На правах рукописи ГОЛОВНИНА КСЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА 03.00.15 – генетика
advertisement
На правах рукописи ГОЛОВНИНА КСЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ВИДОВ В РОДАХ TRITICUM L. И IRIS L. 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2008 1 Работа выполнена в секторе молекулярной эволюции, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Научный руководитель: кандидат биологических наук Блинов Александр Геннадьевич, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук Салина Елена Артемовна, доктор биологических наук, профессор Цильке Регинальд Александрович Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский Институт растениеводства им. Н.И. Вавилова, г. Санкт-Петербург Защита диссертации состоится «__» ________ 2008г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, тел. (383)-333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан «__» __________2007г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема построения естественной классификации живых существ, отражающей их филогенетическую историю, всегда была важна для эволюционных биологов, так как нередко возникают спорные моменты, и их разрешение является одной из задач современной филогении. Ранее традиционным было построение филогенетических и классификационных систем на основании сравнения морфо-анатомических признаков и кариологических данных. Но высокий уровень гомоплазии, чрезвычайное разнообразие морфо-экологических характеристик и многочисленные хромосомные вариации приводят к усложнению работы с этими признаками. В настоящее время основным подходом таксономистов становятся многочисленные методы с использованием молекулярных маркеров, а также анализ непосредственно нуклеотидных последовательностей ДНК и построение на основе полученных данных филогенетических деревьев для тех или иных таксонов, что позволяет существенно дополнить и уточнить традиционные классификационные системы. Выбор того или иного метода и молекулярного маркера, вариабельность которого будет положена в основу работы, является одной из важных задач для исследователя. Скорость эволюционных изменений определенного сегмента ДНК определяет уровень филогенетического разрешения и может быть различной у разных организмов. Поэтому каждая новая группа организмов требует от молекулярных биологов индивидуального подхода и анализа различных участков на роль молекулярно-генетического маркера. Объектами настоящего исследования стали сибирские виды рода Iris L. (семейство Iridaceae Juss.) и виды рода Triticum L. (семейство Poaceae Barnhart). Оба рода из класса Monocotyledons обладают уникальными качествами для практической селекции, несмотря на то, что цели, которые преследуют исследователи в программах по выведению новых сортов, различны. Для садоводов-любителей, ландшафтных дизайнеров и селекционеров ирисы интересны, прежде всего, своим неисчерпаемым потенциалом в качестве декоративных растений. Виды рода Iris занимают одно из первых мест в мире среди цветочных культур по количеству сортов. По количеству входящих видов род Iris является самым обширным в семействе и при этом не имеет согласованной классификации. Представления об эволюционной истории рода также неоднозначны (Родионенко, 1988; Mathew, 1989). Филогения пшениц изучается очень давно (McFadden, Sears, 1946; Mandy, 1970; Tsunewaki, Ogihara, 1983; Гончаров, 2002). Известно, что эволюция пшениц шла в два этапа: а) накопление нуклеотидных замен на диплоидном уровне, б) полиплоидия, с последующей дивергенцией уже на полиплоидном уровне. Такая филогенетическая картина сильно усложняет стандартные схемы эволюционного анализа, так как требует дополнительного этапа клонирования, обусловленного наличием нескольких близкородственных геномов в одном 3 растении. Поэтому хлоропластный геном в данном случае является очень удобным и часто используется в подобных работах (Yang et al., 2002; Kim et al., 2007). Однородность всех молекул хлоропластов (последовательности подвержены процессам ректификации), их многочисленность, материнское наследование (установлено для всех синтетических видов, включенных в работу) делает хлоропластную ДНК важным объектом молекулярных работ с полиплоидными видами. Более того, полностью установленная нуклеотидная последовательность генома и информация о скорости эволюции определенных участков позволяет выбирать наиболее подходящие молекулярные маркеры (Matsuoka et al., 2002, http://www.shigen.nig.ac.jp/organelle/index.jsp). Наряду с развитием современных технологий и увеличением объема знаний остается еще много вопросов в филогении злаковых, где процессы эволюции происходили в тесном контакте с доместикацией. До сих пор до конца не выяснены вопросы происхождения геномов культурных и диких полиплоидов, как происходили процессы доместикации, какие механизмы ответственны за возникновение того или иного хозяйственно важного признака. Для ответа на такие вопросы необходимо изучать именно ядерные последовательности ДНК пшениц, и использовать геном-специфичные молекулярные маркеры для амплифицирования последовательности того или иного генома. При экспоненциальном росте геномных проектов и появлении в базах данных последовательностей ДНК различных геномов это становится возможным. Цель и задачи исследования. Цель данной работы – разработка и использование молекулярных маркеров для построения филогении растительных таксонов на внутриродовом уровне. В конкретные задачи работы входило: 1. Установление филогенетических взаимоотношений сибирских видов рода Iris на основе двух различных систем молекулярных маркеров: RAPD анализ и молекулярно-филогенетический анализ хлоропластных последовательноcтей ДНК. 2. Поиск молекулярных маркеров в хлоропластном геноме для установления родственных взаимоотношений внутри рода Triticum. Построение филогении видов этого рода. 3. Разработка на основе имеющейся в базе данных информации генóмспецифичных ядерных маркеров для амплификации трех геномов пшениц (А, B, G). 4. Исследование происхождения А генома пшениц на основе вариабельности хлоропластных и ядерных последовательностей. Научная новизна работы. Впервые с использованием как пластидных, так и ядерных молекулярных маркеров были установлены филогенетические взаимоотношения сибирских видов рода Iris и всех известных к настоящему моменту видов рода Triticum. Среди включенных в работу пшениц 22 вида и подвида рода Triticum охарактеризованы на молекулярном уровне впервые, их кластеризация с остальными изученными видами пшениц соответствует их геномным формулам. Установлен хлоропластный филогенетический маркер, позволяющий различать эволюционные линии Emmer и Timopheevii. 4 Разработаны геном-специфичные ядерные маркеры на основе последовательностей Acc-1 и Pgk-1 генов для амплификации A, B и G геномов пшениц. Использование таких маркеров позволило уточнить происхождение трех различных геномов пшениц (А,B и G) и выявить полиморфизм A генома у диплоидных видов рода Triticum. Научно-практическое значение. Эволюционная история тех или иных растительных таксонов всегда играла немаловажную роль для селекционеров, генетиков и ботаников. Тщательно и полно разработанные на основе родственных взаимоотношений классификации видов культурных растений важны для сбора, сохранения и оценки биоразнообразия, для прогноза возможности успешной интрогрессии полезных признаков и генов из видовсородичей, а также для сертификации сортов. Полученные в данной работе молекулярные маркеры, специфичные для определенного генома полиплоидных пшениц, могут быть использованы для установления или подтверждения геномного состава у ископаемых растений или ранее описанных видов, в том числе и синтетических. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 8-ой молодежной и I(IX) международной конференциях молодых ботаников (СанктПетербург, Россия, 2004, 2006), на 5-ой конференции “Биоинформатика регуляции и структуры генома” (BGRS’2006, Новосибирск, Россия, 2006), на 2ой центрально-азиатской конференции по злаковым культурам (Чалпан-Ата, Республика Кыргызстан, 2006), на 5-ой европейской конференции по растительной геномике (Венеция, Италия, 2006), на X международной генетикоселекционной школе «Реализация идей Н. И. Вавилова на современном этапе развития генетики, селекции и семеноводства сельскохозяйственных культур» (Новосибирск, Россия, 2007), на международной научной конференции «Современные эволюционные подходы в биологии, медицине и социологии», посвященной 90-летию со дня рождения акад. Д.К. Беляева (Новосибирск, Россия, 2007), на 11-ом конгрессе европейского общества эволюционных биологов (Упсала, Швеция, 2007). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материал и методы, результаты и обсуждения), заключения, выводов, списка цитируемой литературы, в который входит 315 источников, и приложений. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 24 рисунка и 2 приложения. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. Растительный материал. Образцы ирисов были предоставлены к.б.н. В.И. Доронькиным (Центральный сибирский ботанический сад, Новосибирск), листья видов I. tenuifolia Pall., I. loczyi Katitz., I. pallasii Fisch. предоставлены сотрудниками гербария Центрального сибирского ботанического сада. Образцы различных видов и подвидов пшениц, эгилопсов, растительный материал ржи Secale cereale L. и межродовых синтетических гибридов были предоставлены для работы д.б.н. Н.П. Гончаровым (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). 5 Выделение ДНК. Выделение тотальной ДНК проводили стандартным CTAB методом (Rogers, Bendich,1985). Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса с помощью кита ’’WizardTM Minipreps DNA Purification System’’ (Promega). RAPD анализ. Выбор праймеров и условий реакции ПЦР для проведения анализа осуществляли согласно протоколам Журавлева с соавторами (1998). Профили ДНК анализировали вручную, непосредственно с фотографий гелей. Коэффициенты генетического сходства для каждой пары видов вычисляли согласно методу Нея и Ли (1979) по общей формуле: SAB=2 ґ‘ число общих фрагментов / (число фрагментов в наборе А + число фрагментов в наборе B). Для проведения всех расчетов использовали пакет программ RAPD (ftp://ftp.simtel.net/pub/simtelnet/msdos/biology). Достоверность набора данных оценивали с помощью стандартного PTP (Permutation Tail of Probability) теста (Faith, Cranston, 1991). Дендрограмма была построена на основе сравнения генетических дистанций, вычисленных как d=1- SAB, методом кластерного анализа (UPGMA, Sneath, Sokal, 1973). ПЦР-амплификация, клонирование, секвенирование. ПЦРамплификация проводилась по стандартному протоколу с выбранными праймерами (Makarevich et al., 2003; Golovnina et al., 2007; Goncharov et al. 2008). Клонирование выделенных из геля фрагментов (’’Wizard® PCR Preps DNA Purification System’’, Promega) осуществляли в плазмиде pBlueScript. Определение нуклеотидных последовательностей проводили при помощи автоматического секвенирования согласно протоколу ABI PRISMTM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit. Филогенетический анализ. Множественное и попарные выравнивания последовательностей осуществлялось при помощи программ ClustalW (Thompson et al., 2004) и Vector NTI 6.0, приложение AlignX (InforMax. Inc.; http://www.informaxinc.com/). Редактирование проводили с использованием программы GenDoc Version 2.7.000 (Nicholas et al., 1997). Филогенетические деревья были построены методом соединения ближайших соседей (NJ – Neighbor Joining) при помощи программы MEGA 3.0 и 3.1 (Saitou, Nei, 1987; Kumar et al., 2001, 2004); и методом максимальной парсимонии (MP – Maximum Parsimony) при помощи программ Phylip 3.5 (Felsenstein, 1993). Для оценки достоверности топологии использовался бутстрэп-тест (bootstrap test) (Felsenstein, 1985). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. RAPD анализ сибирских видов рода Iris. С помощью RAPD маркеров были проанализированы 13 видов рода Iris, принадлежащие к различным филогенетическим группам. Belamcanda chinensis из близкородственного рода был использован в качестве внешней группы. Выбранные пары праймеров OPD08, OPD11, OPD13, OPB12 (Журавлев и др. 1998) успешно использовались ранее для изучения таксономических взаимоотношений дальневосточных видов рода Iris. При использовании этих праймеров в настоящей работе были получены стабильные, хорошо 6 воспроизводимые, видоспецифичные наборы фрагментов для видов рода Iris при отсутствии внутривидовой и внутрипопуляционной вариабельности. Топология фенограммы, построенной нами на основе данных RAPD анализа, позволяет сделать некоторые выводы о таксономических взаимоотношениях сибирских видов рода Iris. Pardanthopsis dichotoma формирует отдельную от остальных видов рода Iris ветвь, что подтверждает его отделение от ирисов и помещение в отдельный род. Все остальные виды, включенные в исследование, кластеризуются в три группы, соответствующие различным подродам по классификации Родионенко (1988): A, B, C (рис. 1). Рисунок 1. Схема филогенетических взаимоотношений сибирских ирисов, полученная в результате RAPD анализа. Показаны показатели поддержки внутренних ветвей (Bootstrap value) только более 50%. В целом характеристика ирисов, полученная с помощью RAPD маркеров, согласуется с классификацией Родионенко (1988), за исключением положения P. dichotoma. Однако разрешающей способности метода не хватает для определения взаимоотношений между группами видов, и в первую очередь в виду уменьшения количества «истинно» гомологичных RAPD маркеров и увеличению количества не гомологичных маркеров одинакового размера при сравнении более далеких в родственном отношении растений. Для поддержки и детализации первичного RAPD анализа, а также для более глубокого изучения филогенетических взаимоотношений целесообразно использовать сравнение нуклеотидных последовательностей ДНК. Этот современный подход обладает гораздо большей статистической надежностью и позволяет достичь наибольшего разрешения топологии древа (Blattner et al., 2001; Gehrig et al., 2001). TrnT - trnF район хпДНК как маркер для реконструкции филогении. Филогения рода Iris. Для того чтобы выбрать наиболее подходящий филогенетический маркер, на основе которого будет построена более детальная филогения видов рода Iris, были проанализированы последовательности хлоропластного RbcL гена и ядерные последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров (internal transcribed spacer, ITS) I. halophila, I. ludwigi, I. uniflora, I. pseudacorus, I. 7 glaucescens, I. laevigata и P. dichotoma. В RbcL гене было обнаружено только несколько нуклеотидных замен (менее 5% полиморфных позиций), что недостаточно для филогенетического исследования. ITS районы в ирисах состоят из множественных копий различного размера внутри одного вида, представляя случай множественных повторов рДНК, что усложняет работу с ними как с филогенетическими маркерами для исследования взаимоотношений внутри сибирских ирисов и требует дополнительного этапа клонирования. В виду большего количества информативных сайтов, равномерного нуклеотидного состава и нейтральной природы эволюции в дальнейшей работе были выбраны два некодирующих участка хлоропластной ДНК, trnL интрон и trnL-trnF межгенный спейсер. Инсерции и делеции, обнаруженные в результате выравнивания последовательностей, использовались для подтверждения топологии дерева в качестве бинарных характеристик. Филогенетический анализ был проведен с использованием всех 22 нуклеотидных последовательностей сибирских видов ирисов и Paradonthopsis dichotoma для каждого района отдельно вследствие возможно различной скорости эволюции и разного нуклеотидного состава. Но так как топологии деревьев, построенные на основе последовательностей разных участков, были подобны, мы объединили данные и построили дерево на основе общего выравнивания в 971 нуклеотид (рис. 2). Опираясь на полученные филогенетические деревья и распределение инсерций и делеций, предполагая маловероятным событие, что одна и та ■ же инсерция или делеция произойдет несколько раз в ▼ различных ветвях ◘ независимо, все виды можно сгруппировать ▲ в 8 кластеров. Рисунок 2. Филогенетические взаимоотношения сибирских ирисов, основанные на сравнительном анализе некодирующих последовательностей trnL-trnF района. Символами обозначены различные делеции и инсерции, произошедшие в определенной таксономической группе. ☼ ^* □ +# # ● * 8 Спорной осталась локализация только I. ensata, которая отлична на деревьях, построенных на основе двух различных наборов последовательностей. Pardanthopsis dichotoma был более близок к внешнему таксону, чем к видам рода Iris на всех деревьях. Это подтверждает его отличие от видов рода Iris и выделение в отдельный род (Lenz, 1972; Lyte, 1997). Все сибирские ирисы формируют две основные ветви, соответствующие подроду Limniris (безбородые ирисы, I) и подроду Iris (бородатые ирисы, II, III, IV) по классификации Мэтью (Mathew, 1989). В существующих системах рода Iris группы видов подобны, но размер и таксономический ранг кластеров в системе различны (Родионенко, 1988; Mathew, 1989). В результате RAPD анализа все включенные в исследование виды группировались в три группы, соответствующие подродам Iris, Limniris, Xyridon по классификации Родионенко (1988) ( рис. 1). Однако результаты более надежного и полного (изучено почти вдвое большее количество видов) анализа нуклеотидных последовательностей подтверждают классификацию Мэтью. Виды, входящие в кластеры 4 (I. hallophila , I. ludwigii) и 7 (I. pallasii, I. lactea, I. biglumis), несмотря на то, что формируют отдельные кластеры, являются очень близкими другим видам подрода Limniris. Это показывает выделение этих видов в отдельные подрода Xyridon sensu lato по Родионенко (1988), Eremiris sensu lato по Доронькину (1987) необоснованным. Филогения рода Triticum. Настоящее изучение филогенетических взаимоотношений внутри рода Triticum состояло из двух частей: на первом этапе были проанализированы выбранные участки хлоропластной ДНК пшениц и близкородственных видов рода Aegilops, а затем - изучена вариабельность двух генов ядерных геномов. Одной из важных задач был поиск подходящего маркера для эволюционных исследований рода Triticum. Ранее было показано уменьшение генетического разнообразия пшениц вследствие доместикации, характеризующейся ограниченными размерами популяции с интенсивным отбором в сторону хозяйственно важных признаков (Tanskley, McCouch, 1997). Район хлоропластных генов trnT (tRNA - Thr) и trnL (tRNA - Leu) вместе с промежуточными некодирующими участками был успешно использован нами при исследовании эволюционных взаимоотношений видов рода Iris. Анализ последовательностей этого района шести видов пшениц (T. urartu, T. monococcum, T. boeoticum, T. araraticum, T. dicoccoides, T. aestivum GenBank, AB042240) и некоторых эгилопсов: Ae. tauschii (AF519113), Ae. speltoides (AF519112) и Ae. uniaristata Vis. (AF519114) показал недостаточное количество полиморфных сайтов для филогенетического исследования. Вместе с тем в последовательноcтях trnL интрона видов Ae. speltoides, T. aestivum, T. araraticum и T. dicoccoides была обнаружена инсерция в 10 п.н. (AAACTCATAA), а в последовательностях диплоидных пшениц (T. urartu, T. monococcum, T. boeoticum ) - три нуклеотидные замены (G217 - A217, G319 - T319, A474 - C474). Это позволяло разделить полученные последовательности на три группы: (i) диплоиды, (ii) полиплоиды и Ae. speltoides, (iii) два других эгилопса, подтверждая гипотезу о родственности геномов Ae. speltoides и полиплоидных пшениц. 9 TrnK интрон с внутренним matK геном хпДНК как маркер для реконструкции филогении. В целях поиска более подходящего и вариабельного филогенетического маркера был рассмотрен другой участок хпДНК – trnK интрон с внутренним matK геном. Для амплификации района длиной 2.6 тыс. п.н. нами были выбраны три пары праймеров. Из всех трех участков для 6 видов рода Triticum (T. boeoticum, T. monococcum, T. sinskajae, T. urartu, T. dicoccoides, T. araraticum) и двух – рода Aegilops (Ae. squarrosa, Ae. speltoides) второй участок, длиной 960 п.н., включающий часть matK гена, оказался наиболее вариабельным. Множественное выравнивание последовательностей выбранного участка для всех 45 видов включало 523 позиции, из которых 31 была вариабельная, а также были обнаружены инсерции и делеции. Проведенный филогенетический анализ представлен на рис. 3. Рисунок 3. Филогенетический анализ видов рода Triticum, на основе сравнения последовательносте й matK гена. Синтетические амфиплоиды выделены жирным шрифтом. На основе наличия или отсутствия специфической 10 п.н. инсерции в trnL интроне виды с инсерцией заключены в сплошную рамку, виды без инсерции – в рамку, составленную из точек. Звездочками обозначены последовательност и из базы данных GenBank. 10 Так как филогенетический анализ пшениц выполнен на основе сравнения последовательностей хпДНК, построенное дерево отражает эволюционные события внутри рода Triticum согласно происхождению хлоропластных последовательностей. Тем не менее, каждая из четырех филогенетических групп включает виды, которые не только наследуют один и тот же плазмон, но в их геномной формуле присутствует также общий ядерный геном (рис. 3). Для полиплоидных видов (групп I, II) это может означать, что для каждой группы существовало материнское растение, которое в процессе видообразования на последнем этапе гибридизации являлось донором ядерного генома и плазмона одновременно. Обоснованностью этого предположения служат ранее полученные данные о наследовании хлоропластного генома T. timopheevii вместе с ядерным G геномом в результате гибридизации между Ae. speltoides и T. boeoticum (Chen et al., 1975). Все диплоидные виды рода Triticum кластеризуются отдельно от остальных видов рода и четко отделяются от видов рода Aegilops (группа III и IV, рис. 3). Это подтверждается наличием уникальных нуклеотидных замен в последовательности trnL интрона диплоидных пшениц. Обе группы произошли от общего предка после дивергенции от предка групп I и II и формируют общий кластер, что доказывает близкое родство диплоидных видов родов Triticum и Aegilops. Все полиплоидные виды, содержащие B и G геномы в геномной формуле, делятся на две отдельные группы (рис. 3). Такой результат подтверждает предположение о дифилетическом происхождении полиплоидных пшениц, основанном на гибридологических, цитологических и молекулярнобиологических данных (Lilienfeld, Kihara, 1934; Mori et al., 1995; Kilian et al., 2007). И это разделение произошло после дивергенции их предка и предковой формы A, D и других изученных геномов рода Aegilops (U, Sb, Sl и Ss). Более того, исходя из топологии дерева и кластеризации видов геном S Ae. speltoides наиболее близок к геномам B и G. Филогенетические отличия между Ae. speltoides, эгилопсами секции Sitopsis и дикими диплоидными пшеницами Результаты филогенетического анализа показывают очевидное отличие хлоропластного генома Ae. speltoides (II группа) от других видов рода Aegilops (IV группа) и диплоидных видов рода Triticum (III группа). Обе последовательности интронов (trnL и trnK) Ae. speltoides более вариабельны, чем гомологичные последовательности других эгилопсов и диплоидных пшениц. Этот факт полностью совпадает с предыдущими результатами, полученными на основе сравнения четырех других, некодирующих районов хпДНК и микросателлитных повторов (Yamane, Kawahare, 2005). Топологии деревьев в обоих исследованиях демонстрируют, что предковая форма Ae. speltoides отделилась раньше, чем произошла дивергенция диких диплоидных пшениц и эгилопсов (см. рис. 3). Это подтверждает гипотезу о выделении Ae. speltoides в отдельный род. Эволюционное родство видов группы Timopheevii и Ae. speltoides На основе анализа последовательностей выбранного в данной работе 11 филогенетического маркера (участок matK гена) было получено четкое разделение полиплоидных видов пшениц на две эволюционные линии (Emmer и Timopheevii), которые являются сестринскими группами (рис. 3). Из всех проанализированных эгилопсов секции Sitopsis единственный вид Ae. speltoides, составляя общий кластер со II группой, является наиболее близким видом эгилопсов обеим сестринским группам. На основе наших результатов, и учитывая предыдущие работы (Wang et al., 1997; Бадаева, 2000; Hedgcoth et al., 2002) было установлено, что предковая форма Ae. speltoides тесно связана с эволюционной историей полиплоидных пшениц. Геном G и плазмон видов секции Timopheevii (группа II), вероятно, наиболее молодые в эволюционном плане и наиболее близки современному Ae. speltoides. В настоящей работе при анализе последовательностей Pgk-1 гена различных геномов пшениц и эгилопсов была обнаружена специфическая инсерция размером 89 п.н. в интронах G и S геномов T. timopheevii и Ae. speltoides. Этот факт может служить дополнительным доказательством происхождения G генома от генома Ae. speltoides. Кроме того, была выявлена внутривидовая вариабельность Ae. speltoides по этой последовательности, а также по другим маркерам (Breiman et al., 1991, Huang et al., 2002). Внутривидовая вариабельность, возможно, является причиной существования двух предковых форм, которые стали источником двух различных эволюционных линий полиплоидных пшениц. Возможное существование второй формы Ae. speltoides показано в PCR-SSCR анализе плазмона 6 видов рода Triticum и Aegilops, где только один вид эгилопсов, Ae. speltoides, был включен в группу Emmer (Wang et al., 1997). Кластеры видов с В и G геномами распадаются, и чтобы получить достоверную информацию относительно дифилетического происхождения пшениц от двух различных образцов Ae. speltoides, оба эти растения необходимо включить в исследование и показать их родство с обеими группами видов. Маркер, использованный в данной работе, позволяет провести такое более детальное исследование и может считаться перспективным для анализа дифилетического происхождения полиплоидных пшениц. Наследование хпДНК пшениц и эгилопсов по материнской линии Возможность изучения синтетических видов пшениц на молекулярном уровне позволяет получать более точную информацию, а также подтверждать ранее известные данные о путях их происхождения (схемах гибридизации). В настоящее время известно, что наследование цитоплазматических (пластидных, митохондриальных) геномов не является строго материнским. У разных организмов наследование цитоплазматических геномов осуществляется с помощью различных механизмов (Birky, 1995; Korpelainen, 2004). Тем не менее, в результате филогенетического анализа, проведенного в данной работе, мы показали строго материнское наследование пластид всех изученных видов синтетических амфиплоидов (рис. 3). Использование ядерной ДНК как молекулярного маркера Полиплоидия существенно усложняет филогенетические исследования, основанные на ядерных последовательностях. В этом случае необходим дополнительный этап клонирования и информация о специфических 12 характеристиках каждого генома, чтобы было возможно отделять его от других. Однако, информация о делециях, инсерциях и нуклеотидных заменах в разных геномах могут быть использованы для выбора праймеров, специфичных для каждого генома в отдельности. Проблема заключается только в наличии подходящих гомологичных последовательностей из разных геномов в базе данных. Для того чтобы выполнить поставленную задачу был проведен поиск доступных последовательностей у видов рода Triticum в базе данных GenBank. Последовательности генов Acc-1 и Pgk-1 (GenBank, AF343496 - AF343536 и AF343474 - AF343495 соответственно) были получены ранее для всех четырех геномов (Huang et al., 2002) и были использованы в настоящем исследовании. После их выравнивания были обнаружены специфические для каждого генома пшениц нуклеотидные замены, инсерции и делеции, на основе которых выбраны 6 пар геном-специфичных праймеров. В последовательностях Acc-1 гена показаны B геном-специфическая делеция размером 11 п.н. (рис. 4А) и А геномспецифическая делеция размером 46 п.н. (рис. 5). A. Б. Рисунок 4 Места отжига праймеров (Acc3T sense, Acc3T antisense) для В геномспецифичной амплификации и электрофорез продуктов амплификации Acc-1 гена у пшениц и близкородственных видов А. Полиплоидные пшеницы; Б. Диплоидные пшеницы. 13 В выравнивании Pgk-1 гена были обнаружены две перестройки (5 п.н. делеция и 6 п.н. инсерция), специфические для A генома пшениц (рис. 6), а также - 89 п.н. инсерция, которая была общей только для G и S геномов T. timopheevii и Ae. speltoides, соответственно. Рисунок 5. Места отжига одной из пар праймеров для А геном-специфичной амплификации и электрофорез продуктов амплификации Acc-1 гена у пшениц и близкородственных видов с праймерами (Acc1T(2T) sense, Acc2T antisense). Буквами D, S, G, B, A в выравнивании обозначены последовательности геномов полиплоидных пшениц (B, G, D, A) и Ae. speltoides (S). Специфическая амплификация В генома пшениц. Для амплификации участка Acc-1 гена, принадлежащего B геному, были сконструированы соответствующие праймеры (рис. 4А). В ПЦР анализ были включены все виды из кластера I и синтетические виды из других кластеров (рис. 3), которые имели в своей геномной формуле B геном. Все полученные последовательности были идентичны и по наличию специфических нуклеотидных замен принадлежали В геному. Полученные данные позволяют четко разделять B и G геномы, и демонстрируют возможность селективной амплификации определенных геномов в полиплоидном организме (рис. 4А). 14 Рисунок 6. Полиморфные позиции в выравнивании последовательностей Pgk-1 гена, специфичные для различных геномов полиплоидных пшениц (А, В, G и D), генома Ae. speltoides (S) и трех гаплотипов диплоидных видов (I, II, III). Цифрами сверху обозначены позиции в общем выравнивании. 15 Происхождение A генома пшениц. На следующем этапе работы мы исследовали A геном. Геном-специфичные праймеры были разработаны для обоих генов Acc-1 и Pgk-1. Все полученные фрагменты полиплоидных пшениц принадлежали А геному и были идентичны между собой, как и последовательности B генома. Неожиданные результаты были получены при анализе некоторых образцов диплоидных видов (T. urartu, T. boeoticum и T. monococcum). ПЦР амплификация с праймерами, неспецифичными для A генома, давала положительные результаты (рис. 4Б, дорожка 5), тогда как отрицательный результат был получен при использовании A геном-специфичных пар праймеров (рис. 5, дорожки 1 и 5). Для более детального анализа диплоидных видов рода Triticum мы включили в исследование по 8-10 различных географических вариантов этих видов. После установления нуклеотидных последовательностей оказалось, что диплоидные виды имеют по несколько различных вариантов последовательностей исследуемых участков Асс-1 и Pgk-1 генов (гаплотипов). По наличиюотсутствию делеции размером 46 п.н. и специфических замен в гене Acc-1 диплоидные виды поделились на две группы, тогда как последовательности Pgk1 гена этих видов имели три различных варианта I, II, III (рис. 6). Первый гаплотип (I) был общим для T. urartu и А геномов полиплоидных пшениц, доказывая их общее происхождение. Cреди 9 проанализированных образцов T. boeoticum из различных популяций не было обнаружено образцов с подобным гаплотипом. Это подтверждает предыдущие схемы (Chantret et al., 2005), где донором А генома полиплоидных пшениц признается представитель T. urartu. На основе полученных результатов можно заключить, что три существующих диплоидных вида T. urartu, T. boeoticum и T. monococcum могут иметь различные гаплотипы геномов, тогда как в геномах полиплоидных видов никакой гетерогенности не обнаружено. Основные дополнения в эволюционном сценарии и происхождении видов рода Triticum В результате сравнительного и филогенетического анализов хлоропластных и ядерных последовательностей различных видов родов Triticum и Aegilops, полученных в данном исследовании, а также принимая во внимание существующие литературные данные, настоящая работа позволяет сделать следующие выводы относительно эволюции рода Triticum: 1. На основании вариабельности нуклеотидных последовательностей Ae. speltoides следует выделить из секции Sitopsis в отдельную секцию либо подрод. Происхождение этого вида, вероятно, произошло ранее дивергенции остальных видов секции (рис. 7). Более того, мы подтверждаем гипотезу о том, что Ae. speltoides является наиболее вероятным донором плазмона и двух геномов (B и G) полиплоидных пшениц. Другие виды эгилопсов в видообразовании пшениц не участвовали. 2. Проведенный анализ последовательностей ядерных генов Acc-1 и Pgk-1 выявил три различных, не видоспецифичных гаплотипа этих участков у диплоидных пшениц (рис. 6), тогда как полиплоиды имеют одинаковые последовательности исследуемых районов в А геномах. То есть, в предковой 16 популяции рода Triticum, до разделения диплоидных видов T. boeoticum и T. urartu, возникло несколько вариантов последовательностей, только одна из которых затем была унаследована полиплоидными видам в составе А генома. Рисунок 7. Филогенетическая схема эволюции родов Triticum и Aegilops. по Kilian et al., 2007 c дополнениями. Звездочками обозначены эволюционные этапы, изученные в данной работе. 3. Настоящее исследование подтверждает данные том, что донором А генома всех тетра - и гексаплоидных пшениц являлся представитель T. urartu, так как только последовательность Pgk-1 гена этого вида идентична таковым полиплоидных пшениц. Во-вторых, гаплотип II Pgk-1 гена является общим для дикой и культурной однозернянки T. boeoticum и T. monococcum, подтверждая происхождение культурной формы T. monococcum именно от дикой T. boeoticum (рис. 6) 4. Видовой статус диплоидных видов T. boeoticum и T. urartu в данной работе не исследовался и не обсуждается. Взаимоотношения внутри трех диплоидов T. urartu, T. boeoticum и T. monococcum требуют дополнительного изучения. Данные, полученные в нашей работе, позволяют предполагать существование обмена генетической информацией между дикими диплоидными видами T. urartu и T.boeoticum. ВЫВОДЫ. 1. Проведен молекулярный RAPD анализ и построена фенограмма 13 сибирских видов ирисов, принадлежащих разным подродам (Limniris, Xyridon, Iris, Pardanthopsis), и родственного вида Belamcanda chinensis в качестве внешней группы. За исключением Pardanthopsis dihotoma кластеризация близкородственных видов согласуется с современными классификациями Родионенко (1988) и Мэтью (1989). 17 2. Установлены филогенетические взаимоотношения 22 видов сибирских ирисов, на основе сравнения нуклеотидных последовательностей двух некодирующих участков хлоропластной ДНК, trnL интрона и trnL-trnF межгенного спейсера. Показано преимущество их использования в качестве филогенетических маркеров для определения филогении ирисов перед нуклеотидными последовательностями rbcL гена и ITS районами. 3. Показано, что все сибирские ирисы формируют на филогенетическом древе две главные ветви, соответствующие подродам Limniris и Iris. Подтверждено отделение от остальных видов рода Iris вида Pardanthopsis dichotoma и выделение его в отдельный род. Показана недостаточная обоснованность выделения видов кластеров 4 (I. hallophila , I. ludwigii) и 7 (I. pallasii, I. lactea, I. biglumis) в состав отдельных подродов Xyridon sensu lato по Родионенко (1988), Eremiris sensu lato по Доронькину (1987). 4. Установлены филогенетические взаимоотношения 39 различных видов и подвидов пшениц, 6 видов рода Aegilops на основе последовательностей хпДНК. Впервые на молекулярном уровне было проанализировано 22 вида и подвида рода Triticum, их кластеризация с остальными изученными видами пшениц соответствует их геномным формулам. Установлен хлоропластный филогенетический маркер, позволяющий четко различать эволюционные линии Emmer и Timopheevii. Подтверждено участие единственного вида из секции Sitopsis Ae.speltoides в видообразовании полиплоидных пшениц. 5. Анализ синтетических видов T. kiharae, T. timococcum, T. dimococcum, T. soveticum, T. soveticum ssp. fungicidum, T. flaksbergeri, T.palmovae, Tritordium, Aegilotriticum, Triticale показал, что наследование хпДНК пшениц и эгилопсов у данных видов происходит строго по материнской линии. 6. Разработаны геном-специфичные ядерные маркеры на основе последовательностей Acc-1 и Pgk-1 генов для амплификации A, B и G геномов пшениц. Специфичность полученных маркеров проверена экспериментально. 7. Выявлено 3 различных гаплотипа A генома у диплоидных видов рода Triticum, только один из которых был унаследован полиплоидными пшеницами. Подтверждено происхождение А генома всех изученных полиплоидных пшениц от диплоидного вида T. urartu. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. 1. Makarevich I., Golovnina K., Scherbik S., Blinov A. Phylogenetic relationships of the Siberian Iris species inferred from noncoding chloroplast DNA sequences // Int. J. Plant Sci., 2003, V.164, P.229-237. 2. К.А. Головнина. Молекулярная филогения сибирских видов рода Iris , основанная на анализе нуклеотидных последовательностей некодирующих участков хлоропластной ДНK // Материалы VIII Молодежной Конференции Ботаников в Санкт-Петербурге, 17-21 мая, 2004, с. 243. 3. Golovnina K., Glushkov S. Molecular phylogeny of the genus Triticum // Proceedings of the I(IX) international conference of young botanists in SaintPetersburg, May 21-26, 2006, P. 39. 18 4. Гончаров Н.П., Кондратенко Е.А., Храброва М.А., Коновалов А.А., Лайкова Л.И., Блинов А.Г., Головнина К.А., Глушков С.А. Рукотворные виды источник биоразнообразия пшениц. // Агромеридиан, 2006, T.3(4), C.86-91. 5. Golovnina K., Glushkov S., Blinov A., Mayorov V., Adkison L., Goncharov N. Molecular phylogeny of the genus Triticum L. // Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure – BGRS 2006, Novosibirsk, Russia, July 16-22, 2006, V. 3, P. 147-150. 6. Golovnina K., Glushkov S., Blinov A., Goncharov N.P. Genome-specific markers for A, B and G Triticum genomes. // Proceedings of the fifth plant genomics european meetings - PLANT GEMS, Venice, Italy, October 11-14, 2006, P. 211. 7. Golovnina K.A., Glushkov S.A., Blinov A.G., Mayorov V.I., Adkison L., Goncharov N.P Phylogeny of the genus Triticum L. Based on chloroplast TrnL and MatK sequences // Proceedings of the fifth plant genomics european meetings PLANT GEMS, Venice, Italy, October 11-14, 2006, P. 319. 8. Н.П. Гончаров, Е.Я. Кондратенко, С.В. Банникова, А.А. Коновалов, К.А. Головнина. Сравнительно-генетический анализ голозерной диплоидной пшеницы Triticum sinskajae и еe исходной формы T. monococcum // Генетика, 2007, T.43(11), C.1491-1500. 9. K. A. Golovnina, S. A. Glushkov, A. G. Blinov, V. I. Mayorov, L. R. Adkison and N. P. Goncharov. Molecular phylogeny of the genus Triticum L. // Pl. Syst. Evol., 2007, V.264, P.195-216. 10. N.P. Goncharov, K.A. Golovnina, B. Kilian, S. Glushkov, A. Blinov, V.K. Shumny. Evolutionary history of wheats - the main cereal of mankind // In. N. Dobretsov et al. (eds.), Biosphere Origin and Evolution, part VI, Springer 2008, P. 407-419. (DOI 10.1007/978-0-387-68656-1_29). 11. Kseniya A. Golovnina, Sergey A. Glushkov, Nikolay P. Goncharov, Alexander G. Blinov. The origin of A, B and G Triticum genomes based on molecular data // Proceedings of the XI Congress European Society for Evolutionary Biology – ESEB 2007, Uppsala, Sweden, August 20-25, 2007, P.351. 19
