапливаться по экспоненциальному закону:
[Р] = [Р](1 – e-kt), где [Р] - конечная равновесная концентрация
продукта.
В интегральной методе стремятся построить кривую в таких координатах (полулогарифмических, обратных и т.д.), чтобы получить линейный график.
II.2. Определение эффекторов катализа (активаторов и ингибиторов)
Эффекты, изменяющие скорость реакций, имеют большое теоретическое и практическое значение. Они обычно ассоциируются с каталитическими реакциями (их главной областью применения в аналитической химии), хотя могут быть использованы также в некаталитических и даже фотохимических реакциях.
Скорость каталитической реакции c можно либо увеличить, либо
уменьшить (т. е. реакция может быть «активирована» или «ингибирована») при добавлении подходящих веществ. Явления активирования
и ингибирования иллюстрирует рис.2, на котором представлена зави-
симость изменения скорости модифицированной реакции c при фиксированной концентрации катализатора С от концентрации модифицирующего вещества.
′𝑐
Активирование
𝑐
Частичное ингибирование
0
Полное ингибирование
[C] = [I]
[Модификатор]
Рис. 2. Изменение скорости каталитической реакции в зависимости от
концентрации модификатора
Можно заметить, что реакция ингибирована полностью, если константа равновесия реакции ингибирования достаточно велика, так
что ее скорость равна скорости некаталитической реакции 0 для стехиометрического отношения ингибитора (I) к катализатору. Если
константа равновесия реакции ингибирования не так уж велика или
если продукт реакции (комплекс либо осадок) также в некоторой
степени активен, тогда интересующая нас реакция ингибируется
лишь частично. Зависимости, приведенные на рис.2, могут быть
использованы как градуировочные графики.
Каталитические методы широко применяют в анализе следов; изза их высокой чувствительности и низких пределов обнаружения в
большинстве случаев на уровне 10 -9 – 10-7 М, хотя для некоторых методов достигаются и такие низкие значения, как 10 -12  10-10 М. Тем
не менее решение практических задач требует еще более низких пределов
обнаружения. Они достижимы только при использовании явления активирования; при этом добавляется еще одно преимущество - возможность определения активатора, который сам по себе чаще всего не
обладает каталитическими свойствами.
Аналогичным образом явление ингибирования позволяет определять некоторые вещества, выступающие в качестве ингибиторов каталитических реакций. Модификатор можно определить при условии, что
скорость модифицированной реакции пропорциональна его концентра-
ции. Одно из основных приложений этого явления — определение ингибиторов с помощью каталитического титрования. Схема на рис.3 отражает все направления использования эффектов модифицирования
каталитических реакций.
Рис. 3. Применение эффектов активирования и ингибирования
Ингибирующие и активирующие эффекты применимы к ферментативным и неферментативным процессам. В ферментативных реакциях
активирование или ингибирование является следствием присутствия
ионов металлов, которые можно, таким образом, определить по их влиянию на каталитические свойства фермента.
Скорость неферментативных реакций обычно модифицируют с помощью гидроксилсодержащих, полиаминокарбоксильных и хромогенных лигандов, причем комплексоны предпочтительно использовать как
ингибиторы, а другие лиганды выступают либо как ингибиторы, либо
как активаторы. Неорганические анионы часто являются ингибиторами
катализируемых металлами реакций, в то время как ионы металлов используются как в процессах ингибирования катализируемых анионами
реакций (редко), так и для активирования реакций, катализируемых металлами.
Большинство металлов являются катализаторами в тех индикаторных реакциях, которые используют для их определения. Для того чтобы
расширить круг определяемых компонентов, каталитические процессы
применяют также для определения активаторов и особенно ингибито-
ров, то есть соединений, соответственно увеличивающих или уменьшающих действие катализатора. Так, например, для определения щелочноземельных металлов каталитическим методом применяют принцип конкурентного комплексообразования. При этом в индикаторную реакцию,
катализируемую медью(II), вводят ингибитор этилендиаминтетраацетат
(ЭДТА) до практического прекращения протекания реакции. Если в такую систему затем добавить ион одного из щелочноземельных элементов (Ca, Sr, Ba) или ионы, не проявляющие, как правило, собственного
каталитического действия (Cd, Zn), то по мере добавления ионов таких
металлов они, образуя комплексные соединения с ЭДТА, высвобождают ионы меди и скорость каталитического индикаторного процесса увеличивается. При этом увеличение скорости пропорционально концентрации ионов металлов, добавленных в катализируемую медью(II) реакцию.
Активирующее и особенно ингибирующее действие используют
для определения органических соединений самых разных классов. Органические соединения и сами могут быть катализаторами в индикаторных системах (альдегиды, N-нитрозоамины, серосодержащие органические соединения), но чаще их определяют по активирующему или ингибирующему действию. Например, катализируемую медью реакцию
окисления гидрохинона пероксидом водорода применяют для определения 10-10-10-9 моль/л карбоксил-, азот- и фосфорсодержащих комплексонов самого разного строения. Часто определяют каталитическими методами очень малые количества селена, теллура и таких анионов, как I -, F-,
CN-, S2-.
Лабораторный практикум
Лабораторная работа № 1. Определение меди(II) в растворах
Индикаторной реакцией для определения микроколичеств меди является катализируемая медью(II) реакция окисления гидрохинона пероксидом водорода в присутствии NH3 как активатора. Комплексы меди(II) с NH3 и органическими аминами часто обладают большей каталитической активностью, чем ионы Cu(II). Образующийся в результате
индикаторной реакции продукт поглощает в области 490 нм; за скоростью реакции можно наблюдать по изменению оптической плотности
раствора во времени. Скорость реакции, которая зависит от концентрации меди(II), характеризуется тангенсом угла наклона кинетических
кривых в координатах оптическая плотность — время (способ тангенсов).
Реагенты и аппаратура
Гидрохинон, 1.5.10-2 М водный раствор.
Пероксид водорода, 0.45 М раствор.
Сульфат меди, стандартный раствор, содержащий 1000 мкг/мл (1.0
мг/мл) меди (II).
Аммиачный буферный раствор рН 7.5 – 8.0, приготовленный смешением 1% раствора NH4Cl и 10% раствора NH3 (6:1 по об.).
Фотоколориметр КФК-3
Секундомер
Выполнение определения
Раствор с меньшим содержанием меди (1.0 мкг/мл) готовят ежедневно разбавлением исходного раствора следующим образом: 1.0 мл
раствора с концентрацией 1.0 мг/мл разбавляют водой в колбе вместимостью 100 мл (раствор А); 10 мл раствора А, содержащего 10 мкг/мл
Cu(II), разбавляют в колбе вместимостью 100 мл (раствор Б); 1 мл раствора Б содержит 1.0 мкг/мл Сu(II). Растворы А и Б пригодны к употреблению только в день приготовления. Все разбавления проводят
только деионизированной водой!
Для построения градуировочного графика в чистую пробирку вводят растворы, соблюдая последовательность:
1) буферный раствор;
2) раствор, содержащий медь (II) в количестве (мкг): 0; 0.1; 0.2; 0.3;
0.4; 0.5;
3) 0.5 мл 0.45 М раствора Н2О2;
4) 1.5 мл 1.5.10-2 М раствора гидрохинона (ГХ).
Количество аммиачного буферного раствора должно быть таким,
чтобы общий объем раствора был равен 10 мл. При этом следует составить таблицу приготовления растворов (табл. 1).
В момент добавления гидрохинона включают секундомер и измеряют оптическую плотность раствора (А), начиная с первой минуты,
каждые 30 или 60 с в течение 5 - 7 мин ( = 490 нм, l = 5 см).
Таблица 1
Номер
раствора
1
2
…
6
Приготовление растворов
для построения градуировочного графика
Количество, мл
сCu, мкг/мл
Буферного
ГХ
Н2О2
раствора
0
1.5
0.5
8.0
0.1
1.5
0.5
7.9
(0.1 мл раствора Б)
…
….
…
…
0.5
1.5
0.5
7.50
(0.5 мл раствора Б)
По данным измерений строят график в координатах А — t и определяют тангенсы углов наклона полученных прямых (tg). Градуировочный график строят в координатах tg — концентрация меди(II). В
анализируемом растворе концентрацию меди(II) находят по градуировочному графику.
Лабораторная работа № 2. Определение молибдена(VI) в растворах
Реакция окисления иодида пероксидом водорода до свободного йода в кислом растворе Н2О2 + 2I- + 2Н + = I2 + 2 H2O в отсутствие
катализаторов протекает медленно. В присутствии катализаторов
(H2WO4, H2MoO4, соединений тантала, циркония, железа и некоторых
других элементов) скорость реакции резко возрастает.
Зависимость концентрации йода (или пропорциональной ей оптической плотности йодкрахмального комплекса в растворе) от времени
имеет в начальном периоде линейный характер и тангенс угла наклона
прямой оптическая плотность (А) — время (t) пропорционален скорости
реакции, а, следовательно, и концентрации молибдена в растворе (способ тангенсов).
Реагенты и аппаратура
Стандартный раствор молибдата аммония 1.910-5 г/мл. Растворяют
0.9700 г (NH4)2MoO4 в 100 мл воды и раствор разбавляют в 500 раз.
Пероксид водорода, 1.10-2 М раствор.
Иодид калия, 5.10-3 М раствор. Навеску 0.8300 г дважды перекристаллизованного из спирта KI растворяют в 1 л воды.
Соляная кислота, 1 М раствор.
Крахмал, 0.2%-ный раствор, приготовленный в день работы.
Фотоколориметр КФК – 3.
Секундомер.
Выполнение определения
В пять мерных колб вместимостью 50.0 мл вносят 0, 0.50, 1.0, 1.50,
2.0 мл стандартного раствора молибдата аммония, 5 мл раствора иодида калия, 5 мл соляной кислоты, 1 мл раствора крахмала и доводят объем дистилллированной водой до 35 - 40 мл. Раствор тщательно перемешивают и вносят в него 5 мл раствора пероксида водорода; одновременно включают секундомер. Затем объем раствора доводят до метки,
перемешивают и помещают в кювету фотометра (l = 1 см,  = 600 нм) и
через 1 минуту снимают показания оптической плотности каждые 30 с в
течение 7 мин.
Для построения градуировочного графика проводят не менее трех
параллельных опытов с растворами молибдата различной концентрации. Определяют тангенсы углов наклона прямых, построенных в координатах А — t, градуировочный график строят в координатах тангенс
угла наклона (tg) — концентрация (с) молибдата в растворе.
Определению молибдена не мешает присутствие ионов щелочных
металлов, кальция, магния, цинка, никеля, кобальта, марганца, хлорида,
нитрата, сульфата.
Лабораторная работа № 3. Определение йодид-ионов
Сущность метода. Определение базируется на реакции окисления
бромпирогаллолового красного (БПК) или о-фенилендиамина (ОФДА)
пероксидом водорода в кислой среде. При комнатной температуре реакция проходит очень медленно, но в присутствии йодид ионов ее скорость значительно возрастает. В литературе отсутствуют данные о механизме действия I-. Один из вероятных механизмов схематично можно
представить так:
I- + H2O2  IO- + H2O,
IO- + I- + 2H+  I2 + H2O,
R + I2  P + 2I-,
IO- + H2O2  H2O + I- + O2,
где R – БПК или ОФДА, Р – продукт окисления БПК.
В оптимальных условиях скорость реакции пропорциональна концентрации йодид-ионов. Концентрацию йодид-ионов в растворе находят методом градуировочного графика, для построения которого в координатах скорость реакции – концентрация I- изучают зависимость
оптической плотности (А490) растворов с разным содержанием йодида
от времени (t, мин). Полученные результаты представляют в форме кинетических кривых (А от t мин). Определяют тангенс угла наклона
начального участка для каждой кинетической кривой (tg) и строят градуировочный график в координатах tg  сKI.
Реактивы и аппаратура
о-фенилендиамин (или БПК), 4.10-4 моль/л
KI, 2.6.10-4 моль/л
Н2О2, 6 моль/л
HNO3, 0.01 моль/л
HNO3, 0.5 ммоль/л (раствор сравнения: 1.25 мл 0.01 М раствора в колбу на 25 мл до метки)
фотоэлектроколориметр КФК -3
секундомер
колбы мерные на 25 мл
пипетки емкостью 1; 2; 5 мл
деионизированная или дистиллированная вода
Выполнение определения иодида
Построение градуировочного графика. В пять мерных колб, вместимостью 25 мл вводят пипеткой по 1 мл раствора о-фенилендиамина,
добавляют 0, 0.25, 0.5, 1.0 и 1.5 мл раствора KI и 15 мл деионизированной воды. Добавляют 0.5 мл азотной кислоты и доводят объем деионизированной водой до метки и перемешивают. В каждую колбу непосредственно перед измерением добавляют 1.0 мл раствора пероксида
водорода, одновременно включают секундомер. Растворы фотометрируют при  = 490 нм в кювете l = 2 см через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 мин.
Раствор сравнения – 0.5 ммоль/л азотной кислоты.
По полученным данным строят кинетические кривые А490 – t (мин)
и находят тангенсы углов наклона линейных участков в начальный период до оси абсцисс. По полученным результатам строят градуировочный график в координатах tg - концентрация КI, мкг/мл.
Определение концентрации йодида в исследуемом растворе. Получают задачу в мерную колбу емкостью 25 мл, добавляют все реактивы как указано выше, кроме пероксида водорода. Растворы в колбе доводят деионизированной водой до метки, добавляют 1 мл пероксида
водорода и одновременно включают секундомер. Раствор фотометрируют при  = 490 нм в кювете l = 2 см через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 и 10 мин.
Раствор сравнения – 0,5 ммоль/л.
Лабораторная работа № 4. Исследование активирующего действия лимонной кислоты на каталитическую активность Мо(VI)
Некоторые лиганды могут играть двойственную роль, как активатора, так и ингибитора, что позволяет применять их в различных кинетических методах анализа. Одним из таких лигандов является лимонная
кислота, которая активирует каталитические свойства молибдена(VI) и
полностью подавляет эти свойства у вольфрама(VI) в одной и той же
индикаторной реакции, а именно в реакции окисления иодида пероксидом водорода. Это позволяет определять оба металла в смеси, так как
каталитические эффекты обоих ионов в отсутствие модификатора суммируются.
Зависимость концентрации йода (или пропорциональной ей оптической плотности раствора йодкрахмального комплекса) от времени
имеет в начальном периоде линейный характер и тангенс угла наклона
прямой оптическая плотность — время пропорционален скорости реакции, а, следовательно, и концентрации молибдена в растворе (способ
тангенсов).
Реагенты и аппаратура
Стандартный раствор молибдата аммония (1.9.10 -5 г/мл). Растворяют 0,9700 г (NH4)2MoO4 в 100 мл воды и раствор разбавляют в 500
раз.
Пероксид водорода, 1.10-2 М.
Иодид калия, 5.10-3 М. Навеску 0,8300 г дважды перекристаллизованного из спирта KI растворяют в 1 л воды.
Соляная кислота, 1 М.
Крахмал, 0.2%-ный раствор, приготовленный в день работы.
Лимонная кислота, 1.10-4 М
Фотоколориметр КФК-3.
Секундомер.
Выполнение определения
В мерные колбы вместимостью 50.0 мл вносят 1.5 мл раствора молибдата аммония, 1 мл раствора лимонной кислоты с концентрацией
5.10-5, 1.10-5, 5.10-6 и 1.10-6 М, 5 мл раствора иодида калия, 5 мл соляной
кислоты, 1 мл раствора крахмала и доводят объем дистиллированной
водой до 35 - 40 мл. Раствор тщательно перемешивают и вносят в него 5
мл раствора пероксида водорода; одновременно включают секундомер.
Затем объем раствора доводят до метки, перемешивают и помещают в
кювету фотометра (l = 1 см,  = 600 нм) и измеряют оптическую плот-
ность каждые 30 сек в течение 5 минут.
Таблица 2
Приготовление растворов лимонной кислоты методом разбавления
Концентрация
Объем раствора лимонной кислоты,
№
лимонной
мл (в колбу на 50 мл и довести до
раствора
кислоты, М
метки водой)
1
5.10-5 М
25 мл 1.10-4 М
2
1.10-5 М
5 мл 1. 10-4 М
.
-6
3
5 10 М
5 мл раствора №1
4
1.10-6 М
5 мл раствора № 2
Строят градуировочный график в зависимости скорость реакции от
концентрации лимонной кислоты. Скорость реакции рассчитывают методом тангенсов.
Глава III. Кинетические методы анализа в некаталитическом
варианте
Некаталитические методы не отличаются высокой чувствительностью: сmin 10-2 – 10-1 мкг/мл или 10-6 – 10-4 М (она определяется, как
правило, методом наблюдения за скоростью индикаторного процесса),
но они селективны, часто позволяют определять в смеси близкие по
свойствам вещества без их предварительного разделения. Эти методы
применяют при анализе смесей органических соединений (спиртов, сахаров, аминов) и смесей таких близких по свойствам ионов металлов,
как щелочноземельные и редкоземельные элементы.
Если два сходных по химическим свойствам соединения А и В реагируют с одним и тем же реагентом R:
𝑘1
𝐴 + 𝑅 → 𝑃1
𝑘2
𝐵 + 𝑅 → 𝑃2
то при условии, что k1/k2  500 возможно определять в начальный
период реакции вещество А на фоне В с погрешностью < 1%.
Для определения как органических, так и неорганических веществ
при сравнительно больших концентрациях можно использовать некаталитические реакции, протекающие с измеримой скоростью. Это могут
быть реакции окислительно-восстановительные, гидролиза, замещения
лигандов, образования осадков и др. Их скорость или индукционный
период определяется концентрацией реагирующих веществ в растворе.
При этом методы и приемы измерения скоростей некаталитических реакций те же, что и разработанные для каталитических реакций. Для
определения одного вещества в смеси обычно не рекомендуют использовать некаталитическую реакцию, если есть подходящий некинетический метод. Причина этого заключается в том, что точность такого кинетического метода обычно ниже по сравнению с равновесными или
статическими методами. По этой причине количественные определения
кинетическим методом с использованием некаталитических реакций
относительно немногочисленны. Однако в некоторых случаях кинетические методы могут оказаться более применимыми, чем другие классические некинетические методы, особенно в анализе органических
смесей. Кинетический метод может иметь преимущество также благодаря своей простоте и возможности определения без применения специальной аппаратуры.
Однокомпонентный анализ. Пусть вещество А взаимодействует с
реагентом В, образуя продукт реакции Р: А + В  Р
При этом возможны два крайних случая:
1) если В присутствует в большом избытке относительно А (50-и
более кратном), реакция будет иметь псевдопервый порядок по определяемому веществу;
2) если концентрации А и В сопоставимы, реакция будет характеризоваться вторым порядком.
Скорость реакции псевдопервого порядка по определяемому веществу А:
 = — d [A]/dt = d [P]/dt = k [A] [B]o = k' [A] (2), где k' = k [B]0.
Математическое выражение методов фиксированного времени и
фиксированной концентрации включает уравнение (2) в экспоненциальной форме:  = — d [A]/dt = k [A]o exp (— kt)
(3)
Интегрирование выражения (3) по интервалу времени t2 — t1 дает: ∆
[А] = [А]о [ехр(-kt1) - ехр(-kt2)], откуда, учитывая, что t2 = ∆t + t1, имеем:
[А]о = -∆[А]/ехр(-kt1) [1 - ехр(- k∆t)]
(4).
Это уравнение пригодно как для дифференциальных (метод
начальных скоростей), так и для интегральных методов.
В случае метода начальных скоростей (кинетика псевдонулевого
порядка) уравнение (2) можно записать в конечных разностях:
 = 𝛥[𝑃 ]⁄𝛥𝑡 = 𝑘 [𝐴]0 (5), откуда легко рассчитать концентрацию
А.
Лабораторный практикум
Лабораторная работа № 5. Определение концентрации тиосульфата кинетическим методом
Определение основано на индикаторной реакции:
2Fe3+ + 2S2O32- = 2 Fe2+ + S4O62-,
скорость которой пропорциональна концентрации тиосульфатионов в растворе.
Скорость реакции определяют фотометрическим методом, наблюдая за изменением концентрацией Fe3+, как индикатор используется
тиоцианат-ион. Концентрацию тиосульфата в растворе находят методом
градуировочного графика в координатах скорость реакции – концентрация S2O32-. Скорость реакции определяют методом тангенсов. Для этого
изучают зависимость оптической плотности А раствора Fe(III) в присутствии тиоцианат-ионов от времени и по полученным данным для
каждой концентрации тиосульфата строят зависимость А от t. Находят
tg, где  - угол наклона линейного участка кинетической кривой в
начале реакции. Градуировочный график строят в координатах tg 
с(S2O32-).
Реагенты и аппаратура
Деионизированная вода
Fe2(SO4)3, 1.10-2 моль/л
Na2S2O3, 1.10-2 моль/л
KSCN, 2.10-3 моль/л
H2SO4, 0.1 моль/л
Фотоколориметр КФК-3
Секундомер
Колбы мерные на 25 мл
Пипетки на 1, 5 и 10 мл
Дозаторы автоматические на 200 мкл
Выполнение определения
В пять мерных колб емкостью 25.0 мл вводят пипеткой по 0.8 мл
H2SO4 серной кислоты и 10.0 мл раствора тиоцианата. В каждую колбу
непосредственно перед измерением добавляют аликвотную часть раствора тиосульфата натрия (1, 2, 3, 4 и 6 мл) и доводят деионизированной
водой до метки. С помощью дозатора быстро вводят 1,00 мл раствора
Fe(III), одновременно включают секундомер, хорошо перемешивают
содержимое колбы и измеряют оптическую плотность раствора при  =
490 нм в кювете l = 1 см через каждые 30 с в течение 10 мин относи-
тельно раствора сравнения. Для приготовления раствора сравнения в
колбу емкостью 25 мл вносят 0.8 мл серной кислоты, 0.25 мл раствора
Fe(III) и доводят деионизированной водой до метки.
По полученным данным строят график зависимости А – t, мин. Рассчитывают tg линейных отрезков кинетических кривых и строят градуировочный график в координатах tg  концентрация Na2S2O3 (мг/25
мл).
Определение концентрации тиосульфата в контрольном растворе.
Задачу получают в мерную колбу емкость 25 мл, непосредственно перед
измерением, добавляют все реактивы, как сказано выше, кроме раствора
тиосульфата, измеряют оптическую плотность и рассчитывают tg по
полученным результатам, как описано выше. Концентрацию тиосульфата находят по градуировочному графику.
Глава IV. Гибридные и комбинированные методы с кинетическим детектированием
Одним из самых высокочувствительных методов химического анализа является каталитический вариант кинетических методов, в которых
аналитическим сигналом служит скорость индикаторной реакции, а
определяемый компонент выступает в роли катализатора или соединения, влияющего на его активность: активатора либо ингибитора.
Кинетические методы анализа отличаются высокой чувствительностью, экспрессностью, простотой методического и аппаратурного
оформления, однако, как правило, они недостаточно селективны. Для
повышения селективности каталитического метода наряду с другими
известными приемами часто используют сорбционное концентрирование определяемых компонентов в варианте сочетания селективного
сорбционного выделения и концентрирования определяемого соединения с детектированием его каталитическим методом непосредственно
на сорбенте, т.е. гибридный сорбционно-каталитический метод.
В практике развития каталитического метода есть также примеры
комбинации его с сорбционными и экстракционными методами выделения и концентрирования, когда анализ выполняется по схеме: сорбция
(экстракция) компонента, его последующая десорбция и затем каталитическое определение в растворе (в экстракте).
Сорбционно-каталитическое определение ионов металлов. Изменение кинетики и оптимальных условий протекания реакций при реализации их на сорбентах приводит к изменению метрологических характеристик каталитического метода анализа в его сорбционном варианте.
Повышение наряду с чувствительностью селективности при сорбционно-каталитическом определении ионов металлов  одно из основных
преимуществ этого нового гибридного метода. На примере определения
марганца(II) показано, что и без предварительного сорбционного выделения селективность определения иона металла на сорбентах повышается. Стабилизация на сорбентах ярко окрашенных промежуточных продуктов ряда реакций открывает возможность создания визуальных тестметодик, отличающихся простотой исполнения, экспрессностью и экономичностью.
Такие биологически активные ионы, как ртуть(II), кадмий(II) и
свинец(II), являются эффективными ингибиторами нативной пероксидазы (выделенной из корней хрена) в индикаторной реакции окисления одианизидина. Для разработки тест-методик определения этих токсикантов использовали пероксидазу, модифицированную хитозаном. Показано, что ртуть(II) оказывает слабое ингибирующее действие на каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы в интервале концентраций 2.550 нг/мл. Как и в случае нативного фермента, ингибирующее действие ртути(II) на каталитическую активность иммобилизованной пероксидазы значительно усиливается в присутствии другого
органического ингибитора  тиомочевины. При этом сама тиомочевина
значительно ингибирует (на 4050%) нативную пероксидазу, ингибирующее действие проявляется после предварительного инкубирования с
ферментом в течение 4 ч, а в случае фермента, иммобилизованного на
силикагеле и микрокристаллической целлюлозе, после пятиминутного
инкубирования; для фермента на пенополиуретане предварительное
инкубирование с тиомочевиной вообще не требуется. На основе ингибирующего действия ртути (в присутствии тиомочевины) на каталитическую активность пероксидазы, иммобилизованной на силикагеле,
микрокристалличской целлюлозе и пенополиуретане, в реакции окисления о-дианизидина были разработаны тест-методики определения Hg(II)
в интервалах концентраций 0.0150; 0.00550 и 0.00150 нг/мл, соответственно. Кадмий(II) и свинец(II) также ингибируют в большей степени иммобилизованную пероксидазу, чем нативный фермент. Установлено, кроме того, что свинец(II) является эффективным ингибитором
щелочной фосфатазы, иммобилизованной на силикагеле, микрокристаллической целлюлозе и пенополиуретане. Наличие прямо пропорциональных зависимостей степени ингибирования иммобилизованной пероксидазы от логарифма концентрации ионов кадмия(II) и свинца(II) в интервалах 0.11000 и 0.51000 нг/мл, соответственно, и ингибирования иммобилизованной щелочной фосфатазы, от логарифма концентрации свинца(II) позволило предложить тест-методики определения
этих металлов. Визуальные тест-методики определения кадмия(II),
свинца(II), ртути(II) с использованием ферментов, иммобилизованных
на пенополиуретане, отличаются простотой, экспрессностью (продолжительность анализа не превышает 15 мин), по чувствительности и воспроизводимости превосходят разработанные ранее методики с применением ферментов как нативных, так и иммобилизованных на других
носителях. Все разработанные тест-методики достаточно селективны.
Так, из ряда ионов металлов и анионов мешающее влияние на определение ртути(II) в концентрации 1 пг/мл с использованием иммобилизованной на пенополиуретане пероксидазы оказывают только Cd(II),
Bi(III) и Fe(III) в 105-, 105- и 106-кратных количествах, соответственно.
При этом кадмий(II) и висмут(III) так же, как и ртуть(II) ингибируют иммобилизованный фермент, а железо(III) в концентрации ≥1 мкг/мл
активирует его. Активирующее действие железа(III) не проявляется при
анализе морских и речных вод с низким его содержанием (≤0,1 мкг/мл),
и в таких случаях тест-методика определения ртути(II) оказывается высокоселективной. При анализе подземных, минеральных и водопроводных вод, где содержание железа(III) может варьировать от 1 мкг до нескольких мг/л, для его маскирования предлагается использовать винную
кислоту, которая образует достаточно устойчивый комплекс с железом(III), при этом сама кислота не оказывает действия на фермент и не
взаимодействует с ионами ртути(II).
Сорбционно-каталитическое определение органических веществ.
Большинство каталитических методик определения органических соединений основано на их активирующем или ингибирующем действии
на металл катализатор. Cущественным недостатком таких методик является их относительно низкая селективность, для повышения которой
используют
сорбционное
концентрирование.
Сорбционнокаталитический метод определения органических соединений развивается сравнительно недавно. Сочетание сорбции органического вещества
с последующим каталитическим определением его непосредственно на
сорбенте позволяет повысить селективность на фоне высокой чувствительности определения, значительно упростить методику и осуществить
ее в тест-варианте.
Сочетание кинетических методов с планарной хроматографией.
Работ по использованию планарной хроматографии для разделения аналитов с последующим их детектированием кинетическими методами в
литературе встречается мало. Сочетание методов разделения и детектирования в этих работах реализовано в комбинированном или гибридном
варианте. В комбинированном варианте аналит после разделения десорбируют в раствор, в котором и проводят его определение; а в гибридном
– определяют на носителе непосредственно после хроматографирования. Так, сочетание тонкослойной и бумажной хроматографии с детектированием кинетическими методами позволило разработать селективные и чувствительные методики определения формальдегида (3–100
мкг), бензальдегида (0.2 — 2.0 мг) и бромацетальдегида (15 — 100 мкг)
в смеси, бромацетальдегида на фоне 100-кратного избытка его ацеталя,
-аминокислот, бензоата (110-5 — 0.01 М), глюкозы (310–5 – 0.01 М) и
меди(II) (510-3 – 10 мкг/мл).
Лабораторный практикум
Лабораторная работа № 6. Определение меди(II) и гистамина
сорбционно-каталитическим методом на бумажных носителях
Определение меди(II). В основу сорбционно-каталитического метода определения Cu(II) положена катализируемая ионами меди реакция
окисления гидрохинона пероксидом водорода в присутствии 2,2′дипиридила (активатор), хорошо изученная в растворах реакция, характеризующаяся высокой чувствительностью к меди(II). В этой реакции
гидрохинон окисляется в 4-бензохинон, реагирующий далее с пероксидом с образованием розового продукта (λмакс = 490 нм), по которому
обычно и контролируют скорость реакции. Повышение контрастности
индикаторной реакции за счет получения продуктов, поглощающих в
более длинноволновой области, может быть достигнуто, если в реакционную систему ввести модифицирующий реагент, динитрил малоновой
кислоты, который при взаимодействии с 4-бензохиноном образует
ряд окрашенных продуктов.
OH
O
H2O2
H2O2
Cu 2+
Розовый продукт
(490 нм)
O
OH
Малононитрил (недостаток)
NC-CH2-CN
N
O
H2N
NH2
O
Синий продукт
(650 нм)
Малононитрил
(избыток)
N
Зеленый продукт
(490, 650 нм)
Оранжевый продукт
(350, 500 нм)
Схема реакции окисления гидрохинона пероксидом водорода
в отсутствие и в присутствии малононитрила
Поскольку скорость образования промежуточного продукта  4бензохинона зависит от количества катализатора (ионы меди), то при
разных содержаниях меди(II) отношение [бензохинон]:[динитрил]
должно быть различным, в соответствии с чем могут получаться продукты разной окраски. Действительно, при проведении индикаторной
реакции на фильтрах в зависимости от количества введенной меди(II) и
времени от начала реакции наблюдаются продукты и смеси продуктов
оранжевого, серого, зеленого и сине-зеленого цвета. В случае бумажных
фильтров с привитыми гексаметилендиаминными группами (ГМДАфильтры) скорость реакции контролировали по зеленому (при 500 нм)
или синему (при 620 нм) продукту. Введение малононитрила позволило
расширить интервал определяемых содержаний меди до 6 пг0.1 мкг.
На основе каталитической реакции окисления гидрохинона с образованием продуктов, имеющих различные окраски в зависимости от концентрации меди(II), создана визуальная тест-методика ее определения. Путем сравнения с цветной шкалой окраски пятна, появляющегося через
212 мин после начала реакции, можно различать количества меди, отличающиеся на порядок в интервале 0.01 нг  0.5 мкг. Разработанная
методика была использована для определения меди в сыворотке крови
человека и опробована в клинических условиях для диагностики гепатита. Методика экспрессна, не требует сложного оборудования, имеет
значительный запас по чувствительности, для выполнения анализа достаточно всего лишь 3 мкл сыворотки крови.
Определение гистамина. Гистамин (Hisam) - биогенный амин, образующийся в организме при декарбоксилировании аминокислоты гистидина под влиянием гистидиндекарбоксилазы, является одним из медиаторов, участвующих в регуляции жизненно важных функций организма и играющих важную роль в патогенезе ряда болезненных состояний:
N
N
H
COOH
NH2
N
- CO2
NH2
N
H
Возможность селективно обнаруживать и определять биогенные
амины требуется при исследовании их роли в биологических процессах.
В основе сорбционно-каталитического определения гистамина положено его активирующее действие в реакции окисления гидрохинона
пероксидом водорода, проводимой на медьсодержащих ГМДАфильтрах и использованной ранее для определения меди(II). Медьсодержащий бумажный носитель (Cu-ГМДА), который получают путем
прокачивания раствора меди(II) через ГМДА-фильтр, устойчив к вымыванию меди(II) при ее содержании 0.1 мкмоль на фильтре при прокачивании больших объемов буферного раствора (до 100 мл) и может быть
использован в течение до 3 дней.
Реагенты и аппаратура
Гидрохинон ч.д.а. очищают возгонкой, динитрил малоновой кислоты ч. перекристаллизовывают из этанола; H2O2 ос.ч., точную концентрацию которой устанавливают методом перманганатометрии один раз в
месяц. Остальные реактивы (ч.д.а. и х.ч.) используют без дополнительной очистки.
Буферные растворы (рН 1.8 – 12) готовят из смеси уксусной, борной и фосфорной кислот (0.04 М по каждой из кислот) добавлением в
неё необходимых количеств раствора 0.2 М NaOH. Стандартный раствор меди 20 г/л Cu(II) в 0.01 М азотной кислоте; растворы с более низким содержанием меди готовят разбавлением бидистиллированной водой (растворы с содержанием 1 мг/л и менее готовят в день использования).
Для приготовления растворов используют бидистиллированную
воду, дополнительно очищенную пропусканием через смесь катионо- и
анионообменников, и этанол-ректификат.
В качестве носителей используют сорбенты на основе фильтровальной бумаги в виде дисков беззольного фильтра (синяя лента) диаметром 2.5 см с химически привитыми группами гексаметилендиамина
(ГМДА). После проведения реакции фильтры регенерируют, для чего
30-40 фильтров выдерживают по 5-10 мин в 30 мл бидистиллированной
воды, затем в 110-4 М HCl и после этого - в буферном растворе, приготовленном из смеси уксусной, борной и фосфорной кислот добавлением
раствора NaОН (рН 6.8); все операции повторяли трижды. Затем фильтры вымачивают в бидистиллированной воде, высушивают на воздухе и
хранят в закрытом сосуде. Регенерацию можно повторять 4 раза.
В работе применяют кварцевую, полиэтиленовую и стеклянную посуду, которую очищают концентрированной азотной кислотой и тщательно промывают бидистиллированной водой. Для прокачивания раствора меди(II) через бумажный фильтр используют шприц и пластиковый фильтродержатель фирмы «Millipore».
Для измерения светопоглощения растворов и бумажных фильтров используют фотометр КФК-3, интенсивности окраски носителей
(коэффициент отражения R)  портативный рефлектометр «Унифот–
тест-405» фирмы «Марафон» (Россия). Для нанесения аликвот растворов на носители используют микродозаторы типа “Eppendorf”. Значения
рН растворов измеряют с помощью ионометра И-130 с точностью 0.01.
Выполнение определения меди(II)
В середину бумажного фильтра (с привитыми группами или без
них) наносили: 1) 0.5 мкл буферного раствора из смеси уксусной, борной и фосфорной кислот с добавлением NaОН (рН 5.6 или 6.8 в присутствии малононитрила и 5.6 или 8.0-8.8 - в его отсутствие); 2) 1 мкл раствора меди(II) либо анализируемого раствора; 3) 0.5-1 мкл раствора 2,2’дипиридила в этаноле (0.1 М); 4) 1 мкл раствора Н 2О2 (9 М); 5) 1 мкл
раствора малононитрила в этаноле (0.3 М) (только в случае использования методики с модификацией продукта реакции); 6) 1.5 мкл раствора
гидрохинона (0.4 М). После того, как каждая нанесенная аликвота растворов 1-3 впитывалась, фильтр высушивали струей сжатого воздуха до
визуального отсутствия влаги. Измерения оптической плотности фильтров проводили по ранее разработанной методике: после нанесения
предпоследнего раствора (Н2О2 или малононитрила) фильтр, не высушивая, зажимали между двумя стеклянными пластинками (5524 мм) и
помещали в фотометр перпендикулярно световому потоку, устанавливали темновой ток прибора и устанавливали ноль оптической плотности
(установку нуля необходимо повторять для каждого образца с целью
повышения воспроизводимости, поскольку кусочки бумаги различаются
по плотности). Затем фильтр вынимали, высушивали, наносили последний раствор (гидрохинон) и, не высушивая, измеряли оптическую плотность так же, как это делали при установке нуля. Началом реакции считали момент нанесения раствора гидрохинона; в качестве аналитического сигнала использовали оптическую плотность образца через 5 мин
(А5) при 490 нм (в случае реакции без малононитрила) или через 7 мин
(А7) при 500 или 620 нм (в присутствии малононитрила). Кинетические
кривые получали, измеряя оптическую плотность в течение 10 мин.
Концентрацию меди(II) в анализируемом растворе определяли методом градуировочного графика, который строили в координатах А от с.
Выполнение определения гистамина
Получение Cu-ГМДА-фильтра. Медьсодержащий бумажный носитель (Cu-ГМДА-фильтр) получают путем покачивания через ГМДАфильтр 10 мл раствора, состоящего из 5 мл 0.1 мкг/мл меди(II) и 5 мл
буферного раствора (рН 5.6). Затем фильтр высушивают струей сжатого
воздуха.
Проведение индикаторной реакции на Cu-ГМДА-фильтрах. Реагенты наносят на Cu-ГМДА-фильтры в следующей последовательности:
универсальный буферный раствор (рН 7.5; 0.5–1.0 мкл); гистамин или
деионированная вода (1 мкл); Н2О2 (4 М; 1 мкл); малононитрил (110-2
М; 1 мкл) и гидрохинон (0.2 М; 1.5 мкл). После нанесения каждого реагента фильтры высушивают потоком воздуха. До нанесения гидрохинона фиксируют фоновое показание рефлектометра (Vo), затем наносят
гидрохинон и в это время включают секундомер и начинают измерения.
Напряжение на фотодиоде (светодиоды 470, 525 и 615 нм), которое
фиксируют каждую секунду в течение 30 с с помощью соединенного с
компьютером по интерфейсу RS-232 мультиметра Metex, должно понижаться по мере повышения интенсивности окраски пятна на фильтре.
Скорость реакции (30) характеризуют методом тангенсов на начальном
участке (030 с) кинетической кривой (зависимости коэффициента отражения R от времени). Коэффициент отражения рассчитывают по форV  Vd ; где V - сигнал при текущем измерении, Vd – сигмуле:
R
Vo  Vd
нал при неосвещенном фотоприемнике, Vo – сигнал, полученный при
измерении неокрашенного сорбента.
Концентрацию гистамина в анализируемом растворе рассчитывают методом градуировочного графика.
Лабораторная работа № 7. Определение меди(II) сорбционнокаталитическим методом в сочетании с тонкослойной хроматографией
В данной работе используют тонкослойную хроматографию (ТСХ)
для разделения смеси катионов металлов с последующим детектированием меди(II) каталитическим методом непосредственно на носителе.
На примере меди(II) показано, что сочетание ТСХ с сорбционнокаталитическим методом повышает чувствительность и селективность
последнего.
В качестве модельной используют смесь, содержащую катионы тяжелых металлов: медь(II), свинец(II), кадмий(II) и ртуть(II); а в качестве
индикаторной для определения меди(II) сорбционно-каталитическим
методом в тонком слое  реакцию восстановления железа(III) тиосульфатом натрия в присутствии о-фенантролина (Phen), катализируемую
медью(II). По литературным данным предел обнаружения меди(II) в
методиках со спектрофотометрическим контролем за скоростью этой
реакции в присутствии роданид-ионов в варианте проточноинжекционного анализа составил 60 нг/мл и 0.25 мкг/мл в варианте непрерывного проточного анализа.
Реагенты и аппаратура
Все реагенты используют квалификации ч.д.а и х.ч.
Водные растворы готовят на деионизированной воде. Хлорид железа(III) растворяют в 0.1М соляной кислоте, о-фенантролин  в этиловом
спирте.
Используют пластины для ТСХ Sorbfil 100100мм.
Коэффициент зонального диффузного отражения (R, %) измеряют
на рефлектометре-колориметре «ЭКОТЕСТ-2040» («Эконикс», Россия):
R, % = V/Vo100%, где Vo - сигнал при максимальной освещенности фотоприемника, т.е. фоновый сигнал, V - сигнал при текущем измерении.
Выполнение определения меди
Методика проведения индикаторной реакции Fe(III) – Cu(II) –
S2O32-– Phen после хроматографирования на пластинах Sorbfil. Вырезают полоску из пластины Sorbfil шириною 1,5 см, отмечают линию
старта на расстоянии 1 см, на которую затем наносят 2 мкл раствора
меди(II) или анализируемого раствора. Пластину устанавливают в камеру для ТСХ с 2 мл подвижной фазы (83% н-бутанола, 17% 1.5М HCl) с
добавлением 1.25 мг/мл ГМДА. После хроматографирования пластину
вынимают и высушивают. Реакцию проводят в центре зоны, Rf которой
устанавливали путем параллельного эксперимента в аналогичных условиях на другой полоске с помощью 2% раствора KI для обнаружения
меди(II) в виде бурых пятен, следующим образом: последовательно
наносят по 2 мкл следующих растворов реагентов 5,0·10-2 М офенантролина, 0.1 М HCl, 0.012 M Na2S2O3, 5·10-4 М Fe(III). Скорость
реакции определяют методом тангенсов. Для этого наблюдения за скоростью реакции проводят методом спектроскопии диффузного отражения, измеряя зональный коэффициент отражения R с помощью рефлектометра ЭКОТЕСТ-2040 при 470 нм. После добавления реагентов пятно
сушат потоком воздуха, затем после добавления тиосульфата натрия
измеряют фон (V0), помещая пластину в кювету для рефлектометра, а
добавление раствора железа(III) считают началом реакции. С помощью
программных приложений Ecotest-2020 и MS Excel получают зависимость 1/R от времени t, по которой рассчитывают скорость реакции ()
методом тангенсов за 30 – 60 с.
Лабораторная работа № 8. Определение гистамина и -аланина
сорбционно-каталитическим методом в сочетании с планарной
хроматографией
В качестве индикаторных для определения гистамина и -аланина
по активирующему или ингибирующему действию на катализатор использовали катализируемые медью(II) реакции ГХ – H2O2 – МН и Fe3+ –
S2O32- – Phen, проводимые на бумажных носителях и в тонком слое.
Работ по использованию планарной хроматографии для разделения
аналитов с последующим их детектированием кинетическими методами
в литературе встречается мало. Сочетание методов разделения и детектирования в этих работах реализовано в комбинированном или гибридном варианте. В комбинированном варианте аналит после разделения
десорбируют в раствор, в котором и проводят его определение; а в гибридном – определяют на носителе непосредственно после хроматографирования.
Реагенты и аппаратура
Гидрохинон ч.д.а., очищенный возгонкой; Н2О2 ос.ч., точную концентрацию которого устанавливают методом перманганатометрии; малонодинитрил 99%; CuSO45H2O и FeCl36H2O ч.д.а.; о-фенантролин
ч.д.а.; Na2S2O3 ч.д.а. (Россия), очищенный перекристаллизацией; гистамин ч.д.а.; α-аминокислоты ч.д.а. и х.ч.; органические растворители:
этиловый спирт ректификат, 96%; н-пропанол ч.д.а. Другие неорганические и органические реагенты, использованные в данной работе, имели
квалификацию ч.д.а. и х.ч.; их применяли без дополнительной очистки.
В работе используют деионизированную воду, которую получают
из дистиллированной с помощью прибора для получения особо чистой
воды «Водолей» НПП «ХимЭлектроника» (Россия).
Буферные растворы (рН 3.0 – 10.0) готовят из раствора смеси
СH3COOH, H3PO4, Н3BO3 (0.04 М по каждой из кислот) и 0.2 М раствора NaOH или КОН. Хлорид железа(III) растворяют в 0.1М соляной кислоте; малонодинитрил, о-фенантролин и другие органические вещества,
плохо растворимые в воде – в этаноле, ацетоне и ССl4. Все остальные
растворы готовили растворением точных навесок в воде.
В качестве носителей для проведения индикаторных реакций, а
также неподвижных фаз для бумажной хроматографии (БХ) и ТСХ использовали бумажные фильтры на основе фильтровальной бумаги (ФБ)
с синей лентой и пластины Sorbfil, 100100 мм (ПТСХ-П-А, «Сорбполимер», Россия).
Хроматографирование проводят в стеклянных камерах для ТСХ
90150 мм. Для взятия аликвот и микроколичеств растворов используют
дозаторы с переменным объёмом «Ленпипет» и микродозаторы «Eppendorf». Значения рН растворов измеряют с помощью иономера «Экотест120» с точностью ±0.01 рН. Интенсивность окраски носителей (коэффициент отражения R) измеряют на портативном рефлектометре «Унифот–тест-405» («Марафон», Россия).
Выполнение определения гистамина и -аланина
Методика (1) проведения индикаторных реакций на носителях. Реагенты наносили с помощью дозатора в одну и ту же точку на бумаге
или пластине Sorbfil в следующей последовательности: буферный раствор (рН 6.0, 1 мкл), Cu(II) (30 мкг/мл, 2 мкл), гистамин (2 мкл), Н 2О2 (1
М; 2 мкл), малонодинитрил (0.3 М, 2 мкл) и гидрохинон (0.3 М, 3 мкл)
для реакции ГХ–Cu(II) –H2O2–МН и о-фенантролин (7.510-2 М, 2 мкл),
HCl (0.1М, 1 мкл), Cu (II) (10 мкг/мл, 2 мкл), -аланин (1 мкл), Na2S2O3
(2.010-2 М, 2 мкл) и FeCl3 (7.510-4 М, 2 мкл) для реакции Fe(III)–Cu(II)–
S2O32-–Phen соответственно. После нанесения каждого реагента фильтры высушивали потоком воздуха. Фоновое показание рефлектометра
(Vo) фиксировали после нанесения малонодинитрила (или офенантролина), затем наносили гидрохинон (или FeCl3) и в это время
включали секундомер и начинали измерения. Напряжение на фотодиоде
(светодиоды 470 и 525 нм) фиксировали каждую секунду в течение 30 с
помощью мультиметра Metex, соединенного с компьютером по интерфейсу RS-232, понижалось по мере повышения интенсивности голубой
и розово-красной окраски пятна на носителе в случае реакций ГХ–
Cu(II)–H2O2–МН и Fe(III)–Cu(II)–S2O32-–Phen соответственно. Скорость
реакции (30) рассчитывали методом тангенсов на начальном участке (030 с) кинетической кривой (зависимости коэффициента отражения R от
времени). Коэффициент отражения рассчитывали по формуле:
V  Vd , где V - сигнал при текущем измерении, Vd – сигнал при неR
Vo  Vd
освещенном фотоприемнике, Vo – сигнал, полученный при измерении
неокрашенного сорбента.
Методика (2) проведения индикаторных реакций в сочетании с
планарной хроматографией. Вырезали полоску из бумаги или пластины
Sorbfil шириной 5  7 см, отмечали линию старта на расстоянии 1.5  2
см, на которую затем наносили по 2 мкл исследуемых растворов и свидетелей (110-2 М гистамина и -аланина) для контроля Rf. Бумагу (пластину) устанавливали в камеру для ТСХ с 2 мл подвижной фазы. После
хроматографирования бумагу (пластину) высушивали потоком сжатого
воздуха. Затем отрезали полоску с зонами свидетелей и проявляли их с
помощью 0.25%-ного раствора нингидрина в ацетоне для установления
Rf. В случае гистамина и -аланина индикаторные реакции проводили в
зонах Rf по методике (1).
Для построения градуировочных графиков в координатах 30 от lgс
используют стандартные растворы гистамина и -аланина в диапазоне
концентраций 510-14 – 110-10 и 510-7 – 510-5 М соответственно. Концентрацию аналитов в анализируемом растворе находят методом градуировочного графика.
Лабораторная работа № 9. Определение коллагена каталитическим методом в сочетании с тонкослойной хроматографией
Ранее было изучено влияние коллагена на каталитическую активность меди в некоторых известных индикаторных реакциях: окисление
ТМБ, ГХ и сульфаниловой кислоты (СК), восстановление железа(III).
Во всех случаях скорость реакции в присутствии 510-9510-8 М коллагена увеличивается (активирующий эффект). В реакции ТМБ–Cu(II)–
(NH4)2S2O8 эффект активирования коллагена максимален и проявляется
при более низких концентрациях катализатора по сравнению с другими
реакциями. Кроме того, в реакции окисления ТМБ образуется интенсивно окрашенный в зеленый цвет продукт с максимумом поглощения
655 нм. Поэтому эта реакция выбрана в качестве индикаторной для
определения коллагена. Для повышения селективности каталитического
определения коллагена используют предварительное разделение методом ТСХ. Сочетание методов разделения и детектирования в таком слу-
чае проводят в комбинированном варианте: элюирование разделенной
зоны и последующее определение аналита в растворе.
Реагенты и аппаратура
CuSO45H2O ч.д.а.; (NH4)2S2O8 ч.д.а., дополнительно очищенный
перекристаллизацией; 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ) ч.д.а. (Германия); коллаген (сухой, тип I, Германия); этиловый спирт ректификат,
96% и ацетон х.ч. (Россия). Другие неорганические и органические реагенты, ч.д.а. и х.ч.; их применяли без дополнительной очистки.
В работе использовали деионизированную воду, которую получали
из дистиллированной с помощью прибора для получения особо чистой
воды «Водолей» НПП «ХимЭлектроника» (Россия).
Буферные растворы (рН 3.0 – 10.0) готовили из раствора смеси
СH3COOH, H3PO4, Н3BO3 (0.04 М по каждой из кислот) и 0.2 М раствора NaOH или КОН. 3,3’,5,5’-Тетраметилбензидин и другие органические
вещества, плохо растворимые в воде растворяли в этаноле, ацетоне и
ССl4. Все остальные растворы готовят растворением точных навесок в
воде. Коллаген растворяют в 0.25М уксусной кислоте при перемешивании в течение не менее 2 ч при температуре 50С.
В качестве носителя для проведения индикаторной реакции, а также неподвижной фазы для ТСХ используют пластины Sorbfil, 100100
мм (ПТСХ-П-А, «Сорбполимер», Россия).
Хроматографирование проводят в стеклянных камерах для ТСХ
90150 мм. Для взятия аликвот и микроколичеств растворов использовали дозаторы с переменным объёмом «Ленпипет» и микродозаторы
«Eppendorf». Значения рН растворов измеряли с помощью иономера
«Экотест-120» с точностью ±0.01 рН. Оптическую плотность растворов
измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-3-01 (Россия).
Выполнение определения коллагена
Методика (1) проведения индикаторной реакции ТМБ–Cu(II)–
(NH4)2S2O8 в растворе. Растворы реагентов смешивали в пробирке в
следующей последовательности: 1.5 мл 210-4 М (NH4)2S2O8, 1.5 мл этанола, 1 мл 0.4 мкг/мл Сu(II), 1 мл раствора коллагена или анализируемого раствора, 4.95 мл буферного раствора рН 4.35, 50 мкл 2.510-3 М ТМБ.
Общий объем реакционной смеси составил 10 мл. В момент добавления
ТМБ включали секундомер, интенсивно перемешивали реакционную
смесь, переливали в кювету (l = 2 см) и либо снимали спектры поглощения продуктов реакции, либо измеряли оптическую плотность раствора
при 655 нм каждые 15 с в течение 7 мин. Скорость индикаторной реакции в растворе рассчитывали методом тангенсов.
Методика (2) проведения индикаторной реакции в сочетании с
планарной хроматографией. Вырезали полоску из пластины Sorbfil шириной 5  7 см, отмечали линию старта на расстоянии 1.5  2 см, на которую затем наносили по 2 мкл исследуемых растворов и свидетеля
(510-8 М коллагена) для контроля Rf. Пластину устанавливали в камеру
для ТСХ с 2 мл подвижной фазы. После хроматографирования пластину
высушивали потоком сжатого воздуха. Затем отрезали полоску с зоной
свидетеля и проявляли ее с помощью 0.25%-ного раствора нингидрина в
ацетоне для установления Rf. Зону, где предположительно находится
коллаген, вырезали и помещали в 2 мл 0.25М раствора уксусной кислоты на 20–30 мин. Затем 1 мл полученного раствора вводили в индикаторную реакцию, как это описано в методике (1).
ЛИТЕРАТУРА
1. Основы аналитической химии: учебник для вузов: в 2 кн. / под
ред. Ю. А. Золотова. - М. : Высш. шк., 2004. - Кн. 1 - 361 с. - Кн. 2 - 503
с.
2. Крейнгольд С.У. Каталиметрия в анализе реактивов и веществ
особой чистоты. М.: Химия, 1983. – 192 с.
3. Марк Г., Рехниц Г. Кинетика в аналитической химии. / Пер. с
англ. Под. ред. К.Б. Яцимирского. М.: Мир, 1972. - 368 с.
4. Яцимирский К.Б. Кинетические методы анализа. Изд. 2-е. М.:
Химия. 1967. – 199 с.
5. Д. Перес-Бендито, М. Сильва Кинетические методы в аналитической химии: Пер. с англ. М.: Мир, 1991. - 395 с.
6. Бончев П. Комплексообразование и каталитическая активность.
/ Пер. с болг. Под ред. К.Б. Яцимирского. М.: Мир, 1975. – 270 с.
7. Mottola H.A., Perez-Bendito D. Kinetic determinations and some
kinetic aspects of analytical chemistry // Anal. Chem. 1992. V. 64. No 12. P.
407R-428R.
8. И. Ф. Долманова. Каталитические методы химического анализа
// Соросовский образовательный журнал. 1998. № 5. С. 36 – 40.
9. И. Ф. Долманова, Т. Н. Шеховцова. Гибридный сорбционнокаталитический метод химического анализа // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим.
об-ва им. Д.И. Менделеева). 2001. Т. XLV. № 4. С. 95 – 103.
10. Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н., Беклемишев М.К. Сорбционно-каталитические тест-методы // Журн. аналит. химии. 2002. Т. 57.
№ 10. C. 1043–1051.
11. Прикладной химический анализ: Практическое руководство
под ред. Т.Н. Шеховцовой, О. А. Шпигуна, М. В. Попика. - М.: Изд-во
МГУ, 2010. - 456 с.
12. M.K.Beklemishev, Yu.Yu.Petrova, I.F.Dolmanova. Sorptioncatalytic testing of copper on a paper-based sorbent with attached alkylamino
groups // Analyst. 1999. V.124. № 10. P.1523-1527.
13. Ю.Ю.Петрова,
М.К.Беклемишев,
Н.А.Бажанова,
А.А.Дружинин, И.Ф.Долманова. Определение меди по ее каталитическому действию в реакции окисления гидрохинона пероксидом водорода, проводимой на носителях // Журн. аналит. химии. 2000. Т. 55. № 3.
С. 318-325.
14. Beklemishev M.K., Petrova Yu. Yu., Dolmanova I.F. SorptionCatalytic Determination of Imazapyr on a Copper-Containing Sorbent. //
Mikrochim. Acta. 2001. N 136. P. 35-41.
15. М.К. Беклемишев, Ю.Ю.Петрова, О.М.Абрамова, И.Ф. Долманова. Сорбционно-каталитический метод определения азотсодержащих
органических соединений. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 2003.
Т.44. № 2. С.115-122.
16. Ю.Ю.Петрова. Сорбционно-каталитический метод определения
гистамина // Журн. аналит. химии. 2010. Т. 65. № 5. С. 538–547.
17. Petrova Yu. Yu., Zol’nikov Yu. A. Sorption Catalytic Method for
the Determination of Copper (II) in Combination with Planar Chromatography // Inorganic Materials. 2012. Vol. 48. No. 15. pp. 1328–1334.