Автореферат - НИИ биохимии СО РАМН

На правах рукописи
КНЯЗЕВ
РОМАН АЛЕКСАНДРОВИЧ
РОЛЬ АПОЛИПОПРОТЕИНА А-I И АПОЛИПОПРОТЕИНА Е В
РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА И НУКЛЕИНОВЫХ
КИСЛОТ В КУЛЬТУРЕ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ
ГЕПАТОЦИТОВ
03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск – 2007
Работа выполнена в Государственном учреждении Научноисследовательском институте биохимии Сибирского отделения
Российской академии медицинских наук
Научный руководитель:
академик РАМН
Панин Лев Евгеньевич
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор
Поляков Лев Михайлович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович
доктор биологический наук, профессор Гуляева Людмила Федоровна
Ведущая организация: Государственное учреждение Научный центр
клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения
Российской академии медицинских наук (Новосибирск)
Защита состоится «17» апреля 2007 г. в 10 часов на заседании
диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении
Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу:
630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8-3832-33-54-81).
С
диссертацией
можно
ознакомиться
в
библиотеке
Государственного учреждения Научно-исследовательского института
биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских
наук
Автореферат разослан «___» ___________ 2007г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Русских Г. С.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Известно, что липопротеины и их белковые
компоненты участвуют в регуляции многих метаболических процессов.
Среди которых можно выделить следующие. Аполипопротеины апоА-I
и апоЕ осуществляют регуляцию обмена холестерина не только в плазме
крови, но и посредством рецепторов внутри клетки за счет активного его
выведения с помощью встроенных в мембрану специфических
транспортных белков: АТР-связывающего кассетного транспортера
(АВСА1) и мембранного рецептора для ЛПВП - скевенджер-рецептора
класса
В1
(Borst
P.,
Elfehnk
R.O.,
2002;
Wei
C.
e.a.,2005).
Аполипопротеины оказывают влияние на функцию эндокринной
системы, в частности, на стероидогенез; апоЕ является одним из
регуляторов клеточного иммунитета; аполипопротеины способны связывать и транспортировать в клетку различные по структуре соединения
(Поляков Л.М., Панин Л.Е., 2000).
Имеются
сообщения
о
регуляции
аполипопротеинами
генетического аппарата клетки. Это подтверждается в серии работ
Института биохимии СО РАМН под руководством академика РАМН Л.Е.
Панина. Действительно, в ядрах гепатоцитов крыс были обнаружены
аполипопротеины А-I и Е. Оба белка присутствовали во фракции кислых
негистоновых белков, принимающих участие в регуляции экспрессии
генов. Оказалось, что аполипопротеин А-I способствует повышению
транскрипционной
активности
хроматина.
Были
вскрыты
и
молекулярные механизмы этого процесса. Показано, что аполипопротеин
А-I в комплексе с восстановленными формами стероидных гормонов
взаимодействует
с
восстановленная
4–3-кетогруппа
GC-богатыми
участками
А-кольца
ДНК.
стероидных
При
этом
гормонов
инициирует разрыв в GC-парах водородных связей. В дальнейшем
разрыв увеличивается за счет гидрофобного взаимодействия между
3
азотистыми основаниями и гидрофобными участками аполипопротеина
А-I.
С
образовавшимися
одноцепочечными
участками
ДНК
взаимодействует РНК-полимераза, которая и запускает экспрессию генов
с последующей активацией биосинтеза белка (Panin L.E. e.a., 1998; 2000).
Другим регуляторным белком является аполипопротеин Е. Он
известен, как ингибитор пролиферации некоторых типов клеток,
включая
опухолевые
(Vogel
T.
e.a.,
Показано,
1994).
что
аполипопротеин Е повышает экспрессию мРНК перлекана, основного
протеогликана в семействе гепарансульфатов, который и опосредует
антипролиферативный эффект аполипопротеина Е в культуре крысиных
и человеческих гладкомышечных клеток аорты (Paka L. e.a., 1999). По
данным Хоу и соавторов (2001),
стимулированную
сывороткой
аполипопротеин Е ингибировал
пролиферацию
эмбриональных
фибробластов крыс, при этом в бессывороточной среде аполипопротеин
Е увеличивал рост клеток, продлевая G1-фазу клеточного цикла.
Аполипопротеин
Е
усиливал
рост
первичных
нейронов
через
сигнальную функцию ЛПНП-подобного рецептора (LRP, lipoprotein
receptor-related protein) (Qui Z. e.a., 2004). Отмечена способность
аполипопротеина
Е
ингибировать
сосудистую
гиперплазию
при
воспалении, вызванном денудацией эпителия сонных артерий у мышей
(Moore, Z.W., Hui D.Y., 2005). Результаты исследования эффекта
аполипопротеина Е на клетки человеческой аденокарциномы НТ29 и
распределение -катенина позволяют предположить, что данный белок
участвует в сохранении межклеточных взаимодействий, ингибируя рост
опухолевых клеток (Niemi M. e.a. 2002). В дополнение к этому,
показано,
что
аполипопротеин
Е
снижает
экспрессию
генов
канонического, или зависимого от -катенина Wnt-сигнального пути
(Caruso A. e.a. 2006), конститутивная активация которого играет важную
роль в канцерогенезе (Taipale J. e.a., 2001).
4
Перечисленные работы о регуляторных эффектах аполипопротеинов
А и Е позволили высказать предположение о существовании у этих
белков
конкурентных
взаимоотношений
в
регуляции
процессов
внутриклеточной регенерации и пролиферации. В связи с этим, целью
настоящего исследования являлось изучение роли аполипопротеинов
А-I и Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре
нормальных и опухолевых гепатоцитов.
Задачи исследования:
1. Изучить процессы комплексообразования липопротеинов со
стероидными гормонами и их метаболитами.
2. Изучить
влияние комплексов
метаболитов с
стероидных
гормонов
и
их
аполипопротеином А-I на биосинтез белка в
культуре гепатоцитов крыс.
3. Изучить роль аполипопротеина Е в регуляции биосинтеза белка и
нуклеиновых кислот в культуре нормальных гепатоцитов и в
клетках асцитной гепатомы Эрлиха.
Научная новизна. Методами ультрацентрифугирования, гельфильтрации и тушения флуоресценции показано, что при образовании
комплексов
метаболитами
липопротеинов
со
гормонами
принимает участие белковый компонент.
аполипопротеином, участвующим
является
стероидными
аполипопротеин
и
их
Основным
в процессе комплексообразования
А-I. Полученные константы ассоциации
комплексов белок-лиганд свидетельствуют о достаточно высоком
сродстве.
На
культуре
аполипопротеина
гепатоцитов
А-I
с
крыс
показано,
тетрагидрокортизолом
что
и
комплексы
прегненолоном
обладают высокой биологической активностью, усиливая скорость
5
биосинтеза белка. Принципиально важную роль в этом процессе играет
восстановленная 4–3-кетогруппа кольца А стероидных гормонов.
На культуре гепатоцитов крыс показано, что аполипопротеин Е
проявляет
конкурентный
аполипопротеин
эффект
по
отношению
А-I-тетрагидрокортизол
и
к
снижает
комплексу
увеличение
скорости биосинтеза ДНК, РНК и белка, определяемую по включению
радиоактивной метки.
Впервые на модели асцитной гепатомы Эрлиха показано, что
опухолевые
макрофаги
биологическиактивных
играют
ключевую
комплексов
роль
в
образовании
аполипопротеина
А-I
со
стероидными гормонами, которые в свою очередь увеличивают скорость
биосинтеза белка в клетках асцитной гепатомы. Аполипопротеин Е
подавлял биологическую активность комплекса, что отражалось в
снижении скорости биосинтеза белка.
Теоретическая и практическая значимость.
Решение поставленных в диссертации задач является важным
этапом в исследовании молекулярных механизмов межклеточных
взаимодействий
Установление
связанных
характера
с
и
регуляцией
степени
экспрессии
связывания
генов.
(аффинитета)
липопротеинов со стероидными гормонами и их метаболитами важны
для
оценки роли изучаемых комплексов в регуляции важнейших
внутриклеточных процессов. В результате проведенных исследований,
описан неизвестный ранее механизм регуляции биосинтеза ДНК, РНК и
белка – процесс, основанный на конкурентных взаимоотношениях
между
аполипопротеином
Е
и
комплексом
аполипопротеином
А-I-стероид.
Результаты работы свидетельствуют о
том, что
макрофаги
занимают ключевые позиции в регуляции процессов регенерации и
клеточной
пролиферации.
Эти
межклеточные
взаимодействия
6
проявляют себя не только в нормальных тканях, но и в системе –
макрофаг-опухолевая
клетка.
Показано,
что
в
основе
этих
взаимоотношений также лежит способность макрофагов образовывать
биологически активные комплексы восстановленных форм стероидных
гомонов с аполипопротеином А-I. Однако способность к синтезу и
секреции аполипопротеина Е у них снижена, что имеет принципиальное
значение в противоопухолевой защите организма. Понимание тонких
механизмов взаимоотношений макрофаг-опухолевая клетка может
служить основой для повышения эффективности методов коррекции у
онкологических больных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Фракции липопротеинов плазмы крови образуют комплексы со
стероидными гормонами и их метаболитами за счет белкового
компонента.
Одним
из
главных
таких
белков
является
аполипопротеин А-I.
2. Скорость биосинтеза белка в гепатоцитах крыс повышается под
влиянием
комплексов
аполипопротеина
А-I
с
тетрагидрокортизолом и с прегненолоном.
3. Аполипопротеин
Е
подавляет
эффекты
комплексов
аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и с прегненолоном в
нормальных
гепатоцитах
и
опухолевых
клетках
асцитной
гепатомы Эрлиха.
7
Апробация
материалов
диссертации.
Материалы
диссертационного исследования доложены на I Съезде физиологов СНГ
(Сочи, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы
3
работы, из них 2 статьи.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из
введения,
4-х глав, включающих обзор литературы, материалов и
методов,
результатов исследований, обсуждения, выводов и списка
литературы, включающих 30 отечественных и 172 зарубежных
источников. Материалы диссертации изложены на 132 страницах
машинописного текста. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 16
рисунками. Диссертация выполнена в соответствии с планом научноисследовательских работ Института биохимии СО РАМН.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования были проведены на крысах линии Вистар массой 180200 г, мышах линии СВА массой 15-20 г, полученных из вивария СО
РАМН (Новосибирск). Содержание, питание, уход за животными и
выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с
требованиями
«Правил
проведения
работ
с
использованием
экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от
12.08.1977 г № 755).
В работе использовались следующие методы:
1. Выделение
липопротеинов
сыворотки
крови
методом
ультрацентрифугирования в растворах KBr (Hatch, Lees, 1968).
2. Делипидирование
липопротеинов
(Herbert
P.,
e.a.,1973).
Делипидирование проводили охлажденной смесью хлороформметанол (1:1) с последующей многократной отмывкой эфиром.
8
3. Хроматографические методы. Смесь аполипопротеинов наносили на
колонку (1,6 х 100 см) с Сефарозой CL-4В "Pharmacia" (Швеция) и
элюировали 0,01 М трис-НСl буфером, рН 8,6, содержащим 6 М
мочевину, 0,01% азид натрия и 1 мМ фенилметансульфонилфторид
(Herbert P., e.a., 1973).
4. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия
(Laemmli, 1970).
5. Гепатоциты выделяли методом рециркуляторной ферментативной
перфузии с использованием 0,03% раствора коллагеназы (Seglen Р.О.,
1976).
6. В качестве модели опухолевого роста использовалась гепатома
Эрлиха (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск).
7. Анализ взаимодействия триптофансодержащих белков ЛП-фракций
со стероидами их метаболитами проводили на спектрофлуориметре
MPF-4 «Хитачи» (Япония) при длине волны возбуждения 285 нм и
эмиссии в диапазоне от 300 до 600 нм (Лакович Дж., 1986.)
8. Изучение образования комплекса апоА-I-прегненолон проводили
методом гель-фильтрации (колонка: 40  0,8 см, Сефадекс G-25
(«Pharmacia», Швеция), элюент: 0,05 М калий-фосфатный буфер, рН
7,4, содержащий 0,15 М NaCl).
9. Константы ассоциации (Касс.) были рассчитаны на основании
кривых тушения флуоресценции (Attala, Lata 1968).
10.Скорость биосинтеза белка в культуре клеток оценивали по
включению
14
С-лейцина и выражали в имп/мин на 1 мг белка
(Weigand K. e.a., 1974).
11.Скорость биосинтеза РНК в культуре клеток оценивали по
включению 3Н-уридина и выражали в имп/мин на 1 мг белка (Шаткин
А., 1972).
9
12.Скорость биосинтеза ДНК в культуре клеток оценивали по
включению 3Н-тимидина и выражали в имп/мин на 1 мг белка
(Шаткин А., 1972).
Результаты экспериментов обработаны методами вариационной
статистики с использованием t-критерия Стьюдента. При обработке
экспериментальных данных использовали пакет прикладных программ
Microsoft office (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Связывание стероидных гормонов и их метаболитов отдельными
классами
ЛП
и
их
белковыми
компонентами,
мы
изучали
с
использованием методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и
флуоресцентной спектроскопии.
Полученные
методом
ультрацентрифугирования
данные
показали, что связывание меченых стероидов с липопротеиновыми
фракциями в целом оказалось на уровне 34-42%. Основная часть метки
находилась во фракции белков инфранатанта. Однако нельзя не
учитывать и тот факт, что в инфранатанте находится значительная
часть аполипопротеинов, не связанных с липидами. Это, так
называемый, "свободный пул" аполипопротеинов, который также
может вносить свой вклад в связывание стероидов.
Высокая специфичность и чувствительность флуоресцентных
методов позволяет их широко применять для анализа взаимодействий
типа "рецептор-лиганд". Метод белковой флуоресценции позволяет
обнаружить зависимость спектральных характеристик хромофорных
групп (триптофанилов) от конформационного состояния молекул белка.
Считается, что триптофан является естественной "меткой-репортером",
10
поэтому
исследование
параметров
представление о характере
его
флуоресценции
дает
взаимодействий, в частности, при
образовании комплексов белок-стероид.
Анализ взаимодействия ЛП со стероидными гормонами показал,
что наибольшее снижение флуоресценции было для частиц ЛПВП (5565%). Менее выраженным данный эффект был для ЛПОНП (30-35%) и
для ЛПНП (15-20%). При этом форма спектров, их полуширина
практически не изменялись.
В частицах ЛПВП основным структурно-функциональным
белком является апоА-I. В связи с этим, изучали связывание стероидов
хроматографически очищенным апоА-I. На рис. 1. приведены кривые
тушения триптофановой флуоресценции апоА-I при образовании
комплексов с тетрагидрокортизолом. Тушение составило 29%. На рис.
2. приведены кривые тушения триптофановой флуоресценции апоА-I
при образовании комплексов с прегненолоном. Тушение составило
20%.
Изучение временной зависимости тушения флуоресценции при
одномоментном
добавлении
насыщающих
количеств
стероидов
показало, что полное насыщение связывающих областей ЛП-частиц
гормонами происходит уже через 30 мин от начала опыта.
11
интенсивность флуоресценции
100
80
60
40
20
0
310
320
330
340
350
360
370
длина волны (нм)
Рис. 1. Спектры триптофановой флуоресценции апоА-I при
комплексообразовании с тетрагидрокортизолом.
(
) – апоА-I (исходный спектр);
(
) – апоА-I + тетрагидрокортизол (через 60 мин);
интенсивность флуоресценции
100
80
60
40
20
0
310
320
330
340
350
360
370
длина волны (нм)
Рис. 2. Спектры триптофановой флуоресценции апоА-I при
комплексообразовании с прегненолоном.
(
) – апоА-I (исходный спектр);
(
) – апоА-I + прегненолон (через 60 мин).
12
В таблице 1. представлены константы связывания различных
стероидов с ЛП фракциями и изолированного апоА-I, полученные на
основе кривых тушения триптофановой флуоресценции. Константы
ассоциации комплексов белок-лиганд (106 М-1) свидетельствуют о
достаточно высоком сродстве, поэтому связывание можно назвать
специфическим.
Таблица 1.
Константы ассоциации для комплексов липопротеин-стероид на
основании кривых тушения флуоресценции триптофана.
Стероид
ЛПОНП
ЛПНП
ЛПВП
АпоА-I
Кортикостерон
0,6х106М-1
0,67х106М-1
3,6х106М-1
0,8х106М-1
Дезокси1,02х106М-1 0,14х106М-1
кортикостерон
4,0х106М-1
0,3х106М-1
Тестостерон
1,2х106М-1
0,27х106М-1
4,8х106М-1
0,7х106М-1
Прогестерон
0,6х106М-1
0,64х106М-1
4,4х106М-1
0,5х106М-1
Для изучения комплексообразования апоА-I c прегненолоном мы
исполоьзовали
также
метод
гель-фильтрации.
Хроматографию
проводили на сефадексе G-25. На колонку одновременно нанесли
хроматографически чистый апоА-I и
14
С-прегненолон, при этом белок
выходил отдельным пиком без регистрации радиоактивности. Затем
инкубация апоА-I с 14С-прегненолоном на выходе показала присутствие
метки во фракции белка. Что подтверждает данные по тушению
триптофановой
флуоресценции
апоА-I-гормон.
Присутствие
о
процессе
1000-кратного
комплексообразования
избытка
немеченого
13
прегненолона практически вытесняло меченый, что также позволяет
говорить о специфичности связывания гормон-белок.
Для выяснения закономерностей в регуляции экспрессии генов,
связанных с усилением биосинтеза белка, были проведены исследования
в двух независимых парах стероидных гормонов. Первая пара
представляет гормоны пучковой зоны коры надпочечников. Это
кортизол и его восстановленная форма – тетрагидрокортизол. Разница
между ними заключается в том, что у последнего гормона 4–3кетогруппа А-кольца восстановлена. Гидроксил в 3-м положении ТГК
находится в транс-позиции. Вторая пара гормонов – прогестерон и
прегненолон. По структуре А-кольца первый гормон полностью
соответствует кортизолу, а второй - тетрагидрокортизолу, только
оксигруппа в 3-м положении у прегненолона находится в цис-позиции.
Проведены нами исследования показали, что в паре кортизол –
тетрагидрокортизол только комплекс апоА-I-ТГК значительно усиливал
скорость биосинтеза белка в гепатоцитах по сравнению с контролем
(табл. 2). Кортизол, комплекс апоА-I-кортизол и ТГК не вызывали
достоверных изменений по сравнению с контролем.
Таблица 2.
Изменение скорости биосинтеза белка в гепатоцитах крыс (M±m)
Условия инкубации
Скорость биосинтеза белка, имп/мин
на 1 мг белка, (n=5)
Контроль
АпоА-I
18016 ± 554
15763 ± 452 #
Кортизол
ТГК
АпоА-I - кортизол
АпоА-I - ТГК
16395 ± 398 #
15559 ± 433 #
15854 ± 317 #
32802 ± 1175 *
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,001)
# - достоверное различие по сравнению с комплексом апоА-I-ТГК (р < 0,05)
14
Результаты в паре прогестерон – прегненолон оказались схожими,
биологической активностью обладал комплекс апоА-I-прегненолон,
который имеет восстановленную окси группу в А кольце, он значительно
усиливал биосинтез белка, тогда как комплекс апоА-I-прогестерон не
изменял скорость включения
14
С-лейцина по сравнению с контролем
(табл. 3).
Таблица 3.
Изменение скорости биосинтеза белка в гепатоцитах крыс (M±m)
Скорость биосинтеза белка,
имп/мин на 1 мг белка, (n=6)
Контроль
57606 ± 2762
50405 ± 1446 #
АпоА-I
Прогестерон
64815 ± 968 #
Прегненолон
57730 ± 1267 #
АпоА-I - прогестерон
64055 ± 1415 #
АпоА-I - прегненолон
112089 ± 1560 *
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,001)
Условия инкубации
# - достоверное различие по сравнению с комплексом
апоА-I– прегненолон (р < 0,001)
Сами прогестерон и прегненолон также не вызывали достоверных
изменений по сравнению с контролем.
Проведенные исследования говорят о том, что в комплексе с
апоА-I биологической активностью обладает не только восстановленная
форма кортизола - тетрагидрокортизол, но и соответствующий ему по
структуре А-кольца прегненолон. Считаем, что в повышении скорости
биосинтеза белка в гепатоцитах принципиально важную роль играет
восстановленная 4–3-кетогруппа стероидных гормонов.
Ранее
уже
было
показано,
что
комплекс
апоА-I
с
тетрагидрокортизолм обладает биологической активностью, которая
15
заключается в усилении экспрессии генов и увеличении скорости
биосинтеза ДНК, РНК и белка. Исходя из литературных данных о
регуляторных эффектах апоЕ, мы предположили, что этот белок может
играть роль отрицательной обратной связи в данном механизме усиления
биосинтеза
белка
и
нуклеиновых
кислот.
Проведенные
нами
исследования показали, что апоЕ полностью подавлял повышение
биосинтеза ДНК, РНК и белка, вызванное действием комплекса
апоА-I– ТГК (табл. 4).
Таблица 4.
Изменение скорости биосинтеза ДНК, РНК и белка в гепатоцитах
(M±m)
Условия икубации
Контроль
Скорость биосинтеза имп/мин на мг белка
(n=6)
ДНК
РНК
Белка
1343 ± 74
1155 ± 52
18016 ± 554
АпоА-I - ТГК
1985± 104 * 2275 ± 173 *
32802 ± 1175 *
АпоЕ
862 ± 70 *# 1134 ± 131 #
19942 ± 2463 #
АпоА-I - ТГК + апоЕ 803 ± 48 *# 1132 ± 191 #
21823 ± 2292 #
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,01)
# - достоверное различие по сравнению с комплексом
апоА-I – ТГК (р < 0,01)
В отсутствии комплекса апоА-I-ТГК в среде инкубации апоЕ не
оказывал влияния на биосинтез белка и РНК, но снижал скорость
включения меченого тимидина в ДНК в 1,6 раза по сравнению с
контролем.
Таким
образом,
между
комплексом
апоА-I–ТГК
и
апоЕ
существуют конкурентные взаимоотношения. Они проявляются в том,
16
что комплекс апоА-I–ТГК усиливает синтез ДНК, РНК и белка в
гепатоцитах, в то время как апоЕ полностью снимает эффект комплекса.
В НИИ биохимии СО РАМН было показано, что клетки Купфера
фагоцитируя продукты клеточной деградации, кооперативно с помощью
рецептор-опосредованного
эндоцитоза
захватывают
ЛПВП3
и
стероидные гормоны. ЛПВП3 во вторичных лизосомах подвергаются
дезинтеграции
с
образованием
апоА-I,
а
стероидные
гормоны
восстанавливаются при участии - и -редуктаз с образованием
тетрагидросоединений. Полученные продукты образуют биологически
активный комплекс, который сначала попадает в интерстициальное
пространство, а затем в ядра гепатоцитов, где и усиливает экспрессию
генов.
Мы изучали этот процесс на культуре клеток асцитной гепатомы
Эрлиха. Полученные данные показали, что добавление ЛПВП и
кортизола увеличивала скорость биосинтеза белка в сокультуре клеток
асцитной гепатомы и опухолевых макрофагов (табл.5). Добавление
ЛПВП и кортизола в культуру без прилипающих клеток не вызывало
достоверных изменений по сравнению с контролем. Что подтверждает
данные, полученные ранее на нормальных клетках Купфера (Усынин
И.Ф. 1996). У нас была задача изучить роль апоЕ в данном механизме,
предположительно, он должен играть роль отрицательной обратной
связи,
снимая
биологический
эффект
комплекса
апоА-I-
тетрагидрокортизол образованного в макрофагах. Полученные данные
показали – апоЕ действительно ингибировал эффект комплекса апоА-IТГК (табл. 5).
17
Таблица 5.
Изменение скорости биосинтеза белка в клетках асцитной гепатомы
Эрлиха (M±m)
Скорость биосинтеза белка,
имп/мин х 103 на 1 мг белка,
(n=6)
Условия инкубации
1. Контроль (сокультура)
816 ± 14,3
2. Сокультура + ЛПВП + кортизол
937 ± 35,4 *
3. Сокультура + апоЕ + ЛПВП +
733 ± 28,3* #
кортизол
4. Клетки асцитной гепатомы +
728 ± 20,5 * #
ЛПВП + кортизол
* - достоверное различие по сравнению с группой 1 (р < 0,05)
# - достоверное различие по сравнению с группой 2 (р < 0,05)
Мы провели аналогичное исследование еще на одном стероидепрогестероне.
кольце
Предположительно в
прогестерона
может
макрофагах окси группа
восстанавливаться
с
в А
образованием
предшественника прогестерона – прегненолона, который в свою очередь
образует комплекс с основным компонентом ЛПВП – апоА-I. Этот
комплекс и должен усиливать экспрессию генов в клетках гепатомы.
Полученные данные показали увеличение скорости биосинтеза белка в
сокультуре под действием ЛПВП и прогестерона (табл. 6). Добавление
ЛПВП и прогестерона в культуру клеток гепатомы Эрлиха без
прилипающих клеток не вызывало эффекта. Инкубация клеток в
присутствии ЛПВП, кортизола и апоЕ также не оказывало эффекта на
изменение биосинтеза белка.
18
Таблица 6.
Изменение скорости биосинтеза белка в клетках асцитной гепатомы
Эрлиха (M±m)
Условия инкубации
Скорость биосинтеза белка,
имп/мин х 103 на 1 мг белка, (n=6)
1. Контроль (сокультура)
762 ± 34,2
2. Сокультура + ЛПВП +
877 ± 47,9 *
прогестерон
3. Сокультура + апоЕ + ЛПВП +
760 ± 64 #
прогестерон
4. Клетки асцитной гепатомы +
712 ± 48,9
ЛПВП + прогестерон
* - достоверное различие по сравнению с группой 1 (р < 0,05)
# - достоверное различие по сравнению с группой 2 (р < 0,05)
Таким образом, на культуре асцитной гепатомы Эрлиха было
показано, что
в процессе образования
биологически
активного
комплекса ключевая роль принадлежит макрофагам, что подтверждается
серией работ выполненных в Институте биохимии под руководством
академика РАМН Панина Льва Евгеньевича (Панин Л.Е., 1998).
Аполипопротеин Е принимает участие в подавлении биологических
эффектов комплекса аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и,
предположительно, комплекса аполипопротеина А-I с прегненолоном в
культуре клеток асцитной гепатомы Эрлиха.
19
ВЫВОДЫ
1. Липопротеиновые фракции плазмы крови образуют комплексы со
стероидными гормонами и их метаболитами за счет белковых
компонентов.
Одним
из
главных
таких
белков
является
аполипопротеин А-I.
2. Комплексы аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и с
прегненолоном обладают высокой биологической активностью,
усиливая скорость биосинтеза белка в гепатоцитах крыс.
3. Аполипопротеин Е принимает участие в подавлении эффектов
комплексов аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и
аполипопротеина А-I с прегненолоном в гепатоцитах крыс.
4. На модели асцитной гепатомы Эрлиха показано, что опухолевые
макрофаги играют ключевую роль в образовании биологическиактивных комплексов аполипопротеина А-I со стероидными
гормонами, которые в свою очередь увеличивали
скорость
биосинтеза белка в клетках асцитной гепатомы.
5. Аполипопротеин
комплекса
апоА-I,
Е
подавляет
что
биологическую
отражалось
в
снижении
активность
скорости
биосинтеза белка в культуре клеток асцитной гепатомы Эрлиха.
20
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ.
1. Суменкова Д.В.,
Князев Р.А., Гуща Р.С., Поляков Л.М., Панин
Л.Е. Влияние комплекса тетрагидрокортизола и аполипопротеина
А-I
на
метаболические
характеристики
изолированных
гепатоцитов// Тез.докл. I Съезда физиологов СНГ. Сочи -2005.с.216.
2. Л.М.Поляков, Р.А.Князев, Д.В.Суменкова, Л.Е.Панин Анализ
взаимодействия
липопротеинов
и
стероидных
гормонов//
Сибирский Консилиум.-2006.-№7(54).-с.20-24.
3. Л.Е.Панин, Р.А.Князев, Д.В.Суменкова, Р.С.Гуща, Л.М.Поляков
Роль аполипопротеина Е в регуляции биосинтеза белка и
нуклеиновых кислот в культуре гепатоцитов крыс// Бюллетень
Сибирского отделения РАМН.-2007.-123.-№1.-с.63-66.
21