Антитела класса IgG к антигенам печени EUROLINE Antibodies

EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG), EUROIMMUN AG
1
___________________________________________________________________________________________
Антитела класса IgG к антигенам печени EUROLINE
Antibodies against Liver specific antigens (IgG)
Набор для качественного определения in vitro аутоантител класса IgG к антигенам печени AMA-M2, М2-3E
(BPO), Sp100, PML, gp210, LKM-1, LC-1, SLA/LP и Ro-52 в сыворотке или плазме крови человека методом
иммуноблотинга.
Номер по каталогу: DL 1300-1601-4 G
Набор рассчитан на 16 определений
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG) предназначен для качественного определения
in vitro аутоантител класса IgG человека к 9 различным антигенам печени: AMA-M2 (пируватдегидрогеназному комплексу), М2-3E (BPO, белку субъединиц Е2 дегидрогеназ альфа-2-оксикислот
внутренней мембраны митохондрий), Sp100 (белку ядерных гранул, ядерных пятен), PML (белку
промиелоцитарной лейкемии, ядерных пятен), gp210 (интегральному белку ядерной мембраны,
комплекс ядерных пор), LKM-1 (микросомам печени и почек; цитохрому Р450 II D6), LC-1
(цитозольному антигену печени 1 типа; формиминотрансферазе-циклодеаминазе), SLA/LP
(растворимому печеночному антигену/печеночно-панкреатическому антигену) и Ro-52 в сыворотке и
плазме крови.
ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ
Повышение активности трансаминаз неясной этиологии, подозрение на аутоиммунный гепатит, первичный
билиарный цирроз печени.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Тест EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG) основан на методе иммуноблотинга. Набор
содержит тестовые стрипы, на которые нанесены параллельные полосы очищенных антигенов. Тестовые
стрипы инкубируют на первой стадии реакции с образцом разведенной сыворотки или плазмы крови
пациента. В случае если образец положительный, специфические антитела класса IgG (а также классов IgA
и IgM) будут связываться с соответствующими антигенами. Для обнаружения связанных антител
проводится вторая инкубация с использованием ферментного конъюгата (антитела к IgG человека,
меченные щелочной фосфатазой), который способен вызывать развитие цветной реакции.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
Состав набора
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Компонент
Тестовые стрипы, покрытые антигенами:
AMA-M2, М2-3E (BPO), Sp100, PML, gp210, LKM-1,
LC-1, SLA/LP и Ro-52
Положительный контроль
(IgG человека), 100х концентрат
Ферментный конъюгат
Козьи антитела к IgG человека, конъюгированные с
щелочной фосфатазой; 10х концентрат
Буфер для разведения образцов
Готов к использованию
Промывочный буфер
10х концентрат
Раствор субстрата
Нитроголубой тетразолий хлорид/5-бром-4-хлор-3индолил-фосфат (NBT/BCIP), готов к использованию
Оценочный протокол
Лоток для инкубации
Пластиковая пленка
Инструкция по применению набора
Серия
Для in vitro диагностики
Количество
Обозначение
16 × 1
1 × 0,02 мл
STRIPS
POS CONTROL 100×
1 × 3 мл
CONJUGATE 10×
1 × 100 мл
SAMPLE BUFFER
1 × 50 мл
WASH BUFFER 10×
1 × 30 мл
SUBSTRATE
1 шт.
2 × 8 каналов
1 шт.
1 экз.
Температура хранения
Невскрытый набор использовать до
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG), EUROIMMUN AG
2
___________________________________________________________________________________________
Хранение и стабильность набора: Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не
замораживать. Невскрытые компоненты набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока
годности набора.
Удаление отходов: Неразведенную сыворотку крови пациентов и тестовые стрипы после инкубации
следует рассматривать как инфицированные отходы и обращаться с ними соответствующим образом. Все
реагенты следует удалять в соответствии с действующими официальными инструкциями.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание: Перед использованием температуру всех реагентов необходимо прогреть до комнатной (от
+18 °С до +25 °С) в течение 30 минут. После первого использования реагенты сохраняют стабильность в
течение всего указанного срока годности при условии их хранения при температуре от +2 °С до +8 °С и
отсутствии микробной контаминации.
- Тестовые стрипы, покрытые антигенами: Готовы к использованию. Во избежание конденсации влаги
на стрипах, не вскрывайте пакет до тех пор, пока он не прогреется до комнатной температуры. Вынув
необходимое количество стрипов, остальные неиспользованные стрипы немедленно плотно закройте в
той же защитной упаковке и храните при температуре от +2 °С до +8 °С.
-
Положительный контроль: Поставляется в виде 100-кратного концентрата. Для приготовления
готового к использованию контроля из флакона с концентратом отберите необходимое количество
жидкости с помощью пипетки с чистым наконечником и разведите 1:101 буфером для разведения
образцов. Например: добавьте 15 мкл контроля к 1,5 мл буфера для разведения образцов и тщательно
перемешайте. Готовый к использованию разведенный контроль следует использовать до конца
рабочего дня.
-
Ферментный конъюгат: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Отберите необходимое
количество жидкости из флакона с концентратом с помощью пипетки с чистым наконечником и
разведите 1:10 буфером для разведения образцов. Например, для проведения анализа на 1 тестовом
стрипе, смешайте 0,15 мл концентрата ферментного конъюгата с 1,35 мл буфера для разведения
образцов. Разведенный раствор ферментного конъюгата следует использовать до конца рабочего дня.
-
Буфер для разведения образцов: Готов к использованию.
-
Промывочный буфер: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Для приготовления готового к
использованию промывочного буфера отберите необходимое количество жидкости из флакона с
концентратом с помощью пипетки с чистым наконечником и разведите 1:10 дистиллированной водой.
Например, для проведения анализа на 1 тестовом стрипе разведите 1 мл концентрата промывочного
буфера в 9 мл дистиллированной воды. Разведенный буфер следует использовать до конца рабочего
дня.
Раствор субстрата: Готов к использованию. После отбора необходимого количества реагента из
флакона немедленно вновь закройте его, так как раствор чувствителен к свету.
Внимание! Использованный контроль был проверен на отсутствие антигена гепатита В, а также антител к
вирусам ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и вирусу гепатита С методами иммуноферментного анализа или непрямой
иммунофлуоресценции. Тем не менее, все используемые материалы следует считать потенциально
опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры предосторожности. Некоторые реагенты
являются ядовитыми (буфер, субстратный раствор). Избегайте контакта с кожей.
-
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Материал образцов: Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека.
Стабильность: Исследуемые образцы, предназначенные для анализа этим методом, можно хранить до 14
дней при температуре от +2 оС до +8 оС. Разведенные образцы необходимо использовать в течение одного
рабочего дня.
Разведение образцов: Исследуемые образцы разводят 1:101 буфером для разведения образцов.
Например: разведите 15 мкл исследуемого образца в 1,5 мл буфера для разведения образцов и тщательно
перемешайте на вортексе (пипетка для перемешивания не пригодна).
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG), EUROIMMUN AG
3
___________________________________________________________________________________________
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Блокировка стрипов
Выньте из упаковки требуемое количество тестовых стрипов и поместите
каждый стрип в отдельный канал. При этом должен быть виден номер стрипа,
указанный в его нижней части. Заполните каналы пластикового лотка для
инкубации буфером для разведения образцов (по 1,5 мл буфера на один
канал). Инкубируйте 5 минут при комнатной температуре на шейкере-качалке.
Затем удалите всю жидкость из каждого канала.
Инкубация образцов
(1-я стадия)
Внесите в каждый канал по 1,5 мл разведенного образца сыворотки или плазмы
крови и инкубируйте при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С) в
течение 30 минут на шейкере-качалке.
Промывка
Удалите жидкость из каждого канала и затем промойте 3 раза по 5 минут на
шейкере-качалке, внося каждый раз по 1,5 мл промывочного буфера на канал.
Инкубация с
конъюгатом
(2-я стадия)
Внесите в каждый канал по 1,5 мл разведенного ферментного конъюгата
(меченные щелочной фосфатазой антитела к IgG человека). Инкубируйте в
течение 30 минут при комнатной температуре (от +18 ° до +25 °) на шейкерекачалке.
Промывка
Удалите жидкость из каждого канала и затем промойте 3 раза по 5 минут на
шейкере-качалке, внося каждый раз по 1,5 мл промывочного буфера на канал.
Инкубация с субстратом
(3-я стадия)
Внесите в каждый канал по 1,5 мл раствора субстрата. Инкубируйте в течение
10 минут при комнатной температуре (от +18 ° до +25 °С) на шейкере-качалке.
Остановка реакции
Удалите жидкость из каждого канала и затем промойте 3 раза по 1 минуте
дистиллированной водой.
Оценка результатов
Поместите тестовый стрип на оценочный протокол, высушите на воздухе и
проведите оценку результатов.
При использовании EUROBlotMaster для автоматической инкубации, выберите программу Euro02 AAb EL30.
ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG)
Регистрация результатов реакции
После остановки реакции поместите влажные проинкубированные блотовые стрипы на покрытый
прозрачным пластиком оценочный протокол и совместите их с имеющейся разметкой. Затем осторожно
прижмите стрипы листом фильтровальной бумаги для удаления влаги (после высыхания стрипы прочно
закрепятся на пластике). В оценочный протокол заносятся все ясно различимые полосы высохших стрипов,
совпавшие с разметкой. Наличие белой полосы на уровне антигена должно интерпретироваться как
отрицательный результат. Если результаты оцениваются в цифровом виде с использованием сканера
EUROLineScan, стрипы следует поместить на соответствующий лист рабочего протокола, как описано
выше. После сканирования сухие блотовые стрипы для дальнейшего хранения следует закрыть сверху
пластиковой пленкой. Для ввода теста (Test) в сканер EUROLineScan используйте код АLD.
На стрипах имеется контрольная полоса. Инкубация проведена правильно, если контрольная
полоса в результате реакции ярко окрашена.
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG), EUROIMMUN AG
4
___________________________________________________________________________________________
Антигены и их размещение на стрипах: Тестовые стрипы EUROLINE покрыты следующими антигенами:
Нативный антиген AMA-M2 получен очисткой из сердца
быка; в качестве главного компонента он содержит
субъединицу Е2 (74 кДа) пируватдегидрогеназного
комплекса (PDH).
Антиген М2-3E (BPO) – объединенный рекомбинантный
белок, продуцируемый E. coli и представляющий собой
иммуногенные домены субъединиц Е2 дегидрогеназы 2оксикислот
с
разветвленными
цепями
(BCOADH),
пируватдегидрогеназы
(РDH)
и
2оксоглутаратдегидрогеназы (OGDH), вместе называемые
ВРО.
Антигены Sp100 и PML являются компонентами ядерных
телец лейкемичных промиелоцитов (ядерные тельца PMLNB, ядерные гранулы). Соответствующая кДНК человека
была экспрессирована в E. coli.
AMA-M2
М2-3E (BPO)
Sp100
PML
Антиген gp210 является компонентом комплекса ядерных
пор (NPC). Соответствующая кДНК человека была
экспрессирована в E. coli.
Антиген LKM-1 локализован в микросомальной фракции
печени и почек. Путем клонирования и секвенирования он
был идентифицирован как цитохром Р450 II D6.
Соответствующая кДНК человека была экспрессирована в
E. coli.
Рекомбинантный антиген LC-1 (формиминотрансферазациклодеаминаза) был экспрессирован путем клонирования
соответствующей кДНК человека в клетках насекомых с
использованием системы бакуловируса.
Рекомбинантный
SLA/LP
(белок-суппрессор
UGA,
ассоциированный с тРНК) получен клонированием
соответствующей кДНК человека в E. coli.
Ro-52:
Рекомбинантный
белок
Ro-52
(52
кДа).
Соответствующая кДНК человека была экспрессирована в
клетках
насекомых
с
использованием
системы
бакуловируса.
gp210
LKM-1
LC-1
SLA/LP
Ro-52
Контроль
На основании интенсивности сигнала все результаты можно разделить на отрицательные, промежуточные
и положительные.
Сигнал
Нет сигнала
Окраска полосы очень слабая
Окраска полосы от умеренной до интенсивной
Окраска полосы очень интенсивная, сравнимая с окраской контрольной полосы
Результат
Отрицательный
Промежуточный
Положительный
Сильно-положительный
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG), EUROIMMUN AG
5
___________________________________________________________________________________________
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Диапазон определения
Метод EUROLINE является качественным, диапазон определения не дается. Принято, что предельный титр
антител устанавливается при разведении образца 1:101.
Перекрестные реакции
Качество используемых субстратов антигенов и источников антигенов гарантирует высокую специфичность
наборов EUROLINE. Данный набор EUROLINE специфически определяет антитела класса IgG к AMA-M2,
М2-3E (BPO), Sp100, PML, gp210, LKM-1, LC-1, SLA/LP и Ro-52. Перекрестных реакций с другими
аутоантителами не обнаружено.
Интерференция: Не отмечено изменения аналитических характеристик при исследовании в данном
наборе гемолизированных, липемических или желтушных образцов с концентрациями гемоглобина
вплоть до 5 мг/мл, триглицеридов – до 20 мг/мл и билирубина – до 0,4 мг/мл.
Воспроизводимость результатов между опытами и в пределах одного опыта
Воспроизводимость результатов между опытами оценивали многократным повторным исследованием
одних и тех же охарактеризованных образцов в течение нескольких дней, воспроизводимость в пределах
одного опыта – многократным исследованием охарактеризованных образцов в течение одного дня. В
каждом случае интенсивность полос находилась в пределах установленного диапазона. Таким образом,
данный тест EUROLINE показывает очень высокую воспроизводимость в пределах одной постановки и
между постановками.
Результаты клинического исследования: 170 сывороток пациентов с клинически охарактеризованным
первичным билиарным циррозом (РВС), 49 сывороток пациентов с аутоиммунным гепатитом (AIH), 200
сывороток пациентов с вирусным гепатитом (вирусный гепатит С или гепатит В) и 50 сывороток здоровых
доноров крови исследовали на наличие антител к AMA-M2, 3E (BPO), Sp100, PML и gp210. При АIH 94%
сывороток содержали антитела хотя бы к одному из названных антигенов.
AMAM2
3E
(BPO)
M2/3E
Sp100
PML
Sp100/
PML
gp210
Cуммарная
РВС
(n = 170)
138
(81%)
146
(86%)
150
(88%)
35
(21%)
22
(13%)
40
(24%)
45
(26%)
159
(94%)
AIH
(n = 49)*
4
(8%)
2
(4%)
4
(8%)
2
(4%)
2
(4%)
2
(4%)
2
(4%)
6
(12%)
Вирусные
гепатиты
(n = 200)
0
0
0
0
1
(1%)
1
(1%)
1
(1%)
2
(1%)
Доноры
крови
(n = 50)
0
0
0
0
0
0
0
0
Панель
* На основании данного исследования 4 пациентам из группы AIH был поставлен диагноз РВС/AIH с
синдромом перекрывания.
На панели пациентов с РВС (n = 170) была рассчитана чувствительность тест-системы к антигенам AMAM2, М2-3E (BPO), Sp100, PML и gp210, которая суммарно ко всем антигенам составила 94%, а на панелях
вирусных гепатитов и доноров крови (n = 250) была рассчитана специфичность, равная 99%.
Панель
AMAM2
3E
(BPO)
M2/3E
Sp100
PML
Sp100/
PML
gp210
Cуммарная
Чувствительност
ь
81%
86%
88%
21%
13%
24%
26%
94%
Специфичность
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
99%
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG), EUROIMMUN AG
6
___________________________________________________________________________________________
Антитела к Ro-52 не имеют специфичности к какому-либо заболеванию, они могут присутствовать в
сыворотках пациентов с миозитом, склеродермой и другими коллагенозами. Например было определено,
что аутоантител к Ro-52 содержатся только в 35% сывороток пациентов со склеродермой (n = 20).
Более того, по данным Liaskos с сотр. [6], антитела к Ro-52 обнаруживались у 44 из 45 обследованных
пациентов с АИГ, позитивных по SLA/LP.
Другие проведенные исследования:
С помощью тест-систем фирмы EUROIMMUN сыворотки 454 пациентов с аутоиммунным гепатитом (AIH),
полученные из четырех мировых центров, исследовали на аутоантитела к SLA/LP. Было показано, что AIH с
положительной реакцией на анти-SLA/LP распространен по всему миру в процентном соотношении от 5 до
19 %. Степень распространенности, по-видимому, ниже в Японии. На наличие аутоантител к антигенам
печени были проверены сыворотки 24 пациентов, страдающих AIH с положительной реакцией на анти-LKM1 (AIH типа II), сыворотки 26 пациентов с первичным билиарным циррозом, сыворотки 109 человек
контрольной группы с прочими заболеваниями печени и сыворотки 57 здоровых доноров крови.
Специфичность анти-SLA/LP и анти-LC-1 к AIH составляла 100%, тогда как анти-LKM-1 присутствовали как
при AIH, так и при вирусных гепатитах.
Группа
пациентов
Происхождение
сыворотки
n
(670)
AntiAMA-M
позитивные
AntiLKM-1
позитивные
AntiLC-1
позитивные
AntiSLA/LP
позитивные
АИГ
Проф. Lohse,
Университет, Майнц
108
не опр.
не опр.
не опр.
21 (19;%)
АИГ
Панель из Бразилии
154
не опр.
не опр.
не опр.
25 (16%)
АИГ
Панель из Японии
43
не опр.
не опр.
не опр.
2 (5%)
АИГ
АИГ
(позитивный
на антитела
к LKM-1)
Панель из Америки
Др. Gruber, Мюнхенский Университет;
Проф. Vergani, Университетский колледж,
Лондон,
Объединенное
Королевство
Др. Gruber, Мюнхенский Университет;
Др. Wick, Клиника в
Гроссхадерне
Проф. Vergani, Университетский колледж,
Лондон,
Объединенное
Королевство
Др. Stocker,
EUROIMMUN AG
149
24
не опр.
0
не опр.
24 (100%)
не опр.
6 (25%)
23 (15%)
0
26
24 (92%)
0
0
0
4
0
0
0
0
37
0
0
0
0
Проф. Lohse, Университет, Майнц;
Др. Stocker,
EUROIMMUN AG
Проф. Lohse,
Университет, Майнц
30
0
5 (17%)
0
0
38
1 (3%)
0
0
0
Медицинский
Университет, Любек
57
0
0
0
0
Первичный
билиарный
цирроз
Аутоиммунный склерозирующий
хлангит
Инфекционный
гепатит В
Инфекционный
гепатит С
Токсическое
поражение
печени
Доноры
крови
не опр. – не определяются.
Референсные значения
Диапазон референсных значений определяли, используя группу здоровых доноров крови (n = 50). Все
доноры крови были серогенативными.
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG), EUROIMMUN AG
7
___________________________________________________________________________________________
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Аутоиммунные заболевания печени включают:
- аутоиммунный гепатит (АИГ, AIH),
- первичный билиарный цирроз печени (РВС)
- первичный склерозирующий холангит (PSC).
Аутоиммунному гепатиту подвержены в основном женщины; AIH ранее называли волчаночным гепатитом
(lupoid hepatitis), активным хроническим гепатитом ( = постгепатитный цирроз). Заболевание проявляется в
увеличении уровня билирубина, печеночных ферментов и иммуноглобулинов, через типичные
гистологические изменения (биопсия печени показывает некроз паренхимных клеток с инфильтрацией
лимфоцитов и плазматических клеток), а также наличием различных аутоантител.
Встречаемость AIH в Западной Европе составляет 1,9 случаев на 100 000 жителей в год. Нелеченный
аутоиммунный гепатит вскоре развивается в цирроз печени. Однако если вовремя начать проводить
иммуносупрессивную терапию и продолжать ее все время, пациент имеет нормальную продолжительность
жизни. Для дифференциальной диагностики с текущей инфекцией, вызванной гепатовирусами, необходимо
проводить исследование соответствующих серологических параметров.
Циркулирующие аутоантитела имеют большие значение для диагностики AIH. Они есть почти у всех
пациентов с этим заболеванием, однако, их роль в патогенезе стоит под вопросом. Нет также ясной
корреляции между активностью или прогнозом заболевания и титром антител. Кроме антител к SLA/LP с
AIH связаны также следующие антитела: антинуклеарные антитела (ANA), антитела к nДНК, антитела к
гладкомышечной ткани (SMA, с F-актином в качестве главной антигенной мишени), антитела к микросомам
печени и почек (LKM-1, с цитохромом Р450 IID6 в качестве антигена-мишени), антитела к цитозольному
печеночному антигену 1 типа (LC-1, с формиминотрансферазой-циклодеаминазой в качестве антигенамишени) и антитела к гранулоцитам (pANCA). Аутоантитела к SLA/LP, которые в настоящее время можно
измерить с помощью ИФА фирмы EUROIMMUN, вероятно имеют наибольшую диагностическую точность
среди всех видов антител, вовлеченных в ответ при аутоиммунном гепатите. Анти-SLA/LP присутствуют при
AIH или одни, или вместе с другими аутоантителами. Хотя их распространенность составляет только около
30%, предсказанное значение равно почти 100%: каждый положительный результат поэтому дает
существенное доказательство аутоиммунного гепатита (предусматривается, что соответствующие
клинические симптомы имеются).
Исследование антител к SLA/LP до сих пор было возможно только в нескольких специализированных
лабораториях. Раньше предполагалось, что антиген SLA идентичен цитокератинам печени 8 и 18 или
ферменту глутатион-S-трансферазе. И только недавно было показано, что это, по-видимому, не так. Вновь
открытый антиген-мишень SLA/LP только теперь идентифицирован на уровне ДНК. Это, вероятно,
цитоплазматическая молекула, участвующая в регуляции биосинтеза белка (ассоциированного с тРНК
UGA-супрессора). Большая диагностическая ценность аутоантител к SLA/LP теперь убедительно доказана.
Аутоантитела к клеточному ядру (ANA) и к гладкомышечной ткани (SMA) часто бывают при AIH, но их
находят также у 10-20% пациентов с хроническим вирусным гепатитом и при других заболеваниях.
Аутоантитела к LKM-1, могут быть выявлены только примерно у 1% взрослых пациентов с AIH, однако,
чаще они встречаются у детей. Антитела к LKM-1 могут также быть найдены у 1-2% пациентов с
положительной серологией по гепатиту С. В отличие от всех других аутоантител, антитела к SLA/LP
высокоспецифичны к AIH и не были описаны при вирусном гепатите.
Некоторые авторы классифицируют аутоиммунный гепатит в соответствии с аутоиммунным статусом:
субтип I (ANA, SMA), субтип II (аутоантитела к LKM-1 и LC-1) и субтип III (антитела к SLA/LP). Данная
классификация, вероятно, не имеет ни клинического, ни терапевтического, ни прогностического значения.
Диагноз аутоиммунного гепатита (AIH) основан на клинической картине, результатах биохимических и
серологических тестов и гистологических доказательствах воспалительной реакции. Он требует
исключения иных причин хронического гепатита, таких как вирусы, алкоголь и лекарства, и разграничения
от других аутоиммунных заболеваний печени (первичного билиарного цирроза печени и первичного
склерозирующего холангита). Диагноз AIH наиболее вероятен при соблюдении четырех из пяти главных
критериев. Если имеются в наличии все 5 критериев, диагноз установлен. Диагноз подтвержден, если
пациенту помогает иммуносуппрессивное лечение.
Главные критерии при диагностике аутоиммунного гепатита:
1. Гистологическое доказательство гепатита
2. Обнаружение аутоантител (ANA, SMA, LKM, SLA/LP)
3. Гипергаммаглобулинемия
4. Отрицательная серология по вирусным гепатитам В и С
5. Обнаружение HLA–антигенов B8, DR3 или DR4
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG), EUROIMMUN AG
8
___________________________________________________________________________________________
Серологическое выявление аутоантител к SLA/LP обеспечивает точное разграничение с вирусными
гепатитами у трети пациентов с AIH. Таким образом, аутоиммунная серология гепатита обогатилась
дополнительным параметром, значение которого может быть оценено выше значения антител к клеточному
ядру, ДНК, гладкомышечной ткани и к печеночным/печеночно-почечным микросомам (ANA, nDNA, ASMA,
LKM). Для гепатологических клиник возможность тестирования этих антител значит очень много:
последствия от некорректного лечения AIH интерфероном могут оказаться такими же фатальными, как
последствия применения иммуносупрессивной терапии при вирусной инфекции.
Определение антимитохондриальных антител (АМА) имеет важнейшее значение для диагностики
первичного билиарного цирроза печени (PBC). Это иммуноопосредованное хроническое
воспалительное холестатическое заболевание печени неясной этиологии.
Заболевание характеризуется наибольшей встречаемостью у женщин (>90 %), чаще всего в возрасте от
40 до 60 лет. Установлено, что распространенность РВС в различных регионах мира составляет от 4 до
31 случая на миллион человек в год [7].
На переднем плане клинической картины РВС находятся инфильтрация лимфоцитов вокруг малых
внутрипеченочных желчных протоков (желчных канальцев - canaliculi) и застой желчи (холестаз).
Заболевание часто начинается с неспецифических, очень разных общих симптомов, таких как зуд (pruritus,
чесотка), чувство усталости и боль в верхней правой зоне живота. Через различные периоды времени
возникает обтурационная желтуха. Важным диагностическим показателем РВС является увеличение
содержания сывороточных липидов.
Гистологически в печени выявляют изменения, соответствующие хроническому, негнойному
деструктивному холангиту с гранулирующим перихолангитом, медленно прогрессирующей деструкцией
малых и средних желчных протоков с последующим фиброзом, конечной стадией которого является
цирроз. Помимо печени в патологическом процессе часто участвуют другие органы с экзокринной
функцией, более всего слезные и слюнные железы и поджелудочная железа.
Хотя РВС не излечивается путем назначения урсодезоксихолиевой кислоты (растворяющей желчные
камни) и холестирамина (предотвращающего реабсорбцию желчных кислот), некоторые симптомы
заболевания можно минимизировать до такой степени, что большинство пациентов будет иметь
нормальную продолжительность жизни и нормальное качество жизни.
Диагностика РВС включает использование функциональных печеночных тестов (определение уровня
щелочной фосфатазы, аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы), тестов на сывороточные
липиды, скринингового теста на антимитохондриальные антитела (АМА) и антиядерные антитела (ANA), а
также дифференциальных тестов для исключения других хронических воспалительных заболеваний
печени, таких как хронический вирусный гепатит, аутоиммунный гепатит или первичный склерозирующий
холангит (PSC).
До сих пор в сыворотке крови пациентов с РВС обнаруживали четыре из девяти различных типов AМA
(антиядерных антител к антигенам М2, М4, М8 и М9). Наиболее чувствительным и специфичным
диагностическим маркером являются антитела к антигену М2 [8, 9, 10]. Эти антитела обнаруживаются у
94% пациентов с РВС [11]. Высокий титр антител к М2 является важным показателем для диагностики РВС;
по этому показателю с высокой степенью вероятности можно предсказать дальнейшее развитие РВС у
пациентов без значительных нарушений функции печени или без симптомов холестатических заболеваний
[12, 13, 14]. Антитела к М2 могут быть обнаружены также и при других заболеваниях, которые
“перекрываются” с РВС, например, при аутоиммунном гепатите, а также при иммунопатологических
заболеваниях, не оказывающих прямого воздействия на печень (например, у 6% пациентов с
прогрессирующим системным склерозом и у пациентов с синдромом Шегрена) [15, 16, 17, 18]. Некоторые
случаи обнаружения АМА, но в основном в более низких титрах, были описаны при других хронических
заболеваниях печени и, в частности, у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С [19, 20, 21], а также
у пациентов с другими ревматологическими заболеваниями, например, при системной красной волчанке
[22].
По молекулярной природе антигены, на которые направлены анти-М2 аутоантитела, были
идентифицированы как, входящие в комплекс ферментов дегидрогеназы 2-оксикислот (2-OADH) в
дыхательной цепи митохондрий. Они включают субъединицу Е2 дегидрогеназы 2-оксикислот с
разветвленными цепями (BCOADH-E2), субъединицу Е2 пируватдегидрогеназы (РDH-E2), субъединицу Е2
2-оксоглутаратдегидрогеназы (OGDH-E2), cубъединицу E1t пируватдегидрогеназы и связывающий белок Е3
(протеин Х). Среди всех этих ферментных компонентов РDH-E2 является главным аутоантигеном РВС, так
как образцы сыворотки большинства пациентов (80% - 90%) содержат АМА, специфичные к РDH-E2. Кроме
того, около 60% пациентов с РВС проявляют реакцию на BCOADH-E2 [23]. Только 4-13 % образцов
сывороток от пациентов с РВС узнают BCOADH-E2, но не узнают РDH-E2. Компонент Е2 OGDH может
обнаруживаться в 30% - 80% сывороток пациентов с РВС. Иммунодоминантные эпитопы BCOADH-E2, РDH___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG), EUROIMMUN AG
9
___________________________________________________________________________________________
E2 и OGDH-E2 представляют собой домены, связывающие липоильные остатки, но антитела к ним не дают
друг с другом перекрестных реакций.
Путем использования рекомбинантной технологии три липоил-связывающих домена (принадлежащих
комплексам BCOADH-E2, РDH-E2 и OGDH-E2) удалось объединить в единый артефактный белок ВРО; этот
белок содержит все необходимые эпитопы [24]. Использование такого сконструированного белка совместно
с нативным антигеном М2 (белком, очищенным из пируватдегидрогеназного комплекса свиньи) позволяет
увеличить чувствительность моноспецифичной тест-системы для определения антител к М2 по сравнению
с тест-системой, основанной на одном только нативном антигене М2.
У одной трети пациентов с РВС, методом непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), кроме АМА,
обнаруживают еще и антиядерные аутоантитела (ANA). В течение последнего десятилетия было показано,
что многие ядерные структуры при РВС являются специфичными мишенями ANA. В их группу входят белки
промиелоцитарной лейкемии (PML) и Sp100, которые в методе РНИФ дают окрашивание так называемых
“ядерных пятен”, а также два компонента комплекса ядерных пор (gp210 и р62), которые специфичны к
перинуклеарному типу окрашивания в РНИФ [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32].
Приблизительно у 10% - 20% пациентов с РВС развивается вторичный аутоиммунный гепатит (известный
также как “синдром перекрывания” – overlap syndrome). В этих случаях часто находят те же самые
аутоантитела, как при AIH. Антитела к антигенам SLA/LP указывают на вторичный AIH (overlap syndrome),
который следует лечить, применяя иммуносупрессорную терапию.
Распространенность первичного склерозирующего холангита (PSC) составляет 4 случая на каждые
100 000 жителей в год. Клиническая картина также характеризуется холестазом. Диагностической исходной
точкой являются соответствующие диагностические данные, гистология и ERCP (эндоскопическая
ретроградная холангиопанкреатикография). В основном заболевают мужчины, и у половины пациентов
имеется сопутствующий язвенный колит (и наоборот превалирование PSC в случае язвенного колита
составляет 4%). Большинство пациентов с PSC имеют аутоантитела к гранулоцитам (pANCA). Иногда
pANCA могут также быть при AIH и PBC и их ценность для дифференциальной диагностики ограничена в
этом отношении. Однако pANCA являются указанием на аутоиммунное заболевание печени и, возможно,
могут быть использованы для дифференциации инфекционных форм гепатита. Если даже сообщалось о
“перекрывании” между PSC и AIH, антитела к SLA/LP не были найдены у этих пациентов.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
Liver_Profile_EUROLINE_DL 1300 4G_rus.doc
6/16/2009 4:27:10 PM
Оригинал
DL_1300-4G_A_UK_C02.doc
Version: 03/03/2009 10:10:29
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG), EUROIMMUN AG
10
___________________________________________________________________________________________
EUROLINE Profile Autoimmune Liver Diseases (IgG)
Протокол инкубации
Блокировка:
Поместите блотовый стрип в канал лотка для инкубации, и внесите в
лоток 1,5 мл буфера для разведения образцов
5 мин
При встряхивании
1. Инкубация с образцом:
Удалите жидкость, внесите в канал
1,5 мл разведенного образца сыворотки (1:101)
30 мин
При встряхивании
Промывка:
Удалите жидкость, промойте 3 раза по 5 минут каждый канал
1,5 мл промывочного буфера в рабочем разведении
2. Инкубация с конъюгатом:
Удалите жидкость, внесите в канал
1,5 мл ферментного конъюгата (1:10)
30 мин
При встряхивании
Промывка:
Удалите жидкость, промойте 3 раза по 5 минут каждый канал
1,5 мл промывочного буфера в рабочем разведении
3. Инкубация с субстратом:
Удалите жидкость, внесите в канал
1,5 мл раствора субстрата
10 мин
При встряхивании
Остановка реакции:
Удалите жидкость, промойте 3 раза по 1,5 мл дистиллированной воды
Оценка
На сканере EUROLineScan (цифровая) или визуальная
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru