2. Обзор литературы 6
advertisement
2 Основание для Работы 1.1. Государственный контракт по проекту 16533, заключенный между ООО ВНПП «ЖИВА» и ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» 1.2. Договор №16Н/2011 от 12 декабря 2011 года на проведение научноисследовательских работ между ООО ВНПП «ЖИВА» и Государственным учебно-научным учреждением Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова 1.3. Заказчик Работы: ООО ВНПП «ЖИВА»; 1.4. Исполнитель работы: Государственное учебно-научное Биологический факультет Московского государственного учреждение университета имени М.В.Ломоносова 1.5. Исследования предназначены для выявления оптимальных параметров лазерного воздействия на процессы регенерации биоткани с терапевтических аппаратов «ОРИОН-8» с внедрения целью помощью лазерных полученных результатов в медицинскую практику. 1.6. Исследования проводились, начиная с 03.10.2011 по 20.06.2012г. 1.7. В данном отчете представлен литературный обзор и результаты экспериментальных исследований 1.8. В исследованиях принимали участие: Руководитель проекта: профессор Г.В. Максимов ________________ Исполнители: Ст. науч. сотр., к.б.н. А.А. Байжуманов ___________________ Ст. науч. сотр., к.б.н. – М.Я. Ахалая ___________________ Науч. сотр., к.б.н. – Л.К. Трофимова ___________________ Науч. сотр., к.б.н. – Н. Н. Родионова ___________________ 3 Содержание 1. Введение 5 2. Обзор литературы 6 2.1. Общие сведения о действии лазерного излучения оптического диапазона на кожу человека 2.2. 2.3. 6 Некоторые терапевтические эффекты биологического действия лазерного излучения оптического диапазона 7 Антиоксидантная система крови 12 3. Материалы и методы 14 3.1. Получение биоматериала для исследований 14 3.2. Каррагинан-индуцированное воспаление 14 3.3. Технические параметры лазерных аппаратов, использованных в экспериментах 16 3.4. Облучение 16 3.5. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) в гемолизате крови 17 3.6. Определение активности каталазы в гемолизате крови 17 3.7. Определение содержания небелковых тиолов 17 3.8. Определение концентрации гемоголобина в гемолизате крови 17 3.9. Определение активных продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП) в плазме крови 3.10. 18 Определение количества активной формы церулоплазмина в плазме крови 18 3.11. Определение осмотической резистентности эритроцитов 18 3.12. Определение функционального состояния гемопорфирина гемоглобина 3.13. методом спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) 19 Статистическая обработка результатов 21 4. Результаты исследования 21 4.1. Влияние лазерного излучения зелёного спектра (532 нм) на исследованные характеристики 21 4.2. Влияние лазерного излучения синего спектра (450 нм) на исследованные характеристики 22 4 4.3. Влияние лазерного излучения красного спектра (658 нм) на исследованные характеристики 23 4.4. Влияние лазерного излучения инфракрасного спектра (810 нм) на исследованные характеристики 24 4.5. Влияние излучения импульсного лазера инфракрасного спектра (890 нм) на исследованные характеристики 25 5. Заключение 25 6. Выводы 26 7. Приложение 27 8. Список литературы 32 5 1. Введение Отчет изложен на 33 стр., таблиц 8, рисунков 9, библиография 25 Ключевые слова: лазерное излучение (ЛИ), низкоинтенсивная лазерная терапия, антиоксидантный статус, каррагинан-индуцированное воспаление, оксигенация тканей. В опытах на лабораторных животных проведено доклиническое изучение влияния лазерного излучения синего (450 нм), зелёного (532 нм), красного (658 нм), инфракрасного (ИК, 810 нм) и импульсного ИК (890 нм) спектров с целью выбора значимых параметров воздействия на регенерацию дегенеративных изменений кожи при помощи разработанного эффективности лазерного нами комплексного излучения, с метода анализа использованием модели биологической каррагинан- индуцированного воспаления конечности, а также оценки антиоксидантного статуса крови и показателей, характеризующие кислородтранспортные функции гемоглобина. Как известно фотобиологические эффекты ЛИ являются результатом многоэтапного процесса, и для их реализации, естественно, важным является процесс взаимодействия энергии излучения с чувствительными мишенями биологического объекта. Надо отметить, что биологические эффекты ЛИ, зависящие от экзогенных (энергия, проникающая способность) и эндогенных (наличие хромофоров, чувствительность клеток) факторов, осуществляются через включения многоступенчатых физико-химических и биохимических реакций, среди которых необходимо выделить образование активных форм кислорода (АФК), которые способны инициировать как биостимуляцию защитных адаптивных систем организма, так и развитие патологических процессов в тканях. В случае если происходит значительное превышение уровня АФК и антиоксидантная система, не справляется, происходит повреждение белков и ДНК, а также активация перекисного окисления липидов (ПОЛ), что в конечном итоге приводит к повреждению мембран. Кроме того, известно, что одним из важных хромофоров при облучении излучением видимого спектрального диапазона является гемоглобин, модификация свойств которого может привести к изменению оксигенации тканей и вазодилатации (расширению) сосудов. Все это и определило выбор параметров в экспериментах in vitro, характеризующих антиоксидантный статус крови и свойства гемоглобина в качестве маркеров биологической эффективности действия ЛИ. Для оценки антиоксидантного статуса крови, были выбраны показатели наиболее полно его характеризующие: супероксиддисмутазная активность, каталазная активность, уровень 6 небелковых тиолов, уровень церулоплазмина, количество конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). При этом супероксиддисмутаза и церулоплазмин ответственны не только за утилизацию супероксид анион-радикала, но и регулируют уровень металлов переменной валентности (меди и железа), способных стимулировать образование АФК, каталаза и небелковые тиолы принимают участие в утилизации перекиси водорода, а уровень продуктов ПОЛ является косвенным показателем образования самого опасного для клетки гидроксильного радикала и наличия окислительного стресса. В связи с широким применением лазерного излучения в медицине для лечения разных кожных заболеваний, мышечной атрофии, артритов, ускорения заживления ран и других патологических состояний, характеризующихся развитием воспалительных процессов, возникла необходимость разработки модели воспалительного процесса на животных для изучения механизмов терапевтического действия лазеров. Известно, что экссудативное воспаление сопровождает такие заболевания как синуситы, отиты, кожные воспаления различной этиологии, аллергические реакции, травмы, перикардит и др. Таким образом, для изучения терапевтической эффективности ЛИ в экспериментах in vivo была выбрана традиционная модель острого экссудативного воспаления — отек лап крыс, индуцированный каррагинаном (модель каррагинан-индуцированного воспаления конечности). 2. Обзор литературы 2.1. Общие сведения о действии лазерного излучения оптического диапазона на кожу человека. В последнее время широко стали использовать лазерную терапию в медицине для заживления ран и косметической коррекции кожи. Такое применение лазеров стало возможным из-за таких свойств, как а) монохроматизм, б) коллимация (прохождение луча без дивергенции) и в) когерентность (Matic et al, 2003). Данные характеристики позволяют лазерным лучам неинвазивно проникать через кожные покровы. Осуществление первичных эффектов ЛИ происходит при поглощении фотонов лазера митохондриями и мембранами поверхностно расположенных клеток (фибробластов, кератиноцитов, эндотелия), где энергия фотонов поглощается различными соединениями (митохондриальные цитохромы, порфирины, флавопротеины) и превращается в химическую кинетическую энергию клетки (Matic et al, 2003). Это 7 вызывает изменение проницаемости биомембран, что способствует реализации уже вторичных эффектов лазерного излучения. При осуществлении вторичных эффектов ЛИ происходит образование оксида азота, синглетного кислорода, выход ионов кальция из митохондрий и увеличение его уровня в цитозоле. Данные изменения приводят к включению сигнальных путей, ответственных за стимуляцию многих физиологических процессов клетки: миграция, синтез АТФ, ДНК, РНК, белка, пролиферация, которые необходимы для нормализации клеточного метаболизма при заживлении ран (Tunur & Hode, 2002). Кроме того, в клетке синтезируются, а затем секретируются низкомолекулярные белки цитокины и факторы роста, которые осуществляют взаимодействие с соседними клетками, что является уже третичным этапом действия лазерного излучения. Опосредованные эффекты, индуцируемые дистанционно через межклеточные взаимодействия, вызывают не только стимуляцию иммунной системы с активацией Tлимфоцитов, макрофагов, тучных клеток, но и увеличение синтеза эндорфинов и уменьшение уровня брадикинина, что способствует обезболивающему и антистрессовому эффекту действия лазерного излучения (Hamblin, Deidova, 2006). Надо отметить, что если проявление первичных реакций на лазерное излучение ограничены наличием хромофоров, способных поглощать фотон, то вторичные эффекты в большей степени зависят от чувствительности клеток, и менее прогнозируемы, чем первичные эффекты. Опосредованные эффекты считаются менее всего прогнозируемыми, так как они зависят как от внешних, так и от внутренних факторов и межклеточного взаимодействия. Данные эффекты относят также к системным эффектам действия лазерного излучения, что объясняет восстановление кожи необлучённой лазером области раны, расположенной рядом с облучённой частью раны (Dyson, 2006). Таким образом, фотобиологические эффекты лазерного излучения являются многоэтапным процессом, и для их реализации, естественно, важным является процесс взаимодействия энергии излучения с чувствительными мишенями биологического объекта. В клинике в основном используют лазеры с длиной волны области «терапевтического окна» (630-905 нм), но положительные эффекты показаны и для других длин волн. 2.2. Некоторые терапевтические эффекты биологического действия лазерного излучения оптического диапазона Известна обратная зависимость между длиной волны лазерного луча и его энергией, т.е. чем больше длина волны, тем меньше энергия излучения и, соответственно, его 8 проникающая способность в кожные покровы. Однако биологические эффекты зависят не только от энергии излучений, но и от тех областей кожи, которых они достигают, а также чувствительности клеток к данной длине волны лазерного излучения. В.И. Карандашов с коллегами (Карандашов В.И., и др, 2001) исследовал влияние экстракорпорального облучения крови синим светом на реологические характеристики и свертывающую систему крови, биологические, иммунологические, клинические показатели у больных с ишемической болезнью сердца, облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей, нарушением мозгового кровообращения, бронхиальной астмой, хроническим обструктивным бронхитом. Облучение крови синим светом оказалось эффективным методом для нормализации реологических показателей. В последнее время были получены данные об эффективном применении сочетанного воздействия лазерного излучения синего и красного спектров для терапии такого кожного заболевания, как акне (Papageorgiou P., et al, 2000). Терапевтический эффект при лечении болезни акне был показан и при использовании лазерного излучения зелёного спектра (532 нм). Предполагается, что при действии лазерного излучения зелёного спектра происходит активация фибробластов, образование факторов роста и стимуляция синтеза коллагена. В свою очередь образовавшиеся коллагеновые волокна действуют на сальные желёзы и модулируют их активность, что благотворно влияет на течение заболевания (Bangh & Kucaba, 2005). Несмотря на успешное применение сине-зелённого лазерного излучения для лечения некоторых кожных заболеваний, более широко распространенным и популярным является использование лазерного излучения красного спектра при лечении повреждений различных тканей (кожа, мышцы, нервы, хрящи, суставы) из-за большей проникающей способности данного излучения. В экспериментах in vivo после заражения мышей Paracoccidioides brasiliensis показано, что после облучения гелий-неоновым лазером (632 нм, 3.2 Дж/ см2) на 7, 8 и 9 сутки после вызванного у мышей заражения, в ранах облученных лазером мышей количество лимфоцитов и макрофагов было выше, а экспрессия IL-1β была ниже. Кроме того в обработанных лазером ранах экспрессия фактора роста эндотелия сосудов была выше, а экспрессия индуцируемого гипоксией белка HIF-1 ниже по сравнению с контролем. Также в обработанных лазером тканях было выше содержание коллагена и ретикулярных волокон (Ferreira M.C., et al, 2009). Лечебный эффект лазерного излучения красного спектра (670 нм, 9 мВт) был показан в модельных экспериментах, где для ускорения процессов восстановления и затягивания раны повреждённую кожу облучали в 4-х точках в дозе 1 Дж/см2 в течение 2- 9 х недель (Medrado et al, 2010). Проведённые через различное время после облучения иммуногистологические исследования показали увеличение уровня перицитов – клеток, участвующим не только в образовании стенки сосудов, но и способных трансформироваться в миофибробласты и участвовать в синтезе необходимого для заживления раны внеклеточного матрикса. Ускорение постоперационного заживления раны было обнаружено и в других модельных экспериментах, где облучение лазерным излучением красного спектра (632.8 нм) проводили контактно в 54 точках в дозе 3 Дж/см2 (Pinfieldi et al, 2005). Считают, что при действии лазерного излучения улучшается кровообращение повреждённой ткани, что способствует быстрому заживлению раны. При изучении действия лазерного излучения красного спектра (660 нм, 7.9 Дж/см2, 30мВт) на развитие в задней лапе крысы воспалительных процессов, индуцированных введением каррагинана (Silva et al, 2011) было обнаружено, что облучение вызывало уменьшение отёчности и снижение в несколько раз экспрессии РНК провоспалительных белков калликреинов, которые участвуют в стимуляции различных воспалительных цитокинов и интерлейкинов. Таким образом, данные о терапевтическом применении лазеров с разной длиной волны видимого диапазона показали, что чаще применяется лазерное излучение красного спектра, которое обладает большей проникающей способностью, чем сине-зелёное. Однако в последние десятилетия всё более успешным и перспективным становится использование в лечебных целях лазеров инфракрасного (ИК) спектра излучения. Терапевтическое влияние ИК излучения (820-950 нм, 15-25 мВт/см2, 8 Дж/см2) было показано на процессы заживления поверхностных ран после удаления кожных дефектов с переднего предплечья у людей (Hopkins et al. 2004). В частности, было отмечено более быстрое стягивание и восстановление раны (в 1.5 раза) у людей, кожа которых после операции подвергалась действию ИК излучения. Предполагается, что механизмом данного эффекта могут быть: а) увеличение пролиферации фибробластов под действием ИК излучения, что приводит к фиброплазии и быстрому заживлению ран; б) трансформация фибробластов в миофибробласты, сочетающие в себе способность к синтезу не только коллагеновых, но и сократительных белков (актина и миозина), которые способствуют сближению поверхностей раны. Важным фактором для успешного применения ИК излучения в терапевтических целях является подбор дозы облучения. В экспериментах на крысах (Rezende et al. 2007) исследовался процесс заживления раны на дорсальной части тела животного через 10 различное время (3, 7 и 14 суток) после применения 2-х доз (1.3 и 3 Дж/см2) однократного ИК излучения (830 нм, 60 мВт/см2). Было обнаружено, что через 7 и 14 дней после облучения стягивание раны и восстановительные процессы (наличие дифференцированных эпителиальных клеток в эпидермисе, присутствие в дерме в большом количестве высоко активных фибробластов и коллагеновых волокон, а также снижение уровня воспалительных клеток) лучше протекали у животных, облучённых дозой 1.3 Дж/см2, чем у облучённых дозой 3 Дж/см2. Стимулирующее влияние ИК излучения наблюдалось не только на пролиферацию фибробластов, но и их функциональную активность. Было обнаружено, что через сутки после облучения человеческих дермальных фибробластов ИК излучением (900-1000 нм, 35 мВт/см2) в течение 1-5 часов происходит зависимое от длительности облучения увеличение образования коллагена и эластина (Lee et al. 2006), что, по мнению авторов, даёт основание для применения ИК излучения в косметических целях. Было показано, что облучение ИК излучением (810 нм, 5 Дж/см2 и 25 Дж/см2) синовиоцитов, взятых у больных с ревматоидным артритом, снижало экспрессию мРНК и уровень провоспалительных белков TNF-α, интерлейкинов IL-1β и IL-8. Предполагается, что уменьшение болевых ощущений в суставах у больных с ревматоидным артритом после применения ИК излучения может быть обусловлено снижением уровня провоспалительных цитокинов, продуцируемых синовиоцитами (Yamaura et al. 2009). В экспериментах с животными воспаление сустава, индуцированное зимозаном, оценивали по изменению окружности сустава и уровня простагландина E2 (PGE2) в плазме крови (Castano et al. 2007). Было обнаружено, что ежедневное применение ИК излучения (810 нм в течение 5 дней после введения зимозана) в различных дозах (3 и 30 Дж/см2), с разными интенсивностями (5 и 50 мВт/см2) и интервалами облучения (1, 10 и 100 мин.) вызывает быстрое уменьшение отёка сустава и снижение уровня PGE2 в крови. При этом наиболее эффективными оказались более длительные времена воздействия ИК излучения (10 и 100 мин.) независимо от общей дозы облучения. Развитие воспалительных процессов являются также главной причиной истончения стенок артерий и развития аневризмы. По мнению некоторых исследователей из-за способности влиять на уровень биологически активных соединений (цитокинов, хемокинов), а также на экспрессию ферментов, в частности на индуцибельную NO-синтазу (iNOS) ИК излучение может быть перспективным средством для лечения артериальных аневризмов (Gavish et al. 2009). В модельных экспериментах при изучении влияния ИК излучения (2 мВт/см2, 2.2 Дж/см2) на стимулированную полисахаридом активность моноцитов/макрофагов (мышиные клетки RAW 264.7) было показано уменьшение экспрессии генов и уровня 11 провоспалительных цитокинов IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein, моноцитарный хемоаттрактантный белок). В то же время наблюдалось увеличение активности фермента iNOS и уровня оксида азота (NO), способствующего вазодилатации. Ослабление развития аневризмы было продемонстрировано и в экспериментах in vivo, где искусственно вызванную аневризму брюшной аорты мышей подвергали ИК облучению (Gavish et al. 2009). Положительной эффект ИК излучение оказывало и на процессы регенерации периферических нервных волокон. Таким образом, перспективности представленные терапевтического в литературе применения ИК данные излучения указывают при о различных патологических состояниях тканей, действующего посредством усиления пролиферации некоторых видов клеток, усиления генной экспрессии противовоспалительных цитокинов и подавления образования провоспалительных медиаторов. Возникает вопрос, каков физико-химический механизм действия ИК излучения на биологические объекты? Предполагают, что основным фотоакцептором в клетках млекопитающих является митохондриальная цитохром с-оксидаза (Karu and Kolyakov 2005) при активации которой в клетке образуются активные формы кислорода (АФК). Изменение клеточного окислительно-восстановительного состояния вызывает индукцию редокс-чувствительных транскрипционных факторов, среди которых одним из основных является ядерный фактор NF-kB. Известно, что в цитоплазме клетки NF-kB находится в неактивном состоянии в комплексе с ингибиторным белком IkB. Под действием АФК происходит стимуляция IkB-киназы (IkK), которая приводит к фосфорилированию IkB, вследствие чего IkB распадается с высвобождением NF-kB. Далее NF-kB транслоцируется в ядро и вызывает экспрессию более 150 генов-мишеней, участвующих в защитных реакциях организма. В экспериментах in vitro на эмбриональных фибробластах было показано наличие корреляции между процессом стимуляции NF-kB и накоплением АФК при воздействии различных доз (от 0.001 до 3 Дж/см2) ИК излучения (810 нм). При этом максимальная активация NF-kB и накопление АФК наблюдались при дозе облучения 0.3 Дж/см2, а более высокие дозы ИК-излучения вызывали уже значительно менее выраженные эффекты (Huang et al. 2009). Предполагают три основных пути, по которым может быть реализован вышеупомянутый эффект: 1. Образование и накопление АФК. При этом в зависимости от количества и состава образовавшихся продуктов результат действия ИК излучения может быть диаметрально противоположным: при малых концентрациях АФК стимулируют клеточную пролиферацию, однако некоторые типы АФК (синглетный кислород, 12 гидроксильный радикал) даже при низких концентрациях способны вызвать биоингибирование и клеточную гибель. 2. Фотовысвобождение NO из связанного состояния с белками, который при малых концентрациях является биостимулятором, а при больших может вызывать повреждения и привести клетку к гибели. 3. Активация транскрипционных факторов и защитных белков, являющихся антиапоптотическими, что способствует продлению жизни клеток. Возможно, что при высоких дозах ИК излучения запускаются сигнальные пути, приводящие к апоптозу. Таким образом, биологические эффекты лазерного излучения, зависящие от экзогенных (энергия, проникающая способность) и эндогенных (наличие хромофоров, чувствительность клеток) факторов осуществляются через включения многоступенчатых физико-химических и биохимических реакции, среди которых необходимо выделить образование активных радикалов, которые способны инициировать как биостимуляцию защитных адаптивных систем организма, так и развитие патологических процессов в тканях. 2.3. Антиоксидантная система крови В клетке существует многоуровневая система регуляции содержания АФК, которая напрямую борется антиоксидантной с продукцией защиты (АОЗ). свободных Система радикалов АОЗ в клетке представлена – система ферментами и антиоксидантами неферментативной природы (табл. 1). Набор компонентов системы АОЗ является тканеспецифичным. Неферментативные антиоксиданты включают белки (ферритин, трансферритин, лактоферрин, церулоплазмин, альбумин) и низкомолекулярные соединения (витамины Е и С, убихинол, каротиноид, глутатион, мочевая кислота, билирубин). Действие их сводится к связыванию молекул, способных спровоцировать рост продукции свободных радикалов (например, ионов железа), или к нейтрализации уже имеющихся радикалов. Анализ литературных данных говорит о разнонаправленном действии лазерного излучения на систему АОЗ в зависимости от длины волны, мощности излучения и типа ткани. Так существуют данные о том, что красный лазер длиной волны 632.8 нм повышает активность СОД путем депротонизации гистидинового остатка в активном центре фермента. В то же время лазерный свет может вызвать разрушение светозависимых комплексов NO∙ с некоторыми альбуминами плазмы и гемоглобином, чем можно объяснить эффект вазодилатации (Борисенко Г.Г. и др., 1997). Специфическими фотоакцепторами красного ЛИ могут являться медь-содержащие окислительно- 13 восстановительные ферменты, каталаза, цитохромный комплекс, возбужденный кислород, церулоплазмин, некоторые фотосинтетические пигменты. Поглощение ими энергии лазерного излучения приводит к усилению их функциональной активности, а в случае с синглетным кислородом он оказывает слабое повреждающее действие на биомембраны, выступая в роли стрессимитирующего фактора и стимулируя АОЗ (Артюхов и др., 2000). Таблица 1. Ключевые ферменты системы антиоксидантной защиты организма Фермент Локализация Функция Супероксид- Cu-Zn-СОД1 Эритроциты, цитоплазма Дисмутация дисмутаза Mn-СОД Митохондрии супероксиданиона с (СОД) Cu-Zn-СОД2 Плазма крови, стенки сосудов образованием перекиси водорода Каталаза Пероксисомы Нейтрализация перекиси водорода Глутатионпероксидаза Цитоплазма, митохондрии Деградация перекиси Глутатионтрансфераза Клеточные мембраны, водорода и цитоплазма, митохондрии, свободнорадикальных эндоплазматический ретикулум липидов Доказано, что именно с помощью образования АФК происходит биостимуляция многих жизненно важных адаптивных процессов, необходимых для клеточной устойчивости на различные воздействующие факторы. Основными источниками образования АФК считают митохондриальную дыхательную цепь и активированные нейтрофилы (Lumbart et al. 2005), реактивность которых зависит как от физиологобиохимического состояния организма, так и от параметров действующего излучения. Поддержание редокс-статуса в клетках осуществляется так называемыми редокс-парами, такими как окисленная/восстановленная формы никотинамидадениндинуклеотида (NAD/NADH), никотинамидадениндинуклеотид (GSH/GSSG) и тиоредоксина фосфата (NADP/NADPH), глутатиона (Trx(SH)2/TrxSS). Предполагается, что изменение соотношения редокс-пар является необходимым сигналом для активации в клетках редокс-чувствительных транскрипционных факторов, которые в свою очередь включают каскадные механизмы, регулирующие синтез ДНК, белков, активность ферментов и пролиферацию клеток (Liu et al. 2005). При этом, важно даже не количество образовавшихся АФК, а то какие из них непосредственно образовались (супероксид 14 анион радикал, перекись водорода, гидроксил радикал и др.), и то насколько быстро они были утилизированы в клетке системой АОЗ. Известно, что окислительный стресс это нарушение баланса между про- и антиоксидантами в пользу первых, что приводит организм к потенциальной опасности развития различных заболеваний. У человека окислительный стресс является причиной или важной составляющей таких болезней, как серповидно-клеточная анемия, атеросклероз, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, шизофрения и др. Таким образом, изучение антиоксидантного статуса крови, а также некоторых характеристик клеток крови при действии лазерного излучения разного диапазона является необходимым для понимания механизмов как терапевтических, так и возможных негативных биологических эффектов данного воздействующего фактора. 3. Материалы и методы 3.1. Получение биоматериала для исследований В качестве объекта исследования использовали интактных (здоровых) белых беспородных крыс. Крыс забивали методом декапитации, для предотвращения свертывания крови использовали гепарин (10 ед. на 1 мл крови). Для получения плазмы кровь центрифугировали 10 минут при 2000 об/мин при +4°C и отбирали супернатант – плазму. Для получения гемолизата кровь разводили в 50 раз дистиллированной водой. 3.2. Модель каррагинан-индуцированного воспаления В работе использовали самцов беспородных крыс. Животных делили на контрольную и опытную группы. Для моделирования местной воспалительной реакции в обеих группах применяли субплантарную инъекцию 0.1 мл 3% раствора каррагинана в физиологическом растворе (0.9% NaCl). Непосредственно перед введением раствора проводили несколько замеров лапы (для экспериментов использовали левую конечность) при помощи специального измерительного прибора Mitutoyo (Япония), представленного на рис. 1. Места замеров представлены на рис. 2. Через час после введения каррагинана в опытной группе конечность облучали лазером тех или иных характеристик (инфракрасный, инфракрасный импульсный, красный, синий) в течение 5 минут (характеристики лазеров описаны в следующем разделе). Через 4 часа после введения каррагинана (через 3 часа после облучения в случае опытной группы) проводили повторные замеры конечности (снимок конечности до и через 4 часа после введения каррагинана представлен на рис. 3). Время облучения, через 1 час после введения 15 каррагинана, и время замера конечности были выбраны исходя из литературных данных (Silva et al, 2011). Все манипуляции проводили под действием общего наркоза – тиопентала натрия, вводимого внутрибрюшинно в дозе 70 мг/кг (раствор в физиологическом растворе, 70 мг/мл). Рис. 1. Прибор для измерения толщины тканей Mitutoyo Pocket Thickness gage (Япония). Рис. 2. Лапа крысы с указанием проекций замеров (красные линии). Рис. 3. Лапа крысы до (слева) и через 4 часа после (справа) субплантарного введения 0.1 мл 3% раствора каррагинана. Для получения конечного размера конечности значения 5-ти замеров суммировались, после чего проводился расчет процентного увеличения размера конечности через 4 часа после введения каррагинана (за 100% принимали значение до введения). Регистрацию температуры каррагинан-индуцированого воспалённого участка задней конечности проводили с помощью пирометра Optris MS (Германия). 16 3.3. Технические параметры лазерных аппаратов, использованных в экспериментах 1. Лазерный аппарат «Орион 8» производство ВНПП «ЖИВА», Россия. Время экспозиции: 5, 10, 15, 20 минут. Излучатель: длина волны 450 нм. Мощность: 20,30,40, 50 мВт, режим излучения: непрерывный. 2. Лазерный аппарат «Орион 8» производство ВНПП «ЖИВА», Россия. Время экспозиции: 5, 10, 15, 20 минут. Излучатель: длина волны 658 нм. Мощность: 20,30,40, 50 мВт, режим излучения: непрерывный. 3. Лазерный аппарат «Орион 8» производство ВНПП «ЖИВА», Россия. Время экспозиции: 5, 10, 15, 20 минут. Излучатель: длина волны 810 нм. Мощность: 20,30,40, 50 мВт, режим излучения: непрерывный. 4. Лазерный аппарат «Орион 8» производство ВНПП «ЖИВА», Россия. Время экспозиции: 1, 2, 3, 4, 5 минут. Излучатель: длина волны 890 нм. Мощность в импульсе: 9 Вт, длительность импульса: 150 нс, режим излучения: импульсный 5. Лазерный аппарат (модель LCM-T-111, Laser-compact Group, Россия). Время экспозиции: 5, 10, 15, 20, 30 минут. Излучатель: длина волны 532 нм. Мощность излучения: 20 мВт, режим излучения: непрерывный. 3.4. Облучение Облучение проб в экспериментах проводили лазерным модулем (модель LCM-T111, Laser-compact Group, Россия) 532 нм, мощность лазера на выходе 20 мВт. Минимальное время экспозиции составляло 5 минут, максимальное – 30 минут. Кроме того использовали лазерные аппараты («Орион 8», ВНПП «Жива», Россия), позволяющие облучать в диапазоне мощности на выходе от 20 до 50 мВт в течение 5- 20 минут, длины волн лазеров синего спектра 450 нм, красного спектра 658 нм и ИК-спектра 810 нм,. Минимальное время экспозиции составляло 5 минут, максимальное – 20 минут. Для изучения действия импульсного лазерного излучения ИК диапазона применяли облучение лазерным аппаратом «Орион 8», в котором используется импульсный лазер (мощность 8-9 Вт/импульс, длительность импульса 150 нс, длина волны 890 нм, частота 1500 Гц), время облучение 5 минут. Пробы крови и плазмы интактных животных объемом в 1 мл находились в чашках Петри диаметром 40 мм, биологические жидкости во время облучения равномерно перемешивались. Контрольные пробы находились в тех же условиях, только не подвергались облучению. В экспериментах in vivo область воспаления у животных облучалась однократно контактным образом, лазерным излучением синего, красного и ИК-спектра, в течение 5 17 минут, диапазон мощности на выходе 20 мВт. При облучении импульсным ИК-лазером мощность составляла 8-9 Вт/импульсе, время облучения 5 минут 3.5. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) в гемолизате крови (Браже и др., 2011) Метод основан на измерении количества продукта окисления адреналина адренохрома, поглощающего при 320 нм, образование которого происходит в отсутствие дополнительных источников генерации супероксида. Активность СОД оценивалась по ингибированию аутоокисления адреналина в карбонатном буфере при pH 10.0 при добавлении образцов гемолизата крови (1:50). Активность выражали в отн.ед./г гемоглобина, где за 1 отн.ед. принято 50% ингибирование аутоокисления. Референсные значения 20-40 отн.ед./г гемоглобина. 3.6. Определение активности каталазы в гемолизате крови (Браже и др., 2011) Принцип метода основан на том, что каталаза разрушает Н2О2. Измеряют уменьшение оптической плотности образца при 240 нм. Одна единица каталазной активности была определена, как количество фермента необходимое, чтобы переработать 1 мМ Н2О2/мин. Количество израсходованной Н2О2/мин вычислялось с учетом коэффициента экстинкции – 46.3 М-1см-1. Активность фермента выражалась в единицах каталазной активности на грамм гемоглобина (Гб) в минуту. Референсные значения 60-80 отн.ед./г гемоглобина/мин. 3.7. Определение содержания небелковых тиолов в крови (Sedlak J. & Lindsay R.H., 1968) 0.05 мл крови смешивали с 0.5 мл 0.02 М ЭДТА-Na2 и 0.5 мл 10% трихлоруксусной кислоты. После экстракции в течение 10 минут пробы центрифугировали в течение 15 минут при 8000 об/мин. Супернатант отбирали и смешивали с 2 мл 0.4 М трис-HCl буфера(pH = 8.9) и 50 мкл 0.01 М ДТНБ. Через 5 минут определяли оптическую плотность при 412 нм. Содержание небелковых тиолов выражали в нмоль/мг Гб крови. Референсные значения 5,8-7,8 нмоль/мг Гб. 3.8. Определение концентрации гемоголобина в гемолизате (Браже и др., 2011) Метод основан на том, что в 0.06 % водном растворе додецилсульфата натрия все формы Гб переводятся в одну - гемихром. Измеряют оптическую плотность при 540 нм. Концентрацию рассчитывают по закону Бугера-Ламберта-Бера с учетом разведения, молекулярного веса мономера Гб 16114 и коэффициента его молярной экстинкции 10140. Референсные значения 140-160 гр Гб/л 18 3.9. Определение активных продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП) в плазме крови (Браже и др., 2011) Метод основывается на экстракции бутанолом продуктов перекисного окисления липидов, образующих с ТБК окрашенные комплексы. Оптическая плотность (D) супернатанта измерялась против холостой пробы при 535 и 580 нм в кювете толщиной 1 см. Расчет содержания ТБК-активных продуктов проводился по формуле: С=D*106+0.81, где С – концентрация ТБК активных продуктов нмоль/мл плазмы). Референсные значения 2,0-3,5 нмоль/мл плазмы 3.10. Метод определение количества активной формы церулоплазмина в плазме крови (Браже и д., 2011) Метод основан на ферментативной реакции ЦП с о-фенилендиамином (ОФД) с образованием окрашенного продукта при 492 нм. Остановка реакции проводится с помощью добавления концентрированной серной кислоты. Уровень фермента определялся с помощью калибровочной кривой, построенной при использовании различной концентрации фермента ЦП. Референсные значения 350-500 мкг/мл плазмы 3.11. Определение осмотической резистентности эритроцитов в модификации Л.И. Идельсона (1974) (Меньшиков и др., 1984) Для определения степени гемолиза эритроцитов пробы крови помещали в забуференные гипотонические растворы NaCl, после чего спектрофотометрически определяли экстинкцию супернатанта. Готовили водные растворы NaCl (ХЧ, «Лабораторная техника», Москва) концентрации 0.1, 0.2, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6 и 0.65%. В каждый из растворов помещали 20 мкл исследуемой крови и перемешивали Vortex на низкой скорости. После 60 мин инкубации при комнатной температуре пробы центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант переносили в чистые пробирки, после чего измеряли экстинкцию проб в спектрофотометре Hitachi 556 (Japan) при длине волны 540 нм при комнатной температуре. В качестве слепой пробы использовали 1% раствор NaCl. Процент гемолиза в каждой пробе рассчитывали по следующей формуле: Процент гемолиза = Ех/Е1, где Е1 - экстинкция в пробирке, содержащей 1% раствор NaCl; Ех – экстинкция исследуемой пробы. В свежей крови интактных крыс начало гемолиза отмечают при концентрации NaCl 0,5-0,45 %, а полный гемолиз при 0,4-0,35% растворе NaCl. 19 3.12. Определение конформационного состояния гемопорфирина гемоглобина методом спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) Для оценки конформационного состояния гемопорфирина гемоглобина регистрировали спектр КР цельной венозной крови в стеклянном капилляре. Источником возбуждающего света служил лазер (длина волны 473 нм, мощность 18-20 мВт), регистрировали спектр в диапазоне 800-1800 см-1. Для каждой пробы измерения проводили троекратно, полученные значения усредняли. Положение и интенсивность полос КР спектра гемоглобина связана с характером колебаний связей порфиринового кольца, что позволяет оценить конформацию гемопорфирина, которая непосредственно связана с кислород-связывающими свойствами гемоглобина (Соловьёв и др. 1985, Brazhe et al. 2009). Полосы спектра 1355 и 1375 см-1 связаны с симметричными колебаниями пиррольных колец в молекулах дезоксигемоглобина и гемоглобина, связанного с лигандами (кислородом), соответственно, при этом соотношение интенсивностей I1375/(I1355+I1375) пропорционально относительному количеству оксигемоглобина в крови. Интенсивность полос 1552 см-1 и 1588 см-1 характеризует спиновое состояние железа в дезокси- и окси- форме, соответственно, и степень погруженности атома железа в плоскость порфиринового кольца. Чем больше атом железа погружен в плоскость порфиринового кольца, тем легче происходит связывание его с лигандом и труднее происходит диссоциация лиганда из комплекса. Используя соотношения интенсивностей полос I1355/I1552 и I1375/I1588 можно оценить способность молекул гемоглобина в эритроцитах связывать и отдавать молекулы кислорода (Brazhe et al. 2009). Для дезоксигемоглобина также характерны колебания связей, дающие пик с максимумом 1564 см-1. Отношение показателей, характеризующих способность гемоглобина связывать и отдавать кислород ((I1355/I1552)/(I1375/I1588)) и ((I1355/I1564)/(I1375/I1588)) отражает сродство молекул гемоглобина к кислороду в эритроцитах. Отношение I1588/I1552 характеризует степень погруженности атома железа в порфириновое кольцо. Колебание, характеризующее связь молекулы NO с железом гемоглобина, дает полосу с максимумом 1618 см-1. На рис. 4 показаны характерные пики интенсивности комплексов Гб с лигандами (О2 и NO), обладающие характерными разделяющимися полосами в спектре КР. 20 Рис. 4. Спектр комбинационного рассеяния гемопорфирина гемоглобина крови (Соловьев К.Н, и др. 1985). На рис. римскими цифрами I-VI обозначены полосы КР с положением максимумов 1355, 1375, 1564, 1588, 1618 и 1668 см-1. По оси ординат интенсивность КР, в условных единицах.; по оси абсцисс –частотный сдвиг, см-1. В данной работе оценивались следующие характеристики гемопорфирина гемоглобина эритроцитов крови: 1. относительное содержание оксигемоглобина – по соотношению полос I1375/(I1375+I1355) в спектрах комбинационного рассеяния крови 2. способность Гб связывать О2 - по соотношению полос I1355/I1552 3. способность Гб выделять О2 - по соотношению полос I1375/I1588 4. сродство Гб к О2 - по соотношению полос ((I1355/I1552)/(I1375/I1588)), ((I1355/I1564)/(I1375/I1588), I1588/I1552 и I1588/I1564 5. способность Гб связывать лиганды - по соотношению полос I1355/I1564 6. относительное количество комплексов Гб-NO(I) - по соотношению полос I1618/(I1355+I1375). Для экспериментов использовались пробы из смешанной крови крыс, которую in vitro облучали лазерным излучением различного диапазона и дозы. Измерения зависимости интенсивности от частотного сдвига были проведены на спектрофотометре КР. Источником возбуждающего света - твердотельный лазер BL473T-050 (Китай), генерирующий излучение с длинной волны 473 нм, что не попадает в максимум поглощения гемоглобина. Луч лазера фокусировали на капилляре с кровью, каждый спектр записывали спектр в течение 100 секунд с помощью программы MORS (Троицк, 21 Россия). Для каждого эксперимента проводилось 4-6 повторов. Мощность излучения поддерживалась на уровне 20 мВт. Рассеянное излучение собиралось системой линз на входную щель монохроматора ДФС-24. Регистрацию сигналов КР осуществляли системой регистрации МОРС 1/3648 (Троицк, Россия), сделанной на базе линейной ПЗС TCD1304DG (Toshiba, Япония) с фильтром LPO2-473RS-50. 3.13. Статистическая обработка результатов Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием критериев согласия Стьюдента с применением компьютерной программы GraphPad Prism 4.00 и Microsoft Office Excel. Различия между группами результатов считались достоверными при p0.05. 4. Результаты исследования Для выяснения действия лазерного излучения в качестве объекта облучения нами была выбрана кровь, так как состояние крови является интегральным показателем функционирование организма в целом. После облучения крови интактных крыс in vitro были измерены показатели, которые наиболее полно характеризуют антиоксидантный статус крови: содержание небелковых тиолов, супероксиддисмутазная и каталазная активности, а при наличии эффектов действия ЛИ в крови - количество ЦП и продуктов ПОЛ в плазме крови, а также методом КР параметры, характеризующие состояние гемоглобина. Далее будут рассмотрены эффекты лазеров различных длин волн на исследованные характеристики. 4.1. Влияние лазерного излучения зелёного спектра (532 нм) на исследованные характеристики Было изучено влияние лазерного излучения зеленого спектра (532 нм, мощность лазера на выходе 20 мВт) на кровь интактных крыс. Кровь облучали в течение 5, 10, 15 и 30 минут. Установлено, что облучение крови зеленым лазером не влияет на содержание небелковых тиолов, супероксиддисмутазную и каталазную активности крови (табл. 2 приложения), а также – на осморезистентность эритроцитов (рис. 5 приложения). Таким образом, отсутствие изменений в содержании небелковых тиолов (как известно, около 90% от общего числа небелковых тиолов в крови составляет восстановленный глутатион) даже при 30-минутном облучении крови, свидетельствует о том, что выбранные нами параметры облучения не провоцируют генерацию АФК и не приводят к окислительному стрессу в крови интактных животных. 22 Из представленных выше данных, можно сделать заключение, что действие ЛИ с данными параметрами облучения не оказывает негативного влияния на антиоксидантный статус крови и осморезистентность эритроцитов крови интактных животных, что позволяет использовать его в качестве безопасного терапевтического воздействия без соответствующих отрицательных побочных эффектов. 4.2. Влияние лазерного излучения синего спектра (450 нм) на исследованные характеристики Как видно из результатов представленных в табл. 3-6 приложения, лазерное излучение синего спектра только при мощности на выходе 50 мВт и длительности экспозиции 20 минут снижало уровень небелковых тиолов в крови интактных крыс, при этом остальные исследованные характеристики окислительного статуса крови не менялись. Таким образом, лишь довольно высокие дозы облучения ЛИ синего спектра приводят к небольшому увеличению степени окислительных процессов, которое вполне компенсируется имеющимся уровнем глутатиона, не провоцируя изменений других параметров, являющихся показателями усиления продукции АФК и появления окислительного стресса. Кроме того, даже под воздействием наиболее высокой из исследованных доз облучения не наблюдалось изменения резистентности эритроцитов (рис. 6 приложения), что также указывает на безопасность использованного воздействия. Однако применение облучения ЛИ синего спектра, при мощности на выходе в 20 мВт и длительности экспозиции 5 минут, в модели каррагинан-индуцированного воспаления, привело даже к большему, по сравнению с контролем, уровню отёка конечности через 4 часа после индукции воспаления (рис. 7a приложения), что вероятно связано с усилением воспалительной реакции после облучения. При этом увеличение отека не сопровождалось изменением температуры конечности (табл. 7 приложения). На следующие сутки после индукции воспаления отёк спадал, возвращаясь к контрольному уровню (рис. 7б приложения). Известно, что важную роль в реализации терапевтических эффектов лазерного излучения играет оксид азота (NO). Предполагается, что фотовысвобождение из связанного состояния с белками NO, в частности гемоглобином (Гб), обусловливает не только вазодилатацию, но и активацию транскрипционных факторов, и синтез защитных белков клетки, так необходимых для восстановительных процессов при патологии. Ни один из исследованных параметров, позволяющих оценить уровень связывания лигандов (NO, O2) Гб крови, не изменился после облучения синим лазером. В совокупности, полученные нами данные не свидетельствуют о пользе от использования синего лазера исследованных характеристик для воздействия на 23 биологические объекты, более того, наблюдаемые эффекты об увеличении воспалительного отёка могут говорить о потенциальном вреде синего лазера при использовании в других патологических ситуациях, связанных с изменением микроциркуляции. 4.3. Влияние лазерного излучения красного спектра (658 нм) на исследованные характеристики Облучение крови интактных крыс лазерным излучением красного спектра при мощности на выходе 20 мВт в течение 20 минут, а также мощности на выходе 50 мВт и временах экспозиции 5 и 20 минут провоцировало уменьшение содержания небелковых тиолов на 12-25% (табл. 3 приложения). Облучение ЛИ красного спектра с мощностью на выходе 50 мВт и длительностью экспозиции 20 минут также сопровождалось достоверным увеличением содержания ТБК-активных продуктов (табл. 6). Эти результаты говорят об усилении окислительных процессов в исследуемых образцах, которые, однако, не приводят к увеличению активной формы церулоплазмина (ЦП) и активностей антиоксидантных ферментов, СОД и каталазы (табл. 4 и 5 приложения). Не наблюдалось также изменений в осморезистентности эритроцитов в облученной крови (рис. 6 приложения). Несмотря на обнаруженные эффекты, позволяющие говорить о развитии окислительных процессов при действии лазерного излучения красного спектра (658 нм) (снижение количества небелковых тиолов, накопление ТБК-активных продуктов), данный лазер не влиял на развитие воспалительного отёка конечности ни через 4 часа, ни через сутки после индукции воспаления. Не менялась также и температура конечности (рис. 7а,б и табл. 7 приложения). В литературе имеются данные по терапевтическому эффекту красного лазера разной длины волны (632, 660, 670 нм), где основным механизмом считается стимуляция пролиферации и функциональной активности клеток, участвующих в восстановительных процессах. Однако не проводились исследования влияния лазерного излучения красного спектра на свойства гемоглобина, в частности на увеличение способности гемоглобина выделять О2 после облучения. Нами не было выявлено изменений способности Гб связывать лиганды, в частности – О2, а также изменений сродства Гб к О2 и содержания Гб-NO после облучения крови. Однако увеличивалось относительное содержание Гб-О2 и способности Гб выделять О2 после облучения крови ЛИ красного спектра с различными параметрами (табл. 8, рис. 8 приложения), что указывает на способность этого вида излучения (658 нм) вызывать улучшение оксигенации тканей. Данные эффекты могут быть полезны при использовании лазеров для лечения различных патологий, в частности для регенерации поврежденной ткани 24 (образовании коллагена), так как гипоксия (снижение содержания О2 на том или ином уровне, или ухудшение способности к его утилизации клетками) является частью практически любого патологического процесса. Данные о том, что способность ЛИ красного спектра (658 нм) вызвать улучшение оксигенации тканей проявляла максимальный эффект при мощности лазера на выходе 50 мВт и длительности экспозиции 5 минут, дает основание предположить, что и противовоспалительный эффект этого лазера может проявиться при этих параметрах облучения. Это предположение требует проведения дополнительных исследований. 4.4. Влияние лазерного излучения ИК спектра (810 нм) на исследованные характеристики Облучение лазерным излучением ИК спектра (810 нм) при мощности лазера 20 мВт и времени экспозиции 20 минут, а также мощности на выходе 50 мВт и временах экспозиции 5 и 20 минут, вызывало 13-20%-е снижение содержания небелковых тиолов в крови (табл. 3), а также – падение уровня активной формы ЦП на 16%, но только после облучения крови, а не плазмы (табл. 4). Однако не были отмечены изменения активностей других антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза) и уровня ТБК-активных продуктов (табл. 5 и 6), что говорит об отсутствии окислительных процессов, способных вызвать существенные негативные последствия для клеток организма. В пользу этого утверждения свидетельствует также, то, что осморезистентность эритроцитов после облучения крови не менялась (рис.6 приложения). Лазерное излучение ИК спектра оказалось наиболее эффективным в модели каррагинан-индуцированного воспаления (рис. 7 и табл. 7 приложения). Так, отёк был значимо меньше через 4 часа после индукции воспаления (14.5% против 22% в контроле), что сопровождалось и более низкой температурой конечности, а также наблюдалась тенденция (р=0.06) к снижению отёка через сутки (6.8% против 10.4% в контроле), что даёт основания для использования ИК-лазера в терапии воспалительных заболеваний как снижающего отёчность и другие негативные последствия воспалительного процесса. В основе возможных механизмов воздействия, по-видимому, лежит наблюдаемое нами после ИК-облучения увеличение содержания Гб-О2 и роста способности Гб-О2 высвобождать О2, что может приводить улучшению оксигенации ткани (табл.8, рис.9 приложения). Также уменьшение содержания комплексов Гб-NO свидетельствует о возможности увеличения содержания в тканях несвязанного NO, обладающего вазодилаторным эффектом, что позитивно сказывается на кровоснабжении и обмене веществ в тканях. 25 Таким образом, ИК лазер оказался наиболее эффективным для коррекции местного воспаления, а также улучшения оксигенации и микроциркуляции крови поврежденного участка. 4.5. Влияние излучения импульсного лазера ИК спектра (890 нм) на исследованные характеристики Применение излучения импульсного лазера ИК спектра не вызывало изменение основных компонентов, характеризующих антиоксидантный статус крови (СОД, каталаза, небелковые тиолы, ТБК-активные продукты), хотя было отмечено незначительное, но достоверное снижение активной формы ЦП (табл. 4 приложения), что свидетельствует об отсутствии развития окислительных процессов в облученной крови крыс. Это подтверждает и тот факт, что осморезистентность эритроцитов также не изменялась после облучения (рис. 6 приложения). Воздействие излучения импульсного лазера ИК спектра приводило к развитию меньшего, чем в контроле, воспалительного отёка через 4 часа после индукции воспаления в модели каррагинан-индуцированного воспаления (рис. 7 и табл. 7 приложения). Через сутки отличия от контроля в размере отёка исчезали. Импульсный ИК-лазер не повлиял на способность Гб связывать лиганды. Возможно, что этот эффект не наблюдался из-за недостаточного времени экспозиции. Таким образом, также как и при облучении непрерывным ЛИ ИК спектра, обнаружен положительный эффект при использовании импульсного ИК-лазера в терапии местного воспаления. 5. Заключение На основе полученных данных можно заключить, что лазерное излучение всех нами протестированных аппаратов «ОРИОН-8», производства ВНПП «ЖИВА» при мощности на выходе 50 мВт и облучении крови in vitro от 5 до 20 минут не оказывает отрицательного характеризующие влияния на изученные ферментативную показатели систему крови у антиоксидантной интактных крыс, защиты крови, осморезистентность эритроцитов и функциональное состояние гемоглобина. Лазерное излучение красного (658 нм), ИК (810 нм) и импульсного ИК (890 нм) спектров в разной степени в зависимости от исследуемых параметров обладают большей способностью оказывать благотворные эффекты, чем лазерные излучения синего (450 нм) и зелёного (532 нм) спектров. Облучение крови лазерными аппаратами «ОРИОН-8» с красным (658нм) и ИК (810нм) лазерами (50 мВт, 5 минут) максимально изменяет показатели функционального 26 состояния гемоглобина, что потенциально приводит к улучшению снабжения тканей кислородом. Пятиминутное облучение каррагинан-индуцированного воспаления конечности лазерными аппаратами «ОРИОН-8» с импульсным лазером (890нм) (мощность в импульсе 8-9 Вт) и непрерывным ИК (810нм) лазером (при мощности на выходе 20 мВт) снижало эффект воспаления. С учетом вышеизложенного лазерные аппараты «ОРИОН-8» с импульсным (890нм) и непрерывным ИК (810нм) лазерами могут быть рекомендованы для медицинского применения в терапии воспалительных процессов. Возможность применения лазерного излучения синего (450нм) и зеленого (532 нм) спектров требует дальнейшего изучения. 6. Выводы 1. Наиболее эффективное терапевтическое воздействие на каррагинан- индуцированное воспаление конечности оказывало лазерное излучение ИК спектра, которое в 1.3-1.5 раза снижало эффект воспаления 2. Впервые показано, что лазерное излучение красного и ИК спектров значимо увеличивают оксигенацию тканей (повышение содержания оксигемоглобина (в 1,6-18, раза) и способность гемоглобина выделять кислород (в 1,7-1,8 раза) и увеличивают вазодилатацию сосудов (снижение уровня комплексов гемоглобина с NO на 30-40%). Данные готовятся к публикации. 3. Лазерные аппараты «ОРИОН-8» с непрерывным ИК (810нм) и импульсным ИК (890 нм) излучением могут быть рекомендованы для медицинского применения при терапии воспалительных процессов различной этиологии. 27 7. Приложение Таблица 2. Влияние лазерного излучения зеленого спектра (532 нм) на некоторые показатели антиоксидантного статуса крови Длительность СОД- Каталазная Количество облучения, активность активность, % небелковых тиолов, % минуты крови, % от контроля от контроля контроля контроль 1002,4 1003,2 1005,4 5 99.72.3 1022.2 1025.0 10 925.0 1109.2 100.46.5 15 914.3 1158.8 96.2 1.2 30 95.04.9 1021.2 974.2 Табл. 3. Уровень небелковых тиолов при облучении крови животных лазерами в разных режимах Характеристика лазеров и Количество небелковых тиолов, % от облучения контроля Импульсный контроль 100±1.7 ИК-лазер, 890 облучение 100±3.8 нм, 5 минут Синий лазер, 450 контроль 100±1.9 нм 20 мВт, 5 минут 100.9±1.9 50 мВт, 5 минут 104.6±1.9 20 мВт, 20 минут 98±1.9 50 мВт, 20 минут 87.0±2.6, p<0.05 Красный лазер, контроль 100±1.0 658 нм 20 мВт, 5 минут 97.4±1.8 50 мВт, 5 минут 88.5±2.6, p<0.05 контроль 100±1.0 20 мВт, 20 минут 75.2±4.7, p<0.01 контроль 100±2.7 50 мВт, 20 минут 78.9±5.6, p<0.05 ИК лазер, контроль 100±1.0 810 нм 20 мВт, 5 минут 95.6±1.4 50 мВт, 5 минут 86.7±1.8, p<0.05 контроль 100±1.0 20 мВт, 20 минут 80.9±2.9, p<0.01 контроль 100±2.7 50 мВт, 20 минут 82.6±3.8, p<0.05 28 Таблица 4. Уровень активной формы церулоплазмина (ЦП) при облучении крови и плазмы животных лазерами в разных режимах Характеристика лазеров и облучения Импульсный ИК-лазер, 890 нм Синий лазер, 450 нм Красный лазер, 658 нм ИК лазер, 810 нм Количество ЦП в плазме крови после облучения крови, % от контроля Количество ЦП в плазме крови после облучения плазмы, % от контроля контроль облучение 5 минут контроль 100±2.5 90.2±3.0*, p<0.05 100±1.5 103.1±1.0 100±3.3 100±1.5 50 мВт, 20 минут контроль 97.4±2.2 100±3.3 101.2±0.3 100±1.5 50 мВт, 20 минут контроль 50 мВт, 20 минут 101.1±3.5 100±2.5 84.3±3.1*, p<0.05 104.9±5.0 100±1.5 106.9±2.3 Таблица 5. Активности СОД и каталазы при облучении крови животных лазерами в разных режимах Характеристика лазеров и облучения Импульсный ИК-лазер, 890 нм Синий лазер, 450 нм Красный лазер, 658 нм СОД-активность, % от контроля Каталазная активность, % от контроля 100±5.6 91.4±2.3 100±5.4 105.9±10.2 100±5.6 98.4±6.9 100±4.0 100.3±1.8 100±4.0 100.9±1.8 100±5.4 111.8±5.4 100±5.2 111±6.6 100±5.2 113.3±6.6 контроль облучение 5 минут контроль 50 мВт, 20 минут контроль 50 мВт, 20 минут контроль 50 мВт, 20 минут ИК лазер, 810 нм Таблица 6. Изменение содержания ТБК-АП при облучении крови и плазмы животных лазерами в разных режимах Количество ТБК-АП Характеристика лазеров и облучения в плазме крови после облучения крови, % от контроля Импульсный ИКлазер, 890 нм Синий лазер, 450 нм Красный лазер, 658 нм ИК лазер, 810 нм контроль облучение, 5 минут контроль 50 мВт, 20 минут контроль 50 мВт, 20 минут контроль 50 мВт, 20 минут Количество ТБКАП в плазме крови после облучения плазмы, % от контроля 100±5.9 112.1±6.3 100±3.8 114.2±5.2 100±5.9 110.4±9.0 100±5.9 127.4±6.6*, p<0.05 100±5.9 105.9±4.5 100±3.5 95.1±1.0 100±1.6 112.6±3.5*, p<0.05 100±1.6 113.8±5.3*, p<0.05 29 Рис. 5. Степень гемолиза эритроцитов после облучения крови лазерным излучением зелёного спектра (532 нм) Рис. 6. Степень гемолиза эритроцитов после облучения крови лазерным излучением синего, красного, ИК спектра (50 мВт, 20 мин) и импульсным ИК-лазером (5 мин) 30 * % от изначального размера конечности 125 120 * 115 A * 110 105 100 Контроль (n=10) Синий (n=9) Красный (n=9) И К (n=7) И Кимпульс (n=6) Через сутки после введения каррагинана 115 % от изначального размера конечности Через 4 часа после введения каррагинана 130 Б р=0.06 110 105 100 95 Контроль (n=10) Синий (n=9) Красный (n=9) И К (n=7) И Кимпульс (n=6) Рис. 7. Процентное изменение размера конечности через 4 часа (А) и через сутки (Б) после введения каррагинана в контрольной группе и после облучения лазером с различными характеристиками (за 100% принят размер, зарегистрированный до введения каррагинана). * – значимые отличия от контроля, р<0.05; n – число животных в группе; р=0.06 – тенденция к отличию от контроля; ИК – инфракрасный лазер. Таблица 7. Влияние лазерного излучения разного диапазона на каррагинаниндуцированное воспаление и температуру задней конечности крыс Тип лазера Число животных Контроль Синий Красный ИК ИК-импульс 10 9 9 7 6 % размера конечности по сравнению с уровнем до введения каррагинана Через 4 часа Через 24 часа 122.0±1.0 110.4±1.7 126.4±1.8 * 111.5±0.9 123.1±1.6 110.2±1.5 114.5±2.9 * 106.8±1.3 (т) 116.9±2.4 * 108.8±3.2 % температуры конечности через 4 часа после введения каррагинана по сравнению с уровнем до введения 106.3±3.0 101.0±2.9 105.0±4.6 97.1±4.4 * 120.7±3.0 * (среднее±станд.ош.среднего; * - р<0.05 от контроля, т – тенденция к значимости отличий от контроля) Табл.8. Некоторые показатели состояния гемоглобина после облучения красным и ИК лазерами с различными параметрами Параметры Содержание Гб- Способность Содержание Вариант облучения О2, отн. ед. Гб выделять комплексов Гб-NO, О2, отн. ед. отн. ед. Контроль Без облучения 1.000 ± 0.146 1.000 ± 0.130 1.000 ± 0.250 Красный 20 мВт 5 мин 1.231 ± 0.285 1.187 ± 0.236 0.918 ± 0.315 лазер 50 мВт 5 мин 1.589 ± 0.375 * 1.690 ± 0.432 * 0.757 ± 0.253 50 мВт 20 мин 1.323 ± 0.198 (т) 1.332 ± 0.288 0.824 ± 0.165 ИК 20 мВт 5 мин 1.389 ± 0.185 * 1.156 ± 0.275 0.772 ± 0.150 50 мВт 5 мин 1.740 ± 0.341 * 1.852 ± 0.349 * 0.600 ± 0.144 * 50 мВт 20 мин 1.302 ± 0.177 (т) 1.254 ± 0.215 0.874 ± 0.152 (т) - тенденция 31 Относительные единицы 2.5 Контроль * 2.0 * 20 мВт, 5 мин 50 мВт, 5 мин 50 мВт, 20 мин 1.5 1.0 0.5 0.0 Содержание оГб Способность Гб выделять O2 Содержание комплексов Гб-NO Рис. 8. Влияние лазерного излучения красного спектра (658 нм) на некоторые характеристики функциональных свойств гемоглобина крови крыс (* - р<0.05 от контроля) Относительные единицы 2.5 * 2.0 1.5 * Контроль 20 мВт, 5 мин 50 мВт, 5 мин * 50 мВт, 20 мин 1.0 * 0.5 0.0 Содержание оГб Способность Гб выделять O2 Содержание комплексов Гб-NO Рис. 9. Влияние лазерного излучения ИК спектра (810 нм) на некоторые характеристики функциональных свойств гемоглобина крови крыс (* - р<0.05 от контроля) 32 8. Список литературы 1. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Пантак А.А. //Бюлл. эксп. биол. мед. - 2000. Т. 129, N 6. - С. 537-540. 2. Борисенко Г.Г, Осипов А.Н., Казаринов К.Д., Владимиров Ю.А. // Биохимия, 1997, 6, 661-666. 3. Браже Н.А., Байжуманов А.А., Паршина Е.Ю., Юсупович А.И., Ахалая М.Я., Ярлыкова Ю.В., Лабецкая О.И., Иванова С.М., Моруков Б.В., Максимов Г.В. //Авиакосмическая и экологическая медицина, 2011, Том 45, № 1, стр. 40-45. 4. Карандашов В.И., Петухов Е.Б., Зродников В.С. Руководство для врачей: «Фототерапия», М.:Медицина, 2001г., 392 c. 5. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.; Лабораторные методы исследования в клинике: справочник Под ред. Меньшикова В.В. – М.: Медицина, 1987, - 368 с. 6. Соловьев К.Н, Гладков Л.Л, Старухин А.С. Спектроскопия порфиринов: Колебательные состояния//Минск: Наука и техника,1985 7. Brazhe N.A., Abdali S., Brazhe A.R., Luneva O.G., Bryzgalova N.Y., Parshina E.Y., Sosnovtseva O.V., Maksimov G.V. New insight into erythrocyte through in vivo surface-enhanced Raman spectroscopy. //Biophys. J. 2009. 97, 12, 32063214. 8. Castano A.P., Tianhong D., Yaroslavsky I., Cohen R., Apruzzese W.A. et al. Low-Level Laser Therapy for Zymozan-Induced Arthritis in Rats: Importance of Illumination time. // Lasers Surg. Med. 2007, 36, 9, 543-550. 9. Dyson M. Primary, secondary and tertiary effects of phototherapy: a review. Mechanisms of Low Level Light Therapy. Mechanisms for Low-Light Therapy, edited by Michael R. Hamblin, Ronald W. Wainant, Juanita Anders, Proceedings of SPIE Vol. 6140 (SPIE, Bellingham, WA, 2006) 6140, 614005-1 – 614005-12. 10. Ferreira MC, Gameiro J, Nagib PR, Brito VN, Vasconcellos Eda C, Verinaud L. // Photochem Photobiol. 2009 Jan-Feb;85(1), p.227-33. 11. Gavish L., Rubinshtein C., Bulut a., Berlatzky Y., Beeri R. et al. Low-level laser irradiation inhibits abdominal aortic aneurism progression in apolipoprotein Edeficient mice. // Cardiovascular Res. 2009, 83, 785-792. 12. Hamblin M.R., Deidova T.N. Mechanisms of Low Level Light Therapy. Mechanisms for Low-Light Therapy, edited by Michael R. Hamblin, Ronald W. Wainant, Juanita Anders, Proceedings of SPIE Vol. 6140 (SPIE, Bellingham, WA, 2006) 6140, 614001-1 – 614001-11 33 13. Hopkins J.T., Mcloda T.A., SeegmillerJ.G., Baxter G.D. Low-Level Laser Therapy Facilitates Superficial Wound healing in Humens: A Triple-Blind, ShamControlled Study. // J. of Athletic Training. 2004, 39, 3, 223-229. 14. Huang Y.-Y., Chen A.C.-H., Carrol J.D., Hamblin M.R. Biphasic Dose Response in Low Level Light Therapy. // Dose Response, 2009, 7, 358-389. 15. Karu T.I., Kolyakov S.F. Exact action spectra for cellular responses relevant to phototherapy. // Photomed. Laser Surg. 2005, 23, 351-361. 16. Lee J.H., Roh M.R., Lee K.H. Effects of Infrared Radiation on Skin Photo-Aging and Pigmentation. // Yonsei Medical Journal. 2006, 47, 485-490. 17. Liu H., R. Colavitti, Rovira, II and T. Finkel, Redox-dependent transcriptional regulation. //Circ Res. 2005. 97, 967-974. 18. Matic M., Lazetic B., Poljacki M., Duran M., Ivkov-Simic M. Low level laser irradiation and its effects on repair processes in the skin. //Med/Pregl. 2003. 56, 34, 137-141. 19. Medrado A., Costa T., Prado T., Reis S., Andrade Z. Phenotype characterization of pericytes during tissue repair following low- level laser therapy. //Photodermatology, photoimmunology & photomedicine. 2010. 26, 192-197. 20. Papageorgiou P, Katsambas A,Chu A. // Br. J. Dermatol. 2000, 142 (5), p. 973–8. 21. Rezende S.B., Ribeiro M.S., Nunez S.C., Garcia V.G., Maldonado E.P. Effects of a single near-infrared laser treatment on cutaneous wound healing: Biometrical and histological study in rat. //J. of Photochemistry and Photobiology. 2007, 87, 145-153. 22. Sedlak J., Lindsay R.H. // Analyt. Biochem., 1968, vol. 25, N 1, pp. 192205. 23. Silva M.P., Bortone F., Silva M.P., Araujo T.R., Costa M.S., Silva Junior J.A. Inhibition of carrageenan-induced expression of tissue and plasma prekallikreins mRNA by low level laser therapy in a rat paw edema model. //Rev. Bras. Fisioter. 2011. 15, 1, 1-7. 24. Tunur J., Hode L. Laser Therapy – Clinical Practice and Scientific Background. 2002. Prima Books AB, Grangesberg, Sweden. Chapter 1. Some basic Laser physics. 12-22. 25. Yamaura M., Yao M., Yaroslavsky I., Cohen M., Smotrich M., Kochevar L.E., Low level light effects on inflammatory cytokine production by rheumatoid arthritis synoviocytes. //Lasers in Surgery and Medicine. 2009. 41, 4, 282-290.
