магнитно-резонансная бионанодиагностика
advertisement
МИНОБРНАУКИ РОССИИ Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ» им. В. И. Ульянова (Ленина) –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНАЯ БИОНАНОДИАГНОСТИКА Санкт-Петербург СПбГЭТУ «ЛЭТИ» 2013 УДК 537.635 ББК В 334.2 М12 Авторы: Ю.В.Богачев, Я.Ю.Марченко, А.Н.Наумова, Ю.С.Черненко М12 Магнитно-резонансная бионанодиагностика. СПб.: СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2013,. 31 с. ISBN 978-5-7629-1002-6 Описываются принципы диагностического магнитного резонанса. Приводится анализ возможностей применения магнитных биосенсорных наночастиц и магнитнорелаксационных детектирующих устройств в магнитно-резонансной диагностике. Данные научно-популярные материалы предназначены для студентов и аспирантов, инженеров и ученых, интересующихся вопросами применения магнитного резонанса в медицинской диагностике. Материалы подготовлены в рамках НИР по соглашению с Минобрнауки России № 14.B37.21.0568 от 10.08.2012 г. УДК 621.039.665 + 543.429.2 ББК В 373.3 + В 344.1 Рецензент: д-р физ.-мат. наук, проф. СПбГПУ К.Ф. Штельмах. ISBN 978-5-7629-1002-6 © Богачев Ю.В, Марченко Я.Ю., Наумова А.Н., Черненко Ю.С. 2013 © СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 2013 2 СОДЕРЖАНИЕ ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ, ТЕРМИНОВ ............................................................. 4 ВВЕДЕНИЕ .......................................................................................................... 5 1. ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА . 8 2. СВОЙСТВА И МЕХАНИЗМЫ МАГНИТНОЙ РЕЛАКСАЦИИ ПРОТОНОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ В ПРИСУТСТВИИ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ ................................... 12 3. МАГНИТНЫЕ БИОСЕНСОРНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ............................. 16 4. МАГНИТНО-РЕЛАКСАЦИОННЫЕ ДЕТЕКТИРУЮЩИЕ УСТРОЙСТВА ............................................................ 21 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................. 26 3 ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ, ТЕРМИНОВ МР – магнитный резонанс МРТ – магнитно-резонансная томография ДМР – диагностический магнитный резонанс ЯМР – ядерный магнитный резонанс МРС – магнитно-резонансная спектроскопия РКТ – рентгеновская компьютерная томография ЭПР – электронный парамагнитный резонанс МЭМС - микроэлектромеханические системы КМОП - комплементарные металло-оксидные полупроводники ПЦ – парамагнитные центры ММРТ – молекулярная магнитно-резонансная томография РЧ – радиочастотный ВЧ – высокочастотный СВЧ – сверхвысокочастотный 4 Введение В настоящее время явление магнитного резонанса используется не только для исследования различных медико-биологических объектов, но и широко применяется в клинической практике. Магнитно-резонансная томография (МРТ) и магнитно-резонансная спектроскопия (МРС) являются признанными методами современной неинвазивной медицинской диагностики. Среди современных диагностических методов, основанных на высоких технологиях, эти методы выделяются благодаря своей информативности и высокой степени безопасности для человека, так как в них не используются никакие ионизирующие излучения. Отличительными признаками МРТ являются способность, в отличие от методов, использующих рентгеновское излучение, визуализировать мягкие ткани, отсутствие экранирования исследуемой области окружающими тканями и органами (например, костями черепа), возможность целенаправленно манипулировать режимом получения и обработки данных в зависимости от характера требующейся информации. При соответствующей организации процесса приема и обработки данных получаемая информация может быть связана с различными молекулярными и макроскопическими свойствами вещества (концентрация определенных атомов или их групп, образование макромолекулярных комплексов, направленное движение жидкости, перфузия, трансфузия, трансляционная и вращательная диффузия и другие виды молекулярной подвижности). Магнитно-резонансная томограмма отражает пространственное распределение значений различных физических параметров, характеризующих исследуемый объект. В этом отношении МРТ принципиально отличается от, например, рентгеновской компьютерной томографии (РКТ), которая чувствительна исключительно к одному параметру − плотности вещества. МРТ является относительно молодым методом: если прототип рентгеновской компьютерной томографии (РКТ) − рентгеновское просвечивание − появился вскоре после открытия в 1895 г. рентгеновских лучей, то само явление, которое используется в МРТ, − ядерный магнитный резонанс (ЯМР) − было открыто лишь в 1945 г. Только почти тридцать лет спустя, в 1973 г., были осуществлены первые эксперименты по получению изображений с помощью ЯМР (П. Лаутербур, США), а основанные на этом принципе экспериментальные приборы медицинского назначения появились только в начале 80-х годов прошлого века. Справедливости ради, следует отметить, что публикации о возможности использования магнитного 5 резонанса для визуализации внутренних органов человека имелись и раньше (статья 1971 г. и патент 1972 г. Р. Дамадиана, а также его же сообщение о получении первого изображения внутренних органов человека с помощью ЯМР). Кроме того, свидетельство на изобретение метода визуализации с помощью ядерного магнитного резонанса было выдано бывшему выпускнику Ленинградской академии им. Можайского В. А. Иванову (СССР) в 1984 г. с приоритетом от 1960 г. (!). Высокая оценка как научной, так и практической значимости исследований в области МРТ проявилась в присуждении Нобелевской премии в области физиологии и медицины за 2003 год ученым, внесшим значительный вклад в развитие этого направления − П. Лаутербуру (США) и П. Мэнсфилду (Великобритания) «за их открытия, относящиеся к магнитно-резонансному отображению». Однако следует признать, что по данным МРТ удается как правило выявить лишь макроскопические морфологические изменения тканей организма, в то время как функциональные сдвиги, лежащие на биохимическом уровне, часто оказываются нераспознанными. Поэтому поиск новых методик МР-обследования, позволяющих продвинуться в направлении изучения именно функционального состояния органов и систем, является в настоящее время одним из приоритетных направлений исследований. Одной из самых перспективных в данном отношении является магнитно-резонансная спектроскопия (МРС) – методика неинвазивного определения биохимического состава тканей обследуемого организма. Она появилась задолго до магнитно-резонансной томографии и первоночально использовалась для биохимического анализа различных проб in vitro. С появлением же высокопольных магнитно-резонансных томографов появилась возможность применения ее и в условиях in vivo. С развитием техники МРТ появляются все новые сообщения о значительных возможностях МРС в углублении медицинских знаний и понимании некоторых аспектов нормальной и патологической физиологии человека. Описанию методов МРТ и МРС, рассмотрению их возможностей в медицинской диагностике, перспективам развития в большей степени посвящена эта монография. Материалы, представленные здесь, охватывают новое направление применения магнитного резонанса в медицинской диагностике – метод диагностического магнитного резонанса (ДМР). Принцип, лежащий в основе ДМР, – использование магнитных наночастиц в качестве бесконтактных биосенсоров, модулирующих время спин-спиновой релаксации Т2 соседних 6 молекул воды. На сегодняшний день магнитные биосенсорные наночастицы разработаны для обнаружения широкого спектра целей, включая ДНК/микроРНК, белки, ферменты, лекарственные препараты, патогены и опухолевые клетки. В последнее время возможности технологии ДМР значительно шагнули вперед благодаря разработке миниатюрных, основанных на чипе, ЯМР-детектирующих систем (микро-ЯМР), которые способны выполнять высокочувствительные измерения в микролитровых объемах образца и в мультиплексном комбинированном формате. С учетом этих достижений, метод ДМР содержит в себе большие перспективы для создания высокопроизводительных, портативных, недорогих микроплатформ для широкого молекулярного и клеточного скрининга в условиях клиник и пунктах оказания первичной медицинской помощи. Приведенные научно-популярные материалы будут способствовать ознакомлению более широкого круга исследователей с возможностями метода ДМР с целью его более широкого практического внедрения в медицинской диагностике. Пособие будет также полезно и для обеспечения научно-исследовательского и учебного процессов при подготовке молодых специалистов (магистров и аспирантов) в рамках современных образовательных инновационных программ. 7 1. Принципы диагностического магнитного резонанса Одна из основных проблем в медицине – быстрое и точное измерение биомаркеров белков, клеток и патогенов в биологических образцах. В последнее время было разработано множество новых диагностических платформ для измерения биомолекул и клеток с высокой чувствительностью, которые позволили бы выявлять болезни на ранних стадиях или предоставляли ценную биологическую информацию на молекулярно-клеточном уровне. Большинство биологических образцов демонстрируют незначительную магнитную восприимчивость, поэтому магнитные наночастицы используются в разнообразных приложениях, включая биосенсоры, магнитную сепарацию и тепловую абляционную терапию. Этот раздел посвящен использованию магнитных наночастиц для обнаружения биомолекул и клеток на основе эффектов магнитного резонанса, использующих общую платформу детектирования, которая называется диагностическим магнитным резонансом (ДМР). Технология ДМР включает в себя многочисленные конфигурации анализа и принципов детектирования, и на сегодняшний день магнитные наночастицы биосенсоры были разработаны для обнаружения широкого спектра целей, включая ДНК/микроРНК, белки, ферменты, лекарственные препараты, патогены и опухолевые клетки. Принцип, лежащий в основе ДМР, – использование магнитных наночастиц в качестве бесконтактных сенсоров, модулирующих время спин-спиновой релаксации Т2 соседних молекул воды, изменение которого может быть определено с использованием клинических МРТ-сканеров или настольных ЯМР-релаксометров. В последнее время возможности технологии ДМР значительно шагнули вперед благодаря разработке миниатюрных, основанных на чипе ЯМР-детектирующих систем (микро-ЯМР), которые способны выполнять высокочувствительные измерения в микролитровых объемах образца и в мультиплексном комбинированном формате. С учетом этих и будущих достижений, технология биосенсоров ДМР содержит в себе большие перспективы для создания высокопроизводительных, портативных, недорогих платформ для широкого молекулярного и клеточного скрининга в условиях клиник и пунктах оказания первичной медицинской помощи. Развитие надежных, универсальных и высокопроизводительных биосенсорных платформ, как ожидается, имеет большие перспективы в медицине, предклинической диагностике, развитии фармацевтических 8 препаратов и исследованиях белков и генома. Обусловленные быстрым развитием нанотехнологий (наночастиц, нанотрубок и нанопроволок) и микротехнологий (МЭМС микроэлектромеханических систем, микрофлуидных систем и КМОП - комплементарных металло-оксидных полупроводников), несколько новых биосенсорных платформ были предложены и апробированы для биомедицинских применений [1] – [9]. Несмотря на эти достижения, остается необходимость в разработке практических методик анализа, которые: 1) будут иметь более высокую чувствительность и специфичность, 2) сведут к минимуму подготовку образца, 3) смогут регистрировать различные типы молекул, используя тот же самый формат и средства измерений, 4) смогут использовать или одиночные пробирки в пунктах оказания первичной помощи, или скрининговые форматы с высокой пропускной способностью. Эти обязательные предпосылки необходимы для перевода этих микроплатформ в клиническую практику, поскольку молекулярные измерения должны быть выполнены на все более меньших и меньших объемах образцов, чтобы была возможность проводить мультиплексные и продолжительные мониторинги для того, чтобы курсы лечения могли корректироваться индивидуально для пациентов в режиме реального времени. Биосенсорные стратегии, основанные на магнитных наночастицах, привлекли большое внимание, потому что они предлагают уникальные преимущества по сравнению с другими методами. Например, магнитные наночастицы недороги в производстве, физически и химически стабильны, биосовместимы, экологически безопасны. Кроме того, биологические образцы демонстрируют отсутствие магнитного фона, и, следовательно, высокочувствительные измерения могут быть выполнены в мутных или иным образом визуально скрытых образцах без предварительной обработки. Оптические же методы, часто подвержены влиянию рассеяния, поглощения, и/или самофлуоресценции в образце. На сегодняшний день были разработаны многочисленные методы для детектирования биомолекул с использованием магнитных меток [10]. Они включают в себя методики, которые используют магнитометры, такие как SQUID [11], [12], магниторезистивные датчики [13] – [20], и датчики Холла [21] для непосредственного детектирования магнитных частиц. 9 Другой метод, в котором были достигнуты значительные успехи, основан на ядерном магнитном резонансе (ЯМР). Он предполагает использование магнитных наночастиц в качестве опосредованных датчиков изменения скорости релаксации соседних молекул воды. Эта методика получила название диагностического магнитного резонанса (ДМР). Метод ДMР использует способность молекул, связанных (коньюгированных) с магнитными наночастицами, присоединяться к молекулярным мишеням и вызывать изменения в скорости релаксации протонов исследуемых биологических жидкостей, используя один из двух различных процедурных "режимов". Первый включает в себя мечение крупных структур, таких как целые клетки, и требует последующей стадии очистки, чтобы удалить несвязанные наночастицы - сенсоры. Второй режим использует явление магнитно-релаксационного переключения (magnetic relaxation switching MRSw), в котором молекулярные мишени используются для соединения магнитных наночастиц в кластеры, что вносит изменения в скорость релаксации протонов всего образца [22], [23]. В обоих случаях связывающие взаимодействия осуществляются одинаково во всем растворе и распространяют этот эффект магнитного резонанса на миллиарды соседних молекул воды. Таким образом, ДМР является более быстрым методом измерений, чем другие методы магнитного детектирования, которые требуют твердофазной иммобилизации, диффузии наночастиц к детектирующим элементам или наличия стадий дискретной амплификации. На сегодняшний день ДМР успешно используется для обнаружения широкого спектра молекулярных мишеней с высокой чувствительностью и специфичностью, включая ДНК, РНК, белки, активные ферменты, метаболиты, лекарства, патогены и раковые клетки (см. Табл. 1). Первоначально измерения ДМР проводились с использованием клинических сканеров МРТ или настольных ЯМР-спектрометров [22], [24]. Недавно, миниатюрные, основанные на чипе системы детектирования ЯМР (микро-ЯМР) были разработаны таким образом, чтобы все компоненты детектирования ДМР размещались в переносном портативном устройстве. Устройства на микро-ЯМР-чипе способны выполнять измерения на микролитровых объемах образца и содержат несколько катушек для параллельного детектирования многочисленных биомаркеров, и, таким образом создают значительное преимущество технологии ДMР, что может позволить проводить анализ клинических образцов в пунктах оказания первичной медицинской помощи. 10 Таблица 1 Объекты детектирования в диагностическом магнитном резонансе Тип Мишень Сенсорные магнитные Ссылки наночастицы Теломеры (CCCTA)3CLIO 28 ДНК GFP CLIO-ATTTGCCGGTGT и CLIO- 22 РНК TCAAGTCGCACA GFP Anti-GFP-CLIO 22 Белок Авидин (Avidin) Biotin-CLIO 25, 29 β-HCG Anti-HCG-CLIO 30 Теломераза Anti-telomerase-CLIO 31 CA-125 Anti-CA-125-CLIO 25 VFGF Anti-VFGF-CLIO 25 α- фетопротеин Anti-α-fetoprotein -CLIO 25 CLIO-Av-Biotin-GDEVDG-CLIO 22 Ферментативная Каспаза-3 активность BamH1 CLIO-TTA-CGC-CTAGG-ATC-CTC и 32 CLIO-AAT-GCG-GGATCC-TACGAG Метилаза, Mbol, Метилированный BamH1 рецептор 33 Dpnl Ренин (химозин) Biotin-IHPFHLVIHTK-Biotin; Av- 33 CLIO Трипсин Biotin-(G)4RRRR(G)3K-Biotin или 33 Biotin-GPARLAIK-Biotin; Av-CLIO MMP-2 Biotin-GDEVDG-CLIO и CLIO- 28, 31 AATCCCAATCCC Каспаза-3 Biotin-GDEVDG-CLIO; Av-CLIO 22 Теломераза CLIO-AATCCCAATCCC and CLIO- 28, 31 AATCCCAATCCC Пероксидазы Phenol-CLIO, tyrosines-CLIO 34 Лекарства, D-Phenylalanine-CLIO 35 Малые энантиомеры молекулы Фолат Folate-CLIO; anti-folate 36 Глюкоза Glucose-CLIO; concavalin 36 Белок HA HA-CLIO; anti-HA 36 Кальций Calmodulin-CLIO; M13-CLIO or 37, 38 chelaters Белок гриппа Anti-Tag-CLIO 39, 40 герпеса Anti-gpD(HSV-1)-CLIO; Anti-HSV1- 41 Микроорганизм Вирус simplex CLIO Аденовирус-5 Anti-Adenovirus-5-CLIO 41 MAP Anti-MAP-CLIO 42 S. aureus Vancomycin-CLIO 25 BCG/MTB Anti-BCG-CLIO, Anti-BCG-CB 27 Ряды опухолевых Anti-Her2-CLIO; Anti-EGFR-CLIO; 25 Клетки клеток Anti-EpCAM-CLIO FNA (ксено- Anti-Her2-MnMNP; Anti-EGFR- 26 трансплантат MnMNP; Anti-CD326-MnMNP мыши) 11 2. Свойства и механизмы магнитной релаксации протонов биологических жидкостей в присутствии магнитных наночастиц В последнее время подробно обсуждаются механизмы и теоретические модели магнитно-резонансной релаксации протонов биологических жидкостей, содержащих магнитные наночастицы [43]. Наночастицы оксида железа обычно являются парамагнитными, они намагничиваются в присутствии внешнего магнитного поля и утрачивают свой магнитный момент, как только убирают внешнее магнитное поле. Эти явления возникают потому, что наночастицы состоят из одиночного кристаллического домена, и таким образом, проявляют магнитный момент, направленный вдоль оси анизотропии. Однако при помощи тепловой энергии магнитный момент может преодолеть анизотропный барьер и самопроизвольно перевернуться от одного направления анизотропии к другому. В результате ансамбль наночастиц проявляет незначительную остаточную магнитную индукцию. Если наночастицы находятся во внешнем магнитном поле, то их магнитные моменты выстраиваются вдоль направления линий индукции магнитного поля и усиливают магнитный поток. Такое поведение подобно парамагнетизму, но так как оно связано с большим количеством частиц с фиксированным магнитным моментом, то это явление называют суперпарамагнетизмом. Несмотря на то, что наночастицы подвергаются влиянию внешнего магнитного поля, каждая наночастица, имея значительный магнитный момент, создает результирующий градиент локального магнитного поля, приводящий к неоднородности внешнего магнитного поля, которая разрушает когерентную (согласованную) прецессию ядерных спинов соседних протонов воды. Конечный результат заключается в изменении сигнала ядерного магнитного резонанса, которое можно измерить посредством методик магнитного резонанса (ЯМР/МРТ) как сокращение времён продольной (или спинспиновой, Т1) и поперечной (или спин-решёточной, Т2) релаксаций. Для практических приложений ДМР при зондировании биообъектов обычно используют время Т2, потому что значение эффективной поперечной релаксивности (r2) значительно больше, чем значение продольной релаксивности r1 протонов исследуемых жидкостей для большинства магнитных наночастиц. Это очень важно, потому что чем больше эффективная релаксивность, тем меньшее количество магнитных наночастиц в единице объема образца требуется для возникновения поддающегося обнаружению сигнала ЯМР. 12 Свойства магнитной релаксации протонов воды в случае совокупности наночастиц зависят не только от релаксивности протонов для отдельных частиц. Вместе с этим, состояние совокупности наночастиц является также важным, так как объединение частиц в кластеры увеличивает общую скорость поперечной релаксации (R2 = 1/T2) [22], [23]. Это явление, известное как магнитно-релаксационное переключение (magnetic relaxation switching - MRSw), является совместным процессом, в котором при кластеризации магнитных наночастиц их непосредственное взаимодействие вызывает более эффективное расфазирование спинов соседних протонов воды по сравнению с тем, когда наночастицы равномерно диспергированы (рис. 1а), что приводит к укорочению времени поперечной релаксации T2 протонов растворов воды. Возможен и обратный процесс, когда разборка кластеров увеличивает время релаксации T2. Рис. 1. Принципы ДМР-тестирования с использованием магнитных наночастиц. (а) Магнитно-релаксационное переключение (MRSw) включает ансамбль кластеров магнитных наночастиц, используя биомаркер-мишень в качестве связующего мостика, или разборку образованных кластеров, используя ферменты или конкурентное связывание. (b) - Клетки, захваченные магнитными наночастицами, обладают магнитным моментом, который пропорционален числу связанных наночастиц. Последующие процедуры отмывки удаляют несвязанные наночастицы, чей магнитный момент может быть измерен через уменьшение поперечного времени релаксации T2 [25]. 13 Действующая гипотеза, сформулированная для объяснения механизма релаксационного переключения, основана на теории внешней сферы, которая предсказывает, что релаксивность частиц прямо пропорциональна их площади поперечного сечения [44], [45]. Соответственно, когда наночастицы объединяются в кластеры, тогда эффективная площадь поперечного сечения превышает аддитивный вклад от каждой частицы, что приводит к большему и относительно более сильнодействующему магнитному диполю. На продольную намагниченность кластеризация не влияет, и поэтому r1 можно использовать в качестве меры совокупной концентрации наночастиц независимо от их агрегатного состояния [23]. Как показано на рисунке 1(а), тестирование методом магнитнорелаксационного переключения может быть осуществлено с помощью способности магнитных наночастиц самостоятельно объединяться при добавлении молекулярных мишеней (прямое переключение, уменьшение T2) или с помощью разборки предварительно собранных кластеров посредством ферментного расщепления или конкурентного связывания (обратное переключение, увеличение T2). Методика прямого переключения основывается на поперечном связывании магнитных наночастиц в кластеры с использованием в качестве мостиков молекулярных мишеней. Таким образом, они идеально подходят для обнаружения маленьких молекул, таких как лекарства, метаболиты, олигонуклеотиды и белки, потому что короткие поперечные связи предполагают достаточно близкое расположение магнитных наночастиц, чтобы обеспечить релаксационное переключение. Кроме того, нет необходимости в долговременной сепарации или в методике улавливания, потому что исследования по изменению магнитной релаксации могут быть выполнены в мутных растворах, таких как кровь, и они не требуют удаления несвязанных магнитных наночастиц. Интересно, что с увеличением валентности мишени с помощью соединения с белком или микрочастицей-носителем, улучшается чувствительность детектирования в большее число раз, чем рост валентности [39]. Это возможно вследствие того, что мишени с большей валентностью могут более эффективно стимулировать кластеризацию наночастиц, то есть в методике MRSw не выполняется принцип эквивалентности (максимальная чувствительность при эквимолярном соотношении магнитных частиц и мишеней), который доминирует в обычных условиях. Поэтому, может быть более выгодно, если сначала захватить мишени наночастицами, а затем уже выполнить 14 переключение, чтобы использовать этот эффект валентности. Для экспериментов по обратному переключению, сначала, аналогично прямому эксперименту, образуются кластеры наночастиц, а потом добавляются ферменты, который разрушают молекулярные мостики в определённых местах, или осуществляется конкурентное связывание молекул, что дестабилизирует поперечные связи. Магнитные наночастицы также можно использовать для маркирования метками поверхности клетки и посредством этого наделять клетку магнитным моментом, пропорциональным количеству связанных наночастиц (рис. 1 б). Этот метод требует удаления избыточных магнитных наночастиц до момента измерения времени релаксации T2, однако, это можно без труда сделать посредством центрифугирования или фильтрации. Концепция магнитного мечения широко применяется для получения высококонтрастных МР-изображений. 15 3. Магнитные биосенсорные наночастицы Магнитные наночастицы, используемые для ДМР-тестирования, в идеале должны иметь сильный магнитный момент, чтобы создавать резко выраженные изменения T2, и одновременно обладать суперпарамагнитными свойствами, чтобы избежать спонтанной магнитной агрегации. К тому же, наночастицы должны быть пассивированы в гидрофильную и биосовместимую оболочку для предотвращения агрегации в водном растворе и обладать способностью по сродству электронов для присоединения молекул, таких, как антитела, ДНК или пептиды. Конечно, наночастицы меньшего размера предпочтительны, потому что они обычно проявляют более высокую стабильность в растворе (нет осаждения) и, для применений в мечении клеток, они могут упаковываться более плотно для получения максимальной площади поверхности покрытия. Наночастицы оксида железа с поперечными связями Наночастицы оксида железа с поперечными связями (сross-linked iron oxide - CLIO) преимущественно используются для биосенсорных применений ДМР, потому что они имеют превосходные биологические свойства [46]. CLIO-наночастицы содержат суперпарамагнитное ядро оксида железа (монокристаллические наночастицы оксида железа (MION), размером 3-5 нм), состоящее из ферримагнитного магнетита (Fe3O4) и/или маггемита (γ - Fe2O3). Маггемит структурно и функционально подобен магнетиту, но отличается в том, что он содержит катионные вакансии в подрешётке. Ядро оксида железа покрывают декстрановой оболочкой, которую затем поэтапно обрабатывают эпихлоргидрином, чтобы сформировать стабилизирующие поперечные связи, и аммиаком для обеспечения функциональности основных аминогрупп. Аминированные CLIO (амино-CLIO) наночастицы имеют средний гидродинамический диаметр 25-40 нм, где примерно 40-80 аминов приходится на одну частицу для коньюгирования биомолекул [47]. Аминогруппы могут затем реагировать с различными реагентами для присоединения биомолекул через ангидридные, аминные, гидроксильные, карбоксильные, тиоловые или эпоксидные группы [48]. Биоконьюгация CLIO с использованием катализируемых медью азид-алкинных реакций также была рассмотрена [49] – [51]. Магнитные наночастицы оксида железа, легированные марганцем 16 Магнитный момент наночастицы оксида железа может быть увеличен за счёт легирования кристаллов магнетита ионами металлов, такими как марганец, кобальт, никель [52]. Кроме того, релаксивность r2 возрастает пропорционально диаметру магнитного ядра [53]. Эти факторы были недавно использованы для создания магнитных наночастиц с существенно большей релаксивностью для применений ДMР [26]. Наночастицы на основе феррита, легированного марганцем (Mn-МNP), были синтезированы с помощью реакции ацетилацетоната железа (III) [Fe(acac)3], ацетилацетоната марганца (II) [Mn(acac)3] и 1,2-гексадеканедиола при высокой температуре (300 C). Метод зародышевого выращивания был затем использован для постепенного увеличения размеров кристалла ядра от 10 нм до 12, 16 и 22 нм. Полученные суперпарамагнитные монодисперсные Mn-МNP наночастицы с диаметром ≤ 16нм имели высокую кристаллическую ферритовую структуру (рис. 2 А), причем их намагниченность была пропорциональна диаметру ядра. Mn-МNP наночастицы приводили к высоким значениям релаксивности r2 протонов воды, порядка 6 × 10-11 с-1 (частиц / мл)-1(или 300 с−1 мM−1) в магнитном поле 0,5 Tл, что почти в 100 раз больше, чем для случая CLIO-наночастиц (0.07 × 10-11 с-1 (частиц / мл)-1, или 50 с−1 мM−1) [22]. Это связано отчасти с большими размерами ядра, но Mn-МNP наночастицы дают также примерно в шесть раз выше значение r2 протонов водных растворов в расчёте на единицу массы. Если предположить отношение числа биомаркеров к числу магнитных наночастиц один к одному, то релаксивность в пересчете на наночастицу будет наиболее актуальным параметром для характеристики эффективности ДMРтестирования. 17 Рис. 2. Магнитные наночастицы с более высокой релаксивностью, разработанные для улучшения чувствительности детектирования ДМР. А - Снимок, сделанный с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM), легированных марганцем ферритовых магнитных наночастиц (Mn-MNP). Б - Снимок TEM магнитных наночастиц с ядром из элементного железа и ферритовой оболочкой - “cannonballs” с диаметром ядра 11 нм и толщиной оболочки 2.5 нм. В - Mn-MNP и “cannonballs”-наночастицы вызывают более высокую релаксивность протонов растворов по сравнению с другими промышленно доступными или описанными магнитными наночастицами [26], [27]. Г Снимок TEM магнитных наночастиц с ядром из железа и ферритовой оболочкой с подстраиваемыми размером ядра и структурой оболочки. Д - Сравнение размера, релаксивности r2 и намагниченности насыщения различных легированных ферритовых наночастиц и наночастиц с ядром из элементарного железа, CLIO-наночастиц и MIONнаночастиц из монокристаллического оксида железа. Вместо того, чтобы использовать декстрановое покрытие, как в CLIOнаночастицах, в Mn-MNP наночастицах были применены водорастворимые небольшие молекулы мезо-2, 3 - димеркаптосукциниковой кислоты (DMSA) [52] – [54]. Молекулы DMSA имеет конечную группу карбоксильной кислоты на одном конце, непосредственно взаимодействующую с магнитным ядром, в то время как другой конец молекулы содержит сульфогидрильную группу, которая может образовывать дитиолперекрестные связи с другими молекулами DMSA для повышения устойчивости. Оставшиеся свободные сульфогидрильные группы могут быть использованы для присоединения биомолекул с помощью дитиольных связей или малеимидной химии. Из-за небольших размеров DMSA, Mn-MNP наночастицы меньше, чем CLIO-наночастицы, несмотря на большее магнитное ядро. Наночастицы с ядром из элементного железа и ферритовой оболочкой Элементное железо (Fe) имеет более высокую степень намагничивания, чем оксиды металлов, и этот аспект привёл к созданию магнитных 18 наночастиц с ядрами из элементного железа с экстремально высокой релаксивностью протонов [55], [56]. Ядра элементного железа должны быть защищены от окисления, что достигается использованием ферритовой оболочки. Недавно, 16 нм магнитные наночастицы с ядром элементного железа и ферритовой оболочкой, названные “cannonballs” (“пушечные ядра”), были разработаны для применения в ДМР (Рис. 2 Б) [27]. Релаксивность в случае “cannonballs” была подобна Mn-MNP наночастицам (6х10-11 s-1 (частиц/мл) [1]), что значительно выше, чем для других коммерчески доступных или известных ранее ферритовых наночастиц (Рис. 2 С). Ядра элементного железа “Сannonballs” были синтезированы тепловым разложением Fe(CO)5. Защитная ферритовая оболочка затем была сформирована с помощью контролируемого окисления кислородом при высокой температуре, что позволило получить более тонкие оболочки по сравнению с химическими окислителями, использовавшимися ранее [56]. Затем “сannonballs” были покрыты ДМСА кислотой как описывалось выше для магнитных наночастиц Mn-MNP. Затем магнитные наночастицы с ядром железа были усовершенствованы с помощью развития нового комплексного подхода для подстраиваемых размера ядра и структуры оболочки (Йюн и др., 2011). Эти магнитные наночастицы нового поколения состоят из ядра железа и искусственной ферритовой оболочки (Fe@MFe2O4, M = Fe, Mn, Co). Ядра железа были доведены до термостойкого ферромагнитного состояния для увеличения общей намагниченности. Вместо традиционного окисления ядра железа для формирования оболочки была использована методика выращивания защитных ферритных оболочек на ядрах, а затем выполнено легирование металлом для большего усиления намагниченности. Полученные частицы проявляли уникальные магнитные свойства и показывали наличие гистерезиса с незначительной коэрцитивной силой. Дальнейший анализ показал, что оболочка эффективно уменьшает коэрцитивную силу ферромагнитных ядер. Полученные частицы, в особенности наночастицы Fe@MnFe2O4 (Рис. 2 С), достигают больших значений насыщения намагниченности (796 кА/м) и релаксивности протонов водных растворов r2 (7∙10-14 л/с на одну частицу; 430 1/с∙мМ) (Рис. 2 Д), но обладают незначительной остаточной намагниченностью для предотвращения процесса агрегации между частицами. Применение наночастиц Fe@MnFe2O4 для исследований ДМР показало превосходные 19 результаты при обнаружении авидина в количестве одного пикомоля и отдельных раковых клеток в образцах цельной крови [25] - [27]. Магнитные частицы микро-размеров Хотя данный обзор фокусируется на использовании магнитных наночастиц для биосенсорного детектирования, микро-размерные магнитные частицы также проявляют некоторые интересные свойства для тестирования с магнито-релаксационным переключением [40]. Например, микрочастицы имеют больший магнитный момент, потому что содержат значительно больше атомов Fe на одну частицу и имеют более сильную валентность связи. Кроме того, помещение микрочастиц в магнитное поле на продолжительный период времени, побуждает их объединяться в кластеры, которые расформировываются при снятии действия поля. Это свойство магнитного поля объединять магнитные частицы в кластеры, как было показано, значительно увеличивает чувствительность детектирования. Большие размеры микро-размерных кластеров служат причиной быстрого осаждения раствора, усложняя при этом анализ считывания. Поэтому, хотя это и интересно, микрочастицы имеют значительный барьер для использования в приложениях с магнитно-релаксационным переключением и не будут далее обсуждаться в данном разделе. Благодаря их маленькому размеру, броуновское движение не дает возможности усиления чувствительности за счет индукции магнитного поля для наночастиц. 20 4. Магнитно-релаксационные детектирующие устройства Стандартные магнитно-релаксационные детекторы Сигналы ЯМР могут быть обнаружены как с помощью сканеров МРТ, которые используются для получения четкого и детального изображения тела, так и с помощью ЯМР-спектроскопии, которая используется для изучения биомолекулярных структур. Оба этих метода были использованы для измерения времени спин-спиновой релаксации Т2 для биосенсоров ДМР. Клинические и экспериментальные МРТ-сканеры используют сильные магнитные поля (1–11 Tл), получаемые с помощью сверхпроводящих магнитов, а также сложные электронные схемы для получения и накопления данных. Однако, сканеры МРТ непрактичны из-за высоких эксплуатационных расходов, большого размера оборудования (главным образом из-за сверхпроводящих магнитов), а также из-за необходимости в относительно большом объёме образца (сотни микролитров). Настольные релаксометры являются более дешёвой альтернативой, делая их более доступными для использования в ДМР-тестировании [22], [41]. Настольные системы работают на более низких частотах ЯМР (100 kHz–50 MHz) и оснащены постоянным низкопольным магнитом (<1 Тл). Однако, настольные системы не имеют возможности выполнять параллельные измерения и пока еще требуют относительно большого объема образца. Миниатюрный чип ЯМР Чтобы преодолеть ограничения имеющихся стандартных детекторов, недавно была разработана микро-ЯМР система на чипе для выполнения мультиплексных измерений ДМР на меньших объёмах образца [25]. МикроЯМР система состоит из микрокатушек, предназначенных как для возбуждения радиочастотного поля, так и детектирования сигналов ЯМР, размещенного на плате ЯМР-спектрометра, и микрофлуидной системы (рис. 3, a). Магнитное поле может быть получено с помощью маленького портативного магнита, потому что миниатюризация уменьшает необходимость пространственной однородности магнитного поля. Первый прототип микро-ЯМР системы был разработан с плоскими катушками, которые были литографическим способом нанесены на стеклянное основание [25]. Микрокатушки были расположены в формате для параллельных измерений, и каждая микрокатушка вмещала 5–10 мкл образца. Впоследствии, было разработано второе поколение микро-ЯМР 21 систем, где использовались соленоидальные микрокатушки, встроенные в микрофлуидную структуру для увеличения коэффициента заполнения (рис. 3, b) [26, 27]. Данная конфигурация сократила объем образца примерно до 1мкл и привела к более однородному радиочастотному магнитному полю с меньшим электрическим сопротивлением. Таким образом, микро-ЯМР система хорошо подходит для детектирования многочисленных мишеней ограниченных по массе биологических образцов и позволяет сохранить дорогие реагенты. Электроника ЯМР, которая включает РЧ-передатчик для возбуждения ЯМР образца и приемник для обнаружения сигнала ЯМР, была первоначально реализована с использованием дискретных компонентов [25]. В более поздних версиях они были монолитно интегрированы на одном чипе CMOS IC (интегральные схемы (ИС) на комплементарных МОП-структурах) [57]. Чип был разработан для того, чтобы преодолеть неблагоприятные условия для измерений ЯМР, вытекающие из миниатюризации системы: низкий уровень сигнала ЯМР от малых объемов образца и быстрое затухание сигнала (большое время Т2*) из-за неоднородности магнитного поля, вызванной постоянным магнитом. Эти ограничения были преодолены путём использования низкошумящих РЧ-усилителей с высоким коэффициентом усиления напряжения и разработки цифрового импульсного генератора на чипе для спин-эхо последовательностей (последовательности Карра-Парселла-Мейбума-Гилла - CPMG). Протонные времена релаксации были измерены с использованием последовательности импульсов «инверсия-восстановление» (T1) и последовательности импульсов «спинэхо» - CPMG (T2), чтобы компенсировать неоднородность поляризующего магнитного поля. 22 Рис. 3. Схематическое устройство миниатюризированного ЯМР-устройства для ДМР. (а) - Оригинальная система, состоящая из совокупности планарных микрокатушек для ЯМР-измерений, микрофлуидных систем для транспортировки и смешивания образцов, миниатюризированной ЯМР-электроники и небольшого, портативного магнита для генерации поляризующего магнитного поля. Дополнительные рисунки, указанные стрелками, изображают (по часовой стрелке) планарную микрокатушку, схему ЯМРэлектроники и микрофлуидную систему. (b) - Второе поколение микро-ЯМР системы с соленоидальной катушкой, встроенной в микрофлуидную систему, которая увеличивает коэффициент заполнения, увеличивает отношение сигнал/шум и уменьшает требуемый объём образца до ̴ 1 мкл. Образец был размещен вместе со всей ЯМР-электроникой на отдельном CMOS IC чипе. (c) - Изображение мембранного фильтра, который может быть установлен на выходе катушки [26], [27]. Микрофлуидные системы облегчают транспортировку и распределение небольшого объема образца, смешивание различных потоков жидкостей и размещение образца в самой чувствительной области микрокатушки. Кроме того, может быть установлен мембранный фильтр на выходе соленоидальной микрокатушки для селективного по размерам удержания больших частиц, таких как клетки, и удаления более мелких примесей, таких как несвязанные магнитные наночастицы, таким образом делая возможным концентрирование клеток из всего большого объёма образца и выполнение стадий отмывки образца на чипе. (Рис. 3 c) [26], [27]. Совсем недавно было разработано третье поколение устройства – микро-ЯМР-3 [58], [59], оптимизированное для стандартных клинических применений. Основная проблема продвижения микро-ЯМР систем из 23 научных лабораторий в клиническую практику заключалась в присущей им зависимости чувствительности измерений от температуры. Чувствительность к температуре происходит от температурно-зависимой флуктуации магнитного поля, создаваемого постоянным магнитом. Эти флуктуации приводят к дрейфу частоты ЯМР, который вызывает артефакт в значениях измеренного времени T2. В лабораторных условиях проблему можно решить с помощью контроля температуры окружающей среды и температуры ЯМР-системы. Однако такое решение значительно повышает стоимость и размер микро-ЯМР системы, осложняющее её использование в пунктах оказания первой помощи. В новой микро-ЯМР-3 системе эта проблема была решена посредством электронной схемы обратной связи, которая автоматически следит за изменениями температуры и соответствующим образом перестраивает настройки измерений. Это решение гарантирует безотказные и надёжные измерения ДМР. Например, когда режим слежения за температурой выключен, тогда значения T2 флуктуируют вплоть до 200% от первоначального значения в обычных лабораторных условиях. При включённом режиме слежения, однако, изменения T2 значительно уменьшаются (<1%). МикроЯМР-3 система имеет и другие важные перспективы для практического использования. В отличие от предыдущих модификаций микро-ЯМР систем, в ней электронные схемы собраны из готовых IC чипов (например, микроконтроллеры, РЧ синтезаторы), что уменьшило стоимость прибора (<200 $) и улучшило возможность программирования. Кроме того микроЯМР-3 система может связываться с мобильными устройствами (например, iPhoneTM, iPADTM) для управления измерениями. Это максимально увеличивает портативность микроЯМР-3 системы и улучшает удобство в эксплуатации. Медицинский персонал может получать результаты прямо через специальные ДМР-приложения и записывать/открывать к ним доступ через беспроводную сеть для отдалённых клинических отделений. Вся диагностическая платформа (система) ЯМР может быть легко упакована как портативное переносимое средство для действий в пунктах оказания первичной помощи. Кроме того, сравнительный анализ со стандартными ЯМР-системами показал, что чувствительность обнаружения сопоставима, но при этом существенно уменьшался объем образца и стоимость устройства. Таблица 2 содержит краткие сведения о различных детектирующих платформах магнитного резонанса, применяемых в ДМР. 24 Таблица 2 Платформа Размер, помещение Микрофлуидная система Клинический МРТ-сканер Эксперименталь ный МРТ-сканер ЯМРрелаксометр Микро-ЯМР-1 (планарные катушки, дискретные ИС) Микро-ЯМР-2 (соленоидальные катушки, КМОП ИС) Комната Нет Комната Мультиплексность измерений Объём образца Цена ($) Литера тура Да ̴ 1 мл 2 млн. 28, Нет Да Настольный Нет Нет 500 тыс 50 тыс Смешивание Да 22, 31 25 28, Переносной >300 мкл >300 мкл 10мкл 22, 34 31 Переносной Смешивание, фильтр Да ̴ 1 мкл 100 26, 57 27, 100 Таким образом, ДМР является мощной биосенсорной технологией, которая обеспечивает уникальные преимущества перед другими методами анализа: - широкая применимость к различным типам мишеней (ДНК, протеины, метаболиты, клетки и др.), - использование различных режимов работы, - минимальные требования по подготовке образцов, - способность выполнять измерения в неизвестной/мутной среде, - высокая производительность измерений. Этот метод может иметь широкое применение в биомедицине, в том числе геномике/протеомике, биологии рака, общей биологии [59] - [62]. Например, в настоящее время имеется значительный интерес в развитии изучения редких популяций клеток, таких, как циркулирующие опухолевые клетки крови или раковые стволовые клетки [63], [64]. При помощи дополнительных устройств и методик обработки или очистки образцов, эта система cможет также облегчить перевод ДМР в клиническую практику для помощи в диагностике бесчисленных болезней и в разработке индивидуализированной терапии. В частности, низкая стоимость и портативность системы «микро-ЯМР» смогут помочь бороться с такими серьезными проблемами общественного здравоохранения, как туберкулез и ВИЧ в развивающихся странах. 25 Список литературы 1. Aebersold R., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. // Nature. – 2003. – Vol.422. – P. 198–207. 2. Aslan K., Lakowicz J.R., Geddes C.D. Plasmon light scattering in biology and medicine: new sensing approaches, visions and perspectives. // Curr. Opin. Chem. Biol. – 2005. – Vol. 9. – P. 538–544. 3. Heath J.R. Davis M.E. Nanotechnology and cancer. // Ann. Rev. Med. – 2008. – Vol. 59. – P.251–265. 4. Nam J.M., Thaxton C.S., Mirkin C.A. Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. // Science. – 2003. – Vol.301. – P.1884–1886. 5. Patolsky F., Timko B.P., Yu G., Fang Y., Greytak A.B., et al. Detection, stimulation, and inhibition of neuronal signals with high-density nanowire transistor arrays. // Science. – 2006. – Vol.313. – P.1100–1104. 6. Schroder L., Lowery T.J., Hilty C., Wemmer D.E., Pines A. Molecular imaging using a targeted magnetic resonance hyperpolarized biosensor. // Science. – 2006. - Vol.314. – P.446–449. 7. Stern E., Klemic J.F., Routenberg D.A., Wyrembak P.N., Turner-Evans D.B., et al. Label-free immunodetection with CMOS-compatible semiconducting nanowires. // Nature. – 2007. – Vol.445. – P.519–522. 8. Zheng G., Patolsky F., Cui Y., Wang W.U., Lieber C.M. Multiplexed electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays. // Nat. Biotechnol. – 2005. – Vol. 23. – P.1294–1301. 9. Sha M.Y., Xu H., Natan M.J., Cromer R. Surfaceenhanced Raman scattering tags for rapid and homogeneous detection of circulating tumor cells in the presence of human whole blood. // J. Am. Chem. Soc. – 2008. – Vol. 130. – P.17214–17215. 10. Tamanaha C.R., Mulvaney S.P., Rife J.C., Whitman L.J. Magnetic labeling, detection, and system integration. // Biosens. Bioelectron. – 2008. – Vol. 24. – P.1–13. 11. Kotitz R., Matz H., Trahms L., Koch H., Weitshies W., et al. SQUID based remanence measurements for immunoassays. // IEEE Trans. Appl. Superconduct. – 1997. – Vol.7. – P.3678–3681. 12. Chemla Y.R., Grossman H.L., Poon Y., McDermott R., Stevens R., et al. Ultrasensitive magnetic biosensor for homogeneous immunoassay. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – Vol.97. – P.14268–14272. 26 13. Baselt D.R., Lee G.U., Natesan M., Metzger S.W., Sheehan P.E., et al. A biosensor based on magnetoresistance technology. // Biosens. Bioelectron. -.1998. – Vol.13. – P.731–739. 14. Graham D.L., Ferreira H.A., Freitas P.P., Cabral J.M. High sensitivity detection of molecular recognition using magnetically labelled biomolecules and magnetoresistive sensors. // Biosens. Bioelectron. – 2003. – Vol.18. – P.483–488. 15. Li G., Sun S., Wilson R.J., White R.L., Pourmand N., et al. Spin valve sensors for ultrasensitive detection of superparamagnetic nanoparticles for biological applications. // Sens. Actuators A Phys. – 2006. – Vol.126. – P.98–106. 16. Parkin S.S., Kaiser C., Panchula A., Rice P.M., Hughes B., et al. Giant tunnelling magnetoresistance at room temperature with MgO (100) tunnel barriers. // Nat. Mater. – 2004. – Vol.3. – P.862–867. 17. Brzeska M., Panhorst M., Kamp P.B., Schotter J., Reiss G., et al. Detection and manipulation of biomolecules by magnetic carriers. // J. Biotechnol. – 2004. – Vol. 112. – P.25–33. 18. Osterfeld S.J., Yu H., Gaster R.S., Caramuta S., Xu L., et al. Multiplex protein assays based on real-time magnetic nanotag sensing. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2008. – Vol.105. –P.20637–20640. 19. Graham D.L., Ferreira H., Bernardo J., Freitas P.P., Cabral J.M.S. Single magnetic microsphere placement and detection on-chip using current line designs with integrated spin valve sensors: biotechnological appliations. // J. Appl. Phys. – 2002. – Vol.91. – P.7786–7788. 20. Wang S.X., Bae S.Y., Li G., Sun S., White R.L., et al. Towards a magnetic microarray for sensitive diagnostics. // J. Magn. Mater. – 2005. – Vol.293. – P.731–736. 21. Aytur T., Foley J., Anwar M., Boser B., Harris E., et al. A novel magnetic bead bioassay platform using a microchip-based sensor for infectious disease diagnosis. // J. Immunol. Methods. - 2006. – Vol.314. – P.21–29. 22. Perez J.M., Josephson L., O’Loughlin T., Hogemann D., Weissleder R. Magnetic relaxation switches capable of sensing molecular interactions. // Nat. Biotechnol. – 2002. – Vol.20. – P.816–820. 23. Josephson L., Perez J.M., Weissleder R. Magnetic nanosensors for the detection of oligonucleotide sequences. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. – 2001. – Vol.40. – P.3204–3206. 24. Hogemann D., Ntziachristos V., Josephson L., Weissleder R. High throughput magnetic resonance imaging for evaluating targeted nanoparticle probes. // Bioconjug. Chem. – 2002. – Vol.13. - P.116–121. 27 25. Lee H., Sun E., Ham D., Weissleder R. Chip-NMR biosensor for detection and molecular analysis of cells. // Nat. Med. – 2008. – Vol.14. – P.869– 874. 26. Lee H., Yoon T.J., Figueiredo J.L., Swirski F.K., Weissleder R. Rapid detection and profiling of cancer cells in fine-needle aspirates. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2009. – Vol.106. – P.12459–12464. 27. Lee H., Yoon T.J., Weissleder R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. – 2009. – Vol.48. – P.5657–5660. 28. Grimm J., Perez J.M., Josephson L., Weissleder R. Novel nanosensors for rapid analysis of telomerase activity. // Cancer Res. – 2004. – Vol.64. – P.639– 643. 29. Taktak S., Sosnovik D., Cima M.J., Weissleder R., Josephson L. Multiparameter magnetic relaxation switch assays. // Anal. Chem. – 2007. – Vol.79. – P.8863–8869. 30. Kim G.Y., Josephson L., Langer R., Cima M.J. Magnetic relaxation switch detection of human chorionic gonadotrophin. // Bioconjug. Chem. – 2007. – Vol.18. – P.2024–2028. 31. Perez J.M., Grimm J., Josephson L., Weissleder R. Integrated nanosensors to determine levels and functional activity of human telomerase. // Neoplasia. – 2008. – Vol.10. – P.1066–1072. 32. Perez J.M., O’Loughin T., Simeone F.J., Weissleder R., Josephson L. DNA-based magnetic nanoparticle assembly acts as a magnetic relaxation nanoswitch allowing screening of DNA-cleaving agents. // J. Am. Chem. Soc. – 2002. – Vol.124. – P.2856–2857. 33. Zhao M., Josephson L., Tang Y., Weissleder R. Magnetic sensors for protease assays. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. – 2003. – Vol.42. – P.1375–1378. 34. Perez J.M., Simeone F.J., Tsourkas A., Josephson L., Weissleder R. Peroxidase substrate nanosensors for MR imaging. // Nano Lett. – 2004. – Vol.4. – P.119–122. 35. Tsourkas A., Hofstetter O., Hofstetter H., Weissleder R., Josephson L. Magnetic relaxation switch immunosensors detect enantiomeric impurities. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. – 2004. – Vol.43. – P.2395–2399. 36. Sun E.Y., Weissleder R., Josephson L. Continuous analyte sensing with magnetic nanoswitches. // Small. – 2006. – Vol.2.- P.1144–1147. 28 37. Taktak S., Weissleder R., Josephson L. Electrode chemistry yields a nanoparticle-based NMR sensor for calcium. // Langmuir. – 2008. – Vol.24. P.7596–7598. 38. Atanasijevic T., Shusteff M., Fam P., Jasanoff A. Calciumsensitive MRI contrast agents based on superparamagnetic iron oxide nanoparticles and calmodulin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006. –Vol.103. – P.14707–14712. 39. Koh I., Hong R., Weissleder R., Josephson L.. Nanoparticle-target interactions parallel antibody–protein interactions. // Anal. Chem. – 2009. – Vol.81. – P.3618–3622. 40. Koh I., Hong R., Weissleder R., Josephson L. Sensitive NMR sensors detect antibodies to influenza. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. - 2008. – Vol.47. – P.4119–4121. 41. Perez J.M., Simeone F.J., Saeki Y., Josephson L., Weissleder R. Viralinduced self-assembly of magnetic nanoparticles allows the detection of viral particles in biological media. // J. Am. Chem. Soc. – 2003. Vol.125. – P.10192– 10193. 42. Kaittanis C., Naser S.A., Perez J.M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. // Nano Lett. – 2007. – Vol.7. – P.380–383. 43. Gossuin Y., Gillis P., Hocq A., Vuong Q.L., Roch A. Magnetic resonance relaxation properties of superparamagnetic particles. // WIREs Nanomed. Nanobiotechnol. – 2009. – Vol.1. – P.299–310. 44. Brooks R.A. T(2)-shortening by strongly magnetized spheres: a chemical exchange model. // Magn. Reson. Med. – 2002. – Vol.47. – P.388–391. 45. Gillis P., Moiny F., Brooks R.A. On T(2)-shortening by strongly magnetized spheres: a partial refocusing model. // Magn. Reson. Med. – 2002. – Vol.47. – P.257–263. 46. Harisinghani M.G., Barentsz J., Hahn P.F., Deserno W.M., Tabatabaei S., et al. Noninvasive detection of clinically occult lymph-node metastases in prostate cancer. // N. Engl. J. Med. – 2003. – Vol.348. – P.2491–2499. 47. Josephson L., Tung C.H., Moore A., Weissleder R. Highefficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-Tat peptide conjugates. // Bioconjug.Chem. – 1999. – Vol.10. – P.186–191. 48. Sun E.Y., Josephson L., Kelly K.A.,Weissleder R. Development of nanoparticle libraries for biosensing. // Bioconjug. Chem. – 2006. - Vol.17. – P.109–113. 29 49. Sun E.Y., Josephson L., Weissleder R. ‘Clickable’ nanoparticles for targeted imaging. // Mol. Imaging. – 2006. – Vol.5. – P.122–128. 50. Devaraj N.K., Keliher E.J., Thurber G.M., Nahrendorf M., Weissleder R. 18F labeled nanoparticles for in vivo PET-CT imaging. // Bioconjug. Chem. – 2009. – Vol.20. – P.397–401. 51. Thorek D.L., Elias D.R., Tsourkas A. Comparative analysis of nanoparticle-antibody conjugations: carbodiimide versus click chemistry. // Mol. Imaging. – 2009. – Vol.8. – P.221–229. 52. Lee J.H., Huh Y.M., Jun Y.W., Seo J.W., Jang J.T., et al. Artificially engineered magnetic nanoparticles for ultrasensitive molecular imaging. // Nat. Med. – 2007. Vol.13. – P.95–99. 53. Jun Y.W., Huh Y.M., Choi J.S., Lee J.H., Song H.T., et al. Nanoscale size effect of magnetic nanocrystals and their utilization for cancer diagnosis via magnetic resonance imaging. // J. Am. Chem. Soc. – 2005. –Vol.127. – P.5732– 5733. 54. Huh Y.M., Jun Y.W., Song H.T., Kim S., Choi J.S., et al. In vivo magnetic resonance detection of cancer by using multifunctional magnetic nanocrystals. // J. Am. Chem. Soc. – 2005. – Vol.127. – P.12387–12391. 55. Miguel O.B., Gossuin Y., Morales M.P., Gillis P., Muller R.N., et al. Comparative analysis of the 1H NMR relaxation enhancement produced by iron oxide and core–shell iron–iron oxide nanoparticles. // Magn. Reson. Imaging. – 2007. – Vol.25. – P.1437–1441. 56. Peng S., Wang C., Xie J., Sun S. Synthesis and stabilization of monodisperse Fe nanoparticles. // J. Am. Chem. Soc. – 2006. – Vol.128. – P.10676–10677. 57. Liu Y., Sun N., Lee H., Weissleder R., Ham D. CMOS mini nuclear magnetic resonance sysem and its application for biomolecular sensing. // ISSCC Digest Tech. Papers. – 2008. – Vol.1. – P.140–141. 58. Issadore D., Min C., Liong M., Chung J., Weissleder R., Lee H. Miniature Magnetic Resonance System for Point-of-Care Diagnostics. // Lab Chip. – 2011. – Vol.11. P.2282-2287. 59. Shao H., C Min, Issadore D., Min C., Liong M., Chung J., Weissleder R., Lee H. Magnetic Nanoparticles and microNMR for Diagnostic Applications. // Theranostics. – 2012. - Vol. 2(1). – P.55-65. 60. Perez J.M., Josephson L., Weissleder R. Use of magnetic nanoparticles as nanosensors to probe for molecular interactions. // Chembiochem. – 2004. – Vol.5. – P.261–264. 30 61. Daniel K.D., Kim G.Y., Vassiliou C.C., Jalali-Yazdi F., Langer R., et al. Multi-reservoir device for detecting a soluble cancer biomarker. // Lab. Chip. – 2007. – Vol.7. – p.1288–1293. 62. Daniel K.D., Kim G.Y., Vassiliou C.C., Galindo M., Guimaraes A.R., et al. Implantable diagnostic device for cancer monitoring. // Biosens. Bioelectron. – 2009. – Vol.24. – P.3252–3257. 63. Cristofanilli M., Budd G.T., Ellis M.J., Stopeck A., Matera J., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. // N. Engl. J. Med. – 2004. – Vol.351. – P.781–791. 64. Maheswaran S., Sequist L.V., Nagrath S., Ulkus L., Brannigan B., et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells. // N. Engl. J. Med. – 2008. – Vol.359. – P. 366–377. 31
