Резюме проекта, выполняемого в рамках ФЦП

advertisement
Резюме проекта, выполняемого в рамках ФЦП «Исследования и разработки по
приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России
на 2014 – 2020 годы» по этапу № 2
Номер Соглашения о предоставлении субсидии: 14.604.21.0145
Тема: «Молекулярная диагностика бактериальных и вирусных фитопатогенов винограда,
актуальных для сельского хозяйства Крыма.»
Приоритетное направление: Науки о жизни
Критическая технология: Технологии биоинженерии
Период выполнения: 05.11.2014 - 31.12.2016
Получатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр
"Биоинженерия" Российской академии наук
Индустриальный партнер: Общество с ограниченной ответственностью «Торговопроизводственная компания АгроХимПром»
Ключевые слова: Тест-системы, диагностика, фитопатогены, вирусы, бактерии, виноград,
Крым, посадочный материал, интегрированная защита растений, RT-PCR, PCR, BIO-PCR,
секвенирование ДНК, Vitis vinifera
За счет средств субсидии:
1. Обследованы виноградники на наличие растений с внешними признаками
поражения
вирусными
и
бактериальными
инфекциями
(хозяйства
Симферопольского района: «АПК Виноградное», «ООО Янтарный», «Заветное»;
Судакского района: «Морское», «Судак», «Солнечная долина»; района г. Алушты:
«Таврида», «Приветное», «Алушта»; района г. Ялты: «Ливадия», «Таврия») и
отобран 261 образец растительного материала с внешними признаками вирусных и
бактериальных заболеваний.
2. С образцов листьев и фрагментов лозы винограда проведен посев на пять типов
питательных сред (LB, King B, NBY, YDC, питательный агар). Бактерии рассеяны
до получения чистой культуры. В результате с собранных культур выделено 92
чистых культуры бактерий.
3. В экспериментах по контрольному заражению здоровых растений подтверждена
инфекционная природа 2 выделенных бактерий. Патогенность штаммов
Agrobacterium подтверждена классическим тестом по заражению ломтиков
моркови, на которых было отмечено образование каллусной ткани.
4. Выделенные
бактерии
идентифицированы
микробиологическими
и
биохимическими методами. 29 штаммов из всех бактерий, выделенных в чистую
культуру, были грам (+), 58 штамма бактерий имели окислительный тип дыхания, 9
штамма бактерий показатели положительную реакцию в тесте на наличие
оксидазы. Тестом на 3-кетоглюкозидазу было подтверждено наличие Agrobacterium
в 2 исследуемых образцах.
5. Из 2 чистых культур бактерий, патогенность которых была подтверждена,
выделены нуклеиновые кислоты. Качество ДНК было проверено методом
электрофореза в агарозном геле.
6. Методом ПЦР определено наличие фитопатогенных бактерий в собранных
образцах. Было показано наличие бактерий рода Agrobacterium.
7. Определены нуклеотидные последовательности геномов обнаруженных видов
бактериальных фитопатогенов. Целевые ампликоны, подученные в результате ПЦР
на 16S рРНК, были выделены из агарозного геля и секвенированы на
автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730.
8. Проведено сравнение полученных последовательностей геномов видов
бактериальных фитопатогенов с имеющимися в Генбанке последовательностями
родственных микроорганизмов. В результате сравнение показано наличие бактерий
родов Agrobacterium.
9. Из собранных образцов винограда выделены нуклеиновые кислоты (РНК) для
определения наличия вирусных патогенов. Качество РНК было проверено методом
электрофореза в агарозном геле.
10. Методом ОТ-ПЦР определено наличие фитопатогенных вирусов в собранных
образцах. На РНК была проведена обратная транскрипция и ПЦР на следующие
наиболее распространенные вирусы винограда: Grapevine rupestris stem pittingassociated virus (RSPaV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Grapevine virus A (GVA),
Grapevine virus B (GVB), Grapevine leafroll-associated viruses-1, 2, 3 (GLRaV-1, 2, 3).
В результате было обнаружено 24 образца, содержащих RSPaV, 5 образца – GFLV,
9 образцов – GVA, 11 образца - GLRaV-1. 3 образца несли смешанную вирусную
инфекцию.
11. Определены нуклеотидные последовательности геномов обнаруженных видов
вирусных фитопатогенов. Целевые ампликоны, подученные в результате ОТ-ПЦР,
были выделены из агарозного геля и секвенированы и секвенированы на
автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730.
12. Проведено сравнение полученных последовательностей геномов обнаруженных
видов вирусных фитопатогенов с имеющимися в Генбанке последовательностями
родственных микроорганизмов. В результате подтверждены результаты ПЦР и
наличие в исследуемых образцах вирусов: RSPaV, GFLV, GVA, GLRaV-1.
За счет внебюджетных источников:
13. Заложены модельные опыты для оценки эффективности средств защиты растений
для снижения вредоносности вирусов на винограде и других древесных культурах.
Для изучения влияния нового протравителя Зеребра на рост модельных растений
была определена энергия прорастания семян кукурузы, подсолнечника, пшеницы,
ячменя, гороха и тритикале. В культуре in vitro на агаризованной питательной
среде, на фильтровальной бумаге и в вегетационных экспериментах было изучено
влияние протравителей и их комбинаций на рост и развитие растений пшеницы,
гороха и тритикале. Было показано отсутствие стимулирующего эффекта препарата
Зеребра на изучаемые культуры.
Скачать