На правах рукописи ПАХАРУКОВА НАТАЛИЯ АНАТОЛЬЕВНА ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ СЫВОРОТКИ
advertisement
На правах рукописи ПАХАРУКОВА НАТАЛИЯ АНАТОЛЬЕВНА ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА 14.03.08 – авиационная, космическая и морская медицина 03.01.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Ларина Ирина Михайловна кандидат биологических наук Мошковский Сергей Александрович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна доктор биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН Защита состоится «_____»_______________2010 г. на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 при Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН), г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а Автореферат разослан «_____»_______________2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н. Левинских М.А. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. В настоящее время протеомика активно развивается во многих странах мира и занимает ведущие позиции в научных программах современной прикладной и фундаментальной биологии, а также фармацевтики и смежных с ней дисциплин. С развитием протеомики связывают большие надежды по внедрению новых подходов в диагностике различных заболеваний и создании новых лекарственных соединений [Говорун В.М., Арчаков А.И., 2002]. Однако, несмотря на ведущиеся во всем мире исследования по направленному поиску биомаркеров различных патологических состояний, систематическое изучение протеома здорового человека только начинается. Отдельные попытки охарактеризовать вариабельность белков печени [Zhang X. et al., 2006], панкреатического сока [Chen R. et al., 2005] и плазмы крови [Nelsestuen G.L. et al., 2005], предпринятые в недавних исследованиях, не дают представления о групповой вариабельности белков в большой выборке обследуемых и об изменениях белковой композиции за длительный период времени. Кроме того, большой интерес представляет характеристика вариабельности белковой композиции у специально отобранной группы здоровых людей для определения интервала физиологической нормы различных белков внутри человеческой популяции. Очевидно, что протеом здорового человека в состоянии сохранения организмом его функциональных резервов чрезвычайно пластичен. Помимо значительных различий протеомного профиля индивидуального содержания и у протеома разных во индивидуумов времени, и существуют естественных вариации колебаний количественного качественного состава белков, связанные с адаптивным ответом на изменение внешних условий. Так, на протеом сыворотки крови могут оказать влияние различные факторы: питание (содержание в пище жиров и белков), курение, занятия спортом, длительный постельный режим [Anderson N.L. and Anderson N.G., 2002] и циркадианные ритмы [Linkowski P. et al., 1998]. При выполнении космических полетов, а также при участии в модельных экспериментах, имитирующих отдельные стороны космической экспедиции, человек сталкивается с непривычными для него условиями. Изменения, происходящие в организме, затрагивают все системы органов, в том числе модифицируется и белковый состав крови. С помощью радиоиммуннологического различных анализа, биохимических иммунодиффузии, методов (например, электрофореза в ацетатцеллюлозном геле) были проанализированы изменения многих гормонов белковой 4 природы (инсулина, соматотропина, ренина и других) [Ларина И.М. 2000; 2003; Григорьев А.И. с соавт., 1999], компонентов иммунной системы (иммуноглобулинов, факторов комплемента) [Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю, 1979, 1980: Герцик Ю.Г., 2004], белков системы свертывания крови [Фомин, А.Н., 1981] и «острой» фазы [Ларина О.Н., 1992; 2006], ферментов [Маркин А.А., 2001], в т.ч. протеолитических [Тигранян с соавт., 1987]. Протеомные методы для анализа изменений белков в космических полетах и наземных экспериментах ранее не использовались. Сыворотка крови человека является удобным объектом для исследований, поскольку содержит белки практически всех тканей организма, и изучение ее протеомного состава может дать достаточно полную информацию о физиологическом состоянии организма. Однако присутствие в ней солей и высококопийных белков, среди которых содержание альбумина и глобулинов составляет более 90%, и большой динамический диапазон концентраций белков (10-11 порядков) [Anderson N.L. et al., 2004] значительно затрудняет анализ белковой композиции при использовании одного конкретного методического подхода. Поэтому для комплексной оценки протеома сыворотки необходимо сочетание различных технологических платформ (как разделения сложных белковых смесей, так и детектирования белков). Технология прямого протеомного масс-спектрометрического профилирования сочетает предварительное фракционирование образцов сыворотки на магнитных частицах или других носителях, которые связывают белки с определенными свойствами, и масс-спектрометрический анализ смеси пептидов и белков, ионизированных с помощью матрицы. Данная технология является высокопроизводительной, позволяет анализировать одновременно несколько десятков пептидов, белков (до 17000 Да) и белковых фрагментов, составляющих так называемый посттрансляционные модификации низкомолекулярный (PTMs) белков. субпротеом, Оценка а также изменений многих компонентов низкомолекулярного субпротеома и PTMs белков в космических полетах и наземных экспериментах ранее не проводилась. Таким образом, использование протеомных подходов дает возможность уточнить и дополнить картину изменений композиции белков сыворотки при воздействии факторов космического полета, что приведет к пониманию молекулярных механизмов сохранения гомеостаза в экстремальных условиях среды и позволит в будущем разработать принципиально новые средства профилактики неблагоприятных последствий действия микрогравитации. Характеристика состояния здоровья человека в гипоксической аргоносодержащей среде представляет интерес в плане ее возможного использования в замкнутых объектах различного назначения (возможно, и на космической станции) для обеспечения 5 пожаробезопасности. Цель работы: характеристика протеомного профиля сыворотки крови здорового человека при воздействии на организм факторов космического полета и в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды. Задачи исследования: 1) выбор наиболее воспроизводимого метода прямого протеомного профилирования сыворотки крови; 2) изучение групповой и индивидуальной вариабельности протеома сыворотки крови здорового человека; 3) оценка изменений протеомного профиля сыворотки после длительных космических полетов и при воздействии условий модельных экспериментов (антиортостатической гипокинезии, «сухой» иммерсии, изоляции в гермообъеме); 4) характеристика изменений белковой композиции сыворотки крови в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды. Научная новизна работы Впервые была проанализирована индивидуальная и групповая вариабельность низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови здорового человека за длительный период времени (до 12 месяцев). Были выявлены наиболее пластичные и стабильные компоненты протеомного профиля. Охарактеризованы изменения белковой композиции сыворотки крови, включая пептиды, полноразмерные белки и их изоформы, фрагменты и метаболиты после длительных космических полетов и в ходе различных наземных экспериментов (1-суточная антиортостатическая гипокинезия, 7-суточная «сухая» иммерсия, 105-суточная изоляция в гермообъеме, 9-суточная изоляция в гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среде) с помощью технологии прямого масс- спектрометрического профилирования. Теоретическая и практическая значимость работы В ходе данной работы были обнаружены белковые компоненты, характеризующиеся высокой индивидуальной и групповой вариабельностью внутри группы здоровых лиц, что ограничивает использование данных белков как потенциальных биомаркеров различных дизрегуляторных состояний и дисфункций в физиологии, а также патогенетических маркеров в клинической протеомике. Белки и пептиды, обладающие незначительной дисперсией в группе здоровых лиц, напротив, могут представить важную информацию о состоянии здоровья при резком изменении их уровня. 6 Положения диссертации, выносимые на защиту 1. Технологическая платформа, включающая прямое масс-спектрометрическое профилирование после префракционирования сыворотки крови на магнитных частицах MB WCX является информативным и воспроизводимым методом анализа ее белковой композиции; 2. Низкомолекулярный субпротеом сыворотки крови здоровых лиц в условиях обычной жизнедеятельности характеризуется значительной групповой и индивидуальной вариабельностью; 3. Длительные космические экспедиции и эксперименты с моделированием воздействия факторов космического полета вызывают функциональную перестройку белковой композиции сыворотки крови, проявляющуюся в изменении пиков белков «острой фазы» и липидного обмена, а также протеолитических ферментов. 4. 9-суточная изоляция в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды приводит к уменьшению площадей пиков большинства изученных пептидов, белков и белковых фрагментов, что связано с нарушением их синтеза вследствие развития обратимой дисфункции печени в условиях гипоксии и повышенного давления. Апробация работы Основные положения работы были представлены на следующих конференциях: VII, VIII, IX конференциях молодых ученых специалистов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 9 апреля, 2008 г., 14 апреля, 2009 г., 14 апреля, 2010 г.); 17-ом международном симпозиуме «Человек в космосе» (Москва, 7-11 июня, 2009 г.); 30-ом и 31-ом международных симпозиумах по гравитационной физиологии (Сиань, Китай, 24-29 мая, 2009 г., Триест, Италия, 13-18 июня, 2010 г.); IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня, 2009 г.); 3-ей протеомной конференции стран Центральной и Восточной Европы (Будапешт, Венгрия, 6-9 октября, 2009 г.); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 25-27 ноября 2009 г.); Российско-французско-белорусской конференции «Нейрососудистые изменения, вызванные воздействием условий внешней среды: молекулярно-клеточные и функциональные подходы» (Анже, Франция, 10-12 марта 2010 г.). Список публикаций по материалам диссертации По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации. Работа выполнена в лаборатории «Метаболизм и иммунитет» ГНЦ РФ – ИМБП 7 РАН в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», при поддержке программы ОБН РАН, грантов Президента РФ «Ведущие научные школы» № НШ3402.2008.4 и РФФИ № 08-04-01533-а. Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, заключения, выводов и списка литературы. В диссертации приведены 17 таблиц и 28 рисунков. Список использованной литературы содержит 93 отечественных и 161 зарубежных источника. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследований Объект исследования: В качестве объекта исследований были использованы пробы сыворотки крови здоровых мужчин, в том числе космонавтов, совершивших длительные орбитальные полеты на МКС (7 человек), и добровольцев, участвовавших в модельных экспериментах (27 человек). Также была исследована индивидуальная (у 15 человек) и групповая вариабельность протеома (в группе из 58 человек) в привычных условиях жизнедеятельности. Указанные здоровые обследуемые являлись группой сравнения для всех экспериментов. Общий объём проведённых исследований представлен в табл. 1. Программы исследований всех экспериментов были одобрены комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ – ИМБП РАН. Все обследуемые были ознакомлены с условиями проведения экспериментов и подписали информированное согласие на добровольное участие в них. Циклограмма отбора образцов крови: Пробы крови российских космонавтовмужчин были получены за 45-60 суток до начала полета и на 1-ые и 7-ые сутки после окончания экспедиции. В эксперименте с 24-часовой антиортостатической гипокинезией (-15°) (АНОГ) отбор проб крови осуществляли за 8 часов до начала эксперимента и через 24 часа после начала эксперимента в каждой серии; в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией – за 7 суток до начала воздействия, на 7-ые сутки эксперимента и на 7 сутки периода реадаптации; в эксперименте со 105-суточной изоляцией – за 15 и 7 суток до начала изоляции, на 16-17, 51-52, 85-86 сутки изоляции и через 7-8 и 14-15 суток после ее окончания; в эксперименте с 9-суточной изоляцией в барокамере - за 2 суток до начала эксперимента, в день начала эксперимента за 3 часа до «погружения», на 6-ые и 9-ые сутки изоляции и на 1-ые сутки периода восстановления. Для определения индивидуальной вариабельности протеомного профиля в привычных условиях жизнедеятельности у 5 здоровых мужчин отбирали пробы крови на 1-ые, 2-ые, 6-ые, 9-ые, 14-ые, 21-ые, 28-ые; 45-ые; 60-ые сутки. Также у 5 человек были проанализированы изменения масс-спектров сыворотки крови через 6-7 месяцев, и у 10 человек – через 11-12 месяцев. Отбор проб проводили утром, натощак. Все участники имели заключение врачебной экспертной комиссии о состоянии их здоровья на момент обследования. Получение проб сыворотки крови: Образцы крови оставляли на 30 минут при комнатной температуре для формирования сгустка, далее центрифугировали при 4500g в течение 15 минут без охлаждения, затем аликвоты сыворотки замораживали при температуре -80°С. Предобработка образцов сыворотки с использованием магнитных частиц: Очистка и концентрация белков из проб сыворотки осуществлялась с помощью наборов магнитных частиц MB WCX, MB IMAC Cu, MB WAX. Все шаги пипетирования 8 растворов, отделения магнитных частиц и нанесения на MALDI-мишень AnchorChip (600/384) выполнялись роботом ClinProtrobot с помощью программы ClinProtRobot 1.3 («Bruker Daltonics»). В качестве матрицы использовали α-циано-4-гидроксикоричную кислоту (0,3 мг/мл в растворе ацетон/этанол в соотношении 1:2). Каждый образец префракционировали в двух повторах, и с каждого повтора в дальнейшем было получено по 4 спектра. Использовали растворители высокой степени очистки («Merck», Германия). Таблица 1. Объём проведенных исследований Эксперимент Длительные космические полеты (169-199 суток) 24-часовая антиортостатическая гипокинезия (-15°) 7-суточная «сухая» иммерсия 105-суточная изоляция в гермообъеме 9-суточная изоляция в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды (13,53%, 28,26%, 58,21%) Групповая вариабельность Индивидуальная вариабельность Количество участников Средний возраст (max-min) Количество проб 7 космонавтов-мужчин 43 года (35-51) 21 -контрольная группа (6 чел.); -группа с применением десмопрессина (6 чел.); - контрольная группа (5 чел.); - группа с применением низкочастотной электромиостимуляции (5чел.); - группа с применением механической стимуляции опорных зон стопы (6 чел.) 26 лет (22-39); 24 26 лет (22-39) 25 лет (23-29); 25 лет (21-31); 48 23 года (21-26) 6 чел. 33 года (25-41) 42 4 чел. 32 года (25-46) 20 36 чел. 25 лет (21-29); 11 чел. 35 лет (31-39); 11 чел. 45 лет (40-51) 12 чел. 34 года (20-51) 58 61 Префракционирование образцов сыворотки с использованием микронаконечников ZipTip С18: Концентрирование и обессоливание белков с помощью микронаконечников ZipTip С18 проводили в соответствии с протоколом производителя («Millipore»). Проба сыворотки (1,5 мкл) была разбавлена в 10 раз и подкислена 1% раствором трифторуксусной кислоты (ТФУ). Наконечник промывали 100% ацетонитрилом, затем 0,1% ТФУ. Далее образец 10-15 раз пропускали через наконечник для связывания пептидов и белков, после чего промывали 0,1% ТФУ. Затем белки элюировали раствором ацетонитрила и 1% ТФУ в соотношении 3:2. Элюат помещали в чистую пробирку и смешивали с α-циано-4-гидроксикоричной кислотой (0,3 мг/мл в 9 растворе ацетон/этанол=1:2) в отношении 1:10, затем 0,8 мкл раствора было нанесено на мишень MALDI-TOF AnchorChip (600/384). Масс-спектрометрические измерения: Масс-спектры (диапазон масс от 1000 до 17000 Да) были получены на масс-спектрометре MALDI MS Autoflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics), работающем в положительном линейном режиме. Калибровка массспектрометра осуществлялась с помощью белковых стандартов (Peptide Calibration Standard и Protein Calibration Standard II, «Bruker Daltonics»). Анализ масс-спектров: По каждому спектру был получен масс-лист с указанием отношения массы к заряду (m/z) каждого пика, его площади и интенсивности (ClinProTools 2.1 software («Bruker Daltonics»)). Эти данные экспортировали в таблицы MS Excel, и значения площадей в повторных измерениях усредняли. Кроме того, проводился контроль качества всех полученных спектров с помощью программ Flex Analysis 3.0 и Statistica 6.0 (кластерный анализ, древовидная кластеризация, мера расстояния – евклидово расстояние). Статистический анализ: Статистический анализ проводили с использованием непараметрического критерия Уилкоксона (программа Statistica 6.0 для Windows). Межгрупповые отличия считали достоверными при p<0,05. Тандемная масс-спектрометрия и идентификация отличающихся пиков: Идентификацию достоверно отличающихся пиков проводили посредством прямого MS/MS анализа на масс-спектрометре MALDI MS Autoflex III TOF/TOF («Bruker Daltonics») с помощью метода LIFT. Интерпретацию MS/MS спектров осуществляли с использованием программы BioTools («Bruker Daltonics»), соединенной с сервером Mascot (www.matrixscience.com). Некоторые пики были определены на основании сопоставления точного значения m/z пика в спектре и его идентификации в данных других исследователей. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выбор воспроизводимой технологии для прямого протеомного профилирования сыворотки Для выбора наиболее воспроизводимого метода при анализе протеома сыворотки были проверены следующие технологии прямого масс-спектрометрического профилирования: префракционирование образцов магнитными частицами MB WCX (принцип катионообменной хроматографии), MB IMAC Cu (металл-афинная хроматография), два варианта обработки проб магнитными частицами MB WAX (анионообменная хроматография), с очисткой элюата магнитными частицами MB HIC (обращенно-фазовая хроматография) и без нее; и микрохроматографическими насадками ZipTip С18 (обращено-фазовая хроматография). Сыворотка крови здорового донора была префракционирована в 10 повторах, и с каждого повтора получено по 4 спектра. Спектры, резко выделяющиеся из общего набора данных («выбросы»), не учитывали при расчете коэффициента вариации (CV) метода. Таким образом, для определения наиболее воспроизводимого метода принимали во внимание количество «выбросов» и значение 10 коэффициента вариации. Количество выбросов и коэффициенты вариации для каждого метода пробоподготовки приведены в табл. 2. Таблица 2. Количество выбросов и значения коэффициентов вариации для различных методов префракционирования сыворотки крови Метод префракционирования ZipTip C18 Магнитные частицы MB IMAC Cu Магнитные частицы MB WCX Магнитные частицы MB WAX Магнитные частицы MB WAX с дополнительной очисткой элюата MB HIC C8 Количество выбросов (% от общего числа спектров) 13 (32,5%) 7 (17,5%) 4 (10%) 9 (22,5%) Коэффициент вариации, % 60,0% 14,6% 15,9% 50,2% 4 (10%) 38,1% Наибольшее количество неудачных спектров и самое высокое среднее значение коэффициента вариации было получено с использованием микронаконечников ZipTip C18. Обработка проб магнитными частицами MB WAX также показала высокую техническую вариабельность метода, которая, однако, снижалась при проведении дополнительной очистки пептидно-белковой смеси с помощью магнитных частиц MB HIC (табл. 2). В случае с использованием ZipTip C18 низкая воспроизводимость может объясняться тем, что все этапы протокола проводились вручную, когда как предобработка сыворотки с помощью магнитных частиц была полностью автоматизирована и проходила в контролируемых условиях температуры и влажности. Высокое значение коэффициента вариации для метода с использованием магнитных частиц WAX связано с необходимостью дальнейшей очистки элюата. И действительно, было показано, что после дополнительной обработки проб аналитическая ошибка стала меньше (50,2% vs 38,1%). Однако наличие большого числа этапов и длительное время проведения протокола (около 2 часов) также отрицательно сказываются на воспроизводимости данного метода. Пробоподготовка образцов сыворотки с помощью магнитных частиц MB IMAC Cu показала самое низкое значение коэффициента вариации, но количество спектроввыбросов было выше, чем при использовании MB WCX (табл. 2). Спектры, полученные с помощью MB WCX, образовали однородную группу и имели наименьшее число выбросов; значение коэффициента вариации было также невысоким, что свидетельствует о том, что данная технология пробоподготовки образцов является самой воспроизводимой. По данным других исследователей, значения коэффициентов вариации для методов предобработки сыворотки на магнитных частицах MB HIC C3, MB HIC C8, MB HIC C18 находились в диапазоне от 11 до 26% [Zhang X. et al., 2004; Baumann S. et al., 11 2005], что соответствует полученным в данной работе результатам для магнитных частиц MB WCX и MB IMAC Cu. В дальнейшем, прямое протеомное профилирование сыворотки крови в нормальных условиях жизнедеятельности, а также в космических полетах и наземных экспериментах проводили на магнитных частицах MB WCX с помощью робота ClinProt. 2. Характеристика вариабельности протеомного профиля сыворотки крови здорового человека в привычных условиях жизнедеятельности 2.1. Групповая вариабельность протеомного профиля сыворотки крови Для определения межиндивидуальных различий белковой композиции были получены протеомные профили сыворотки здоровых мужчин трех возрастных групп: от 20 до 30 лет (36 человек), от 30 до 40 лет (11 человек), от 40 до 50 лет (11 человек). В каждом масс-спектре сыворотки крови в среднем было получено 174 MS-пика. После составления таблицы масс всех пиков с указанием их площадей, были рассчитаны коэффициенты вариации для каждого пика во всех возрастных группах. Оказалось, что средний, по всем пикам, коэффициент вариации в возрастной группе от 20 до 30 лет был равен 37 %, от 30 до 40 лет – 40,2 %, от 40 до 50 лет – 50,6% (общее СV по всем группам = 42,6%). Данные значения намного превышают ошибку метода профилирования (15,9%), что свидетельствует о достаточно высокой групповой вариабельности протеомного профиля. Оказалось, что среди изученных групп здоровых лиц пики с коэффициентами вариации >50% составляют 21% от всех пиков протеомного профиля, а пики с небольшой дисперсией (CV<30%) - 29%. Таким образом, большую часть пиков протеомного профиля составляют пики с умеренной групповой вариабельностью (CV от 30 до 50%). Коэффициенты вариации некоторых пиков приведены в табл. 3. Так, высокие значения коэффициентов вариации имели фрагменты интер-α-трипсинового ингибитора, С3 и С4а комплемента, α-цепи фибриногена, антитромбина III и высокомолекулярного кининогена (табл. 3), а среди полноразмерных белков - аполипопротеины СI, СIII, β2-микроглобулин и цистатин С. Также были обнаружены пики, имеющие относительно небольшую дисперсию среди групп здоровых мужчин: это фрагменты транстиретина и β-цепи α2-HSгликопротеина (табл. 3). Необходимо отметить, что величина коэффициентов вариации пиков фрагментов С3-комплемента, β2-микроглобулина и транстиретина была примерно одинакова во всех группах. Однако разброс пиков высокомолекулярного кининогена, интер-α-трипсинового ингибитора, аполипопротеинов СIII и AII среди мужчин от 40 до 50 лет был значительно больше, чем в других группах, что свидетельствует о том, что вариабельность данных белков увеличивается с возрастом. 12 Таблица 3. Групповая вариабельность пиков протеомного профиля сыворотки крови здоровых лиц Идентификация [ссылка] m/z, Да Интер-а-трипсиновый ингибитор, фрагменты [Villanueva J. et al., 2006] 996 коэффициент вариации, % 20-30 40-50 30-40 лет лет лет 56,6 65,4 81,6 2272 46,8 27,5 160 16,2 1450 1692 1865 2022 8931 1741 1897 3208 1945 2082 2210 1617 33,8 31,2 61,7 198 61,2 68,8 52,5 31,5 62,8 61,9 60,9 25,9 45,4 51,1 115 113 41,6 62,8 48,3 55,7 73,8 55,2 55,8 56,9 68,4 48,8 79,4 120 41,7 59,3 28,6 22,2 105 109 99,7 52,8 11,1 16,2 10,1 16,2 13,9 18,2 16,2 14,2 10,9 17,5 14,5 13,8 2863 55,3 43,5 57,1 22,7 4475 50,6 64,2 42,2 16,2 7804 29,3 37,7 54,4 14,2 6432 6630 9135 9424 55,2 67,3 30,4 26,2 77,7 88,5 41,5 29,3 91,8 95,5 61 45,3 17,3 17,7 16,2 11 11730 51,7 54,7 53 12,1 13300 81,2 69,6 81,9 22,1 2902 23,6 29,4 31 16,2 2741 21,6 27,9 39,5 18,6 8675 22,7 18,5 52 16,2 С3 комплемент, фрагменты [Villanueva J. et al., 2006; Lopez M.F.et al., 2007] С4а комплемент, фрагменты [Villanueva J. et al., 2006] Высокомолекулярный кининоген, фрагменты [Villanueva J. et al., 2006] Фибриноген, α-цепь, фрагменты [Villanueva J. et al., 2006] Антитромбин III, фрагмент [Allard L. et al., 2004] Аполипопротеин АII, фрагмент [Nomura F. et al., 2004] Аполипопротеин СI [Ward D.G.et al., 2006] Аполипопротеин СIII [Bondarenko P.V. et al.,1999] β2-микроглобулин [Nelsestuen G.L. et al., 2005] Цистатин С [Zinkin N., 2008] Транстиретин, фрагмент [Lopez M.F. et.al.,2007] β-цепь α2-HS-гликопротеина, фрагмент [Mitchell B.L. et al., 2005] Аполипопротеин АII [Rossi L. et al., 2006] Ошибка метода, % 25,1 Таким образом, протеомный профиль сыворотки крови обладает значительной групповой вариабельностью, что проявляется в уровне интенсивности MS-пиков различных белков (аполипопротеинов СI, СIII, β2-микроглобулина, цистатина С) и фрагментов белков высокомолекулярного кининогена, системы комплемента, интер-αтрипсинового ингибитора, фибриногена. Высокая групповая вариабельность различных 13 форм аполипопротеинов может объясняться особенностями питания и двигательной активности у здоровых лиц. Остальные белки относятся к "белкам острой фазы", проявляющим опсонизирующую, антипротеолитическую и бактериостатическую активность [Алешкин В.А. с соавт., 1988]. Возможно, что эти белки являются наиболее пластичной частью протеома сыворотки крови, поскольку их активация или дезактивация обеспечивает адекватную реакцию организма на воспалительные процессы различной этиологии. Высокие коэффициенты вариации пиков, являющихся фрагментами белков, указывают на индивидуальные особенности активности протеолитических ферментов в сыворотке крови. 2.2. Индивидуальная вариабельность протеомного профиля сыворотки крови В данной части работы изучали изменчивость протеомного профиля у 5 здоровых мужчин за 24 часа, 7, 14, 21, 28, 45, 60 суток, 6 месяцев и у 10 здоровых мужчин за 12 месяцев. Было обнаружено, что протеомный профиль за 24 часа практически не изменялся, о чем свидетельствуют невысокие значения коэффициентов вариации всех пиков (от 13 до 19%, среднее CV = 16%). Анализ протеомных профилей, полученных каждую неделю в течение месяца, а затем на 45-ые и 60-ые сутки, показал значительную индивидуальную вариабельность пиков двух форм аполипопротеина СI (m/z=6431; 6630 Да, CV=52,3 и 55,7% соответственно) и фрагмента высокомолекулярного кининогена (m/z=1945 Да, CV=73,2%) (рис. 1). Площади данных пиков изменились более чем в 2 раза в течение одной недели у большинства испытателей. Компоненты протеомного профиля, обладающие низкой групповой вариабельностью - аполипопротеин АII (m/z=8675 Да), фрагменты транстиретина (m/z=2902 Да), кластерина (m/z=1279 Да) и β-цепи α2-HS-гликопротеина (m/z=2741 Да) (табл. 5) – незначительно изменялись во времени у здорового человека в привычных условиях жизнедеятельности (рис. 2). Интересно, что недавно транстиретин вошел в состав панели маркеров для доброкачественных дифференциальной диагностики опухолей и групповая диагностическую значимость. вариабельность яичника малого этого белка и таза Безусловно, (http://www.medicalnewstoday.com/articles/163761.php). индивидуальная рака низкая увеличивает его 14 Высокомолекулярный кининоген, фрагмент (m/z=1945 Да) Аполипопротеин СI (m /z=6630 Да) изменение площади пика относительно фона,% изменение площади пика относительно фона, % 100 50 0 фон 1 7 14 21 28 45 60 -50 -100 1800 1400 1000 600 200 -200 фон 1 7 14 21 28 45 60 период эксперимента, сутки период эксперимента, сутки Рис. 1. Изменение пиков аполипопротеина СI и фрагмента высокомолекулярного кининогена в течение 60 суток у 5 здоровых мужчин Транстиретин, фрагмент (m/z=2902 Да) Аполипопротеин АII (m/z=8675 Да) 100 изменение площади пика,% изменение площади пика,% 100 50 0 -50 фон 1 7 14 21 28 45 60 -100 50 0 -50 фон 1 7 14 21 28 45 60 -100 период эксперимента, сутки период эксперимента, сутки Рис. 2. Изменение аполипопротеина АII и фрагмента транстиретина в течение 60 суток у 5 здоровых мужчин Анализ динамики протеомного профиля сыворотки крови за 6 месяцев показал схожие результаты. Так, была отмечена высокая индивидуальная вариабельность аполипопротеина СI (m/z=6432; 6630 Да) и фрагмента высокомолекулярного кининогена (m/z=1945 Да). Однако прослеживалась также высокая изменчивость площади пика фрагмента С3 системы комплемента (m/z=1865 Да). Вариабельность данного белка, таким образом, имеет более широкий временной интервал, чем, например, аполипопротеина СI, период изменений которого составлял 1-2 недели (рис. 3). Кроме того, у 4 из 5 испытателей была обнаружена значительная динамика пика инсулина (m/z=5633 Да), что объясняется годичной ритмикой его базальной секреции, зависящей от продолжительности светового дня [Демин Д.Б., 2007], что также может быть причиной обнаруженных нами изменений, так как у некоторых обследованных пробы крови были получены в летнее и зимнее время года. 15 Площадь пика фрагмента β-цепи α2-HS-гликопротеина за полгода изменилась незначительно у всех испытателей (рис. 3). То же было справедливо для фрагмента транстиретина (m/z=2902 Да) и аполипопротеина АII (m/z=8675 Да). α2-HS-гликопротеин, фрагмент (m/z=2741 Дa) фон 150 6 месяцев спустя 100 фон 50 50 Площадь пика, усл.ед. Площадь пика, усл.ед. Фрагмент С3-комплемента (m/z=1865 Да) 40 6 месяцев спустя 30 20 10 0 0 1 2 3 4 1 5 2 3 4 5 испытатели испытатели Рис. 3. Изменение фрагментов С3-комплемента и β-цепи α2-HS-гликопротеина за 6 месяцев у 5 здоровых мужчин Анализ профилей проб сыворотки, полученных у 5 здоровых мужчин с интервалом в 12 месяцев, подтвердил полученные результаты: аполипопротеин СI, цистатин С, инсулин и фрагмент высокомолекулярного кининогена составляют наиболее пластичную часть низкомолекулярного протеома сыворотки крови, когда как фрагменты β-цепи α2HS-гликопротеина, относительно транстиретина, стабильными кластерина компонентами. и аполипопротеин Следовательно, АII факт являются увеличения вариабельности аполипопротеина АII с возрастом дополнительно подтверждается незначительными изменениями данного белка во времени у 5 здоровых мужчин (табл. 3). Таким образом, низкомолекулярный субпротеом сыворотки характеризуется значительной групповой и индивидуальной вариабельностью. Так, среднее значение коэффициентов вариации спектров, полученных за 24 часа, составило 16%, за 60 суток – 26,4%, за 6 месяцев - 27,5%, за 12 месяцев – 42,3%. Значение коэффициента вариации между индивидуумами было равно 42,6%. 3. Характеристика протеомного профиля сыворотки крови при воздействии факторов космического полета 3.1. Изменения протеомного профиля после длительных космических полетов (169199 суток) В данном разделе проводился анализ изменений белковой композиции сыворотки после длительных космических полетов. При обработке образцов сыворотки крови космонавтов на магнитных частицах MB WCX было получено, в среднем, 158 MS-пиков в 16 диапазоне масс от 1000 до 17000 Да с отношением сигнал/шум=5. Таким образом, появилась возможность охарактеризовать изменения не только полноразмерных белков, но и их фрагментов, метаболитов и пептидов, динамика которых при воздействии факторов космического полета ранее не оценивалась. На 1-ые и 7-ые сутки после окончания длительной космической экспедиции было обнаружено достоверное снижение полной формы аполипопротеина СI. Данный белок сильно изменяется во времени у здорового человека, что было показано при анализе индивидуальной вариабельности. Однако амплитуда изменений данного белка у здоровых мужчин за 6 месяцев была значительно меньше (рис. 4). Данные изменения могут быть связаны с подавлением синтеза данных белков в печени в период реадаптации ввиду недостатка необходимого количества аминокислот, с одной стороны, и необходимости синтеза мышечных белков – с другой. Так, в работе Stein с соавт. было показано, что синтез фибриногена, а также церулоплазмина, гаптоглобина и С3-комплемента в ранний послеполетный период подавлен [Stein T.P., & Schluter M.D., 2006]. Кроме того, после космического полета продолжительностью 175 суток обнаружено достоверное снижение концентраций в крови лизина, треонина, валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина и других аминокислот по сравнению с предполетными данными [Попов И.Г., Лацкевич А.А., 1984]. Аполипопротеин СI (m /z=6630 Да) 600 500 фон 400 1-ые сутки ПВ 300 7-ые сутки ПВ 200 100 0 1 2 3 4 5 космонавты 6 7 Площадь пика, усл.ед. площадь пика, усл. ед. Аполипопротеин СI (m/z=6630 Да) 600 500 фон 400 300 200 6 месяцев спустя 100 0 1 2 3 4 5 испытатели Рис. 4. Изменение полной формы аполипопротеина СI после длительных космических полетов (n=7) и в привычных условиях жизнедеятельности (n=5) у здоровых мужчин (ПВпериод восстановления). На 1-ые и 7-ые сутки периода восстановления было также обнаружено достоверное увеличение практически всех пиков фрагментов фибриногена (m/z=2661; 2933; 3192; 3241; 3263; 5904 Да), за исключением пика с m/z=1617 Да, который был понижен. Сравнение с контрольным исследованием указывает на то, что обнаруженные сдвиги не являются проявлением индивидуальной вариабельности. Полученные результаты могут быть объяснены либо резкой интенсификацией протеолиза в ранний послеполетный 17 период, либо значительным увеличением концентрации фибриногена, что приводило и к закономерному увеличению его фрагментов. Кроме того, не исключено и сочетание этих реакций. Увеличение концентрации фибриногена наблюдается при острых воспалительных процессах в организме, стрессе [McKenzie J.M. et al., 1963] и снижении уровня физической активности [Козлов А.А. с соавт., 2006]. Некоторые авторы также указывают на увеличение содержания фибриногена после космических экспедиций [Фомин А.Н., 1981; Stein, 2000]. Вероятно, что гемоконцентрация крови и высокая степень эмоционального напряжения космонавтов на заключительном этапе космического полета привели к увеличению содержания фибриногена в крови. На 1-ые сутки периода реадаптации после космических полетов были выявлены разнонаправленные изменения пика С3-комплемента. Вероятно, подобные сдвиги связаны с изменением активности протеолитических ферментов. Ранее было показано, что начальный период адаптации после кратковременных полетов связан с активацией калликреин-кининовой системы [Тигранян Р.А. с соавт., 1987], которая играет важную роль в регуляции активности каскадных протеолитических систем плазмы крови: кининогенеза, гемокоагуляции, фибринолиза, комплемента и ренин-ангиотензиновой системы, обеспечивающих процессы адаптации и защиты гомеостаза организма [Яровая Г.А., 2001]. 3.2. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в эксперименте с 24-часовой антиортостатической гипокинезией (-15°) Данный эксперимент состоял из двух серий – с использованием десмопрессина в качестве средства профилактики неблагоприятных эффектов АНОГ и без применения каких-либо фармакологических препаратов (контрольная серия) с участием одних и тех же испытателей. Следует отметить, что небольшая продолжительность данного эксперимента не вызывала ярко выраженных изменений на уровне синтеза или модификации тех белков, которые охватываются данной технологической платформой. Так, при прямом профилировании образцов сыворотки крови, собранных в ходе АНОГ, было получено, в среднем, 148 пиков в диапазоне масс от 1000 до 17000 при обработке проб магнитными частицами MB WCX. В серии с применением десмопрессина было обнаружено достоверное уменьшение пика тромбоцитарного фактора IV (табл. 4), что свидетельствует о снижении активности системы сосудисто-тромбоцитарного (или первичного) гемостаза в крови. Известно, что десмопрессин повышает активность VIII фактора коагуляции и плазминогена без клинически значимого усиления фибринолиза у здоровых добровольцев [Cash J.D. et al., 1974]. Вероятно, что уменьшение пика тромбоцитарного фактора IV связано с влиянием данного препарата на систему 18 свертывания крови. Некоторые пики, уровень которых изменился в серии в десмопрессином, являются следствием адаптации организма к применяемому воздействию. Увеличение содержания аполипопротеина СI – как полной формы, так и формы с отщепленным треонином и пролином (табл. 4) - является подтверждением развития приспособительных реакций у испытуемых в условиях моделирования микрогравитации. В более ранних исследованиях было продемонстрировано увеличение содержания общего холестерина и понижение содержания липопротеинов высокой плотности в эксперименте со 120-суточной АНОГ [Смирнов К.В. с соавт., 1986; Маркин А.А. с соавт., 2006]. Вероятно, что обнаруженное нами увеличение пиков аполипопротеина СI является компенсаторной реакцией организма, способствующей нормализации уровня холестерина в крови. В контрольной серии эксперимента также наблюдалась тенденция к увеличению пиков данного белка, однако амплитуда изменений была значительно меньше, чем в эксперименте с приемом десмопрессина, и эти сдвиги были недостоверны (табл. 4). Таблица 4. Изменения пиков белков сыворотки крови (n=6) после 24-часовой антиортостатической гипокинезии (-15°) Название белка (m/z пика) Аполипопротеин СI (6630 Да) Аполипопротеин СI с отщепленным треонином и пролином (6432 Да) Тромбоцитарный фактор IV (7765 Да) фибриноген, фрагмент (2661 Да) фибриноген, фрагмент (3241 Да) Медиана Нижний квартиль Верхний квартиль Медиана Нижний квартиль Площадь пика, усл.ед. серия с контрольная десмопрессином серия 24 часа 24 часа фон фон АНОГ АНОГ 235 286* 99** 117 204 281* 76** 103 254 341* 104** 135 79 116* 37** 48 61 85* 30** 36 Верхний квартиль 109 150* 48** 56 Медиана Нижний квартиль Верхний квартиль Медиана Нижний квартиль Верхний квартиль Медиана Нижний квартиль Верхний квартиль 291 270 310 107 88 123 125 91 134 230* 152* 242* 76 56 95 110 100 129 149** 140** 188** 35** 28** 38** 51** 41** 69** 162 150 175 50 34 70 67 62 71 Параметр * - достоверное изменение по сравнению с фоном (критерий Уилкоксона, p<0,05); ** - достоверное изменение между фонами двух серий эксперимента (критерий Уилкоксона, p<0,05) Кроме того, было показано, что отдельные пики достоверно изменялись не в 19 течение суток, а спустя определенное время после окончания эксперимента. Скорее всего, обнаруженные нами изменения являются следствием естественной динамики протеомного профиля, хотя нельзя исключать и возможность развития остаточных реакций организма после завершения эксперимента. Например, было обнаружено резкое снижение пика тромбоцитарного фактора IV, которое наблюдалось после АНОГ с применением десмопрессина и усугубилось за 2 недели периода восстановления. При исследовании индивидуальной вариабельности таких резких изменений в площади пика обнаружено не было. Кроме того, было выявлено значительное уменьшение фрагментов фибриногена (m/z=2661; 3241 Да) и высокомолекулярного кининогена, однако их изменение было сопоставимо с индивидуальной изменчивостью данных белковых фрагментов. 3.3. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией Во время «сухой» иммерсии тело испытуемого, погруженного в воду, отделено от нее специальной водоотталкивающей пленкой [Шульженко И.Б., Виль-Вильямс И.Ф., 1976]. Таким образом, сила опоры оказывается равномерно распределенной по всей поверхности тела согласно закону Архимеда. При прямом профилировании образцов сыворотки крови, собранных в ходе эксперимента с 7-суточной «сухой» иммерсией, было получено, в среднем, 170 пиков в диапазоне масс от 1000 до 17000 Да. На последние сутки эксперимента, как в контрольной группе, так и в группах с профилактикой, было обнаружено достоверное уменьшение фрагментов фибринопептида А. Однако в группе с механической стимуляцией амплитуда изменений была ниже, чем в контрольной группе. Уменьшение данных пиков может свидетельствовать о снижении фибринолитической активности крови во время эксперимента. Кроме того, на 7-ые сутки эксперимента в контрольной группе и группе с механической стимуляцией отмечено изменение другого параметра системы гемостаза: снижение пика пептида-активатора коагуляционного фактора XIII (m/z=3953). Данная тенденция продолжалась и в течение периода восстановления. Полученные данные указывают на сдвиги в системе гемостаза во время иммерсии. В группе с миостимуляцией достоверных изменений данного пептида обнаружено не было. На 7-ые сутки эксперимента достоверно уменьшалась площадь пика белка С4а системы комплемента (m/z=1741 Да) в группах с профилактикой; в контрольной группе также наблюдалась тенденция к уменьшению, но изменения были недостоверны. К 7-ым суткам периода реадаптации площадь данного пика была близка к фоновым значениям. В то же время другой пик С4а белка (m/z=3208 Да) увеличивался на 7-ые сутки «сухой» 20 иммерсии. Разнонаправленные изменения в площади пиков одного белка могут указывать на избирательную активацию протеолитических систем сыворотки крови, что может свидетельствовать о развитии острофазной реакции в ходе эксперимента. Хорошо известно, что белки системы комплемента могут стать объектом действия протеаз при повышении протеолитической активности плазмы крови [Бельтюков П.П. с соавт., 2003]. Кроме того, об активации протеолитических ферментов свидетельствуют данные, полученные нами после завершения длительных космических полетов. 3.4. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в эксперименте со 105суточной изоляцией в гермообъеме Эксперименты с изоляцией здоровых лиц в гермообъекте представляют огромный интерес для характеристики вариабельности протеомного профиля, поскольку условия жизнедеятельности обследуемых в гермообъекте (газовый состав воздуха, температура, влажность, микробиологические условия, двигательная активность, режим дня, рацион питания и потребление воды) – максимально унифицируются для всех участников испытаний. В эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъеме были проанализированы 42 пробы сыворотки крови, полученные в фоновом периоде, во время изоляции и после ее окончания у 6 участников испытаний. Количество пиков в каждом спектре составило, в среднем, 160 в диапазоне масс от 1000 до 17000 Да. Анализ спектров сыворотки крови, полученных в фоновом периоде эксперимента (за 14-15 и за 7-8 суток до начала изоляции) показал, что протеомный профиль менялся незначительно. При сравнении фона (за 7-8 суток до начала эксперимента) и начального периода изоляции (16-17 сутки) были обнаружены изменения по 80 пикам (50% от всех детектированных пиков). Так, было выявлено достоверное увеличение площади пиков фрагментов комплемента С3 (рис. 5). Обнаруженные изменения могут указывать на возможную активацию системы комплемента в начальном периоде изоляции, что может объясняться острой адаптацией организма к условиям гермообъекта. На 16-ые сутки изоляции было также обнаружено уменьшение пика фрагмента кластерина (аполипопротеина J), уровень которого оставался пониженным весь период эксперимента. Кроме того, на 16-ые сутки эксперимента было выявлено уменьшение 2 форм аполипопротеина CI (редуцированной формы с отщепленным треонином и пролином (рис. 5) и полной формы) и аполипопротеина СIII. Вероятно, сдвиги в липидном метаболизме связаны с модификацией привычного рациона питания и ограничением двигательной активности испытателей. По ходу эксперимента прослеживалась высокая вариабельность пиков цистатина С, β2-микроглобулина и аполипопротеина СI, что свидетельствует об их 21 С3-комплемент, фрагмент (m /z=1450 Да) Аполипопротеин СI (-TrePro; m/z=6432 Да) 120 80 40 0 су тк и) 2 из (-7 ол с яц ут ки ия ) из (1 ол 6 де яц нь ия ) из (5 ол 2 де яц нь ия ) (8 5 де нь 7 ) су тк и ПВ 15 су тк и ПВ площадь пика, усл. ед. он ф 1 он ф ф он 160 (-1 4 (-1 4 ф су он тк 2 из и) (-7 ол су яц тк ия из и) (1 ол 6 яц де ия нь из (5 ) ол 2 яц де ия нь (8 ) 5 де нь 7 су ) тк и 15 П В су тк и П В 120 100 80 60 40 20 0 1 площадь пика, усл. ед. высокой пластичности даже в контролируемых условиях жизнедеятельности. период эксперимента период эксперимента Рис. 5. Изменения пиков фрагмента С3-комплемента и аполипопротеина СI с отщепленным треонином и пролином (m/z=6432 Да) в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъеме (ПВ-период восстановления) 3.5. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды (13,53%, 28,26%, 58,21%) Пребывание человека в среде повышенного давления связано не только с профессиональной деятельностью (водолазные и кессонные работы) и формой активного отдыха (дайвинг), но и лечебными процедурами: в случае возникновения специфических заболеваний водолазов и дайверов гипербарическое воздействие (лечебная рекомпрессия, гипербарическая оксигенация) является основным методом лечения. Гипербарическая среда отличается от нормобарической величиной повышенного давления, составом газовой среды, вариациями парциального давления кислорода, длительной изоляцией в замкнутом отсеке барокамеры, отличными от воздушной среды температурой и теплопроводностью, процессами насыщения тканей газами [Попова Ю.А. с соавт., 2008]. Эти особенности могут вызвать мобилизацию регуляторных механизмов, обеспечивающих адаптацию организма к новым условиям обитания, что отражается и на динамике белков крови. После обработки образцов сыворотки крови магнитными частицами MB WCX был получен 151 пик в диапазоне масс от 1000 до 17000 Да. Ввиду небольшого количества испытуемых (4 человека), проводился индивидуальный анализ изменений пиков протеомного профиля. Динамика пиков в эксперименте с изоляцией в гипербарической среде сравнивалась с контрольным экспериментом. В контрольном исследовании были отобраны пробы крови от тех же испытуемых по аналогичной циклограмме спустя 10 месяцев после изоляции в барокамере, поэтому оказалось возможным отделить 22 изменения, непосредственно связанные с условиями эксперимента, от тех, которые являются следствием индивидуальной вариабельности. Показано, что в день начала эксперимента (перед «погружением») у всех испытателей были значительно увеличены площади пиков фрагментов высокомолекулярного кининогена (рис. 6) и С3-комплемента, что, вероятно, связано с «предстартовым напряжением» в ожидании начала воздействия. Ранее было показано, что период, непосредственно предшествующий «погружению», является одним из наиболее стрессогенных этапов экспериментов, моделирующих водолазные спуски различной продолжительности [Попова Ю.А., 2006]. площадь пика, усл. ед. 400 300 200 100 0 фон 1 фон 2 6 сутки 9 сутки 1 сутки ГИ ГИ ПВ Контрольный эксперимент площадь пика, усл. ед. 9-суточная изоляция в гипербарической среде (13,53% O2, 28,26% N2, 58,21% Ar) 400 300 200 100 0 фон 1 сутки 6 сутки 9 сутки 14 сутки период эксперимента период эксперимента Рис. 6. Изменение пика фрагмента высокомолекулярного кининогена (m/z=1945 Да) в условиях гипербарической среды (13,53% O2, 28,26% N2, 58,21% Ar) и в контрольном эксперименте (n=4); ГИ – гипербарическая изоляция; ПВ – период восстановления На 6-ые сутки эксперимента у двух участников обнаружено значительное увеличение аполипопротеина AII и 2 форм аполипопротеина СI, однако на 9-ые сутки изоляции в барокамере и на 1-ые сутки периода восстановления площади данных пиков опускались ниже фоновых значений у всех испытателей. Кроме того, на 9-ые сутки эксперимента и на 1-ые сутки периода восстановления было отмечено резкое уменьшение площадей пиков тканевого активирующего пептида III, пептида-активатора коагуляционного фактора XIII, тромбоцитарного фактора IV, β2-микроглобулина. Так, площадь пика тканевого активирующего пептида III у одного испытателя снизилась более чем в 50 раз (рис. 7). Вероятной причиной снижения уровней данных белков к окончанию эксперимента и в период реадаптации могло быть подавление синтеза белков в печени вследствие ее обратимой дисфункции в условиях повышенного давления [Doran et al., 1985]. Гипоксическая газовая среда также могла быть причиной снижения уровня данных белковых компонентов, что связано с нарушением энергетического обеспечения тканей, приводящим к сдвигам в углеводном, жировом и белковом метаболизме [Сологуб Т.В. с соавт., 2008]. Кроме того, уменьшение аполипопротеинов АII и СI может быть связано и с ограничением двигательной активности испытателей, пребывающих довольно 23 продолжительное время в глубоководном водолазном комплексе ограниченного объема. Контрольный эксперимент 2500 2000 1500 1000 500 0 фон 1 фон 2 6 сутки 9 сутки 1 сутки ГИ ГИ ПВ площадь пика, усл. ед. площадь пика, усл. ед. 9-суточная изоляция в гипербарической среде (13,53% O2, 28,26% N2, 58,21% Ar) 2500 2000 1500 1000 500 0 фон период эксперимента 1 6 9 14 сутки сутки сутки сутки период эксперимента Рис. 7. Изменение пика тканевого активирующего пептида III (m/z=9286 Да) в условиях гипербарической среды (13,53% O2, 28,26% N2, 58,21% Ar) и в контрольном эксперименте (n=4); ГИ – гипербарическая изоляция; ПВ – период восстановления ВЫВОДЫ 1. Технология прямого масс-спектрометрического профилирования в космической биологии и медицине является методом выбора для проведения скринингового анализа пептидов, метаболитов и белков (до 17 000 Да) в оценке изменений субпротеома биологических жидкостей при воздействии факторов космического полета. 2. Префракционирование образцов сыворотки крови на магнитных частицах MB WCX перед прямым масс-спектрометрическим профилированием является информативной и воспроизводимой технологической платформой для характеристики низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови здорового человека (CV=15,9%). 3. Протеомный профиль сыворотки крови здоровых лиц (20-50 лет, n=58) в обычных условиях жизнедеятельности характеризуется значительной групповой вариабельностью (CV=42,6%): большой разброс имеют фрагменты высокомолекулярного кининогена, интер-α-трипсинового ингибитора, С3 и С4а фрагменты комплемента, аполипопротеин СI, тромбоцитарный фактор IV, β2-микроглобулин и цистатин С. Дисперсия пиков высокомолекулярного кининогена, интер-α-трипсинового ингибитора, аполипопротеинов AII и CIII возрастает с увеличением возраста. 4. Компоненты протеомного профиля сыворотки крови здорового человека могут значительно изменяться во времени: среднее значение коэффициента вариации спектров, полученных за 24 часа, составило 16%, за 60 суток – 26,4%, за 6 месяцев - 27,5%, за 12 месяцев – 42,3%. Наиболее пластичными белками низкомолекулярного субпротеома являются аполипопротеин СI, инсулин, цистатин С, а также фрагмент высокомолекулярного кининогена (m/z=1945 Да). Индивидуальные изменения пластичной 24 части субпротеома (до 17 000 Да) могут маскировать эффекты воздействий, предъявляемых организму здорового человека. 5. Стабильную часть протеомного профиля сыворотки крови здорового человека в условиях обычной жизнедеятельности составляют аполипопротеин АII, фрагменты кластерина и транстиретина, что делает их ценными маркерами временной деградации белковых компонентов сыворотки при ее длительном хранении в банке биоматериала, а также косвенными маркерами эффективности терапии. 6. Учет параметров групповой вариабельности и темпов проявления индивидуальной пластичности позволяют выделить функциональные сдвиги белковой композиции сыворотки крови после длительных космических полетов и модельных экспериментов. Показано, что эти условия вызывают изменения пиков белков «острой фазы» (β2микроглобулин, цистатин С) и липидного обмена (аполипопротеины CI, СIII, AII). Как в периоде реадаптации после завершения космических полетов, так и в модельных экспериментах, регистрируются сдвиги активности протеолитических систем крови, что приводит к изменению паттерна фрагментов белков. Характер изменений определяется условиями конкретного эксперимента. 7. В условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды наблюдались наиболее значительные изменения низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови, проявляющиеся в уменьшении площадей пиков аполипопротеина AII, аполипопротеина СI, тканевого активирующего пептида III, пептида-активатора коагуляционного фактора XIII, тромбоцитарного фактора IV, β2-микроглобулина, что связано с нарушением их синтеза вследствие развития обратимой дисфункции печени в условиях гипоксии и повышенного давления. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Выбор оптимальной методологической платформы для профилирования сыворотки крови здорового человека. / Пахарукова Н.А. // Материалы VII конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики и приуроченной к 45-летию ГНЦ РФ ИМБП РАН: Тезисы докладов. – Москва, 2008. – C. 49-50. 2. Исследование протеома сыворотки крови здорового человека в условиях гипербарии и дыхания кислородно-аргоновой смесью. / Пахарукова Н.А. // Материалы VIII конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики: Тезисы докладов. – Москва, 2009. – C. 38. 3. Оптимизация метода профилирования сыворотки крови здорового человека. / Пахарукова Н.А., Пастушкова Л.Х., Трифонова О.П., Пятницкий М.А., Власова М.А., Никитин И.П., Мошковский С.А., Николаев Е.Н., Ларина И.М. // Физиология человека. – 2009. - Т. 35. - № 3. - C. 101-107. 25 4. Changes of healthy human serum proteome profile during 7-day «dry» immersion. / Pakharukova N.A., Pastushkova L.H., Larina I.M. // 30th Annual International Gravitation Physiology Meeting: Book of Abstracts. - Xi'an, China, 2009. - P.56. 5. Changes of healthy human serum proteome profile after long space flights. / Pastushkova L.H., Pakharukova N.A., Larina I.M., Morukov B.V. // 30th Annual International Gravitation Physiology Meeting: Book of Abstracts. - Xi'an, China, 2009. - P.47. 6. Changes of serum proteome profile during 7-day "dry" immersion / Pakharukova N., Pastushkova L., Trifonova O., Larina I. // 17th IAA Human in Space Symposium: Book of Abstracts. - Moscow, Russia, 2009. – P.98. 7. Выбор статистического подхода для анализа протеомных профилей сыворотки крови здорового человека. / Пахарукова Н.А., Носовский А. М., Пастушкова Л.Х., Трифонова О.П., Ларина И.М. // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2009. - Т. 43. - № 4. - C. 60-66. 8. Исследование нормальной вариабельности протеомного профиля сыворотки крови здорового человека. / Пахарукова Н.А., Пастушкова Л.Х., Ларина И.М. // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды»: Тезисы докладов. - Казань, 2009. - С. 129. 9. Study of a native variability of serum proteome profile. / Pakharukova, N.A., Pastushkova, L.Kh., Trifonova, O.P., Valeeva, O.A., Larina I.M. // 3rd Central and Eastern European Proteomics Conference: Book of Abstracts. - Budapest, Hungary, 2009. - P. 46. 10. Популяционная протеомика плазмы здоровых доноров. / Бессонов В.В., Васильев А.В., Хотимченко С.А., Батурин А.К., Эллер О.И., Передеряев Ю.В., Ведищева Ю.В., Байгарин Е.К., Мошковский С.А., Карпова М.А., Мельник С.А., Сычева А.М., Хряпова Е.В., Фомченкова Е.Я., Ларина И.М., Трифонова О.П., Пастушкова Л.Х., Пахарукова Н.А., Валеева О.А., Доброхотов И.В. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: Сборник тезисов. - Москва, 2009. – С. 201-202. 11. Исследование протеомного профиля сыворотки крови здорового человека в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды. / Пахарукова Н.А., Пастушкова Л.Х., Попова Ю.А., Трифонова О.П., Ларина И.М. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. - Т.148. - №1. - C. 42-45. 12. Changes of human serum proteome profile during 7-day "dry" immersion. / Pakharukova N., Larina I., Pastushkova L., Grigoriev A. // Acta Astronauticа, 2010, Epub.: http://dx.doi.org/10.1016/j.actaastro.2009.10.014. 13. Прямое протеомное профилирование сыворотки крови в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъеме. / Пахарукова Н.А. // Материалы IX конференции молодых ученых специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики: Тезисы докладов. – Москва, 2009. – C. 60. 14. Direct proteome profiling of human serum during 105-day isolation. / Pakharukova N.A., Pastushkova L.Kh., Larina I.M. // 31st Annual International Gravitation Physiology Meeting: Book of Abstracts. - Trieste, Italy, 2010. - P. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CV - коэффициент вариации MALDI-TOF MS - время-пролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) MB HIC - магнитные частицы, функционирующие по принципу обращенно-фазового взаимодействия (magnetic beads based hydrophobic interaction chromatography) MB IMAC Cu - магнитные частицы, функционирующие по принципу иммобилизованной металион аффинной хроматографии (magnetic beads based immobilized metal ion affinity chromatography) MB WAX - магнитные частицы, функционирующие по принципу слабого анионообменника (magnetic beads based weak anion-exchange chromatography) MB WCX - магнитные частицы, функционирующие по принципу слабого катионообменника (magnetic beads based weak cation-exchange chromatography) MS/MS - тандемная масс-спектрометрия m/z - отношение массы к заряду, Дальтон PTMs – посттрансляционныe модификации белков (post translation modifications) АНОГ - антиортостатическая гипокинезия ТФУ – трифторуксусная кислота
