Разработка тканеинженерных трансплантатов на основе клеток
advertisement
Разработка тканеинженерных трансплантатов на основе клеток постнатального организма Дашинимаев Э.Б., Васильев А.В., Терских В.В. Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН РЕГЕНЕРАЦИОННАЯ БИОМЕДИЦИНА ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ СТИМУЛЯЦИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ПОРАЖЕННЫХ ТКАНЕЙ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КЛЕТОК (Цитотерапия) ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Органы и ткани Трансплантация живых структур без модификации Клеточные трансплантаты Лекарственные средства Трансплантация живых структур после модификации в процессе производства Процесс производства Тканевая инженерия – безальтернативное будущее трансплантологии •Возможность подготавливать тканевые конструкции in vitro •Возможность использовать аллогенные и аутологичные клетки, заготовленные заранее (Biobanking) •Возможность широко использовать живое донорство •Отмена или снижение потребности в иммуносупрессии •3D‐структуры •Биосовместимый (деградируемый и недеградируемый) матрикс •Клеточно‐матриксные взаимодействия •Использование многоклеточных конструкций КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ И ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Плюрипотентные стволовые клетки (эмбриональные и индуцированные стволовые клетки) Культивированные клетки Постнатальные стволовые клетки ПОСТНАТАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ Высокий уровень обновления Высокий регенеративный потенциал Низкий уровень обновления Высокий регенеративный потенциал Низкий уровень обновления Низкий регенеративный потенциал Клетки крови Печень Мозг Спинной мозг Эпидермис Скелетные мышцы Сетчатка Эпителий кишечника, молочной железы Поджелудочная железа Почка Сердце Классификация стволовых клеток: Эмбриональные Фетальные Взрослые По: M. Rao, 2004 Тотипотентные Зигота Плюрипотентные ЭСК Мультипотентные Мезенхимальная стволовая клетка, Кроветворная стволовая клетка, Эпидермальная стволовая клетка Унипотентные По: Wagers, Weissman, 2004 Сателлитная клетка мышц КРИТЕРИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК Lajtha (1979) 1. Стволовые клетки – самоподдерживающаяся клеточная субпопуляция 2. Стволовые клетки содержатся в тканях в состоянии пролиферативного покоя или крайне медленно циклируют 3. Содержание стволовых клеток в тканях крайне низкое в пределах 1-3% 4. Стволовые клетки активируются при повреждении 5. Стволовые клетки дают начало дифференцированным и стволовым клеткам Постнатальные стволовые клетки МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ Максимов А.А. 1915 Фриденштейн А.Я. 1976, 1987 Каплан А. (Caplan A.) 1991 •Адгезивность к пластику в стандартных условиях in vitro; •Способность к дифференцировке in vitro в остеобласты, хондробласты и адипоциты; •Экспрессия специфических поверхностных маркеров. «+» «-» CD105 (эндоглин, CD45 – лейкоциты рецептор к TGFβ) CD73 (экто-5’-нуклеотидаза) CD34 – кроветворные и эндотелиальные клетки CD90 (Thy1 – семейство иммуноглобулинов) CD14 и CD11b – макрофаги и моноциты CD79a и CD19 – B лимфоциты HLA-DR Локализация стволовых клеток в различных типах эпителия (Miller et al., 1993) Стволовые клетки сердца Принципы восстановления структуры или функции тканей тканевыми эквивалентами Аутологичные Аллогенные •Замещение Восстановление структуры/функции •Стимуляция регенерации •Создание условий (ниша) для замещения Аутологичные клеточные трансплантаты Функция замещения Трансплантация пласта аутологичных кератиноцитов На 7 сутки после трансплантации Гистология участка кожи после восстановления с помощью трансплантации аутологичных кератиноцитов НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Сочетанное применение аллогенных и аутологичных трансплантатов в лечении критических и сверхкритических ожогов Клинический случай лечения 12‐летней девочки с ожогами 60% тела. Республиканская детская клиническая больница Доктор А.В. Быстров ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЖИВОГО ЭКВИВАЛЕНТА КОЖИ С АУТОЛОГИЧНЫМИ КЕРАТИНОЦИТАМИ Клетки окрашены DIO Трансплантация в уретру Обогащение стволовыми кератиноцитами (Са2+ free medium) Кожные кератиноциты Данные О.С. Роговой (ИБР) и д.м.н. А.К. Файзулина (МГСУ) Участок уретры в месте перехода нативного эпителия в восстановленный с использованием эпидермальных кератиноцитов Данные О.С. Роговой (ИБР) и д.м.н. А.К. Файзулина (МГСУ) РЕКОНСТРУИРОВАННАЯ УРЕТРА КРОЛИКА (40 дней после трансплантации живого эквивалента кожи) Di o Hoechst К7 Данные О.С. Роговой (ИБР) и д.м.н. А.К. Файзулина (МГСУ) РЕКОНСТРУИРОВАННАЯ УРЕТРА КРОЛИКА (40 дней после трансплантации) GFP Hoechst Данные О.С. Роговой Аллогенные клеточные трансплантаты Индукция регенерации Трансплантация пластов аллогенных кератиноцитов на гранулирующие раны (50-е сутки с момента ожога) Вид ран на 6-е сутки с момента трансплантации аллогенных кератиноцитов Вид ран на 10-е сутки с момента трансплантации аллогенных кератиноцитов Работа проведена совместно с НИИ СП им. Н.В. Склифосовского Восстановление кожного покрова трансплантацией аллогенных выращенных эпидермальных пластов на глубокие ожоги (IIIБ - IV степени). НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Военномедицинская академия Всего по двум клиникам Полное восстановление 7(32%) 2 (33,3%) 9(32.1%) Частичное восстановление 7(32%) 2 (33,3%) 9(32,1%) Отсутствие восстановления 8(36%) 2 (33,3%) 10(35%) Всего 22 6 28 Распределение компонентов внеклеточного матрикса, миофибробластов и моноцитов/макрофагов в длительно незаживающих ранах до начала лечения и после трансплантации аллогенного выращенного эпидермиса. Коллаген I типа ++ 5-е сутки после трансплантации ++ Коллаген III типа -/+ + ++ ++ Ламинин ++ ++ + + Тенасцин +++ ++ + -/+ CD68+ клетки +++ ++ ++ + αSMA+ клетки + + + + Иммуногистохимические маркеры В ране до трансплантации 10-е сутки после трансплантации ++ 15-е сутки после трансплантации ++ Критерии оценки: « - » – реакция отсутствует, « -/+ » - слабоположительная реакция, « + », « ++ », « +++ » - степени выраженности положительной реакции. Работа проведена совместно с Институтом молекулярной медицины ММА Экспрессия факторов роста, провоспалительных цитокинов, MMP-9 и TIMP-1/TIMP-2 в длительно незаживающих ранах до начала лечения и после трансплантации аллогенного эпидермиса. bFGF -/+ 5-е сутки после трансплантации ++ TGF-β - ++ + / ++ + IL-1β +++ ++ + + MIP-1α -/+ + + -/+ MIP-1β ++ + + -/+ MMP-9 ++ + + + TIMP-1 - / -/+ -/+ + + TIMP-2 - / -/+ -/+ + + Иммуногистохимические маркеры В ране до трансплантации 10-е сутки после трансплантации ++ 15-е сутки после трансплантации ++ Критерии оценки: « - » – реакция отсутствует, « -/+ » - слабоположительная реакция, « + », « ++ », « +++ » - степени выраженности положительной реакции. Язва роговицы 3 недели после щелочного ожога После двух последовательных трансплантаций фибробластов в коллагеновом геле с интервалом в 5 дней Институт глазных болезней им.Г. Гельмгольца, д.м.н. П.В. Макаров Механизм регенерации роговицы Процесс эпителизации Миграция фибробластов реципиента 5‐ сутки 14‐ сутки 30 сутки Работа проведена совместно с Институтом молекулярной медицины ММА Методика резекции и пластики гортани Схема лоскута Костный фрагмент с титановой пластиной Имплантация живого кожного эквивалента Функциональный результат Эндофото надскладочного отдела гортани Эндофото подскладочного отдела гортани Живой эквивалент кожи как универсальный эпителио-мезенхимный эквивалент Кожа Роговица Уретра Гортань Клеточная пластичность – новые возможности тканевой инженерии Пределы пластичности клеток для тканевой инженерии В пределах ткани Соматические клетки В пределах зародышевого листка Мультипотентные стволовые клетки Во все ткани организма Плюрипотентные стволовые клетки (эмбриональные и индуцированные стволовые клетки) Фибробласты – миофибробласты. Контракция коллагенового геля. Экспрессия гладкомышечного актина. α‐SMA Сканирующая электронная микроскопия коллагенового геля с включенными фибробластами культуральная чашка коллагеновый гель фибробласты Флотирующий коллагеновый гель Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток при культивировании в индукционных средах Клетки Фенотип А/О Клетки дермальной папиллы Oil Red O Oil Red O/ гематоксилин Остеогенез Лептин Лептин / DAPI Остеопонтин Остеопонтин/DAPI Остеонектин Остеонектин/DAPI +-/+ Клетки стромы жировой ткани +/+ Фибробласты дермы кожи +-/- Клетки дермальной папиллы в контрольной среде Адипогенез -/- Киселева и др., Цитология, 2009 Жизненно важные нерешенные проблемы тканевой инженерии •Нервная ткань •Кардиомиоциты •Гепатоциты •Инсулин‐продуцирующие клетки РЕШЕНИЕ: индуцированная плюрипотентность или прямая трансдифференцировка Oct 3/4, Sox2, Klf4, c‐ myc Индуцированная плюрипотентность (iPS cells) iPS K. Takahashi,….., S. Yamanaka, 2007, Cell Спасибо за внимание!
