Паразитарная диагностика

Инструкция по применению Toxoplasma gondii IgG ELISA Avidity Test
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АВИДНОСТИ АНТИТЕЛ КЛАССА IGG
К ТОКСОПЛАЗМЕ (TOXOPLASMA GONDII) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА.
СОДЕРЖАНИЕ
1.
2.
3.
4.
Введение
Назначение
Принцип метода
Материалы
Реагенты, входящие в комплект поставки
Необходимые дополнительные материалы, не входящие в комплект поставки
5. Стабильность и хранение
6. Подготовка реагентов
7. Процедура проведения анализа
8. Результаты
Вычисление результатов
Интерпретация результатов
9. Специфические характеристики анализа Точность (прецизионность) Специфические характеристики анализа
Интерференции/Кросс-реактивность
10. Ограничения метода
11. Особые указания и меры предосторожности 12. Литература
13. Схема анализа
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
4
4
4
5
6
+7 (495) 799-1165, +7 (495) 725-1169
sale@fooke.ru, info@fooke.ru
www.fooke.ru
Дата выпуска: 2012
Страница 1 из 6
Инструкция по применению Rus
Инструкция по применению Toxoplasma gondii IgG ELISA Avidity Test
Инструкция по применению Toxoplasma gondii IgG ELISA Avidity Test
Каталожный №
TOXGA460
96
ВВЕДЕНИЕ
Определение авидности – диагностический метод, использующийся для дифференциации недавней (острой) и более отдаленной во времени (перенесенной в прошлом) инфекции, возбудителем которой является Toxoplasma gondii, в сыворотке пациента. Авидность – это прочность
связывания антитела (из образца сыворотки) с соответствующим антигеном.
Антитела класса IgG с низкой авидностью на начальной стадии заражения можно дифференцировать от антител с высокой авидностью, которые связаны с перенесенной в прошлом инфекцией.
Анализ на определение авидности антител класса IgG проводится в дополнение к классическому серологическому исследованию для определения статуса инфекции, возбудителем которой
является Toxoplasma gondii.
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор для определения авидности антител класса IgG к токсоплазме (Toxoplasma gondii) предназначен для дифференциации острой инфекции и инфекции, перенесенной в прошлом.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Лунки микротитрационных стрипов, покрытые антигеном токсоплазмы, инкубируют с разведенным образцом сыворотки (пипетирование в двух повторностях). После промывания одну лунку
инкубируют с реагентом для определения авидности, а соответствующую лунку – с промывочным буфером. На этом этапе антитела с низкой авидностью отделяются от антигенов, а антитела
с высокой авидностью остаются связанными со специфическими антигенами.
Добавляют меченные пероксидазой антитела к IgG человека. Иммунокомплекс визуализируют с
помощью тетраметилбензидина (ТМБ), который в результате реакции дает продукт синего цвета.
Реакцию останавливают добавлением серной кислоты, которая приводит к окрашиванию продукта в желтый цвет. С помощью ридера для микролуночных планшетов для ИФА определяют
оптическую плотность на длине волны 450 нм.
МАТЕРИАЛЫ
Пипетирование образцов сыворотки и контроля в двух повторностях:
Для внесения каждого контроля и образцов сыворотки нужно использовать чистый одноразовый
наконечник для дозирования.
1. Лунки A1/A2 используют для субстрата – холостой пробы.
2. Внесите 100 мкл функционального контроля в лунки B1/B2.
3. Внесите 100 мкл разведенного образцы сыворотки (1+100) в лунки C1/C2.
Внесите 100 мкл разведенного образцы сыворотки (1+100) в лунки D1/D2 и т.д. Закройте
лунки фольгой.
4. Инкубируйте в течение 1 часа ± 5 минут при 37±1°C.
5. После инкубирования снимите фольгу, проведите аспирацию содержимого лунок и промойте каждую лунку три раза, используя 300 мкл промывочного раствора. Избегайте переливания из лунок, в которых происходили реакции. Время выдержки между каждым
циклом промывания должно быть >5 сек. В конце тщательно удалите остатки жидкости,
выстучав стрипы на бумажное полотенце, прежде чем переходить к следующему этапу!
(Смотрите этап 4, вкладыш с инструкцией по применению набора для определения IgG к
Toxoplasma gondii, каталожный номерTOXG0460.
Примечание: Промывание очень важно! Недостаточное промывание приводит к низкой
точности.
6. Внесите 100 мкл Реагента для определения авидности в лунки B1, C1, D1, E1 и т.д.
Внесите 100 мкл разведенного (1+19) Промывочного раствора в лунки B2, C2, D2, E2 и т.д.
7. Инкубируйте ровно 15 минут в темноте при комнатной температуре (от +20 до +25°C).
8. Повторите этап 5.
9. Внесите 100 мкл Конъюгата антител класса IgG к токсоплазме во все лунки, за исключением лунок с холостой пробой (A1/A2). Закройте фольгой.
10.Следуйте инструкциям 6–11, представленным во вкладыше с инструкцией по применению
набора для ИФА IgG к Toxoplasma gondii, каталожный номерTOXG0460.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Критерии достоверности анализа: Чтобы анализ был признан достоверным, необходимо
соответствие следующим критериям (ОП – оптическая плотность):
Реагенты, входящие в комплект поставки
Реагент для определения авидности: 1 флакон, содержащий 15 мл раствора мочевины, синего
цвета, готов к использованию, белая крышка.
Функциональный контроль: 1 флакон, содержащий 3 мл разведенной сыворотки с высокой авидностью, желтого цвета, готов к использованию, зеленая крышка.
Субстрат – холостая проба в A1/A2: Функциональный контроль в B1/B2: Необходимые дополнительные материалы, не входящие в комплект поставки
Маркированный знаком CE набор для ИФА IgG к токсоплазме (Toxoplasma gondii) каталожный
номер TOXG0460.
Вычисление результатов
СТАБИЛЬНОСТЬ И ХРАНЕНИЕ
Реагенты стабильны до истечения их срока годности, указанного на этикетке, при условии их
хранения при температуре 2...8 °C. После первого открытия стабильность реагентов сохраняется
до истечения срока годности.
ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ
значение ОП меньше 0.100.
авидность (%): точное значение и диапазон указаны
на этикетке.
Если данные критерии не соблюдены, анализ является недостоверным и его необходимо повторить.
Образцы пациентов со значением ОП ниже порогового согласно результатам стандартного ИФА
с использованием набора для ИФА IgG к Toxoplasma gondii можно не подвергать дальнейшему
анализу. В этих образцах вообще нет антител к токсоплазме или концентрация антител класса
IgG к токсоплазме низкая для оценки авидности IgG. Для каждого образца пациента или контроля вычисляют соотношение между ОП лунки, в которую вносили Реагент для определения авидности, и ОП лунки, в которую вносили Промывочный буфер, и умножают на 100:
ОП (образец или контроль) Реагент для определения авидности х 100 = Авидность (%)
ОП (образец или контроль) Промывочный буфер (разведенный: 1+19)
Реагент для определения авидности и функциональный контроль готовы к использованию.
При низкой температуре может произойти кристаллизация реагента для определения авидности.
Поэтому очень важно довести реагент для определения авидности и контроль до комнатной температуры (+20…+25°C), прежде чем приступать к проведению анализа!
Образцы или контроли, у которых значение оптической плотности больше, чем измеряемый диапазон ридера для ИФА (больше f/ошибка) на длине волны 450 нм, необходимо проанализировать
на длине волны 405 нм. Вычисление авидности (%) аналогично вычислению авидности при проведении анализа на длине волны 450 нм.
ПРОЦЕДУРА ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА
Интерпретация результатов
Соблюдайте процедуру проведения и подготовки к анализу в соответствии с описанием, представленным во вкладыше с инструкцией по применению набора для определения IgG к Toxoplasma
gondii, каталожный номерTOXG0460.
Отличия проведения теста на авидность следующие:
Авидность (%) > 40: Антитела к токсоплазмозу с высокой авидностью → Перенесенная в прошлом инфекция.
Авидность (%) ≤ 40: Антитела к токсоплазмозу с низкой авидностью→ → Острая или недавняя
инфекция.
Дата выпуска: 2012
Страница 2 из 6
Инструкция по применению Rus
Дата выпуска: 2011-04
Страница 3 из 6
Инструкция по применению Rus
Инструкция по применению Toxoplasma gondii IgG ELISA Avidity Test
Инструкция по применению Toxoplasma gondii IgG ELISA Avidity Test
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
Точность (прецизионность)
В пределах одной серии анализов
Образец
Сыворотка с высокой авидностью
Сыворотка с высокой авидностью
Сыворотка с низкой авидностью
n
Средняя авидность (%)
Коэффициент вариации (%)
24
89.0
4.1
22
77.1
4.0
20
24.7
4.6
Между сериями анализов
Образец
Сыворотка с высокой авидностью
Сыворотка с высокой авидностью
Сыворотка с низкой авидностью
n
Средняя авидность (%)
Коэффициент вариации (%)
6
88.8
2.4
6
78.8
3.2
6
25.8
3.9
Специфические характеристики анализа
Набор для анализа авидности IgG к токсоплазме (Toxoplasma gondii) оценивали на предмет использования для анализа сыворотки с острой инфекцией и с перенесенной в прошлом инфекцией. Всего было протестировано 69 образцов пациентов. Образцы сыворотки были предоставлены Институтом паразитологии, Боннский университет.
Острая инфекция
Перенесенная
ранее инфекция
Всего
Институт паразитологии
25
44
69
Анализ на авидность
23
41
64
3 f Острая
2 f Перенесенная
ранее
5
92%
93.2%
92.7%
Несоответствие образцов сыворотки:
Анализ на авидность
Совпадение
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Эти пять образцов сыворотки, по которым были расхождения, были протестированы с использованием системы для ИФА для определения авидности от другого производителя. По четырем образцам сыворотки было совпадение с результатами ИФА Dr.Fooke для определения авидности,
и 1 образец сыворотки отличался от анализа фирмы Dr.Fooke.
Интерференции/Кросс-реактивность
Информация, касающаяся мешающего влияния и кросс-реактивности, представлена во вкладыше с инструкцией по применению набора фирмы Dr.Fooke для определения IgG к Toxoplasma
gondii, каталожный номерTOXG0460.
ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
Заражение бактериями или повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания образца могут
негативно повлиять на значения оптической плотности. На основе одного лишь результата анализа диагностировать инфекционную болезнь нельзя. Для постановки точного диагноза необходимо учитывать клиническую историю болезни, симптоматику и серологические данные. У
пациентов с ослабленным иммунитетом и у новорожденных серологические данные имеют лишь
ограниченное значение. Результат, свидетельствующий о высокой авидности, не исключает возможности недавнего инфицирования.
ОСОБЫЕ УКАЗАНИЯ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
•
•
•
Никакие изменения конструкции, состава или процедуры анализа, равно как и использование в сочетаниях с другими продуктами, не одобренными производителями, не разрешены;
за такие изменения ответственность несет сам пользователь. Производитель не несет ответственности за ложные результаты и инциденты, обусловленные такими причинами. Производитель не несет ответственности за любые результаты визуального анализа образцов
пациентов.
Только для диагностического применения in-vitro.
Все компоненты, полученные от людей-доноров и использованные для производства данных
реагентов, были протестированы на анти-ВИЧ антитела, антитела к вирусу гепатита C и поверхностный антиген вируса гепатита B, и были признаны отрицательными. Тем не менее,
все материалы все равно необходимо считать потенциально инфицированными и обращаться с ними соответственным образом.
Не заменяйте реагенты или стрипы из одной партии реагентами или стрипами из других партий.
Реагенты других производителей нельзя использовать вместе с реагентами из этого набора
для анализа.
Не используйте реагенты после истечения срока годности, указанного на этикетке.
Используйте только чистые наконечники для пипеток, дозаторы и лабораторную посуду.
Не меняйте завинчивающиеся крышки флаконов с реагентами, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Плотно закрывайте флаконы с реагентами сразу же после использования, чтобы избежать
испарения и микробного загрязнения.
После первого открытия и последующего хранения проверяйте флаконы с конъюгатом и контролями на предмет микробного загрязнения перед дальнейшим использованием.
Чтобы избежать перекрестного загрязнения и ложно завышенных результатов, вносите образцы пациента и дозируйте конъюгат точно на дно лунок, не разбрызгивая.
Набор для определения авидности предназначен только для квалифицированного персонала, знающего надлежащую лабораторную практику.
ВНИМАНИЕ: Серная кислота оказывает раздражающее действие на глаза и кожу. Храните в
недоступном для детей месте. В случае попадания в глаза тщательно промойте водой и проконсультируйтесь с врачом!
Утилизация отходов
Остатки химических реактивов и препаратов обычно считаются опасными отходами. Утилизация
отходов такого рода регулируется национальными и региональными законами и постановлениями. Обратитесь к своим местным властям или в компании по утилизации отходов для получения
рекомендаций относительно утилизации опасных отходов.
ЛИТЕРАТУРА
M.H. Beaman, R.E. McCabe, S-Y. Wong, J.S. Remington, Toxoplasma gondii, Inc: Principles and Practice of
Infectious Diseases, G.L.
Mandell, J.E. Bennet, R. Dolin, eds., Churchill Livingstone Publ., Fourth edition, p. 2455-2475 (1995)
Katalin N. Horvath, Zsuzsanna Szenasi, Jozsef Danka and Istvan Kucsera: Acta Parasitologica,, 50 (3), p.255 –
260 (2005)
K. Janitschke, J. Lab Med, 29(6), p. 439- 445 (2005)
Hedman K., Lappalainen M.,Seppala I., Recent primary Toxoplasmosa infection indicated by a low avidity specific
IgG,
J. Infect. Dis. 159, p. 736 – 740 (1989)
Joynson, DHM, Payne RA, Rawal BK, Potencial role of IgG avidity for diagnosing Toxoplasmosis, J. Clin. Pathol.43,
p: 1032-1033 (1990)
В соответствии со статьей 1, параграф 2b, Европейской директивы 98/79/EC, для использования медицинских изделий для диагностики in vitro производителем предусмотрено обеспечение пригодности, технических характеристик и безопасности продукта. Поэтому необходимо
строго следовать процедуре анализа, информации, особым указаниям и мерам предосторожности, изложенным в инструкциях по применению. Необходимо подвергнуть проверке использование наборов для анализа вместе с анализаторами или аналогичным оборудованием.
Дата выпуска: 2012
Страница 4 из 6
Инструкция по применению Rus
Дата выпуска: 2012
Страница 5 из 6
Инструкция по применению Rus
Инструкция по применению Toxoplasma gondii IgG ELISA Avidity Test
СХЕМА АНАЛИЗА
Тест на авидность IgG к токсоплазме (Toxoplasma gondii)
Подготовка к анализу
Подготовьте реагенты и образцы в соответствии с описанием.
Составьте план распределения и идентификации для всех образцов и контролей на бланке для
результатов, входящем в комплект поставки набора.
Отберите необходимое количество микротитрационных стрипов или лунок и установите их в
рамку-держатель.
Процедура анализа
Субстрат – хо- Функциональ- Функциональлостая проба ный контроль ный контроль
(A1/A2)
B1
B1
Функциональный контроль
– пипетирование в двух
повторностях
-
100 мкл
Образец
1+100 – пипетирование в
двух повторностях
-
-
100 мкл
Образец разведен: 1+100
н-р, C1
Образец разведен: 1+100
н-р, C2
-
-
100 мкл
100 мкл
Закройте лунки фольгой, входящей в комплект поставки набора.
Инкубируйте в течение 1 часа при 37°C.
Промойте каждую лунку три раза, используя 300 мкл промывочного раствора.
Реагент для
определения
авидности
-
Промывочный
раствор
-
100 мкл
100 мкл
100 мкл
100 мкл
Закройте лунки фольгой, входящей в комплект поставки набора.
Инкубируйте 30 минут в темноте при комнатной температуре.
Промойте каждую лунку три раза, используя 300 мкл промывочного раствора.
Конъюгат
-
100 мкл
100 мкл
100 мкл
100 мкл
Закройте лунки фольгой, входящей в комплект поставки набора.
Инкубируйте 30 минут в темноте при комнатной температуре.
Промойте каждую лунку три раза, используя 300 мкл промывочного раствора.
ТМБ субстрат
100 мкл
100 мкл
100 мкл
100 мкл
100 мкл
Инкубируйте ровно 15 минут в темноте при комнатной температуре
Стоп-реагент
100 мкл
100 мкл
100 мкл
100 мкл
100 мкл
Фотометрическое измерение на длине волны 450 нм (референтная длина волны: 620 нм)
Дата выпуска: 2012
Страница 6 из 6
Инструкция по применению Rus