На правах рукописи - Институт цитологии и генетики СО РАН
advertisement
На правах рукописи КАРПОВА ЕВГЕНИЯ КОНСТАНТИНОВНА РОЛЬ ЭКДИСТЕРОИДОВ В РАЗВИТИИ СТРЕССРЕАКЦИИ И КОНТРОЛЕ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ DROSOPHILA В НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ УСЛОВИЯХ. Генетика - 03.00.15 АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск, 2008 Работа выполнена в лаборатории генетики стресса, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент, Грунтенко Наталия Евгеньевна, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Маркель Аркадий Львович, кандидат биологических наук Дубовский Иван Михайлович, Ведущее учреждение: Томский государственный университет, г. Томск Защита диссертации состоится “____”____________ 2008 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д – 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (3832)33-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан “____”_______________ 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев 1 Актуальность проблемы. Непрерывный рост социально-экологической напряженности на планете привлекает всё большее внимание исследователей к проблеме стресса. Эффективным способом защиты от неблагоприятных факторов среды является нейроэндокринная стресс-реакция, cвойственная всем представителям царства животных. Она позволяет им либо адаптироваться к неблагоприятным условиям, либо свести к минимуму повреждающее воздействие стрессора, если первое невозможно (обзоры: Jancovic-Hladni, 1991; Rauschenbach, 1991; Раушенбах, 1997; Грунтенко, Раушенбах, 2004). Таким образом, изучение адаптационных механизмов, обеспечивающих стрессустойчивость, является одной из важнейших задач современной биологии. Показано, что центральными звеньями стресс-реакции имаго насекомых являются биогенные амины, ювенильный гормон (ЮГ) и экдистероиды (Orchard et al., 1981; Davenport, Evans, 1984; Hirashima et al., 1993, 2000а,b; Rauschenbach et al., 1993, 1995; Раушенбах и др., 2000). Однако до сих пор остаётся неясным, существует ли компонент стресс-реакции (триггер), запускающий каскад изменений в остальных компонентах, или эти системы отвечают на неблагоприятные условия независимо друг от друга? Ранее на роль триггера стресс-реакции были протестированы биогенные амины - дофамин (ДА) и октопамин (ОА), белки теплового шока, и ЮГ (Rauschenbach et al., 1993, 1995, 1996; Gruntenko et al., 1999, 2003b; Раушенбах и др., 2001). Однако, как оказалось, ни один из этих важнейших компонентов стресс-реакции не является пусковым. Известно, что 20Э играет чрезвычайно важную роль в развитии, размножении и других жизненно важных функциях насекомых. Совместно с ЮГ он контролирует переход от одной онтогенетической стадии к другой: при высоком титре ЮГ происходит личиночно-личиночная линька, при снижении титра ЮГ и резком повышении содержания 20Э наступает метаморфоз, а в отсутствие ЮГ осуществляется линька в имаго (обзоры: Hammock, 1985; Zdarek, 1985; Riddiford, 1994). У имаго насекомых 20Э и ЮГ выполняют функции гонадотропинов: регулируют репродуктивную функцию самок Drosophila, инициируя синтез желточных белков (ЖБ) в жировом теле после вылета имаго, поддерживая затем его на определенном уровне и контролируя поглощение ЖБ ооцитами. Однако, 2 до сих пор не существует единого мнения о вкладе каждого из этих гормонов в регуляцию репродуктивной функции насекомых (оогенеза, в частности). В конце 1999 года Соллер с соавторами (Soller et al., 1999) на основании результатов экспериментов по обработке самок D. melanogaster экзогенными ЮГ и 20Э впервые выдвинули гипотезу о том, что для нормального течения оогенеза необходимо сохранение баланса 20Э и ЮГ. Результаты исследования влияния теплового стресса на оогенез D. virilis (Gruntenko et al., 2003а) дали подтверждение этой гипотезе и позволили авторам предположить что 20Э контролирует ранние, а ЮГ поздние стадии развития ооцитов дрозофилы. Цель работы: Установить, какую роль играет 20-гидроксиэкдизон в развитии нейрогормональной стресс-реакции Drosophila и в контроле репродуктивной функции самок в условиях стресса. Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи: 1. Исследовать влияние мутации ecdysoneless1, нарушающей синтез 20гидроксиэкдизона, на развитие стресс-реакции Drosophila и выяснить, является ли 20-гидрокиэкдизон запускающим звеном реакции. 2. Исследовать влияние пищевого стресса на оогенез и плодовитость линий D. virilis дикого типа и мутантной, с изменённым уровнем 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона. 3. Изучить воздействие экзогенных 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона на плодовитость D. virilis дикого типа в нормальных условиях и при пищевом стрессе. 4. Изучить механизм взаимодействия 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона в контроле репродуктивной функции Drosophila. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проанализировано развитие стресс-реакции у самок линии ecd1, несущих рецессивную температурочувствительную мутацию ecdysoneless1 - она прерывает синтез 20Э при рестриктивной температуре. Установлено, что отсутствие 20Э не препятствует инициации стресс-реакции, хотя значительно изменяет ее интенсивность, т.е. 20Э является важным, но не пусковым звеном стресс-реакции дрозофилы. Впервые обнаружено, что пищевой стресс вызывает у самок дрозофилы нарушения в ходе оогенеза: деградацию части ранних вителлогенических 3 ооцитов, задержку их созревания и накопление зрелых ооцитов. Продемонстрировано, что эти изменения являются следствием изменений в метаболизме ЮГ и 20Э в ответ на действие стрессора, причем 20Э контролирует вителлогенические стадии оогенеза, а ЮГ – созревание и откладку яиц. Впервые in vivo показано, что у самок дрозофилы существует механизм взаиморегуляции ЮГ и 20Э, опосредованной через систему метаболизма ДА. Впервые установлено, что экспериментальное увеличение титра 20Э или ЮГ в нормальных условиях приводит к различным изменениям в репродуктивной функции самок дрозофилы: повышение титра 20Э снижает уровень плодовитости, не останавливая откладку яиц, а увеличение титра ЮГ вызывает прекращение откладки яиц, не влияя на уровень плодовитости. Научно-практическая значимость работы. Результаты работы дают представление о структуре нейроэндокринного механизма, контролирующего приспособляемость насекомых к неблагоприятным условиям, которое может быть использовано для создания новых видов инсектицидов, безопасных для млекопитающих. Апробация работы. Результаты исследования были представлены на IV Европейском симпозиуме по экофизиологии беспозвоночных (Санкт-Петербург, 2001), на конференции «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), на III Международной научной конференции молодых ученых (Алматы, Казахстан, 2003), на 18ой Европейской конференции по исследованиям на дрозофиле (Геттинген, Германия, 2003), на IV конференции молодых ученых, посвященной М.А. Лаврентьеву (Новосибирск, 2004), на III съезде ВОГИС (Москва, 2004), на VIII Международной конференции по ювенильному гормону (Кингз Бич, 2004), на XVI Международном симпозиуме по экдизону (Гент 2006), на XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на IX Международной конференции по ювенильным гормонам (Йорк, 2007) и на 2 Международном конгрессе по исследованию стресса (Будапешт, 2007). Вклад автора. Основная часть экспериментов проведена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам лаборатории генетики стресса Института цитологии и генетики СО РАН Адоньевой Н.В., Фаддеевой Н.В., Ченцовой Н.А., Богомоловой Е.В, а также 4 Сапрыкиной З.А. и доктору Иване Газиовой (Университет Южной Богемии, Чехия) за любезно предоставленную линию ecd1. Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н. Н.Е. Грунтенко и заведующей лабораторией д.б.н. И.Ю. Раушенбах. Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ (из них 7 статей). Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы, который состоит из 256 наименований. Работа изложена на 158 страницах, содержит 25 рисунков и 3 таблицы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. Исследование проведено на двух моделях. I. Линии Drosophila melanogaster: дикого типа – Canton S и линия ecdysoneless1, несущая рецессивную термочувствительную мутацию, прерывающую синтез 20Э при рестриктивной температуре (29оС) II. Линии D. virilis, контрастные по реакции на действие теплового стресса: линия дикого типа 101 и линия 147, несущая мутации brick (розовые глаза), broken (прервана задняя поперечная жилка крыла) и detached (недоразвитие продольных жилок крыла) в хромосоме-2, температурочувствительную условную личиночную леталь в хромосоме-6. Культуры линий выращивали на стандартной питательной среде (Раушенбах, Лукашина, 1984) при температуре 25оС и плотности 20 личинок на 7 мл среды. Синхронизацию культур проводили по вылуплению личинок и по вылету имаго. Условия стрессирования. Мух стрессировали высокой температурой (38С, экспозиция указана в соответствующих разделах) или голоданием (содержание на обедненной питательной среде: 20г агара и 4г сахарозы на 1л воды). Биохимические методы. Содержание ДА измеряли флюориметрическим методом Майкеля (Maiсkel et al., 1968), модифицированным Кудрявцевой и Бакштановской (1989), измерение содержания 20Э проводили по методу Вайнрайта с соавторами (Wainwright et al., 1997), измерение деградации ЮГ проводили при помощи модифицированного (Rauschenbach et al., 1991) метода Хэммока и Спаркса (Hammock, Sparks, 1977). Анализ плодовитости при голодании и экспериментальном изменении 5 уровня 20Э осуществляли, как описано Раушенбах и др. (2005), при голодании и аппликации ЮГ - как описано Раушенбах и др (2004). Приготовление препаратов яичников, окрашивание по Хечсту. Стадии развития ооцитов определяли в соответствии с King (1970), окрашивая яичники по Хечсту в модификации Cоллера с соавторами (Soller et al., 1999) и анализируя препараты с использованием флюоресцентного микроскопа Zeiss Axioskop 2 Plus (программное обеспечение Axio Vision). Достоверность результатов оценивали, используя t-критерий Стьюдента. Стресс-реактивность рассчитывали, как процент изменения признака у каждой стрессированной особи по отношению к среднему в контроле. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Роль 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона в регуляции оогенеза D. virilis в нормальных условиях и при голодании. Ранее в лаборатории И.Ю. Раушенбах было показано, что тепловой стресс (38оС, 4 ч) вызывает у самок дикого типа (101) D. virilis накопление зрелых ооцитов, 24 ч задержку в откладке яиц, деградацию вителлогенических ооцитов и снижение плодовитости в течение нескольких суток; деградация ооцитов и снижение плодовитости наблюдались и у самок мутантной линии (147), однако накопления зрелых яиц и прекращения их откладки у мутантных самок зафиксировано не было (Rauschenbach et al., 1996; Gruntenko et al., 2003a). Исходя из этих результатов Грунтенко с соавторами (Gruntenko et al., 2003a) предположили, что деградация ранних вителлогенических ооцитов у D. virilis происходит под влиянием 20Э, титр которого возрастает у самок обеих линий (Раушенбах и др., 2000а; Gruntenko et al., 2003a); накопление же ооцитов на 14 стадии развития у самок дикого типа происходит в ответ на увеличение титра ЮГ при тепловом стрессировании, тогда как мутантные самки не накапливают зрелые яйца, так как их система метаболизма ЮГ не отвечает изменениями на тепловой стресс (Rauschenbach et al., 1995; Gruntenko et al., 2003a). Поскольку мутация 147 линии изначально была обнаружена, как температурочувствительная личиночная леталь (Raushenbach et al., 1984), можно было ожидать, что при стрессирующих воздействиях иной природы (например, при голодании), реакция системы метаболизма ЮГ у самок 147 линии окажется 6 подобной той, которая наблюдается у самок дикого типа. Для проверки этого предположения мы исследовали ЮГ деградацию и оогенез у самок обеих линий под воздействием голодания. Таблица 1. Динамика ЮГ-гидролизующей активности при голодании у самок Drosophila virilis дикого типа (101) и мутантов (147). длительность голодания, ч Гидролиз ювенильного гормона, пмоль/мин/муху 101 147 контроль 13,1±0,45 11,5±0,67 6 9,3±0,35 7,7±0,48 12 9,2±0,36 8,3±0,79 18 8,0±0,29 7,3±0,44 24 9,2±0,34 7,6±0,28 Примечание: Для каждой точки сделано 8-13 измерений В таблице 1 представлены результаты измерения уровня деградации ЮГ при голодании у самок линий 101 и 147. Видно, что голодание сопровождается резким снижением уровня деградации ЮГ у особей обеих линий (различия с контрольным уровнем достоверны для всех точек для самок линии дикого типа при p<0,001 и для мутантных самок при p<0,01). Как и ожидалось, мутация 147 линии не мешает отвечать ей на голодание снижением деградации (повышением уровня) ЮГ (табл. 1) и если накопление зрелых яиц при стрессе обусловлено именно повышением уровня ЮГ, то при голодании у самок линии 147 можно ожидать изменения на поздних стадиях оогенеза, которые отсутствуют при тепловом стрессе (Gruntenko et al., 2003a). Действительно, данные по распределению ооцитов по стадиям 3-суточных самок линий 147 и 101 D. virilis при голодании весьма сходны (рис.1): у самок обеих линий после суточного голодания наблюдается значительное снижение доли ооцитов 9-13 стадий (различия достоверны при p<0.001 для всех стадий у обеих линий), сопровождающееся накапливанием зрелых яиц (14 стадии) (различия достоверны при p<0.001 для обеих линий). Необходимо подчеркнуть, что для линии дикого типа при тепловом стрессировании были получены аналогичные результаты (Gruntenko et al., 2003a). Поскольку Соллер с соавторами (Soller et al., 1999) показали, что обработка самок D. melanogaster 20Э вызывает деградацию ранних вителлогенических ооцитов, мы предположили, что деградация ооцитов при голодании вызывается повышением титра 20Э. Данные, представленные на рисунке 2, подтвердили это: титр гормона после 12ч голодания вдвое превышает его уровень у кормленных 7 самок (различия достоверны при p<0,001). 101 контроль 101 голод 147 контроль 147 голод ооциты/ число ооцитов 8-14 стадий (%) содержание 20Э (пкг/муха) 25 20 15 10 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 5 8 9 10 11-13 14 стадии ооцитов 0 контроль голод Рис 2. Влияние 12 час голодания на содержание 20Э у 3 суточных самок линии 101 D. virilis. Рис. 1. Влияние голодания на вклад каждой стадии развития ооцита в формирование общего пула яйцевых камер стадий 8-14 у 3-суточных самок 101 и147 линий D. virilis. Примечание: 8 пар яичников использовали в каждой экспериментальной группе. Роль 20-гидроксиэкдизона и ювенильного гормона в регуляции плодовитости D. virilis в нормальных условиях и при голодании. Исходя из изменений, наблюдаемых в метаболизме 20Э и ЮГ и оогенезе при голодании (таблица 1, рис. 1, 2), можно было ожидать появления изменений и в плодовитости. Действительно, результаты, представленные на рисунке 3 демонстрируют наличие таких изменений в плодовитости самок 101 и 147 линий D. virilis. Отчетливо видно, что в нормальных условиях мутантная линия начинает размножаться на 2 дня позже линии дикого типа и плодовитость её значительно снижена. При голодании у самок обеих линий наблюдается прекращение откладки яиц на 1 сутки, затем повышение плодовитости - на 7 сутки после вылета (различия с контролем достоверны для 147 линии при p<0,001 и для самок 101 линии при p<0,01), и вслед за этим достоверное ее снижение, происходящее на 8-е сут после вылета у самок 101 (p<0,01) и на 9-е сут – у самок 147 (p<0,001). Таким образом голодание, в отличие от теплового воздействия (Rauschenbach et al., 1996), вызывает у мутантных самок изменения в плодовитости, аналогичные изменениям у самок дикого типа. Возник вопрос, какой из гонадотропинов вызывает прекращение откладки яиц при голодании? Чтобы выяснить это, были оценены: плодовитость кормленных 8 самок, которым апплицировали 2 мкг ЮГ, 101 контроль 101 голод 147 контроль 147 голод плодовитость (потомки/самка) 70 Рис.3. Влияние голодания на плодовитость половозрелых самок 101 и 147 линий D. virilis (24 часовое голодание на 6-й день после вылета). растворенного в ацетоне; 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 дни после вылета плодовитость и количество отложенных яиц у самок, которым апплицировали 2 мкг ЮГ перед голоданием, и плодовитость голодавших и контрольных мух, которым апплицировали соответствующее количество ацетона (рис. 4). Плодовитость оценивалась как количество потомков успешно прошедших метаморфоз. У самок линии дикого типа D. virilis, содержащихся на нормальной питательной среде, экспериментальное повышение титра ЮГ вызывает падение уровня плодовитости до нуля, но не приводит затем к ее снижению в последующие дни (рис. 4). Однако, у самок линии дикого типа, которым перед голоданием апплицировали ЮГ (рис. 4), число потомков заметно увеличено не по сравнению контрольной с группой (все различия достоверны при p<0,001). последующие значения для 3 В суток плодовитости обработаных голодавших самок ЮГ не отличаются от таковых плодовитость (потомки/самка) только по сравнению с необработанными гормоном голодавшими самками, но и контроль ЮГ голод ЮГ+голод 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 дни после вылета для самок, голодавших без 3 предварительной Рис.4. Влияние аппликации ЮГ на плодовитость самок обработки ЮГ. 101 линии D. virilis в нормальных условиях и при голодании. 9 Для проверки представления Ричарда (Richard et al., 2001) о ведущей роли 20Э в гормональном контроле репродуктивной функции самок Drosophila мы изучили влияние экспериментального увеличения титра 20Э на плодовитость самок D. virilis линий дикого типа (101) и мутантной (147) в нормальных плодовитость(число яиц/самка) условиях и при голодании (рис.5). Данные, показанные контроль 20Э голод 20Э+голод 60 50 на рисунке 5А, демонстрируют, что в 40 отличие от 30 экспериментального 20 повышения титра ЮГ (рис. 4) и пищевого 10 стресса 0 А 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 дни после вылета (рис 3), кормление самок 101 линии 20Э не плодовитость(число яиц/самка) Рис.5. Влияние 24-часового комления 20Э (60 мкг 20Э на виалу) на откладку яиц самками 101 (А) и 147 (Б) линий вызывает прекращения D. virilis в нормальных условиях и при голодании. откладки яиц. Повышение титра 20Э контроль 20Э голод 20Э+голод 60 50 приводит них к продолжительному 40 снижению 30 уровня плодовитости, начиная 20 со 10 (7й 0 Б у 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 дни после вылета 11 дня день вылета): день обработки после в этот плодовитость обработанных мух снижается по сравнению с контрольными особями (p<0,05). На 9, 10 день после вылета у самок дикого типа также наблюдается сниженный уровень плодовитости (различия достоверны при p<0,01 для обоих дней), соответствующий уровню, наблюдаемому на 9, 10 день у необработанных 20Э голодавших мух. Обработка самок 101 20Э одновременно с голоданием практически не влияет на плодовитость мух в первые 2 дня эксперимента (7-8 сутки после вылета). Однако на третий день (9-е сутки после вылета) их плодовитость достоверно снижается (p<0,05) по сравнению с необработанными 10 голодающими мухами. На 4 день после эксперимента (11 день после вылета) различия между всеми группами исчезают. Результаты, представленные на рисунке 5Б, указывают на то, что в целом изменения в уровне плодовитости, вызываемые экзогенным 20Э, у мутантных особей линии 147 с повышенным, по сравнению с диким типом, эндогенным уровнем 20Э (Hiraschima et al., 2000), аналогичны обнаруженным у мух дикого типа: наблюдается снижение плодовитости начиная со дня обработки (7й день после вылета) продолжающееся в течение 8 - 10 дней после вылета. Однако, плодовитость обработанных 20Э мутантных мух снижается в день обработки значительней, чем у особей линии 101. Обработка 20Э голодающих самок линии 147 сказывается на уровне их плодовитости (вызывает достоверное ее снижение (p<0,001)) на сутки позже, чем у самок дикого типа (10 сут после вылета). Сравнение наших результатов с данными, полученными ранее в лаборатории И.Ю. Раушенбах (Rauschenbach et al., 1996; Gruntenko et al., 2003a), указывает на то, что механизм ответа репродуктивной системы самок D. virilis на пищевой стресс в целом аналогичен ответу на тепловое стрессирование. Надо отметить, что обработка самок 101 и 147 линий D. virilis экзогенным 20Э одновременно с голоданием приводит, в отличие от ЮГ-обработки, к более выраженному падению плодовитости (см. рис. 4, 5) вследствие голодания. Итак, увеличение титра ЮГ в нормальных условиях останавливает откладку яиц, но не снижает плодовитость самок после ее возобновления, а увеличение титра 20Э ее не останавливает, но снижает плодовитость в течение нескольких дней, а также усиливает отрицательный эффект голодания на уровень плодовитости. Взаимодействие 20-гидроксиэкдизона с ювенильным гормоном и биогенными аминами у Drosophila. Для того, чтобы выяснить какие изменения в метаболизме ДА и ЮГ повлечет за собой повышение титра 20Э, мы провели анализ воздейстия экзогенного 20Э на эти параметры у особей дикого типа D. virilis. Из результатов, представленных на рисунке 6, видно, что кормление 20Э вызывает существенное снижение деградации (повышение титра) ЮГ у молодых самок (различия с контролем достоверны при p<0,001 для обеих использованных доз 20Э). Причем влияние 20Э на метаболизм ЮГ носит дозозависимый характер: использование более высокой концентрации 20Э при обработке мух 11 более резко снижает деградацию гормона (различия между группами, обработанными 30 и 60 мкг 20Э, достоверны при p<0,05). У зрелых (7-суточных, рис.7) самок, как и у молодых (3-суточных, рис. 6), повышение уровня 20Э вызывает тот же эффект - снижение деградации (повышение титра) ЮГ 8 3 4 6 5 12 4 8 3 2 4 1 0 0 н 20 т р Э ол 60 ь м кг 6 7 ко 12 0 Гидролиз ЮГ (пмоль/мин/муха) 9 8 16 н 20 т р Э ол 60 ь м кг 16 ко 12 0 20 20 Содержание ДА(нг/мг массы мухи) ко Гидролиз ЮГ(пмоль/мин/муха) н 20 т ро Э ль 20 30 м Э кг 60 мк г ко н 20 т ро Э ль 3 20 0 м Э кг 60 мк г 15 Содержание ДА(нг/мг массы мухи) (различия с контролем достоверны при p<0,01). Рис. 7. Влияние 7-дневного кормления 20Э (60 мкг 20Э на виалу) на содержание ДА и деградацию ЮГ у 7суточных самок 101 линии D. virilis Рис. 6. Влияние 72 часового кормления 20Э (30 или 60 мкг 20Э на виалу) на содержание ДА и деградацию ЮГ у 3суточных самок 101 линии D. virilis. Возник вопрос, влияет ли изменение уровня 20Э непосредственно на метаболизм ЮГ или опосредовано - через систему метаболизма ДА, поскольку ранее было показано, что метаболизм ЮГ в нормальных условиях регулируется ДА: ДА ингибрует деградацию ЮГ у молодых самок и стимулирует ее у зрелых (Gruntenko et al., 2000). Данные, представленные на рисунках 6, 7, показывают резкое дозозависимое возрастание уровня ДА у молодых самок при обработке их 20Э (различия с контролем достоверны при p<0,001 для обеих использованных доз 20Э) и его снижение у половозрелых (различия достоверны при p<0,01). Заметим, что при прямом влиянии 20Э на уровень ЮГ, мы наблюдали бы обратную картину, поскольку повышение тира ЮГ повыщает уровень ДА у молодых самок дрозофилы и снижает его у зрелых (Раушенбах и др., 2004) Итак, 20Э регулирует in vivo метаболизм ЮГ опосредованно через систему ДА. Чтобы еще раз проверить это, мы использовали линию ecdysoneless1 (ecd1) D. melanogaster с рецессивной температурочувствительной мутацией, которая прерывает синтез 20Э при рестриктивной температуре (29ОС) (Garen et al., 1977). 12 Мы измерили ЮГ-гидролизующую активность у половозрелых самок линии ecd1, лишенных 20Э (при 29оС), используя в качестве контроля мух той же линии, развивавшихся при пермиссивной температуре (19оС) – т.е. синтезирующих 20Э, и у самок линии дикого типа Canton S, развивавшихся как при 19оС, так и при 29оС. Результаты представлены на рисунке 8. Видно, что перенос мух ecd1 в 29оС (и, соответственно, прекращение у них синтеза 20Э) вызывает у самок значительное увеличение деградации (снижение титра) ЮГпо сравнению с особями обеих линий, содержавшимися при 19C и самками Canton S при 29оС (различия достоверны для всех групп при р<0,001). Отметим, что самки ecd1 и Canton S при 19оС и самки Canton S при 29оС не различаются контроль 5 стресс 4 3 2 1 0 ecd 19 ecd 29 CS 19 CS 29 Рис.8. Гидролиз ЮГ у 5-суточных самок линий ecd1 и Canton S при пермиссивной (19оС) и рестриктивной (29оС) температурах, в нормальных условиях и под воздействием теплового стресса (38оС, 3ч). содержание ДА (нг/мг массы мухи) гидролиз ЮГ (пмоль/мин/муха) между собой по уровню деградации ЮГ. контроль 25 стресс 20 15 10 5 0 ecd 19 ecd 29 CS 19 CS 29 Рис.9. Содержание ДА у 5-суточных самок линий ecd1 и Canton S при пермиссивной (19оС) и рестриктивной (29оС) температурах, в нормальных условиях и при тепловом стрессе (38оС, 3ч) Данные, представленные на рисунке 9, показывают резкое возрастание уровня ДА у самок ecd1, развивающихся при рестриктивной температуре (различия с особями обеих линий, содержавшимися при 19C и самками Canton S при 29оС достоверны при p<0,001). Так же, как по уровню деградации ЮГ, самки ecd1 и Canton S при 19оС и самки Canton S при 29оС не различаются между собой по содержанию ДА. Таким образом падение титра 20Э у зрелых самок дрозофилы вызывает возрастание уровня ДА, что приводит к повышению деградации (снижению титра) ЮГ. Как и зрелые, молодые самки ecd1 (рис. 10) в условиях резкого дефицита 20Э 13 (при 29оС) имеют достоверно (р<0,001) повышенный уровень деградации 4 16 3 содержание ДА (нг/мг массы мухи) гидролиз ЮГ (пмоль/мин/муха) (сниженный титр) ЮГ по сравнению с особями с нормальным титром 20Э 12 2 8 1 4 C C 29 o 19 o 29 o 19 o C 0 C 0 Рис.10. Гидролиз ЮГ и содержание ДА у суточных самок ecd1 при пермиссивной (19оС) и рестриктивной (29оС) температурах. (при 19оС). В то же время, уровень ДА у молодых самок ecd1 с резко сниженным уровнем 20Э, в отличие от зрелых особей (рис. 9), снижен, что и приводит (см. выше) к повышению деградации (снижению титра) ЮГ. Итак, полученные нами результаты подтверждают гипотезы Соллера с соавт. (Soller et al., 1999) о необходимости баланса ЮГ и 20Э для нормального протекания оогенеза и Грунтенко с соавт. (Gruntenko et al., 2003a) о том, что 20Э регулирует ранние, а ЮГ – поздние стадии оогенеза у Drosophila и, вместе с тем, не противоречат гипотезе Ричарда с соавторами (Richard et al., 1998) о том, что 20Э может играть определяющую роль (регулируя титр ЮГ, в том числе) в этом процессе. Роль экдистероидов в регуляции развития стресс-реакции у Drosophila Как уже было упомянуто, неблагоприятные факторы вызывают у насекомых неспецифичную, адаптивную реакцию нервной и эндокринной систем, включающую значительные изменения в статусе систем метаболизма биогенных аминов, экдистероидов и ЮГ (обзоры: Ivanovič, 1991; Chernysh, 1991; Cymborowski 1991; Rauschenbach, 1991; Раушенбах, 1997). Однако взаимоотношения между этими компонентами остаются неясными. Остаётся открытым вопрос: существует ли компонент стресс-реакции, запускающий каскад изменений в остальных компонентах? Или эти системы отвечают на неблагоприятные условия независимо друг от друга? В поисках пускового механизма стресс-реакции ранее в лаборатории И.Ю. Раушенбах был изучен ряд линий D. melanogaster и D. virilis с мутациями, которые резко изменяют уровень ДА и ОА, синтез белков теплового шока, метаболизм и рецепцию ЮГ (Rauschenbach et al., 1993, 1995a, 1996, Раушенбах и др., 2001, Gruntenko et al., 1999, 2003b, 2004). Было обнаружено, что эти мутации не препятствуют развитию стресс-реакции, 14 но меняют уровень ее интенсивности. В настоящей работе мы пытались выяснить роль 20Э в развитии стресс-реакции. Если бы 20Э являлся пусковым звеном стресс-реакции, особи линии ecd1 не должны были бы развивать эту реакцию при рестриктивной температуре. Наши данные показывают, что этого не происходит: хотя особи ecd1 при рестриктивной температуре и имеют изменения в метаболизме ЮГ и ДА, (рис. 9, 10), они отвечают на стресс повышением содержания ДА, и 40 100 35 90 80 30 70 25 60 20 50 15 40 30 10 20 5 10 0 0 ecd ecd CS CS 19 29 19 29 ecd ecd CS CS 19 29 19 29 Чтобы стресс-реактивность системы ДА (% ) стресс-реактивность системы ЮГ (%) снижением деградации ЮГ, т.е. стресс-реакция у них инициируется. оценить интенсивность ответа систем метаболизма ЮГ и ДА на тепловой стресс при дефиците 20Э, мы расчитали у 6 суточных самок линий ecd1 и Canton S, содержавшихся при пермиссивной и рестриктивной температурах, стрессреактивность этих систем, как процент снижения уровня деградации ЮГ и процент увеличения содержания ДА при тепловом стрессе Рис.11. Стресс-реактивность систем метаболизма ДА и ЮГ самок линий ecd1 и Canton S при пермиссивной (19оС) и рестриктивной (29оС) температурах. относительно значений этих признаков в нормальных условиях (рис. 11). Видно, что линия дикого типа (Canton S) при 19оС и при 29оС, и линия ecd1 при 19оС характеризуются сходной стресс-реактивностью как системы метаболизма ЮГ, так и системы ДА (различия между группами недостоверны). В тоже время у линии ecd1 при 29оС наблюдается существенно более низкий уровень этого параметра (p<0.001 для системы ДА и р<0,05 для системы ЮГ) при сравнении с остальными группами. Таким образом, очевидно, что 20Э не является компонентом, запускающим стресс-реакцию у Drosophila, однако его отсутствие приводит к значительным изменениям в ответе на стрессор систем метаболизма ДА и ЮГ, что свидетельствует о важной роли 20Э в развитии стресс-реакции. Подводя итоги, мы можем заключить, что настоящее исследование: (1) показало, что 20-гидроксиэкдизон является важным, но не пусковым компонентом стресс-реакции дрозофилы; 15 (2) продемонстрировало, что изменения в процессе оогенеза при пищевом стрессе у дрозофилы обусловлены ответом систем метаболизма ЮГ и 20Э на действие стрессора и совпадают с происходящими при тепловом стрессе (Gruntenko et al., 2003а), а следовательно, являются универсальной реакцией организма на неблагоприятное воздействие; (3) выявило, что 20Э ответственен за снижение плодовитости самок дрозофилы при повышении его титра, а ЮГ – за остановку откладки яиц; (4) показало, что 20Э регулирует титр ЮГ опосредованно через систему метаболизма ДА в контроле репродуктивной функции самок дрозофилы. ВЫВОДЫ 1. Показано, что температурочувствительная мутация D. melanogaster ecdysoneless , прерывающая синтез 20-гидроксиэкдизона при рестриктивной 1 температуре, не препятствует инициации стресс-реакции, но существенно изменяет ее интенсивность. Сделано заключение о том, что 20-гидроксиэкдизон является важным, но не пусковым компонентом стресс-реакции дрозофилы. 2. Установлено, что механизм ответа репродуктивной системы самок дрозофилы на пищевой стресс аналогичен ответу на тепловой: стресс вызывает задержку созревания ооцитов, деградацию ранних вителлогенических яйцевых камер, накопление зрелых ооцитов и прекращение откладки яиц. 3. Показано, что изменения в процессе оогенеза при пищевом стрессе у дрозофилы обусловлены ответом систем метаболизма ЮГ и 20Э на действие стрессора, причем 20Э контролирует вителлогенические стадии оогенеза, а ЮГ – созревание и откладку яиц. 4. Обнаружено, что в нормальных условиях повышение титра 20Э не вызывает прекращения откладки яиц, но снижает плодовитость в течение нескольких дней, а увеличение титра ЮГ останавливает откладку яиц, не приводя к снижению уровня плодовитости. 5. Установлено, что 20Э регулирует титр ЮГ у дрозофилы и делает это опосредованно через систему метаболизма ДА: повышение титра 20Э увеличивает уровень ДА у молодых самок D. virilis и снижает его у половозрелых, вызывая снижение деградации (повышение титра) ЮГ у тех и других, а резкое падение титра 20Э у D. melanogaster, напротив, снижает 16 уровень ДА у молодых самок и повышает у половозрелых, приводя к резкому повышению деградации (снижению титра) ЮГ у тех и других. СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Раушенбах И.Ю., Адоньева Н.В., Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Ченцова Н.А., Фаддеева Н.В. Синтез и деградация ювенильного гормона у Drosophila находятся под общим контролем // Докл. РАН. 2002. V. 386. P. 136-138. 2. Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Раушенбах И.Ю. Ювенильный гормон контролирует откладку яиц у Drosophila при тепловом стрессе. // Докл. РАН, 2003, Т.392, №2, С.283-285. 3. Карпова Е.К., Ченцова Н.А., Адоньева Н.В., Грунтенко Н.Е. Взаимодействие дофамина и гонадотропных гормонов Drosophila melanogaster в нормальных условиях и при тепловом стрессе.// III Международная научная конференция молодых ученых "Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии". Алматы. Казахстан. 2003. с.105. 4. Adonyeva N.V., Gruntenko N.E., Karpova E.K., Faddeeva N.V., Rauschenbach I.Yu. The effect of starvation on juvenile hormone metabolism and reproduction in Drosophila virilis // 18th European Drosophila Research Conference. Goettingen. Germany. 2003. P. 148. 5. Raushenbach I.Y., Gruntenko N.E., Bownes M., Adonieva N.V., Terashima J., Karpova E.K., Faddeeva N.V., Chentsova N.A. The role of juvenile hormone in the control of reproductive function in Drosophila virilis under nutritional stress // J. Insect. Physiol. 2004. V. 50. P. 323-330. 6. Раушенбах И.Ю., Грунтенко Н.Е., Баунс М., Адоньева Н.В., Карпова Е.К. Взаимодействие ювенильного гормона и 20-гидроксиэкдизона в контроле оогенеза Drosophila в норме и при стрессе генетически детерминировано // III съезд ВОГИС. Москва. 2004. С.468. 7. Gruntenko N.E., Bownes M., Adonyeva N.V., Terashima J., Karpova E.K., Rauschenbach I.Yu. Juvenile hormone in the control of reproductive function in Drosophila virilis under stress // Eighth International Conference on the Juvenile Hormones. King’s Beach, USA. 2004. P. 10. 8. Раушенбах И.Ю., Адоньева Н.В., Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Фаддеева Н.В. Ювенильный гормон контролирует процесс откладки яиц и плодовитость Drosophila virilis при голоде // Онтогенез. 2004. Т. 35 №5. С. 366-371. 9. Gruntenko N.E., Karpova E.K. , Adonyeva N.V., Chentsova N.A., Faddeeva N.V., Alekseev A.A.,. Rauschenbach I.Yu. Juvenile hormone, 20hydroxyecdysone and dopamine interaction in Drosophila virilis reproduction under normal and nutritional stress conditions // J. Insect Physiol. 2005. V. 51. P. 17 417-425. 10. Раушенбах И.Ю., Грунтенко Н.Е., Карпова Е.К., Адоньева Н.В., Алексеев А.А., Володин В.В. 20-гидроксиэкдизон взаимодействует с ювенильным гормоном и дофамином в контроле плодовитости Drosophila virilis // ДАН. 2005. Т. 400 С. 847-849. 11. Карпова Е.К.,. Грунтенко Н.Е, Раушенбах И.Ю. Ген ecdysoneless1 регулирует метаболизм ювенильного гормона и дофамина у Drosophila melanogaster // Генетика. 2005. Т. 41. № 11 C. 1480-1486. 12. Карпова Е.К., Ченцова Н.А., Грунтенко Н.Е., Раушенбах И.Ю. Роль экдистероидов и ювенильного гормона в развитии стресс-реакции у Drosophila melanogaster // XIII Международное совещание и VI школа по эволюционной физиологии. Тезисы докладов Санкт-Петербург. 2006. С. 100. Подписано к печати 00.00.2008 г. Формат бумаги 60х90 1/16. Печ. л. 1. Уч.-изд. л. 0,7 Тираж 100 экз. Заказ 00. Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10 18
