Автореферат - Российский кардиологический научно

На правах рукописи
Смирнова Людмила Александровна
Изучение связи мутаций митохондриального генома с
атеросклеротическим поражением коронарных и сонных
артерий
14.01.05 – кардиология
03.02.07 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2014
1
Работа выполнена в отделе проблем атеросклероза и лаборатории медицинской генетики
НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс» МЗ РФ
Научные руководители:
доктор медицинских наук
Ежов Марат Владиславович
доктор медицинских наук
Постнов Антон Ювенальевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор кафедры
терапии, кардиологии и функциональнойдиагностики
с курсом нефрологии ФГБУ «Учебно-научныймедицинский центр»
УД Президента РФ
Затейщиков Дмитрий Александрович
доктормедицинских наук, профессор,
заведующая лабораторией медицинской генетикиФГБУ
«Российский научный центр хирургии имени академика
Б.В. Петровского» РАМНЗаклязьминская Елена Валерьевна
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский
медицинский университет имени Н. И. Пирогова» МЗ РФ
Защита диссертации состоится « »2014года в 13.30 на заседании диссертационного совета
Д 208.073.04 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГБУ
«Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ (121552,
Москва, ул. 3-я Черепковская, д.15а)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Российский кардиологический
научно-производственный комплекс» МЗ РФ
Автореферат разослан «
»
2014 года
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат медицинских наук
Полевая Т.Ю.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Атеросклероз представляет собой полиэтиологическое заболевание, в
развитии и прогрессировании которого играет роль взаимодействие генетических,
фенотипических, средовых и социально-экономических факторов[AndreassiM.G.,
2003]. Данные последних исследованийсвидетельствуют о том, что в развитии
атеросклероза имеетзначение не только генетическая предрасположенность, но и
приобретенные соматические мутации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)
также могут вносить значительный вклад в патогенез заболевания. В течение
длительного
времени
мутациям
митохондриального
генома
не
уделялось
должноговнимания, хотя они могут играть важную роль в формировании
атеросклеротических поражений артерий,вызывая различные дефекты в белковой
цепи некоторых дыхательных ферментов, приводя к развитию митохондриальной
дисфункции[Andreassi M.G., 2003]. Митохондриальная дисфункция способствует
избыточному образованию активных форм кислорода, которые вызывают
эндотелиальную дисфункцию, пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов,
приводят
к
развитию
воспалительной
сосудистой
реакции,
апоптозу
гладкомышечных клеток и макрофагов, внося, тем самым, вклад в развитие и
прогрессирование атеросклеротического поражения [Madamanchi N.R. еt al., 2007].
Количество
исследований,
посвященных
изучению
связи
мутациймитохондриального генома и атеросклеротическим поражением артерий,
невелико [Sazonova M.A. et al., 2009; Weakley S.M. et al., 2010; Mueller E.E. et al.,
2011; Sobenin I.A. et al., 2013].
В исследовании при изучении 40 мутаций в образцах митохондриальной
ДНК (мтДНК), выделенных из пораженных атеросклерозом и нормальных
участков интимы аорты 10 молодых людей, погибших вследствие несчастных
случаев, обнаружено, что уровни гетероплазмии десяти мутаций мтДНК (A1555G,
С3256T, G12315A, T3336C, G13513A, C5178A, G15059A, G14459A, G14846A,
652insG) были значительно выше в участках аорты, пораженных атеросклерозом
[Sazonova M. et al., 2009].
В исследовании с участием 191 пациента (84 мужчин, средний возраст
65,09,4 лет), из которых у 45 больных были клинические проявления
3
ишемической болезни сердца (ИБС),была показана ассоциация между уровнем
гетероплазмии мутации митохондриального генома С3256Т в лейкоцитах крови и
атеросклеротическим поражением сонных артерий [Sobenin I.A. еt al., 2012].
В австрийском исследовании было установлено, что распространенность
мутации митохондриального генома T16189C была значительно выше среди
пациентов с ИБС(n=482) по сравнению со здоровыми лицами (n=481): 21,6% и
11,8% соответственно, р<0,0001 [Mueller E.E. et al., 2011]. Однако в этой работе
использовался качественный, а не количественный метод оценки мутаций
митохондриального генома.
Таким
образом,
проблеме,немногочисленны,
исследования,
в
связи
с
чем,
посвященныеданной
изучение
роли
мутаций
митохондриального генома в развитии атеросклероза коронарных и сонных
артерий представляется актуальным.
Цель исследования.
Изучить
связь
мутаций
митохондриального
генома
с
наличием
и
выраженностью атеросклеротического поражения коронарных и сонных артерий.
Задачи исследования.
1.
Оценить уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома
(С3256Т, G12315A, G13513A, G14846A) в лейкоцитах цельной крови у пациентов с
наличием и отсутствием коронарного атеросклероза.
2.
Изучить связь между митохондриальными мутациями и тяжестью
атеросклероза коронарных артерий.
3.
Исследовать возможную связь мутаций митохондриального генома с
классическими факторами риска атеросклероза.
4.
Оценить уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома
(С3256Т, G12315A, G13513A, G14846A) в лейкоцитах цельной крови у пациентов с
различной степенью атеросклеротического поражения сонных артерий.
Научная новизна.
В работе был использован метод количественной оценки мутантного аллеля
митохондриального генома на основе технологии пиросеквенирования для
определения уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома. Впервые
проведено исследование мутаций митохондриального генома у пациентов с
4
наличием и отсутствием коронарного атеросклероза, верифицированного данными
коронарной ангиографии. Установлено, что уровень гетероплазмии мутаций
митохондриального генома С3256Т, G13513A выше у пациентов с коронарным
атеросклерозом. Выявлена отрицательная связь мутации G12315Ac атеросклерозом
коронарных артерий. Впервые изучена взаимосвязь изучаемых мутаций с
выраженностью коронарного атеросклероза, установлена прямая связь мутации
С3256Т состепенью атеросклеротического поражения коронарных артерий.
Выявлена прямая зависимость между наличием атеросклероза сонных артерий и
уровнем гетероплазмии мутаций митохондриального генома С3256Т, G14846A и
обратная - с мутацией G12315A. Впервые было показано наличие прямой связи
между
мутацией
митохондриального
генома
G14846A
и
уровнем
липопротеида(а)[Лп(а)].
Практическая значимость работы.
В работе использована методика количественной оценки мутантного аллеля
митохондриального генома. Показана связь уровня гетероплазмии мутаций
митохондриального генома G13513A и С3256T с коронарным атеросклерозом,
мутаций С3256Т, G14846A - с атеросклерозом сонных артерий.Учитывая
полученные данные, мутации митохондриального генома могут быть использованы
в качестве информативных генетических маркеров предрасположенности к
атеросклерозу коронарных и сонных артерий.
Понимание
точных
механизмов,
с
помощью
которых
мутации
митохондриального генома способствуют развитию атеросклероза, откроет новые
мишени для разработки лекарственных препаратов.
Мутации митохондриального генома не связаны с классическими факторами
риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), такими как пол, курение,
артериальная гипертония, ожирение, отягощенный семейный анамнез по ССЗ.
Впервые показана положительная связь между уровнем гетероплазмии
мутации G14836A и уровнем Лп(а), что требует дальнейшего изучения.
Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в научную и
практическую работу отдела проблем атеросклероза и отдела сердечно-сосудистой
патологии НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ.
5
Апробация диссертации состоялась 11 ноября 2013 года на заседании
межотделенческой конференции НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ
«РКНПК» МЗ РФ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6работ, в том числе 3
статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной
комиссией для публикации результатов диссертационных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124страницах
машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, практических
рекомендаций и списка литературы, включающего 220 отечественных и
зарубежных источников. Диссертация содержит 31 таблиц, 23 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
В исследование включены 193 пациента (154 мужчин и 39 женщин) в
возрасте от 33 до 78 лет.
Критерии включения: в исследование включались мужчины и женщины
старше 18 лет, имеющие показания для проведения коронарной ангиографии
(КАГ).
Критериями
исключения
из
исследования
были:
1)
семейная
гиперхолестеринемия; 2) концентрация ТГ ≥4,5 ммоль/л; 3) острый коронарный
синдром, оперативные вмешательства в последние 3 месяца; 4) онкологические
заболевания в анамнезе; 5) сахарный диабет; 6) дисфункция печени, почек,
щитовидной железы.
Исходя из данных ангиографии, обследованные больные были разделены на
2 группы: основную группу составили 130 пациентов с атеросклерозом
коронарных артерий. Группу контроля составили 63 пациента с интактными
коронарными артериями, это лица, имеющие несколько факторов риска ССЗ, у
которых при проведении обследования выявлен сомнительный результат пробы с
физической нагрузкой.
Биохимические методы исследования.
Определение концентрации общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ),
холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛВП) в сыворотке крови
проводили
клинической
ферментативным
биохимии
колориметрическим
липидного
обмена.
6
методом
в
лаборатории
Содержание
холестерина
липопротеидов низкой плотности (ХС ЛНП) рассчитывали по формуле Фридвальда
(1972): ХС ЛНП = ОХС - ХС ЛВП - ТГ/2,2 (ммоль/л). Определение концентрации
Лп(а)
проводили
методом
твердофазного
иммуноферментного
анализа
с
использованием моноспецифических поликлональных антител барана против Лп(а)
человека [Афанасьева О.И. и др., 1995].
Генетическое исследование.
Для данного клинического исследования было выбрано 4 мутации
митохондриального генома G13513A, G14846A, C3256Т и G12315A, для которых
повышенный
уровень
гетероплазмии
был
связан
с
атеросклеротическим
поражением по данным аутопсии [Sazonova M. et al., 2009].
Для исследования мутаций митохондриальногогенома кровь собирали в
пробирки, содержащие этилендиаминтетраацетат в качестве антикоагулянта. Кровь
замораживали и хранили при -20оСдо проведения анализа.
Выделение геномной ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили методом
фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. Измерение
концентрации ДНК проводили нанофотометром IMPLEN, GmbH, Германия. Далее
разводили ДНК водой mQ (18,2) до концентрации 30 нг/мкл. Хранили ДНК при
температуре – 20оС.
С целью амплификации короткоцепочечных участков мтДНК проводилась
полимеразная цепная реакция (ПЦР) в амплификаторе РТС-200 (MJ Research,
США). Для проведения ПЦР использовали раствор ДНК с концентрацией 30
нг/мкл и праймеры (таблица 1) с концентрацией 10 пмоль/мкл (ООО «Синтол»,
Москва). В состав реакционной смеси объемом 40 мкл входили: матричная ДНК 4
мкл, праймер F 2,7 мкл, праймер R 2,7 мкл, Taq-полимераза, 5 ед/мкл (ЗАО
«Силекс», Москва) - 1,33 мкл, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: 2 mM
аденозилтрифосфата, 2 mM тимидилтрифосфат, 2 mM гуанозилтрифосфата, 2 mM
цитозилтрифосфата – 4 мкл, 70 mM Трис-HCl, pH 8,6, 16,6 mM (NH4)2SO4, MgCl2,
25 mM – 4 мкл (при необходимой концентрации 2,5 мМ) или 2,4 мкл (при
необходимой концентрации 1,5 мМ), вода mQ 1,8 – до 40 мкл.
7
Таблица 1. Последовательность праймеров для полимеразной цепной
реакции.
Мутация
Праймеры для ПЦР
C(Mg2+)
C3256T
bio-AGGACAAGAGAAATAAGGCC
2,5mM
ACGTTGGGGCCTTTGCGTAG
G12315A
bio-CTCATGCCCCCATGTCTAA
2,5mM
TTACTTTTATTTGGAGTTGCAC
G13513A
bio-AAGTCCTAGGAAAGTGACAGCGAGG
1,5mM
CCTCACAGGTTTCTACTCCAAA
G14846A
bio-CATTATTCTCGCACGGACT
1,5mM
GCTATAGTTGCAAGCAGGAG
Примечание. А – аденин, С - цитозин, Т – тимин, G – гуанин, bio –
биотинилированный праймер, C(Mg2+) – концентрация магния.
ПЦР проводили по схеме: денатурация ДНК при 94°С в течение 4 мин. Затем
проводили 35 циклов амплификации, включающей в себя денатурацию ДНК
(94°С/30 секунд), отжиг праймеров (56°С/30 секунд для C3256T, G13513A,
G14846A и 50°С/30 секунд для G12315A) и элонгацию (синтез второй цепи) 72°С/1
мин. По окончании 35 циклов осуществляли заключительную элонгацию 72°С/7
мин. Детекцию продуктов ПЦР
- амплификаты проводили с помощью
электрофореза в 1,5% агарозном геле.
Пиросеквенирование.
Далее
нуклеотидной
ПЦР
амплификаты
последовательности
были
и
пиросеквенированы
определения
уровня
для
детекции
гетероплазмии
исследуемых мутаций с помощью соответствующих праймеров («Синтол»,
Москва, РФ) (таблица 2). Пиросеквенирование проводили в автоматическом 96луночном анализаторе PSQ96MA (PyrosequencingAB, Швеция) по методике,
рекомендованной производителем.
Таблица 2. Праймеры для проведения пиросеквенирования.
Мутация
Сиквенсовый праймер
C3256T
AAGAAGAGGAATTGA
G12315A
TTTGGAGTTGCAC
G13513A
AGGTTTCTACTCCAA
G14846A
GCGCCAAGGAGTGA
Примечание.А – аденин, С - цитозин, Т – тимин, G – гуанин.
8
Определение
уровня
гетероплазмии
мутаций
митохондриального
генома.
Количественная оценка мутантного аллеля заключалась в расчете уровней
гетероплазмии мутаций мтДНК с использованием высот пиков пирограммы в
исследуемой
генома.
области
Формула
одноцепочечного
для
подсчёта
ПЦР-фрагмента
процента
митохондриального
гетероплазмии
мутаций
митохондриального генома была разработана Сазоновой М.А и соавторами в
лаборатории медицинской генетики НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова:P = (hN) / (M-N) * 100%; где P – процент гетероплазмии, h – высота пика исследуемого
нуклеотида,N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию
в образце 100% нормальных аллелей, M – высота пика исследуемого нуклеотида,
соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей[Sazonova M. et al.,
2009].
Для каждой из мутации C3256T, G13513A, G14846A, G12315A на основании
общей формулы была создана собственная формула. Расчет производился с
помощью программы MicrosoftExel.
Коронарная ангиография выполнялась на аппарате Allura Xper FD-10
(Philips, Нидерланды) через феморальный, радиальный либо ульнарный доступ
Автоматический количественный анализ ангиограмм проводился на цифровой
системе “Xcelera” (Philips, Нидерланды). Оценка поражения коронарного русла
проводилась на основе ангиографической симптоматологии по двум методикам: 1)
с учетом числа пораженных магистральных артерий (1; 2; 3), имеющих сужение
просвета более 50% по диаметру; 2) по суммарному индексу стенозов (индекс
Gensini), учитывая степень уменьшения просвета 15 основных сегментов
коронарных артерий (Рекомендации Американской Ассоциации Сердца, 1975).
Одним баллом оцениваются сужение просвета артерии до 50% по диаметру; 2 - на
50 - 74%; 3 - на 75 - 99% и 4 - окклюзия сосуда. Сумма баллов, полученная при
оценке поражения коронарного русла, представляет собой коронарный индекс
стенозов для каждого больного.
Ультразвуковое дуплексное сканирование брахиоцефального ствола,
правой и левой общих сонных артерий, внутренних и наружных сонных артерий,
позвоночных и подключичных артерий проводилось по стандартной методике в В9
режиме с цветовым допплеровским картированием потоков линейным датчиком 7
Мгц ультразвуковой системы «АСUSON 128 ХР 10», а также на аппарате Philips iU
22 и Philips Ewiser. У всех больных оценивали наличие атеросклеротических
бляшек
с
оценкой
степени
стенозирования.
Атеросклеротическая
бляшка
определялась как «фокальная» структура, выступающая в просвет артерии не
менее, чем на 0,5 мм или на 50% от величины толщины интима-медиа
прилегающих участков артерии, либо имеющая толщину, измеренную как
расстояние между линиями раздела «медиа - адвентиция» и «просвет артерия интима» более 1,5 мм (по данным Международного консенсуса по ТИМ 2004-2006
годов [Touboul P.J. et al., 2007].
Статистический анализ данных.
Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью пакета
прикладных статистических программ STATISTICA (v.6.0). Вид распределения
количественных признаков анализировали при помощи теста КолмогороваСмирнова.
При
описании
количественных
показателей
с
нормальным
распределением приводились среднее значение (М) и стандартное отклонение
(SD), если распределение не соответствовало параметрическому, приводили
медиану (Ме) и межквартильные интервалы (25-й процентиль; 75-й процентиль).
Для качественных величин данные представляли какn(%).Для оценки значимости
статистических
различий
по
количественному
признаку
использовались
параметрический (t критерий Стьюдента) и непараметрический (критерий МаннУитни) методы. Значимость различий качественных признаков в группах
наблюдения оценивали при помощи непараметрического критерия 2 Пирсона, при
малой встречаемости признака использовали точный тест Фишера. Для оценки
связи мутаций митохондриального генома с факторами риска и атеросклерозом
коронарных
и
сонных
артерий
использовался
корреляционный
анализ
с
использованием рангового критерия Спирмена. Для оценки диагностической
значимости
мутаций
митохондриального
генома
были
построены
характеристические кривые. В качестве критерия диагностической значимости
рассчитывали площадь под кривой. Уровень значимости принят при р<0,05.
10
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
За период с 2010 по 2012гг в исследование включены 193 пациента (154
мужчин и 39 женщин) в возрасте от 33 до 78 лет (средний возраст 54,69,5 лет).
Группы были сопоставимы по возрасту, артериальной гипертонии, ожирению,
отягощенной наследственности по отцовской линии (таблица 3). В основной
группе было больше мужчин, чем в контрольной группе. Мужчины с коронарным
атеросклерозом были существенно старше. Средний возраст у обследованных
женщин между группами не отличался. Лиц с отягощенным анамнезом по
материнской линии было больше среди больных в основной группе: 26% против
13% в контрольной группе, p=0,05. В группе с коронарным атеросклерозом
встречались существенно чаще лица с курением в анамнезе: 68% в сравнении с
24%, p<0,001. В основной группе 60% больных перенесли инфаркт миокарда, у
половины было стентирование коронарных артерий,
у 18%
- операция
аортокоронарного шунтирования в анамнезе.
Таблица 3.Клиническая характеристика групп обследованных больных
Показатель
Основная группа,
n=130
116 (89%)
14 (11%)
55,09,1
54,48,9
59,99,5
95 (73%)
88 (68%)
124 (95%)
Контрольная группа,
n=63
38 (60%)
25 (40%)
53,910,3
49,37,5
60,810,1
45 (71%)
15 (24%)
50 (78%)
<0,001
<0,001
0,45
<0,001
0,54
0,94
<0,001
<0,001
9 (14%)
8 (13%)
21 (33%)
0
0
0
0,80
0,05
0,59
-
Мужчины
Женщины
Возраст, лет
Возраст мужчин, лет
Возраст женщин, лет
Артериальная гипертония
Курение
Гиперлипидемия
Отягощенная наследственность:
- по отцовской линии
22 (17%)
- по материнской линии
34 (26%)
Ожирение
37 (28%)
Инфаркт миокарда в анамнезе
78 (60%)
Коронарное стентирование
69 (53%)
Аортокоронарное шунтирование
23 (18%)
Примечание.Данные представлены как n (%), М±SD.
p
Уровень ОХС и ХС ЛНП, ХС ЛВП был существенно ниже у больных
основной группы, так как все пациенты находились на терапии статинами, тогда
как в контрольной группе лишь 24% пациентов получали статины (таблица 4).
Уровень Лп(а) был выше при наличии коронарного атеросклероза, p=0,016.В связи
11
с тем, что исследование было одномоментное, не у всех пациентов на момент
включения были целевые значения липидов, в последующем проводилась
коррекция гиполипидемической терапии.
Таблица 4. Сравнительная характеристика групп по биохимическим
параметрам.
Показатель
Основная группа,
n=130
4,71,3
Контрольная группа,
n=63
5,41,1
<0,001
ХС ЛВП, ммоль/л
1,10,3
1,20,3
0,03
ХС ЛНП, ммоль/л
2,91,0
3,40,9
<0,001
ТГ, ммоль/л
1,81,3
2,01,4
0,3
Лп (а), мг/дл
54 (8; 100)
23 (5; 69)
0,016
ОХС, ммоль/л
p
Примечание. Данные представлены как М±SD, медиана (25%; 75%).
Явление гетероплазмии было обнаружено для всех изучаемых мутаций
мтДНК (таблице 5).
Таблица 5. Уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома у
обследованных пациентов (n=193).
Мутация
Межквартильные интервалы
Миним.
Максим.
25%
Медиана
75%
G13513A, %
3,4
5,1
8,1
0,97
75,14
G12315A, %
12,6
16,6
23,8
1,75
81,97
C3256T, %
7,4
8,5
9,5
3,20
12,40
G14846A, %
2,9
5,2
9,4
0,67
18,30
Для всех мутаций распределение уровней гетероплазмии значительно
отличалось от нормального (тест Колмогорова-Смирнова с коррекцией по
Лиллиефорсу, p<0,001).
Мы проанализировали связь между уровнем гетероплазмии исследуемых
мутаций и наличием коронарного атеросклероза.Уровень гетероплазмии по
мутации С3256Т был выше среди больных с коронарным атеросклерозом 8,6% (7,7;
9,6) по сравнению с лицами без коронарного атеросклероза 8,1% (6,8; 9,1), p=0,01
(рисунок 1). Уровень гетероплазмии по мутации G13513A был достоверно выше
12
среди больных с коронарным атеросклерозом 5,4% (3,5; 8,6) по сравнению с
лицами без коронарного атеросклероза 4,7% (3,2; 6,8), p=0,03 (рисунок 2), тогда как
уровень гетероплазмии по мутации G12315A был значимо выше у лиц без
коронарного атеросклероза 19,2% (15,4; 25,0) по сравнению с 15,5% (11,6; 23,2) в
группе с коронарным атеросклерозом, р=0,004 (рисунок 3). По мутации G14846A
% гетероплазмии С3256Т
различий по группам выявлено не было.
12
p=0,01
10
8
6
4
2
КА
без КА
Рисунок 1. Cравнение уровня гетероплазмии мутации С3256Т между
пациентами с и без коронарного атеросклероза (КА).
% гетероплазмии G13513A
40
35
30
25
p=0,03
20
15
10
5
0
.
без КА
КА
Рисунок 2. Cравнение уровня гетероплазмии мутации G13513A между
пациентами с и без коронарного атеросклероза (КА).
13
% гетероплазмии G12315A
70
60
50
р=0,004
40
30
20
10
0
.
КА
без КА
Рисунок 3. Cравнение уровня гетероплазмии мутации G12315A между
пациентамис и без коронарного атеросклероза (КА).
Данные нашего исследования частично совпадают с работой, в которую
было включено 192 пациента (85 мужчин, средний возраст 65,09,4 лет), среди них
45 участников имели клинические проявления ИБС ибыло показано, что с ИБС
ассоциированы мутации митохондриального генома C3256T, G12315A, G13513A,
уровень
гетероплазмии
мутации
G14846Aне
различался
между
группами
[Желанкин А.В., 2013]. Однако в этой работе диагноз ИБС выставлялся клинически
и коронарный атеросклероз не был верифицирован с помощью КАГ.
В ранее проведенных исследованиях не изучалась ассоциация мутаций
митохондриального
генома
со
степенью
выраженности
коронарного
атеросклероза.Оценка поражения коронарного русла в нашем исследовании
проводилась по количеству пораженных основных магистральных артерий и на
основе расчета индекса Gensini. Выявлена прямая связь мутации С3256Т с
количеством пораженных основных коронарных артерий (r=0,18, р<0,05) и с
индексом стенозов (r=0,18, р<0,05).
Учитывая данныелитературы о том, что мутации митохондриального генома
могут накапливаться с возрастом [Marin-Garcia J. et al., 2002; Тодоров И.Н., 2009]
мы провели оценку связи изучаемых мутаций мтДНК с возрастом.Получена
положительная связь мутации G14846A с возрастом (r=0,21, р=0,012), тогда какв
другомисследовании
была
показана
14
ассоциация
и
других
мутаций
митоходриального генома с возрастом: G13513A (r =-0,363, p<0,001), C3256T
(r=0,279, p<0,001), G12315A (r=0,255, p<0,001) [Sobenin I.A. et al., 2013].
Ассоциация мутаций с возрастом свидетельствует о накоплении мутаций
митохондриального генома в течение жизни человека. Данный факт может быть
обусловлен
несколькими
причинами.
Возможно,
мутации
являются
соматическими, это подтверждается тем, что для мтДНК характерна высокая
скорость мутирования за счет повышенной концентрации активных форм
кислорода в митохондриях, отсутствия защитных гистонов и неэффективной
системы репарации [Тодоров И.Н., 2009].Следующим объяснением накопления
мутантной
мтДНК
может
быть
пролиферация
митохондрий,
содержащих
мутантный аллель, переданный по наследству по материнской линии. Мутации
митохондриального генома приводят к развитию заболевания, если порог
гетероплазмии мутации достигает определенного уровня [Silvestri G. et al, 1994;
Merante F. et al., 1994].
В связи с данными литературы, свидетельствующими о том, что факторы
риска ССЗ (курение, артериальная гипертония, гиперлипидемия) ассоциируются с
повышением производства активных форм кислорода в митохондриях и, как
следствие, сразвитием повреждения мтДНК [Wallace D.C. еt al., 1992; Ballinger
S.W. еt al., 2002],мы провели оценку взаимосвязи классических факторов риска с
изучаемыми мутациями мтДНК. В проведенном нами исследовании не выявлено
связи мутаций митохондритального генома с такими факторами риска ССЗ, как
пол, курение, артериальная гипертония, ожирение, отягощенный семейный анамнез
по ССЗ.С наличием гиперлипидемииотмечена прямая связь мутации C3256T
(r=0,18, р=0,01) (рисунок4)и обратная для мутации G12315A (r= -0,2, р=0,005)
(рисунок5). Для других мутаций зависимости выявлено не было. Такие же данные
были получены в исследовании с участием 183 условно здоровых женщин в
возрасте от 34 до 86 лет, не имеющих клинические проявления атеросклероза, где
было показано, что мутации митохондриального генома G13513A, G14846A,
С3256Т и G12315A не связаны с классическими факторами риска (курение,
артериальная гипертония, ожирение) [Чичева М.М., 2013].
15
% гетероплазмии С3256Т
14
r=0,18, р=0,01
12
10
8
6
4
2
нет
есть
.
Гиперлипидемия
Рисунок
4.
Взаимосвязь
между
уровнем
гетероплазмии
мутации
гетероплазмии
мутации
митохондриального генома С3256Т и гиперлипидемией.
% гетероплазмии G12315A
90
80
70
r= -0,2, р=0,005
60
50
40
30
20
10
0
нет
есть
.
Гиперлипидемия
Рисунок
5.Взаимосвязь
между
уровнем
митохондриального генома G12315A и гиперлипидемией.
Мы изучили связь мутаций митохондриального генома лейкоцитов крови с
различными липидными параметрами (ТГ, ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, Лп(а)) крови
пациентов, не получавших статины и другие гиполипидемические препараты.
Получена положительная корреляция уровня гетероплазмии мутации G13513A с
ХС ЛВП (r=0,2, p<0,005) и отрицательная связь мутации C3256T c ХС ЛВП (r= 0,17, p<0,05). В исследовании Желанкина А.В. выявлена слабая положительная
корреляция между ТГ и уровнем гетероплазмии мутаций C3256T, G12315A,
16
уровень гетероплазмии мутации G12315A положительно коррелировал с уровнями
ТГ, ОХС и ХС ЛНП в крови [Желанкин А.В., 2013]. В работе Чичевой М.М. ни
одна из изучаемых мутаций не была связана с липидами крови [Чичева М.М.,
2013].Различия полученных результатов, вероятно, обусловлены тем, что в других
исследованиях не учитывали факт приема пациентами гиполипидемических
препаратов.
В раннее проведенных исследованиях не изучалась ассоциация мутаций
митохондриального генома с уровнем Лп(а).Мы выявили положительную связь
% гетероплазмии G14846A
мутации G14846A и уровня Лп(а) (r=0,23, р=0,01) (рисунок 6).
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
r=0,23, р=0,01
0
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
Липопротеид(а)
Рисунок 6. Взаимосвязь уровня гетероплазмии мутации митохондриального
генома G14846Aс уровнем Лп(а).
При
подгрупповом
анализе
мы
не
выявили
связи
мутаций
митохондриального генома с коронарным атеросклерозом у женщин, лиц с
курением в анамнезе, больных с артериальной гипертонией, лиц с отягощенным
семейным анамнезом по материнской линии по ССЗ.
Во всех работах по изучению ССЗ оценивается общий отягощенный
семейный анамнез. Учитывая то, что митохондриальный геном наследуется только
по материнской линии, мы разделили выборку на две подгруппы: лиц с
отягощенным семейным анамнезом по материнской линии и без него.В подгруппе
больных
с
отягощенным
материнским
анамнезом
различий
по
уровню
гетероплазмии между пациентами основной и контрольной группы не выявлено.
17
Среди пациентов без отягощенного материнского анамнеза выявлялась ассоциация
мутаций С3256Т и G13513А с коронарным атеросклерозом.
Выявили прямую связь между атеросклерозом сонных артерий и мутацией
С3256Т (r=0,49, p=0,0001) (рисунок 7) и мутацией G14846A (r=0,48, p=0,0001)
(рисунок 8). Для мутации G12315A
установлена отрицательная связь с
% гетероплазмии С3256Т
атеросклерозом сонных артерий (r= - 0,32, p=0,01) (рисунок 9).
12
r=0,49, p=0,0001
10
8
6
4
2
.
0
1
2
3
.
атеросклероз сонных артерий
Рисунок
7.Взаимосвязь
между
уровнем
гетероплазмии
мутации
% гетероплазмии G14846A
митохондриального генома С3256Т и атеросклерозом сонных артерий.
20
r=0,48, p=0,0001
16
12
8
4
0
.
0
1
2
3
.
атеросклероз сонных артерий
Рисунок
8.Взаимосвязь
между
уровнем
гетероплазмии
митохондриального генома G14846A и атеросклерозом сонных артерий
18
мутации
% гетероплазмии G12315A
70
60
r= - 0,32, p=0,01
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
.
атеросклероз сонных артерий
Рисунок
9.Взаимосвязь
между
уровнем
гетероплазмии
мутации
митохондриального генома G12315A и атеросклерозом сонных артерий.
Вранее проведенных исследованияхбыла установлена корреляция между
толщиной комплекса интима-медиа сонных артерий и уровнем гетероплазмии
мутаций C3256T (r=0,362, р<0,001), G12315A (r=0,306, р<0,001), G13513A (r=0,357, р<0,001), в то время как уровень гетероплазмии мутации G14846A не
ассоциирован с толщиной комплекса интима-медиа [Sobenin I.A. et al., 2013;
Желанкин А.В., 2013]. В исследовании Чичевой М.М. уровень гетероплазмии
мутаций митохондриального генома C3256T, G14709A, G12315A, G13513A и
G14846A ассоциирован с атеросклерозом сонных артерий у женщин [Чичева М.М.,
2013]. Различия между исследованиями могут быть обусловлены разными
выборками, в частности, в нашей работе были пациенты с более тяжелым
каротидным атеросклерозом, не только с утолщением комплекса интима-медиа, но
и с гемодинамически значимыми атеросклеротическими бляшками в сонных
артериях.
Таким образом, в ходе анализа данных, полученных в нашем исследовании,
можно сделать вывод, что на исследуемой выборке мутации митохондриального
генома С3256T, G13513А, G14846A оказывают проатерогенное действие, а
мутация G12315A обладает антиатерогенным потенциалом.
Возможным механизмом, объясняющим влияние мутаций мтДНК на
развитие атеросклероза является то, что в макрофагах, содержащих мутантную
ДНК,
снижается
продукция
аденозинтрифосфата,
19
синтез
ферментов-липаз,
работающих в лизосомах, макрофаги становятся неспособными полностью
метаболизировать модифицированные ЛНП, в результате чего они накапливаются
в атеросклеротической бляшке, превращаясь в пенистые клетки. Поражение
сосудистой стенки при атеросклерозе развивается локально. Классическими
факторами риска ССЗ невозможно объяснить локальность атеросклеротического
поражения. Мутации митохондриального генома могут частично объяснить
данный факт. Мутации, передающиеся по материнской линии, могут избирательно
накапливаться в определенных участках сосудистой стенки в связи с тем, что при
делении митохондрии распределяются между дочерними клетками случайным
образом вследствие митотической сегрегации, в результате чего дочерние клетки
могут значительно различаются по уровнюгетероплазмии [Wonnapinij P. еt al.,
2008]. Возможно, участки сосудистой стенки, где содержатся клетки с наибольшим
количеством мутантной мтДНК, вследствие митохондриальной дисфункции,
снижения производства энергии и выработки большого количества активных форм
кислорода становятся наиболее подвержены атеросклеротическому процессу.
Хотя активные формы кислорода, несомненно, играют важную роль в
повреждении
мтДНК
при
атеросклерозе,
данные
исследования
Yu
Е.
свидетельствуют о другой механизме, связывающем повреждения мтДНК и
атеросклероз. Дефекты мтДНК способствуют снижению экспрессии генов,
кодирующих белки дыхательных комплексов, что приводит к уменьшению
выработки
аденозинтрифосфата
в
гладкомышечных
клетках,
моноцитах/макрофагах, что стимулирует апоптоз и ингибирует пролиферацию
клеток, способствуя развитию атеросклероза [Yu Е.et al., 2013].
На модели мышей в исследовании Yu Е. показано, что моноциты/макрофаги,
содержащие повреждения мтДНК, увеличивают производство фактора некроза
опухоли-α и интерлейкина-1, способствуя увеличению некротического ядра
атеросклеротической бляшки и истончения фиброзного покрытия [Yu Е. et al.,
2013].
По данным внутрисосудистого ультразвукового исследования коронарных
артерий показано, что повреждения мтДНК лейкоцитов крови человека не имеют
связь с объемом атеросклеротических бляшек, но отмечается положительная
20
корреляция с тонкой фиброзной покрышкой атеросклеротических бляшек [Calvert
P.A. et al., 2011; Stone G.W. et al., 2011].
Мутация
мтДНК
C3256T
происходит
в
гене,
кодирующем
митохондриальную транспортную рибонуклеиновую кислоту (тРНК) лейцина.
Мутация C3256T вызывает нарушение терминации трансляции, что препятствует
отделению полипептидной цепи от рибосомы и приводит к нарушению
дальнейшего использования как полипептида, так и рибосомы. Следствием
дефектов
тРНК лейцина снижается синтез
белков дыхательной
цепи
в
митохондриях, что приводит к падению уровня энергии в клетке [Rossmanith W.,
1998].
Мутация G12315A происходит в нуклеотиде 52 тРНК лейцина, который
входит в состав Т-петли тРНК лейцина. Мутация G12315A приводит к замене
гуанина на аденин в одной из цепей тРНК лейцина, что приводит к нарушению ее
третичной структуры и к снижению ее функциональности [Levinger L. et al., 2004].
Мутация G13513A вызывает замену аспарагиновой кислоты на аспарагин в
белке субъединицы 5 комплекса НАДН-дегидрогеназы дыхательного комплекса I,
что приводит к нарушению переноса НАДН с убихинона на различные цепи
пластохинона. В результате наличия мутации происходит снижение эффективности
работы комплекса Iдыхательной цепи митохондрий, что способствует развитию
митохондриальной дисфункции [Shanske S. et al., 2000; Sudo A. et al., 2004].
Мутация G14846A ведет к изменению аминокислотного состава цитохрома
В, который является частью комплекса III дыхательной цепи. При мутировании
меняется аминокислота глицин на серин, что создает дополнительный сайт
фосфорилирования белковой цепи [Andreu A.L., 1998].
Определение точных патогенетических механизмов, с помощью которых
мутации митохондриального генома влияют на атерогенез, является важной
задачей и требует дальнешего изучения.
Учитывая
полученные
выше
данные,
для
оценки
диагностической
значимости мутаций митохондриального генома как генетического биомаркера
атеросклероза коронарных и сонных артерий был проведен метод построения
ROC-кривых (рисунок 10).
21
Рисунок 10.Характеристические кривые для оценки диагностической
значимости мутаций митохондриального генома.МГ – митохондриальный геном,
ФР – факторы риска.
Мы создали четыре модели (таблица 5). Первая модель включает только
мутации митохондриального генома (C3256T,G14846A,G13513A) вторая модель мутации и возраст, третья модель - классические факторы риска, четвертая модель
- мутации в сочетании с возрастом и классическими факторами риска ССЗ.Мы
сравнили модели для оценки вклада мутаций митохондриального генома в
значимость диагностики коронарного и каротидного атеросклероза.
Таблица 5. Данные характеристических кривых.
Переменные
Площадь под Стандартная
кривой
ошибка
95% доверительный
интервал
Нижняя
Верхняя
граница
граница
0,511
0,719
0,517
0,724
0,576
0,774
Мутации МГ
0,615
0,053
МутацииМГ+возраст
0,620
0,053
Классические ФР
0,675
0,050
Мутации+возраст
0,734
0,047
0,642
0,827
+классические ФР
Примечание. МГ –митохондриальный геном, ФР – факторы риска
При
изолированном
использовании
мутаций
митохондриального
генома(C3256T, G14846A, G13513A) в качестве предиктора атеросклероза площадь
под кривой составила 0,615, что свидетельствует о связи мутаций с наличием
атеросклеротического поражения коронарных и сонных артерий, но степень этой
22
взаимосвязи слабее, чем у классических факторов риска
(площадь под
характеристической кривой 0,675). При использовании в модели мутаций
митохондриального генома в сочетании с возрастом площадь под кривой была
0,620, и она существенно возрастала при использовании в модели возраста,
классических факторов риска и мутаций митохондриального генома (0,7340,047).
Таким образом, наилучшее предсказующее значение для подтверждения наличия
атеросклероза коронарных и сонных артерий имеет модель, в которую вошли
классические факторы риска, возраст и мутации митохондриального генома
(C3256T, G13513A, G14846A).
Заключение.В
митохондриального
коронарных
и
нашей
генома
сонных
и
работе
были
показана
артерий.
исследованы
мутации
их
ассоциация
с
атеросклерозом
Учитывая
полученные
данные,
мутации
митохондриального генома могут быть использованы в качестве генетических
маркеров предрасположенности к атеросклерозу. В настоящее время появляется
все больше доказательств того, что мутации митохондриального генома и, как
следствие, митохондриальная дисфункция принимают непосредственное участие в
развитии
атеросклероза.
Дальнейшие
исследования
в
этом
направлении
представляются необходимыми. Понимание точных механизмов, с помощью
которых мутации митохондриального генома и, как следствие, митохондриальная
дисфункция способствуют развитию атеросклероза, откроет новые мишени для
разработки лекарственных препаратов.
ВЫВОДЫ
1.
Уровень гетероплазмии мутаций G13513A и С3256T существенно
выше у пациентов с наличием коронарного атеросклероза.
2.
Выявлена прямая связь между мутацией С3256Т и степенью
поражения коронарных артерий.
4.
Установлена положительная связь мутации G14846A с возрастом. С
гиперлипидемией отмечена прямая связь мутации С3256T. Не установлено связи
мутаций
митохондриального
генома
с
полом,
курением,
гипертонией,ожирением, отягощенным семейным анамнезом по ССЗ.
23
артериальной
5.
Выявлена прямая зависимость между наличием атеросклероза сонных
артерий и мутациями митохондриального генома С3256Т, G14846A. Установлена
отрицательная связь мутации G12315A c атеросклерозом сонных артерий.
6.
Показана положительная связь между уровнем гетероплазмии мутации
G14836A и уровнем липопротеида(а).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Измерение уровня гетероплазмии мутаций С3256T, G13513A и G14846A
митохондриального генома может быть рекомендовано в качестве генетического
маркера для улучшения диагностики предрасположенности к атеросклерозу
коронарных и сонных артерий.
Метод количественной оценки мутантного аллеля митохондриального
генома на основе технологии пиросеквенирования, может быть предложен для
определения уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома в
популяции.
24
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Ежов М.В., Егорова Л.А., Сафарова М.С., Митрошкин М.Г.,
Афанасьева О.И., Меднис И.М., Кухарчук В.В., Коновалов Г.А., Покровский С.Н.
Регрессия коронарного атеросклероза после афереза липопротеида(a) у молодого
мужчины
с
ишемической
болезнью
сердца
(клинический
случай).
Кардиологический вестник 2012; 7(1): 31-34.
2.
Егорова Л.А., Ежов М.В., Шиганова Г.М., Постнов А.Ю. Возможная
роль мутаций митохондриального генома при ишемической болезни сердца.
Клиницист 2013; 2: 4-13.
3.
Сазонова М.А., Баринова В.А., Синёв В.В., Чичёва М.М., Митрофанов
К.Ю., Желанкин А.В., Хасанова З.Б., Егорова Л.А., Собенин И.А., Постнов А.Ю.
Детекция уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома G14459А в
гомогенатах интимы аорты человека. Атеросклероз и дислипидемии 2013; 1: 40-43.
4.
L. Egorova, Z. Khasanova, A. Postnov, M. Ezhov. Mutations C3256T,
G13513A, G14846A, G12315A of mitochondrial genome and atherosclerosis of coronary
and carotid arteries. Тезисы 82-го Европейского Конгресса по Атеросклерозу,
Мадрид, Испания 2014. 31 мая-3 июня. №0878.
5.
L. Egorova, A. Postnov, M. Ezhov, I.Sobenin. Mutations of mitochondrial
genome and atherosclerosis of coronary and carotid arteries. ТезисыEuropean Human
Genetics Conference, Милан, Италия 2014. 31 мая-1июня.
6.
L. Egorova, M. Safarova, Z. Khasanova, A. Postnov, M. Ezhov.
Association of mitochondrial DNA mutations with coronary atherosclerosis. Тезисы
Европейского конгресса кардиологов, Барселона, Испания 2014. 30 августа – 3
сентября.
25
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИБС - ишемическая болезнь сердца
КАГ - коронарная ангиография
Лп(а) - липопротеид(а)
мтДНК – митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота
ОХС - общий холестерин
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания
ТГ - триглицериды
тРНК – транспортная рибонуклеиновая кислота
ХС ЛВП - холестерин липопротеидов высокой плотности
ХС ЛНП - холестерин липопротеидов низкой плотности
26