УДК. 577.216.3+577.218 С.М. Тайпакова, И.Т.Смекенов, А.К. Бисенбаев*
advertisement
УДК. 577.216.3+577.218 С.М. Тайпакова, И.Т.Смекенов, А.К. Бисенбаев* НИИ проблем биологии и биотехнологии, Казахский Национальный университет имени аль-Фараби, г. Алматы *e-mail: amangeldy.bissenbaev@kaznu.kz Создание рекомбинантного штамма Saccharomyces cerevisiae с геном целлобиогидролазы гриба Lentinula edodes в HO локусе хромосомы С помощью генно-инженерных методов сконструирована pHO-GAPDH-α-cel7A-myc-6His-KanMX4-HO интегральная конструкция, включающая ген целлобиогидролазы cel7A гриба Lentinula edodes с сигнальным пептидом α-фактора дрожжей, Мyc-эпитопом и гистидиновым хвостом. Создан новый стабильный штамм дрожжей с геном целлобиогидролазы cel7A гриба L. edodes. Хромосомная интеграция гена целлобиогидролазы cel7A гриба L. edodes в НО локус генома дрожжей была подтверждена методом ПЦР. Ключевые слова: целлобиогидролаза, Lentinula edodes, Saccharomyces cerevisiae, геномная интеграция, αфактор. С.М. Тайпақова, И.Т.Смекенов, А.К. Бисенбаев Хромосомасының НО локусында Lentinula edodes саңырауқұлағының целлобиогидролаза гені бар рекомбинантты Saccharomyces cerevisiae штаммын алу Гендік инженериялық әдістер көмегімен ашытқы α-факторының сигналды пептиді мен myc-эпитоп және 6xHis құйрығы бар Lentinula edodes саңырауқұлағының целлобиогидролазы ферментін кодтайтын сel7А кДНК гені енгізілген интегральді pHO-GAPDH-α-cel7A-myc-6His-KanMX4-HO вектор құрастырылды. L. edodes саңырауқұлағының целлобиогидролаза ферментін эффективті түрде экспрессиялауға және дақылдау ортасына секрециялауға қабілетті жаңа тұрақты ашытқы штаммы алынды. L. edodes саңырауқұлағының целлобиогидролаза cel7A генінің ашытқы геномының НО локусына интеграциялануы ПЦР көмегімен дәлелденді. Түйін сөздер: целлобиогидролаза, Lentinula edodes, Saccharomyces cerevisiae, геномдық интеграция, αфактор. S.M. Taipakova, I.T. Smekenov, A.K. Bissenbaev Construction of recombinant Saccharomyces cerevisiae strains containing cellobiohydrolase gene of Lentinula edodes into the chromosomal HO locus Using genetic engineering techniques the pHO-GAPDH-α-cel7A-myc-6His-KanMX4-HO integrated construction, including cellobiohydrolase gene cel7A of the Lentinula edodes with the signal sequence of yeast α-factor, Mycepitope and 6xHis tail have been designed. The new stable yeast strain efficiently expressing recombinant cellobiohydrolase CEL7A of the fungus Lentinula edodes have been obtained. Chromosomal integration of the cel7A gene at the HO locus was confirmed by PCR verification. Keywords: cellobiohydrolase, Lentinula edodes, Saccharomyces cerevisiae, genome integration, α-factor. Глубокая деструкция целлюлозы с образованием растворимых сахаров осуществляется под действием полиферментной системы целлюлаз, включающей в себя эндо-1,4-β-глюконазы (КФ 3.2.1.4), экзо-1,4-β-глюконазы (КФ 3.2.1.91), экзо-1,4-β-глюкозидазы (КФ 3.2.1.74) и целлобиазы (КФ 3.2.1.21). Свойства индивидуальных ферментов, а также их взаимодействие в составе целлюлазного комплекса определяют их эффективность при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов [1]. Ключевыми ферментами целлюлазного комплекса, ответственными за глубокий гидролиз кристаллической целлюлозы, являются экзо-1,4-β-глюконазы или целлобиогидролазы, основным продуктом действия которых является целлобиоза. Показано, что целлобиогидролаза образует до 60% глюкозы и 80% целлобиозы [2]. В настоящее время целлюлитические ферменты используются в качестве добавок к детергентам и моющим средствам, целлюлозно-бумажной промышленности, в составе премиксов к кормам животных и птиц, и даже в пищевой промышленности [3]. В последнее время в связи с истощением запасов нефти и газа в энергетике широко обсуждаются проблемы применение технологии консолидированного биопроцесса гидролиза и сбраживания (CBP), т.е. прямой ферментации целлюлозосодержащего субстрата в этанол [4]. sdADFSDVF В связи с этим конструирование интегрального вектора с геном целлобиогидролазы гриба Lentinula edodes под контролем сильного промотора, с сигнальным пептидом α-фактора дрожжей, myc-эпитоп и 6xHis хвостом, и создание стабильного рекомбинантного штамма Saccharomyces cerevisiae, эффективно экспрессирующего ген целлобиогидролазы cel7A, и обеспечивающего секрецию продукта этого гена в окружающию среду имеют большое теоретическое и практическое значение. Для создания интегрального вектора с промотором глицероальдегид-дифосфат дегидрогеназы (GAPDH), сигнальным пептидом α-фактора дрожжей и гистидиновым тэгом нами были использованы несколько плазмидных векторов в качестве источников промотора, сигнального пептида, Myc-эпитопа и 6xHis тэга (таблица 1). Таблица1 – Плазмиды использованные в данной работе Плазмиды pMETalphaB Особенности Сигнальный пептид (α-фактор) Источник Invitrogen pBAD/gIII A YEGAр Myc-эпитоп, 6xHis•tag рGAPDH, tGAPDH Invitrogen [5] М4297 Интегральный вектор, KanMX4 [6] pBAD/gIII A/α-cel7A YEPGAp/α-cel7A α-cel7A- myc-6xHis•tag pGAPDH-α-cel7A-myc-6xHis•tag-tGAPDH В этой работе В этой работе pHO-GAPDH-α-cel7A-myc-6HisKanMX4-HO Экспрессионный вектор для нтеграции в НО локус генома дрожжей В этой работе Известно, что для создания векторов секреции активно используют лидерную последовательность α-фактора. Этот феромон состоит из 13 аминокислот и первоначально синтезируется со структурного гена MFal как часть белка-предшественника размером 165 аминокислот. Данный белок на N-конце содержит сигнальный пептид из 19 аминокислот, который расщепляется при секреции препробелка в эндоплазматическом ретикуллуме. За сигнальным пептидом следует пропоследовательность длиной 64 аминокислот, имеющая три участка гликозилирования. Точная функция пропоследовательности не выяснена. Предполагают, что она может усиливать секрецию белка в окружающую среду [7,8]. Поэтому для эффективной секреции клонируемого гена (cel7A) мы использовали последовательность нуклеотидов кодирующий сигнальный пептид из 19 аминокислот и пропоследовательность длиной 64 аминокислот. В общей сложности нами использованная последовательность, кодирующая сигнальный пептид α-фактора дрожжей, состояла из 267 п.н. Последовательность, состоящая из шести кодонов аминокислоты гистидина, была использована для последующей очистки продукта клонируемого гена на основе никель - основанной аффинной хромотографией. Известно, что молекулы ДНК, кодирующие эпитопы, которые распознаются известными антителами, могут быть «привязаны» к известным генам. В результате белковый продукт такого гена будет содержать соответствующий эпитоп, что позволяет следить за этим белком в условиях эксперимента с помощью коммерческий доступных антител к данному эпитопу. Так как для продукта клонируемого нами гена нет доступных антител, мы решили использовать Myc-эпитоп. Мyc-эпитоп состоит из 11 аминокислот и к нему имеются коммерческие доступные специфические антитела. Создание интегрального экспрессионного вектора с сигнальным пептидом α-фактора дрожжей, Мyc-эпитопом и гистидиновым хвостом (6xHis) проводили в несколько этапов: Для конструкции вектора pBAD/gIII A/α-cel7A, содержащий сигнальный пептид, использовали дрожжевой вектор pMETalphaB в качестве источника сигнального пептида α-фактора дрожжей. Для этого вектор pMETalphaB обработали ферментами SacI и PstI, полученный фрагмент длиной 267 нуклеотидов лигировали в вектор pBAD/gIII A обработанный по тем же сайтам рестрикции. Далее на матрице полученной pBAD/gIIIA-α-MCS-myc-6xHis амплифицировали фрагмент длиной 404 нуклеотидов, состояший из нуклеотидных последовательностей сигнального пептида, Myc-эпитопа и 6xHis (α-MCS-myc-6xHis) с применением следующих праймеров: смысловой праймер 5’-DirsdADFSDVF NotISmaIα–GCGGCCGCCCCGGGATGAGATTTCCTTC и антисмыс-ловой праймер 5’-RevNotIPacISacI–GCGGCCGCTTAATTAAGGATCCTCAAT GATGATGATG. Полученный продукт ПЦР обработали с помощью SmaI и NotI для клонирования в вектор YEGAp под контролем конститутивного промотора и терминатора. Перед клонированием кассеты α-MCS-myc-6xHis, плазмиду YEGAp/eng1 [5], любезно предоставленную профессором Х. Кумагай, (Киотский университет, Япония) обработали ферментом EcoRI и 3’ –концы продукта рестрикции наращивали с помощью фрагмента Кленова. После инактивации фрагмента Кленова, проводили обработку ферментом NotI, что обеспечило соответствие концов плазмидного вектора к концам α-MCS-myc6xHis фрагмента. В результате клонируемый фрагмент лигировали с YEGAр и получили YEGAp/αMCS-myc-6xHis конструкцию. Далее путем обработки полученной рекомбинантной плазмиды ферментом рестрикции HindIII и фрагментом Кленова для получения тупых концов, фрагмент длиной около 2700 п.н., соответсвующий длине PGAPDH-α-MCS-myc-6xHis-TGAPDH кассеты, лигировали в корпус интегрального вектора М4297 [6], порезанный по сайту рестрикции фермента SmaI, в результате чего был получен рНО-GAPDH-α-myc-6xHis-KanMX4-HO экспрессионный вектор c промотором GAPDH, сигнальным пептидом α-фактора дрожжей и гистидиновым тэгом. Ранее нами был выделен кДНК ген целлобиогидролазы cel7A гриба L. edodes [9]. Сel7A - белок длиной 516 аминокислот с молекулярной массой 53,5кДа. По данным компьютерного анализа этот фермент должен секретироваться из клеток гриба, поскольку имеет на N-конце сигнальный пептид, который должен отщепляться между аминокислотами Gly18 и Gln19. Однако наши предыдущие эксперименты показали, что сигнальный пептид СEL7A не распознается секреторной системой S. cerevisiae [10]. В связи с чем было решено использовать сигнальный пептид дрожжевого полового феромона - α-фактора дрожжей, которая способствует эффективной секреции рекомбинантного белка в окружающую среду [8]. Для клонирования гена cel7A в созданную нами рНО-GAPDH-α-myc6xHis-KanMX4-HO конструкцию с нуклеотидной последовательности данного гена необходимо было удалить последовательность кодирующую нативный сигнальный пептид для секреции (20 аминокислот) и стартовый кодон, что было учтено при разработке праймеров для ПЦР амплификации гена cel7A L. edodes. Амплификацию cel7A на матрице полученной нами ранее плазмиды pET11d/cel7A проводили с использованием смыслового праймера 5’-cel7A-PstIcacgCTGCAGCCCAGCAAGCCGGAACA c сайтом рестрикции PstI и антисмыслового праймера 5'cel7A-XbaI–cacgTCTAGACGCAAACATTG ACTGTAGT c сайтом рестрикции XbaI. Далее ПЦР продукт размером около 1500 п.н. был обработан ферментами рестрикции PstI и XbaI. Фрагменты ДНК полученные в результате рестрикции, были разделены электрофорезом в 1% агарозном геле. Фрагмент размером в 1494п.н., соответствующий длине кДНК гена целлобиогидролазы cel7A без нативного сигнального пептида, был выделен из геля и использована для клонирования в плазмиду рНО-GAPDH-α-myc-6xHis-KanMX4-HO, обработанную по тем же сайтам рестрикции. Продукты лигирования трансформировали в клетки E.coli штамма DH5 для наработки плазмиды. Скрининг трансформантов проводили в агаризовонной среде LB с ампициллином. В результате были отобраны 7 клонов, содержащие рекомбинантную плазмиду рНОGAPDH-α- cel7A-myc-6xHis-KanMX4-HO. Далее для анализа плазмид, выделенных с трансформированных клеток, на наличие вставок провели ПЦР анализом. При этом для определения правильной ориентации гена cel7A по отношению к промотору, сигнальному пептиду и к myc-6xHis последовательностям нами был разработан набор праймеров для ПЦР анализа. Результаты этих экспериментов подтверждают правильную ориентацию гена cel7A по отношению к промотору, сигнальному пептиду и к myc-6xHis последовательностям. В последующих экспериментах полученную рекомбинантную интегральную плазмиду pHOGAPDH-α-cel7A-myc-6His-KanMX4-HO линеаризировали рестрикцией ферментами EcoRV и XbaI и использовали для трансформации клеток S. cerevisiae штамма FF18733. Скрининг трансформантов проводили в агаризованной YPD в присутствии G418. Хромосомная интеграция кассеты с геном αcel7A в НО локус генома дрожжей была подтверждена методом ПЦР на матрице геномной ДНК рекомбинантных штаммов с применением праймеров гомологичных к участкам хромосомы, фланкирующих НО локус и к участку селективного гена KanMX4. Результаты этих эксприментов подтверждают эффективную интеграцию кассеты pHO-GAPDH- α-cel7A -myc-6His -KanMX4-HO в НО локус генома S. cerevisiae. sdADFSDVF Таким образом, в результате работы был создан вектор интеграции pHO-GAPDH-α-cel7A-myc6His-KanMX4-HO, способный встраиваться в хромосому штамма Saccharomyces cerevisiae за счет гомологичной рекомбинации. На основе штамма F18733 Saccharomyces cerevisiae с помощью вектора pHO-GAPDH-α-cel7A-myc-6His-KanMX4-HO был получен рекомбинантный штамм S. cerevisiae/рGAPDH-α-cel7A, который способен обеспечивать непрерывную экспрессию гена целлобиогидролазы cel7A и секрецию продукта этого гена в окружающую среду. Наличие в составе гена Мyc-эпитопа, позволяет следить за экспрессией гена с помощью иммуноблотинга со специфическими антителами к Мyc-эпитопу. Кроме этого, присутствие на С-конце продукта гена последовательности 6xHis-хвоста позволяет проводить аффиную очистку белкового продукта на основе никель-основанной хроматографии. Литература 1 Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. – М.; МГУ, 1995. -224с. 2 Teeri T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases // Trends in Biotechnology. – 1997. – V. 15. – P. 160-167. 3 Bhat M.K. Cellulases and related enzymes in biotechnology // Biotechnol. Adv. – 2000. – Vol.18. – P.355-383. 4 Lynd L.R., van Zyl W.H., McBride J. E., Laser M. Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass: an update // Current Opinion in Biotechnology. -2005. -Vol.16. - № 5. – P. 577–583. 5 Hong J., Tamaki H., Akiba S., Yamamoto K., Kumagai H. Cloning of a gene encoding a highly stable endo-b-1,4-βglucanase from Aspergillus niger and its expression in yeast // J. Biosci. Bioeng. – 2001. –Vol.92. - P. 434-441. 6 Voth W.P., Richards J.D., Shaw J.M., Stillman D.J. Yeast vectors for integration at the HO locus // Nucleic Acids Res. -2001. –Vol.29. - №12. – P. 354-363. 7 MichaelisS., and Herskowitz I., et al.The a-factor pheromone of Saccharomyces cerevisiae is essential for mating // Mol. Cell Biol. -1988. - Vol.8. - № 3. –Р.1309-18. 8 Strazdis J.R., MacKay V.L. Induction of yeast mating pheromone a-factor by alpha cells // Nature. - 1983. –Vol. 305. - № 5934. –Р.543-5. 9 Taipakova S.M., Smailov B.B., Stanbekova G.E, Bissenbaev A.K. Cloning and expression of Lentinula edodes cellobiohydrolase gene in E. Coli and characterization of recombinant enzyme // Journal of Cell and Molecular biology. - 2011. – Vol. 9. - №1. –P.53-63. 10 Бисенбаев А.К. Тайпакова С.М. Клонирование и экспрессия кДНК целлобиогидролазы СEL7A гриба Lentinula edodes в про- и эукариотических системах и изучение физико-химических свойств рекомбинантного фермента // Известия НАН РК. Серия биологическая и медицинская. - 2012. - №3(291). - С. 39-46. sdADFSDVF
