1,2 Mb. - Биофон
advertisement
1 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СВЕРДЛОВСКОЙ ОБЛАСТИ СВЕРДЛОВСКОЕ ОБЛАСТНОЕ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ «ФТИЗИОПУЛЬМОНОЛОГИЯ», ОБЛАСТНОЙ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫЙ ДИСПАНСЕР На правах рукописи ХОХЛОВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА Туберкулостатическая активность электромагнитного излучения в эксперименте и клинике при современной химиотерапии туберкулеза 14.00.26- фтизиатрия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель доктор медицинских наук Мордовской Г.Г. Научный консультант доктор медицинских наук профессор, Чугаев Ю.П. Екатеринбург 2005 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................. 4 Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................... 8 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Характеристика материалов исследования ........................................ 26 2.2 Описание методов исследования ....................................................... 29 Глава 3 ДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ МИКОБАКТЕРИЙ В ОПЫТАХ in vitro 3.1 Ростовые свойства различных видов микобактерий под влиянием электромагнитного излучения ................................................................ 36 3.2 Исследование сочетанного действия электромагнитного излучения и противотуберкулезных препаратов в опытах in vitro............................... 47 3.3 Метод определения туберкулостатической активности электромагнитного излучения в сочетании с противотуберкулезными препаратами............................................................................................ 52 Глава 4 ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ 4.1 Выявление микобактерий туберкулеза у экспериментальных животных в условиях применения электромагнитного излучения в сочетании с изониазидом ........................................................................ 58 4.2 Бактериостатическая активность крови и легочной ткани у экспериментальных животных при применении ЭМИ ........................... 64 Глава 5 ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ПРИ СОВРЕМЕННОЙ ХИМИОТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ 5.1 Клинико-лабораторная характеристика больных групп наблюдения ............................................................................................ 66 5.2 Динамика клинико-рентгенологических изменений у больных при сочетании химиотерапии и электромагнитного излучения ..................... 70 3 5.3 Бактериовыделение у больных легочным туберкулезом при сочетании химиотерапии и электромагнитного излучения...................... 75 5.4 Изучение бактериостатической активности крови больных туберкулезом легких при сочетании лечения противотуберкулезными препаратами и ЭМИ ............................................................................... 76 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .......................................................................................... 78 ВЫВОДЫ ................................................................................................... 89 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ....................................................... 90 Л И Т Е Р А Т У Р А ................................................................................... 91 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Эпидемическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации характеризуется отрицательной динамикой показателей заболеваемости и смертности (Шилова М.В., 2001; Перельман М.И., 2002; Левашев Ю.Н., 2003). Отмечается увеличение удельного веса остро прогрессирующего туберкулеза легких (Хоменко А.Г., 1997). Значительно увеличилось число больных с казеозной пневмонией и фиброзно-кавернозным туберкулезом, развивающихся на фоне иммунодепрессивных состояний различного генеза (Мишин В.Ю., 1999; Чуканов В.И., 2000; Л.А. Иванова и др., 2001). При этом неуклонно нарастает частота первичной и вторичной лекарственной устойчивости МБТ с преобладанием поли- и мультирезистентности в ее структуре (Рудой Н.М., 1993; Репин Ю.М. и др., 2001; Вишневский Б.И., 2003; Goble M. et al., 1993; Kochi A., 1994; Reichmann L.B., 1997), что является одной из основных причин неэффективности химиотерапии туберкулеза. В современных схемах химиотерапии туберкулеза предлагается одновременное и длительное применение 4, 5 и даже 6 противотуберкулезных препаратов (Мишин В.Ю. и др., 2001; Iseman M., 1993; Laserson К. et al., 1998), что нередко приводит к тяжелым побочным реакциям и нарушениям функций иммунной системы больного (Иванова Л.А., 1995; Чуканов В.И. и др., 2000; Павлова М.В, 2000; Елькин А.В, 2000; Литвинов В.И., 2000; Румянцева Е.И., Мишин В.Ю., 2000). Сложившаяся ситуация вынуждает искать новые подходы к лечению туберкулеза. Не принижая значения рациональной химиотерапии в XXI веке, необходимо разрабатывать принципиально новые методы лечения этого заболевания (Чучалин А.Г., 2000). Наиболее приемлемым подходом к решению проблемы представляется поиск методов, повышающих общую и специфическую резистентность макроорганизма с одновременным снижением жизнеспособности инфекционного агента (Северин Е.С., 5 2000). 6 Одним из таких методов является использование физических факторов в комплексном лечении туберкулеза, которое позволяет с учетом клинической формы, фазы процесса, индивидуальных особенностей течения заболевания уменьшить лекарственную нагрузку на организм больного и улучшить переносимость химиотерапии (Ломаченков В.Д. и др., 2000). Цель работы: изучение возможности применения электромагнитного излучения низкой интенсивности в комплексной терапии туберкулеза на основе исследования его туберкулостатической активности в экспериментальных и клинических условиях. Задачи исследования. 1. Изучить влияние электромагнитного излучения на ростовые свойства различных видов микобактерий. 2. Разработать метод определения туберкулостатической активности электромагнитного излучения низкой степени интенсивности в сочетании с противотуберкулезными препаратами. 3. Определить сочетанное воздействие на МБТ электромагнитного излучения и основных противотуберкулезных препаратов в опытах in vitro и in vivo. 4. Определить возможность использования электромагнитного излучения в комплексной терапии туберкулеза легких. Научная новизна. Впервые изучено влияние электромагнитного излучения низкой оптического микобактерий. степени диапазона) В на интенсивности ростовые (инфракрасной свойства экспериментальных различных условиях части видов выявлена туберкулостатическая активность электромагнитного излучения с длиной волны 0,8-30 мкм в сочетании с противотуберкулезными препаратами и обоснована возможность применения его в клинике . Разработана методика применения электромагнитного из лучения низкой степени интенсивности в комплексном лечении туберкулеза. 7 Практическая значимость. Выявленная в экспериментальных исследованиях туберкулостатическая активность электромагнитного излучения низкой степени интенсивности (инфракрасной части оптического диапазона) позволила обоснованно использовать его в комплексной терапии больных туберкулезом легких. Предложенная методика по применению этого вида излучения в сочетании с современными режимами химиотерапии статистически значимо сокращает сроки бактериовыделения и тем самым повышает эффективность лечения. Разработана методика определения бактериостатической активности крови, позволяющая контролировать комплексное применение противотуберкулезных препаратов в сочетании с электромагнитным излучением низкой степени интенсивности в процессе проведения комбинированной терапии туберкулеза легких. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Электромагнитное излучение низкой интенсивности оказывает туберкулостатическое действие на вирулентные микобактерии туберкулеза при культивировании их на питательных средах. 2. Определен синергизм туберкулостатического действия противотуберкулезных препаратов и электромагнитного излучения низкой степени интенсивности на микобактерии туберкулеза в опытах in vitro и у экспериментальных животных. 3. При применение комплексной терапии электромагнитного больных туберкулезом легких излучения сокращает сроки бактериовыделения и тем самым повышает эффективность химиотерапии. 4. Разработан туберкулостатическую метод, позволяющий активность электромагнитного определить излучения в сочетании с противотуберкулезными препаратами в комплексном лечении туберкулеза. Реализация работы. Предложенная инструкция по применению элек- 8 тромагнитного излучения низкой степени интенсивности используется в противотуберкулезных учреждениях в комплексной терапии больных туберкулезом. Разработанная методика определения туберкулостатической активности внедрена в работу лабораторий противотуберкулезных учреждений Свердловской области, подана заявка на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Способ определения воздействия магнитного поля на микроорганизмы», регистрационный номер 2004128070. Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: IV (XIV) съезде научно-медицинской ассоциации фтизиатров (Йошкар-Ола, 1999); региональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы туберкулеза на современном этапе» (Челябинск, 2000); VII Российском съезде фтизиатров - секционное заседание № 7 «Микробиологическая диагностика туберкулеза (Москва, 2003); конференции ОГУЗ СО НПО «Фтизиопульмонология» (Екатеринбург, 2003). Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликованы три работы, оформлена одна заявка на изобретение. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований в трех главах, заключения, выводов, списка литературы. Библиографический указатель включает 175 источников, из них отечественные - 121, иностранные - 55. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 6 рисунками. 9 Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Среди многообразия инфекционной патологии туберкулез является одной из наиболее распространенных и вместе с тем наиболее опасных для человека хронических инфекций. ВОЗ в 1993 году объявила туберкулез проблемой «всемирной опасности» и глобальным «экстренным случаем». (В.В. Пунга и соавт, 1997; Castro Kenneth G, 1998; PJ. Dolin, M.C. Raviglione, A. Kochi, 2001). Эпидемическая ситуация по туберкулезу в России остается неблагополучной (Ю.Л. Шевченко, 2000). С 1990 года отмечается рост показателей заболеваемости и смертности населения от туберкулеза, численность впервые выявленных больных к 2003 году увеличилась более чем в 2 раза, а смертность возросла в 1,5 раза, выросла заболеваемость туберкулезом и среди детского населения (М.В. Шилова, 2003; М.И. Перельман, 2004). В последнее десятилетие в Российской Федерации в структуре клинических форм отмечается увеличение удельного веса остро прогрессирующего туберкулеза легких (А.Г. Хоменко, 1997). Значительно увеличилось число больных с казеозной пневмонией и прогрессирующим фиброзно-кавернозным туберкулезом, развивающихся на фоне иммунодепрессивных состояний различного генеза (В.Ю. Мишин, 1999; В.И. Чуканов, 2000). Рядом авторов отмечается и тенденция к затяжному течению туберкулеза с хронизацией процесса (Р.П. Селицкая, 2000; В.Ю. Мишин, 2001). Основным методом лечения больных туберкулезом является химиотерапия (М.А. Клебанов, P.O. Драбкина, 1957; А.Г. Хоменко, 1999; A. Kochi, 2001). В современных схемах антибактериальной терапии этого заболевания по приказам Минздрава Российской Федерации и стандартным режимам химиотерапии ВОЗ предлагается одновременное и длительное применение 4, 5 и даже 6 противотуберкулезных препаратов (М. Iseman, 1993; К. Laserson, L.E. Osorio, H. Hernandez, 1998; В.Ю. Мишин, СЕ. Бори- 10 сов, Г.Б. Соколова, 2001). Применение таких схем направлено на устранение инфекционного компонента (М.С. Raviglion, 1996; А.Г. Хоменко, В.И. Чуканов, 1980). Однако при этом часто сохраняются, а иногда и усугубляются нарушения функционирования иммунной системы больного, что в свою очередь оказывает негативное влияние на исход заболевания (В.И. Литвинов, 2000). По данным литературы при туберкулезе отмечены и морфофункциональная недостаточность макрофагов, приводящая к незавершенности фагоцитоза, и повышенный апоптоз в результате воздействия туберкулезной интоксикации на костный мозг и органы иммуногенеза (В.В. Ерохин, 1998). Трудности современной терапии туберкулеза во многом связаны с возрастанием в его этиологии роли микобактерий с природной или приобретенной резистентностью к большинству используемых противотуберкулезных препаратов (М Goble et al., 1993; Н.М. Рудой, 1993; A. Kochi; 1994; L.B. Reichman, 1997; Ю.М. Репин и соавт., 2001; Б.И. Вишневский, 2003 ). Появление и размножение в процессе лечения лекарственно-устойчивых форм микобактерий, по мнению ряда авторов, служит доказательством ослабления естественных защитных сил организма больного (В.И. Чуканов, Н.В. Кузьмина, 1999; Е. Teyler, 1997). Нарушение функций клеток иммунной системы ведет к развитию патологического процесса, его прогрессированию, к неудачам при лечении и, в конечном итоге, к появлению и размножению лекарственно-устойчивых форм микобактерий туберкулеза (В.Ю. Мишин, 2000). В международной практике различают два вида лекарственной устойчивости: - первичную и приобретенную. Первичная лекарственная устойчивость определяется как устойчивость, обнаруженная у микобактерий, выделенных от больного, никогда не принимавшего ранее противотуберкулезные препараты или получавшего такое лечение менее одного месяца. В этом случае подразумевается, что больной заразился лекарственноустойчивым штаммом микобактерий от другого больного. Приобретенная 11 лекарственная устойчивость определяется как устойчивость микобактерий, выявленных у больного туберкулезом, получавшего лечение противотуберкулезными препаратами в течение месяца и более. Приобретенная лекарственная устойчивость возникает в процессе лечения больного при несоблюдении режимов химиотерапии, при моно терапии, при плохой абсорбции препаратов из кишечника и является косвенным показателем эффективности проводимой химиотерапии. Устойчивые штаммы характеризуются генотипически специфическими для каждого препарата хромосомными мутациями в генах, контролирующих важные функции микробной клетки (L. Heifets, 2001). Определена частота появления устойчивых мутантов микобактерий туберкулеза в результате спонтанных мутаций, при этом для каждого вида противотуберкулезных препаратов частота этих мутаций различна (L. Heifets, 2001). В современной терминологии по стандартам ВОЗ выделяют множественную лекарственную устойчивость (МЛУ- Multi-Drug Resistance MDR), она характеризуется наличием устойчивости к рифампицину и изониазиду. Полирезистентностью называют наличие устойчивости к любым двум или более препаратам, при условии, что сохранилась чувствительность к изониазиду и рифампицину или хотя бы к одному из этих препаратов. По данным литературы первичная лекарственная устойчивость регистрируется почти у четверти впервые выявленных больных туберкулезом легких, вторичная - у 30-40 %, а среди пациентов-хроников устойчивость достигает 70% (Е.С. Северин, 2000; И.Р. Дорожкова и соавт., 2001). По данным А.Г. Хоменко и соавторов лекарственная устойчивость регистрируется значительно чаще. Эти авторы отмечают, что у впервые выявленных больных лекарственная устойчивость наблюдается в 50,1% случаев, при рецидивах - 81,2%, а у хронических больных - в 90,2% случаев. Особое практическое значение имеет множественная лекарственная устойчивость и полирезистентность МВТ к противотуберкулезным препаратам. 12 Реальная стоимость излечения больного туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью у возбудителя заболевания в 100-150 раз выше, чем пациента с аналогичным процессом в легких, но с сохраненной чувствительностью у микобактерии туберкулеза (А.К. Стрелис, 1999). В Свердловской области отмечены такие же тенденции. Так в 2002 году в области число заболевших туберкулезом составило 4831, умерших 980 (О.Б. Нечаева, 2003). Показатель заболеваемости в области выше на 23,5% среднего показателя по России. По данным годовых отчетов увеличивается число больных туберкулезом с лекарственной устойчивостью МВТ как среди вновь выявленных больных (с 7% в 1999 до 8,8% в 2001), так и среди контингентов (с 11,3% до 13,6% соответственно) (О.Б. Нечаева, 2003). В структуре клинических форм туберкулеза у этих больных преобладают распространенный фиброзно-кавернозный (39,2%) и инфильтративный (33,1%) туберкулез, а также казеозная пневмония (14,4%). При этом отмечается высокий процент хронизации туберкулезного процесса (91,2%) и инвалидизации этих больных (76,2%) во всех группах (О.Б. Нечаева, 2003). Одной из главных причин снижения эффективности химиотерапии является развитие побочных реакций на основные противотуберкулезные препараты (Л.А. Иванова, 1995; А.В. Елькин, 2000; М.В. Павлова, 2000; В.И. Чуканов и др., 2000). Комплексное и длительное применение антибактериальных препаратов вызывает напряжение ферментных систем, нарушение обменных процессов и функционального состояния таких органов, как печень и почки. Определенную роль играет и органотропность препаратов, что ведет к преимущественному поражению конкретного органа или системы. Так, например, самый активный в отношении микобактерии туберкулеза препарат изониазид вызывает тяжелый, иногда фатальный гепатит. Риск развития гепатита зависит от возраста больного, наиболее часто такое осложнение развивается у пациентов старше 50 лет, либо при сочетании с приемом алкоголя. Одним из наиболее распространенным 13 токсическим эффектом приема изониазида является периферическая нейропатия. Отмечены атрофия и неврит зрительного нерва, нарушение мочеиспускания, эксфолиативный дерматит, эпигастральный дистресс, метгемоглобинемия, агранулоцитоз, лихорадка, появление на кожных покровах различного вида сыпи, васкулит, артрит. При развитии прогрессирующей дисфункции печени либо при проявлении других токсических осложнений или гиперчувствительности прием изониазида должен быть немедленно прекращен. Рифампицин оказывает бактерицидный эффект против нескольких видов микобактерий путем ингибирования РНК-полимеразы, однако доказан его гепатотоксический эффект. Кроме того, прием рифампицина может вызывать желудочнокишечную дисфункцию и сопровождаться усиленным развитием грибковой микрофлоры. Отмечены такие реакции гиперчувствительности, как стоматит, экссудативный диатез, глоссит, лейкопения, гемолитическая анемия, тромбоцитопения, почечная недостаточность с гематурией, развитие желтухи. Одновременное применение изониазида и рифампицина приводит к увеличению частоты развития осложнений. В связи с этим, лекарственная непереносимость противотуберкулезных препаратов, проявляющаяся в процессе проведения комбинированной химиотерапии, существенно ограничивает возможности ее проведения и тем самым снижает эффективность лечения больных туберкулезом (Е.И. Румянцева, В.Ю. Мишин, 2000). В результате проведения комплексных клиниколабораторных исследований установлено, что побочные реакции чаще развиваются на конкретный противотуберкулезный препарат, а именно, на изониазид, рифампицин, стрептомицин. В их структуре 45,7% составляют токсические реакции, 37% - аллергические реакции, а в 17,3% случаев отмечаются реакции смешанного типа (В.И. Чуканов, В.Ю. Мишин, 2000). При хроническом течении туберкулезного процесса частота непереносимости основных препаратов, требующая прерывания интенсивного курса лечения или отмены одного из препаратов, составляет в сред- 14 нем 17,3%. В целях снижения развития явлений побочных реакций у больных применяются различные патогенетические средства, в том числе и физиотерапевтические методы (А.Г. Хоменко, Л.Н. Новикова, 1995). Однако проблема сокращения сроков химиотерапии и уменьшения лекарственной нагрузки на организм больного остается актуальной (Р.П. Селицкая, 2000). Таким образом, рост заболеваемости туберкулезом сопровождается появлением устойчивых форм микобактерий на фоне снижения как общей, так и специфической резистентности макроорганизма с развитием побочных токсико-аллергических реакций на основные противотуберкулезные препараты, что значительно снижает эффективность химиотерапии. Сложившаяся ситуация вынуждает искать новые подходы к лечению туберкулезной инфекции. Не принижая значение рациональной химиотерапии в XXI веке необходимо разрабатывать принципиально новые методы лечения этого заболевания (А.Г. Чучалин, 2000). Наиболее приемлемым подходом к решению проблемы представляется такое воздействие на организм больного, которое повысит как общую резистентность, так и специфическую резистентность к микобактериям туберкулеза с одновременным снижением жизнеспособности инфекционного агента (Е.С. Северин, 2000). Физические факторы в комплексном лечении различных заболеваний находят все более широкое применение и рассматриваются в практической медицине как важный резерв повышения терапевтической эффективности, что в полной мере относится и к фтизиопульмонологии (В.Д. Ломаченков и соавт., 1989; М.И. Перельман, 1990; А.Г. Хоменко, Л.Н. Новикова, 1995). Использование физических факторов в комплексном лечении туберкулеза позволяет значительно расширить выбор этиопатогенетических средств с учетом клинической формы, фазы процесса, индивидуальных особенностей течения заболевания, уменьшить лекарственную нагрузку на организм больного и улучшить переносимость химиотерапии (Л.Н. Новикова, А.Г. Хоменко, 2000). Лечебное действие 15 физических факторов на организм человека основано на преобразовании энергии в биологический процесс. Эти изменения проявляются физикохимическими сдвигами на субклеточном, клеточном, органном и системном уровнях. Механизм лечебного действия большинства физических факторов, используемых во фтизиатрии, проявляется в улучшении трофики тканей, развитии дифференцированных тканевых реакций, стимуляции окислительно-восстановительных процессов, образовании биологически активных веществ (Л.М. Клячкин и соавт., 1997; Л.П. Яковлева и соавт., 2001). По данным литературы влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на организм больного сводится к воздействию на клетки сигнала, способного мобилизовать собственные защитные механизмы для восстановления и сохранения гомеостаза (П.И. Щеколдин, 1996). Отклики клеток организма человека и животных на электромагнитное излучение острорезонансны, проявляются в крайне узких диапазонах частот, соответствующих характеру нарушения в этих клетках, выбор длины волны при этом имеет принципиальное значение (А.Г. Хоменко, Л.Н. Новикова, 1995). В эксперименте на животных показано, что электромагнитное излучение миллиметрового диапазона оказывает положительное влияние на течение туберкулезного процесса. Отмечается значительная пролиферация лимфоцитов и макрофагов с массивной инфильтрацией ими пораженных органов. Возрастает функциональная активность альвеолярных макрофагов, обеспечивающая более быстрое освобождение организма от микобактерий туберкулеза. При этом в условиях стандартной химиотерапии сокращаются сроки рассасывания туберкулезных очагов в легких (Л.Н. Новикова, 1995). В физиотерапии больных туберкулезом широко используются аппараты КВЧ-терапии, являющиеся источником электромагнитного излучения с длиной волны 4-8 мм, частотой 57-65 ГГц с мощностью 10 мВт\см2. Терапевтический эффект такой терапии обусловлен иммунокорригирующим и нейростимулирующим действием, 16 нейрогуморальной активацией антиоксидазной системы защиты, блокирующей процессы перекисного окисления липидов в клетках тканей систем и органов больного (Л.Н. Новикова, 1995). Установлено, что под действием ЭМИ-КВЧ терапии происходит усиление регионарного кровотока в зоне туберкулезного поражения, улучшается бронхиальная проходимость, ликвидируются нарушения иммунной системы, устраняются побочные реакции химиопрепаратов (В.В. Ерохин, Г.М. Николаев, Л.Е. Гедымин, 1995). Однако недостаточно в литературе данных о воздействии электромагнитного излучения на ростовые свойства микробной клетки, ее жизнедеятельность и изменение биологических свойств, особенно в отношении формирования устойчивости к противотуберкулезным препаратам. Микобактерии туберкулеза относятся к микроорганизмам особо резистентным к внешним неблагоприятным воздействиям (J. Weiszfeiler, 1975). В мокроте микобактерии туберкулеза остаются жизнеспособными и вирулентными в течение 5-6 месяцев, а в высохшем состоянии на различных предметах в течение десяти месяцев способны сохранять свои свойства и, попадая затем в благоприятные условия, проявлять свою патогенную активность (Ф.В. Шебанов, 1981). По другим данным микобактерии могут сохранять свою патогенность от года до полутора лет при отсутствии солнечного света (В.Н Василев, 1971). Они обладают большой устойчивостью и по отношению к действию различных физических факторов. В книге В.Н. Василева приведены данные по исследованиям Kadish, Drea, Laporte, Loiseleur. Согласно наблюдениям Kadish (1950) микобактерии туберкулеза могут переносить понижение температуры до уровня жидкого гелия (270 ниже нуля). В своих исследованиях Drea (1940) доказал, что на штамм H37RV облучение рентгеновскими лучами в течение 36 часов оказало лишь слабое воздействие. Действие радия и других ионизирующих лучей неоднозначно, например, бета-лучи оказывают более выраженное действие, а гамма-лучи практически не действуют на МВТ (В.Н. Василев, 1971). Ульт- 17 развуковые волны оказывают разрушающее воздействие (Laporte, Loiseleur, 1971). Множество авторов считает, что микобактерии слабо чувствительны к действию рентгеновского излучения (М.М. Цехновицер, И.Я. Гольденберг, A.M. Абрамович, 1940). Таким образом, различные физические факторы оказывают разнонаправленное действие на МВТ. В целом, согласно данным литературы, микобактерии обладают высокой способностью адаптироваться к неблагоприятному воздействию (П.М. Модель, 1952). В литературе имеются сообщения о влиянии магнитных полей различной напряженности и экспозиции на жизнедеятельность микроорганизмов. В сборнике « Актуальные вопросы экспериментального туберкулеза», 1979 г. Москва, приведены данные исследований С.А. Павлович (1971) о длительном воздействии магнитного поля на микроорганизмы, в результате которых установлено, что это воздействие вызывает изменение морфологических и культуральных свойств микроорганизмов и влияет на чувствительность микробных клеток к действию различных факторов внешней среды, в частности к антибиотикам. Например, по данным этого автора, резистентность стафилококка к стрептомицину увеличивалась в 33 раза, а к пенициллину - в 307 раз. В исследованиях, выполненных Г.А. Стасюк (1974), было установлено, что воздействие постоянного магнитного поля в течение одного часа не влияло на рост лабораторного штамма микобактерии H37RV, а при увеличении времени воздействия с двух до 24 часов отмечено различной степени угнетение роста этого штамма. В исследованиях Ю.А. Курунова (1975) было изучено воздействие магнитного поля на пробирки с посевами штамма БЦЖ. Установлено, что это воздействие приводило к ускорению роста на трое суток в сравнении с контрольными посевами (« Актуальные вопросы экспериментального туберкулеза», 1979 г. Москва). Исследовалось влияние на МБТ пульсирующего магнитного поля с напряженностью 2000 Э, такое поле оказывало стимулирующее действие и 18 ускоряло сроки роста культур МБТ на питательной среде, при этом достигалось более равномерное распределение колоний на косяке среды (Г.Г. Мордовской, С.А. Гаврилов, 1979). В исследовании Г.Г. Мордовского (1979) было изучено циклическое изменение ростовых свойств микобактерии туберкулеза. Для посевов были взяты лабораторные штаммы H37RV и H32V. Воздействие осуществляли постоянным магнитным полем с напряженностью от 600 до 1800 Э. Установлено, что воздействие таких полей изменяет амплитуду колебания ростовых свойств МБТ и смещает во времени фазы цикличного (волнообразного) изменения ростовых свойств микробной популяции при хранении их во взвешенном состоянии в дистиллированной воде. Однако чаще всего различные виды излучений оказывают на микобактерий туберкулеза угнетающее воздействие. Так В. М. Должанский и А.Н. Калюк с соавторами исследовали влияние низкоэнергетического гелий-неонового лазера на биологические свойства микобактерий туберкулеза. В опытах in vitro в этих исследованиях доказано, что воздействие излучения этого лазера угнетает рост микобактерий туберкулеза лабораторного штамма H37RV, как при однократном, так и при повторном воздействии. По сравнению с контрольными посевами рост облученных микобактерий во всех испытуемых режимах задерживался в среднем до 6 недель на среде Финн-2, при этом количество выросших колоний уменьшалось в соответствии с увеличением длительности воздействия облучением. В исследованиях на экспериментальных животных этими авторами продолжено изучение изменения биологических свойств микобактерий туберкулеза лабораторного штамма H37RV под воздействием низкоэнергетического гелий-неонового лазера. Изменение биологических свойств исследованного штамма оценивали по сенсибилизации и выживаемости морских свинок, а при аутопсии определяли степень распространенности специфических поражений внутренних органов. При этом однократно облучали взвесь культуры штамма до проведения заражения экспериментальных животных. Длительность облучения культуры была различ- 19 ной: 5, 10, 20 минут. При проведении заражения выполняли одновременно и дозированный посев каждой опытной пробы штамма, а в дальнейшем исследовали изменение облученных микробных клеток при электронной микроскопии. В результате этих исследований установлено, что биологические свойства микобактерий туберкулеза под влиянием облучения гелий-неонового лазера изменяются. Отмечена корреляция между изменениями ростовых свойств и вирулентностью. Установлена зависимость снижения ростовых свойств и вирулентности микобактерий туберкулеза от длительности облучения. При микроскопическом исследовании на электронном микроскопе выявлены морфологические изменения микробной клетки. После 5 минутного воздействия излучением отмечалось образование внутриклеточных мембран различной ориентации, что свидетельствует об активизации метаболических процессов микобактериальной клетки. После увеличения времени воздействия до 10 минут отмечена коагуляция нуклеида, расслоение клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, частичное отхождение мембранных структур от цитоплазмы. Увеличение времени воздействия до 20 минут приводило к значительным изменениям анатомии микобактериальной клетки с нарушением белкового синтеза. Однако по данным микробиологических исследований жизнеспособность микобактериальной популяции в целом даже после воздействия в течение 20 минут сохранялась. До 40 % колоний при дозированном посеве облученного штамма H37RV росли на питательных средах. Однако облучение в период культивирования на питательных средах не проводилось. Кроме того, не изучено действие этого излучения в сочетании с противотуберкулезными препаратами, не решен вопрос о влиянии излучения на резистентность к противотуберкулезным препаратам у культур микобактерий туберкулеза. В исследованиях Государственного научного центра прикладной микробиологии и научно-производственного предприятия «Бионике» получены данные, свидетельствующие об угнетающем воздействии на жиз- 20 недеятельность микроорганизмов электромагнитного излучения в инфракрасном диапазоне нетепловой интенсивности с длиной волны 0,8-30 мкм и мощностью непрерывного режима излучения не более 10" Вт/Гц*м . Отмечено наиболее значительное воздействие этого излучения на барьерную функцию цитоплазматических мембран микроорганизмов. Клетки в результате такого воздействия получают сублетальные повреждения (А.Н. Байдусь, 1999). С использованием метода люминонезависимой хемилюминесценции на штаммах золотистого стафилококка доказано возрастание интенсивности проникновения из окружающей среды неспецифических для микробной клетки веществ за счет изменения электростатического потенциала на клеточных оболочках, уменьшение количества вырабатываемых продуктов жизнедеятельности и увеличении скорости гибели микробных клеток. На штаммах других микроорганизмов (Е. coli, Ps. aeruginosa, Chlamydia trachomatis) изучалось воздействие электромагнитного излучения низкой интенсивности на жизнеспособность микробных клеток, оценивалась барьерная функция цитоплазматических мембран этих микроорганизмов, определялось изменение интенсивности дыхания как прямого показателя физиологической активности микробов. Полученные в результате экспериментов данные свидетельствуют об угнетающем воздействии приборов серии «Биофон», являющихся источниками электромагнитного излучения низкой интенсивности, на жизнедеятельность этих микроорганизмов, при этом значительно снижалось количество колониеобразующих единиц (КОЕ) и скорость нарастания биомассы. После воздействия прибором интенсивность дыхания этих микроорганизмов значительно снижалась, изменялась функция мембран, причем наряду с выходом собственных компонентов клетки в окружающую среду, отмечено и возрастание интенсивности проникновения неспецифических для микробных клеток веществ из внешней среды (Е.Б. Копытов, А.Н. Байдусь, 1999). Приборы этой серии успешно используются в клинической практике для лечения хламидиозной, 21 уреаплазмозной, стафилококковой и др. инфекций. Доказана терапевтическая эффективность и медико-биологическая безопасность применения этого излучения для лечения урогенитальных инфекций в исследованиях Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии в опытах на культурах тканей, на экспериментальных животных и в клинике. При этом рекомендуется применение аппаратов «Биофон» и без антибактериальной терапии, либо с уменьшением доз антибиотиков. Вопрос о применении такого излучения в терапии туберкулеза изучен недостаточно, а воздействие электромагнитного излучения инфракрасного диапазона нетепловой интенсивности с длиной волны 0,8-30 мкм и мощностью непрерывного режима излучения не более 10~23 Вт/Гц*м2 на различные виды микобактерий не исследовалось. Однако перспективы применения этого вида излучения в терапии больных туберкулезом представляют интерес. Методы изучения воздействия физических факторов на различные виды микроорганизмов основаны на оценке изменения ростовых свойств, биологической активности и скорости роста по срокам и увеличению биомассы колоний. Обычно при этом необходимо проведение опытов как in vitro, так и in vivo на опытных животных. Общими требованиями к методам изучения являются высокая чувствительность, достоверность при минимальной сложности выполнения, использование стандартного оборудования и реактивов. Учитывая биологическую и культуральную специфичность микобактерий, определение воздействия физических факторов на их ростовые и биологические свойства представляет определенные трудности. Во-первых, для культивирования микобактерий требуются высокопитательные среды. Будучи гетеротрофными микроорганизмами, микобактерий должны получать в готовом виде многие химические вещества, кроме того, общеизвестно значение различных ростовых факторов, необходимых для роста МБТ. Во-вторых, медленная скорость роста требует длительной инкубации, а, следовательно, и длительности проведения эксперимента. 22 Время деления микробной клетки составляет 18-24 часа. Обычно при исследовании in vitro используют среды яичные, например стандартная среда Левенштейна-Йенсена. С целью исследования биологических свойств микобактерий используют их способность интенсивно размножаться и вызывать специфические изменения в организме чувствительных видов животных. Классическим экспериментальным животным для биологических методов исследования при туберкулезе является морская свинка. Эти животные реагируют типичным образом на введение микобактерий. При получении модели туберкулеза уже на 3 сутки МБТ обнаруживаются во внутренних органах (селезенка, печень, легкие) и регионарных лимфатических узлах (P.O. Драбкина, 1974). Рекомендуют использовать для заражения штамм с постоянной вирулентностью М. H37RV. При этом необходимо использовать 1-2 недельные культуры с обильным ростом (В.Н. Василев, 1971). Для целей химиотерапии наиболее удобными экспериментальными животными являются белые мыши. Использование этой модели экспериментального туберкулеза дает возможность применить малые количества препаратов и значительно сократить время проведения опыта (P.O. Драбкина, 1974). Рекомендуется соблюдение следующих правил: - вес не должен превышать 20 г; - в каждую группу необходимо включать не менее 10 животных, каждое из которых должно получить одинаковую дозу микобактерий (В.Н. Василев, 1971). Антибиотические препараты можно вводить перорально и парентерально. При исследовании всегда рекомендуется определять увеличение или потерю веса. При опыте на белых мышах длительность эксперимента 3-4 недели, а при выборе морской свинки необходимо увеличить длительность до 60 дней. Опытные и контрольные группы необходимо сравнивать путем макроскопических и микробиологических исследований (В.Н. Василев, 1971). Эффективность применения терапии определяют на основании относительного выживания групп леченных и не леченных животных, сравнения макроскопических и гистологических исследований, 23 прогрессирования или регрессирования болезни и, наконец, на основании наличия или отсутствия жизнеспособных микобактерий туберкулеза, полученных из материала органов животных (В.Н. Василев, 1971). Обнаружение МБТ при экспериментальном туберкулезе является необходимым подтверждением полученной модели инфекции. Кроме того, выявление МБТ является необходимым исследованием динамического контроля эффективности использовать два метода проводимого выявления лечения. Необходимо МВТ: - бактериоскопию и культуральное исследование. Бактериоскопия с окраской препаратов по методу Ziehl-Neelsen является менее чувствительным методом, однако дает возможность определить микроорганизмы, не способные расти на питательной среде в силу изменения своих культуральных свойств и снижения жизнеспособности. Микробиологические методы исследования являются неотъемлемой частью при контроле динамики бактериовыделения и оценки эффективности лечения в связи с их высокой чувствительностью и специфичностью. В организме больного химиопрепараты оказывают губительное действие на МБТ только при достижении бактериостатической концентрации в очаге инфекции. Различают общую концентрацию препарата, которая определяется чаще химическими методами, и эффективную концентрацию, которую определяют микробиологическим способом, эта концентрация чаще соответствует активным фракциям препарата и превышает его минимальную бактериостатическую активность. Микробиологические методы более чувствительны и отражают специфичность биологического действия химиопрепаратов, в конечном итоге терапевтическое действие всех антибиотиков определяется их антибактериальной активностью в очаге поражения (М.А. Клебанов, P.O. Драбкина,1957). Микробиологическими методами контролируется всасываемость, распределение препаратов в жидкостях и тканях, длительность пребывания и пути их выведения из организма. Успеху химиотерапии любого инфекционного процесса способ- 24 ствуют микробиологические методы определения бактериостатической активности препаратов и степени чувствительности к ним различных видов микроорганизмов. Кроме того, химическими методами не всегда удается обнаружить те минимальные концентрации препаратов, которые определяются микробиологическими методами. Особый интерес представляет совместное действие на МБТ в организме больного сочетания противотуберкулезных препаратов, так как при этом возможны эффекты синергизма и аддитивных свойств различных комбинаций лекарственных препаратов. А оценить их действие при комплексном применении химиотерапии в сочетании с воздействием физических факторов представляется возможным только с помощью микробиологических методов. Косвенным показателем действия препаратов в самих очагах поражения является бактериостатическая активность крови. С помощью этого исследования можно определить суммарную активность противотуберкулезных препаратов в плазме крови, что дает возможность установить наиболее оптимальные сочетания препаратов, их дозы, а также выяснить некоторые причины неудач в химиотерапии (Г.Г. Мордовской, 1970). По бактериостатической активности крови можно оценить и воздействие физических факторов, в частности воздействие различных видов излучения. Однако в литературе нет данных о применении исследования бактериостатической активности крови для оценки воздействия электромагнитного излучения. Для определения бактериостатической активности крови наиболее широко применяется метод серийных разведений (Н. М. Рудой, 1962). Для оценки эффективности химиотерапии в целях решения вопроса о коррекции лечения препаратами ГИНК в случае длительного выделения больными микобактерий туберкулеза использовалась туберкулостатическая проба, рекомендованная приказом № 558 МЗ СССР. Для выполнения этой методики требуются аутоштамм микобактерий туберкулеза и три разведения плазмы крови больного в жидкой питательной среде Школьниковой. 25 Оценка пробы проводится по результатам микроскопии мазков, приготовленных из осадка после инкубации опытных пробирок в термостате. По полученным данным определяется соответствие концентрации препаратов ГИНК в крови и чувствительности к этой концентрации аутоштамма больного. Однако проведение этой пробы возможно только после получения культуры от больного, что требует длительного времени, кроме того, не все больные являются бактериовыделителями. Метод достаточно сложен и требует обязательной микроскопии препаратов на наличие микрокультуры и микроколоний, это создает условия для образования микробных аэрозолей и приводит к дополнительному загрязнению воздуха в лаборатории, что повышает опасность заражения для работающего персонала. Кроме того, туберкулостатическая проба не проводится на начальном этапе лечения больного. При сравнении активности антимикробных препаратов до сих пор имеют важное методическое значение постулаты, предложенные Кохом: употребление стандартных эквимолекулярных концентраций препаратов; применение тест-микроба одной чувствительности и одной концентрации на объем питательной среды; - выбор и использование стандартной питательной среды. Микробиологический способ определения активности антибиотиков основан на прямом их воздействии на живую бактериальную клетку тест-микроба в период роста на питательной среде. Наиболее широкое распространение получили два метода. Первый метод серийных или последовательных разведений; а второй метод диффузии в агар. При этом второй метод используется чаще и основан на наблюдениях Behring E. (1912) за появлением зон задержек роста тест-микроба на твердой питательной среде. При этом величины диаметров этих зон были прямо пропорциональны степени чувствительности микробных клеток. Это наблюдение впервые использовал Reddish G (1929) для испытания антисептиков. Усовершенствовали метод и применили его для количественного определения пенициллина Abraham E. и соавторы (1941). В настоящее время ис- 26 пользуется луночный вариант этого метода, разработанный Gellisen G (1954) на основе работ Fleming A.(1942), Cooper С, Woodman D. (1946). При использовании лунок зоны задержки роста имели ровные края и более постоянные величины. При определении концентрации антибиотиков ряд авторов предлагали на первом этапе работы извлекать их из тканей методом экстракции (Grove D., Randall W., Л.Л. Аверьянова, СМ. Семенов и др., 1960). Однако при этом необходимо подбирать экстрагирующий раствор для каждого компонента, так как различные химические вещества имеют свои характеристики растворения и трудно добиться полной экстракции. Мордовским Г.Г. (1969) был разработан способ оценки эффективного бактериостатического действия противотуберкулезных препаратов на МБТ методом вертикальной диффузии и с помощью этого способа исследована бактериостатическая активность основных противотуберкулезных препаратов в крови и резецированных легких больных туберкулезом. Однако влияние применения современных схем химиотерапии в сочетании с воздействием физических факторов на бактериостатическую активность крови не исследовалось. Таким образом, при современной эпидемической ситуации по туберкулезу проблема повышения эффективности химиотерапии больных требует применения новых методов лечения. При этом с уменьшением лекарственной нагрузки на организм больного в целях профилактики развития побочных токсико-аллергических реакций на основные противотуберкулезные препараты необходимо повысить как общую резистентность, так и специфическую резистентность к микобактерии туберкулеза с одновременным снижением жизнеспособности инфекционного агента. Применение электромагнитного излучения низкой степени интенсивности в комплексной терапии туберкулеза требует исследования туберкулостатической активности ЭМИ в эксперименте и клинике при современной химиотерапии туберкулеза. Кроме того, необходимо разработать метод определения туберкулостатической активности электромагнитного излучения при 27 сочетании с основными противотуберкулезными препаратами. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Характеристика материалов исследования. Для опытов in vitro использовались лабораторные тест-штаммы микобактерий, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (ГИСК), MET H37Rv и H37Ra, M.bovis-вovinus-8, входящие в Mycobacterium tuberculosis complex, а также нетуберкулезные микобактерий (НТМБ) - основной возбудитель микобактериоза M.avium и сапрофит M.smegmatis. Кроме того, использовано 57 культур микобактерий туберкулеза, выделенных от больных туберкулезом легких. Из них 19 культур были чувствительны к противотуберкулезным препаратам, а 38 культур имели устойчивость к противотуберкулезным препаратам разной степени и спектра. Выполнено 2033 опыта in vitro. Структура этих исследований представлена в таблице 1. Таблица 1 Структура исследований in vitro Штаммы микобактерий Количество исследований M.H37Rv 450 М Bovis-Bovinus-8 90 M.Avium 90 28 M.H37Ra 90 M.Smegmatis 90 Культуры МВТ, чувствительные к ПТП 423 Культуры МВТ, устойчивые к ПТП 800 Итого исследований 2033 29 Для культивирования использовались одномоментно приготовленные в соответствии с методическими рекомендациями МЗ РСФСР от 1972 г. «Приготовление и использование питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза» питательные среды «Новая» и ЛевенштейнаЙенсена. Для опытов in vivo в качестве экспериментальных животных использовано 60 половозрелых самцов белых мышей весом 18-20 г. и 48 половозрелых особей морских свинок весом 270-300 г. Распределение количества исследований по группам животных указано в таблице 2. Таблица 2 Количество исследований у экспериментальных животных Группы белых мышей N = 60 № Количество гр. исследовани й Здоровые животные (контроль № 1) I Здоровые животные, получавшие ЭМИ II 150 Зараженные животные, не леченые (контроль № 2) III 150 Зараженные животные, получавшие ЭМИ IV 150 Зараженные животные, леченые изониазидом V 150 Зараженные, получавшие лечение изониазидом и ЭМИ VI 150 Всего исследований у белых мышей 6 900 Зараженные животные (контроль) I 75 Зараженные животные, получавшие ЭМИ II 75 Зараженные, получавшие лечение изониазидом и ЭМИ III 75 Всего исследований у морских свинок 3 225 150 Группы морских свинок N = 48 Итого исследований у экспериментальных животных 1125 В клинике на выявление микобактерий туберкулеза исследовались мокрота, секрет бронхов после применения раздражающих ингаляций, промывные воды бронхов, полученные от 115 больных. Всего выполнено 30 1840 бактериологических исследований на выявление МБТ и 2190 бактериоскопических исследований с окраской препаратов по ZiehlNeelsen. Выделено от больных 93 культуры МБТ, которым проведена идентификация до вида и определение спектра и степени лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Иенсена. Для определения туберкулостатической активности ЭМИ при химиотерапии исследовано 920 образцов плазмы крови, полученных от 115 больных с впервые выявленным туберкулезом легких, находившихся на стационарном лечении в терапевтическом отделении СО ГУЗ «Противотуберкулезный диспансер» г. Екатеринбурга. В основную группу включено 72 человека, которым проведена комплексная химиотерапия в сочетании с воздействием электромагнитным излучением низкой степени интенсивности по разработанной инструкции. В контрольной группе 43 пациента, получавших туберкулостатические препараты в таких же дозах и сочетаниях, но без применения ЭМИ. Распределение количества исследований бактериостатической активности крови у больных по группам наблюдения с учетом клинических форм туберкулеза представлено в таблице 3. Основу терапии составляли антибактериальные препараты, назначаемые по стандартным режимам для впервые выявленных больных, рекомендованным Международным союзом по борьбе с туберкулезом и легочными заболеваниями. Наиболее часто использовалась схема для лечения третьей категории больных: в течение двух месяцев комбинация изониазида, рифампицина и пиразинамида, а затем в течение четырех месяцев -комбинация изониазида и рифампицина. При наличии бактериовыделения и/или деструкции использовалась схема химиотерапии с включением четвертого препарата - стрептомицина или этамбутола. В качестве источника электромагнитного излучения взяты аппараты медицинского назначения серии «Биофон», представляющие собой 31 электронные устройства, формирующие электромагнитное излучение низкой интенсивности с длиной волны 0,8-30 мкм. Мощность непрерывного режима излучения не более 10--23 Вт/Гц*м2. На этот аппарат имеются положительное заключение научно-исследовательского института Государственной патентной экспертизы об его патентоспособности, сертификат соответствия № 3018981, аппарат рекомендован к применению комитетом по новой медицинской технике МЗ России (протокол № 4 от 10 октября 1997 г.). Регистрационное удостоверение МЗ РФ № 29/09030401/4442-02 от 30.10.02 разрешает использование аппарата «Фтизио-Биофон» для лечения больных туберкулезом. Таблица 3 Количество исследований плазмы крови у больных туберкулезом Группы наблюдения Очаговый Инфильтративный Диссеминированный Итого Контрольная N=43 80 168 104 352 Основная 128 272 168 568 208 440 272 920 N=72 Всего исследований 2.2 Описание методов исследования. Для проведения исследования использовались как общепринятые, так и разработанные методы. Ниже приводим описание использованных общепринятых методов исследования. Приготовление питательной среды. До начала исследования на весь период работы по стандартной рецептуре в соответствии с методическими рекомендациями МЗ РСФСР от 1972 г. «Приготовление и использование питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза» приготовлены концентраты питательных сред. Расфасованные по 350 мл во флаконы, концентраты хранились в холодильнике при -10 градусах С. По необходимости эту концентрированную среду разводили, разливали по 5 мл в стерильные бактериологические пробирки одинакового 32 диаметра и свертывали в АСИС при температурном режиме от 82 до 85 градусов С в течение 15-20 минут. При этом угол наклона пробирок составлял 12 градусов для получения правильной формы косяка с длиной 100 мм и свободной от среды 1/2 части дна. Соблюдение именно таких условий приготовления питательной среды особенно важно для постановки метода вертикальной диффузии. До начала исследований проведен стандартный контроль качества питательной среды на стерильность, питательные свойства, определена рН от 7,3 до 7,5. Приготовление бактериальной суспензии микобактерий и методика посева. Для проведения исследований в эксперименте использовались различные штаммы микобактерий. Бактериальные суспензии всех штаммов готовили в стерильных условиях путем растирания в фарфоровой ступке до гомогенной массы с 1 мл физиологического раствора снятых петлей колоний трехнедельных культур, а затем разводили в пробирках «Видаля» в соответствии с 10 стандартом мутности ГКИ с последующим использованием различных разведений. Посев проводили пипеткой по 0,1 мл бактериальной суспензии в каждую пробирку. Для оценки ростовых свойств различных штаммов микобактерий учитывали скорость их роста в сутках и выход микробной массы. Скорость роста оценивали макроскопически, по появлению видимых колоний. С интервалом в 24 часа проводили просмотр пробирок с посевами и регистрацией в протоколах опытов времени появления и количества выросших колоний. Выход микробной массы оценивали путем смыва колоний с поверхности питательной среды с последующим определением оптической плотности на КФК-3 при длине волны 580 нм и длине кюветы 5 мм. При проведении замеров на фотоколориметре величина оптической плотности равная 0,288 ед. соответствовала 10 стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича и в количественном выражении равна 109 микробных тел в 1 мл. 33 Методика заражения и лечения экспериментальных животных. Использована стандартная методика заражения экспериментальных животных (В.Н. Василев, 1971). Белых мышей заражали внутривенно (в вену хвоста) в дозе ОД мг суспензии 2-х недельной культуры лабораторного штамма M.H37R.V. Лечение и облучение начато через 7 дней после заражения и проводилось в течение 30 дней. Изониазид вводили раз в сутки подкожно из расчета 10 мг/кг веса животного. Морских свинок заражали в дозе 0,1 мг суспензии 2-х недельной культуры лабораторного штамма M.H37Rv подкожно. Лечение и облучение начато со второго дня после заражения и проводилось в течение 30 дней. Изониазид вводили раз в сутки per os из расчета 10 мг\кг веса животных (P.O. Драбкина, 1963). Применение ЭМИ по разработанной нами инструкции. Эффективность лечения определяли по следующим показателям: - разница в весе животных в начале и в конце опыта;- средний вес легких;- наличие специфических для туберкулезной инфекции поражений в органах; - микробиологические методы выявления МБТ. Бактериоскопический метод выявления микобактерий. Из материала, полученного от больных, а так же из материала, полученного от экспериментальных животных, готовились препараты с последующей окраской по методу Ziehl-Neelsen в соответствии с методическими рекомендациями «Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза» (составители В.М Должанский, А.Н. Калюк с соавторами, М., 1994 г). Для микроскопического метода выявления МБТ из легочной ткани и ткани селезенки экспериментальных животных готовили тонкие мазки размером 2 на 1,5 см, сушили на воздухе, фиксировали в пламени спиртовки и окрашивали по методу Ziehl-Neelsen. При микроскопии количество микобактерий определяли в баллах на 100 полей зрения: от 1 микробной клетки до 5 -1 балл; от 5 до 25 микробных клеток-2 балла; от 25 до 50 микробных клеток3 балла; более 50 микобактерий в одном поле зрения - 4 балла. 34 Бактериологический метод выявления микобактерий из органов лабораторных животных. Для определения высеваемости микобактерий туберкулеза из органов лабораторных животных половину легкого и селезенки каждого животного растирали в фарфоровой ступке со стерильным песком, заливали 5 мл 5% раствора серной кислоты. Полученную массу переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали в течение 10 минут при 3000 оборотов; затем серную кислоту сливали, осадок нейтрализовали, добавляли несколько капель физиологического раствора и сеяли в 2 пробирки со средами Левенштейна-Иенсена и "Новая". Индексы высеваемости определяли по 4-х бальной системе:- от 1 до 10 колоний - 1 балл; от 11 до 30 колоний - 2 балла; от 31 до 100 колоний - 3 балла; сплошной рост- 4 балла. Методика получения образцов крови. Забор крови из локтевой вены пациента для получения плазмы проводили в стерильную центрифужную пробирку с пробкой в количестве 5 мл с 1 мл стерильного 5% цитрата натрия. Место инъекции обрабатывали трехкратно 70 % спиртом. Время забора крови через 6-7 часов после получения последней дозы препарата, доставку в лабораторию проводили сразу после взятия материала. Методика определения бактериостатической активности крови. При выполнении работы для определения бактериостатической активности крови был выбран микробиологический способ оценки эффективного бактериостатического действия ПТП на МБТ методом вертикальной диффузии (Г.Г. Мордовской, 1970). Он основан на введении исследуемых образцов на дно пробирок с косяком питательной среды, предварительно засеянным суспензией стандартного лабораторного штамма микобактерий. Оценку антибактериальной активности проводят по величине зоны задержки роста тест-штамма, туберкулостатической активности которая прямо исследуемого пропорциональна образца. Метод вертикальной диффузии был использован и в опытах in vitro для изучения влияния ЭМИ на МБТ в сочетании с основными противотуберкулезными 35 препаратами. 36 Для проведения исследований в клинике использовались общепринятые микробиологические, клинико-диагностические и клиникорентгенологические методы. Учитывая, что одним из основных параметров эффективности лечения больных туберкулезом является негативация трахеобронхиального секрета, особое внимание было уделено микробиологическому обследованию больных. Принята следующая схема: - до начала лечения 3-х кратное бактериологическое обследование методом раздражающих ингаляций с посевом на две среды (Левенштейна-Иенсена и «Новая») и люминесцентной бактериоскопией на микроскопе "ЛюмамИЗ", в период применения сочетанных схем химиотерапии и ЭМИ - ежемесячное микробиологическое обследование по полной схеме. При инкубации проводился ежедневный просмотр посевов с регистрацией сроков появления роста для каждой питательной среды и интенсивности роста в суммарном количестве колоний. При выделении культур микобактерий туберкулеза в соответствии с Приказом МЗ СССР № 558 от 8 июня 1978 г. «Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе» проводилось изучение лекарственной чувствительности и первичная идентификация до вида. Определение чувствительности у выделенных культур микобактерий проводили методом абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Иенсена к основным противотуберкулезным препаратам: тубазиду (1, 5, 25 мкг/мл); стрептомицину (5, 10, 50 мкг/мл), рифампицину (20, 50 мкг/мл), канамицину (30, 50 мкг/мл.), этамбутолу (2, 5 мкг/мл). Идентификацию выделенных культур проводили культуральным и биохимическим методами: определяли скорость роста на различных питательных средах при разных температурных режимах, морфологию колоний, пигментообразование, нитратредуктазную активность, ниациновый тест, каталазный тест. Клинико-рентгенологическое обследование больных туберкулезом проводилось с учетом разработанной программы по кратности и объему. Рентгенологическое обследование проводилось на аппаратуре ТУР Д – 800 37 "Сименс" и состояло из обзорной рентгенограммы легких, а при необходимости - прицельной рентгенографии и томографии отделов легких. В сложных случаях проводилась бронхологическое исследование методом фибробронхоскопии. Использовались методы статистической обработки данных: Критерии достоверности Фишера - Стьюдента определялись по формулам: M1 M 2 t m12 m22 ; где М1 – первое среднее арифметическое; М2 - второе среднее арифметическое; m1 - средняя ошибка первой средней арифметической; т2 - средняя ошибка второй средней арифметической. Среднюю ошибку средней арифметической вычисляли по формуле: m aK , в которой ошибка средней арифметической по Петер- су (а) умножается на фактор Молденгауэра или константу (К). K 1 0.79788n n1 где n - количество наблюдений. Средняя ошибка того или иного показателя, выраженного в процентах, вычислялась по формуле: m Pq n где Р - величина показателя; n - количество наблюдений; q = 100-р, если р выражено в процентах. Вторая формула: t P1P2 P1(100P1 ) P2 (100P2 ) n11 n2 1 где P1 - первый показатель в процентах; Р2 - второй показатель в процентах; n1 - количество наблюдений в первой группе; n2 - количество наблюдений во второй группе. 38 Обработка материала проводилась на ПВЭМ типа IBM PSYAT с процессором Intel Pentium-200 MMX с использованием современных программных комплексов. При достаточном числе наблюдений возможная ошибка не превышала 5% (Р < 0,05) при коэффициенте достоверности 1,96. 39 Глава 3 ДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ МИКОБАКТЕРИЙ В ОПЫТАХ in vitro. 3.1 Ростовые свойства различных видов микобактерий под влиянием электромагнитного излучения. До изучения сочетанного действия электромагнитного излучения и противотуберкулезных препаратов у экспериментальных животных возникла необходимость определить в опытах in vitro воздействие электромагнитного излучения на ростовые свойства различных видов микобактерий и культур МВТ, выделенных от больных. В работе использовались лабораторные штаммы МБТ H37Rv и H37Ra, M.bovis-Bovinus-8, входящие в Mycobacterium tuberculosis complex, а также нетуберкулезные микобактерий (НТМБ) - основной возбудитель микобактериоза M.avium и сапрофит M.smegmatis. Взвесь микобактерий готовили по стандарту мутности ГКИ 10 единиц как описано в главе 2 и засевали в количестве ОД мл на поверхность питательных сред трех опытных (с облучением ЭМИ) и трех контрольных (без облучения) пробирок. Инкубировали все пробирки в стандартных условиях. При проведении облучения из термостата извлекали и опытные, и контрольные пробирки. Контрольные пробирки с посевами экранировали при проведении облучения с помощью металлического щита. Учет ростовых свойств проводили по методике, изложенной в главе 2. При проведении фотоколориметрирования величины оптической плотности суспензии, взятой с контрольных пробирок, принимали за 100 процентов, а в опыте определяли % от контроля. При проведении облучения по одному сеансу в день, как предложено в инструкции к аппарату «Биофон» для лечения урогенитальных инфекций, не выявлено различий между опытом и контролем в сроках роста и в количестве колоний. Проведено увеличение количества сеансов до 5 в сутки и длительности сеанса до 5 минут. Облучение 40 проводили в 9, 11, 13, 15, 17 часов ежедневно в течение 10 дней. Выполнено 450 исследований, данные представлены в таблице 4. Таблица 4 Действие ЭМИ на ростовые свойства лабораторных тест-штаммов микобактерий (в % от контроля) Лабораторные штаммы M.H37Rv Скорость роста колоний Выход микробной массы (в процентах) (в процентах) Контроль Опыт (М±т) Контроль Опыт (М±т) 100±0 75,0 ± 5,0 100±0 (Р<0,05) N=90 M.Bovis- Bovinus8 100±0 85,5 ± 5,0 (Р<0,05) 100±0 (Р<0,05) N=90 M.Avium 100±0 60,0 ± 5,0 M.H37Ra 100±0 115,5 ±1,5 100±0 M.Smegmatis 100±0 N=90 166,5 ±2,0 (Р<0,05) 64,5 ± 2,5 (Р<0,05) 100±0 (Р<0,05) N=90 53,3 ±4,4 (Р<0,05) (Р<0,05) N=90 62,8 ± 1,6 128,8 ±3,2 (Р<0505) 100±0 173,3 ±4,3 (Р<0,05) При воздействии ЭМИ в опыте выявлена задержка скорости роста колоний вирулентных штаммов M.H37Rv, M.Bovis- Bovinus 8 и M.Avium во всех сериях опытов. Замедление скорости роста составило: у M.H37Rv в среднем на 25%; у M.Bovis-Bovinus-8 на 14,5 %; у M.Avium на 40 % по сравнению с контролем. Выход микробной массы уменьшился соответственно у M.H37Rv от 35,6% до 38,8%; у М. Bovis-Bovinus-8 от 42,3% до 51,1%; у M.Avium от 33% до 38%. В отличие от вирулентных штаммов у авирулентных микобактерий наблюдалось ускорение роста колоний: у M.H37Ra от 14% до 17%; у M.Smegmatis от 64,4% до 68,5%, а выход микробной массы увеличился 41 соответственно у штамма M.H37Ra от 25,6% до 32%, у M.Smegmatis от 64,5 % до 68,5%. Таким образом, электромагнитное излучение угнетает рост вирулентных штаммов микобактерий на питательных средах, а рост авирулентных штаммов, напротив, стимулирует. На следующем этапе исследования изучено воздействие ЭМИ на ростовые свойства культур МБТ, выделенных от больных. Взяты 19 культур чувствительных к противотуберкулезным препаратам и 38 культур с различной степенью и спектром лекарственной устойчивости. Посев, учет результатов и облучение ЭМИ проводилось аналогично первой серии опытов. Взято по 3 контрольных (без облучения) и по 6 опытных (с облучением) пробирок. Выполнено 513 исследований. Данные представлены в таблице 5. Таблица 5 Действие ЭМИ на ростовые свойства культур МБТ, чувствительных и с различной устойчивостью к ПТП (в % от контроля) Культуры МБТ Контроль Скорость колоний (сутки) N = 513 Чувствительные к ПТП 100 + 0 N=171 С умеренной устойчивостью 100 ±0 к ПТП N=162 С высокой устойчивостью кПТП=180 роста Выход 100 ±0 мик- робной массы 75,5 ± 1,0 72,5 ± 7,5 (Р<0,05) (Р<0,05) 70,5 ± 3,0 75,0 ± 5,0 (Р<0,05) (Р<0,05) 67,5 ±1,5 57,5 ± 8,0 (Р<0,05) (Р<0,05) В опыте скорость роста колоний у культур МБТ с сохраненной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам уменьшилась в среднем на 24,5 %. У культур с умеренной устойчивостью скорость роста замедлилась на 29,5 %, а у культур с высокой степенью устойчивости – на 32,5 %. Выход микробной массы у чувствительных культур 42 уменьшился на 27,5 %. У культур с умеренной устойчивостью - на 25 %; а у культур с высокой степенью устойчивости - на 42,5 %. Таким образом, выявлено, что ЭМИ замедляет скорость роста колоний в среднем на 28,8% и уменьшает выход микробной массы в среднем на 31,6% у всех культур микобактерий туберкулеза, независимо от наличия у них чувствительности или различной степени и спектра резистентности к противотуберкулезным препаратам. Проведено в следующей серии опытов сравнительное изучение действия ЭМИ на изменение ростовых свойств вирулентных штаммов МБТ в зависимости от количества микробных тел в 0,1 мл посевного материала. Взяты чувствительный к ПТП международный лабораторный штамм M.H37Rv и два клинических штамма МБТ: - № 389 с множественной лекарственной устойчивостью к изониазиду 1 мкг/мл и рифампицину 40 мкг/мл; и полирезистентный штамм № 375 с устойчивостью к стрептомицину 10 мкг/мл, канамицину 30 мкг/мл и изониазиду 10 мкг/мл. По стандарту мутности ГКИ приготовлены следующие разведения: 10ед х 10-2, 10ед х 10-1, 10ед х 10. Посев, учет результатов и облучение ЭМИ проводилось аналогично первой серии опытов. Выполнено 126 пробирочных опытов. Полученные данные представлены в таблице 6. По данным таблицы видно, что замедление скорости роста колоний и уменьшение выхода микробной массы под воздействием ЭМИ наблюдалось во всех опытных пробирках независимо от количества микробных тел в 0,1 мл посевного материала. Таким образом, на основании проведенных исследований in vitro определено, что электромагнитное излучение оказывает угнетающее воздействие на ростовые свойства вирулентных микобактерий (лабораторные штаммы и культуры микобактерий туберкулеза) независимо от их степени и спектра устойчивости к противотуберкулезным препаратам при культивировании на питательных средах. 43 При дальнейшем наблюдении за опытными и контрольными посевами и выполнении облучения с интервалом 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264 часа отмечено, что разница в массивности роста между опытом и контролем снижается и при 264 часах количество колоний в опытных и контрольных пробирках равняется соответственно 50 и 52. Таким образом, на основании этих данных выполнен графический анализ с учетом скорости роста в часах и массивности роста по количеству колоний. Построена кривая зависимости действия электромагнитного излучения на массивность роста лабораторного штамма H37Rv от длительности культивирования на питательной среде при микробной нагрузке по стандарту ГКИ 10ед × 10-1 Динамика действия ЭМИ на массивность роста лабораторного штамма H37Rv в зависимости от длительности культивирования на питательной среде представлено на рисунке 1. Массивность роста (количество колоний) 60 50 40 31 26 30 20 0 50 42 40 10 52 50 15 14 8 5 0 0 1 120 144 168 192 216 240 264 сроки роста (часы) контроль опыт Рис 1. Динамика действия электромагнитного излучения на массивность роста лабораторного штамма M.H37Rv от длительности культивирования на питательной среде при микробной нагрузке по стандарту ГКИ 10ед х 10-1. 44 Максимальная разница в количестве колоний в 5 раз наблюдается в 144 часа, в 192 часа в 2 раза количество колоний в опыте меньше, чем в контроле. До исследования действия ЭМИ в эксперименте и клинике при туберкулезе возникла необходимость в разработке инструкции применения ЭМИ с учетом влияния расстояния от источника излучения до объекта. С этой целью исследовали влияние расстояния от источника ЭМИ до опытных пробирок с посевами МБТ, а также влияние варьирования количества проведенных сеансов в сутки, длительности каждого сеанса облучения и длительности перерывов между сеансами. Использовали лабораторный штамм M.H37Rv, в микробной нагрузке 10ед х 10. Посев и учет результатов проводились аналогично первой серии опытов. В этой серии опытов изучена зависимость угнетающего действия ЭМИ от сроков начала и длительности сеансов облучения. Облучение начинали через 18 часов после посева и проводили в течение 10 часов в начале каждого получаса однократно. Выявлено замедление скорости роста колоний микобактерий под действием ЭМИ на 48 часов, а также уменьшение выхода микробной массы в 1,9 2,2 раза. Определено также влияние сроков начала облучения на рост микобактерий туберкулеза. Облучение начинали в день посева МБТ, на вторые сутки и на третьи сутки после посева. При этом опытные пробирки каждого дня инкубировались в отдельных термостатах и экранировались от контрольных пробирок с посевами с помощью металлического щита. Облучение проводили в течение 10 часов в начале каждого часа, с пятикратным повторением в течение каждого сеанса. Результаты представлены на рисунке 2. Сроки начала роста микобактерий туберкулеза в пробирках, облучаемых с 3 дня после посева, практически совпали с контрольными посевами. При начале облучения в первый и второй дни после посева скорость роста колоний МБТ замедлилась: начало роста МБТ, облучаемых с 1 дня - 8 сутки; МБТ, облучаемых со 2 дня - 7 сутки. 45 Таблица 6 Влияние ЭМИ на скорость роста колоний в сутках и выход микробной массы МБТ в зависимости от величины микробной нагрузки Штаммы Микробная нагрузка по стандарту ГКИ 10ед х 10-2 МБТ Контроль Сроки H37Rv 10ед х 10-1 Опыт Масса Сроки Опыт Контроль Опыт Масса Сроки Масса Сроки Масса Сроки Масса Сроки Масса (%) роста (%) роста (%) роста (%) роста (%) роста (%) 18-19 100 21-24 85±3,5 10-12 100 14-21 90+5,1 3-7 100 5-7 75+3,9 72±7,5 25-26 67±4,2 16-18 88±3,8 21-28 65±4,3 5-8 85+3,9 7-10 65±3,9 70±7,2 25-26 68+3,7 16-18 89+4,1 21-28 61±5,3 5-8 88±3,9 7-10 65+3,0 N=42 Клинический 21-23 роста Контроль 10ед х 10 штамм№389 N=42 Клинический штамм№375 N=42 22-24 Выход микробной массы в облучаемых пробирках также уменьшился по сравнению с контролем в 2,0 раза в облученных пробирках с 3 дня, в 4,4 раза в пробирках, облученных со 2 дня, в 15 раз в пробирках, облученных с 1 дня, максимальная разница отмечена на 8 сутки от дня посева. К 12 дню количество колоний составило 52, 50, 48, 46 соответственно. Массивность роста (количество колоний) 60 50 26 20 10 0 40 34 31 30 48 42 46 34 15 14 18 8 5 50 50 42 40 52 52 50 0 0 1 0 2 0 120 144 168 7 2 7 192 216 16 240 264 288 сроки роста (часы) контроль облучение со 2 суток облучение с 3 суток облучение с 1 суток Рис 2. Зависимость ростовых свойств М.Н37Rv от сроков начала облучения В следующей серии опытов применен метод вертикальной диффузии. Облучение опытных пробирок с посевами лабораторного штамма М.Н37Rv с микробной нагрузкой 10ед х 10-1 проводили с различного расстояния: 35 мм, 55 мм и 75 мм. Такие расстояния от прибора до пробирок, находящихся в штативе в первом ряду и обусловлены тем, что при вертикальной диффузии пробирки с посевами должны стоять строго вертикально. Опытных пробирок (с облучением) взято по 6 штук для каждого препарата, контрольных пробирок (без облучения) по 3. Количество сеансов 5 раз в сутки, длительность сеанса 5 минут. Облучение проводили в 9, 11, 13, 15, 17 часов ежедневно. Использовались среды Левенштейна-Йенсена, «Новая» и разведения рифампицина и стрептомицина в критических кон- 47 центрациях 40 мкг/мл и 10 мкг/мл. На среде Левенштейна-Йенсена учет результатов проводили на 21 день, на среде «Новая» - на 7 день, в эти сроки во всех пробирках отмечен «густой газон» роста лабораторного штамма M.H37Rv с зонами задержки роста. Опыты были повторены в трех параллельных сериях. Учет результатов проводили путем измерения зон задержки роста лабораторного штамма M.H37Rv в мм от дна пробирки с точностью 1±0,5 мм. Выполнено 54 пробирочных опыта. Данные в процентах к контрольным пробиркам представлены на диаграммах 1 и 2. На среде «Новая» зоны задержки роста для стрептомицина в критической концентрации 10 мкг/мл в пробирках без облучения составили в среднем 23,3 мм. В опытных пробирках с облучением и с расстоянием до аппарата 35 мм зоны задержки роста увеличились до 30,5 мм, с расстоянием 55 и 75 мм зоны задержки роста увеличились до 27,9 мм. Для рифампицина в критической концентрации 10 мкг/мл в контрольных пробирках зоны задержки роста составили в среднем 16,7 мм, а в опытных пробирках зоны задержки роста увеличились и составили в 20,7 мм , 19,9 мм и 19,0 мм соответственно для пробирок с расстоянием до аппарата 35, 55 и 75 мм. На среде Левенштейна-Йенсена в контрольных пробирках с разведением стрептомицина зоны задержки роста составили в среднем 19,9 мм, а в опыте увеличились до 26,3 мм, 25,3 мм, 21,5 мм соответственно расстоянию до аппарата 35, 55 и 75 мм. В пробирках с разведением рифампицина зоны задержки роста составили в контроле 12,2 мм, а в опыте увеличились до 17,6 мм, 16,8 мм, 15,3 мм соответственно расстоянию до аппарата 35, 55, 75 мм. Таким образом, чем меньше расстояние от аппарата до опытных пробирок, тем зоны задержки роста увеличиваются на большую величину в сравнении с контролем. Диаграмма 1 Влияние расстояния от источника ЭМИ до пробирок на зоны задержки роста на среде Левенштейна-Йенсена 49 Диаграмма 2 Влияние расстояния от источника ЭМИ до пробирок на зоны задержки роста на среде «Новая» 38 50 3.2 Исследование сочетанного действия электромагнитного излучения и противотуберкулезных препаратов в опытах in vitro. Сочетанное влияние противотуберкулезных препаратов и ЭМИ на МБТ изучено методом вертикальной диффузии. Использовались основные противотуберкулезные препараты: - изониазид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол, стрептомицин. Из препаратов резерва был взят канамицин. Эти препараты занимают основное место в химиотерапии туберкулеза, их назначают в виде отдельных или комбинированных лекарственных форм в фазе интенсивной терапии и в фазе продолжения лечения. Взвесь микобактерий лабораторного тест-штамма M.H37Rv с количеством микробных тел по стандарту мутности ГКИ 10 ед. х 10-1 засевалась в пробирки с питательной средой «Новая» как описано в главе 2. Были взяты стандартные разведения препаратов: - изониазид - 1 мкг/мл; стрептомицин 50 мкг/мл; рифампицин 40 мкг/мл; канамицин 30 мкг/мл; этамбутол 2 мкг/мл; пиразинамид 50 мкг/мл. Для каждого препарата было взято по 12 контрольных пробирок для опыта (с облучением) и по 6 контрольных пробирок для контроля (без облучения). Было проведено 5 серий опытов. Разведения препаратов вносили во все пробирки на вторые сутки после посева M.H37RV. Облучение опытных пробирок с посевами проводили 5 раз в сутки в 9, 11, 13, 15, 17 часов ежедневно в течение 10 дней, длительность сеанса 5 минут. Учет результатов проводили на 10 день от момента посева путем измерения зон задержки роста МБТ в мм от дна пробирки с точностью 1±0,1 мм. Выполнено 108 исследований. Данные полученных исследований представлены в таблице 7. В опыте в сравнении с контрольными пробирками зоны задержки роста при применении ЭМИ увеличились от 4,4% до 21,1%. Причем максимальное увеличение зон задержки роста в опытных пробирках в сравнении с контрольными отмечено для стрептомицина - 21,1%, для изониазида составило 20,7%, для этамбутола - 20,3%. Для рифампицина увеличение зон задержки роста составило 4,4%. Для канамицина - 9,8%. В случае с 51 пиразинамидом отмечено уменьшение зон задержки роста в опытных пробирках. Таблица 7 Туберкулостатическая активность препаратов в сочетании с ЭМИ. Наименование Зоны задержки Зоны задержки препарата (доза роста МБТ в мм роста МБТ в мм мкг\мл) (опыт) (контроль) Изменение зон задержки роста МБТ в% Изониазид (1 мкг\мл) N=90 39,0 ±11,3 32,3 ± 0,5 Увеличение на 20,7% Стрептомицин (50 мкг\мл)N=90 23,0 ±3,3 19,0 ± 0,7 Увеличение на 21,1% Рифампицин (40 мкг\мл)N=90 16,7 ±0,9 16,0 ±1,3 Увеличение на 4,4 % Канамицин (30 мкг\мл)N=90 19,0 ±2,0 17,3 ± 0,9 Увеличение на 9,8% Этамбутол (2 мкг\мл)N=90 16,0 ±0,7 13,3 ± 1,6 Увеличение на 20,3% Полученные данные свидетельствует о синергетическом действии основных противотуберкулезных препаратов и электромагнитного излучения низкой степени интенсивности в отношении микобактерий штамма M.H37RV при культивировании на питательной среде. Далее в опытах in vitro изучено влияние ЭМИ на лекарственную устойчивость у культур МБТ, выделенных от больных. У всех культур МБТ определялась методом абсолютных концентраций на плотной питательной среде «Новая» различная по степени и спектру устойчивость к разным противотуберкулезным препаратам. Степень лекарственной устойчивости микобактерий определяется в соответствии с установленными критериями по приказу МЗ СССР № 558 от 8 июня 1978 г. «Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе». В первой серии опытов были взято 96 культур с начальной степенью устойчивости к ПТП. 52 Проведено облучение всех штаммов при культивировании их на питательной среде с последующим повторным определением лекарственной устойчивости по стандартной методике. Облучение опытных пробирок с посевами проводили 5 раз в сутки в 9, 11, 13, 15, 17 часов ежедневно в течение 10 дней, длительность сеанса 5 минут. Выполнено 206 исследований. Данные представлены в таблице 8. Таблица 8 Влияние электромагнитного излучения на начальную степень устойчивости культур МБТ к противотуберкулезным препаратам Препараты Количество Из них число культур, у которых под возкультур действием излучения степень устойчивости МБТ Повысилась Снизилась Не изменилась абс. % абс. % Абс. % Изониазид 43 3 7 0 0 40 93 Стрептомицин 12 6 50 1 8,3 5 41,7 Рифампицин 6 0 0 1 16,7 5 83,3 Канамицин 17 2 11,7 8 47,1 7 41,2 Этамбутол 13 3 23 1 7,7 9 69,3 Тибон 5 0 0 1 20 4 80 Итого 96 14 14,6 12 12,5 70 72,9 Под влиянием ЭМИ выявлены наиболее существенные изменения в устойчивости к стрептомицину - у 50% культур степень устойчивости под воздействием ЭМИ повысилась. К другим препаратам степень начальной устойчивости менялась неоднозначно. Из 96 культур в 72,9 % случаев не выявлены существенные изменения начальной степени устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. В следующей серии опытов изучено влияние ЭМИ на высокую степень устойчивости культур МБТ, выделенных от больных. Условия проведения исследования были аналогичны первому опыту. Данные представлены в таблице 9. В результате этого исследования установлено, что на 53 высокую степень устойчивости культур МБТ к противотуберкулезным препаратам электромагнитное излучение практически не влияло. У 94,6% культур под влиянием ЭМИ степень устойчивости не изменилась. Таблица 9 Влияние электромагнитного излучения на высокую степень устойчивости к ПТП культур МБТ Препараты Количество Из них число культур, у которых под возкультур действием излучения степень устойчивости МБТ Повысилась Снизилась Не изменилась Абс. % абс. % абс. % Изониазид 15 0 0 0 0 15 100 Стрептомицин 17 0 0 0 0 17 100 Рифампицин 7 0 0 0 0 7 100 Канамицин 14 0 0 1 7,1 13 92,9 Этамбутол 14 1 7,1 1 7,1 12 85,7 Тибон 7 0 0 1 14,3 6 85,7 Итого 74 1 1,4 3 4,1 70 94,6 В следующей серии опытов увеличено время воздействия ЭМИ. Об лучение опытных пробирок с посевами проводили 5 раз в сутки в 9, 11, 13, 15, 17 часов ежедневно в течение 30 суток с длительностью сеансов по 5 минут. Полученные результаты представлены в таблице 10. В результате опыта установлено, что у 73,8 % под влиянием ЭМИ степень лекарствен ной устойчивости культур МБТ не изменилась. 54 Таблица 10 Влияние электромагнитного излучения на степень лекарственной устойчивости культур МБТ Наименование Культуры, устойчивые к Культуры с начальной Всего устойчивых культур к провысоким концентрациям устойчивостью данному препарату тивотуберкулезн Всег данного Из них,препарата у которых под Всего Из них, у которых под Общее Из них с изменением ых препаратов о воздействием излучения воздействием ЭМИ степень число степени устойчивости степень устойчивости начальной устойчивости под влиянием ЭМИ Повыси Понизи Не измеПовыси Понизи- Не измеПовыси Понизи- Не лась лась нилась лась лась нилась лась лась изменилась Изониазид 4 0 0 4 11 1 0 10 15 1 0 14 Стрептомицин 14 0 1 13 3 1 0 2 17 1 1 15 Рифампицин 4 0 0 4 3 0 2 1 7 0 2 5 Канамицин 3 0 0 3 11 1 7 3 14 1 7 6 Этамбутол 6 1 0 5 8 1 4 3 14 2 4 8 Тибон 0 0 0 0 17 3 0 14 17 3 0 14 Итого 31 1 1 29 53 7 13 33 84 8 14 62 Проценты 100 3,2 3,2 93,6 100 13,2 24,5 62,3 100 9,5 16,7 73,8 55 3.3 Метод определения туберкулостатической активности электромагнитного излучения в сочетании с противотуберкулезными препаратами. До начала исследований у экспериментальных животных и в клинике у больных туберкулезом возникла необходимость разработать метод определения туберкулостатической активности электромагнитного излучения в сочетании с противотуберкулезными препаратами. Мы использовали микробиологический способ оценки эффективного бактериостатического действия на МБТ противотуберкулезных препаратов (ПТП) методом вертикальной диффузии. Данный метод основан на том, что величины зон задержки роста МБТ прямо пропорциональны туберкулостатической активности исследуемого образца. Метод включает ведение на дно пробирок с питательной средой, предварительно засеянных взвесью стандартного тест-штамма микобактерий, исследуемых образцов с последующей оценкой величин зон задержки роста после инкубации этих пробирок в термостате. При выполнении этого метода для получения сравнимых результатов в достаточно короткие сроки необходимо соблюдение стандартных условий. Во-первых, использовать оптимального состава питательную среду с высокими диффузионными и питательными свойствами, а также с постоянной плотностью. Во-вторых, применять лабораторный тест-штамм микобактерий туберкулеза с постоянной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам и в стандартной микробной нагрузке на определенный объем питательной среды. Метод вертикальной диффузии был усовершенствован Г.Г. Мордовским и предложен для определения концентраций противотуберкулезных препаратов в жидкостях и тканях у экспериментальных животных и у больных туберкулезом в процессе химиотерапии. В качестве питательной среды он предложил использовать среду на желтковой основе «Новая». Она обладает высокими питательными свойствами, что позволяет получить хороший рост (густой газон) лабораторного штамма на 6-7 сутки. Кроме того, использование для культивирования микобактерий среды на желтковой основе улучшает 56 диффузию препарата в питательную среду и тем самым повышает точность измерения. Готовится «Новая» по стандартной рецептуре. Разливается по 5 мл в стерильные бактериологические пробирки одинакового диаметра. Свертывание проводится в АСИС при стандартном температурном режиме. Однако необходимо при этом строго соблюдать угол наклона пробирок, который должен составлять 12 градусов для получения правильной формы косяка с длиной 100 мм и свободной от среды ½ части дна, что особенно важно для метода вертикальной диффузии. Нами предложено использовать принцип объемных соотношений для получения сопоставимых результатов, упрощения и удешевления метода. Применение этого принципа не требует подбора специальных пробирок, достаточно при разливе среды отметить на первой пробирке уровень, по которому в дальнейшем будет разливаться весь ряд. В качестве тест-штамма был взят международный лабораторный штамм М. H37Rv. Посев проводили с соблюдением следующих условий. Взвесь готовили в концентрации, равной 10 единиц по стандарту мутности ГКИ, затем разводили дистиллированной водой 1:10. Вносили взвесь микропипеткой на поверхность питательной среды «Новая» в количестве 0,1 мл с визуальным контролем равномерного распределения посевного материала по поверхности всего косяка. Пробирки помещали в горизонтальном положении на 24-48 часов в термостат при 37° с контролем впитывания засеянного материала по появлению «матовой» поверхности у косяка питательной среды. Этот этап необходим для закрепления микробных тел на поверхности косяка. Подготовленные таким образом пробирки допускается хранить в холодильнике при 5°, но не более 2 недель до применения. Учет результатов проводят путем измерения зон задержки роста M.H37Rv в мм от дна пробирки с точностью 1±0,1 мм. Для измерения бактериостатической активности в качестве эталона условно принимают антибактериальную активность определенного соединения. Специфическая активность определенного весового количества этого 57 соединения, принятого за эталон, называется единицей действия (ЕД) антибактериальной активности. ЕД - это величина постоянная и служит основой для количественного выражения бактериостатической активности. За 1 ЕД может быть принята минимальная концентрация химиопрепарата, задерживающая рост выбранного для этой цели штамма тест-культуры в строго определенных условиях испытания. Измерение активности исследуемого образца в сравнении с активностью известного противотуберкулезного препарата позволяет повысить точность и достоверность результатов исследования за счет возможности сопоставления получаемых результатов. Нами в качестве стандартного противотуберкулезного препарата взят изониазид, а оценка антибактериальной активности проводилась в единицах действия (ЕД), равных минимальной туберкулостатической активности изониазида 0,12 мкг\мл. Для оценки полученных данных нами использованы стандартные номограммы. Для построения калибровочных графиков (номограмм) требуется употребление стандартных контрольных концентраций (разведений) ПТП. При этом необходимо учитывать и диффузионные свойства растворителя. Для построения номограммы стандартные (контрольные) растворы изониазида готовили на стерильном 1\15 М фосфатном буфере, рН =7,8-8,0 в кратных концентрациях от 0,125 до 4,0 мкг\мл. На дно пробирок с засеянным тест-штаммом помещали по 0,3 мл рабочих разведений изониазида. При этом для каждого разведения изониазида необходимо брать по 6 пробирок со средой, ко всему ряду разведений необходимо ставить контроль -2 пробирки с 0,3 мл буфера. Причем вносить препарат надо по свободному от питательной среды краю пробирки для исключения его воздействия на растущие колонии лабораторного штамма. Пробирки инкубируют строго в вертикальном положении в термостате при температуре 37° С. По истечении срока инкубации, который составляет 10 дней, в контрольных пробирках по всей поверхности среды отмечается массивный рост M.H37Rv, а в пробирках с разведениями препарата образуются зоны задержки роста 58 микобактерий. Зоны замеряют в мм от дна пробирки с точностью до 1 ± 0,5 мм. Далее на основании полученных данных строят стандартную номограмму туберкулостатических концентраций для изониазида на полулогарифмической бумаге, по оси абсцисс откладывают величины зон задержек роста в мм, а по оси ординат - известные разведения изониазида. разведение изониазида мкг/мл Номограмма изониазида 10 1 2 10,2 21,6 31,2 53 63 0,1 Высота зон задержки роста мм Изониазид Оценка полученных данных проводится по стандартной номограмме. На номограмме по оси абсцисс находим значение в мм полученного среднего величин зон задержки роста. От этого значения строим перпендикуляр до пересечения с линией графика, а от точки пересечения строим перпендикуляр до оси ординат. Полученное значение на этой оси соответствует величине антибактериальной активности в единицах действия - ЕД/мл. Сравнение полученных данных со стандартной номограммой повышает точность и достоверность исследования. Определение бактериостатической активности в БД дает возможность проводить сравнение полученных результатов в каждом конкретном случае. Для каждой последующей серии питательной среды необходимо строить свою 59 номограмму и вносить коэффициент поправки относительно стандартной номограммы. На конечном этапе исследования измеряют зоны задержки роста M.H37Rv при воздействии электромагнитного излучения. По номограмме определяют туберкулостатическую активность этого воздействия в ЕД относительно изониазида. В современных условиях стандартное лечение больных туберкулезом на интенсивном этапе включает применение комплекса из 4-5 противотуберкулезных препаратов. Бактериостатическая активность крови (БАК) является косвенным показателем суммарного действия химиопрепаратов и может служить критерием оценки их эффективного применения в сочетании с электромагнитным излучением. Подготовка исследуемого образца. Для получения плазмы забор крови из локтевой вены пациента проводят в стерильную центрифужную пробирку с пробкой в количестве 5 мл с 1 мл стерильного 5% цитрата натрия. Место инъекции обрабатывается 70 % спиртом. Время забора крови через 6-7 часов после получения последней дозы препарата и проведения лечебных сеансов электромагнитного излучения по схеме. Доставка в лабораторию проводится сразу после взятия материала. Проведение исследования. Полученный образец крови в лаборатории отстаивается в термостате при 37° для получения плазмы. Вносится исследуемая плазма в количестве 0,3 мл по свободному от питательной среды краю пробирки для исключения воздействия на растущие колонии тестштамма. В целях получения сопоставимых результатов необходимо на каждый образец плазмы брать не менее 3-х пробирок. Инкубировать пробирки строго в вертикальном положении в термостате при температуре 37° в течение 10 суток. Учет результатов проводится по стандартной номограмме в единицах действия. Таким образом, с помощью этой методики можно оценить туберкулостатическое действие ЭМИ в сочетании с препаратами. Методика дает возможность определить сочетанное действие комплекса противотуберкулезных препаратов у конкретного больного на фоне хи- 60 миотерапии в сочетании с воздействием различных видов излучения. 61 Резюме. Установлено ингибирующее влияние электромагнитного излучения на ростовую активность вирулентных штаммов микобактерий и культур МБТ, выделенных от больных, независимо от их резистентности к противотуберкулезным препаратам. Определена прямая зависимость задерживающего эффекта электромагнитного излучения на развитие микобактерий от степени их вирулентности при культивировании на питательных средах. Установлено, что основные противотуберкулезные препараты и ЭМИ обладают синергидным действием на микобактерий. Влияние ЭМИ на начальную степень устойчивости у культур МБТ к противотуберкулезным препаратам выражено слабо. На высокую степень резистентности культур МБТ ЭМИ не влияет. Разработан метод, позволяющий определить воздействие электромагнитного излучения низкой интенсивности в сочетании с противотуберкулезными препаратами у экспериментальных животных и у больных при комплексной терапии. 62 Глава 4 ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ. 4.1 Выявление микобактерий туберкулеза у экспериментальных животных в условиях применения электромагнитного излучения в сочетании с изониазидом. В исследовании использовали стандартную методику заражения экспериментальных животных. В нашем исследовании использовались два вида лабораторных животных - белые мыши и морские свинки. В первом опыте использовано 60 половозрелых самцов белых мышей весом 18-22 г. Развитие туберкулеза тестировалось по общему состоянию животных (снижение активности и снижение веса), а через 14 дней выполнена эвтаназия 3 мышей из контрольной группы (не леченых) и их паренхиматозные органы подверглись макроскопическому и микробиологическому исследованию. У этих животных на вскрытии обнаружились множественные очаги туберкулезного воспаления в легких и селезенке. При бактериоскопическом исследовании в мазках окрашенных по методу Ziehl-Neelsen обнаружены кислотоустойчивые микобактерий, а при микробиологическом исследовании из паренхиматозных органов этих животных были высеяны микобактерий туберкулеза. Все животные были разделены на 6 групп по 10 особей в каждой. Лечение начато через 7 дней после заражения и проводились в течение 30 дней. Изониазид вводили раз в сутки подкожно из расчета 10 мг\кг веса животных. Применение ЭМИ проводили следующим образом : - 1день - 4 раза с интервалом 6 часов; 2 день - 3 раза с интервалом 8 часов; с 3 и по 7 день - двукратно с интервалом 12 часов; с 8 дня и до конца терапии - однократно. После окончания опыта, выжившим животным проводили эфтаназию ингаляционным наркозом. На протяжении всего опыта проводили поведением, постоянное наблюдение за животными: 63 потреблением корма, состоянием волосяного покрова и слизистых оболочек, изменением веса (ежедневное взвешивание). Эффективность лечения определялась по следующим показателям: разница в весе мышей в начале и в конце опыта; - средний вес легких; - наличие специфических поражений в легких. Индекс поражения легких определяли по 4-х бальной системе (от единичных, слабо выраженных очагов -1 балл до множественных, крупных некротических очагов - 4 балла). Выявление МБТ микроскопическим методом из легочной ткани по методу Ziehl-Neelsen описано в главе 2. При микроскопии количество микобактерий в мазках из легочной ткани также определяли в баллах на 100 полей зрения: от одной микробной клетки до 5 - 1 балл; от 5 до 25 - 2 балла; от 25 до 50 - 3 балла; более 50 микобактерий в одном поле зрения 4 балла. Результаты макроскопических и микроскопических исследований представлены в таблице 11. Таблица 11 Данные макроскопических и микроскопических исследований у белых мышей. Группы мышей N=60 Изменение веса мышей (г) Средний вес Индекс поралегких (мг) жения легких Индекс количества МБТ в легких I здоровые, N=10, (контроль) + 6,3 246,0+1,8 0 0 II здоровые, N=10, Получавшие ЭМИ + 8,4 256,0 + 2,0 0 0 III зараженные, N=10 не леченые -2,4 416,0 ±2,4 3,8 3,7 IV зараженные, N=10 леченые ЭМИ + 3,5 273,5 ±3,5 2,6 2,5 V зараженные, N=10 Леченые изониазидом + 5,8 264,0 ±2,0 0 0 VI зараженные, N=10 Леч. изониазид + ЭМИ + 5,3 260,2 ±2,4 0 0 64 У мышей как здоровых, так и зараженных, получавших лечение, отмечено прибавление веса в конце опыта, причем различия в этом показателе между V и VI группами были незначительны. В III группе мышей (зараженные и не леченые) средний вес по сравнению с первоначальным снизился на 2,4 г, что свидетельствует о прогрессировании туберкулезной инфекции. По данным таблицы видно, что средний вес легких у животных, получавших изониазид (V группа) и получавших сочетанное лечение с ЭМИ (VI группа) практически не отличался от такового у здоровых животных (I группа). У мышей, подвергшихся только облучению ЭМИ, вес легких был ниже (в 1,5 раза) чем у животных в контрольной группе. Специфические изменения в легких были отмечены у мышей контрольной III группы - множественные, сероватые, крупные очаги. У животных V и VI групп макроскопических изменений в легких не выявлено, а в IV группе они были единичными и составили 2,6 балла. В мазках из легочной ткани наибольшее количество МБТ также обнаружено у мышей III группы. В мазках у животных V и VI групп они не выявлены, а в IV группе у нескольких мышей обнаружены единичные микобактерии в полях зрения, что составило 2,5 балла. Микробиологические исследования выполнены по методике, представленной в главе 2. Индекс высеваемости МБТ определяли по 4-х бальной системе: 1 балл от 1 до 10 колоний; 2 балла от 11 до 30 колоний; 3 балла от 31 до 100 колоний; 4 балла - сплошной рост. Культуральный метод исследования показал массивный рост МБТ при посеве гомогенатов легких и селезенок мышей третьей группы через один месяц от момента засева. Процент положительных находок при посеве легких животных, получавших облучение ЭМИ, составил 85% и был ниже, чем в контрольной III группе. Высевы из легочной ткани мышей, получавших лечение изониазидом без ЭМИ, и в группе с сочетанием с ЭМИ, показали отсутствие или сниженную жизнеспособность 65 микобактерий. Индексы высеваемости были максимальными в контрольной III группе и составили 2,6 и 2,8 баллов. В IV группе мышей индексы высеваемости были ниже в 1,9 и 1,6 раза. Результаты микробиологических исследований представлены в таблице 12. Таблица 12 Высеваемость МБТ из органов белых мышей. Группы мышей N = 60 Легкие %положительных посевов Селезенка Индекс вы- %положительн севаемости ых посевов Индекс высеваемости I здоровые N=10 (контроль) 0 0 0 0 II здоровые N= 10 получавшие ЭМИ 0 0 0 0 III зараженные N= 10 не леченые 100 2,6 100 2,8 IV зараженные N= 10 Леченые ЭМИ 85 1,4 80 1,8 V зараженные N= 10 леч. изониазидом 15 0,6 20 0,5 VI зараженные леч изониазид+ЭМИ N=10 0 0 0 0 Во втором опыте использованы 48 половозрелых особей морских свинок весом 270-300 г. Методика заражения и лечения представлена в главе 2. В опыте использовано 3 группы морских свинок. Облучение было начато на следующий день после заражения и проводилось 30 дней. Применение ЭМИ проводили следующим образом : - 1день - 4 раза с интервалом 6 часов; 2 день - 3 раза с интервалом 8 часов; с 3 и по 7 день - двукратно с интервалом 12 часов; с 8 дня и до конца терапии - однократно. Аппарат применяли индивидуально для каждого животного. По 66 окончании опыта животные забивались, паренхиматозные органы подвергались макроскопическому и микробиологическому исследованию. При макроскопическом изучении паренхиматозных органов не леченых свинок (контрольная группа №1) через 30 дней после заражения были обнаружены признаки туберкулезной инфекции. В легких определялось большое количество серых, хорошо выраженных очагов, у части животных - крупных некротических очагов. Печень и селезенка были увеличены в 2,0 - 2,5 раза, в них обнаружены множественные туберкулезные очаги, что со ставило 2,8 балла. Макроскопическая картина внутренних органов животных, получавших лечение, отличалась от контрольной группы. В легких морских свинок опытной группы № 2, получавших облучение ЭМИ, определялись единичные некрупные серые очаги, в печени и селезенке множественные, мелкие туберкулезные очаги, в баллах 1,5. У животных группы № 3, получавших сочетанное лечение с облучением ЭМИ, туберкулезные изменения были выражены слабо, составили 0,5 балла. Данные макроскопических исследований представлены в таблице 13. Таблица 13 Данные макроскопических исследований у морских свинок. Группы морских свинок N = 48 I зараженные, N = 15 Среднее изменение веса свинок (г) 20,5 Средний вес легких (г) Индекс поражения легких 4,6 ± 0,2 2,8 56 3,4 + 0,2 1,5 61,2 3,2 ± 0,4 0,5 (контроль) II зараженные, N = 15 получавшие ЭМИ III зараженные, N = 15 леченые изониазидом и ЭМИ 67 Результаты микроскопии практически подтвердили результаты макроскопических исследований. Количество микобактерий в мазках из легких свинок II и III групп было снижено в 1,9 - 2,3 раза по сравнению с контрольной группой животных. Данные микробиологических исследований представлены в таблице 14. Таблица 14 Высеваемость МБТ из органов морских свинок Группы свинок морских Легкие I контроль N=15 Селезенка %положитель Индекс ных посевов высеваемости МБТ %положитель Индекс высеных посевов ваемости МБТ 100 2,6 100 2,8 зараженные 2 зараженные N=15 100 1,2 100 2 леченые ЭМИ 3 зараженные N=15 0 0 0 0 леч.ЭМИ+изониазид Индекс высеваемости: от 1 до 10 колоний - 1 балл; от 11 до 30 колоний - 2 балла; от 31 до 100 колоний - 3 балла; сплошной рост - 4 балла. Посевы гомогенатов паренхиматозных органов животных контрольной группы и получавших только ЭМИ в 100% случаев дали положительный результат, однако индексы высеваемости из легких и селезенки были в 2,2 и 1,4 раза меньше, чем в контроле. В то время как при сочетанном лечении ЭМИ и изониазидом МБТ не высевались. Изменение индексов поражения легких и селезенки в опытной и контрольной группах представлено в таблице 15. Из приведенных данных видно, что у морских свинок опытной группы № 2 селезеночный индекс был в 3,9 раз меньше, а легочный в 1,3 раза меньше, чем у животных контрольной группы, что подтверждает данные макроскопических и микробиологических исследований. 68 Таблица 15 Изменение индексов поражения у морских свинок. Индексы по- Опытная группа № 2 Контрольная группа № 1 ражения Кол-во (М±т) Кол-во (М±т) Селезеночный 15 0,0011 ±0,0002 15 0,0043 ± 0,0008 15 0,0012 ±0,0001 15 0,0044 ±0,0009 Р < 0,05 Легочный 15 0,009 ± 0,0006 15 0,0113 ±0,001 15 0,010 ±0,0023 15 0,0113 ±0,001 Р < 0,05 Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что применение ЭМИ не влияло на состояние лабораторных животных (поведение, потребление корма, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек и т. д.). При сочетании применения ЭМИ и ПТП снижается активность проявления специфических поражений в 1,9 - 2,4 раза. Сочетанное использование ЭМИ с изониазидом повышает химиотерапевтическую активность препарата. 4.2 Бактериостатическая активность крови и легочной ткани у экспериментальных животных при применении ЭМИ. Методом вертикальной диффузии определяли БАК крови и легочной ткани морских свинок после введения изониазида через 1,5 часа, 3 часа и 6 часов. Изониазид ввели per os из расчета 10 мг/кг веса животного. В опыте использовано по три морские свинки в опытной и контрольной группах. Животные опытной группы получали воздействие ЭМИ по 5 сеансов после приема изониазида. После эвтаназии животных с интервалом в 1,5 часа, 3 часа и 6 часов от времени получения изониазида, исследуемые образцы плазмы крови по 0,3 мл помещали в 4 пробирки с питательной средой «Новая», засеянные тест-штаммом M.H37Rv, как описано в методике. По 4 образца исследуемой ткани легкого брали в навесках с точностью до 1 мг. 69 Навески готовили под бактерицидной лампой на расстоянии 20 см от образцов, помещали на дно 4 пробирок для вертикальной диффузии и вносили по 1-2 капли фосфатного буфера для улучшения диффузии препаратов в питательную среду. В качестве контроля использовали пробирки с разведениями изониазида 0,125 мкг/мл, 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл и пробирки с фосфатным буфером. Все пробирки инкубировали при 37 градусах С. Результаты снимали на 10 сутки. Значения зон задержки роста в пробирках с кратными разведениями изониазида использовали для построения стандартной номограммы. При замере зон задержки роста в опытных пробирках по данным полученной номограммы определяли бактериостатическую активность крови и легочной ткани животных опытной и контрольной групп. В результате установлено, что через 1,5 часа после получения изониазида БАК крови животных контрольной и опытной групп составляла 3,7 +\- 0,24 мкг/мл, а в легочной ткани - 3,5 +\- 0,31 мкг/г. Через 3 часа в легочной ткани концентрация составляла 7 мкг/г, а через 6 часов 2,8 мкг/г. Таким образом, применение ЭМИ не влияет на бактериостатическую активность крови и легочной ткани морских свинок после однократного введения изониазида. Резюме. Применение ЭМИ у экспериментальных животных (белых мышей и морских свинок) снижает активность проявления туберкулезной инфекции и высеваемость МБТ из тканей легких и селезенки. Сочетание применения ЭМИ с изониазидом обладает синергидным действием в отношении МБТ. 70 Глава 5 ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ПРИ СОВРЕМЕННОЙ ХИМИОТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ. 5.1 Клинико-лабораторная характеристика больных групп наблюдения. В клиническое исследование включено 115 больных с впервые выявленным туберкулезом легких, находившихся на стационарном лечении в терапевтическом отделении Свердловского Областного научно- практического объединения «Фтизиопульмонология», СОПД, г. Екатеринбурга. В основную группу включено 72 человека, которым проведена комплексная химиотерапия в сочетании с воздействием электромагнитного излучения низкой степени интенсивности по разработанной схеме. В контрольной группе было 43 пациента, получавших туберкулостатические препараты в таких же дозах и сочетаниях, но без применения ЭМИ. Кратность и длительность облучения больных аппаратом «ФтизиоБиофон» соответствовала разработанной нами схеме: - 1день - 4 раза с интервалом 6 часов; 2 день - 3 раза с интервалом 8 часов; с 3 и по 7 день двукратно с интервалом 12 часов; с 8 дня и до конца терапии - однократно. Всем больным в доступной форме излагалась суть метода комплексной терапии с применением ЭМИ. Облучение проводилось индивидуально для каждого больного с учетом места положения и распространенности патологического очага в легочной ткани по данным рентгенологического обследования. Для этого использовалась схема проекции сегментов и долей легких на стенки грудной клетки и определялась зона оптимального воздействия излучения аппарата. В основу положен принцип маятникообразного движения аппаратом в течение времени проведения одного сеанса в зоне проекции патологического очага. Количество сеансов в каждом облучении равнялось десяти. В основной группе мужчин - 75% (n = 54), женщин 25% (n = 18). В группе сравнения - мужчин 74,4% (n = 32), женщин 25,6% (n = 11). 71 Возрастная структура больных представлена в таблице 16. Таблица 16 Характеристика больных групп наблюдения по возрасту Группы наблюдения 21-30 лет 31-40 лет 41-50 лет Абс.число % Абс.числ % Абс.число % 8 18,6±5,9 о 27 62,8±7,4 8 18,6±5,9 12 16,7±4,4 41 56,9±5,8 19 26,4±5,2 20 17,4±3,5 68 59,1+4,6 27 23,5±3,9 Контрольная N = 43 Основная N = 72 Итого больных N=115 Критерий достоверности (Р > 0,05) Из данных таблицы следует, что большинство больных (59,1%) относится к категории 3 1 - 4 0 лет как в основной группе (56,9 %), так и в контрольной (62,8%). По клиническим формам туберкулеза больные групп наблюдения распределились следующим образом. Очаговый туберкулез легких зарегистрирован в 22,6 % случаев, инфильтративный в 47,8 % случаев, 29,6% больных болели диссеминированным туберкулезом легких (таблица 17). В основной группе наблюдения наибольшее количество больных (47,2 %) с инфильтративным туберкулезом легких. На втором месте по численности находились больные с диссеминированным туберкулезом — 30,6 %. В контрольной группе соответственно у 48,8% больных инфильтративный туберкулез и диссеминированный - у 27,9 %. 72 Таблица 17 Характеристика больных групп наблюдения по клиническим формам туберкулеза. Группы наблюдения Контрольная Очаговый Инфильтративный Диссеминированный Абс.число % Абс.число % Абс.число % 10 23,3±6,5 21 48,8±7,6 12 27,9±6,8 16 22,2±4,9 34 47,2±5,9 22 30,6±5,4 26 22,6±3,9 55 47,8±4,7 34 29,6±4,3 N = 43 Основная N = 72 Итого больных N=115 Критерий достоверности (Р > 0,05) Одним из основных критериев тяжести туберкулезного процесса является деструкция легочной ткани и бактериовыделение. Характеристика больных по наличию деструкции легочной ткани представлена в таблице 18. Из данных таблицы следует, что в основной группе наблюдения 33,3 % больных имели полости деструкции в легочной ткани, а в контрольной группе 30,2 % соответственно. Материал для бактериологического исследования на выявление микобактерий туберкулеза у больных групп наблюдения: - мокрота (30%), секрет бронхов после применения раздражающих ингаляций (65%), промывные воды бронхов (5%). Методы бактериоскопического и микробиологического выявления микобактерий туберкулеза изложены в главе 2. Всего выполнено 1840 микробиологических исследований. Выделены 43 культуры микобактерий, проведено типирование и определение спектра и степени лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам методом абсолютных концентраций в соответствии с установленными критериями как изложено в главе 2. 73 Таблица 18 Характеристика больных групп наблюдения по наличию деструкции легочной ткани. Группы Очаговый Наблюдения Абс. ^числ 1 о Инфильтративный Диссеминированн % Абс. % 2,3±2,2 число 7 16,3±5,6 Абс. ый % Число 5 11,6±4,9 Всего больных с деструкцией в контрольной группе 13 30,2 ± 7,0 Основная 9 12,5±3,9 Всего больных с деструкцией в основной группе 24 33,3 ± 5,6 Итого больных 14 12,2±3,1 37 32,2 ±4,4 Контрольная N = 43 3 4,2±2,4 12 16,7±4,4 N = 72 4 3,5±1,7 19 16,5+3,5 N=115 Всего больных с деструкцией в группах наблюдения Критерий достоверности Характеристика (Р >0,05) больных групп наблюдения по наличию бактериовыделения представлена в таблице 19, из данных таблицы следует, что в основной группе наблюдения у 38,9 ± 5,8 % больных выявлено наличие МБТ в мокроте и у 34,9 ± 7,3 % в контрольной группе. При этом наибольшее количество больных с наличием бактериовыделения отмечено при инфильтративном туберкулезе, соответственно 22,5% и 20,5%. В основной группе в 11,1 %, а в контрольной в 11,6 % случаев отмечено массивное бактериовыделение по результатам микробиологического исследования. Таким образом, сопоставление возрастно-половых и клинических характеристик основной и контрольной групп показало их однородность по анализируемым параметрам. 74 Таблица 19 Характеристика больных групп наблюдения по наличию бактериовыделения. Группы наблюдений Очаговый Абс. число % 0 0 Больные основной Инфильтративный Диссеминированны й Абс. число % Абс. число % 16 группы с бактериовы- 22,5± 12 16,9± 4,9 4,4 делением N = 72 Всего больных с бактериовыделением в основной группе 28 чел.(38,9±5,8%) Больные контрольной группы 0 0 9 с 20,5± 6 13,6± 6,2 5,2 бактериовыделение N = 43 больных с бактериовыделением в этой группе 15 чел. (34,9± 7,3 %) Всего Итого больных N=115 0 0 25 21,9± 18 15,7± 3,9 3,4 Всего больных с бактериовыделением в группах 43 чел. (37,4±4,5%) Критерий достоверности (Р >0,05) 5.2 Динамика клинико-рентгенологических изменений у больных при сочетании химиотерапии и электромагнитного излучения. Эффективность лечения больных с впервые выявленным туберкулезом органов дыхания оценивалась на основании комплекса признаков: быстроты исчезновения симптомов интоксикации, рентгенологической динамике легочных изменений, сроков прекращения бактериовыделения, лабораторным показателям крови и иммунологической реактивности. Важным показателем тяжести туберкулезного процесса является наличие симптомов общей воспалительной реакции. В качестве лабораторных 75 критериев отобраны показатели: количество лейкоцитов и лимфоцитов, скорость оседания эритроцитов. Количество лейкоцитов в крови от 4,0 до 7,0х10 9/л расценивалось как нормальное; от 7,0 до 9,0><109/л оценивалось как умеренное повышение; более 9,0x109 /л - как значительное повышение. Содержание лимфоцитов в периферической крови от 27 до 30 % считалось нормальным. Снижение до 22% расценивалось как умеренная лимфопения, а при содержании менее 22% - значительная лимфопения. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) до 12 мм/час считалась нормальной, до 25 мм/час расценивалась как умеренно ускоренная, более 25 мм/час - как выраженное повышение этого показателя. По степени выраженности лабораторных критериев симптомов общей воспалительной реакции больных опытной и контрольной групп условно разделили на три группы. К первой группе отнесены больные с удовлетворительным общим состоянием. Вторую группу составили больные, имевшие слабо выраженные симптомы общей воспалительной реакции. К этим симптомам отнесены жалобы на легкое недомогание, потливость, слабость и периодический субфебрилитет, а из лабораторных показателей - увеличение СОЭ до 25 мм\час и лейкоцитоз до 8,0х109/л. Третью группу составили больные с выраженными проявлениям общей воспалительной реакции. В эту группу вошли пациенты, имевшие фебрильную температуру, лейкоцитоз более 8,0x109/л и увеличение (более 25 мм/час) СОЭ. Динамика симптомов общей воспалительной реакции с учетом лабораторных критериев у больных легочным туберкулезом основной и контрольной групп отражена в таблице 20. Под влиянием комплексного лечения с включением воздействия ЭМИ у больных основной группы наблюдения уже через один месяц число больных, у которых отсутствовали симптомы интоксикации, возросло с 18,1 % до 86,1 %, через два месяца они составили 93,1%. 76 Таблица 20 Динамика симптомов интоксикации у больных легочным туберкулезом на фоне лечения Через 2 месяца Через 1 мес. после начала лечения отсутствуют До начала лечения Через 2 месяца Через 1 мес. после начала лечения Симптомы интоксикации слабо выраженные До начала лечения Через 2 месяца значительно выраженные Через 1 мес. после начала лечения Всего N115 До начала лечения Группы наблюдения абс. Основная группа Контрольная группа Критерий достоверности 72 43 % абс. % абс. % абс. % абс. % абс. % абс. % абс. % абс. % 5,6 58,3 8,3 6,9 18,1 86,1 93,1 23,6 17 ±5,0 4 ±2,7 0 0,0 42 ±5,8 6 ±3,3 5 ±3,0 13 ± 62 ±4,1 67 ±2,9 6 14,0 ±5,3 5 11,6 ±4,9 0 0,0 29 67,4 34,9 ±7,2 15 ±7,3 Р<0,05 7 16,3 ±5,6 8 18,6 ±5,9 23 53,5 ±7,6 Р<0,05 83,7 36 ±5,6 77 Слабо выраженные симптомы интоксикации до начала лечения отмечались у 58,3 % больных, после месячной терапии у 8,3 %, через два месяца они регистрировались у 6,9 % больных. За первый месяц терапии удельный вес больных с выраженными симптомами интоксикации (23,6%) уменьшился в 4,2 раза и составил 5,6%. К концу второго месяца лечения такие проявления у больных основной группы не наблюдались. У больных контрольной группы через один месяц противотуберкулезной терапии симптомы интоксикации отсутствовали лишь у 53,5% больных. Слабо выраженные симптомы интоксикации отмечались у 34,9% больных, значительно выраженные симптомы у 11,6% пациентов. После двух месячного лечения у больных данной группы симптомы интоксикации отсутствовали лишь в 83,7 % случаев. Сравнительный анализ данных, свидетельствующих о выраженности симптомов интоксикации, показал, что в основной группе наблюдения, значительно выраженные признаки интоксикации диагностировались в 1,7 раза чаще, чем в контрольной. Через месяц после начала лечения, значительно выраженные проявления интоксикации сохранялись лишь у 5,6 % больных основной группы, в то время как у больных контрольной группы в 11,6% случаев. Наибольшее количество больных в обеих группах наблюдения имели слабо выраженные проявления интоксикации, а удельный вес их внутри каждой группы был почти равным (58,3 % и 67,4 %). Через месяц после начала комплексной терапии это соотношение достоверно изменилось. В группе больных, получавших комплексную противотуберкулезную терапию в сочетании с ЭМИ, доля лиц со слабо выраженными симптомами интоксикации уменьшилась с 58,3 % до 8,3 %, а в контрольной группе с 67,4 % до 34,9 %. Из приведенных данных следует, что в группе больных, получавших ЭМИ, более быстрая и полная регрессия симптомов интоксикации 78 отмечается на начальном этапе противотуберкулезной терапии. Так, через два месяца от начала лечения полностью удалось купировать симптомы интоксикации у 93,1 % больных основной группы и лишь у 83,7 % в контрольной. К окончанию стационарного курса лечения разницы по данному признаку между группами не наблюдалось. Динамика рентгенологических изменений представлена в таблице 21. Таблица 21 Динамика рентгенологических изменений у больных туберкулезом легких при сочетании химиотерапии и ЭМИ Группы Наблюдений 1 мес 2 мес 3 мес 4 мес Выраж. Умерен. Выраж. Умерен Выраж. Умерен. Выраж. Умерен. аб. % Аб. % Аб. % аб. % Аб. % аб. % Аб. % аб. % Основная N = 72 ч 54, 33 ч 45, 28 ч 38, 44 ч 61, 6ч 8,3 23 ч 32 39 2 8 9 1 ±3, 1 9 ±7, 9 9 ±7, 2 8 ±7, 5 5 6 0 5ч 6,9 0 ±2, 6 14 9 ±5, ±5, Контрольная 25 58, 18 41, 19 44, 24 55, 10 23, 33 76, ±5, ±5, ±5, ±5, 3 5 N = 43 Разница достоверна 0ч 0 8 3 7 8 Р<0,05 Р<0,05 ±7, ±6, ±6, 6 5 3 5 При анализе рентгенологической динамики туберкулезного процесса в легких выявлено, что выраженные и умеренные очаговые и инфильтративные изменения в легких к концу первого месяца составляли соответственно 54,2 % и 45,8 % у больных основной группы. В контрольной группе эти показатели равнялись 58,1% и 41,9%. К концу второго месяца эти изменения составляли в основной группе 38,9 % и 61,1 %, а в контрольной -44,2 % и 55,8 %. В третьем месяце - 8,3% и 32 % в основной группе и 23,3% и 76,7 % в контрольной группе. Таким образом, к концу 4 месяца умеренные изменения остались только у 6,9 % больных основной группы, получавшие лечение ЭМИ, а в контрольной группе 79 таких больных осталось в 2 раза больше (14 %). Эти данные свидетельствуют о более быстрой положительной рентгенологической динамике туберкулезного процесса в легких под влиянием сочетанного лечения с применением ЭМИ. По закрытию полостей распада статистически достоверных различий в сравниваемых группах при наблюдении в течение четырех месяцев не выявлено. 5.3 Бактериовыделение у больных легочным туберкулезом при сочетании химиотерапии и электромагнитного излучения. Данные микробиологических исследований, выполненных в ходе работы, по обнаружению микобактерий туберкулеза методом посева и бактериоскопии представлены в таблице 22. Таблица 22 Динамика прекращения бактериовыделения у больных туберкулезом легких при сочетании химиотерапии и ЭМИ Группы 1 мес 2 мес гериовыдел Массив. бакгелей Аб.ч % иОсновная 8 N = 72 Контрольн ая 5 11 3 мес Умерен. Массив. Умерен. Массив. Умерен. Аб.ч % аб.ч % Аб. % Аб.ч % аб.ч % 20 27 1 1,4 ч 5 ±4,3 ±4,1 11,6 ±5,8 ±5,5 11 10 23±6 2 4,7 ±7,4 ,8 ±6,1 N = 43 Критерий достоверности 5 6,9 0 0 0 0 0 0 2 4,7 ±5,9 Р<0,05 Как видно из таблицы 22 у больных в основной группе наблюдения в первый месяц лечения массивное бактериовыделение прекращено в 7,8 раза, а умеренное в 3,9 раза. В контрольной группе соответственно в 2,3 и 2,1 раза. К концу 3 месяца терапии в основной группе больных у всех прекращено бактериовыделение, а в контрольной группе осталось 4,7 % 80 бактериовыделителей. 81 5.4 Изучение бактериостатической активности крови больных туберкулезом легких при сочетании лечения противотуберкулезными препаратами и ЭМИ. Проведено изучение бактериостатической активности крови больных туберкулезом легких при сочетании лечения противотуберкулезными препаратами и ЭМИ. Через 3 часа после приема препарата стерильно шприцем брали кровь из локтевой вены в количестве 5-6 мл. Затем проводили облучение больных ЭМИ, после чего сразу же вновь забирали кровь. Полученные образцы центрифугировали при 1500 об\мин в течение 3 минут. Сыворотку использовали для дальнейших исследований. Для определения БАК использовали бактериологический метод вертикальной диффузии по предложенной нами методике. В качестве тест-микроба применяли стандартный международный штамм M.H37Rv. Взвесь готовили в концентрации, равной 10 ед. по стандарту мутности ПСИ, затем разводили дистиллированной водой 1:10. Полученную взвесь наносили на поверхность питательной среды «Новая» в количестве 0,1 мл. Пробирки в горизонтальном положении инкубировали 48 часов в термостате при 37°С, после чего на незанятую средой стенку пробирки закапывали по 0,5 мл сыворотки крови больных. К каждому исследованию ставили контроль с разведениями препаратов (стрептомицин - 0,5; 2,0; 5,0; 10,0 мкг\мл; изониазид - 0,5; 1,0 мкг\мл). Пробирки с исследуемыми образцами и контролем инкубировали строго вертикально в термостате при температуре 37°С, а результаты учитывали на 21 день после посева. Туберкулостатические концентрации препаратов определяли по высоте стерильной зоны над уровнем сыворотки. Сравнение полученных зон задержки роста M.H37Rv проводили со стандартными эталонами для определения уровня противотуберкулезных препаратов. Средние величины зон задержки роста M.H37Rv для изониазида составили: до применения ЭМИ - 50,2 ± 1,2 мм, а после применения ЭМИ 51,4 ± 1,8 мм, что соответствовало концентрациям изониазида в сыворотке 82 крови: до применения ЭМИ - 2,3 мкг\мл, а после применения ЭМИ - 2,7 мкг\мл. Средние величины зон задержки роста M.H37Rv для стрептомицина составили: до применения ЭМИ - 28,0 ± 0,8 мм, после применения ЭМИ 29,5 ±1,2 мм. Это соответствовало концентрациям стрептомицина в сыворотке крови: до применения ЭМИ - 17,5 мкг\мл, после применения ЭМИ 20,0 мкг\мл Таким образом, применение ЭМИ повышает бактериостатическую активность крови больных туберкулезом легких в сочетании с изониазидом и стрептомицином. Резюме Химиотерапия в сочетании с ЭМИ является эффективным элементом комплексного лечения больных туберкулезом органов дыхания. При сравнительной оценке установлено, что использование при лечении электромагнитного излучения приводит к более быстрому купированию симптомов интоксикации и рассасыванию инфильтративно-воспалительных изменений в легочной ткани, более раннему прекращению бактериовыделения. При этом повышается бактериостатическая активность крови во время применения ЭМИ. 83 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Эпидемическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации характеризуется отрицательной динамикой показателей заболеваемости и смертности с одновременным снижением эффективности терапии (М.И. Перельман, 2002; Ю.Н. Левашев, 2003). Современные схемы лечения больных туберкулезом предлагают применение комплекса из 4, 5 и даже 6 противотуберкулезных препаратов и направлены на подавление размножения возбудителя заболевания (А.Г. Хоменко, 1999; В.Ю. Мишин, СЕ. и др., 2001; М. Iseman, 1993; К. Laserson, L.E. Osorio, H. Hernandez, 1998). Однако их применение ограничивается развитием побочных токсикоаллергических реакций на основные противотуберкулезные препараты (Л.А. Иванова, 1995; В.И. Чуканов и др., 2000). Кроме того, снижение общей и специфической резистентности макроорганизма на фоне лечения часто сопровождается появлением устойчивых форм микобактерий, что значительно снижает результаты терапии (Н.М. Рудой, 1993; Ю.М. Репин и соавт., 2001; Б.И. Вишневский 2003; М Goble et al., 1993; A. Kochi; 1994; L.B. Reichman, 1997). В целях повышения эффективности химиотерапии применяются различные патогенетические средства, в том числе и физиотерапевтические методы (В.Д. Ломаченков и соавт., 1989; М.И. Перельман, 1990; А.Г. Хоменко, Л.Н. Новикова, 1995). Согласно данным литературы использование физических факторов в комплексном лечении туберкулеза позволяет значительно расширить выбор этиопатогенетических средств и уменьшить лекарственную нагрузку на организм больного с улучшением переносимости химиотерапии. Механизм лечебного действия большинства физических факторов, используемых во фтизиатрии, проявляется в улучшении трофики тканей, развитии дифференцированных тканевых реакций, стимуляции окислительно-восстановительных процессов, образовании биологически активных веществ (Т.И. Еремичева, 1968; В.Г. Ясногородская, 1992; Л.М. Клячкин и соавт., 1997). Однако проблема сокращения сроков терапии и уменьшения лекарственной нагрузки на организм боль- 84 ного остается актуальной (Е.С. Северин, А.Г. Чучалин, 2000). В связи с этим исследована туберкулостатическая активность электромагнитного излучения низкой интенсивности (инфракрасной части оптического диапазона) в сочетании с противотуберкулезными препаратами в эксперименте и клинике у больных туберкулезом легких. Для решения этой задачи в опытах in vitro и in vivo и при лечении впервые выявленных больных туберкулезом легких, находившихся в стационарном отделении Свердловского Областного научно-практического объединения «Фтизиопульмонология» (СОГУЗ «ПТД»), применяли аппарат медицинского назначения «Биофон». Аппарат содержит источник электромагнитных излучений в инфракрасной части оптического диапазона нетепловой интенсивности с длиной волны 0,8-30 мкм с мощностью непрерывного режима излучения не более 10-23 Вт/Гц*м2. Доказана терапевтическая эффективность и медико-биологическая безопасность применения этого излучения для лечения урогенитальных инфекций в исследованиях Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии в опытах на культурах тканей, на экспериментальных животных и в клинике (Е.Б. Копытов, А.Н. Байдусь, 1999). Приборы этой серии успешно используются в клинической практике для лечения хламидиозной, уреаплазмозной, стафилококковой и др. инфекций. Однако применение этого вида излучения при лечении туберкулеза исследовано недостаточно. До изучения туберкулостатической активности электромагнитного излучения низкой интенсивности (инфракрасной части оптического диапазона) и сочетанного действия этого вида излучения и противотуберкулезных препаратов в клинике и у экспериментальных животных возникла необходимость определить в опытах in vitro воздействие излучения на ростовые свойства различных штаммов микобактерий, влияние излучения на антибактериальную активность основных противотуберкулезных препаратов, воздействие излучения на характер формирования устойчивости у микобактерий туберкулеза и изменение под воздействием излучения 85 лекарственной чувствительности и степени резистентности у культур микобактерий туберкулеза, выделенных от больных. В связи с этим на первом этапе данного исследования изучено в опытах in vitro воздействие электромагнитного излучения на ростовые свойства 5 лабораторных тестштаммов. В опытах in vitro использовались лабораторные тест-штаммы микобактерий, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (ГИСК), M.H37RV и М.Нз7К.а, M.Bovis-Bovinus-8, входящие в Mycobacterium tuberculosis complex, а также нетуберкулезные микобактерий (НТМБ) — основной возбудитель микобактериоза M.avium и сапрофит M.smegmatis. В результате выполненных 1089 пробирочных опытов выявлена задержка скорости роста колоний вирулентных штаммов M.H37RV, M. Bovis-Bovinus-8 и M.Avium во всех сериях опытов независимо от кратности и длительности облучения. Замедление скорости роста составило: у M.H37RV в среднем на 25%; у М. Bovis-Bovinus-8 на 14,5 %; у M.Avium на 40 % по сравнению с контролем. Выход микробной массы уменьшился соответственно у M.H37RV от 35,6% до 38,8%; у М. BovisBovinus-8 от 42,3% до 51,1%; у M.Avium от 33% до 38%. На следующем этапе исследования изучено воздействие ЭМИ на ростовые свойства культур МБТ, выделенных от больных. Взяты культуры с различной степенью устойчивости к противотуберкулезным препаратам. Выполнено 513 пробирочных опытов. В результате установлено замедление скорости роста колоний в среднем на 28,8% и уменьшение выхода микробной массы в среднем на 31,6% во всех сериях опытов независимо от степени устойчивости культур МБТ и от микробной нагрузки. Таким образом, электромагнитное излучение низкой интенсивности оказывает угнетающее воздействие на ростовые свойства вирулентных лабораторных штаммов микобактерий и культур микобактерий туберкулеза, выделенных от больных. Однако в отличие от вирулентных штаммов у авирулентных микобактерии наблюдалось напротив ускорение роста колоний у M.H37Ra 86 от 14% до 17%; у M.Smegmatis от 64,4% до 68,5%, и увеличение выхода микробной массы соответственно у штамма M.H37Ra от 25,6% до 32%, у M.Smegmatis от 64,5 % до 68,5%. Таким образом, установлено, что электромагнитное излучение низкой интенсивности стимулирует развитие авирулентных лабораторных штаммов микобактерии. В результате выявлена прямая зависимость от степени вирулентности туберкулостатического действия электромагнитного излучения на рост лабораторных штаммов микобактерии при культивировании их на питательных средах. В этой же серии опытов установлено, что выраженность ингибирующего эффекта электромагнитного излучения определяется фазой размножения микобактерии, а также удаленностью источника излучения от объекта воздействия. Показано, что сокращение расстояния между источником излучения и объектом воздействия приводит к усилению туберкулостатической активности ЭМИ. Более выражено действие электромагнитного излучения низкой интенсивности на микобактерии туберкулеза в условиях начального роста и адаптации микроорганизмов при культивировании их на питательных средах. Эти данные положены в основу разработанной инструкции применения электромагнитного излучения низкой степени интенсивности аппарата «Биофон». В исследованиях Государственного научного центра прикладной микробиологии и научно-производственного предприятия «Бионике» доказано, что под влиянием облучения аппаратов «Биофон» изменяется электростатический потенциал на клеточных оболочках микроорганизмов (Е.Б. Копытов, А.Н. Байдусь, 1999). Отмечено наиболее значительное воздействие этого излучения на барьерную функцию цитоплазматических мембран микробной клетки. По данным С.А. Павловича длительное воздействие магнитного поля влияет на чувствительность микробных клеток к антибиотическим препаратам. В связи с этими фактами изучено сочетанное 87 действие электромагнитного излучения низкой интенсивности и противотуберкулезных препаратов на микобактерии туберкулеза. С помощью метода вертикальной диффузии в опытах in vitro изучено влияние электромагнитного излучения на антибактериальную активность основных противотуберкулезных препаратов. Использовались: - изониазид, стрептомицин, рифампицин, канамицин, этамбутол, они занимают основное место в терапии туберкулеза. Туберкулостатический эффект определяли по величине зон задержек роста. В результате выполненных 108 исследований установлено, что зоны задержки роста при применении электромагнитного излучения увеличились от 4,4% в пробирках с разведениями рифампицина и до 21,1% в пробирках с разведениями стрептомицина. Таким образом, определен синергизм туберкулостатического действия противотуберкулезных препаратов и электромагнитного излучения на микобактерии туберкулеза в опытах in vitro. Трудности современной химиотерапии туберкулеза по данным литературы во многом связаны с увеличением роли микобактерии с резистентностью к основным противотуберкулезным препаратам (А.Г. Хоменко, В.И. Чуканов, 1980; М.С. Raviglion, 1996). В связи с этим в следующей воздействием серии опытов in vitro электромагнитного исследовано излучения изменение под лекарственной чувствительности и степени резистентности у культур МБТ, выделенных от больных. Было исследовано 170 культур МБТ с различной степенью устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. Из 96 культур в 72,9 % случаев не выявлены изменения начальной степени устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. На высокую степень устойчивости культур МБТ к противотуберкулезным препаратам электромагнитное излучение практически не влияло. У 94,6% культур под влиянием ЭМИ высокая степень устойчивости к противотуберкулезным препаратам не изменилась. 88 Для определения туберкулостатической активности электромагнитного излучения в эксперименте на лабораторных животных и при современной химиотерапии необходимость в больных разработке туберкулезом новой методики. легких Мы возникла использовали микробиологический способ оценки эффективного бактериостатического действия на МБТ противотуберкулезных препаратов (ПТП) методом вертикальной диффузии. Данный метод основан на том, что величины зон задержки роста МБТ прямо пропорциональны туберкулостатической активности исследуемого образца. Метод включает ведение на дно пробирок с питательной средой, предварительно засеянных взвесью стандартного тест-штамма микобактерий, исследуемых образцов с последующей оценкой величин зон задержки роста после инкубации этих пробирок в термостате. При выполнении этого метода для получения сравнимых результатов в достаточно короткие сроки необходимо соблюдение стандартных условий. Во-первых, использовать оптимального состава питательную среду с высокими диффузионными и питательными свойствами, а также с постоянной плотностью. Во-вторых, применять лабораторный тест-штамм микобактерий туберкулеза с постоянной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам и в стандартной микробной нагрузке на определенный объем питательной среды. В разработанной методике мы использовали среду на желтковой основе «Новая». Она обладает высокими питательными свойствами, что позволяет получить хороший рост (густой газон) лабораторного штамма на 6-7 сутки. Кроме того, использование для культивирования микобактерий среды на желтковой основе улучшает диффузию препарата в питательную среду и тем самым повышает точность измерения. Нами для упрощения и удешевления метода предложено использовать принцип объемных соотношений в процессе приготовления пробирок со средой, что не требует применения дорогостоящих специальных пробирок для вертикальной диффузии. В качестве тест-штамма в предложенной методике взят между- 89 народный лабораторный штамм M.H37Rv. Нами в качестве стандартного противотуберкулезного препарата использован изониазид, как самый активный в отношении МБТ противотуберкулезный препарат, а оценка туберкулостатической активности проводится в единицах действия (ЕД), равных минимальной туберкулостатической активности изониазида 0,12мкг\мл. При этом для оценки полученных данных предложено использовать стандартную номограмму активности изониазида. В современных условиях стандартное лечение больных туберкулезом на интенсивном этапе включает применение комплекса из 4-5 противотуберкулезных препаратов. Бактериостатическая активность крови (БАК) является косвенным показателем суммарного действия химиопрепаратов и может служить критерием оценки их эффективного применения в сочетании с электромагнитным излучением. Таким образом, разработанная методика позволяет определить туберкулостатическую активность электромагнитного излучения в сочетании с применением комплекса противотуберкулезных препаратов у конкретного больного на любом этапе современной химиотерапии. Это дает возможность провести необходимую коррекцию схемы лечения, что способствует профилактике развития лекарственной резистентности у микобактерий туберкулеза. Для определения влияния электромагнитного излучения низкой интенсивности (инфракрасной части оптического диапазона) на течение туберкулезной инфекции при химиотерапии были выполнены исследования на экспериментальных животных. В этом исследовании для опытов in vivo взяты две группы лабораторных животных. Морские свинки являются классическим экспериментальным животным для биологических методов исследования при туберкулезе, эти животные реагируют типичным образом на введение микобактерий, а при получении модели туберкулеза уже на 3 сутки МБТ обнаруживаются во внутренних органах и регионарных лимфатических узлах (P.O. Драбкина, 1974). Для целей химиотерапии наиболее удобными экспериментальными животными являются белые мыши 90 (В.Н. Василев, 1971). Согласно рекомендациям литературы был использован для заражения штамм с постоянной вирулентностью M.H37Rv. Оценка результатов лечения проведена по данным макроскопических и микробиологических исследований. В первом опыте было использовано 60 половозрелых самцов белых мышей, разделенных на 6 групп. В результате установлено, что применение электромагнитного излучения снижает активность проявления специфических поражений туберкулезной инфекции у белых мышей. Этот вывод подтвержден увеличением веса мышей в группе, получавшей ЭМИ, снижением веса легких и индекса поражения легочной ткани в этой группе, а также снижением в 1,48 раза индекса количества МБТ при микроскопии. По данным микробиологических исследований снижены % положительных посевов и индексы высеваемости в 1,55 раза из тканей селезенки ив 1,86 раза из тканей легкого. Кроме того, в группе животных, получавших изониазид в сочетании с электромагнитным излучением, методом посева не выявлено наличие микобактерий в тканях легкого и селезенки. Во втором опыте использовано 48 особей морских свинок, распределенных на 3 группы. В этом случае также как и в первом опыте определено снижение специфических проявлений туберкулезной инфекции. Индексы поражения снижены в случае применения ЭМИ в 1,87 раза, а при сочетании с изониазидом в 5,6 раза. При микроскопии препаратов из легочной ткани индексы количества МБТ снижены в 1,9-2,3 раза в группах, получавших лечение. По данным микробиологических исследований посевы гомогенатов паренхиматозных органов животных контрольной группы и получавших только лечение с применением электромагнитного излучения в 100 % случаев дали положительные результаты. Однако индексы высеваемости из тканей легких и селезенки были в 2,2 и 1,4 раза меньше, чем в контроле. Таким образом, в опытах in vivo установлено, что применение электромагнитного излучения низкой интенсивности в 1,9 2,3 раза снижает активность проявления специфических поражений при 91 туберкулезной инфекции и повышает химиотерапевтическую активность изониазида. Были проведены исследования бактериостатической активности крови (БАК) и ткани легкого по разработанной методике. Методом вертикальной диффузии определяли БАК крови и легочной ткани морских свинок после введения изониазида через 1,5 часа, 3 часа и 6 часов. Исследуемые образцы плазмы крови по 0,3 мл помещали в 4 пробирки с питательной средой, засеянные тест-штаммом, как описано в методике. По 4 образца исследуемой ткани легкого брали в навесках с точностью до 1 мг. Навески готовили под бактерицидной лампой на расстоянии 20 см от образцов, помещали на дно 4 пробирок для вертикальной диффузии и вносили по 1-2 капли фосфатного буфера для улучшения диффузии препаратов в питательную среду. Через 1,5 часа после получения изониазида БАК животных контрольной и опытной групп составляла 3,7 +\- 0,24 мкг/мл, а в легочной ткани - 3,5 +\- 0,31 мкг/г. Через 3 часа в легочной ткани концентрация составляла 7 мкг/г, а через 6 часов 2,8 мкг/г. Применение излучения не влияло на бактериостатическую активность крови и ткани легкого морских свинок при получении разовой дозы изониазида по истечении 1,5 и более часов. В клиническое исследование включено 115 больных с впервые выявленным туберкулезом легких, находившихся на стационарном лечении в терапевтическом отделении Свердловского Областного научно- практического объединения «Фтизиопульмонология», СОПД, г. Екатеринбурга. В основную группу включено 72 человека. В этой группе пациентам проводилась комплексная химиотерапия в сочетании с воздействием электромагнитным излучением низкой степени интенсивности по разработанной схеме. В контрольной группе было 43 пациента, они получали туберкулостатические препараты в таких же дозах и сочетаниях, но без применения ЭМИ. Кратность и длительность облучения больных аппаратом «Фтизио-Биофон» соответствовала разработанной нами инструкции: 1день - 4 раза с интервалом 6 часов; 2 день - 3 раза с интервалом 8 часов; с 92 3 и по 7 день - двукратно с интервалом 12 часов; с 8 дня и до конца терапии - однократно. Облучение проводилось индивидуально для каждого больного с учетом места положения и распространенности патологического очага в легочной ткани по данным рентгенологического обследования. Для этого использовалась схема проекции сегментов и долей легких на стенки грудной клетки и определялась зона оптимального воздействия излучения аппарата. В основу был положен принцип маятникообразного движения аппаратом в течение времени проведения одного сеанса в зоне проекции патологического очага. Количество сеансов в каждом облучении равнялось десяти. Эффективность лечения больных с впервые выявленным туберкулезом органов дыхания оценивалась на основании комплекса признаков: быстроты исчезновения симптомов интоксикации, рентгенологической динамике бактериовыделения. легочных В изменений, результате сроков проведенных прекращения исследований установлено, что в основной группе больных более быстрая и полная регрессия симптомов интоксикации отмечается на начальном этапе противотуберкулезной терапии. Кроме того, в этой группе больных отмечена и ранняя положительная рентгенологическая динамика туберкулезного процесса в легких под влиянием сочетанного лечения с применением ЭМИ в сравнении с контрольной группой. По закрытию полостей распада статистически достоверных различий в сравниваемых группах при наблюдении в течение четырех месяцев не выявлено. По данным микробиологических исследований у больных основной группы за первый месяц лечения массивное бактериовыделение прекращено в 7,8 раза, а умеренное в 3,9 раза. В контрольной группе соответственно в 2,3 и 2,1 раза. К концу 3 месяца терапии в основной группе больных у всех прекращено бактериовыделение, а в контрольной группе осталось 4,7 % бактериовыделителей. Проведено изучение бактериостатической активности крови больных туберкулезом легких при сочетании лечения противотуберкулезными пре- 93 паратами и ЭМИ. Через 3 часа после приема препарата стерильно шприцем брали кровь из локтевой вены в количестве 5-6 мл. Затем проводили облучение больных ЭМИ, после чего сразу же вновь забирали кровь. Полученные образцы центрифугировали при 1500 об\мин в течение 3 минут. Сыворотку использовали для дальнейших исследований. Для определения бактериостатической активности крови использовали предложенную методику. Средние величины зон задержки роста микобактерий для изониазида составили: до применения ЭМИ - 50,2 ±1,2 мм, а после применения ЭМИ - 51,4 ± 1,8 мм, что соответствовало концентрациям изониазида в сыворотке крови: до применения ЭМИ - 2,3 мкг/мл, а после применения ЭМИ - 2,7 мкг\мл. Средние величины зон задержки роста микобактерий для стрептомицина составили: до применения ЭМИ - 28,0 ± 0,8 мм, после применения ЭМИ - 29,5 ±1,2 мм. Это соответствовало концентрациям стрептомицина в сыворотке крови: до применения ЭМИ 17,5 мкг\мл, после применения ЭМИ - 20,0 мкг\мл. Таким образом, применение ЭМИ повышает бактериостатическую активность крови больных туберкулезом легких в сочетании с изониазидом и стрептомицином в период применения ЭМИ. В более длительные сроки от применения излучения (6, 9, 12 часов) увеличения бактериостатической активности крови не отмечено. Таким образом, химиотерапия в сочетании с ЭМИ является эффективным элементом комплексного лечения больных туберкулезом органов дыхания. При сравнительной оценке установлено, что использование при лечении электромагнитного излучения низкой степени интенсивности приводит к более быстрому купированию симптомов интоксикации и рассасыванию инфильтративно-воспалительных изменений в легочной ткани. Отмечено прекращение бактериовыделения у больных при комплексной терапии в более ранние сроки. При этом повышается бактериостатическая активность крови больных в период применения облучения. 94 ВЫВОДЫ 1. Электромагнитное излучение низкой интенсивности (инфракрасной части оптического диапазона) оказывает угнетающее воздействие на ростовые свойства вирулентных лабораторных штаммов микобактерий и культур микобактерий туберкулеза, выделенных от больных. 2. Выявлена прямая зависимость задерживающего действия электромагнитного излучения на рост лабораторных штаммов микобактерий от степени их вирулентности при культивировании на питательных средах. 3. Влияние электромагнитного излучения на начальную степень устойчивости у культур микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам выражено слабо. На высокую степень резистентности к противотуберкулезным препаратам культур микобактерий туберкулеза электромагнитное излучение не влияет. 4. Определен синергизм туберкулостатического действия противотуберкулезных препаратов и электромагнитного излучения на микобактерий туберкулеза в опытах in vitro. 5. При сочетанием применении электромагнитного излучения и противотуберкулезных препаратов у экспериментальных животных снижается активность проявления специфических поражений туберкулезной инфекции в среднем в 2,2 раза. 6. Применение в комплексном лечении больных туберкулезом легких электромагнитного излучения низкой степени интенсивности (инфракрасной части оптического диапазона) приводит к более быстрому купированию симптомов интоксикации, рассасыванию инфильтративно- воспалительных изменений в легочной ткани, сокращению сроков бактериовыделения. 90 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для больных повышения туберкулезом эффективности легких комплексной целесообразно терапии применять электромагнитное излучение длиной волны 0,8 -30 мкм. Облучение больных проводится в период основного курса химиотерапии с учетом локализации и распространенности патологического очага в легочной ткани по данным рентгенологического обследования. 2. Рекомендовать определение бактериостатической активности крови методом вертикальной диффузии на среде «Новая» с целью контроля за лечением больных туберкулезом легких на любом этапе химиотерапии в сочетании с электромагнитным излучением низкой степени интенсивности. Это позволит своевременно провести необходимую коррекцию схемы лечения в каждом конкретном случае. 91 ЛИТЕРАТУРА 1. Аболыня И.Я., Лотоцкая Р.А. Клинико-бактериологические исследования у больных микобактериозом и туберкулезом // II (XII) Всероссийский съезд врачей-фтизиатров: Тез. докл. - Саратов, 1994.С.228 2. Аникин В.А. Особенности репродукции метаболически измененных микобактерий туберкулеза // II (XII) Всероссийский съезд врачей-фтизиатров: Тез. докл. - Саратов, 1994. - С. 227-228. 3. Аникин В.А. Разработка и оптимизация сред для культуральной диагностики туберкулеза на основе препаратов микробиологического синтеза : Автореф. дис. ... канд. мед. наук. 4. Бебергаль Б.А., Панин А.Б. Определение устойчивости МБТ к пиразинамиду радиометрическим методом // Пробл. туберкулеза. 1991. - №2. - С. 9-12. 5. Билько И.П. Выращивание МБТ на питательных средах с синтетической плотной основой // Пробл. туберкулеза. - 1985. - N7. С. 62-63. 6. Благодарный Я.А., Кривцова А.Е., Блонская Л.И. Оптимизация методов бактериологических исследований на туберкулез и некоторые особенности его возбудителя //Пробл. туберкулеза.-1986. - № 9. - С. 3-5. 7. Благодарный Я.А., Кривцова А.Е., Блонская Л.И., Блехман И.М. Оптимизация методов бактериологических исследований на туберкулез и некоторые особенности его возбудителя // Пробл. туберкулеза. - 1986. - №9. - С. 3-5. 8. Благодарный Я.А., Сидоркина Э.В. Сравнительная характеристика некоторых методов типирования МБТ // Пробл. туберкулеза. - 1971. - №11.-С. 72-75. 9. Благодарный Я.А., Сидоркина Э.В. Типирование МБТ культуральными и биохимическими методами // Организационные вопросы лечения и эпидемиологии туберкулеза в Казахской ССР. - 92 Алма-Ата, 1972.-С. 271-272. 93 10. Благодарный Я.А., Сидоркина Э.В. Типирование МБТ культуральными и биохимическими методами // Организационные вопросы лечения и эпидемиологии туберкулеза в Казахской ССР.Алма-Ата, 1972.-С. 271-272. 11. Бокун А.О. Биологическая активность МБТ в эпизоотическом инфекционном процессе // Пробл. туберкулеза. - 1989. - №1. - С. 5112. Буровая Ф.И. Новая питательная основа для бактериологических сред : Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Л., 1974. 15 с. 13. Виноградова Р.Г., Сидорова Р.Ф. Методика расчета основных статистических показателей: Информ. письмо МЗ РСФСР.- М.,-1980.С.35. 14. Вишневский Б.И., Иванова Л.А., Колечко Н.Г. и др. Клиническое значение микобактерий туберкулеза с различными биологическими свойствами // Пробл. туберкулеза. - 1991. - № 4 — С. 51 - 54. 15. Вишневский Б. И. Основные направления работы лаборатории микробиологии туберкулеза // Туберкулез: проблемы диагностики, лечения и профилактики. - СПб., 2003. - С. 34-38. 16. Голанов B.C., Богданова В.Е., Андреев Л.П. и др. Клиническое значение лекарственно-устойчивых микобактерий туберкулеза и Lформ // Пробл. туберкулеза. -1991. - №12. - С. 27-28. 17. Голышевская В.И., Макаревич Н.М. Обработка мокроты раствором хлоргексидинбигмоконикума отечественного производства // Пробл. туберкулеза. -1990. - №3. - С. 41-42. 18. Гришин В.К., Гришин А.В. Первичная лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза // 10 Нац. Конгр. по болезням органов дыхания: Сб.резюме. - СПб., 2000. - С. 263. 19. Денисов А.Н., Огиренко А.П., Омигов В.М. и др. Пути преодоления лекарственной устойчивости при деструктивных и прогрессирующих формах туберкулеза легких // Пробл.туб. -2001.- 94 №9.-С. 11-13. 20. Должанский В.М. Актуальные вопросы бактериологии туберкулеза // Сб. научн. трудов МНИИТ -М.51975 - С.4-5. 21. Должанский В.М. Сравнительная характеристика "анормальных" кислотоупорных микобактерий и их антигенные взаимосвязи с другими представителями рода : Автореф. дис... Д-ра. мед. наук. М., - 1964. 22. Должанский В.М., Калюк А.Н. Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза: Метод, рекомендации- М.Д992С. 22 23. Должанский В.М., Калюк А.Н., Малиев Б.М., Левченко Т.Н. Влияние низкоэнергетического биологические свойства гелий-неонового микобактерий лазера на туберкулеза // Пробл.туберкулеза - 1990. - № 4.-С 11-14. 24. Дорожкова И.Р., Попов С.А., Медведева И.М. Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза в России за 1979 - 1998 гг. // Пробл.туберкулеза. - 2000. - №5 - С. 19-22. 25. Дорошенкова А.Е., Сокол Л.А., Гребенников СВ., Дорошенко Ю.В. Лечение больных туберкулезом легких с лекарственной устойчивостью МБТ // 10 Нац. Конгр. по болезням органов дыхания: Сб.резюме. - СПб., 2000. - С. 287. 26. Драбкина P.O. О патогенезе экстропульмонального туберкулеза // Пробл. туберкулеза. - №2. - С. 29-33. 27. Драбкина P.O. Микробиология туберкулеза. - М., 1963. - 255 с. 28. Дьячкова О.А. Глубинный посев на кровяную среду для ускорения диагностики туберкулеза // Казанский мед. журнал. - 1991. Т 72. -№5. - С. 395-397. 29. Егоров А.М. Достижения фундаментальных наук и новые подходы к химиотерапии туберкулеза // Пробл. туберкулеза. - 2000. - 95 №5-С.И-15. З0. Елькин А.В. послеоперационные рецидивы туберкулеза легких: факторы риска, хирургическое лечение: автореф. Дис....д-ра мед. наук. СПб., 2000. 31.Зыков М.П. Микробиология туберкулеза. Медицина, 1976-160с. 32. Зыков М.П., Ильина Т.Б. Потенциально-патогенные микобактерии и лабораторная диагностика микобактериозов. -М., Медицина, 1978.- 176 с. 33. Зыков М.П., Поти С. и др .Ускоренный метод определения вирулентности туберкулезных микобактерии // Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. - 1972. - т. 16. - №4. С. 397-403. 34. Иванова Л.А. современные методы коррекции этиопатогенетической терапии деструктивных форм туберкулеза легких: Авреф. дис.... д-ра мед.наук.-СПб., 1995.. 35. Иванов А.К., Племянникова Г.И., Пятунина Г.А. Основные причины неэффективного лечения туберкулеза //10 Нац. конгр. по болезням органов дыхания: Сб.резюме. -СПб., 2000.- С. 290. 36. Кибардина З.А., Елизарова Э.Д. Использование бактериологического метода при обследовании группы риска // VI Всесоюзный съезд фтизиатров: Тез. докл. - Кемерово, 1987. - С. 72-73. 37. Клебанова А.А. К вопросу о влиянии физических факторов на жизнеспособность микобактерии.//Вопр.туберкулеза.- 1931.-№ 2 -С.202-204 38. Клячкин Л.М., Малявин А.Г., Пономаренко Г.Н. и др. Физические методы лечения в пульмонологии. СПб, 1997.- С. 315. 39. Колычев Н.М., Боганец Н.С., Лосева А.В. Характеристика микобактерий, изолированных от человека, животных и объектов внешней среды // Пробл. туберкулеза. -1990. - №11. - С. 59-60. 40. Корецкая Н.М. Лекарственная устойчивость микобактерий как фактор, предрасполагающий к летальному исходу туберкулеза в пени- 96 тенциарных учреждениях //10 Нац. конгр. по болезням органов дыхания: Сб.резюме. - СПб., 2000. - С. 381. 41. Кравченко М.А., Ударцева М.А. Влияние продуктов гидролиза яичного белка и различных ингредиентов на рост микобактерий туберкулеза // Актуальные вопросы экспериментального туберкулеза и силикотуберкулеза: Сб. науч. трудов. - М., 1979. - С. 33-35. 42. Круду В.Н., Могуш А.С., Благодетелева Г.В. Новые питательные среды для культивирования микобактерий туберкулеза // II (XII) Всерос. съезд врачей-фтизиатров: Тез. докл. - Саратов, 1994. С. 238-239. 43. Кудрин А.Н., Пономарева Г.Т. Применение математики в экспериментальной и клинической медицине.- М., Медицина: - 1967. 356с. 44. Кузьмина Н.В., Вялков А.И. Сравнительный анализ первичной и вторичной лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в Ханты-Мансийском национальном округе //10 Нац. конгр. по болезням органов дыхания: Сб.резюме. -СПб., 2000. - С. 381. 45. Лазовская А.Л., Блохина И.Н. Патогенные и условнопатогенные микобактерий. - Горький, 1976. - С.114 . 46. Лазовская А.Л., Пинчук Л.М. Факторы патогенности микобактерий // Пробл. туберкулеза. - 1988. - №8. - С. 72-76. 47. Левашев Ю.Н. Состояние и перспективы борьбы с туберкулезом на Северо-Западе России // Пробл. Туберкулеза. - 2003.№10. - С.3-9. 48. Ломаченков В.Д.. Клименко Н.И., Павлюнина Л.Д. Физические методы лечения в комплексной терапии туберкулеза. - Смоленск, 1989 С. 67. 49. Макаревич Н.М. Идентификация кислотоустойчивых 97 микобактерий. Метод указания. - М., 1972. - С. 12 -15. 50. Макаревич Н.М., Рудой Н.М. Патогенность атипичных микобактерий в клинике туберкулеза и подбор эффективных противотуберкулезных препаратов // Теоретические и практические аспекты современной фтизиатрии. - М., 1974. -Т. 19. - С. 92-96. 51. Макаревич Н.М., Рудой Н.М. Диагностика заболеваний легких, вызванных туберкулезными микобактериями // X Всесоюзный съезд фтизиатров: Тезисы докладов. - Киев, 1986. - С. 85 - 86. 52. Методические указания по применению унифицированных микробиологических методов исследования при туберкулезе. Сост. Козулицина Т.Н., Макаревич Н.М., Смолянская А.З. и др.-М., 1978.С.72. 53. Мишин В.Ю., Борисов С.Е., Соколова Г.Б. и др. Разработка современных протоколов диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания // Consilium Medicum. - 2001. - Т. 3, № 3. - С. 148-154. 54. Мишин В.Ю., Чуканов В.И. Феномен индукции нарастающей поливалентной лекарственной резистентности микобактерий при стандартных курсах химиотерапии / / 1 0 Нац. конгр: Сб.резюме. Спб., 2000.-С. 293. 55. Модель Л.М. Биология и биохимия туберкулезных микобактерий -М., 1952. - 247 с. 56. Можокина Г.Н., Смирнова Н.С., Левченко Т.Н. и др. Дифторхинолон - ломефлоксацин в терапии инфекций, вызванных микобактериями туберкулеза // II Рос. нац. конгр. "Человек и лекарство": Тез. докл.-М., 1995.-С. 186-187. 57. Монцевчюте-Эрингене Е.В. Упрощенные математические методы в медицинской исследовательской работе // Патол. физиология и экс-перим. терапия. - 1964. - №4. - С. 71-78. 58. Мордовской Г.Г. Методы оценки ростовых свойств различных питательных сред для выращивания микобактерий туберкулеза // Проблемы и перспективы развития бактериологии во фтизиатрии. - М., 98 1988.-С. 31-35. 59. Мордовской Г.Г. Особенности бактериологической диагностики силикотуберкулеза при современной химиотерапии: Дис. дра мед. наук. - Свердловск, 1987. - 258 с. 60. Нечаева О.Б. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу и приоритеты в оказании противотуберкулезной помощи населению Свердловской области // Здравоохранение. - 2002. - № 2. -С. 33-38. 61. Николаева Г.М., Дорожкова И.Р. Морфология измененных форм МБТ // Пробл.туберкулеза. - 1988.- № 4. - С. 10 -11. 62. Новикова Л.Н. Эффективность химиотерапии в сочетании с электромагнитным излучением крайне высокой частоты в лечении больных деструктивным туберкулезом легких: Автореф. дис... канд. мед. наук. М., 1995. 63. Оттен Г.Ф. Определение активности антибиотиков широкого спектра действия против М. Fortuitum методом диффузии в агаре // Пробл. Туберкулеза .-199О.-№9.- С. 54-55. 64. Павлова М.В. особенности течения и лечения туберкулеза органов дыхания у подростков в современных эпидемиологических условиях: Автореф. дис д-ра мед.наук. - СПб., 2000. 65. Перельман М.И. // Consilium medicum. -2001.-Т.З, № 12-С. 564568. 66. Перельман М.И., Протопопова Н.М. Туберкулез.- М.: Медицина-1990.-С. 302. 67. Перельман М.И., Хомяков Ю.Н., Киселев В.И. и др. Молекулярная медицина и лечение туберкулеза // Пробл.туберкулеза 2001. - № 5. -С. 5-7. 68. Применение миллиметровых волн в комплексном лечении больных туберкулезом легких: Методические рекомендации / Сост. А.Г. Хоменко, Л.Н, Новикова и др. - М., 1995.- 10 с. 69.Пунга В.В., Хоменко А.Г., Стоюнин М.Б. и др. Медико- 99 социальные аспекты выявления и лечения больных туберкулезом в современных условиях // Пробл. туберкулеза - 1997. - № 6. - С. 15-17. 70. Пухлик Б.М. Проблема химиорезистентного туберкулеза и возможности ее решения // Украинский химиотерапевт, журн. - 1999. Т2. №2-С. 37-41. 71. Руднева С.Н., Пулькис А.В., Третьяков Г.В. Лекарственноустойчивый туберкулез как причина неэффективности лечения и смерти больных туберкулезом //10 Нац. конгр. по болезням органов дыхания: Сб.резюме СПб., - 2000. - С. 384. 72. Рыбалко В., Афанасьев В., Колечко Н. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза в Ленинградской области // Большой Целевой Журн. о туберкулезе - 1998. -№1. - С. 31-34. 73. Савула М.М., Стасюк Г.А. Комплексная терапия больных деструктивным туберкулезом легких с применением постоянного магнитного поля. // Проблемы туберкулеза . 1981, № 5. С 19-21. 74. Северин Е.С., Зыкова И.Е., Хомякова Ю.Н. Молекулярная медицина и лечение туберкулеза в XXI веке // Химиотерапия туберкулеза: Сб. резюме М., 2000. -СП. 75. Селицкая Р.П. Влияние антибактериальной терапии на иммунную систему при туберкулезе легких // Большой Целевой Журн. о тубер-кулезе-2000.-№ 9-С. 16-18. 76. Сидоркина Э.В. Сравнительная характеристика некоторых современных культурологических и биохимических методов типирования МБТ: Автореф. дис... канд. мед. наук. - Алма-Ата, 1973. 77. Соболева М.В., Цвирова И.М. Новые средства неспецифической профилактики туберкулеза // II Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тезисы докладов. - М.,1995.- С 250. 78. Соловьева А.С., Самцов B.C. Использование постоянного 100 магнитного поля для повышения эффективности химиотерапии больных туберкулезом легких // Пробл. туберкулеза. -1987,- № 8.- С 5356. 79. Соловьева И.П. Эпидемиология туберкулеза в морфологическом освещении // Архив патологии - 1998. - №1. - С 4-7. 80. Сосновская А.В. Идентификация туберкулёзных и нетуберкулёзныхмикобактерий // Пробл. туберкулеза. -1991. - № 3. - С. 65-66.. 81. Сосновская А.В. Методика идентификации МБ с помощью скрининг-тестов // Лабораторное дело. - 1979. - № 9. - С. 551-554. 82. Сосновская А.В. Сравнительная оценка значимости различных критериев вирулентности туберкулезных микобактерий // Пробл. тубер кулеза. - 1990. - № 4. - С. 17-19. 83. Сосновская А.В. Количественный метод оценки вирулентности микобактерий туберкулеза в опыте на морских свинках // Пробл.туберкулеза. - 1978. - С.79 - 82. 84. Стрелис А.К. Современная фтизиатрия и проблемы туберкулеза XXI века: Актовая речь. - Томск, 1999. 85. Толстенко Н.Г., Овдиенко Н.П., Косенко В.И. и др. Экспериментальное изучение патогенности атипичных микобактерий // II (XII) Всерос. съезд фтизиатров: Тез. докл. - Саратов, 1994. - С. 243. 86. Туберкулез в России: Информационное письмо. - М., 1994. 87. Туберкулез в России в 1996 г.: Информационное письмо). М., 1997. 88. Туберкулез в Российской Федерации в 1997 г.: Информационное письмо. - М., 1998. 89. Туберкулез в Российской Федерации в 1998 г.: Информационное письмо. - М., 1999. 90. Туркебаева К.А., Шипунова О.В., Кривцова А.Е. и др. О возможности лечения туберкулеза полимерным изониазидом 101 пролонгированного действия // Пробл. туберкулеза. - 1990. - № 3. - С. 32-33. 91. Тяк Е.П., Розенфельд Н.Я., Погорелова Н.А. и др. Причины недостаточной эффективности лечения впервые выявленных больных туберкулезом легких //10 Нац. конгр. по болезням органов дыхания: Сб.резюме. СПб., 2000. - С. 298. 92. Устиян А.И., Сапожник Г.Р. Эффективность лечения туберкулеза легких амниоценом // Пробл. туберкулеза. - 1990. - № 8. - С. 47-49. 93. Фадеева Н.И., Голышевская В.И., Бибергаль Е.А., Сафонова С.Г. Белковый спектр таксономической микобактерий принадлежности в зависимости и от устойчивости их к противотуберкулезным препаратам // Пробл. туберкулеза. -1991. - №6. С. 65-68. 94. Финкель Е.И. Совершенствование и стандартизация бактериологических исследований при туберкулёзе: Сб. науч. трудов. Фрунзе, 1985.-114 с. 95. Финн Э.Р. Пути повышения высеваемости и ускорения роста МБТ в современных условиях их изменчивости: Автореф. дис... канд. мед. наук. - Кишинев, 1973. 96. Фирсова В.А., Русакова Л.И., Григорьева З.П. с соавторами. Течение и эффективность лечения туберкулеза у подростков, выделяющих устойчивые микобактерий туберкулеза // 10 Нац. конгр. по болезням органов дыхания: Сб.резюме. СПб., 2000. - С. 298. 97. Хоменко А.Г. Новые аспекты химиотерапии туберкулеза //Пробл. туберкулеза-198O.-№ 7.-C.14-19. 98. Хоменко А.Г. Современная химиотерапия туберкулеза // Клин, фармакология и терапия. - 1998. - №4. - С. 16-20. 99. Хоменко А.Г. Современные тенденции в эпидемиологии туберкулеза и пути уменьшения Пробл.туберкулеза -1997.- № 1 . - С. 4-6. резервуара инфекции // 102 100. Хоменко А.Г. Туберкулез на рубеже XXI века: Актовая речь. -М., 1996. 101. Хоменко А.Г., Голышевская В.И., Носков Л.Э. и др. Химиотерапевтическая эффективность нового противотуберкулезного фармакологического средства флуронизида в эксперименте // Пробл. туберкулеза -1990. -№6.- С.6-8. 102. Хоменко А.Г., Голыпевская В.И., Королев М.Б.и др. Выделение и изучение морфологических свойств и иммунологенности фильтрующихся форм M.tuberculosis // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1983. - № 5. - С. 32-35. 103. Хоменко А.Г., Ерохин В.В. Современные представления о строении микобактерий туберкулеза // Журн микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1982. - № 12. - С.ЗЗ - 40. 104. Чичибабин Е.С. Совершенствование питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза // Пробл. туберкулеза. 1990.-№5.-С. 60-61. 105. Чуканов В.И. Основные принципы лечения больных туберкулезом // Русс. мед. журнал. - 1998. - Т. 6, № 17. - С. 1138-1142. 106. Чуканов В.И., Мишин В.Ю., Комиссарова О.Г. Частота и характер побочных реакций при химиотерапии туберкулеза легких. Химиотерапия туберкулеза: Сб резюме. М., 2000. - С. 76 - 77. 107. Чучалин А.Г. Молекулярная медицина и лечение туберкулеза в XXI веке. Химиотерапия туберкулеза: Сб. резюме. М., 2000. - С.42- 44. 108. Шевченко Ю.Л. Борьба с туберкулезом в России на пороге XXI века // Пробл.туберкулеза - 2000. - № 3. - С. 2-6. 109. Шеина А.Н. Физиотерапия в клинике туберкулеза // Вопр.курорт. физиотер.и лечеб.физ.культуры.- 1991. -№1.-С.60-63. 110. Шилова МБ. Туберкулез в России в 1999. - М., 2000. 111. Шилова М.В. Туберкулез в России в 2000. - СПб., 2001. 112. Шилова М.В. Туберкулез в России в 2001. - М., 2002. 103 Шилова М.В. Туберкулез в России в конце XX 113. века // Пробл. туберкулеза - 2001. - № 5. - С. 8-13. Шпанер И.Я., Залялиев Р.А., Сунгатуллина Т.Н. Динамика 114. лекарственной резистентности у больных туберкулезом легких / / 1 0 Нац. конгр. по болезням органов дыхания: Сб.резюме. СПб.,-2000.С. 300. Щеколдин 115. П.И. Общие принципы применения физических факторов в комплексной терапии туберкулеза // Доктор Лэндинг. - 1996.-№2-С. 43-46. 116. Эберт Л.Я., Евтушенко А.Д., Рыкова К.И. Эффективность различных лабораторных методов выявления бацилловыделения // Пробл. туберкулеза. - 1972. - № 3. - С. 70-72. 117. Диагностика Юхименко Н.В., Митинская Л.А., Елуфимова В.Ф. и др. и методы определения эффективности химиотерапии туберкулеза у детей // Пробл. туберкулеза.- 2002.-№ 1 .-С. 9-12. 118. Яковлева Л.П., Линева З.Е., Можокина Г.Н. Электромагнитное излучение крайне высокой частоты в комплексном лечении больных распространенным инфильтративным туберкулезом легких. // Пробл. туберкулеза - 2001. - №2 —С.11-12. 119. Ященко Л.В., Чистяков И.В. Низкочастотное магнитное поле в комплексной терапии воспалительных заболеваний легких. // Пробл. туберкулеза. - 1988. -№3.- С. 53-56. 120. Ященко Т.Н., Личева И.С. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. -М. 1973.-С. 86. 121. Ященко Т.Н., Личева И.С. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулезе. - М., 1973. - 86 с. 104 122. Abate G., Miorner H., Ahmed О. Et al. Drag resistance in Micobacterium tuberculosis strains isolated from re-treatment cases of pulmonary tu berculosis in Ethiopia: Susceptibility to first-line and alternative drags // Int. J. Tuberc. and Lung Disease. - 1998. -Vol. 2, №7. - P. 580-584. 123. Akarasewi P., Chati P., Pokaew P. Infectious ТВ and drug resistance tuberculosis in a prison, Chiangrmai 1989—1994: Abstr. Glob. Congr. Lung Health and 29th World Conf. Int. Union against Tuberc. and Lung Disease (IUATLD/UICTMR), Bangkok. 23-26 Nov., 1998. // Int. J. Tuberc. and Lung Disease. - 1998. - Vol. 2, № 11, Suppl. n2. - P. 197. 124.A1-Mazrou Y.Y., Khoja Tawfik A.M. Aziz Khwaja M.S., Salem Abdul Majeed. High proportion of multi-drag resistant mycobacterium tuberculosis in Saudi Arabia // Scand. J. Infect. Diseases. - 1997. - Vol. 29, № 3. - P. 323. 125. Antituberculosis Drug Resistance in the World. The WHO / JUATLD. Global Project on Antituberculosis Drug Resistance Surveillance 1994-1997. 126.Ariel Pablos-Mendez, Mario С Raviglione, Adalbert Laszlo et al. // New Engl. J. Medicine.-1998. - Vol. June 4. - P. 1641-1649. 127. Baghdadi J.Ei, Lazraq R., Ibrahimy S. Et al. Survey of primary drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in Casablanca, Morocco // Int. J. Tuberc. and Lung Disease. - 1997. - Vol. 1, № 4. - P. 309—313. 128.Bennett D, Watson J, Yates M, et al. The UK Mycobacterium Resistance Network, 1994.// Tuberc. Lung Disease, 1994. Vol., 75, P. 99. 129. Blanchard John S. Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis // Ann. Rev. Biochem. - 1996. Vol. 65. - P. 215-239. 130. Castro Kenneth G. Character of tuberculosis in a world // Emerging Infect. Diseases. - 1998. - Vol. 4, № 3. - P. 4-8. 131. Chan SL. Chemotherapy of tuberculosis // Clinical tuberculosis/ PDO, - London, 1994, P. 141-156. 132. Chanteau S., Rasolofo V., Ramarokoto H; Rasolonavulona T. et al. Anti-tuberculosis drug resistance in Madagascar in 1994—1995 // Int. J. 105 Tuberc. and Lung Disease. - 1997. - Vol. 1, № 5. - P. 405—410. 106 133. Chaulet P, Boulahbal F, Grosset J. Surveillance of drug resistance for tuberculosis control: why and how // Tuberc. Lung Disease, 1995, Vol. 76. № 6. P. 487-492. 134. Chaulet P, Raviglione M, Bustreo F. Epidemiology, control and treat ment ofinultidrug resistant tuberculosis// Drugs. Vol. 52, supplement 2, P. 103-108. 135. Chaulet P, Zidouni N. Failures in tuberculosis chemo- therapy // Tuberculosis/ PRJ. Edited Gangadharam, 1996. 136. Chaulet P., Boulahbal F., GrosseU. Surveillance of drug resistance for tuberculosis control: why and how // Tuberc. Lung Disease, 1995.- Vol. 76, - P. 487-92. 137. Chaulet P., Raviglione M., Bustero F. Epidemiology, control and treat ment of multidrug - resistant tuberculosis // Drugs. - 1996. - Vol. 52. - P. 103-108. 138. Chaves F., Alonso-Sarfz M.. Rebollo V.J. et al. RpoB mutations as an epidemiologic marker in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis // Int. J. Tuberc. Lung Disease. - 2000. - Vol. 4. № 8. - P. 765—770. 139. Cohn D, Bustreo F, Raviglione M. Drug resistance in tuberculosis: re view of worldwide situation and WHO'S global surveillance project// Clin. Infect. Diseases, 1996. 140. Crofton J. Failure in the treatment of pulmonary tuberculosis: potential causes and their avoidance// Bull. Int. Un. Tubenc, -1980. Vol. 55. № 3.- P. 93-99. 141. Crofton J. Multidrug resistance: danger for the Third World. In Porter JDH, McAdam, KDNJ, 1981. 142. Crofton J. The prevention and management of drug resistant tuberculo sis// Bull. Int. Un. Tuberc, Lung Diseases. 1987. Vol. 62. №. 1.- P. 6-11. 143. Davidaviciene E., Gaidanwniene D., Sosnovskaja A. et al. Drug-resistant Mycobacterium tuberculosis in Lithuania : Abstr. 30th IUATLD World Conf. lung Health, Madrid, 14—18 Sept., 1999 // Int. J. Tuberc. and Lung Disease. - 1999. Vol. 3, № 9, -P. 165. 107 144. Debarber A.E., Mdluli K., Bosnian M. et al. Ethionamide activation and sensitivity in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2000. Vol. 97, № 17. - P. 9677-9682. 145. Dolin P.J., Raviglione M.C., Kochi А. Туберкулез: заболеваемость и смертность в мире в 1990-2000 гг. // Бюлл. ВОЗ. 1994. - Т. 72, № 2. - Р. 27-34. 146. Drobniewski F. Drug resistant tuberculosis in adults and its treatment // J. Roy. Coll. Physicians London. - 1998. Vol. 32, № 4. - P. 314-318. 147. Drobniewski F., Tayler E., Ignatenko N., et al. Tuberculosis in Siberia: 1. An epidemiological and microbiological assassment // Tuberc. Lung. Dis eases. - 1996. - Vol 77 - P. 199-206. 148. Tuberculosis back to the future/ Editors Chichester, John Wiley & Sons Ltd., 1994,-P. 231-233. 149. Farmer P., Furin J., Shin S. Managing multidrug — resistant tuberculosis // The Journal of Respiratory Diseases.- 2000. - Vol. 21. №.1.- P. 6-8. 150. Farmer P.E., Bayaona J., Becerra M., et al. Proceedings of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease // North American Region Conference - 1997. - February 27 - March 2 - P. 88-102 151. Garcia Rodriguez Jose Francisco, Callejo Ana Marino. Lorenzo Garcia Maria Virginal et al. Resistencias de Mycobactenum tuberculosis en Ferrol. Factores asociados // Med. din.- 1999.- Vol. 113, № 15. - P. 572574 152. Ghazi-Saidi K.. Rahbar M, Masjedi M.R et al. The assessment of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in Western Azerbaijan and evaluation of resistance on rate of growth of this bacteria : Abstr. 30th IUATLD World Conf. lung Health, Madrid, 14-18 Sept, 1999 // Int. J. Tuberc. And Lung Disease. - 1999. - Vol. 3, № 9, - P. 165. 153. Githui W., Juma E; van Gorkom J. Et al. Anti-tuberculosis drug resistance surveillance in Kenya, 1995 : Abstr. 175th Meet. Pathol. Soc. Gr. Brit. and Irel, Sheffield, 2-4 July. 1997 // Med. Microbiol. - 1997. - Vol. 46, № 12.-P. 10-54 108 154. Global surveillance for antituberculosis-drug resistanc// New Engl. J. Med., -1998.- № 4, P.1641-1649. 155. Herbert J., Watson J.M., Drobniewski F. et al. Anti-tuberculosis drug resistance in London, 1994—1998: Abstr. 30th IUATLD World Conf. lung Health, Madrid, 14—18 Sept., 1999 // Int. J. Tuberc. Lung Disease. 1999. - Vol. 3,№9,-P. 163—164. 156. Hersi Ahmed, Elwood Kevin, Come Robert et al. Multidrugresistant tuberculosis in Alberta and British Columbia, 1989—98: Pap. CSCI Reg. Meet. Young Invest. Forum, Vancouver, June 26, 1999 // Clin. and Invest. Med. - 1999. - Vol. 22, № 5. - P. 224. 157. Iseman M. Treatment of multidrug-resistant tuberculosis // N. Engl. J. Med. - 1993. - Vol. 329. - P. 784-791. 158. Kim S.J., Bai G.H., Hong Y.P. Drug-resistant tuberculosis in Korea, 1994 / Int. J. Tuberc. Lung Disease.-1997.-Vol. 1, № 4.-P. 302-308 159. Kochi A, Vareldzis B, Styblo K. Multidrug resistant tuberculosis and its control// Res. Microbiol., -1994, -Vol. 144. P. 104-110. 160. Kochi A. The Global tuberculosis situation and the new control strategy of the World Health Organization // Bull World Health Organ. 2001. - Vol. 79, №1.-P. 71-75. 161. Lambregts-van Weezenbeek C.S.B., Jansen N.M., Nagelkerke N.J.D., van Klingeren В., Veen J. Nationwide surveillance of drug-resistant tuberculosis in The Netherlands: Rates, risk factors and treatment outcome // Int. J. Tuberc. and Lung Disease.-1998,- Vol. 2, № 4.- P. 288-295. 162. Laserson K... Osorio L.E., Hernandez H. et al. Risk factors for chronic, drug resistant tuberculosis. Buenaventura, Columbia, 1998: Abstr. Glob. Congr. Lung Health and 29th World Conf. Int. Union against Tuberc. And Lung Disease (1UATLD/UICTMR), Bangkok, 23-26 Nov., 1998 // Int. J. Tuberc Lung Disease.- 1998. -Vol. 2,№ 11,-P. 311-312. 109 163. Laszlo A., Rahman M, Raviglione M., Bustreo F. Quality assurance programme for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in the WHO/IUATLD Supranational Laboratory Network: First round of profi ciency testing // Int. J. Tuberc. Lung Disease. - 1997. -Vol. 1, № 3. - P. 231-238. 164. Mahajan M., Agarwal D.S., Gadre D.J., Singh N.P., Gupta H.C., Talvvar V. J. Initial and acquired drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in East Delhi // Commun. Diseases. - 1996. -Vol. 28, № 1. - P. 15-19. 165. Mazouni L, Zidouni N, Boulahbal F, Chaulet P. Treatment of failure and relapse cases of pulmonary tuberculosis within a national programme based on short- course chemotherapy (preliminary report). -TSRU, Progress Report, -1992, - Vol. 1. - P. 36-42. 165. Murray C.J.L., Sulomon J.A.S. Expanding the WHO tuberculosis control strategy: rethinking the role of active case - finding // Int/ Tuberc. Lung Disease. - 1998. - Vol. 2, № 9. -P. 9-15. 166. Raviglione M.C. What is the current situation of ТВ / HIU? // Tuberc. Lung Disease. - 1996. - Vol. 77. - P. 13. 167. Reichman L. Political reform in the us ensures the continued resurgenceof tb. // - T.B. & HIV. - 1996. - Vol. 9. - P. 7-8. 168. Reichman L.B. How to ensure the continued resurgence of tuberculosis// Lancet. - 1996. - Vol. 347, № 8995. - P. 175-177. 169. Reichman L.B. Tuberculosis elimination - what to stop us? // Int. J. Tubercl. Lung Disease. - 1997. - Vol. 1, № 1. - P. 3-11. 170. Schwoebel V, de Benoist AC, Decludt B, Haeghebaert S, Vincent V, Torrea G, Perronne C, Grosset J. Resultats de la surveillance de la tuberculose a bacilles multiresistants en 1994// Bull. Epid. Hebd.,- 199, - Vol. 8. - P. 33-34. 171. Stewart SM, Crofton JW. The clinical significance of low degree of drug resistance in pulmonary tuberculosis// Am. Rev. Respir. Dis., 1964, - Vol.89.- P. 811-829. 110 172. Teyler E. Antituberculosis drug resistance: Practical solutions to practicals problems / J. Med. Microbiol. -1997. -Vol. 46, № 7. - P. 531-533 173. Treatment of tuberculosis: Guidelines for national programmes / WHO, - Geneva, 1993. 174. Vareldzis BP. Grosset J, de Kantor I. et al. Drug resistant tuberculosis: laboratory issues, World Health Organization recommendations// Tuberc. LungDisease. - 1994, - Vol. 75. № 1. - P. 1-7. 175. World Health Organization. Treatment of tuberculosis: guidelines for national programmes / WHO, Geneva. 1997.
