утверждена - НВО Иммунотех

УТВЕРЖДЕНА
Приказом Росздравнадзора
от 10 декабря 2007 г. № 4602-Пр/07
"УТВЕРЖДАЮ"
Генеральный директор
ЗАО “НВО Иммунотех”
_____________________ А.П. Осипов
"__21_" __августа___ 2007 г.
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕСТОСТЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
(ИммуноФА-ТС)
Регистрационное удостоверение № ФСР 2007/01391 от 10 декабря 2007 г.
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Набор ИммуноФА-ТС предназначен для количественного определения содержания
тестостерона (ТС) в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного
анализа (ИФА).
ТС является наиболее важным андрогенным и природным анаболическим гормоном
мужчин и женщин. У мужчин основная часть ТС образуется в семенниках клетками Лейдига,
меньшее количество вырабатывается клетками сетчатого слоя коры надпочечников и при
трансформации из предшественников в периферических тканях. У женщин этот гормон секретируется яичниками и корой надпочечников, являясь промежуточным продуктом стероидного обмена. Нормальная секреция ТС необходима для поддержания репродуктивной
функции у мужчин. ТС контролирует сперматогенез, функцию предстательной железы и потенцию. У женщин секреция ТС зависит от фазы менструального цикла – максимальное значение достигается в лютеиновой фазе и в период овуляции. Секреция ТС надпочечниками
резко снижается у обоих полов после 50-60 лет.
У мужчин недостаток андрогенов может вызвать замедленное половое созревание,
бесплодие и импотенцию. У девочек избыток ТС в организме всегда является следствием
нарушения функции надпочечников, а гиперсекреция у женщин может быть причиной гирсутизма с вирилизмом разной степени, часто в сочетании с олигоменореей, аменореей и бесплодием.
Количественное определение содержания тестостерона в сыворотке крови человека
может быть использовано для оценки функционального состояния репродуктивной системы,
а также при некоторых заболеваниях, связанных с гормональными нарушениями.
Набор рассчитан на проведение анализа в дубликатах 41 неизвестного образца, 6 калибровочных проб и 1 пробы контрольной сыворотки, всего 96 определений.
2. ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА
Принцип метода основан на конкуренции тестостерона из измеряемой пробы и тестостерона, меченного пероксидазой, за центры связывания специфичных к тестостерону антител, иммобилизованных на поверхности лунок полистиролового планшета. Количество связавшегося конъюгата тестостерон-пероксидаза выявляют с помощью раствора субстрата
(тетраметилбензидина с добавлением перекиси водорода). Интенсивность окраски продукта
окисления субстрата обратно пропорциональна концентрации тестостерона, содержащегося
в анализируемом образце.
3. СОСТАВ НАБОРА:
- планшет 96-луночный полистироловый, стрипованный, сенсибилизированный моноклональными антителами к тестостерону, готовый для использования - 1 шт.;
- калибровочные пробы на основе сыворотки крови теленка, содержащие известные
количества тестостерона: 0; 1,0; 3,0; 10; 30 и 60 нмоль/л; концентрации ТС в калибровочных
пробах могут незначительно изменяться от серии к серии, точные значения концентраций
указаны на этикетках флаконов, готовые для использования – 6 фл. (по 0,5 мл);
- контрольная сыворотка на основе сыворотки крови человека с известным содержанием тестостерона, готовая для использования - 1 фл. (0,5 мл);
- конъюгат тестостерона с пероксидазой, готовый для использования - 1 фл. (12,5 мл);
- фосфатно-солевой буферный раствор с добавлением твин-20, рН 7,0+0,5, концентрированный - 1 фл. (15 мл);
- раствор субстрата на основе 3,3`,5,5`-тетраметилбензидина (ТМБ) с добавлением перекиси водорода, готовый для использования - 1 фл. (12,5 мл);
- стоп-реагент, готовый для использования - 1 фл. (15 мл);
- пленка для заклеивания планшета - 1 шт.
4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Специфичность. Перекрестная реакция антител к тестостерону с другими стероидами
приведена в таблице.
Стероид
Перекрестная реакция, %
5-Дигидротестостерон
9
11-Гидрокситестостерон
1
5-5-Андростан-3,17-диол
1
Дегидроэпиандростерон сульфат
0,01
Дегидроэпиандростерон
0,008
Андростерон
0,08
Прогестерон
0,66
11-Гидроксипрогестерон
0,03
Дезоксикортикостерон
0,03
Кортикостерон
0,03
Чувствительность. Минимальная концентрация тестостерона, определяемая с помощью набора, составляет не более 0,2 нмоль/л.
Воспроизводимость результатов. Коэффициент вариации результатов определения
содержания тестостерона в одном и том же образце сыворотки крови не превышает 8%.
Точность. Процент "открытия" составляет 90-110%.
Линейность. Линейность определения в диапазоне концентраций 1,0-60 нмоль/л составляет 90-110 %.
Клиническая проверка набора. Концентрация тестостерона, исследованная с помощью набора ИммуноФА-ТС, в сыворотке крови здоровых женщин составила менее 4,0
нмоль/л, в сыворотке крови здоровых мужчин: 8,5 - 30 нмоль/л.
Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора уточнить значения
концентраций ТС, соответствующие нормальным для обследуемого контингента.
5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Потенциальный риск применения набора - класс 2а.
Все компоненты набора, за исключением стоп-реагента, в используемых концентрациях являются нетоксичными.
Стоп-реагент действует на кожу и слизистые прижигающим образом, вызывая раздражение и ожоги, поэтому в случае попадания на кожные или слизистые покровы следует
его немедленно тщательно смыть большим количеством проточной воды.
При работе с набором и утилизации отходов следует соблюдать "Правила устройства,
техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарноэпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва,
1981 г.).
При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые
перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита и другие возбудители вирусных инфекций.
6. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ:
- Фотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в лунках планшета при длине волны 450 нм;
- термостат суховоздушный, поддерживающий температуру +(37+1)оС;
- секундомер;
- шейкер;
- пипетки полуавтоматические одноканальные с переменным объемом со сменными
наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 2-20 мкл, 50-200 мкл, 200-1000
мкл;
- пипетка полуавтоматическая многоканальная с переменным объемом со сменными
наконечниками, позволяющая отбирать объем жидкости 50-250 мкл;
- стакан химический или колба мерная вместимостью 300 мл;
- бумага фильтровальная;
- вода дистиллированная;
- перчатки резиновые или пластиковые.
7. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
Перед проведением анализа компоненты набора и исследуемые образцы сыворотки
крови следует выдержать при комнатной температуре (+20-250С) в течение времени не менее 30 мин.
Построение калибровочной кривой необходимо проводить для каждой серии
анализов.
7.1. Приготовление рабочего раствора фосфатно-солевого буферного раствора
(ФСБР).
Содержимое флакона с концентратом фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР)
перенести в мерный стакан вместимостью 300 мл, дважды ополоснуть флакон дистиллированной водой, все промывные воды объединить с разведенным ФСБР и довести общий объем раствора до 300 мл дистиллированной водой.
Полученный рабочий раствор ФСБР можно хранить в закрытой емкости при температуре +(2-8)оС не более 7 дней.
Примечание. При хранении ФСБР могут образовываться кристаллы, поэтому перед
отбором аликвоты ФСБР необходимо слабо подогреть флакон с буферным раствором, поместив его в водяную баню или термостат при температуре +37оС до полного растворения кристаллов.
8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
8.1. Вставить в свободную рамку необходимое количество лунок для калибровочных
проб, исследуемых образцов и контрольной сыворотки для постановки в дубликатах. Неиспользуемые стрипы необходимо тщательно заклеить пленкой для заклеивания планшетов и
хранить в упаковке при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности набора.
A
B
C
D
E
F
G
H
1
КП1
КП2
КП3
КП4
КП5
КП6
КС
ИС
2
КП1
КП2
КП3
КП4
КП5
КП6
КС
ИС
3
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
4
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
5
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
6
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
7
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
8
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
9
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
10
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
11
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
12
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
ИС
Рис. 1. Схема заполнения лунок планшета.
8.2. В два ряда лунок планшета внести в дубликатах по 20 мкл калибровочных проб
(КП), начиная с минимальной концентрации.
8.3. Внести в две лунки планшета по 20 мкл контрольной сыворотки (КС).
8.4. В оставшиеся лунки внести в дубликатах по 20 мкл исследуемых образцов сывороток крови (ИС). Процедуру внесения образцов следует выполнять как можно быстрее.
8.5. Во все лунки планшета внести по 100 мкл конъюгата. Конъюгат вносить в лунки
планшета в той же последовательности, что и калибровочные пробы, контрольную сыворотку и исследуемые образцы. Продолжительность операции не должна превышать 15 минут.
8.6. Тщательно перемешать содержимое лунок, поместив планшет на шейкер, при
комнатной температуре +(20-25оС) в течение 2-3 минут.
8.7. Закрыть планшет крышкой или пленкой для заклеивания планшета и инкубировать при температуре +37оС в течение 1 часа, избегая попадания прямого солнечного света.
8.8. Содержимое лунок удалить декантированием. Затем отмыть планшет. Для этого в
каждую лунку планшета внести по 250 мкл рабочего раствора ФСБР (см п. 7.1), встряхнуть
на шейкере в течение 1 минуты, после чего удалить содержимое лунок декантированием.
Процедуру повторить еще 2 раза. При автоматической промывке необходимо вручную удалить содержимое лунок планшета, только после этого приступить к отмывке с помощью
прибора, внося в каждую лунку планшета 300–350 мкл рабочего раствора ФСБР. По окончании промывки тщательно удалить остатки жидкости из лунок, несколько раз резко вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.
8.9. Во все лунки планшета внести по 100 мкл раствора субстрата в той же последовательности, что и конъюгат. Инкубировать планшет при температуре +37оС в течение 10-15
минут, избегая попадания прямого солнечного света.
Примечание. При внесении раствора субстрата рекомендуется всегда использовать
новые наконечники.
8.10. Внести во все лунки планшета с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата, по 100 мкл стоп-реагента. Тщательно перемешать содержимое
лунок, поместив планшет на шейкер, при комнатной температуре в течение 1 минуты.
8.11. Измерить оптическую плотность в лунках планшета при длине волны 450 нм.
Длительность процедуры измерения оптической плотности не должна превышать 15 минут.
9. РАСЧЕТЫ
9.1. Построить калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации тестостерона в калибровочных пробах. Образец калибровочного графика приведен на
рис. 2.
2
ОП, 450 нм
1,5
1
0,5
0
0
20
40
60
80
Тестостерон, нмоль/л
Рис.2. Типичный калибровочный график, полученный с
использованием набора ИммуноФА-ТС.
9.2. Рассчитать средние арифметические значения показателей оптической плотности контрольной сыворотки и исследуемых образцов и по калибровочному графику определить концентрацию тестостерона.
9.3. При построении калибровочного графика и определении содержания тестостерона в исследуемых образцах с помощью автоматического анализатора иммуноферментных
реакций рекомендуется использовать кусочно-линейный метод аппроксимации.
9.4. Для выражения концентрации тестостерона в мкг/л значения, полученные в
нмоль/л, следует умножить на коэффициент пересчета 0,288.
10. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
10.1. Набор реагентов ИммуноФА-ТС должен храниться в упаковке предприятияизготовителя при температуре +(2-8)оС в течение всего срока годности - 12 месяцев. Допускается хранение набора при температуре до +25оС не более 5 суток. Замораживание компонентов набора не допускается.
10.2. Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре +(20-25оС) в течение времени не менее 30 минут.
10.3. Неиспользованные стрипы после вскрытия упаковки необходимо тщательно заклеить пленкой для заклеивания планшета и хранить в упаковке при температуре +(2-8)оС в
течение всего срока годности набора.
10.4. Калибровочные пробы, контрольную сыворотку и конъюгат после вскрытия
флаконов можно хранить при температуре +(2-8)оС не более 2 месяцев, остальные компоненты набора – в течение всего срока годности.
10.5. Рабочий раствор промывочного буфера можно хранить при температуре +(2-8)оС
в закрытой емкости не более 7 дней.
10.6. В случае дробного использования набора построение калибровочного графика
необходимо проводить для каждого независимого эксперимента, а также рекомендуется
определение концентрации ТС в контрольной сыворотке.
10.7. После постановки анализа необходимо убрать флаконы с оставшимися калибровочными пробами, контрольной сывороткой и конъюгатом в темное место (холодильник).
10.8. До проведения анализа возможно хранение образцов сыворотки крови при температуре +(2-8)оС не более 3 дней или в замороженном состоянии при температуре минус
20оС не более 2 месяцев.
Допускается только однократное замораживание и размораживание образцов сывороток крови.
10.9. Исключается использование для анализа гемолизированных и мутных образцов
сывороток крови.
10.10. Для отбора и добавления реагентов и анализируемых проб необходимо использовать полуавтоматические пипетки со сменными наконечниками, аттестованные на точность по значению средней дозы и воспроизводимость результатов пипетирования.
10.11. Не допускается использование раствора субстрата и стоп-реагента из наборов,
производимых другими фирмами.
10.12. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
По вопросам, касающимся качества набора ИммуноФА-ТС, следует обращаться в
ЗАО «НВО Иммунотех», почтовый адрес: 119991, Москва, Ленинские Горы, МГУ, д. 1,
строение 11 А, тел. 939-46-83, факс 932-88-96; электронный адрес: support@immunotek.ru;
http://www.immunotek.ru.
и в Институт стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «НЦЭСМП»
Росздравнадзора по адресу: 117246, Москва, Научный проезд, д.14а, тел. 120-60-95.