Государственное бюджетное учреждение здравоохранения г. Москвы
advertisement
Государственное бюджетное учреждение здравоохранения г. Москвы «Московский научно-практический Центр дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения г. Москвы» На правах рукописи Потапова Александра Анатольевна ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ НЕОДНОЗНАЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С 14.03.10 «Клиническая лабораторная диагностика» Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: д.м.н., профессор Н.И. Cюч Москва 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………………..... 6 6 ГЛАВА 1. ПРОБЛЕМЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)……………………… ……………….. 16 1.1. Особенности эпидемиологического процесса вирусного гепатита С. Хронизация, наличие скрытых форм и осложнений …………………………... 16 1.2. Строение вириона. Классификация и распространение генотипов ВГС. Геном, белки и жизненный цикл вируса гепатита С …………………………... 22 1.3. Диагностическая значимость и ограничения методов определения прямых маркеров ВГС-инфекции: РНК и белков ВГС. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты ……………........ 29 1.4. Клеточный и гуморальный иммунный ответ на белки ВГС. Методы выявления антител к ВГС и границы диагностической точности…………….. 34 1.5. Сочетание серологических, молекулярно-генетических и клеточных методов исследования в выявлении скрытой ВГС-инфекции ………………... 45 1.6. Молекулярная мимикрия антигенов ВГС с белками других микроорганизмов и человека как причина появления аутореактивности и ложной позитивности. Патологические продукты иммунной системы при хроническом гепатите С…………………………………………………………. 48 1.7. Диагностическое значение неспецифических маркеров воспаления печени при ВГС- инфекции……………………………………………………… 53 1.8. Различные стратегии и алгоритмы скрининга на наличие маркеров вирусного гепатита С. Сравнительные эпидемиологические и экономические аспекты лабораторного скрининга маркеров гепатита С и ГЛАВА 2. ВИЧ-инфекциии…. 59 1.9. Контроль качества исследования антител к ВГС…………………………. 68 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Этапы исследования………………………………………………………… 72 2.2. Пациенты……………………………………….……………………………. 73 2.3. Материал исследования…………………………………………………….. 77 2.4. Методы исследования…………………………………………………......... 77 2.5. Статистическая обработка…………………………………………….......... 85 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ГЛАВА 3. ЧАСТОТА И ДИНАМИКА РАСПРОСТРАНЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВГС СРЕДИ РАЗЛИЧНЫХ ГРУПП ПАЦИЕНТОВ ЛПУ Г. МОСКВЫ ПРИ МАССОВОМ СКРИНИНГЕ В 2000 − 2012 г.г………………………………… ГЛАВА 4. 87 ПОКАЗАТЕЛИ И CПОСОБЫ ОПТИМИЗАЦИИ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ МАССОВОМ СКРИНИНГЕ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С…... ГЛАВА 5. 98 ЛАБОРАТОРНЫЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ АЛГОРИТМ МАССОВОГО СКРИНИНГА АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С………………………… 105 5.1. Подтверждение наличия антител к вирусу гепатита С при массовом скрининге крови: противоречивость результатов в подтверждающих иммуноферментных диагностических системах планшетного формата……... 105 5.2. Сравнение результатов исследования проб в ИФА планшетного формата «Спектр» (с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4 и NS5-антигенам ВГС) с результатами исследования в ЛИА «INNO-LIA HCV Ab III update» и иммуноблоте «RecomBlot HCV IgG 2.0»……………………. 110 5.3. Противоречия между результатами исследования проб сыворотки крови в иммуноблотах разных производителей и некоторые ограничения использования иммуноблотов…………………………………………………… 114 5.4. Критерии отбора проб для дополнительного подтверждения наличия в них анти-ВГС при массовых исследованиях………………………………….. 119 5.5. Количество дополнительных исследований и увеличение стоимости массового скрининга анти-ВГС………………………………………………… ГЛАВА 6. 132 ПРОБЛЕМЫ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ МАССОВОГО СКРИНИНГА КРОВИ НА АНТИТЕЛА К ВГС У ПАЦИЕНТОВ ЛПУ г.МОСКВЫ……………………………………………………………………….. 138 6.1.Контингенты пациентов с противоречивыми результатами исследования антител к ВГС…………………..…………............................................................ 138 6.2. Проблемы диагностики ВГС-инфекции у лиц пожилого возраста………. 140 6.3. Определение РНК ВГС в образцах с неопределенными результатами исследования анти-ВГС. Результаты и интерпретация……………………….. 142 4 6.4. Белки сыворотки крови у пожилых пациентов с позитивными, негативными и неопределенными результатами исследования анти-ВГС. Исследование анти-ВГС в пробах крови пациентов с диспротеинемией………………………………………………………………… ГЛАВА 7. 147 КОНЦЕНТРАЦИЯ α-ФЕТОПРОТЕИНА КАК МАРКЕР БИОХИМИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА ПРИ НЕОПРЕДЕЛЕННОМ РЕЗУЛЬТАТЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИТЕЛ К ВГС………………………………………………………………………………… 164 7.1. Концентрация α-фетопротеина в сыворотке крови молодых мужчин с различными результатами исследования антител к ВГС……………………… 164 7.2. Концентрация сывороточного α-фетопротеина у женщин на ранних стадиях беременности с неопределенными результатами исследования антител к вирусу гепатита С………………………. ……………………………. 169 7.3. Сывороточная концентрация α-фетопротеина С у пожилых пациентов с позитивными, негативными и неопределенными результатами исследования антител к вирусу гепатита С…………………………………............................... 173 ГЛАВА 8. ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИММУНОЧИПОВ ДЛЯ ВЕРИФИКАЦИИ НАЛИЧИЯ АНТИ-ВГС В ОБРАЗЦАХ СЫВОРОТКИ КРОВИ С НИЗКИМ СОДЕРЖАНИЕМ АНТИТЕЛ…………………………… 8.1. Изучение верификационных возможностей иммуночипов 182 при серодиагностике гепатита С в случаях низкой позитивной оптической плотности антител к Core-антигену ВГС в ИФА ……………………………... 182 8.2. Изучение верификационных возможностей иммуночипов при серодиагностике гепатита С в случаях низкой позитивной оптической плотности антител к NS3-антигену ВГС в ИФА………………………………. 8.3.Изучение верификационных возможностей иммуночипов 189 при обнаружении антител к NS4-антигену ВГС в ИФА с низкой позитивной оптической плотностью ……………………………………………. 197 8.4. Результаты исследования в иммуночипах образцов, положительных в ИФА планшетного формата, на наличие анти-NS5 ВГС…………………...... 205 8.5. Сравнение результатов исследования антител к ВГС, полученных различными методами: ИФА, иммуноблот, иммуночип………………………. 206 5 8.6. Результаты исследования РНК в образцах сыворотки крови с антителами к неструктурным антигенам ВГС, обнаруженными в ИФА с низкой оптической плотностью…………………………………………………. 209 8.7. Выявление анти-ВГС с помощью иммуночипов в сыворотке крови пациентов с различным анамнезом (клинические примеры)…… ……………. 212 ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………………………. 223 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………………………. 227 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………………………………… 229 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ……………………………………………………………………… 232 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………………………... 234 ПРИЛОЖЕНИЯ…………………………………………………………………………………... 260 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Инфекция, вызываемая вирусом гепатита С (ВГС), в конце 20 века стремительно превратилась в одну из наиболее острых проблем в мировом здравоохранении. По данным ВОЗ, в мире более 170 миллионов человек (примерно 3%) больны гепатитом С (ГС), и 3−4 миллиона человек заражаются каждый год [Chen S.L. et al., 2006]. Инфицированными ВГС в США являются по крайней мере 5,2 млн. человек [Chak E. et al., 2011], в Российской Федерации − 5 млн. человек [Нетесов С.В., 2008]. Постановлением Правительства Российской Федерации от 2004 г. гепатит С отнесен к социально–значимым заболеваниям, представляющим опасность для окружающих [Об утверждении перечня…, 2004]. В Российской Федерации имеют место выраженные региональные различия активности эпидемического процесса вирусного ГС [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. В г. Москве с начала XXI века показатель заболеваемости ГС в 1,5-2,5 раза выше, чем по России в целом [О совершенствовании медицинской помощи…, 2000; Каира А.Н. и др. 2002]. Длительное течение ВГС-инфекции без клинических проявлений и биохимических изменений приводит к тому, что заболевание диагностируется на стадии тяжелых осложнений. Активное выявление и регистрация скрытых форм ГС при массовом скрининге маркеров инфекции в Российской Федерации привела к тому, что в 2009 г. людей со скрытыми формами заболевания было зарегистрировано в 40 раз больше, чем с острыми формами ГС и в 2 раза больше, чем с хроническими формами. Регистрация бессимптомных форм ГС в России в 2009 г. составляла 87,5%ооо [Онищенко Г.Г, Жебрун А.Б., 2010]. Объективная оценка значения и уровня скрытых форм должна вытекать из всестороннего комплексного обследования лиц, у которых обнаруживаются анти-ВГС. В большинстве случаев острого и бессимптомного гепатита С раннее лечение и постоянное наблюдение способствуют сохранению здоровья прогрессирование пациенту заболевания и уменьшению печени. Другим стоимости важным лечения, основанием предотвращая для выявления инфицированных ВГС пациентов является предотвращение дальнейшей передачи вируса вследствие изменения поведения, ведущего к трансмиссии ВГС, тем более, что за период активной регистрации ГС в России с 1997 по 2008 г. увеличилось количество случаев, при которых источник и пути передачи ВГС не обнаружены: с 36,2% в 1997 г. до 41,4% в 2008 г. [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. Эти цифры соответствуют ситуации в США: в 40-50% случаев острого гепатита С, зарегистрированных в США, не удается выявить парентерального анамнеза и путь инфицирования остается не определенным [Kamal S.M., 2008 ]. 7 Актуальность постоянной оценки динамики эпидемиологического процесса и ранней диагностики ГС обусловила проведение в г. Москве по приказу Управления Роспотребнадзора №122 от 01 октября 2008 г. клинико-лабораторного мониторинга, который включает в себя выявление и диагностику больных всеми формами гепатитов, сбор и анализ информации о результатах серологического обследования лиц, относящихся к группам высокого риска инфицирования вирусами гепатитов B и С [О мерах по совершенствованию эпиднадзора…, 2008]. В настоящее время выявление лиц, инфицированных вирусом гепатита С (ВГС), обеспечивается проведением массового скрининга сыворотки крови на наличие антител к вирусу (анти-ВГС) в тест-системах на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В России по приказу МЗ РФ действует двухэтапная схема определения анти-ВГС с обязательным подтверждением результатов, положительных в первичном скрининге, в конфирматорных диагностических системах с раздельным выявлением антител к структурному нуклеокапсидному антигену (анти-Core) и комплексу неструктурных антигенов (анти-NS) ВГС [О применении в практике здравоохранения …, 2002]. Положительным считается результат измерения оптической плотности (ОП) пробы, превышающий критическую ОП, статистически вычисляемую производителем тест-систем. Среди анти-ВГС-положительных проб более 10% составляют пробы с низкой позитивной ОП, ненамного превышающей критическую ОП. Интерпретация результатов определения анти-ВГС с низкой позитивной оптической плотностью в ИФА до настоящего времени является одной из наиболее значимых и нерешенных проблем во всем мире [Le Page A.K. et al., 2013]. По данным российских и зарубежных исследователей, в эту группу входят как образцы, действительно содержащие антиВГС, так и пробы с ложноположительной реакцией. Заключение о наличии или отсутствии анти-ВГС в данных пробах сделать во многих случаях сложно из-за противоречий результатов в различных диагностических системах. Информирование пациента об инфицированности вирусом гепатита С вызывает психо-эмоциональную травму и сопряжено с негативными социальными последствиями, вследствие чего требуется осторожность в интерпретации низкопозитивных результатов выявления анти-ВГС в ИФА. Наличие проблемы ложных результатов исследования анти-ВГС требует дальнейшего совершенствования лабораторной диагностики гепатита С и разработки новых методов и алгоритмов исследования. Так, согласно Руководству по проведению исследования на антиВГС в США, после первичного скрининга в тест-системах с общим определением анти-ВГС, пробы с низкой позитивностью дополнительно исследуются в иммуноблотах, обладающих высокой специфичностью. Недостатком иммуноблотов, отмеченным в многочисленных исследованиях, является более низкая, по сравнению с твердофазным ИФА, чувствительность 8 [Zer Y. et al., 2009]. Кроме того, верификация результатов исследования в иммуноблоте являются чрезвычайно дорогостоящей и малоприемлемой при проведении массового скрининга. В ряде европейских стран решающим критерием проведения скрининга является его экономическая эффективность. Скрининг на анти-ВГС был признан эффективным только в группах с высокой распространенностью инфицирования ВГС, например, среди наркоманов. Как показано в ряде исследований, степень подтверждаемости анти-ВГС-позитивных результатов с низкой оптической плотностью в ИФА в дополнительных тестах (например, в иммуноблоте) прямо зависит от показателя распространенности инфекции в группе [Alter M.J. et al., 2003], что несколько облегчает интерпретацию результата при высокой распространенности ВГС-инфекции. При выявлении в ИБ положительной реактивности сыворотки крови пациента только к одному антигену ВГС (либо с низкой интенсивностью к нескольким) результат интерпретируется как неопределенный. В большинстве случаев неопределенного результата отсутствуют сведения о моменте заражения вирусом и не обнаруживаются клинические проявления болезни, биохимические показатели находятся в пределах нормы, результаты тестирования РНК и самих антигенов ВГС являются отрицательными, что затрудняет ответ на вопрос, обусловлена неспецифической ли реакцией реактивность сыворотки наличием крови. истинных Причины антител к неопределенного ВГС либо результата исследования наиболее активно изучаются в гемотрансфузиологии, что обусловлено необходимостью максимально возможного использования донорского материала. Сравнительно успешному проведению таких исследований способствует подробное обследование состояния здоровья доноров – относительно однородной группы населения, возможность проведения масштабных проспективных исследований в данной группе, находящейся на длительном учете, и использование дополнительных, кроме выявления анти-ВГС, методов исследования [Piro L. et al., 2008]. Во многом аналогичным является подход при изучении динамики появления (и исчезновения в отсутствии вируса) маркеров ВГС-инфекции при наблюдении за детьми, рожденными матерями с ГС, людьми с известным моментом заболевания и пациентами в процессе лечения [Николаева Л.И., 2006; 2006а]. Тщательный контроль отбора участников и процесса лечения, длительное наблюдение являются «идеальными» условиями, которые позволяют глубже понять биологические механизмы, однако результаты таких исследований не всегда применимы в клинической, в том числе лабораторной практике, не поддающейся такому строгому контролю [Ланг Т., 2005]. Особенностью массового скрининга является охват разных групп населения, в том числе с невысоким риском инфицирования и прогнозируемой низкой величиной подтверждения 9 наличия анти-ВГС в пробах с низкой ОП в первичном скрининге, и практически полном отсутствии сведений о пациентах. Использование в качестве подтверждающих наличие антиВГС диагностических систем с альтернативными вариантами ответов (позитивным и негативным) не приводит к удовлетворительному решению проблемы интерпретации низких позитивных результатов скрининга на анти-ВГС, поскольку в разных тест-системах результаты могут быть противоречивыми. В России разработаны и применяются в практике специализированных клиник тест-системы на основе твердофазного ИФА с раздельным выявлением антител к четырем белкам ВГС: Core, NS3, NS4, NS5 [Николаева Л.И. и др., 2004], и проходят сертификацию диагностические системы нового поколения − иммуночипы. Результат исследования в данных тест-системах, так же, как в иммуноблоте, может быть интерпретирован как позитивный, негативный и неопределенный, что, по-видимому, делает актуальным изучение возможности включения этих диагностических систем в скрининг для адекватной интерпретации результата. В целом, проблема неопределенных результатов при массовом скрининге широких групп населения на наличие анти-ВГС изучена недостаточно, является актуальной и требует проведения углубленного исследования. По-видимому, определенную помощь в решении этой проблемы может оказать исследование дополнительных специфических маркеров инфекции (РНК ВГС) и неспецифических маркеров повреждения печени, в частности, концентрации α-фетопротеина (АФП). Вышеизложенное подтверждает необходимость дальнейшего совершенствования лабораторной диагностики гепатита С на этапе первичного скрининга с разработкой новых методов и алгоритмов исследования. Цель исследования Установление диагностической значимости неопределенных результатов исследования маркеров вирусного гепатита С для повышения качества клинико-лабораторной диагностики инфекции на этапе первичного скрининга антител к вирусу гепатита С. Задачи исследования 1) Определить частоту и динамику распространения антител к вирусу гепатита С (2000-2011 годы) среди пациентов лечебно-профилактических учреждений г.Москвы с разным риском гемоконтактного инфицирования. 2) Оптимизировать внутрилабораторный контроль качества исследований на наличие антител к ВГС, для чего провести сравнительный анализ показателей воспроизводимости и сходимости результатов при использовании контрольных материалов промышленного производства и 10 материалов, изготовленных в лаборатории, при выполнении ИФА-исследований в ручном, полуавтоматическом и автоматическом режимах. 3) Установить критерии отбора проб сыворотки крови c разноречивыми и низкими положительными результатами при скрининге на антитела к ВГС, для проведения дополнительного верифицирующего исследования. 4) Разработать алгоритм исследования анти-ВГС, который обеспечит достижение максимально достоверного результата и исключит получение ложных результатов. 5) Установить группы пациентов с высокой частотой неспецифических ложноположительных результатов при тестировании антител к ВГС в ИФА. 6) Определить значимость сывороточных компонентов: ревматоидного фактора (РФ), циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), фракций белков крови, иммуноглобулинов классов A, M, G, парапротеинов, С-реактивного белка (СРБ), − для проявления неспецифических реакций при тестировании антител к ВГС в ИФА. 7) Изучить взаимосвязь между уровнем продукции антител к ВГС и концентрацией αфетопротеина как биохимического маркера, ассоциированного с поражением печени. 8) Определить диагностическую значимость ПЦР для подтверждения инфицированности ВГС лиц с неопределенными результатами исследования анти-ВГС. 9) Выяснить референсные возможности иммуночипов при исследовании проб с противоречивыми и неопределенными результатами определения анти-ВГС в ИФА планшетного формата и иммуноблотах. Научная новизна Впервые разработан экономически доступный алгоритм исследования антител к ВГС, эффективный при массовых объемах исследований, с хорошо воспроизводимыми и информативными для врачей и пациентов результатами, основанный на использовании тестсистем российского производства. Показано, что пробы с разноречивыми результатами тестирования анти-ВГС, не подтвердившимися как позитивные в расширенных исследованиях, принадлежат лицам с возрастной физиологической и транзиторной иммунной недостаточностью (соответственно пожилым людям и детям первого года жизни). Впервые установлено, что РНК ВГС выявляется в пробах с неопределенными результатами исследования, обусловленными наличием только анти-NS3, что сочетается с позитивностью по анти-ВГС в хемилюминесцентном иммунном анализе на микрочастицах 11 (ХИАМ). При неопределенном результате исследования вследствие обнаружения в ИФА только анти-NS4 РНК ВГС не обнаруживается. Впервые показано, что пробы сыворотки крови пожилых лиц с отрицательными и с ложнопозитивными результатами тестирования анти-ВГС не различаются по количеству Igсодержащих патологических белков (по ревматоидному фактору − РФ и циркулирующим иммунным комплексам − ЦИК), а также по частоте выявления повышенного уровня Среактивного белка (СРБ). В сыворотке крови пожилых людей с анти-ВГС повышено содержание ЦИК по сравнению с пробами с ложнопозитивными результатами тестирования и с пробами без анти-ВГС. Образцы сыворотки крови пожилых лиц с ложнопозитивными результатами исследования отличаются от проб, содержащих анти-ВГС, повышенным уровнем α1-глобулинов. Высокая концентрация РФ, ЦИК, γ-глобулинов, наличие парапротеинов не влияет на качество тестирования анти-ВГС в современных диагностических системах на основе твердофазного ИФА. Установлено, что диагностическая значимость определения сывороточного α- фетопротеина (АФП) при неопределенном результате тестирования анти-ВГС зависит от возрастной категории пациентов. В группах молодых мужчин и женщин в первом триместре беременности с неопределенными результатами исследования анти-ВГС сывороточная концентрация АФП повышена в 2 раза по сравнению с пациентами, в крови которых не обнаруживались анти-ВГС. Повышение концентрации АФП было статистически значимым в пробах с антителами, направленными к Core- либо к NS3-, но не к NS4-антигену. У пожилых лиц с отрицательными результатами тестирования анти-ВГС установлен широкий диапазон сывороточной концентрации АФП, при этом не выявлено отличий этой группы по содержанию АФП от групп с положительными и неопределенными результатами определения анти-ВГС. Впервые доказано, что метод иммуночипов позволяет верифицировать наличие антител – маркеров ВГС-инфекции (в том числе характерных для активной стадии патологического процесса) более чем в 80% проб с неопределенными результатами исследования в ИФА планшетного формата, поскольку в них выявляются антитела не к одному, а к нескольким белкам ВГС. Практическая значимость работы Разработанный алгоритм повышает диагностическую ценность результатов массового скрининга населения на наличие антител к вирусу гепатита С. В предложенном алгоритме разработаны исследований. критерии отбора проб, ограничивающие количество дополнительных 12 Включение иммуноферментных тест-систем с расширенным спектром определения антител к вирусу гепатита С российского производства в дополнительные исследования способствует повышению точности результата, что особенно важно при исследовании так называемых проблемных проб. Результаты, полученные при использовании разработанного алгоритма, соответствуют значениям: позитивным, негативным и неопределенным. Созданный алгоритм обеспечивает оптимальные точность и объем информации для пациентов и лечащих врачей, поскольку содержит информацию о направленности обнаруженных антител к определенному антигену и величине коэффициента позитивности, что позволит оценить динамику изменения этих показателей. Использование для дополнительных исследований при массовом скрининге иммуноферментных тест-систем планшетного формата с расширенным спектром определения антител российского производства значительно удешевляет верифицирующее тестирование по сравнению с иммуноблотом. Выделение групп с противоречивыми результатами в ИФА: лиц с возрастным иммунным дисбалансом (пожилых людей и новорожденных) и беременных женщин, − способствует дополнительному проведению верифицирующих исследований в этих группах для предотвращения сообщения ложноположительного результата. Показана эффективность использования ПЦР (с чувствительностью 50 МЕ\мл) для выявления РНК ВГС при обнаружении в ИФА только анти-NS3, но не анти-NS4. Отсутствие неспецифических реакций в тест-системах для ИФА планшетного формата у больных моноклональными гамма-глобулинопатиями, пациентов с высокими концентрациями ревматоидного фактора, циркулирующих иммунных комплексов, С-реактивного белка свидетельствует о специфичности реакции в ИФА и подтверждает необходимость расширенного обследования на наличие инфекции данных пациентов с неопределенными результатами исследования анти-ВГС. Определение биохимическим сывороточной верифицирующим концентрации маркером АФП может быть повреждения/репарации дополнительным печени при неопределенном результате исследования анти-ВГС у лиц моложе 60 лет. Применение иммуночипов способно существенно улучшить лабораторную диагностику гепатита С. Высокая эффективность иммуночипов для верификации наличия антител к ВГС в образцах с неопределенным результатом исследования обусловлена высокой чувствительностью иммуночипов; расширением спектра выявляемых антител к ВГС по сравнению с иммуноблотом и ИФА; возможностью раздельного выявления в одной постановке IgG и IgM (показателей активности инфекционного процесса). Для полного комплексного обследования требуется небольшое количество материала (не более 30 мкл на весь анализ). 13 Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования используются в практике работы клинико-иммунологической лаборатории по диагностике ВИЧ-инфекции МНПЦДК ДЗ г.Москвы, лаборатории вирусных гепатитов ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН и лаборатории инфекционной иммунологии лабораторного отделения ФКУ «Медицинского научно-клинического цкнтра имени П.В. Мандрыка» МО РФ для повышения качества лабораторной диагностики вирусного гепатита С. Полученные новые сведения используются в процессе обучения дополнительного образовательного на кафедре клинической профессионального учреждения высшего лабораторной образования диагностики Государственного профессионального образования Факультета бюджетного «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России». Основные положения, выносимые на защиту 1. Разработан алгоритм расширенного исследования проб сыворотки крови с противоречивыми результатами исследований на наличие антител к ВГС. Алгоритм основан на использовании диагностикумов российского производства и обеспечивает необходимую достоверность и информативность результатов. 2. Алгоритм исследования анти-ВГС содержит критерии отбора проб для дополнительного исследования с целью подтверждения наличия маркеров гепатита С, что ограничивает количество необходимых тестов и позволяет исключить ложнопозитивные результаты. 3. При массовом скрининге на антитела к ВГС сомнительные результаты исследования в ИФА часто регистрируются у пациентов с физиологическим иммунным дисбалансом: пожилых пациентов и детей первого года жизни. 4. Повышенное содержание фракции белков крови − α1- глобулинов – ассоциировано с ложнопозитивными реакциями у пожилых пациентов. Ревматоидный фактор, высокие концентрации γ-глобулинов у больных моноклональными γ-глобулинопатиями, циркулирующие иммунные комплексы, С-реактивный белок не влияют на результаты исследования анти-ВГС в современных диагностических наборах для твердофазного ИФА в планшетном формате. 14 5. В группе пациентов моложе 60 лет с неопределенными результатами исследования антител к ВГС существует биохимический маркер заболевания печени − повышенная по сравнению с нормой сывороточная концентрация альфа-фетопротеина. У пожилых пациентов без антител к ВГС наблюдаются значительные отклонения концентрации АФП от нормы, что не позволяет использовать данный маркер в комплексной диагностике гепатита С в этой возрастной группе. 6. Использование ПЦР в качестве метода подтверждения наличия ВГС-инфекции путем выявления РНК ВГС у лиц с неопределенными результатами исследования антител к ВГС эффективно при обнаружении в ИФА только анти-NS3; при обнаружении только анти-NS4 использование ПЦР при чувствительности метода 50 МЕ\мл нецелесообразно. 7. Эффективным способом проведения референсного исследования при разноречивых и неопределенных результатах тестирования антител к ВГС в ИФА и иммуноблотах являются иммуночипы. Апробация работы Апробация работы состоялась на научно-практической конференции ГБУЗ г.Москвы МНПЦДК ДЗ г.Москвы 10. 02. 2015. Материалы диссертации доложены на заседании Ученого совета МНПЦДК ДЗ г.Москвы, на конференции молодых ученых МНПЦДК ДЗ г.Москвы, на научных конференциях и съездах в России и за рубежом, в числе которых: 5th Annual Meeting FOCIS (Federation of clinical immunology societies), 2005, Бостон, США; 1st Joint Meeting of European National Societies of Immunology and 16th European Congress of Immunology, сентябрь 2006, Париж, Франция; VIII Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», июнь 2007, Москва, Россия; Международная научная конференция Российской академии естествознания "Наука и образование в современной России" в разделе "Инновационные медицинские технологии", ноябрь 2010, Москва, Россия; IV междисциплинарная научно-практическая конференция «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинanико-лабораторная диагностика и терапия», март 2011 г., Москва, Россия; Национальные дни лабораторной медицины России-2011, октябрь 2011, Москва, Россия; Конференция в Центральном военном клиническом госпитале им. Мандрыка П.В., 13 июля 2012 г., Москва, Россия; 15 II Московский Форум «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики». 17-19 октября 2012, Москва, Россия. Личный вклад автора Автор самостоятельно осуществил выбор направления исследования, определил цели и задачи, выбор необходимых методов исследования. Автор непосредственно участвовал как в проведении рутинных скрининговых и конфирматорных исследований на наличие антител к ВГС, так и самостоятельно проводил отбор проб для дополнительной специфической иммунодиагностики и исследования факторов, влияющих на результаты иммуноферментного анализа и ассоциированных с заболеваниями печени. В совместных исследованиях (описаны ниже в разделе «Материалы и методы исследования») вклад автора также являлся определяющим и заключался в непосредственном участии на всех этапах, от пробоподготовки до получения и анализа результатов. Таким образом, автор играл ведущую роль на всех этапах исследования, от постановки задач и проведения исследований до обсуждения и обобщения результатов и формулировки выводов, а также в подготовке научных публикаций и докладов. Публикации По материалам диссертации опубликовано 42 печатных работ в российских и зарубежных журналах, из них 13 − в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и выпущено руководство для практических врачей. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 277 страницах и включает 8 глав. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований с их обсуждением, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложения. Диссертация иллюстрирована 23 рисунками и 40 таблицами. Список литературы включает 295 источников, в том числе 117 работ отечественных авторов. 16 ГЛАВА 1. ПРОБЛЕМЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Особенности эпидемиологического процесса вирусного гепатита С. Хронизация, наличие скрытых форм и осложнений Проблема вирусного гепатита С как в нашей стране, так и за рубежом остается одной из самых актуальных. По данным ВОЗ, в мире более 170 миллионов человек (примерно 3%) больны гепатитом С, и 3−4 миллиона человек заражаются каждый год [Chen S.L. et al., 2006]. Наименьшая распространенность ГС, от 0.01% до 0.1%, регистрируется в Великобритании и Скандинавских странах, наибольшая распространенность − от 15% до 20%, − в Египте [Alter M.J., 2007]. Инфицированными ВГС в США являются по крайней мере 5,2 млн. человек [Chak E. et al., 2011], в Российской Федерации − 5 млн. человек [Нетесов С.В., 2008]. Распространенность ВГС-инфекции отражает частота, с которой встречаются в популяции антитела к ВГС (анти-ВГС). В США, в частности, распространенность анти-ВГС среди населения в целом составляет 1,6% [Armstrong G.L. et al., 2006]. В России в 2010 г. анти-ВГС определялись у 1% крови доноров [Селиванова Е.А. и др., 20\11]. В Российской Федерации регистрируется неравномерная частота выявления анти-ВГС. В Центральном, Северо-западном регионе и Волго-Вятском районе она составляет 0,7 − 1,2%, в Восточно-Сибирском и Дальневосточном регионе страны − 1,6−5,6%. Об уровне распространенности инфекции среди основного населения территории можно судить по показателю пораженности среди беременных женщин. Так, этот показатель является одним из основных при определении стадии эпидемии ВИЧ-инфекции в изучаемом регионе. Если показатель распространенности ВИЧ-инфекции среди беременных устойчиво превышает 1%, делают вывод о генерализованной стадии эпидемии в регионе [Анализ эпидемиологической ситуации …, 2007 г.]. В отличие от ВИЧ-инфекции, критерии эпидемии ВГС-инфекции в настоящее время не разработаны. В то же время распространенность анти-ВГС − маркеров данной инфекции − в период гестации у женщин в различных странах достаточно велика. В странах Евросоюза анти-ВГС обнаруживаются у 0,1-2,4% [Roberts E., Yeung L., 2002]. В Российской Федерации в 2008 г. анти-ВГС были выявлены у 1,4% беременных женщин, что в 5 раз превышало частоту выявления анти-ВГС в данном контингенте в 1997 г. (0,3%). 17 Преодоление порога распространения анти-ВГС в 1% среди беременных женщин было зафиксировано к 2008 г. в 41 из 57 субъектов Российской Федерации [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. Согласно классификации ВОЗ и Постановлению Правительства Российской Федерации от 1 декабря 2004 г. №715 «Об утверждении перечня социально-значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих» гепатит С по МБК-10 (Международная статистическая классификация болезней и проблем, связанных со здоровьем, 10 пересмотр) вирусный гепатит С относится к социально-значимым заболеваниям. В 2007 г. была принята Федеральная Программа "Предупреждение и борьба с социально- значимыми заболеваниями (2007 − 2012 годы)», составной частью которой была подпрограмма «Вирусные гепатиты». Конечным результатом реализации Программы и показателем ее социальноэкономической эффективности ожидалось снижение заболеваемости острым вирусным гепатитом C с 4,5 (в 2007 г.) до 3,7 случая на 100 тыс. населения [Предупреждение и борьба …, 2007]. Успехи в профилактике первичного заражения ВГС проявились в благоприятной динамике регистрации острого гепатита С (ОГС): заболеваемость была снижена до 2,2%ооо в 2009 г. Однако в первое десятилетие XXI века в уровне регистрации, в динамике и в соотношении трех диагностируемых и регистрируемых форм ГС: острой, хронической и бессимптомной, − произошли принципиальные изменения. После начального быстрого прироста показателя заболеваемости ХГС в 1999-2001 гг. (с 12,9 до 29,5%ооо) динамика регистрации приобрела плавно увеличивающийся характер. С 2002 по 2010 гг. заболеваемость ХГС увеличилась с 30,7 до 40,2 %ооо [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010; О взаимодействии территориальных органов…, 2011]. В настоящее время, кроме острого и хронического ГС или бессимптомную, ранее называвшуюся «носительством вируса». Бессимптомное течение острого гепатита С наблюдается у 70-80% заболевших, как было установлено в трансфузиологии при анализе документально подтвержденных случаев заражения ВГС [McCaughan G.W. et al., 1992]. Сведения о показателях, характеризующих активное выявление и регистрацию скрытых форм ГС в России, представленные Онищенко Г.Г. и Жебруном А.Б., свидетельствуют о том, что «их уровень в 40 раз превысил таковой для острых форм ГС и в 2 раза − для хронических форм. Регистрация бессимптомных форм ГС в России в 2009 г. составляла 87,5%ооо. Объективная оценка значения и уровня скрытых форм должна вытекать из всестороннего комплексного обследования лиц, у которых обнаруживаются анти-ВГС. Они свидетельствуют об активном и преимущественного хроническом течении инфекции у этих лиц» [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. Кроме увеличения регистрации скрытых форм, в этиологической структуре хронических вирусных гепатитов за период с 1999 по 2009 год уменьшилась с 7,2% до 2,1% доля 18 хронического вирусного гепатита неясной этиологии (ХВГНЭ) [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. Анализ путей передачи вируса гепатита С в Российской Федерации выявляет постоянное изменение их структуры. Так, в начальный период изучения ВГС-инфекции, до внедрения в службу переливания крови в 1994 г. тестов для определения анти-ВГС, большую часть (50% и более) занимали случаи заражения при переливании крови, контаминированной вирусом, а уже в 1998-1999 годах число этих случаев резко уменьшилось и составляло не более 0,7% заражения ВГС [Шахгильдян И.В. и др., 2003]. В то же время по распространению анти-ВГС в 1997 − 2008 гг. в Российской Федерации среди пациентов центров гемодиализа отмечена неблагоприятная динамика: в эти годы содержание анти-ВГС в крови пациентов составляло соответственно 1,6% и 2,5%. Среди медперсонала соответствующих отделений в пяти из семи Федеральных округах (ФО, в том числе в Центральном ФО, ЦФО) страны распространение анти-ВГС также увеличилось [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. Количество случаев заражения, связанных с приемом наркотических препаратов, резко возросло с 1993 по 1998 г. Если в 1993 г. анти-ВГС обнаруживались у 19,6% лиц, внутривенно вводящих наркотики, то в 1998 – 1999 г. − у 72,1-89,7%, что, кроме роста наркоманий, было обусловлено практически полным отсутствием стерилизационной обработки щприцев [Шахгильдян И.В. и др., 2003]. Динамика заражения при внутривенном введении наркотиков за следующие 10 лет (по 2008 г.) коррелировала с общим спадом заражения или, вернее, в значительной степени определяла его: в 1997 г. лица, заразившиеся при введении психотропных препаратов, составляли в РФ 40% (в ЦФО 43,3%), а в 2008 − 24,3% (в ЦФО − 24,8%) [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. В настоящее время считают, что значимость естественных путей передачи ВГС (при контактах с кровью и, возможно, с другими биологическими жидкостям больного в быту, в основном в семьях больных ГС; полового и перинатального пути передачи) в распространении инфекции невелика [Terrault N.A. et al., 2013]. Однако при активном вовлечении в эпидемиологический процесс ГС населения репродуктивного возраста особое значение приобретает его диагностика у беременных женщин. В 2008 г. частота выявления анти-ВГС в семи Федеральных округах Российской Федерации составляла от 1 до 2,1% [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. В отдельных районах этот показатель был гораздо выше: в Самарской области анти-ВГС выявлялись у 6,7%, в Пермском крае − у 2,6%, в Удмуртской республике − 2,5%, в Чебоксарах − у 3%, а в Челябинске − у 16,2% беременных [Рябикова Т.Ф и др., 2007; Даниленко Е.Д. и др., 2007]. Известно, что минимальный риск передачи самого вируса (а не антител к нему) детям от инфицированных ВГС матерей составляет в среднем 5% [Баранов А.А. и др., 2003]. Результаты обследования т. н. «отказных» детей в Сибири свидетельствуют о 19 том, что риск вертикальной передачи ВГС в данной группе детей в 2 раза превышал среднестатистический показатель и составлял 9,54% [Сеченова Н.В. и др., 2007]. В связи с распространением вируса гепатита С среди лиц репродуктивного возраста, в том числе среди беременных женщин, вопросы перинатального контакта плода с больными вирусным ГС женщинами приобретают все большую актуальность, и в последние годы, по мнению Рейзис А. Р. и соавт., хронический гепатит С все более становится проблемой педиатрической. При отсутствии заражения вирусом анти-ВГС материнского происхождения исчезают из кровотока детей в возрасте от 3-5 месяцев до 18 месяцев [Рейзис А.Р. и др., 2007; Ершова О.Н., 2009]. К группам риска инфицирования ВГС традиционно относят пациентов венерологических клиник; в США антитела к ВГС в этом контингенте выявляются с частотой 3,4%, примерно в 2 раза чаще, чем среди населения США в целом, что служит основанием для организации службы профилактики ВГ при клиниках ИППП [Gunn R.A. et al., 2001]. В Италии распространенность анти-ВГС среди пациентов дерматологических клиник составляет всего 2,36% [Bongiorno M.R. et al., 2002]. Результаты проведенного в Москве исследования свидетельствовали о высоком уровне инфицирования ВГС больных сифилисом (13,8% по сравнению с инфицированностью первичных доноров в 1,27%, р<0,05), что позволило отнести пациентов с ИППП к группе высокого риска в отношении ВГС [Потятынник О.Н., 2005 г.] В последние годы вирус гепатита С (ВГС) рассматривается как наиболее частая причина острых вирусных гепатитов у пожилых людей [Подымова С.Д., Азов А.Г., 2001], и адекватную лабораторную диагностику данной инфекции можно отнести к первоочередным задачам, от решения которых зависит улучшение медицинского обслуживания людей пожилого возраста. Изучение клинико-эпидемиологических особенностей гепатита С в старшей возрастной групп населения в настоящее время является одним из приоритетных направлений исследований в мире [Гепатит С: консенсус 2002, 2002]. Сравнение данных о распространении антител к ВГС среди пожилых и более молодых людей в разных странах привело к неоднозначным выводам. Так, в ряде стран распространенность антител к ВГС среди пожилых людей является такой же, как среди остального населения, например, в Канаде она составляет 1,4% [Sinor A.E. et al., 1992]. Увеличение встречаемости анти-ВГС антител с возрастом обнаружено среди доноров крови в Италии: от 0,6% в возрастной группе 18-28 лет до 2,5% у людей старше 60 лет [Sirchia G. et al., 1990]. Среди населения г.Токио самая высокая распространенность анти-ВГС антител наблюдалась в группе людей старше 60 лет (3,1%) по сравнению с показателем в общей группе 1,3% [Watanabe J. et al., 1990]. В США в 2002 году анти-ВГС антитела были распространены среди 1,8% всего населения, при этом в группе людей 41-59 лет распространение данного маркера ВГС-инфекции было выше, чем среди людей старше 60 лет [Гепатит С: консенсус 2002, 2002]. Главным фактором риска заражения гепатитом С у пожилых людей являются ранее 20 (до 1992 г.) проведенные гемотрансфузии [Подымова С.Д., Азов Ф.Г., 2001]. Дополнительными факторами риска для возрастного контингента являются потребление в прошлом наркотических препаратов, татуировки, принадлежность к военному медицинскому персоналу, пребывание в заключении, более чем 15 половых партнеров за жизнь [Briggs M.E. et al., 2001]. За период активной регистрации ГС в России с 1997 по 2008 г. увеличилось количество случаев, при которых источник и пути передачи ВГС не обнаружены: с 36,2% в 1997 г. до 41,4% в 2008 г. [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. Эти цифры соответствуют ситуации в США: в 40-50% случаев острого гепатита С, зарегистрированных в США, не удается выявить парентерального анамнеза и путь инфицирования остается не определенным [Kamal S.M., 2008]. Кроме общих закономерностей, в Российской Федерации имеют место выраженные региональные различия активности эпидемического процесса вирусного ГС [Шахгильдян И.В. и др., 2003; Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. Центральный федеральный округ стабильно относится к наиболее благополучным в РФ как по количеству регистрируемых острых, так и хронических форм ГС. Однако в 2000-2002 гг. Москва и Московская область относились к неблагополучным регионам ЦФО, в частности, в г. Москве показатель заболеваемости ВГС был в 1,5-2,5 раза выше, чем по России в целом [О совершенствовании медицинской помощи …, 2000; Каира А.Н., Фролова Г.С, 2002]. Изучение региональных особенностей эпидемического процесса вирусного гепатита С предполагает, в частности, определение широты распространения маркеров парентеральных гепатитов, а также оценку различных групп населения как источников вирусов. В соответствии с Приказом Роспотребнадзора в г. Москве проводится клинико-лабораторный мониторинг, который включает выявление и диагностику больных всеми формами гепатитов, сбор и анализ информации о результатах серологического обследования лиц, относящихся к группам высокого риска инфицирования вирусами гепатитов B и C, в соответствии с перечнем контингентов, подлежащих обязательному обследованию на маркеры этих инфекций [О мерах по совершенствованию эпиднадзора …, 2008]. Вирусный гепатит С является основной причиной заболеваний печени в мире. При частом асимптоматическом течении заболевания примерно 10-30% заразившихся благополучно избавляются от инфекции [Afdhal N.H., 2004; Poynard T. et al., 2003], но у 70% лиц инфекция переходит в хроническую форму с риском развития таких осложнений, как фиброз, цирроз, стеатоз, инсулиновая резистентность, гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК). В конечном счете, при вызванном ВГС заболевании печени может потребоваться пересадка печени, но, как правило, аллотрансплантат инфицируется ВГС, а патологические изменения в трансплантате прогрессируют значительно более высокими темпами, чем в собственной печени [Uprichard. S.L., 2010]. Установлено, что ГС является причиной 27% случаев цирроза печени и 25 % ГЦК 21 в мире [Perz J.F. et al., 2005]. Риск заболеть циррозом печени спустя 20 лет после инфицирования среди больных ХГС в различных исследованиях оценивается по-разному, но в среднем составляет 10%-15% для мужчин и 1-5% для женщин, что во многом обусловлено таким дополнительным фактором риска развития цирроза, как наличие алкоголизма [Chen S.L. et al., 2006; Management of hepatitis C 2002, 2002a; Management of hepatitis C 2002, 2002b]. У 1−4% лиц с диагнозом цирроза печени ежегодно развивается ГЦК [Degos F. et al., 2000; Chen S.L. et al., 2006]. Прогрессирование цирроза печени часто не имеет клинических признаков, и некоторые пациенты не знают, что они больны ГС, пока не возникают осложнения в виде заболеваний печени терминальной стадии или ГЦК. В США смертельные случаи, связанные с хроническим ГС, чаще вызываются декомпенсированным циррозом печени (вследствие развития асцита, верхнего желудочно-кишечного кровотечения, гепаторенального синдрома и печеночной энцефалопатии), а не ГЦК [Fattovich G. et al., 1997; Serfaty L. et al., 1998; Hu K.Q. et al., 1999]. В целом, ежегодно приблизительно 280 000 смертельных случаев в мире связаны с ВГС-инфекцией [Yu M.L., Chuang W.L., 2009]. Таким образом, изучение региональных особенностей эпидпроцесса ГС, в частности, в г.Москве, не теряет своей актуальности. Такие особенности ГС, как широкое распространение и преимущественная хронизация, наличие бессимптомных форм и развитие тяжелых осложнений делает необходимым применение высокочувствительных методов выявления серологических маркеров инфицирования ВГС для выявления лиц со скрыто протекающим инфекционным процессом. 22 1.2. Строение вириона. Классификация и распространение генотипов ВГС. Геном, белки и жизненный цикл вируса гепатита С Вирус гепатита С (ВГС; семейство Flaviviridae, род Hepacivirus) является мелким вирусом (средний диаметр 50 нм), структурными элементами которого являются оболочка, сформированная белками вируса Е1 и Е2 и фосфолипидным бислоем (молекулы которого включены в состав оболочки из организма хозяина − человека) и нуклеокапсид, образованный Core-белком вируса, внутри которого упакована РНК вируса (рис. 1.1). Рис. 1.1. Строение вируса гепатита С по Moriishi K. and Matsuura Y. (2012). Особенностями генома ВГС являются открытая рамка считывания и наличие вариабельных и гипервариабельных регионов (ГВР). Наличие вариабельных и гипервариабельных областей вызвано отсутствием у РНК-зависимой РНК-полимеразы ВГС корректирующей 3’-5’- экзонуклеарной последовательности, что приводит к постоянному образованию при репликации ВГС генетически разнородных, отличающихся на несколько процентов, вариантов вируса (так называемых квазивидов). Изучение гетерогенности нуклеотидных последовательностей регионов Core, E1 и NS5 различных изолятов HCV легло в основу генотипической классификации ВГС, согласно которой выделяют 6 генотипов (обозначаемых цифрами), степень гомологии последовательностей между которыми не превышает 65%-70%. В пределах каждого генотипа последовательности далее классифицированы в подтипы (субгенотипы) с 78%-ой идентичностью последовательностей генома (обозначаются латинскими буквами). В России и странах СНГ зарегистрировано преобладание генотипа 1b (не менее 68,9%) [Шахгильдян И.В. и др., 2003; Fishman S.L. and Branch A.D., 2009]. Геном вируса представлен однонитевой положительно заряженной молекулой РНК (9400-9600 нуклеотидных остатков), ограниченной нетранслируемыми областями 5’-НТО и 3’- 23 НТО (рис.1.2). Синтезированный в процессе трансляции единый полипептид впоследствии последовательно обрабатывается комбинацией клеточных и вирусных протеаз. В результате процессинга образуются структурные белки (Core, E1, E2 и p7) и неструктурные белки (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B). Рис. 1.2. Строение генома РНК HCV по Uprichard S.L. (2010). 24 Отщепление структурных белков от единого полипептида происходит с помощью клеточных сигнальных пептидаз (рис. 1.2), при этом первым образуется Core (нуклеокапсидный или сердцевинный) белок. Структурными функциями протеина Core являются формирование нуклеокапсида, упаковка РНК и сборка оболочки вируса. Неструктурные функции связаны с влиянием на репликацию и сборку вируса, участием в механизме его персистенции, а также выполнением роли транскрипционных регуляторов части генома хозяина, вовлеченной в гепатоканцерогенез [Moriishi K. et al., 2003]. Нуклеокапсидный белок воздействует на метаболизм печеночных клеток, особенно на липидный обмен [Moriishi K. and Matsuura Y., 2012]. Сведения о влиянии белка Core на апоптоз противоречивы [Ray R. B. et al., 1996; Zhu N. et al., 1998]. Многие из биологических эффектов нуклеокапсидного белка, по-видимому, создают условия выживания для вируса в организме хозяина. Особая роль в этом процессе отводится наличию антигенной мимикрии. В частности, была показана гомология первичной последовательности пептида, являющегося частью белка Core ВГС (а.о. 178-187), и цитохрома P450 2D6 [Kammer A.R. et al., 1999]. Следующими от единого синтезированного полипептида ВГС после отщепления предшественника Core белка с помощью клеточных пептидаз отделяются полипротеины, соответствующие белкам оболочки Е1 и Е2. Гликозилирование и пространственная укладка E1 и E2 происходят с помощью клеточных ферментов на мембранах эндоплазматического ретикулума и в вакуолях аппарата Гольджи, в результате чего у данных белков возникают характерные антигенные детерминанты, часть из которых являются высокоиммунногенными. Кроме того, в результате этих процессов образуются сайты связывания с рецепторами клетки, обеспечивающие проникновение вируса в клетку по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза. Потенциальными рецепторами для оболочечных белков являются CD209 (на поверхности дендритных клеток), CD209L (на поверхности эндотелиальных клеток печени и лимфатических сосудов), трансмембранный белок CD81, присутствующий на большинстве клеток организма, и другие. Широкий спектр рецепторов обеспечивает тропизм вирусных частиц к многим тканям организма человека с развитием системного заболевания. Основной особенностью первичной структуры белка Е2 является наличие трех гипервариабельных участков с частой заменой аминокислот, что постоянно создает новые варианты антигенных детерминант и, соответственно, квазивиды вируса, в момент появления и некоторое время после этого не распознаваемые иммунной системой организма [Николаева Л.И., 2009]. Для существования вируса значима не только структурная роль белка Е2, но и его способность ингибировать противовирусное действие α-интерферона (ИФН), которая обусловлена молекулярной мимикрией его консервативного участка (с 660 по 671 аминокислотный остаток) с участком фосфорилирования в рибосомальном факторе инициации трансляции eIF2α [Taylor 25 D.R. et al., 1999]. Еще один вариант молекулярной мимикрии обнаружен между NH2-концевой частью белка Е2 и участками легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов, а также Т-клеточным рецептором, что объясняет отсутствие полноценного иммунного ответа хозяина недостаточностью полноценного иммунного распознавания вируса. Hu Y.W. с соавт. показали, что N-концевой регион Е2 распознается антителами к иммуноглобулину человека, и чем больше степень сходства HVR1 с Ig, тем легче вирус уходит от иммунного ответа с развитием персистирования в организме человека или экспериментально зараженного животного (шимпанзе) [Hu Y.W. et al., 2005]. В отделении неструктурных белков от оставшейся части полипротеина ВГС клеточные пептидазы участия не принимают. На следующем этапе за счет образования комплекса NS2 c NS3 участком полипротеина образуется NS2-NS3 Zn-зависимая цистеиновая металлопротеиназа, которая расщепляет связь между NS2 и NS3; впрочем, необходимость образования комплекса ставится под сомнение, поскольку NS2 обладает всеми компонентами активного центра фермента [Lorenz C. I. et al,. 2006]. Кроме протеазной, у NS2 предполагается наличие функции предотвращения апоптотической гибели инфицированной клетки, которая реализуется, в частности, ингибированием активности специфического для печени проапоптотического белка CIDE-B. Таким образом, NS2 также вносит свой вклад в стратегию вируса по разрушению защиты организма хозяина от инфицирования с последующей опухолевой трансформацией клеток [Erdtmann L. et al., 2003]. Первичная структура следующего за NS2 в полипептиде белка NS3 является наиболее консервативной по сравнению с прочими неструктурными белками, поскольку NS3 выполняет ряд важных функций в жизненном цикле вируса, наиболее значимыми из которых являются функции сериновой протеазы и геликазы/нуклеотидтрифосфатазы. Активности ферментов раздельно локализованы в двух доменах NS3. На NН2-конце белка расположен домен сериновой протеазы протяженностью 181 аминокислотных остатков (а.о.), с 1026 по 1207 а.о., участвующий в нарезании остальных неструктурных белков ВГС [Mondelli M. et al., 1993]. Кофактором этого фермента служит белок NS4A. Кроме совместного участия в процессинге полипротеина ВГС, белки NS3 и NS4A, соответственно как сериновая протеаза и ее кофактор, защищают вирус от антивирусного действия интерферона. Показано, что NS3/4A сериновая протеаза вызывает специфический протеолиз домена Toll-IL1−рецептора, который содержит адапторный белок TICAM-1 (или TRIF), опосредованно индуцирующий синтез ИФН-beta и фактора транскрипции NF-kappaB, под контролем которого находится большинство видов клеточной антивирусной защиты [Li K. et al., 2005]. СООН-концевая часть NS3 является АТФ-геликазой (1207-1612 а.о.), ее основная функция заключается в расплетании "плюс"- и "минус" -цепей РНК в процессе репликации генома ВГС [Neddermann P. et al., 1997]. Основные домены и отдельные последовательности белка NS3, участвующие в осуществлении ферментативных 26 реакций, изучены достаточно детально. Об антигенной структуре белка NS3 известно относительно мало. Главная причина этого состоит в том, что большинство эпитопов белка NS3 имеет конформационно-зависимый характер, что препятствует локализации антигенных детерминант с помощью метода пептидного картирования — основного методологического подхода для изучения В-клеточных эпитопов белков ВГС. Перспектива дальнейшего изучения белка NS3 ВГС связана прежде всего с получением к нему моноклональных антител (МКА) [Абдулмеджидова А.Г. и др., 2002]. Функции следующего за NS3 в полипротеине ВГС белка NS4А как кофактора сериновой протеазы NS3 в разрезании полипротеина ВГС на неструктурные белки и в расщеплении белков противовирусной защиты клетки описаны выше. Белок NS4В является важной частью комплекса репликации ВГС. Высказано предположение, основанное на исследованиях in vitro, что репликация генома ВГС происходит в непосредственной близости от мембраны эндоплазматического ретикулума в связанном с мембраной комплексе репликации [Gosert R. et al., 2003; Paredes A.M. and Blight K.J., 2008], в настоящее время часто называемом мембранной сетью (membranous web, рис. 1.3) Наиболее очевидным преимуществом этого расположения является возможность секвенирования вирусных белков и нуклеиновых кислот в определенном цитоплазматическом компартменте с высокой локальной концентрацией вирусных компонентов. Кроме того, везикулярная структура компартментов предотвращает попадание внутрь клеточных протеаз и нуклеаз, разрушающих вирусные белки и РНК. Основным белком, обеспечивающим структурную организацию мембранных везикул, необходимых для репликативного комплекса (и создающим ее даже в отсутствие остальных белков ВГС) является именно белок NS4B, который образует четыре трансмембранных сегмента с локализацией в цитоплазме N и C концевых остатков [Egger D. et al., 2002]. Для взаимодействия NS4B и NS3 при репликации РНК ВГС необходима их генетическая близость [Paredes A.M. and Blight K.J., 2008]. В последние годы установлены трехдоменная структура и функции NS5A белка, следующего за NS4B в полипротеине ВГС. Основной функцией NS5A белка является регуляция репликации. Домен I формирует димер, связывает транспорт к репликативному центру (рис. 1.3). РНК ВГС и обеспечивает ее Рис. 1.3. Жизненный цикл вируса гепатита С по Uprichard S.L. (2010). 1. Связывание вируса с рецепторами на клеточной поверхности. 2. Вход ВГС в клетку посредством клатрин-опосредованного эндоцитоза. 3. Ацидофикация внутри везикул ведет к процедуре «раздевания», завершающейся выходом вирусного генома в цитоплазму. 4. IRESопосредованная трансляция полипротеина. 5. Процессинг полипротеина. 6. Образование вирусного репликативного комплекса. 7. Репликация вирусной РНК. 8. Упаковка и объединение образовавшихся вирионов. 9. Созревание вирионов и выход через секреторную систему клетки. На рисунке показаны капли липида (LD − lipid droplets), которые, как полагают, являются местом объединения частиц ВГС; в то же время LD тесно связаны с перепончатой сетью − местом репликации вирусной РНК. GAG − гликозаминогликан; LDLR (low density lipoprotein receptor) − рецептор для липопротеинов низкой плотности; SR-B1 (scavenger receptor class B member I) − рецептор для липопротеинов высокой плотности, CLDN1 − клаудин-1 (соединительный межклеточный белок), OCLN − окклудин (интегральный мембранный белок плотного соединения); IRES (internal ribosome entry site) − внутренний сайт связывания рибосомы, LD (lipid droplets) − липидные капли. 28 Кроме активации репликации РНК, NS5A в гиперфосфорилированной форме вызывает ее угнетение [Appel N. et al., 2006]. Домен II содержит участок, определяющий чувствительность к ИФН (interferon sensitivity determining region, ISDR), а мутации в нем вызывают у пациента устойчивый вирусологический ответ на интерферонотерапию [Kobayashi M. et al., 2002]. Домен III содержит вариабельный регион V3, который, повидимому, также влияет на устойчивость вируса к интерферону. Так, среднее число мутаций в регионе V3 и в вышележащем участке NS5A было достоверно выше у изолятов, полученных от пациентов, в дальнейшем достигших устойчивого вирусологического ответа (УВО) на интерферон в сочетании с рибавирином, по сравнению с не ответившими лицами [El-Shamy A. et al., 2008]. Белок NS5B, кодированный частью РНК, локализованной у 3'- НКО, обладает активностью РНК-зависимой РНК-полимеразы, для работы которой необходим репликативный комплекс. D. Quinkert с соавт. (2005 г.) представили экспериментальные доказательства того, что каждый репликативный комплекс состоит из многочисленных молекул неструктурных протеинов ВГС, большинство их которых необходимы для постройки везикулярной структуры, и только небольшая часть неструктурных белков требуется для проявления полимеразной активности. Авторы работы подсчитали, что на 1000 плюс-молекул РНК ВГС образуется 1000000 молекул NS белков. Из всех образующихся молекул NS5B менее 0,1% должны быть ферментативно активными. Показано, что одним из механизмов ограничения активности полимеразы может быть стехиометрическая самоинактивация [Quinkert D. et al., 2005]. Методом иммунопреципитации была обнаружена перекрестная реактивность антител к антигенным детерминантам белков NS3 и NS5А ВГС и антител к антигенной детерминанте в районе последовательности а.о. 254-288 региону молекулы цитохрома цитохрома P4502D6. Показано, что к данному образуются аутоантитела LKM1 (печень/почки микросомальные антитела I типа), которые обнаруживаются также у больных ХГС [Sugimura T. et al., 2002; Marceau G. et al., 2005]. Кроме того, антитела класса G к конформационному поверхностному В-эпитопу мутантной молекулы цитохрома P4502E1 (а.о.324-346) эффективно связываются с конформационными эпитопами NS5b (438-449) и NS5b (456-465) [Sutti S. et al., 2010]. Кроме молекулярной мимикрии с цитохромом P4502D6, при анализе сходства геномов ВГС и человека с помощью базы Swiss-prot была показана гомология аминокислотной последовательности NS5 белка ВГС с ферментами человека: синтазой амина азота и тирозинкиназой–Lck, протоонкогеном и активатором фактора роста печени [Vasiljević N., Marković L., 2005]. 29 1.3. Диагностическая значимость и ограничения методов определения прямых маркеров ВГС-инфекции: РНК и белков ВГС. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты «Золотым стандартом» лабораторной диагностики гепатита С является выявление прямых специфических маркеров инфекции − антигенов и РНК ВГС с помощью современных иммунохимических и молекулярно-биологических методов. При остром гепатите С первым маркером является РНК ВГС, которую удается обнаружить на 7 − 21-й день после инфицирования [Orland J.R. et al., 2001; Thimme R. et al., 2001]. Уровень РНК ВГС быстро повышается в течение нескольких первых недель и достигает максимума 105−107 МЕ/мл незадолго до увеличения концентрации сывороточной аминотрансферазы, манифестации клинических признаков и до начала сероконверсии – появления анти-ВГС (6-8 недель) [Kleinman S. et al., 1997]. При самопроизвольном излечении от острого гепатита С признаки инфекции могут длиться несколько недель, с дальнейшим исчезновением и снижением уровня аланинаминотрансферазы и РНК ВГС. Острая инфекция HCV может быть тяжелой, но фульминантная печеночная недостаточность развивается редко [Farci P. et al., 1996]. При хронизации заболевания РНК после сероконверсии исчезает из кровотока и выявляется в основном в клетках печени, где происходит активная репликация и сборка вирусных частиц [Масалова О.В., 2011]. Последующее появление РНК в крови связано с активным выходом вируса из клеток и распространением его в организме человека, которое имеет (так же как поражение различных органов) системный характер. Выделено три варианта вирусемии: транзиторная (при остром гепатите С с выздоровлением) − появляющаяся на короткий срок с последующей элиминацией вируса; персистирующая (на фоне хронического гепатита) − на протяжении нескольких лет происходит регулярное выявление РНК ВГС; возвратная − после выявления вируса в начале заболевания и последующего исчезновения через несколько месяцев отмечается повторное выявление РНК ВГС. Для выявления РНК ВГС апробировано большинство методов выявления нуклеиновых кислот. Качественные тесты, например, определение РНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией продуктов реакции в агарозном геле, позволяют установить факт наличия вирусной РНК в крови (положительный результат) или ее отсутствие (отрицательный результат). Концентрация РНК ВГС характеризуется порядковыми величинами, например, "+", "++" и т.д., визуально отражающими интенсивность полос, полученных при электрофорезе продуктов амплификации, или же методом конечных 30 разведений, т.е. по наличию позитивного результата в конечной точке титрования. При оценке качества выявления РНК ВГС в Российской Федерации в 2007 г., по данным Федеральной системы внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК), 45% участников использовало для детекции продуктов амплификации метод электрофореза в геле [Творогова М.Г., Малахов В.Н., 2009]. Результаты исследования количественных тестов выражают в количестве копий РНК ВГС, содержащихся в 1 мл, в абсолютном или логарифмическом выражении (log 10), а также измеряют в Международных Единицах на мл (МЕ/мл); в России приняты оба способа выражения результатов. Принята следующая интерпретация результатов тестирования вирусной нагрузки при ГС: при выражении в копиях вируса на мл низкая вирусная нагрузка − менее 2 миллионов копий, высокая − более 2 миллионов копий; при выражении в Международных Единицах на мл (МЕ/мл) низкая − менее 800,000 МЕ/мл, высокая − более 800,000 МЕ/мл. В настоящее время одним из наиболее используемых в практике методов обнаружения РНК ВГС является количественный тест ПЦР с флуоресцентной детекцией конечного продукта в режиме реального времени (Real-time-ПЦР) − очень чувствительный метод, позволяет измерять вирусную нагрузку порядка 50 МЕ/мл («Amplicor HCV Monitor v2.0; LCx HCV RNA Quantitative Assay», «Roche Diagnostic Systems») [Castro F.G. et al., 2001., Ребриков Д.В. и др., 2009] и даже 15 МЕ/мл при выделения РНК ВГС из 1 мл анализируемой сыворотки (плазмы) крови [Ведерников В.Е. и др., 2009]. В то же время метод транскрипционно-опосредованной амплификации (Transcription-mediated amplification − ТМА) с учетом результатов реакции по хемилюминесценции позволяет измерять вирусную нагрузку порядка 5-10 МЕ/мл. Поиск путей повышения качества выявления РНК ВГС обусловил широкое применение препаратов для ПЦР, изготовленных в научных лабораториях. Сравнение этих тест-систем, так называемых − "домашних" тестов ("in house tests"), продемонстрировало их высокую вариабельность по чувствительности и специфичности [Maylin S. et al., 2009]. Сведения о пределах чувствительности разных методов означают, что при тестировании РНК ВГС может присутствовать в крови, но остаться не выявленной. В России в 2001 г. из 14 лабораторий, участвующих в Федеральной системе внешнего контроля качества, лишь 3 (21,4%) смогли правильно решить поставленную задачу по выявлению РНК ВГС [Исаева О.В. и др., 2001]. По сравнению с этими данными, чувствительность выявления РНК ВГС в последующем увеличилась. Основной тенденцией изменения в России спектра методов детекции РНК ВГС, отмеченной ФСВОК, является увеличение количества лабораторий, применяющих метод амплификации в присутствии флуоресцентно- 31 меченых зондов в режиме реального времени и снижение продуктов амплификации методом электрофореза. В то же время последний метод продолжает активно использоваться, и в 2007-2008 гг. доля правильных результатов, полученных двумя методами (в 90% случаев с использованием реагентов отечественных производителей), была одинаковой и составляла 95% для образцов с концентрацией РНК ВГС 104 МЕ/мл. Для контрольных образцов с концентрацией РНК 103 МЕ/мл доля правильных результатов не превышала 87%. Специфичность двух методов детекции в период 2007-2008 гг. также была сравнимой и не превышала 95%. По результатам проведения контрольных циклов ФСВОК был сделан вывод о необходимости работы по повышению чувствительности как при разработке наборов реагентов, так и при их использовании [Творогова М.Г, Малахов В.Н., 2009]. В отдельных лабораториях методика с электрофоретической детекцией демонстрировала меньшую чувствительность по сравнению с Real-Time ПЦР. Так, сравнение метода ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов ПЦР и Real-time-ПЦР для исследования крови доноров на станции переливания крови привело к следующим результатам. Результаты обоих вариантов ПЦР в основном совпали. Один образец плазмы донора, содержащий анти-ВГС, был позитивен по ПЦР в формате реального времени при первом исследовании, а при повторном тестировании негативен и по Real-time-ПЦР и по ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов, вероятно, в силу низкой концентрации РНК ВГС. При тестировании разведений образцов с известной концентрацией РНК методика с электрофоретической детекцией продемонстрировала в ряде случаев меньшую чувствительность по сравнению с Real-Time ПЦР [Туполева Т.А. и др., 2013; Сомова А.В. и др., 2005]. Отличительной особенностью "ПЦР в реальном времени" считают возможность получать информацию о наличии РНК ВГС непосредственно в процессе реакции, что позволяет уменьшить время анализа в сочетании с высокой чувствительностью и линейностью получаемых результатов [Germi R. et al.,2001]. В то же время результаты ПЦР, использованной для выявления генетического материала вирусов гепатитов, проведенной на разных приборах с использованием диагностических наборов разных производителей, также могут быть противоречивыми в зависимости от предела чувствительности теста [Тарасенко О.А. и др., 2011]. Причины появления ложнонегативных и ложнопозитивных результатов выявления РНК ВГС разнообразны. Считается, что РНК в очищенном виде и в клинических образцах менее стабильна при хранении, чем ДНК, но более вероятно, что это связано не с разной сохранностью при низких температурах, в которые помещают образцы до исследования, а с меньшей стабильностью РНК при работе с ней при комнатной температуре за счет работы 32 эндогенных и привнесенных РНКаз [Ребриков Д.В. и др., 2009]. Кроме РНКаз, в сыворотке крови могут присутствовать другие ингибиторы, представленные различными химическими или белковыми субстанциями, которые влияют на компоненты ПЦР и препятствуют выявлению РНК ВГС, например, высокий уровень криоглобулинов [Colantoni A. et al., 1997]. Кроме того, ингибирование ПЦР наблюдалось при наличии гепарина, а также при несоблюдении теплового режима хранения и транспортировки клинического материала [Ребриков Д.В. и др., 2009]. Причиной ложнопозитивных результатов может являться контаминация материалом иных проб (при обработке образцов и/или работе с реакционной смесью), в том числе и контаминация материалом позитивного контрольного образца; контаминация продуктами предшествующий амплификации (ампликонами), которые могут загрязнять исследуемые образцы и растворы через аэрозоли или лабораторное оборудование [Ребриков Д.В. и др., 2009]. Новый уровень проведения лабораторных исследований РНК ВГС был связан с появлением стандартизированных диагностических наборов с введением внутреннего контроля в каждый исследуемый образец: отсутствие позитивной реакции при выявлении внутреннего контроля свидетельствует о наличии в образце ингибиторов и ложнонегативном результате реакции на РНК ВГС. К сожалению, несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный изъян. Если в реакционной смеси находится нужная ДНК (полученная в результате обратной транскрипции), то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с внутренним контролем за праймеры. Это особенно принципиально важно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце, что может приводить к ложноотрицательным результатам [Основы полимеразной …, 2012]. Полная автоматизация всех этапов реакции, достигнутая, в частности, в системе "COBASAmpliPrepTM", позволяет автоматизировать процесс выделения РНК ВГС, амплификации и детекции, тем самым уменьшить риск получения ложнопозитивных и ложнонегативных результатов, сохранив при этом высокую чувствительность и специфичность. Применение внутренних стандартов с различным содержанием РНК ВГС позволяет избежать многих методических ошибок, которые могут отразиться на конечном результате реакции, однако и стандартная кривая, и неизвестные образцы могут иметь некоторый разброс, поэтому результат определения может варьировать примерно в 3 раза. Для образцов с низким содержанием мишени (например, РНК ВГС) точность определения значительно ниже, чем для высококопийных образцов. Для низкого числа копий статистические вариации при отборе проб являются значимым фактором [Ребриков Д.В. и др., 2009]. 33 Таким образом, использование ПЦР в качестве «золотого стандарта» инфицирования ВГС ограничено как биологическими особенностями ВГС, так и чувствительностью используемых методов. Антигены ВГС, которые также, как РНК вируса, являются прямыми маркерами инфицирования, появляются в крови в период от одного до 20 дней после появления в крови РНК вируса [Laperche S. et al, 2005]. Применение метода флюоресцирующих антител позволяет определить антигены вируса гепатита С в гепатоцитах, полученных при биопсии или аутопсии печени, что впервые было продемонстрировано К. Krawczynski с соавторами [Krawczynski K. et al, 1992]. В настоящее время разработаны диагностикумы на основе моноклональных антител иммунохимическими к методами различным эпитопам определяются белков антигены ВГС, в структурного которых (Core) и неструктурных белков (NS4A, NS5A, NS), накапливающиеся в печени, циркулирующие в крови или полученные в результате лизиса мононуклеарных клеток периферической крови. С их помощью было установлено, что ВГС в крови у пациентов с острым гепатитом С циркулирует преимущественно в виде безоболочечных капсидов, а у больных с циррозом печени − в виде иммунных комплексов; что средняя концентрация Core-белка в сыворотках крови больных ХГС достоверно выше, чем у пациентов с ОГС. Низкая концентрация Coreбелка (<40 пг/мл) в сыворотке в ранние сроки (до 1 месяца) после манифестации ОГС является предиктором реконвалесценции. Между обнаружением Core белка и РНК ВГС в пробах сыворотки крови установлена статистически значимая корреляция; максимальная его концентрация составляла 2,2 нг/мл при средней около 200 пг/мл. Обнаружение Core белка в печени также коррелирует с количеством РНК и может служить маркером ранней стадии ОГС. При оценке исхода ОГС установлено, что концентрация белка нуклеокапсида в сыворотке крови выше у больных с последующей хронизацией гепатита, чем у предполагаемых реконвалесцентов (92±40 против 26±13 пг/мл). С помощью моноклональных антител установлены концентрации и показано различие динамик накопления неструктурных белков в печени при ОГС и ХГС, а выявление белков Core и NS4 у пациентов без антител к ВГС в крови позволило верифицировать гепатит С у 3 из 15 пациентов с гепатитом неясной этиологии [Масалова О.В., 2011]. Имеются отдельные сообщения о разработке диагностических систем для ИФА, основанных на методике библиотечного твердофазного пептидного синтеза, позволяющих выявлять множество вариантов поверхностных антигенов Core и E2 в сыворотке крови. Коэффициент корреляции с концентрацией РНК ВГС составлял 0,8 [Рыжиков Е.А., 2009]. Определение белков ВГС (кроме Core-протеина) до сих пор не нашло широкого применения в практическом здравоохранении, поскольку в сыворотке крови больных 34 острым и хроническим гепатитом С антигены вируса могут циркулировать в крайне низких концентрациях (менее 1 нг/мл). В коммерческих диагностических системах в качестве цели детекции был избран только Core-антиген ВГС, который определяют при помощи твердофазного варианта ИФА, сконструированного на основе моноклональных антител. Исследования по применению этих тестов определили их высокую чувствительность, специфичность и перспективность применения, прежде всего, в службе переливания крови, вследствие наличия прямой корреляции между концентрацией РНК ВГС и выявлением Core Ag ВГС [Масалова О.В., 2011] и сокращением фазы "окна" − времени от момента инфицирования до первого позитивного результата выявления анти-ВГС. Core Ag ВГС удается выявлять в 83% случаев на следующий день после первого обнаружения РНК ВГС [Aoyagi K. et al., 2001] и задолго (в среднем 26 дней) до появления анти-ВГС [Peterson J. et al., 2000; Laperche S. et al., 2005]. Данные литературы о значимости дополнительного к анти-ВГС выявления антигенов в диагностических наборах, предназначенных для скрининга, достаточно противоречивы. Так, имеются свидетельства того, что определение антигена Core не способствует увеличению чувствительности диагностикума [Yagci S., Padalko E., 2011]. 1.4. Клеточный и гуморальный иммунный ответ на белки ВГС. Методы выявления антител к ВГС и границы диагностической точности Прогресс, достигнутый в изучении структуры и свойств белков ВГС, определил представления об особенностях иммуногенных свойств белков и иммунного ответа на отдельные антигены ВГС. Показано, что белок Core отличается от остальных белков ВГС наиболее консервативным аминокислотным составом и высокой иммуногенностью; Вэпитопы в основном сосредоточены в гидрофильной NH2-концевой области в консервативных участках, Т-эпитопы как для Т-хелперов (CD4+), так и для Т-киллеров (CD8+) располагаются по всей протяженности белка Core. Оболочечные белки Е1 и Е2 обладают меньшей иммуногенностью, но они содержат В-эпитопы, антитела к которым обладают вируснейтрализующим действием. Эти эпитопы располагаются в ГВР, в частности, в ГВР1 белка Е2. Высокая гетерогенность этого белка, проявляющаяся между различными изолятами и чрезвычайная изменчивость в течение инфекции у одного и того же больного обусловливают неэффективность гуморального звена иммунного ответа (и трудности создания вакцин), так как нейтрализующее действие постоянно продуцируемых изолятспецифических антител оказывается ограниченным во времени. Связыванию ВГС с клеткой препятствуют антитела к NOB-эпитопу (от англ. «Neutralization of binding») белка 35 Е2. В-эпитопы белка NS3 являются линейными и конфомационными консервативными эпитопами, локализованными в основном в геликазной области. Т-эпитопы как для Тхелперов (CD4+), так и для Т-киллеров (CD8+) располагаются по всей молекуле NS3. В полипептидах NS4A и NS4B обнаружены как консервативные, так и типозависимые Вэпитопы; среди Т-эпитопов преобладают хелперные. В полипептидах NS5A и NS5B обнаружены как линейные, так и конформационные В-эпитопы, Т-хелперные и Т-киллерные эпитопы [Kuiken C. et al., 2005; Kuiken C. et al., 2006]. Несмотря на наличие вирусспецифического иммунного ответа, у большинства инфицированных лиц (около 80%) он не приводит к элиминации вируса и не защищает от реинфекции. Протективный эффект при ВГС-инфекции связывают в первую очередь с Тклеточным иммунитетом, который, как показали эксперименты in vitro, развивается с активацией и дифференцировкой наивных CD4+ и CD8+ клеток в эффекторные T–клетки, направленные против белков ВГС Сore и NS3 [Krishnadas D.K. et al., 2009]. Оценка активности СD4+-хелперов (Тh) и СD8+- цитотоксических (CTL) клеток у лиц, выздоровевших от ВГС-инфекции, показала, что выраженность ответа на антигены Core и NS3, а также преимущественная продукция Th 1-го типа коррелируют с саморазрешением ВГС-инфекции, в то время как при хронизации наблюдаются слабый СD4+-Т-клеточный ответ и обратное соотношение числа Th (преобладание количества Th 2-го типа) и продуцируемых ими цитокинов [Madalinski K. et al., 2006]. Активация антигенами ВГС реакций клеточного иммунитета в отсутствие сероконверсии может отражать бессимптомную и самоизлеченную острую ВГС-инфекцию в прошлом. [Koziel M.J. et al., 1997; Rivièr Y. et al., 2012]. С этим наблюдением согласуется то, что у пациентов, спонтанно излечившихся от ВГС-инфекции, иммунные реакции ВГС-специфических CD4+ и CD8+ Tклеток сохраняются в течение нескольких лет, а гуморальная иммунная реакция (продукция антител) уменьшается [Takaki A. et al., 2000]. Характер ВГС-специфического Т-клеточного ответа, поддерживаемого Th 1-го типа, позволяет предполагать, что клиническое и вирусологическое саморазрешение HCV-инфекции, по-видимому, не всегда означает полной эрадикации вируса, персистенция которого в минимальных количествах сохраняется под контролем иммунного ответа. Гуморальный иммунный ответ на антигены ВГС. Данные литературы относительно динамики появления антител к различным белкам ВГС, участия антител в элиминации вируса и их значимости в разграничении ОГС и ХГС противоречивы. В подробном исследовании специфического гуморального иммунитета при вирусном гепатите С, проведенном Л.И. Николаевой, продемонстрирована динамика появления антител класса G к вирусным белкам после заражения. Антитела, направленные к вариабельным и реже к 36 консервативным областям оболочечных пептидов Е1 и Е2, появляются со 2-3 недели после заражения, в начальном периоде острой инфекции. После второго месяца острой фазы у большинства людей происходило снижение уровня антител, вируснейтрализующих, направленных к В-эпитопам белков Е2 и Е1. в том числе Исход болезни в данной работе не зависел от гуморального ответа на антигены оболочечных белков, и к концу второго месяца острой фазы у большинства людей наблюдалось снижение количества этих антител [Николаева Л.И., 2006]. По данным других авторов, в ряде случаев элиминация вируса коррелирует с увеличением концентрации нейтрализующих антител к белкам оболочки [Lavillette D. et al., 2005]. При исследовании динамики появления антител класса G к нуклеокапсидному (Core) и к неструктурным (NS) белкам при сероконверсии в процессе ОГС также были получены противоречивые результаты, что, возможно, зависело от конструктивных особенностей диагностических систем и генотипа вируса. Так, было обнаружено, что антитела к Core-белку и к неструктурному белку NS3 появляются практически в один и тот же период, через 2 недели после желтухи, причем с равной частотой (33,3%) обнаруживаются либо антитела к одному из этих белков, либо антитела, направленные к двум белкам сразу. Титры анти-Core и анти-NS3 имели близкие значения, что по мнению автора исследования высокоиммуногенные В-эпитопы. свидетельствует о том, что оба белка содержат Через 3 недели кроме анти-Core и анти-NS3 у большинства зараженных определялись анти-NS4, а к концу первого месяца в 15% образцов обнаруживались и анти-NS5 [Николаева Л.И., 2006]. В исследовании других авторов было показано, что при заражении потребителей внутривенных наркотиков вирусом первого генотипа первоначально возникает высокий ответ на Core и неструктурный белок NS4, что, возможно, было связано с тем, что использованный иммуноблот Chiron «RIBA HCV-titering Strip Immunoblot Assay» сконструирован на основе антигенных групп белков ВГС первого генотипа. У людей, зараженных ВГС первого генотипа, антитела к белку NS3 в высоком титре при сероконверсии обнаруживались в основном при высокой постоянной виремии. У людей, зараженных иными генотипами вируса, при виремии обнаруживались антитела к NS3 и к NS5 белкам. Авторы исследования наблюдали быстрое уменьшения количества антител к NS3 после снижения вирусной нагрузки, независимо от генотипа вируса [Beld M. et al., 1999]. В случае полной элиминации вируса в острой фазе гепатита С антитела ко всем вирусным неструктурным белкам снижались быстрее, чем анти-Core, и обычно уже к 12 месяцу после желтухи антитела ко всем неструктурным белкам не определялись. При элиминации вируса обычно последовательно исчезали антитела класса G к анти-NS5A, NS4AB, NS3, Core антигенам ВГС. Иногда IgG-антитела к NS4AB исчезали позже, чем к NS3. Около 40-60% людей, перенесших ОГС с выздоровлением, не имеют антител к 37 антигенам ВГС через 3 года, а у остальных обнаруживаются только анти-Core, причем иногда пожизненно [Николаева Л.И., 2009, Николаева Л.И. и др., 2009]. У 80% зараженных ВГС лиц, по устоявшемуся в настоящее время мнению, происходит хронизация заболевания, которой в первую очередь способствуют факторы вируса: ускользание от иммунного ответа и способность ингибировать иммунную систему хозяина. Переход ОГС в ХГС условно проводится ВОЗ после шестимесячного периода от начала инфицирования, за который не произошло элиминации вируса. Изменения, которые наблюдаются в реакциях гуморального иммунитета при ХГС, касаются ответа на В-эпитопы как нуклеокапсидного, так и неструктурных белков. Наиболее значительное различие гуморального иммунитета при ОГС и ХГС заключается в уровне продукции анти-ВГС IgG, которое, по-видимому, обусловлено прогрессированием заболевания и может быть установлено, по мнению одних авторов, только с помощью мультиплексного анализа результатов определения уровня антител к 8 основным структурным и неструктурным белкам ВГС [Araujo A.C. et al., 2011]. Дифференциальную серодиагностику ОГС и ХГС предложено проводить и на основе определения только титров анти-Core, поскольку при ОГС анти-Core обнаруживается в титрах менее 1/800, а при ХГС − более 1/800 (при p<0,0001) [Николаева Л.И., 2006]. Показано, что у большинства ВГС-инфицированных пациентов вырабатываются антитела (AT) к белку NS3, и постоянно высокий, не снижающийся титр этих AT рассматривают в качестве маркера хронизации инфекции [Beld M. et al., 1999]. Наиболее характерным для ХГС изменением гуморального ответа на неструктурные антигены в разных группах пациентов является активность антител к белку NS5A, которая коррелирует с накоплением белка NS5A в печени пациента [Масалова О.В., 2011]. Анти- NS5A определяются у 63% больных ХГС. У больных ХГС с анти-NS5A и антиВГС IgM, по сравнению с пациентами с отсутствием данных антител, чаще выявлялся повышенный уровень АЛТ. Вирусологический ответ на курс интерферонотерапии значимо чаще ассоциировался с отсутствием анти-NS5A до начала терапии [Красавцев Е.Л. и др., 2006; Мицура В.М. и др., 2009]. В литературе имеются и прямо противоположные данные о прогностическом значении анти-NS5 для предварительной оценки интерферонотерапии: у части больных ХГС не выявляются ни анти-NS5А, ни анти-NS4АВ, и интерферонотерапия у таких больных оказывается безуспешной; как неблагоприятный прогностический признак рассматривается отсутствие и одного из этих маркеров [Николаева Л.И. и др., 2009]. При интерферонотерапии ХГС с появлением устойчивого вирусологического ответа на лечение наблюдали сходную с выздоровлением от ОГС динамику исчезновения антиВГС, что было связано авторами работы с уменьшением антигенной нагрузки на организм при прекращении разрушения клеток печени, в которых преимущественно происходит 38 синтез вирусных белков, и меньшей иммуногенностью неструктурных антигенов по сравнению со структурными [Maylin S. et al., 2009]. Через 10 лет успешной интерферонотерапии, приведшей к эрадикации ВГС, у половины пациентов не обнаруживались анти-NS5 и анти-NS4, а у остальных количество этих антител значительно снизилось. Результаты тестирования анти-Core через 10 лет были позитивными у большинства пациентов, но титры заметно снизились [Toyoda H. et al., 2005]. В работе Попонина Д.М. и др. указаны параметры, которые позволяют разграничить «носительство» вируса от ХГС: при «носительстве» в низких титрах обнаруживаются анти-Core и анти-NS4, в высоких титрах анти-NS3 и средних − анти-NS5 IgG. Средние и высокие титры анти-Core, средние анти-NS3 и анти-NS4, а также высокие титры анти-NS5 являются показателями хронического гепатита С [Попонин Д.М. и др., 2011]. Наиболее однозначные результаты исследования гуморального иммунитета при ГС относятся к продукции анти-ВГС, относящихся к IgM. Продукция этих антител характеризуется рядом особенностей, связанных с персистирующим характером инфекции. Так, почти у всех пациентов с острым гепатитом С был обнаружен типичный ответ на ВГСантигены с образованием IgM: эти антитела предшествовали IgG анти-ВГС и персистировали в высоком титре несколько месяцев. У 50-80% лиц с хроническим гепатитом С IgM анти-ВГС обнаруживались в низком титре, что обычно наблюдалось при обострении хронического гепатита С. Более того, у многих пациентов с активным хроническим гепатитом С без обострения также обнаруживались IgM анти-ВГС, титр которых коррелировал с биохимическими показателями заболевания печени. У пациентов с устойчивой ремиссией заболевания, достигнутой в результате лечения α-интерфероном, позитивность на IgM анти-ВГС исчезала в 70% случаев, в отличие от пациентов, не отвечающих на терапию. Авторы исследования предположили, что IgM анти-ВГС являются маркером активного заболевания печени, индуцированного ВГС, в случаях как острой, так и хронической инфекции [Brillanti S. et al., 1993]. При различных нарушениях иммунитета возможна сниженная продукция антител, которая осложняет своевременную лабораторную диагностику ВГС-инфекции. В частности, у пациентов с онкогематологическими заболеваниями существует возможность отсроченного образования антител к ВГС, что обусловлено как иммуносупрессией в результате опухолевого процесса, так и полихимиотерапией, приводящей к нарушению процессов образования антител. При этом большой объем оперативных вмешательств, частые и массивные трансфузии компонентов крови увеличивают риск заражения парентеральными гепатитами, в том числе ГС [Ильченко Л.Ю. и др., 2010]. Кроме онкогематологических больных, задержка образования антител к ВГС наблюдается у ВИЧ- 39 инфицированных пациентов. Коинфекция ВГС и ВИЧ может приводить к усилению репликации ВГС и быстрому прогрессированию тяжелого заболевания печени, включая развитие цирроза и ГЦК, поскольку у больных с коинфекцией ВГС/ВИЧ снижены выраженность и разнообразие ВСГ-специфического Т-клеточного ответа [Roe B., Hall W.W., 2008]. При тестировании образцов сыворотки крови, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц с установленным сроком заражения ВГС, только 20% образцов, положительных на РНК ВГС, оказались позитивными на анти-ВГС. Антитела к ВГС появлялись у больных в среднем через 7 месяцев, а не в первый месяц после определения РНК ВГС, что препятствовало ранней диагностике ВГС-инфекции у ВИЧ-инфицированных лиц, которая имеет очень важное значение для тактики ведения этих пациентов [Nastouli E. et al., 2009]. Латентный (скрытый, мало- или бессимптомный) ГС, протекающий с периодическим исчезновением анти-ВГС на фоне выраженных иммуносупрессивных процессов, был обнаружен у 0,5-10% взрослых пациентов с наличием факторов риска инфицирования ВГС, определенных в процессе эпидобследования [Москалев А.В., Астапенко П.В., 2009]. Результаты динамического наблюдения детей, у которых в течение длительного времени обнаруживались антитела только к одному антигену ВГС, представлены в работах И.А. Евпловой с соавт. Как правило, эти дети имели повышенный риск инфицирования ВГС как естественным путем (при перинатальной и внутрисемейной передаче), так и искусственными путями (при проведении операций и множественных медицинских манипуляций). Длительное динамическое наблюдение в течение 7 лет мальчика, рожденного матерью с ХГС, показало следующее изменение спектра антител: в первый месяц обнаружены антитела к структурным и неструктурным антигенам, РНК ВГС и подъем АЛТ, диагноз ОГС; к пятому году жизни обнаруживались только антитела к Core и NS4 белкам, РНК не выявлялась; в шесть лет антитела к ВГС не выявлялись; в 7 лет появились антитела только к NS4-антигенам. У других детей, рожденных матерями с ХГС, при рождении могли выявляться антитела только к NS4 или NS3 белкам, а РНК ВГС отсутствовала, однако при обследовании через 1-3-12 месяцев могли дополнительно выявиться анти-Core и РНК ВГС. Авторы исследования сделали вывод о том, что транзиторное выявление РНК ВГС свидетельствовало о возможном присутствии вируса в низких, не определяемых современными методами концентрациях. Кроме низкой концентрации вируса, к сниженной продукции антител к ВГС, как, впрочем, и антител к другим патогенам, у «часто болеющих детей» приводит иммунный дисбаланс [Евплова И.А. и др., 2009; Евплова И.А. и др., 2009а; Евплова И.А. и др., 2010]. Таким образом, небольшое количество антител к ВГС в крови обусловлено особенностями сероконверсии и серореверсии при самопроизвольном разрешении и при естественном протекании инфекции, 40 а также в результате лечения; с иммуносупрессирующим действием вируса и с недостаточностью иммунитета вследствие других факторов (заболеваний и фармакологической супрессии) у ВГС-инфицированных лиц. Кроме того, возможность выявления антител, циркулирующих в крови в небольших количествах, зависит от качеств использованных диагностических систем и алгоритмов исследования. Основным методом детекции анти-ВГС является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Метод отвечает требованиям практического здравоохранения, поскольку для него характерны высокая чувствительность, специфичность и простота проведения. В настоящее время иапользуются диагностикумы для ИФА третьего и четвертого поколения; последние, в отличие от препаратов предыдущих поколений, содержат как рекомбинантные, так и синтетические белки. Использование диагностикумов 3-го поколения для выявления анти-ВГС среди иммунокомпетентного населения (например, доноров крови) оценивается в 98,8-100%. В то же время у лиц с угнетенным иммунитетом, например, таких, как онкологические больные, пациенты после трансплантации почки, костного мозга, этот показатель значительно ниже и составляет 50-95% [Шахгильдян И.В. и др., 2003]. Выявление анти-ВГС у ВИЧинфицированных пациентов в современных диагностических системах представляет собой и в настоящее время существенную проблему. Серонегативный ГС наблюдается у 3-13% лиц, зараженных ВГС и ВИЧ, при этом РНК ВГС в сыворотке крови обнаруживается только у 13% серонегативных по анти-ВГС лиц [Bharti A.R. et al., 2011]. Одной из наиболее важных проблем при проведении исследований на наличие антиВГС являются ложнопозитивные результаты, которые характерны для серодиагностики и других инфекций, в частности, сифилиса [Дмитриев Г.А., Фриго Н.В., 2004]. Уровень ложноположительных реакций при выявлении анти-ВГС с различными диагностическими препаратами может достигать 10-20% [Маянский А.Н. и др., 2003; Медицинские лабораторные технологии, 1998; Shroter M. et al., 1999]. Таким образом, чувствительность и специфичность тест-систем, используемых в ИФА, и в настоящее время недостаточны для исследования проб сыворотки крови отдельных контингентов пациентов. Поиск способов достижения достоверного результата выявления анти-ВГС отчасти решается посредством использования дополнительных подтверждающих тестов и оценки реактивности пробы. Эффективным способом оценки реактивности пробы в ИФА (в том числе пригодным для массового скрининга) является коэффициент позитивности (КП), который отражает количество антител в пробе. При определении ОП с помощью спектрофотометра (ридера) КП подсчитывается делением оптической плотности (ОП) пробы, выраженной в условных единицах на ОП критическую (ОПкр.), иначе называемой уровнем Cut off (CO). В 41 англоязычном варианте величина КП именуется величиной S/CO, от англ. «Sample/Cut off». ОП критическая является статистически рассчитанной величиной, которой соответствует большинство результатов измерения проб без анти-ВГС. Обнаружено, что среди сывороток, которые имеют низкий КП в скрининговых тестах, ложноположительной реакцией. повышено количество образцов с Было подсчитано, что при 9-ти кратном превышении отношения ОП сыворотки к ОП критической, т. е. при КП более 9, вероятность наличия ВГС-инфекции у пациента составляет 92,6%, а при величине КП менее 1,5 вероятность наличия данного заболевания составляет только 11,8% [Арсенин С.Л. и др., 2001]. Наиболее распространенным (и очень дорогим) верифицирующим тестом в мире являются иммуноблоты. Принцип метода основан на адсорбции нитроцеллюлозной мембраной антигенов, кодированных различными зонами РНК ВГС в виде отдельных полос. Анти-ВГС взаимодействуют с адсорбированными антигенами с помощью меченных ферментом антител против IgG человека с последующей их детекцией при помощи субстратного комплекса. Совершенствование иммуноблотов также, как совершенствование ИФА в планшетном формате, идет по пути расширения состава включенных в ИБ антигенов, замены рекомбинантных антигенов синтетическими, которые уменьшают количество неспецифических реакций, и замены одних антигенных групп другими, входящими в состав того же белка ВГС. Примером явилось замещение иммуноблота RIBA-2 иммуноблотом третьей генерации RIBA-3, у которого при исследовании проб сыворотки РНК-позитивных людей оказалась выше чувствительность (99,5% по сравнению с 93,3%, p = 0,0005) за счет замены рекомбинантных пептидов c22 (протеин Core) и c100 (протеин NS4) на синтетические. К сожалению, неспецифическая реактивность против модифицированного антигена c33 (NS3 протеин) и антигенной группы из протеина NS5 оказалась повышенной. Реактивность к двум полосам адсорбированных антигенов чаще наблюдалась в пробах сыворотки без РНК, чем в пробах с РНК (32.7% vs. 8.2%, p < 0.0001). Таким образом, высокая чувствительность иммуноблота третьего поколения RIBA-3 позволила снизить количество неопределенных результатов при тестировании анти-ВГС у РНК-позитивных лиц. Авторы работы заключили, что референсные лаборатории должны учитывать частое возникновение неспецифической реактивности к одному или даже двум антигенам в ИБ, в котором также используется принцип ИФА [Damen M. et al., 1995]. Величина КП (или S|CO) позитивных результатов скрининга может использоваться для оценки вероятности того, что в иммуноблоте результаты будут также позитивными. На это указывает анализ ранее полученных в ИФА результатов определения анти-ВГС при тестировании добровольных доноров крови. Данные были получены при исследовании 42 средней величины КП 24700 образцов сыворотки, анти-ВГС-позитивных в скрининге (ТС «Version 3.0 HCV ELISA»), после сравнения с результатами в иммуноблоте RIBA 3.0. В целом, 64.0 % позитивных в скрининге образцов были RIBA-положительными. Доля образцов, позитивных в RIBA, была равна: 5.8% для образцов с КП 1.0 - 2.9; 37.1 % для образцов с КП 3.0 - 3.4; 67 % для образцов с КП 3.5 - 3.7; 88.1 % для образцов с КП 3.8 - 3.9; и 94.1 % для образцов с КП равным или более 4.0 [Alter M.J. et al., 2003]. Аналогичные сведения о высокой позитивной корреляции между S|CO в ИФА планшетного формата и частотой подтверждения наличия анти-ВГС в иммуноблоте были получены для тест-систем китайского производства [Ren F. R. et al., 2005]. Помимо иммуноблотов, в России в качестве подтверждающих дополнительных тестов также используются диагностические наборы планшетного формата с раздельным выявлением анти-ВГС, направленных против антигенов, кодированных различными зонами РНК ВГС: «РекомбиБест АНТИ-ВГС-СПЕКТР» (ЗАО «Вектор Бест», г.Новосибирск); «ИФА-Анти-НСV-Спектр» (НПО "Диагностические системы", г. Нижний Новгород). Разработка и внедрение этих тестов идет параллельно с внедрением скрининговых тестов для выявления анти-ВГС, повторяя принцип расширяющегося спектра использованных пептидов в каждом последующем поколении диагностических препаратов. Взаимодействие антител с отдельными пептидами, а также применение в диагностикуме расширенного спектра пептидов, которые не используются в скрининговых тестах, в некоторых случаях обеспечивает более четкие результаты ферментативной реакции в конфирматорных диагностических системах планшетного формата. Соотношение спектра регистрируемых ответов при проведении подтверждающих тестов колеблется в зависимости от характеристик групп пациентов, у которых первично выявлены анти-ВГС. По заключению Мукомоловой Л.А., у больных острым гепатитом С наиболее часто обнаруживаются антитела класса IgG к ядерному (100%) и NS3 (84,6%) белкам вируса ГС, а антитела к NS4 и NS5 белкам выявляются соответственно всего в 23,1% и в 7,7% случаев. У больных ХГС частота выявления антител к белкам ВГС колеблется от 90,9% (NS3) до 100% (Core, NS4) [Мукомолова А.Л., 2004; Николаева Л.И., 2003; Николаева Л.И. и др., 2003; Николаева Л.И., 2006]. 43 В то же время при исследовании проб с низким КП в первичном скрининге часто наблюдается противоречивость результатов, полученных в конфирмационных диагностических системах, как в иммуноблотах, так и в подтверждающих тест-системах планшетного формата [Кузина Л.Е. и др., 2004]. Для того, чтобы согласовать результаты всех использованных тестов, А.П. Сусловым и соавт. было введено интегральное понятие «диагностический консенсус». При исследовании «проблемных» проб в 3-4 скрининговых иммуноферментных тест-системах (ИФТС) планшетного формата и двух подтверждающих ИБ «диагностический консенсус» считался достигнутым [Suslov A. P. et al., 2002], если 1) два скрининговых теста (КП > 3) и два подтверждающих теста были положительными, либо 2) два скрининговых теста, включая референсную в данном исследовании ТС «Мюрекс», были положительными (КП > 3), при этом один из подтверждающих тестов был положительным, а второй имел неопределенный результат. В остальных случаях сыворотки подлежали дальнейшему исследованию с использованием иммуноблотов. Этот подход в силу трудоемкости и высокой стоимости иммуноблотов не вполне отвечает задаче достижения достоверности результата при массовом скрининге на наличие антител к ВГС. Задача разграничения ложнопозитивных результатов с истинным выявлением антиВГС решается посредством разработки более специфичных способов выявления антител, например, ИФА с биотин-стрептавидин амплифицирующей системой [He J. et al., 2011]; технологии SMARTube, предназначенной для стимулирования лимфоцитов человека антигенами ВГС при культивировании in vitro для выявления предварительной сенсибилизации лимфоцитов in vivo [Gorodin S. et al., 2013]. В последнее время появился новый класс препаратов для серодиагностики инфекционных заболеваний − иммуночипы, принцип работы которых основан на непрямом методе выявления антител к спектру антигенов с помощью флуоресцентной детекции. Эффективность иммуночипов была продемонстрирована на стандартных коммерческих панелях проб, содержащих и не содержащих анти-ВГС, а также при исследовании образцов сыворотки крови, положительных по анти-ВГС в ИФТС [Чеканова Т.А. и др., 2008]. Кроме того, дополнительную характеристику реактивных в ИФА антител к ВГС, и, соответственно, характеристику специфичности реакции и стадии инфекции, предоставляют методы определения IgM и авидности антител. Опредение и диагностическое значение IgM анти-ВГС. В настоящее время тестсистемы для определения IgM к ВГС основаны на применении рекомбинантных антигенов ВГС, соответствующих участкам белков, кодируемых структурной (core) и неструктурной (ns3, ns4 и ns5) областями генома вируса, и способны выявлять в сыворотке (плазме) крови человека антитела класса IgM к ВГС, которые являются маркерами репликативной 44 активности вируса при первичной (острой) и рецидивирующей (хронической) стадии инфекции гепатита С, а также в динамике проведения интерферонотерапии [Мицура В.М. и др., 2009]. Обнаружено, что большинство больных хроническим гепатитом С (79%) являются IgM-анти-ВГС-позитивными; во всех пробах с IgM-анти-ВГС присутствует РНК ВГС; 80% проб, позитивных на наличие РНК ВГС, содержат IgM-анти-ВГС [Martinelli A.L. et al., 1996]. Сравнение результатов определения IgM к ВГС в группах лиц, употребляющих и не употребляющих наркотики, показывает, что доля наркозависимых лиц с IgM к ВГС (33,1%), т. е. находящихся в активной стадии ГС, значительно выше, чем среди пациентов, не употребляющих психоактивные вещества (8 %) [Кругляк С.П., Мартынченко Ю.Н., 2005]. Так же как и при использовании тестов для выявления анти-ВГС (IgG), при исследовании IgM анти-ВГС могут быть зарегистрированы ложнопозитивные результаты, причиной которых может быть ревматоидный фактор [Stevenson D.L. et al., 1996]. Определение и диагностическое значение авидности анти-ВГС. Одним из простых и доступных лабораторных методов для разграничения острой и хронической инфекции, а также инфекции, имевшей место в прошлом, является измерение авидности антител. Этот показатель характеризует суммарную величину прочности связывания всех молекул антител с целевыми антигенными детерминантами. Во многих исследованиях было продемонстрировано, что в период острой инфекции антитела класса IgG обладают низкой авидностью, однако в дальнейшем они заменяются на высокоавидные антитела, которые могут длительно циркулировать в крови. Показано, что определение индекса авидности (ИА) может быть полезным для разграничения острого ГС от хронического ГС в период обострения (ИА соответственно 0,5 и выше 0,9) [Coppola N. et al., 2007]. Кроме того, улучшению диагностики острого ГС может способствовать оценка авидности антител класса IgG вместе с определением титра антител класса IgM [Coppola N. et al., 2009]. Авидность IgG антител к ядерному белку ВГС в стадии острого процесса, как правило, не превышает 50%, а в стадии хронической инфекции — достигает 90-100%. Эти данные указывают на то, что при гепатите С наблюдаются общие для инфекционных заболеваний закономерности формирования иммунного ответа. В частности, продемонстрировано, что при одновременной циркуляции антител к ядерному белку вируса ГС классов IgM и IgG последние являются низкоавидными. У больных острым гепатитом С низкоавидные антитела со временем замещаются на высокоавидные антитела. При текущем хроническом процессе у пациентов постоянно циркулируют высокоавидные антитела. На основе этого был предложен новый алгоритм лабораторных исследований при гепатите С с включением в него теста измерения авидности [Мукомолова А.Л., 2004]. В то же время 45 было показано, что есть некоторые факторы, лимитирующие ценность теста измерения авидности. Так, авидность антител к ВГС у пациентов в начале сероконверсии (индекс авидности 18,6%), у пациентов c ХГС, позитивных на анти-ВГС и РНК ВГС (индекс авидности 100%) и у пациентов после выздоровления от ВГС-инфекции (индекс авидности 54%) различалась. Возрастание авидности анти-ВГС зависело от уровня виремии: у пациентов с небольшим количеством РНК в крови или при отсутствии РНК после выздоровления низкоавидные антитела сохранялись в течение длительного времени. Авидность антител быстро возрастала у пациентов с количеством РНК более 1 млн. копий/мл, что свидетельствовало о высокой достоверности теста изменения авидности антител в течение заболевания в основном при высоком уровне виремии [Klimashevskaya S. и др., 2010]. 1.5. Сочетание серологических, молекулярно-генетических и клеточных методов исследования в выявлении скрытой ВГС-инфекции При исследовании взаимосвязей серологического и молекулярно-генетического тестирования обнаружено, что РНК ВГС чаще обнаруживалась в образцах сыворотки крови, содержащих антитела, направленные к широкому спектру белков ВГС. РНК вируса обнаруживалась у 70% больных ХГС, причем у РНК-позитивных пациентов в 78% случаев обнаруживались антитела класса M к Core-белку (также показатели активной ВГСинфекции). У РНК-позитивных и РНК-негативных пациентов частота встречаемости антител класса G к Core-, NS3- и NS4-белкам ВГС была одинаковой. Встречаемость антител класса G к NS5-белку у РНК-позитивных больных ХГС как с клиническими проявлениями заболевания, так и с латентным течением заболевания была выше, чем у РНК-негативных больных [Баранов А.В. и др., 2009]. В ряде исследований были сделаны попытки использования методов выявления РНК ВГС для уточнения диагноза в случае неопределенных результатов исследования наличия антител к ВГС. По данным J.M. Pawlotsky с соавт. [Pawlotsky J.M. et al., 1994], в половине случаев результатов, трактуемых как "неопределенные", удавалось обнаружить РНК ВГС. При оценке клинического статуса пациентов с низким − от 1 до 5 − значением отношения S/Co (иначе КП) анти-ВГС, обнаруженных в тестах ИФА третьего поколения, позитивность на РНК ВГС (15.6 x 106; 4.3 x 105 и 2.6 x 103 IU/ml) была обнаружена только у трех пациентов из 215 (1.4%) с величинами S/Co анти-ВГС в соответствующих образцах 3.69, 4.46 и 4.59. Эти три пациента были старше 50 лет, имели высокие уровни АЛТ, были больны 46 хронической почечной недостаточностью, и находились на гемодиализе по крайней мере в течение одного года. Данные, полученные в этом исследования, подчеркивают проблему низкой позитивности результатов исследования анти-ВГС у лиц с повышенным риском гемоконтактного заражения [Zer Y. et al., 2009 ]. В то же время при определении частоты позитивности на наличие РНК ВГС образцов с низким отношением S/Co в исследовании, предпринятом Sayan M. С соавт., ни в одном образце с отношением S/Co ниже, чем 3.8, РНК HCV не была обнаружена. Авторы работы сделали вывод о том, что для подтверждения ВГС-инфицирования в образцах с низким S/Co и/или с неопределенными результатами исследования анти-ВГС, находящимися в «серой зоне», до тестирования образцов на РНК ВГС более обоснованным и экономически доступным является исследование тех же образцов тестирование образцов в других тест-системах в иммуноблотах, или повторное для ИФА планшетного формата, или исследование новой пробы [Sayan M. et al., 2006]. В ряде случаев при сомнительных данных о наличии анти-ВГС крови и даже при отсутствии анти-ВГС в скрининговом тесте в крови потенциальных доноров выявляли РНК ВГС. При этом в последнем случае позитивный результат на РНК был ассоциирован с минимальным уровнем анти-NS4 антител, определяемых только в иммуноблоте. Авторы исследования сделали вывод о том, что использование метода ПЦР с различной детекцией продуктов реакции в массовом скрининге донорской крови на наличие РНК ВГС может сопровождаться появлением как ложнонегативных, так и ложнопозитивных результатов, и, как следствие, требует проведения дополнительных исследований с помощью сертифицированных тест-систем [Малышев B. C. и др., 2000]. При оценке результатов серологического исследования нельзя не учитывать появившиеся в последнее время данные о существовании т.н. скрытой (occult) ВГСинфекции − серологически молчащей, с отсутствием РНК в сыворотке крови и анти-ВГСнегативной, иногда с повышенным уровнем трансаминаз, впервые описанной в 2004 г. [Pham T. N. Q. et al., 2004]. В настоящее время распространение и клиническая значимость скрытой ВГС-инфекции активно исследуются. Кроме т.н. «золотого стандарта» диагностики ГС − выявления РНК ВГС при биопсии печени, − используются менее инвазивные методы: выявление РНК ВГС в мононуклеарах периферической крови [Zaghloul H., El-Sherbiny W., 2010] и/или в образцах сыворотки крови, подвергшихся ультрацентрифугированию, выявление анти-Core в диагностических некоммерческих системах с повышенной чувствительностью. Комбинация этих методов приводит к 90% выявлению скрытого ГС, ранее диагностированному при биопсии печени [Carreðo V. et al., 2012]. В последние годы изучается возможность диагностики скрытого ГС по состоянию клеточного иммунного 47 ответа на ВГС-антигены [Veerapu N.S. et al., 2011], в частности, у серонегативных сексуальных партнеров пациентов лиц с высоким риском трансмиссивного заражения (сексуальным, профессиональным и внутрисемейным), а также сексуальных партнеров лиц с ХГС. По повышенному уровню продукции γ-интерферона и интерлейкина-4 в ответ на пептиды ВГС и вследствие обнаружения у 4 из 31 сексуальных партнеров лиц с ХГС в мононуклеарах периферической крови РНК ВГС в виде «+» или «–» (репликативной) цепи Roque-Cuellar M.C. и соавт. сделали вывод о развитии специфического клеточного иммунного ответа, и, следовательно, о выявлении скрытой ВГС-инфекции у серонегативных, авиремических сексуальных партнеров пациентов с ХГС [Roque-Cuellar M.C. et al., 2011]. В последнее время все большее внимание исследователи уделяют возможностям диагностики скрытой ВГС-инфекции по реактивности к иммунодоминантным эпитопам Core-белка, которые обнаруживаются при проведении динамических исследований. Так, из 145 пациентов со скрытой ВГС-инфекцией (по результатам биопсии печени) у 45 пациентов были обнаружены IgG анти-Core; у одного из них в течение времени наблюдения анти-ВГС исчезли. Из 31 пациента с негативным результатом тестирования IgG анти-Core у 14 пациентов за время наблюдения произошла сероконверсия, которая у 10 пациентов оказалась транзиторной. Таким образом, у 40,7% пациентов со скрытой ВГС-инфекцией в какой-либо момент анализа обнаруживалась IgG анти-Core реактивность, в том числе у 14 изначально не реактивных пациентов. В дополнительном тестировании в иммуноблоте 16 образцов сыворотки крови слабо реагировали с линией Core-пептида ВГС (неопределенный результат), из них в 10 образцах (62,5%) в ИФА определялись IgG анти-Core. У пациентов со скрытой ВГС-инфекцией, позитивных на наличие IgG анти-Core, чаще обнаруживалось некротическое воспаление печени и РНК ВГС- позитивные гепатоциты, чем у IgG анти-Coreнегативных пациентов [Quiroga J.A. et al., 1996; Quiroga J.A. et al., 2007]. При изучении влияния скрытой ВГС-инфекции на течение различных заболеваний получены следующие данные. У больных хроническим гепатитом В (ХГВ) без РНК ВГС и анти-ВГС в сыворотке крови в 40% образцов печени (в 21 из 52) была обнаружена РНК ВГС, что свидетельствовало о наличии у пациентов скрытой ВГС-инфекции. У пациентов с ХГВ и скрытой ВГС-инфекцией чаще, чем у негативных по РНК ВГС пациентов, обнаруживался фиброз печени и степень его была значительно выше. Полученные данные заставляют предположить, что скрытая ВГС-инфекция оказывает существенное влияние на клиническое течение ВГВ-инфекции [Castillo I. et al., 2013]. Скрытый (occult) гепатит С может быть выявлен у ВИЧ-инфицированных людей, особенно при тяжелом иммунодефиците и высокой репликации ВИЧ, при этом ВГСинфекция, которая развивается без образования антител, рассматривается как фактор, 48 способствующий прогрессированию ВИЧ-инфекции. При своевременной диагностике, проведенной с использованием ПЦР, возможно обеспечить раннее начало терапии сочетанной инфекции, что оказывает существенное влияния на продолжительность жизни и ее качество у этой категории детей и взрослых людей [Иноятова Ф.И. и др., 2011; Nastouli E. et al., 2009]. По-видимому, этот вывод справедлив в отношении и других групп пациентов с проблемами диагностики ВГС-инфекции. Появление новых и совершенствование имеющихся молекулярно-генетических диагностических систем и использование нанотехнологий обуславливают дальнейшее изучение возможностей подтверждения или опровержения наличия ВГС-инфекции с помощью сочетания серологических, генетических и клеточных исследований. 1.6. Молекулярная мимикрия антигенов ВГС с белками других микроорганизмов и человека как причина появления аутореактивности и ложной позитивности. Патологические продукты иммунной системы при хроническом гепатите С Позитивные результаты определения иммунореактивности Т- или В-клеток человека к антигенам ВГС могут быть обусловлены не только контактом иммунной системы человека с данным вирусом, но и, возможно, наличием молекулярной мимикрии между антигенами ВГС и других микроорганизмов, а также аутоантигенами человека. Косвенным свидетельством того, что ложнопозитивные результаты определения анти-ВГС могут быть обусловлены наличием иной вирусной инфекции, является повышенная частота у данных пациентов цитомегаловирусной и герпесвирусной инфекции, обнаруженных у 88,1% человек с позитивным результатом определения анти-ВГС в первичной скрининговой тест-системе и негативным − в подтверждающей тест-системе [Элбакян Р.М. и др., 2003]. В экспериментах in vitro c иммунокомпетентными клетками людей и в экспериментах in vivo на животных была установлена перекрестная реактивность цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ CD8+) людей, не инфицированных ВГС, к одному из Т-эпитопов белка NS3 ВГС (пептиду CVNGVCWTV) и к нейраминидазе вируса гриппа А (НА). У белков NS3 ВГС и нейраминидазного пептида вируса гриппа обнаружилась высокая степень гомологии первичной последовательности, оба белка распознавались ЦТЛ CD8+ со сходной аффинностью. При использовании трансгенных HLA-A2-мышей было прямо продемонстрировано, что ВГС-специфические Т-клетки могут быть индуцированы in vivo вирусом гриппа. При этом эффекторные клетки зараженных гриппом мышей проявляли функциональную активность ЦТЛ в полном объеме: распознавали белок NS3 ВГС, 49 лизировали покрытые им клетки-мишени и продуцировали γ-интерферон. Эти результаты являются подтверждением того, что ответ организма хозяина на внедрение инфекционного агента находится под влиянием кросс-реактивных клеток памяти, индуцированных предшествующей экспозицией с гетерологичным вирусом [Wedemeyer H. et al., 2001]. Вопрос о том, насколько ВГС-специфический ответ отражает наличие иннапарантной или (само)излеченной ВГС-инфекции, а не является результатом мимикрии антигенов [Rivière Y. et al., 2012], относится не только к Т-клеточному, но также к В-клеточному иммунному ответу – продукции антител к ВГС. Подробно механизм возникновения ложно-позитивной реакции и возможной роли аутоантител проанализирован среди доноров крови с выявлением анти-ВГС в низких титрах, которое часто сочетается с шистоcомозом. Из 2400 египетских доноров крови 192 человека (8%) были позитивны по анти-ВГС в ИФА; из них в соответствии с показателями оптической плотности у 96 человек результаты выявления анти-ВГС были слабопозитивными (КП≤2), и у 96 − высокопозитивными (коэффициент позитивности пробы был равен и более 2). В обеих группах проводили количественное определение Core-антигена ВГС (HCVcAg), определяли функцию печени (уровни альбумина, АЛТ, АСТ) и антитела к Schistosoma mansoni (анти-Sm) IgG. В группе слабопозитивных проб HCVcAg отсутствовал, функциональные тесты печени находились в пределах нормы, в 44 случаях выявляли анти-Sm. У всех лиц в группе слабопозитивных проб определяли аутоиммунные маркеры (ANA, AMA, SMA и LKM). Полученные при обследовании доноров крови результаты показали, что варианты выявления слабопозитивных анти-ВГС часто являются ложнопозитивными, вызванными Sm-индуцированными аутоантителами [Agha S. et al., 2006]. Кроме молекулярной мимикрии с антигенами других болезнетворных микроорганизмов, описано сходство антигенных детерминант структурных и неструктурных антигенов ВГС с антигенами человека, которое ведет к модификации иммунного ответа. Показано, что антигенное и структурное сходство N-терминального участка Е2 и вариабельных доменов иммуноглобулина человека (Ig) ведет к тому, что Е2 распознается антителами к IgG человека. Степень сходства HVR1 с Ig разных типов коррелировала с ускользанием от экспериментально иммунного ответа инфицированных и персистированием шимпанзе. Авторы вируса у исследования человека и высказали предположение об особой роли критического уровня молекулярной мимикрии Ig в биологии ВГС-инфекции, которая не только способствует ускользанию вируса от иммунного ответа, но и объясняет зависимость заболевания от факторов организма-хозяина [Hu Y.W. et al., 2005]. Кроме белка Е2, кандидатами на роль структур, мимикрирующих с антитенами человека, являются белки Core, NS3 и NS5. У всех этих белков обнаружены антигенные 50 детерминанты, сходные с эпитопами цитохрома P450 2D6. В частности, была показана гомология первичной последовательности пептида, являющегося частью белка Core ВГС (а.о. 178-187), и цитохрома P450 2D6, причем индуцированные пептидом ВГС CD8+ ЦТЛ приобретают кросс-реактивность к эпитопам цитохрома человека P450 2D6, т.е. становятся аутореактивными [Kammer A.R. et al., 1999 ]. На основании высокой частоты выявления серологических маркеров аутоиммунитета предполагается, что еще одним механизмом, участвующим в повреждении печени при ХГС, является антителозависимая клеточная цитотоксичность, которая, по-видимому, также частично обусловлена молекулярной мимикрией В-эпитопов белков вируса и цитохрома P450 2D6. Методом иммунопреципитации была обнаружена кросс-реактивность между антигенными детерминантами белков NS3 и NS5a ВГС и антигенной детерминантой в районе последовательности а.о. 254-288 региону молекулы цитохрома цитохрома P4502D6. Показано, что к данному образуются аутоантитела LKM1 (печень/почки микросомальные антитела I типа), которые обнаруживаются у 80% больных аутоиммунным гепатитом 2 типа и 5% больных ХГС [Marceau G. et al., 2005]. В иммунопатогенезе поражения печени остается спорной и требует дальнейшего изучения роль антител к GORэпитопу (GRRGQKAKSNPNRPL) − до настоящего времени не идентифицированного белка ядра гепатоцитов человека, перекрестно реагирующих с Сore-протеином (а.о. 5-19) ВГС. Реактивность к эпитопу GOR обнаруживалась у 22% лиц с ОГС, которые были анти-ВГСнегативными, но РНК ВГС- позитивными. Наличие перекрестной реактивности между антителами к GOR-протеину человека и к Core-протеину ВГС J.A. Quiroga с соавторами предложили использовать в качестве чрезвычайно чувствительного дополнительного метода выявления скрытой (occult) ВГС-инфекции. Было обнаружено, что сыворотка крови 20% пациентов со скрытой ВГС-инфекцией (в том числе в отсутствии позитивных результатов выявления антител к ВГС) реагирует с аутоэпитопами GOR в ИФА, хотя частота реактивных к GOR образцов сыворотки крови ниже, чем среди пациентов с хроническим ГС. Авторы предположили, что скрининг на анти-GOR IgG может быть полезен для выявления скрытой ВГС-инфекции у РНК-негативных пациентов без проведения биопсии печени [Quiroga J.A. et al., 1996; Quiroga J.A. et al., 2007]. При ВГС-инфекции нередко обнаруживается ряд органоспецифических антител, возникающих вследствие молукулярной мимикрии, в частности, к тромбоцитам. что позволяет предполагать аутоиммунный механизм в основе некоторых внепеченочных поражений [Zhang W. et al., 1994; Zhang W. et al., 2009]. Механизму молекулярной мимикрии между антигенными структурами вируса и эпитопами клеток хозяина отводят основную роль в индукции вирусом гепатита С 51 аутоиммунных патологий. В то же время известно, что срыв толерантности к собственным антигенам возможен при воздействии других инфекционных агентов, лекарственных средств и при различных заболеваниях. Известно, что при развития лекарственного гепатита возникают аутоантитела, направленные к печеночному цитохрому Р450s, а при недостаточности коры надпочечников − антитела, направленные к аутоэпитопам Р450с21 (ферменту 21-гидроксилазе). Нельзя исключить, что аутоантитела, возникшие при ряде заболеваний и обладающие кросс-реактивностью с анти-ВГС, могут быть причиной ложноположительного результата при определении антител к ВГС. В комплекс иммунных нарушений, характерных для ХГС, который развивается с активацией В-лимфоцитов постоянно образующимися новыми вариантами вируса, кроме продукции аутоантител, входит умеренное увеличение концентрации сывороточных иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA, IgE, Ig (κ), Ig (λ), наличие циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и смешанных криоглобулинов, основным компонентом которых является ревматоидный фактор (РФ). Ревматоидный фактор (РФ) представлен аутоантителами, реагирующими с Fc фрагментом человеческого или животного IgG и относящимися ко всем классам иммуноглобулинов [Дунаева Н.В., Эсауленко Е.В., 2011]. РФ синтезируется плазматическими клетками синовиальных оболочек и из суставов попадает в кровь. При ГС герминативные центры из пролиферирующих, активированных, дифференцированных Вклеток формируются в печени и могут быть вероятными источниками РФ [Murakami J. et al., 1999; Newkirk M. M., 2002]. В популяции здоровых людей доля лиц с РФ в крови составляет от 1,3−4% до 30% (у североамериканских индейцев) [Husby G. Et al., 1988]. Частота IgM в составе РФ увеличивается, а частота IgG снижается с возрастом [Van Schaardenburg D. et al., 1993]. РФ обнаруживается в сыворотке крови 12 − 70% лиц с ХГС, по данным различных авторов [Дунаева Н.В. и др., 2007; Pawlotsky, J.-M. et al., 1994; Vigani A.G. et al., 2011]. РФ часто является одним из основных компонентов смешанных криоглобулинов − белков с аномальной температурной растворимостью, роль которых в патогенезе различных заболеваний, в том числе ГС, описана в многочисленных исследованиях и монографиях [Константинова Н.А., 1999]. Вторым компонентом комплекса являются IgG, в том числе антитела к различным протеинам ВГС. В основном РФ при ХГС является иммуноглобулином класса М, направленным против IgG. Однако РФ может быть представлен и изотипами IgА и IgG [Toubi E. et al., 2003]. M. Galli было обнаружено, что среди больных с клиническими проявлениями криоглобулинемии доминировали женщины средних лет и старше − так называемые 52 носители ВГС, инфицированные спорадически, т.е. без установления точного пути, у которых не было клинических и биохимических признаков ГС, а также гепатита В и С в анамнезе [Galli M., 1995]. Образование комплексов РФ с IgG, соединенными с вирусными частицами, в состав которых входит РНК ВГС, приводит к снижению концентрации РНК, вплоть до определения РНК ВГС только в составе комплексов [de Maddalena C. et al., 1995]. Возможно, связывание с РФ приводит к снижению концентрации не только РНК, но и антител к белкам ВГС в крови, что в некоторых случаях затрудняет выявление данных маркеров инфекции. Подобный феномен маскировки антител был описан для циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), которые также вносят вклад в развитие внепеченочных осложнений ВГС. Так, Troisi C.L. и Hollinger F.B. предположили, что в некоторых случаях у РНКпозитивных пациентов антитела к вирусу не обнаруживаются вследствие того, что находятся в связанном состоянии в составе ЦИК. При диссоциировании ЦИК, выделенных от девяти РНК-позитивных, анти-ВГС-негативных пациентов с ХГС в трех случаях обнаруживались анти-ВГС, не обнаруживаемые в рутинной процедуре иммуноферментного определения антител. В отличие от пациентов с ХГС, диссоциирование ЦИК, полученных от больных ОГС, не привело к выявлению анти-ВГС, по-видимому, вследствии не произшедшей сероконверсии. [Troisi C.L., Hollinger F.B., 1997]. Изучение анти-ВГС класса IgG показало, что в состав ЦИК способны входить антитела различной специфичности. В 100% ЦИК обнаруживались комплексы анти-NS3 с ссответствующим антигеном, в 87-90% в образовании ЦИК участвовали антител класса IgG к антигенам Cоrе и соответствующий антиген. Участие в образовании специфических ЦИК анти-NS4 было менее выраженным; практически полностью отсутствовали иммунные комплексы, построенные на основе антител к NS5 белкам. Важными оказались результаты исследований уровня специфических анти-ВГС в составе ЦИК на различных сроках наблюдения. Одновременное увеличение в составе ЦИК и снижение в сыворотке крови анти-Cоrе IgG было связано авторами исследования с быстрым переходом специфических IgG антител в состав ЦИК вплоть до полного исчезновения их из крови, возможно, вследствии повышения аффинности антител [Хаертынова И.М. и др., 2012; Баширова Д.К. и др., 2005]. На сегодняшний день отсутствуют прямые доказательства противовирусного действия анти-ВГС IgG антител. Однако значительное увеличение уровня ЦИК, содержащих в высоких концентрациях специфические антитела, косвенно свидетельствует о таких возможностях. Возможно, ЦИК снижают уровень виремии с помощью агрегации вирусов, приводя их к дальнейшему повреждению системой комплемента или путем фагоцитоза. Ревматоидный фактор, образуя комплексы с анти-ВГС IgG, в некоторой степени может 53 способствовать удалению избыточного количества антител. По-видимому, повышение концентрации РФ и/или ЦИК может быть причиной колебаний содержания антител к вирусу в крови. Таким образом, современные исследования биологии ВГС и патогенеза вызываемой им инфекции показывают, что для ВГС характерно выраженное и своеобразное взаимодействие с иммунной системой хозяина. Основными особенностями этого взаимодействия, обусловливающими в свою очередь своеобразие течения и клинических проявлений инфекции, являются: выраженная способность ВГС избегать и модулировать иммунный ответ хозяина; высокая (как ни при какой другой инфекции) частота продукции ревматоидного фактора, представляющего основу смешанных криоглобулинов, ЦИК, различных неорганоспецифических и некоторых органоспецифических аутоантител. Большинство этих процессов, по данным литературы, влияет на появление и исчезновение маркеров инфекции, и, следовательно, на возможность их определения. Спонтанное излечение от ВГС-инфекции, по мнению Tarr A.W. c соавт., ассоциировано не только с эффективностью приобретенного организмом хозяина иммунитета к ВГС, включающего продукцию ВГС-специфических Т-клеток и нейтрализующих антител, но и растворимых факторов врожденного иммунитета, в частности, компонентов комплемента, белков коллектинов и фиколинов [Tarr A.W. et al., 2012]. Известно, что система врожденного иммунитета, составными частями которой являются белки острой фазы воспаления, обеспечивает первую линию защиты от инфекций, вызывая воспаление и участвуя в формировании адаптивного иммунитета. Роль этих факторов как в защите от ВГС-инфекции, так и в качестве маркеров, свидетельствующих о наличии инфекции при бессимптомном скрытом течении, требует дальнейшего изучения. 1.7. Диагностическое значение неспецифических маркеров воспаления печени при ВГС-инфекции Для диагностики и мониторинга состояния больных гепатитом С активно используют измерение сывороточной активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), которая находится в цитоплазме печеночных клеток и поступает в кровь при их повреждении [NIH, 2002; NIH, 2002a; Байкова И.Е. и др., 2007]. При остром гепатите С активность АЛТ может быть повышена до 400 Ед/л и более [Daniels D. et al., 2009]. Аспарагинаминотрансфераза (АСТ) также является маркером поражения печени, однако она не специфична, поэтому при повышении ее концентрации в сыворотке необходимо исключать внепеченочные факторы. Измерение активности обеих трансаминаз является полезным при наблюдении пациентов с 54 ГС, так как повышение соотношения АСТ/АЛТ свидетельствует о прогрессировании болезни [Di Bisceglie A., 1995]. В некоторых группах пациентов увеличение активности АЛТ при ХГС выше нормы не наблюдается, например, среди пациентов, находящихся на гемодиализе. Для этих пациентов характерно относительное увеличение активности АЛТ: у пациентов с анти-ВГС отношение активности АЛТ к активности АЛТ «нормы» равно 0,77, а у пациентов без анти-ВГС – 0,38 [Lopes E.P. et al., 2006]. В большинстве случаев хронический ГС сопровождается повышением сывороточной активности АЛТ [Tateyama M. et al., 2011], но примерно у 30% больных она остается нормальной даже при наличии в крови IgM анти-Core – маркеров активной репликации вируса [Martinelli A.L. et al., 1996]. Ранее даже при выявлении в крови РНК ВГС состояние пациентов при нормальном уровне трансаминаз рассматривалось как «здоровое носительство» [Майер К.-П., 1999]. В настоящее время накопилось значительное количество сведений о том, что сывороточная активность АЛТ не отражает гистологические изменения в ткани печени, а ее нормальный уровень не всегда соответствует «здоровью» [Puoti C., 2003]. Проблема использования АЛТ для оценки состояния пациента с ВГС-инфекцией связана со способами определения ее активности, основным из которых является флюорометрический метод. Поскольку определяется не абсолютное количество фермента, на точность результатов оказывают влияние различные факторы, включая температуру, концентрацию субстрата и коферментов, ионный состав буфера, условия забора и хранения образцов. В связи с этим результаты измерения уровня АЛТ отличаются в разных лабораториях, также как и критерии «нормы» в разных исследованиях. Данные о широте границ «нормы» приведены в обзоре Zeuzem S. с соав. [Zeuzem S et al., 2006]: от 30 до 72 Ед/л. По-видимому, во многом широта интервала «нормы» могла быть обусловлена включением в выборку «здоровых» доноров людей со скрытыми заболеваниями печени, в том числе хроническим гепатитом С. Так, у пациентов с латентными формами вирусных ГВ и ГС активность ферментов незначительно выходит за пределы нормы и составляет: АЛТ – 65-68 Ед/л, АСТ – 52-58 Ед/л. Авторы исследования сделали аналогичный с предыдущей работой вывод: при оценке результатов надо использовать не известные из справочной литературы нормальные значения, а сопоставлять их с контрольными данными, характерными для данного региона и возрастной группы. Поскольку у больных с латентными формами вирусных гепатитов в 10% случаев специфические маркеры инфекции могут не выявляться, при количестве АЛТ>70 Ед/л и АСТ>60 Ед/л и щелочной фосфатазы 101-105 Ед/л пациенты для установления окончательного диагноза должны обследоваться на специфические маркеры ежемесячно в течение полугода [Москалев А. В., Астапенко П.В, 2009]. При периодических обследованиях примерно у 50% больных могут быть выявлены эпизоды увеличения сывороточной 55 активности АЛТ от некоторого превышения верхней границы нормы до 10-кратного [Martinot-Peignoux M. et al., 2001; Zeuzem S. et al., 2006]. При обследовании жителей Аляски, инфицированных ВГС, было обнаружено, что из 208 человек, в крови которых постоянно обнаруживается РНК вируса, у 13 человек уровень АЛТ был постоянно нормальным, у 121 человека − постоянно повышенным, а у 74 − флуктуирующим. Статистических различий между этими группами по полу, возрасту, длительности заболевания, склонности к рискованному поведению, уровню РНК в крови и генотипу вируса не было [Bruce M.G. et al., 2006]. При оценке значимости активности АЛТ для выявления ВГС-инфекции было обнаружено, что в крови потенциальных доноров крови РНК ВГС выявляли в ряде случаев при сомнительных данных о наличии анти-ВГС крови и даже при отсутствии анти-ВГС в скрининговом тесте [Caspari G. et al., 1997]. В последнем случае выявление РНК было ассоциировано с минимальным уровнем анти-NS4 антител, определяемых только в иммуноблоте. Повышение активности трансаминаз в сыворотке крови во время отвода донора было только у 12% доноров [Малышев B.C. и др., 2000]. Сходные результаты были получены при исследовании методом ПЦР проб сыворотки крови потенциальных доноров, не содержащих анти-ВГС: 24 пробы из 119421 (0,02%) содержали РНК ВГС. Нормальный уровень трансаминаз был у 16 из них, а у 8 других в крови был зарегистрирован повышенный уровень активности АЛТ [Тарасенко О.А и др., 2011]. При хронической ВГС-инфекции часто отмечают повышенные уровни гаммаглютамилтрансферазы (транспептидазы) (ГГТ) в сыворотке крови. При определении связи между активностью ГГТ и клиническими, биохимическими и гистологическими особенностями у больных ХГС было обнаружено, что повышенный уровень активности ГГТ свидетельствует о тяжелом поражении печени и наблюдается при высокой концентрации АЛТ, 3 и 4 степени воспалительной активности, 3 и 4 стадии фиброза [Silva I.S. et al., 2004]. Исходя из представленных сведений, информативность определения активности ферментов АЛТ, АСТ, ГГТ для уточнения диагноза в случае неопределенных результатов исследования анти-ВГС вызывает сомнения. Кроме ферментопатий, для ГС и вызванных им осложнений характерен подъем сывороточной концентрации альфа-фетопротеина (АФП) – гликозилированного белка с многообразными биологическими функциями. Определение концентрации АФП в настоящее время проводится с помощью ИФА [Решетников С.С., 2005]. В первую очередь измерение сывороточного уровня АФП имеет значение для мониторинга беременности. В эмбриональном развитии АФП играет важную роль в регуляции роста и дифференцировки тканей плода, в защите плода и матери от встречной атаки иммунных систем и в транспорте ряда биологически активных веществ [Абелев Г.И., 1989]. В эмбриогенезе АФП 56 синтезируется клетками висцеральной эндодермы желточного мешка (до 10 недели беременности), а к концу первого триместра беременности − гепатоцитами плода человека. В организм матери АФП поступает двумя путями: сначала − через амниотическую жидкость, а после формирования маточно-плацентарного кровотока − из крови плода. В течение физиологической беременности современные методы определения концентрации АФП позволяют регистрировать достоверное изменение уровня АФП плода в крови матери лишь с 14-15 недели беременности, то есть с момента завершения плацентации. Многочисленные данные свидетельствуют о наличии корреляции уровня в крови матери АФП (как повышения, так и понижения) с состоянием плода матери [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003]. Пренатальный скрининг генетических и соматических аномалий развития плода по уровню АФП в крови беременных женщин в РФ проводится согласно приказу МЗ РФ №457 от 28.12.2000 г. «О совершенствовании пренатальной диагностики в профилактике наследственных и врожденных заболеваний у детей» на сроке 16–20 недель. В качестве точки отсчета в АФП–скрининге используется статистический показатель – медиана, а для определения границ нормы вычисляется величина MOM (от англ. multiply of median − кратность медиане), которая составляет от 2,0 MOM и 0,5 MOM [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003]. Важно подчеркнуть, что при массовом АФП-скрининге уровень эмбрионального протеина бывает повышенным у 5-7,5% женщин, но из этой группы открытый дефект нервной трубки выявляется лишь в 2,5% случаев [Ариас Ф., 1989]. Диагностическое значение определения АФП в материнской крови, не связанное с аномалиями развития плода, продемонстрировано на обширном материале [Kraus T.G. et al., 2001; Waller D.K. et al., 1996]. В литературе приводятся сведения о нормальной концентрации АФП в сыворотке крови женщин на сроке беременности 15 недель, которая составляет около 29 МЕ/мл, при этом отмечено, что в разных регионах и в разных группах населения пределы зоны риска и медиальные величины уровня АФП в крови матери могут несколько отличаться [Решетников С.С., 2005]. В конце первого триместра беременности, по данным литературы, концентрация АФП составляет 12,9 мкг/л [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003]. Причиной отклонения АФП могут быть разные патологические состояния как со стороны плода, так и со стороны матери, в том числе инфицированность матери ВГС. В крови здоровых людей (кроме беременных женщин) концентрация АФП не превышает 10 мкг/мл [Молдогазиева Н.Т., Терентьев А.А., 2006.; Hu K.Q. et al., 2004], в среднем составляет менее 5 нг/мл [El-Bassiouny A.E. et al., 2007; Резников Ю.П., 2007; Окунев Д.Ю., 2001]. Полагают, что фоновая концентрация АФП может быть обусловлена репаративными физиологическими процессами в организме, в том числе с пролиферацией клеток, а активация синтеза АФП при онкозаболеваниях частично связывается с включением 57 аналогичных гомеостатических механизмов защитно-регуляторного характера [Trojan J. et al., 1989; Корыстов Ю.Н., 1994]. Основной вклад в увеличение сывороточной концентрации АФП при онкозаболеваниях, однако, вносят сами малигнизированные клетки, продуцирующие АФП. Наиболее важное значение исследование АФП имеет при наблюдении за больными, инфицированными ВГС, для развитии ГЦК выявления малигнизации при [El-Bassiouny A.E. et al., 2007]. Корреляция высокого уровня АФП с неблагоприятным прогнозом ХГС объясняется усилением под влиянием АФП клеточной пролиферации и ангиогенеза, а также снижением уровня апоптоза, что препятствует гибели малигнизированных клеток в инфицированной ВГС печени [Mitsuhashi N. et al., 2008]. Критическим значением для диагноза ГЦК является концентрация АФП 50 нг/мл [Cedrone A. et al., 2000]. Данные литературы свидетельствуют о том, что подъем концентрации АФП, наблюдающийся при ГЦК, развивается на протяжении хронического ГС, но не характерен для острого ГС [Pardo M. et al., 2007 ]. Рост сывороточной концентрации АФП наблюдается главным образом при прогрессировании фиброза печени, вызванного ВГС-инфекцией [Bruce M.G. et al., 2008]. El-Bassiouny с соавт. представили следующие сведения относительно концентрации АФП: в контрольной группе здоровых людей она равна 3.39±2.9 МЕ/мл, в группе больных хроническим гепатитом С без цирроза была увеличена до 9.36±13.6 МЕ/мл, в группе больных хроническим гепатитом С с циррозом − до 10.41±15.6 МЕ/мл, у больных ГЦК и ХГС − до 25.04±27.9 МЕ/мл [El-Bassiouny A.E. et al., 2007]. В исследовании Chen T.M. и соавт. средняя концентрация АФП у больных ХГС без ГЦК была равна 18.5 ± 63.0 нг/мл, а интервал концентрации составлял 1.3 – 676.0 нг/мл [Chen T.M. et al., 2007]. При лечении больных ХГС обнаружено, что высокая сывороточная концентрация АФП является предиктором отсутствия устойчивого вирусологического ответа [Males S. et al., 2007]. Представленные в литературе сведения о неспецифических маркерах гепатита С указывают на то, что высокоточное определение АФП методом ИФА позволяет провести дифференциальную диагностику острого и хронического ГС, оценить степень прогрессирования фиброза печени, вызванного ГС, выявить такое осложнение ГС, как ГЦК. Сведения о концентрации АФП при неопределенном результате исследования наличия специфических маркеров ВГС-инфекции в литературе практически отсутствуют. Существенная особенность гепатитов, в том числе ГС, заключена в том, что органоммишенью является печень, занимающая ключевые позиции в поддержании гомеостаза и реализации специфического острофазового ответа. В связи с этим особый интерес вызывает определение роли С-реактивного белка (СРБ) как гепатоспецифического острофазового белка, синтез которого происходит в печени под влиянием ИЛ-6 и других цитокинов. Множество исследований свидетельствуют о том, что этот белок, определяющийся в 58 сыворотке крови при различных воспалительных и некротических процессах, имеет большое прогностическое значение при инфекционных процессах и мониторинге эффективности антимикробного лечения [Peltola H.O., 1982]. В настоящее время установлено, что главной функцией СРБ у млекопитающих является иммунорегуляторная функция, охватывающая реакции преципитации, агглютинации, фагоцитоза и связывания комплемента, а также непосредственное связывание лигандов в полисахаридах микроорганизмов и их элиминацию. Референтные пределы СРБ в сыворотке крови зависят от региона, группы и метода исследования: от 5 мг/л до 12 мг/л [Kindmark C.-O., 1972; Руководство по клинической лабораторной диагностике …, 1982; Клиническое руководство …, 2003; Кишкун А.А., 2006; Камышников В.С., 2008; Villegas R. et al., 2012]. Повышение концентрации СРБ в крови начинается в течение первых 4 − 6 час. от момента тканевого повреждениях [Клиническое руководство …, 2003]. Содержание СРБ при воспалительном процессе может повышаться в 10000 раз [Khan S. et al., 2011]. В литературе имеются лишь единичные данные о роли СРБ в защитных реакциях организма при вирусных заболеваниях, в частности, при вирусных гепатитах. В работе И.З. Каримова с соавт. [Каримов И.З. и др., 2004] представлены данные о клиническом значении определения СРБ и других белков острой фазы для мониторинга больных с острым гепатитом А и В. У больных острым гепатитом уровень СРБ был повышен в 10-15 раз по сравнению с группой здоровых лиц. У больных с низкими значениями СРБ продолжительность пребывания в стационаре была большей и выздоровление наступало позже, чем у больных с высокими уровнями СРБ. В работе S. Khan с соавт. наблюдался повышенный уровень СРБ у больных ХГС и ХГВ по сравнению с контрольной группой, но корреляций с вирусной нагрузкой не было [Khan S. et al., 2011]. Вопрос о том, насколько синтез СРБ связан с прогрессированием ГС, остается неясным. К белкам острой фазы воспаления, кроме СРБ, относятся белки, большинство из которых входит в группу α-глобулинов при электрофоретическом разделении. Концентрация их возрастает в остром периоде многих заболеваний, а также при активировании хронических процессов (при воспалении в результате инфекции, аллергии, ревматизме, или деструкции тканей при ожогах или травмах, злокачественных опухолях). Уменьшение относительного содержания α-глобулинов может быть связано с угнетением их синтеза в печени на ранних стадиях гепатита [Руководство по клинической …, 1982]. Основным компонентом фракции α1-глобулинов является α1-антитрипсин − белок с антипротеазной активностью [Руководство по клинической …, 1982; Клиническое руководство… 2003]. Прогностическая роль α1-антитрипсина (снижение его концентрации) установлена при гепатоцеллюлярной карциноме. По мнению Elzouki A.N. и Eriksson S., риск 59 развития цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы не зависит от наличия в анамнезе гепатита В или C, а связан с дефицитом α1-антитрипсина у лиц, гомозиготных по генетическому дефекту в 14 хромосоме, а именно с мутацией, названной PiZZ. Наличие вирусного гепатита С или В рассматривается авторами как дополнительный к генетическому дефекту фактор развития цирроза или ГЦК [Elzouki A.N., Eriksson S., 1996]. В исследованиях последних лет, посвященных исследованию биомаркеров воспаления при ХГС, показано, что у этих пациентов наблюдается снижение уровня кислого α1-гликопротеина, С3 (фракция β-глобулинов) и гаптоглобина (фракция α2-глобулинов), но увеличение уровня α1-антитрипсина и ферритина; концентрация СРБ была без изменения. Однако при гепатите, сопровождающемся некрозом клеток печени, уровень СРБ понижается, а при прогрессирующем фиброзе − понижается уровень α1-антитрипсина [Atta M. et al., 2012]. Аналогичные данные о диспротеинемиях при ХГС были получены Cheung K.J. с соавт. при определении протеинового профиля в сыворотке крови больных на разных стадиях фиброза (METAVIR F0-F4) с помощью электрофореза в геле. Концентрация некоторых белков, например, α2-макроглобулина, α -1B-гликопротеина увеличивалась на поздних стадиях (F4) по сравнению с ранними (F0-F1); концентрация других, в частности, α1-антитрипсина, α2-гликопротеина уменьшалась [Cheung K.J. et al., 2009]. Таким образом, гепатит С и его осложнения сопровождаются определенными изменением уровня биомаркеров воспаления (белков острой фазы СРБ и α1-глобулинов) и репарации (АФП). Можно предполагать, что определение концентрации биомаркеров может быть полезным не только для оценки степени воспалительной реакции при ВГС, но и для оценки вероятности наличия заболевания печени у лиц с противоречивыми результатами определения специфических маркеров ГС. В доступной нам литературе сведений об изменении концентрации этих маркеров и, в целом, белковых фракций крови в случае противоречивых реакций при исследовании анти-ВГС мы не обнаружили. 1.8. Различные стратегии и алгоритмы скрининга на наличие маркеров вирусного гепатита С. Сравнительные эпидемиологические и экономические аспекты лабораторного скрининга маркеров гепатита С и ВИЧ-инфекции Скрининг (от англ. «screening» ––– «отбор, сортировка, просеивание») – система первичного обследования клинически бессимптомных лиц с целью выявления не распознанных ранее случаев заболевания. Целью большинства скрининговых программ является выделение групп риска развития определенной патологии на доклиническом этапе среди пациентов, считающих себя здоровыми, снижение смертности и улучшение качества 60 жизни пациентов. Однако социальные последствия таких скрининговых программ зависят от качества проводимых исследований, поскольку результаты скрининга часто сопровождаются гипердиагностикой, неоправданным медицинским вмешательством, социальной дискриминацией лиц с ранним лабораторным диагнозом и негативным психологическим воздействием на пациента результатов скринингового теста. Медработники, которые проводят первичный скрининг, и назначившие исследования врачи нередко сталкиваются с необходимостью принятия сложных решений о правильной интерпретации результатов [Флетчер Р. и др., 1998]. Наиболее массовый лабораторный скрининг в России, который проводится в течение последних 20 лет, направлен на выявление антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) [Об организации службы …, 1989; Мазус И.А. и др., 2010]. Сравнение значимости для здравоохранения ВИЧ-инфекции и хронического ГС проводится во многих странах. С использованием данных официальной статистики и метода обратного вычисления во Франции проведено прогнозирование смертности от ВГС- и ВИЧ-инфекции с учетом современных терапевтических подходов. Представленные модели позволяют предположить, что ежегодная смертность, связанная с ВГС-инфекцией, будет расти и достигнет во Франции 4500 случаев к 2022 г. (против 1000 в 1998 г., т.е. увеличится в 4,5 раза за 30 лет). Напротив, количество смертельных исходов от СПИДа стало уменьшаться с 1997 г., в связи с чем расходы органов здравоохранения, направленные на лечение ВГС-инфекции, вероятно, будут возрастать, в то время как значение ВИЧ-инфекции, учитывая довольно широкое распространение эффективных терапевтических способов, может снижаться [Deuffic-Burban S. et al., 2004]. По-видимому, представленные модели характерны для большинства стран с развитой системой терапевтической помощи больным ВИЧ-инфекцией, в том числе и для России [Ольшанский А. Я. и др., 2010]. У лабораторной диагностики вирусного гепатита С (ГС) имеется много общего с диагностикой ВИЧ-инфекции. Первичным скрининговым маркером как ВИЧ-инфекции, так и инфекции, вызываемой вирусом гепатита С (ВГС) являются антитела, к которым в последнее время было добавлено выявление антигенов. Каждое из данных заболеваний длительно протекает без клинических проявлений; биохимические и гематологические сдвиги нарастают постепенно; последствия имеют летальный характер. Большими, чем для ВИЧ-инфекции, проблемами для гепатита С являются отсутствие эффективных средств профилактики и лечения заболевания, что придает особое значение выявлению при массовом скрининге лиц, инфицированных ВГС, для прерывания пути передачи возбудителя. Эффективность скрининга на маркеры ВИЧ-инфекции в настоящее время не вызывает сомнений. Широкие показания к тестированию на ВИЧ по приказу Минздрава СССР от 61 10.04.1989 г. и отсутствие строго соблюдаемого требования добровольности обследования пациентов способствовали тому, что практически все пациенты, обращающиеся за медицинской помощью в лечебно-профилактические учреждения (ЛПУ) г.Москвы по разным поводам, обследовались на ВИЧ. Успехи в разработке антиретровирусных препаратов привели к выводу о том, что раннее выявление инфекции может способствовать не только отказу от рискованного поведения и к предупреждению заражения окружающих, но и к своевременному назначению антиретровирусной терапии с увеличением продолжительности и качества жизни [Ольшанский А.Я. и др., 2010]. В отличие от массовой стратегии обследования на ВИЧ в СССР (а затем в Российской Федерации), в США и в Европе до 2006 г. скрининг на ВИЧ проводился только в группах лиц высокого эпидемиологического риска. В настоящее время к этим группам в большинстве европейских стран относят мигрантов и этнических меньшинств (Alvarez-Del Arco D. et al., 2013). Опубликование результатов клинико-экономических исследований, свидетельствующих о целесообразности расширенного лабораторного скрининга на ВИЧ пациентов лечебных учреждений, привело к введению новых рекомендаций в США и в Европе. Согласно эим рекомендациям, скрининг на ВИЧ должен быть включен в общее соглашение об оказании медицинской помощи, основанное на принципе «opt-out» − пациент обследуется, если он был проинформирован и не отказался [Branson B.M. et al., 2006]. В отношении необходимости массового скрининга на маркеры ВГС-инфекции в разных странах имеются различные точки зрения. Так, в США ГС считается наиболее распространенной инфекцией с парентеральным механизмом передачи: распространенность ГС среди городских жителей в 1999 г. составляла 1,8%. Необходимость профилактики и контроля распространенности ГС привели к разработке и внедрению «Руководства по выполнению исследований на наличие антител к вирусу гепатита С», согласно которому мероприятия должны быть направлены не только на снижение частоты передачи вирусов в группах высокого риска инфицирования, но и на раннее выявление лиц с хроническим гепатитом С. При отсутствии такого контроля большинство людей с хроническим ГС могут не подозревать о том, что они инфицированы, поскольку острая фаза заболевания протекает обычно малосимптомно, однако они могут быть источником заражения других лиц [Williams I., 1999]. Вследствие системного характера заболевания обследование пациентов на наличие ВГС-инфекции может быть полезным при обращении по разнообразным поводам. Так, одним из наиболее частых внепеченочных проявлений ГС являются артропатии, поэтому пациентов с нетипичным хроническим воспалительным артритом неясной этиологии необходимо обследовать на наличие ВГС, так как раннее выявление инфекции влияет на выбор медикаментозной терапии [Kemmer N.M., Sherman K.E., 2010]. 62 Цель скрининга на маркеры ВГС-инфекции была определена CDC USA: 1) клиническая диагностика в среде пациентов с симптомами заболеваний печени, 2) слежение за профессиональными и перинатальными рисками заражения, 3)скрининг бессимптомных носителей для выявления людей, зараженных ВГС, которые должны получить медицинскую оценку состояния здоровья, рекомендации и помощь. По определению CDC, в США результаты определения анти-ВГС используются также для того, чтобы органы здравоохранения могли контролировать инцидентность и распространенность, а также направлять и оценивать усилия по предотвращению распространения ВГС [Alter M.J. et al., 2003]. В Москве массовый скрининг населения на анти-ВГС − маркеры социальнозначимого инфекционного заболевания − проводится более 15 лет. Контингенты обследуемых лиц по приказам Департамента Здравоохранения, Центра Госсанэпиднадзора г.Москвы и Управления Роспотребнадзора по г. Москве за эти годы несколько изменялись [Об организации мероприятий…, 1996; О мерах по совершенствованию эпиднадзора…, 2008]. Особая значимость обследования на маркеры гепатита С доноров крови для предотвращения заражения при гемотрансфузиях обуславливает постоянную разработку и совершенствование положений и правил проведения исследований этого контингента, которые включают также динамическое наблюдение и подробный сбор информации о донорах [Шубина Ю.Ф, 2009.]. При массовом скрининге прочих контингентов (с разным риском инфицирования) значимой проблемой является отсутствие доступной лабораторному работнику клинической информации о пациенте, особенно если он обследуется впервые. В настоящее время в большинстве европейских стран, так же как и в США, отсутствует единая стратегия скрининга на ВГС. Только в нескольких странах выполняется обследование в популяциях с высокой распространенностью ВГС. Но даже в этих случаях рекомендации по исследованию и медицинская практика чрезвычайно гетерогенны. Эволюция алгоритма исследования анти-ВГС в России, как и во всем мире, определяется успехами в разработке диагностических тест-систем. Так, до 2002 г. положительный результат исследования в скрининге обязательно проверялся путем перестановки анализа в двух параллельных пробах. Если хотя бы одна из этих двух проб данной сыворотки/плазмы снова оказывалась положительной, образец считали первично-положительным [Ястребова О.И., 2003; Ястребова О.И., 2003а]. Для подтверждения наличия анти-ВГС в пробах использовали в основном иммуноблот RIBA HCV SIA (Recombinant ImmunoBlot Strip ImmunoAssay) [Медицинская лабораторная диагностика…, 2001]. После разработки и сертифицирования российских подтверждающих иммуноферментных тест-систем 63 планшетного формата с раздельной сорбцией структурных и неструктурных антигенов ВГС был утвержден двухэтапный алгоритм скрининга: пробы, положительные при исследовании в планшетах с общей сорбцией антигенов на дне одной лунки, следует дополнительно и следовать в диагностических наборах для ИФА планшетного формата с раздельной сорбцией структурных и неструктурных антигенов ВГС [О совершенствовании медицинской помощи …, 2000]. При использовании контрольных панелей было показано, что около 10 лет назад ИФТС российских производителей характеризовались низкой чувствительностью, особенно в отношении ранних сероконверсий (от 16,7% до 87,5%), вследствие чего на ранней стадии инфекции при развитии гуморального ответа только к одному антигену (например, c33c), результат мог быть ложноотрицательным. В то же время постановка диагноза ВГС-инфекции при обнаружении антител только к одному антигену вируса также могла быть ошибочной, поскольку специфичность тест-систем для иммуноферментного анализа не превышала 59,387%. Кроме того, отсутствовала корреляция между чувствительностью диагностических систем при выявлении антител в серийных разведениях проб, исходно содержащих антиВГС в высоких титрах, и антител в исходно низкопозитивных образцах [Медицинская лабораторная диагностика…, 2001; Bondarenko I.G. et al., 1999]. Интерпретация результатов определения анти-ВГС с низкой позитивной оптической плотностью в ИФА до настоящего времени является одной из наиболее значимых и нерешенных проблем во всем мире [Le Page A.K. et al., 2013]. В проспективных исследованиях установлено, что в группе потенциальных доноров крови с неопределенным результатом исследования анти-ВГС были как лица с ложнопозитивной неспецифической реакцией, так и лица, инфицированные ВГС [Piro L et al., 2008]. Для снижения риска трансфузионно-трансмиссивной передачи гепатита С и, с другой стороны, для предотвращения излишней выбраковки гемопродукции, был разработан рациональный алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов в соответствии с современными достижениями в области лабораторных исследований [Шубина Ю.Ф., 2009]. Этот алгоритм включает этапы повторного серологического контроля через 1-3 месяца крови доноров с неопределенными или сомнительными результатами скринингового лабораторного исследования на наличие антиВГС и тестирования крови доноров на наличие РНК ВГС. Новый алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови представлен на рисунке 1.4. На представленной схеме на первом этапе исследования каждый образец сыворотки крови доноров исследуется в дублях на наличие анти-ВГС методом ИФА (первая постановка ИФА). По результатам, полученным на 1 этапе, выбирается дальнейший ход анализа. Все серонегативные на анти-ВГС образцы на втором этапе анализа направляются на РНК- 64 тестирование, а все образцы, положительные на наличие анти-ВГС и со значениями оптической плотности в границах 20% («серая зона») повторно исследуются на анти-ВГС методом ИФА. ИФА 1-ая постановка Образец Оптическая плотность «Серая зона» anti-HCV - ИФА 2-ая постановка anti-HCV + ПЦР anti-HCV + / + +/- anti-HCV - Подтверждающий тест Здоровый донор Оптическая плотность «Серая зона» Сероконтроль через 1 месяц Карантинизация плазмы Отрицательный Абсолютный брак продукции Неопределенный Положительный Клиническое обследование Рис. 1.4. Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови (по Шубиной Ю.Ф., 2009). 65 При широком охвате пациентов различных ЛПУ дополнительные сложности лабораторной диагностики вирусного ГС связаны с тем, что в контингентах с различным риском инфицирования соотношение лиц с неспецифической и с истинной реактивностью значительно отличается, что было продемонстрировано в американском Руководстве по лабораторному тестированию и представлению результата исследования антител к вирусу гепатита С [Alter M.J. et al., 2003]. По рекомендации Центра по контролю заболеваний (CDC) США, человек может быть определен как носитель серологических маркеров ВГС-инфекции только после того, как позитивные результаты в скрининговом тесте были подтверждены в более специфическом анти-ВГС тесте или посредством выявления РНК ВГС. В качестве тест-систем для скрининга FDA лицензировал 2 иммуноферментных теста: Abbott HCV EIA 2.0 (Abbott Laboratoris) и Ortho HCV Version 3.0 ELISA (Ortho Clinical Diagnostics), а также один хемилюминесцентный иммунотест (ХЛТ; Vitros Anti-HCV assay, Ortho Clinical Diagnostics). В качестве дополнительного анти-ВГС теста в США лицензирован только иммуноблот RIBA HCV 3.0 (Chiron Corporation), в котором использованы рекомбинантные антигены и синтетические пептиды. В двух лицензированных ПЦР-тестах порог определения РНК ВГС составляет примерно 50 Ед/мл; при этом отрицательный результат в ПЦР требуется дополнять исследованием анти-ВГС в RIBA. Для проб с низкой позитивной оптической плотностью в ИФА или низкой позитивной величиной хемилюминесцентного сигнала в ХЛТ характерны ложнопозитивные результаты, которые наиболее часто встречаются в популяции с низким, менее 10%, распространением ВГС-инфекции [Alter M.J. et al., 2003]. Вследствие высокой стоимости дополнительных подтверждающих исследований CDC ввел ограничение по величине сигнала в скрининге: необходимо подтверждать исследование проб с отношением оптической плотности пробы к критической оптической плотности (Sample to Cut off, S/CO) в ИФА менее 3,8; для ХЛТ величина S/CO, при которой пробы надо исследовать дополнительно в RIBA, равна 8. Общий алгоритм исследования представлен на рисунке. 1.5. 66 Рис. 1.5. Лабораторный алгоритм тестирования анти-ВГС [Alter M.J. et al., 2003]. * Интерпретация скринингового теста, основанная на критериях, предложенных производителем теста ↑ Отношение Signal-to-cut-off (S/co) § Результаты, позитивные в скрининге, были классифицированы как высокопозитивные, если отношение S/co было равно или выше S/co позитивного результата теста 95% исследованной популяции; результаты скрининга были низкопозитивными, если отношение S/co было ниже этого уровня ¶ Рекомбинантный иммуноблот Зависимость выбора алгоритма от цели исследования была продемонстрирована в работе Chapko M.K. и соавт. (2005 г.). При оценке эффективности девяти различных стратегий тестирования на наличие хронического гепатита было выделено 2 лучших стратегии: 1) ИФА, за которым следует ПЦР («ИФА → ПЦР»), и 2) ИФА, по результатам которого выделены 3 уровня оптической плотности (высокая позитивная, низкая 67 позитивная, негативная); в случае низкой позитивной оптической плотности в ИФА необходимо повторить исследование в RIBA, а затем провести ПЦР для определения РНК ВГС во всех позитивных в RIBA образцах («ИФА → RIBA → ПЦР»). Стратегия «ИФА→ПЦР» имеет равную со стратегией «ИФА → RIBA → ПЦР» чувствительность при определении вирусной нагрузки, немного более низкую стоимость, немного более высокую чувствительность при определении анти-ВГС, но намного более низкую специфичность по сравнению со стратегией «ИФАОП→ RIBA → ПЦР». Был сделан вывод о том, что при распространении в тестируемой группе анти-ВГС менее 20% лучшей стратегией выбора является последовательность: ИФА → RIBA → ПЦР. При увеличении распространения анти-ВГС в исследуемой группе выбор алгоритма «ИФА → RIBA → ПЦР» или «ИФА → ПЦР» будет зависеть от сравнительной важности в некоторой степени альтернативных задач скрининга: избежать ложную позитивность при определении анти-ВГС или пропустить действительное присутствие анти-ВГС [Chapko M.K. et al., 2005]. В исследовании Singer M.E. и соавт. было проведено сравнение по стоимости трех различных стратегий скрининга среди бессимптомного взрослого населения США: 1) первичный скрининг на наличие анти-ВГС с использованием ИФТС 3-го поколения с последующим подтверждением наличия ВГС-инфекции по наличию РНК ВГС у анти-ВГСпозитивных пациентов с помощью ПЦР; 2) начальный скрининг на гепатит С посредством исследования РНК ВГС в ПЦР; 3) стратегия, которая являлась доминантной в США в 2000 г. – отсутствие скрининга на маркеры ГС среди взрослого бессимптомного населения. Было показано, что в данном контингенте первая стратегия является экономически оправданной только в том случае, если по крайней мере половина пациентов с обнаруженной ВГСинфекцией приступает к лечению, или при ежегодном увеличении случаев цирроза печени более чем на 2,5%. Скрининг с использованием только ПЦР оказался неэффективным. Несмотря на то, что модель «отсутствие скрининга» оказалась наиболее чувствительной к снижению качества жизни, связанному с осведомлением пациента о наличии ВГС-инфекции, в представленном исследовании не была поддержана точка зрения о необходимости широкого скринирования на ГС взрослого бессимптомного населения с умеренным риском инфицирования [Singer M.E., 2001]. Скрининг беременных женщин с низким риском инфицирования на бессимптомный ГС также был признан нерентабельным [Plunkett B.A., Grobman W.A., 2005], несмотря на то, что вертикальная передача ГС является основным путем заражения новорожденных. К контингентам с высоким риском инфицирования относятся пациенты, находящиеся на гемодиализе. Во Франции была отмечена значительная разнородность стратегий скринирования на маркеры гепатита С сыворотки крови лиц данной группы. Доминирующей 68 стратегией является исследование крови реципиента в ИФТС с подтверждением наличия ВГС-инфекции с помощью ПЦР для обнаружения РНК. В ряде больниц и отделений сыворотка крови пациента исследуется в ИФТС с оценкой трансаминаз до и после переливания крови и ее продуктов. Был сделан вывод о том, что необходимы рекомендации по унифицированию скрининга, что поможет построить модель «затраты – эффективность скрининга» [Jusot J.F., Colin C., 2001]. Данные литературы, приведенные выше, свидетельствуют о том, что разработка стратегии и алгоритма массового скрининга на маркеры ГС является актуальной задачей мирового здравоохранения, которая может быть решена на основе сведений о значимости отдельных маркеров инфицирования, при рациональном использовании утвержденных методов исследования и изучении диагностических возможностей новых методов. 1.9. Контроль качества исследования антител к ВГС Контроль качества исследований сыворотки крови на наличие антител к вирусу гепатита С (ВГС) является чрезвычайно важной задачей из-за негативных социальных и материальных последствий, а, главное, последствий для здоровья людей в случае неверно выданного ответа. При интерпретации противоречивых результатов необходима уверенность в том, что в каждой из использованных ТС полученные данные воспроизводятся, что также повышает роль контроля качества исследований на наличие анти-ВГС. Проведение внутрилабораторного контроля качества (ВКК) регламентируется рядом нормативных документов Минздрава РФ, в которых подробно разработан порядок проведения количественных методов исследования [Об утверждении отраслевого стандарта …, 2003; ГОСТ Р 53133.3 – 2008, 2008]. Относительно проведения и показателей контроля качества неколичественных методов ИФА в литературе имеются немногочисленные сведения. Отмечено, что планшетный формат ИФА характеризуется существенной случайной ошибкой – CV = 8% [ГОСТ Р 51352-99, 1999]; эта ошибка, по мнению Шарковой В.Е. с соавт., достаточно велика, ее игнорирование, следствием которого является постановка анализа в монопликатах, может привести к неправильной трактовке результата в пробах с пограничным значением аналита [Шаркова В.Е. и др., 2007]. Специалистами ЗАО «ВекторБест» – одного из ведущих производителей диагностических наборов для ИФА, − была разработана Программа внешней оценки качества (ПВОК) лабораторных исследований, выполняемых методом ИФА, составной частью которой является контрольное задание по выявлению антител к ВГС. Из 177 лабораторий, принявших участие в ПВОК, только в 123 лабораториях (69,3%) образцы с КП от 1,2 до 1,7 были определены правильно – как анти- 69 ВГС-позитивные. Образцы с КП от 1,7 до 2,1 были определены правильно (как позитивные) только в 145 лабораториях (82,1%). В целом, только 78% лабораторий, регулярно принимавших участие в ПВОК, смогли правильно справиться с заданием. В анкете участника только 67 лабораторий из 177 (38%) указали, что в лаборатории регулярно используется материал внутрилабораторного контроля. Анализ отчетов по выполнению заданий показал, что правильность тестирования контрольной панели в лабораториях не зависел от используемой тест-системы (наименования, производителя, серии), а также типа применяемого промывателя планшет (вошера) и спектрофотометра для ИФА. У участников ПВОК, допустивших ошибки в определении проб контрольной панели, была отмечена как хорошая, так и неудовлетворительная воспроизводимость результатов анализа (соответственно в первом случае ошибка была систематической, во втором – случайной). Авторы исследования указали, что для оценки правильности исследований необходимо использовать аттестованные панели образцов, содержащих и не содержащих анти-ВГС [Ястребова О.Н. и др., 2006]. Проведение контроля качества неколичественного ИФА, который используется для выявления в скрининге антител к ВИЧ, описано в методических рекомендациях «Применение контрольных образцов для внутрилабораторного контроля качества скринингового ИФА на наличие антител к ВИЧ». В качестве контрольного показателя рекомендовано использовать только воспроизводимость результатов, «при этом в качестве измеряемой величины при проведении ВКК качественного ИФА выступает отношение оптической плотности контрольного образца к ОП критического значения, которое является постоянным для каждого контрольного образца» [Бобкова М.Р. и др., 2004]. В статье Нетесовой И.Г. и Бобковой М.Р. были приведены показатели сходимости и воспроизводимости результатов определения анти-ВГС и анти-ВИЧ в ИФА: CV сходимости был ниже 15%, а CV воспроизводимости ниже 19%. Эти значения были получены эмпирическим путем на основании анализа результатов выявления анти-ВГС лабораториями – участницами разных циклов ПВОК на наборах разных серий одного производителя. Авторами работы было предложено для оценки чувствительности качественного ИФА использовать контрольный образец с истинно положительным результатом, значение которого является достаточно низким (от одного до двух ОП кр.). Для оценки специфичности анализа авторы предложили использовать дополнительный контрольный образец с истинно отрицательным результатом [Нетесова И.Г., Бобкова М.Р., 2011]. При массовых исследованиях и измерении контрольного материала более одного раза за серию контрольную карту можно вести по методу Леви-Дженнингса (Шухарта) «по средним 70 значениям», то есть наносить на карту среднее значение измерений контрольного материала в серии [Качество клинических лабораторных исследований …, 2002]. Кроме рассмотренных выше, известны и прочие способы оценки качества лабораторных исследований, в том числе повторный анализ проб, уже исследованных ранее. В Приложении №2 к приказу Минздрава СССР от 23 апреля 1985 г. №545 «Методические указания по осуществлению контроля качества гематологических исследований» описан принцип метода, который состоит «в повторном исследовании нескольких случайно выбранных проб, число которых пропорционально количеству проводимых исследований. Сравнивая соответствующие пары результатов, получают объективные данные о качестве проведенных исследований. Метод повторных определений дает возможность оценить качество работы аппаратуры и лаборанта во время исследований. Метод может использоваться в любой лаборатории вне зависимости от количества производимых анализов» [Методические указания …, 1985]. Сведения по контролю качества массового скрининга проб сыворотки крови на наличие анти-ВГС в литературе практически отсутствуют, также как сведения о показателях контроля качества при автоматическом или полуавтоматическом проведении исследований. Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о том, что в последнее десятилетие в диагностике ГС в Российской Федерации достигнут значительный прогресс, который проявился, в частности, в активном выявлении и регистрации скрытых бессимптомных форм. Возможно, именно с улучшением диагностики скрытого ГС связано снижение доли лиц с ХВГНЭ в этиологической структуре лиц с вирусными гепатитами. Несомненно, успехи в выявлении лиц, инфицированных ВГС, связаны с введением массового скрининга анти-ВГС в крови пациентов, обращающихся за медицинской помощью в ЛПУ по разнообразным поводам. Несмотря на достигнутый прогресс, в лабораторной диагностике ГС существуют значительные проблемы. Выявление в сыворотке крови прямых маркеров инфекции – РНК и антигенов ВГС, – при развитии заболевания и распространения вируса по организму ограничено кратким начальным периодом. При латентном течении ВГС-инфекции виремия и соответствующие ей периоды появления в крови антигенов ВГС (как правило, в небольшом количестве), так же могут быть непродолжительными. Проблема серодиагностики ГС, связанная с малыми количествами антител к вирусу в крови, чрезвычайно актуальна, по данным литературы, на этапе первичного скрининга специфических маркеров ВГС-инфекции. Ложноотрицательные результаты могут быть связаны с особенностями сероконверсии и серореверсии при естественном протекании или 71 самопроизвольном разрешении ВГС-инфекции, а также в результате снижения количества анти-ВГС при интерферонотерапии (эффект при этом может быть временным, без достижения УВО); иммуносупрессирующим действием самого вируса и с недостаточностью иммунитета у лиц с гепатитом С при наличии других патологий, в первую очередь ВИЧинфекции и онкологических заболеваний. Кроме того, ложноотрицательные результаты определения анти-ВГС характерны для лиц с так называемым скрытым (occult) гепатитом С, а также при повышении в сыворотке крови концентрации патологических продуктов иммунной системы, например, ЦИК, содержащих в своем составе плохо диагностируемые антитела к ВГС. Источником ложно-положительных результатов скрининга на анти-ВГС могут быть, по литературным данным, также патологические продукты иммунной системы, например, парапротеины или РФ, появление которых вызвано иными этиологическими факторами. Кроме того, причиной ложно-положительных реакций может быть мимикрия антитенами ВГС антигенов других микроорганизмов и аутоантигенов человека, ведущая к образованию перекрестно-реагирующих антител. Сложности лабораторной диагностики ВГС-инфекции, по многочисленным данным литературы, связаны не только с билогическими особенностями ВГС и физиологическими реакциями на него организма человека, но и с ограничениями используемых диагностикумов и алгоритмов исследования. Ложноположительный результат скринингового тестирования на наличие анти-ВГС, возможно, не приведет к травмирующим диагностическим исследованиям (биопсии печени) и терапии с помощью современных лекарственных препаратов, которые имеют многочисленные тяжелые побочные эффекты, поскольку будет сопровождаться ПЦР для подтверждения наличия активной инфекции. Однако иной вред, который трудно измерить (статус больного социально-опасным заболеванием, беспокойство по поводу собственного здоровья и здоровья близких), безусловно, будет нанесен и приведет к ухудшению качества жизни пациентов, которым сообщили о позитивных (возможно, мало достоверных) результатах выявления антител к ВГС. Таким образом, на этапе массового скрининга антител к ВГС проявляются многочисленные проблемы, обусловленные первичной диагностикой заболевания по непрямому маркеру инфекции (т.е. зависимостью количества антител от состояния иммунной системы хозяина), биологией вируса, наличием антигенной мимикрии с белками человека и микроорганизмами, наличием различных путей передачи и соответственно разнородностью зараженных контингентов. Все вышесказанное обусловило необходимость проведения представленной работы. 72 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования по диагностике инфекции, вызванной вирусом гепатита С, проводили в 2001-2012 годах в КИЛ по диагностике ВИЧ-инфекции Государственного бюджетного учреждения здравоохранения г. Москвы «Московский научно-практический Центр дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения г. Москвы» (МНПЦДК ДЗМ). 2.1. Этапы исследования Исследование проводилось в несколько этапов. Первый этап посвящен анализу распространения антител к ВГС в контингентах пациентов лечебно-профилактических учреждений г.Москвы с разным риском гемоконтактного инфицирования на основе годовых отчетов результатов исследования анти-ВГС. Использовано 2 типа исследований: поперечное (одномоментное) исследование − определение количества случаев обнаружения анти-ВГС по группам пациентов за год наблюдений, и продольное исследование − динамическое наблюдение изменения распространения анти-ВГС в группе пациентов за 10 лет. Материалы представлены в главе 3. Второй этап исследования посвящен оценке эффективности методов контроля качества массового скрининга анти-ВГС. Результаты представлены в главе 4. На третьем этапе проводилось параллельное исследование одних и тех же образцов на наличие анти-ВГС несколькими методами, в нескольких диагностических системах. Результаты представлены в главе 5. На четвертом этапе для изучения проблемы интерпретации результатов массового скринина антител к ВГС проведены параллельные и ретроспективные исследования с использованием протоколов измерения оптической плотности сыворотки в ИФА, журналов регистрации и подтверждения условно-положительных результатов скрининга в конфирматорных иммуноферментных тест-системах, журналов исследования проб в иммуноблотах и отдельных историй болезни пациентов. Результаты представлены в главе 6. На пятом этапе проведено параллельное стратифицированное исследование, в котором пробы распределены в зависимости от возраста и пола пациентов в различные группы (страты). Результаты представлены в главе 7. На шестом этапе проведено параллельное и ретроспективное исследование наличия маркеров ГС несколькими методами. Результаты представлены в главе 8. 73 2.2. Пациенты В КИЛ по диагностике ВИЧ-инфекции МНПЦДК исследованы пробы сыворотки крови пациентов из 380 разнопрофильных ЛПУ (кроме инфекционных больниц и инфекционных отделений для взрослых, а также организаций службы крови), в частности, из 25 больниц, в том числе одной наркологической, 12 родильных домов, 20 женских консультаций, 23 филиалов МНПЦДК ДЗ г.Москвы, трех наркологических диспансеров, 172 поликлиник, 7 Домов ребенка, трех детских инфекционных больниц. Количество обследованных пациентов с разным риском заражения ВГС в различных ЛПУ в 2000-2011 гг., представлено на рис. 2.1. Количество пациентов различных ЛПУ, обследованных на анти-ВГС в 2000-2011 гг., представлено на рис. 2.1. количество обследованных лиц 700000 615731 626150 594272 538451 600000 498083 463373 412089 401079 500000 400000 300000 270921 234696 308947 334769 200000 100000 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 год Рис. 2.1. Количество пациентов различных ЛПУ, обследованных на наличие маркеров ВГСинфекции в 2000-2011 гг. В таблице 2.1 представлены сведения о количестве лиц из обследованных контингентов в 2006 и в 2011 гг. 74 Таблица 2.1 Контингенты и количество пациентов, обследованных на наличие анти-ВГС в МНПЦДК ДЗ г. Москвы в 2006 году и в 2011 г. № Количество обследованных лиц Контингент п/п 2006 г. 2011 г. 1 Пациенты ЛПУ без известных факторов риска заражения 290334 414497 2 Беременные женщины 80650 116424 3 Дети первого года жизни 519 585 4 Медицинский персонал отделений гемодиализа, пересадки почки, сердечно-сосудистой и легочной хирургии, гематологии; персонал клинико-диагностических, вирусологических лабораторий, хирургических, урологических, акушерскогинекологических, анестезиологических, реаниматологических, стоматологических, инфекционных, гастро-энтерологических стационаров, отделений и кабинетов поликлиник 5830 5769 Пациенты отделений с высоким риском заражения гепатитом с парентеральным путем передачи: центры, отделения гемодиализа, пересадки почки, сердечно-сосудистой и легочной хирургии, гематологии; больные, находящиеся на стационарном лечении свыше 6 месяцев в туберкулезных, онкологических, психоневрологических больницах 11755 13456 6 Больные с хроническими заболеваниями печени 33514 33210 7 Контингент наркологических диспансеров и больниц 24801 24328 8 Контингент кожно-венерологических диспансеров 15970 17881 9 Все обследованные лица 463373 626150 5 лечебных учреждений: Для решения поставленных в работе задач дополнительно проанализированы архивные материалы, относящиеся к исследованиям, в которых автор принимала непосредственное участие. С целью определения общего количества проб, низкопозитивных в первичном скрининге и в конфирматорных исследованиях, проведен анализ результатов исследования 6789 образцов на наличие анти-ВГС, положительных в первичном скрининге в IV квартале 2004 года. 75 Проведена оценка 2748 проб, исследованных в мае 2006 года. Определено количество положительных, отрицательных и неопределенных результатов исследования низкопозитивных проб, исследованных в иммуноблоте и диагностических наборах для ИФА планшетного формата с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенам ВГС. Для разработки оптимизированного алгоритма по архивным материалам (журналам регистрации результатов исследований) дополнительно проанализированы результаты исследования в массовом скрининге на присутствие анти-ВГС 4050 проб сыворотки крови пациентов ЛПУ с условно-положительными при первичном скрининге результатами, исследованных в ИФТС и иммуноблотах в ноябре 2012 года, и 3206 проб − в сентябре 2014 г. Для подтверждения наличия анти-ВГС у пациентов различных возрастных групп проанализированы результаты исследования 5351 проб, 4351 из которых получены от пациентов моложе 60 лет, а 1000 − от лиц старше 60 лет (данные за май 2003 года). В случае принадлежности пациента к группе с определенным фактором риска заражения гемоконтактными инфекциями указывали номер соответствующей группы, приведенный в таблице 2.1. Все прочие пациенты принадлежали к группе с невыявленными факторами риска заражения ВГС. Для изучения противоречивых результатов исследования, полученных в разных иммуноферментных системах планшетного формата и иммуноблотах, разрешенных к применению в Российской Федерации, исследованы пробы сыворотки крови 264 пациентов различных ЛПУ, в том числе 161 женщин и 103 мужчин, средний возраст 44,3±1,3 (здесь и далее M±m). Среди обследованных лиц были 23 беременных женщины, 1 ребенок первого года жизни, 11 медработников, 3 пациента с высоким риском гемоконтактного заражения, 12 пациентов с заболеваниями печени, 10 потребителей внутривенных наркотиков, 204 пациента кожно-венерологических диспансеров. Разработка алгоритма обследования пациентов (глава 5) проведена на основании исследования 117 проб пациентов (50 мужчин и 67 женщин). Средний возраст 50,5±1,9 (M±m). В исследование отобраны пробы сыворотки крови пациентов, не являющихся потребителями внутривенных наркотиков. В главе 6 при исследовании подтверждаемости наличия анти-ВГС в пробах пациентов из контингентов с разным риском гемоконтактногозаражения исследованы пробы 1333 пациентов. Из них обследованных по общим показаниям было 933 человека, 102 беременных женщины, 15 детей первогот года жизни, 25 медработников, 58 пациентов с высоким риском гемоконтактного заражения, 50 пациентов с заболеваниями печени, 38 потребителей внутривенных наркотиков, 112 пациентов кожно-венерологических диспансеров. При 76 исследовании проб сыворотки крови 15 детей первого года жизни с противоречивыми результатами в нескольких ИФТС в 5 случаях не выявлена инфицированность матери; в остальных случаях эпидрасследование провести не удалось. Все дети направлены на обследование в связи с предстоящим оперативным вмешательством; из 15 детей у двух были врожденные пороки развития (врожденная расщелина губы и неба). Исследовано наличие РНК в пробах сыворотки крови с неопределенными и противоречивыми результатами определения анти-ВГС, полученных от 50 пациентов из разных возрастных групп: 32 человека были старше 60 лет (средний возраст 74 ± 1,9), 18 человек − моложе 60 лет (средний возраст 29,6±3,84). В пробах пациентов старше 60 лет с положительными (3 женщины и 3 мужчины, средний возраст 69±2,9г.), ложноположительными (4 мужчины и 4 женщины, средний возраст 72,2±2,5г.) и отрицательными (5 мужчин и 6 женщин) результатами тестирования анти-ВГС проведено исследование наличия РНК ВГС, иммуноглобулинов, фракций сывороточных белков и ЦИК. Исследование влияния парапротеинов на результаты тестирования анти-ВГС проведены в 44 пробах сыворотки крови (22 мужчины и 22 женщины) на базе ФГБУ «Гематологический научный центр РАМН» Минздрава РФ. Ревматоидный фактор определяли в пробах сыворотки крови с положительными (33), отрицательными (77) и ложноположительными (30) результатами исследования анти-ВГС пожилых пациентов. Исследование концентрации С-реактивного белка проводили в полученных от пожилых пациентов пробах сыворотки крови с положительными (6), отрицательными (12) и ложноположительными (11) результатами исследования анти-ВГС. Концентрацию АФП определяли в 65 пробах сыворотки крови мужчин в возрасте от 17 до 60 лет (средний возраст 33,6 ± 12,9 года), в 56 образцах сыворотки крови женщин в первом триместре беременности (8-10 недель), в 88 образцах сыворотки крови пациентов старше 60 лет (возраст от 60 до 93 лет, средний возраст 74,0 ±6,5 лет). Наличие антител к ВГС класса G и класса М определяли в иммуночипах (71 образец сыворотки крови пациентов, из которых 30 пациентов были старше 60 лет), средний возраст в общей группе молодых и пожилых пациентов составил 51,9± 2,5 лет. Контрольными образцами являлись 60 проб сыворотки крови пациентов без анти-ВГС и 9 проб пациентов с анти-ВГС, направленными к нескольким антигенам ВГС (обнаружены в ИФА). 77 2.3. Материал исследования Для определения анти-ВГС использовались пробы сыворотки крови без признаков хилеза и гемолиза, приготовленные без использования ЭДТА и гепарина. До исследования пробы хранились при +4°С не более 72 часов. Отобранные для дополнительных исследований пробы аликвотировались и замораживались при -24°С; повторного замораживания-оттаивания проб не допускалось. Контрольные материалы внутрилабораторного контроля качества (ВЛКК): 1. «Внутрилабораторный контроль анти-ВГС» (лиофилизированные сыворотки) производства ЗАО «Вектор-Бест» (серии 8, 12 и 15); 2. Самостоятельно приготовленный слабоположительный контрольный материал (так называемый «домашний контроль», иначе «сливная сыворотка»), для получения которого использовали ряд образцов сыворотки крови с КП менее 3, присланные в лабораторию на исследование. Пробы объединяли в пул, полученную «сливную» сыворотку использовали в течение 8 часов, не замораживая, для контроля сходимости результатов, или разливали аликвотами по 0,5 мл, замораживали и хранили при -20С. Для контроля воспроизводимости результатов применяли образцы, подвергнутые однократному оттаиванию; 3. «Virotrol» («БиоРад»), с. 0500-А; 4. Панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВГС: А) «Контрольная панель сывороток, содержащих и не содержащих анти-HCV», с.4 (НПО» Диагностические системы» г.Н.Новгород); Б) «Контрольная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВГС», с.12 (ЗАО «Медико-биологический союз»); В) «Анти-ВГС-контрольная панель сывороток», с.1 (ЗАО «Вектор Бест»). 2.4. Методы исследования Твердофазный иммуноферментный анализ для определения анти-ВГС. Исследование наличия анти-ВГС в пробах сыворотки крови пациентов осуществлялось в диагностических системах, зарегистрированных в РФ. Использованы скрининговые иммуноферментные тест-системы (ИФТС): «РекомбиБест анти–ВГС тест» (ЗАО «ВекторБест», г.Новосибирск), «Гепаскрин» («Биосервис», г.Москва) и «Monolisa anti-HCV plus» («BioRad», Франция), три подтверждающие ИФТС с раздельным определение в двух лунках планшета анти-Core и анти-NS ВГС: «ВГС-ДСМ-подтверждающий тест» (ЗАО «Медикобиологический союз», г.Новосибирск), «РекомбиБест анти-ВГС подтверждающий тест» 78 (ЗАО «Вектор-Бест», г.Новосибирск) и «ИФА-анти-HCV-спектр-GM» (НПО «Диагностические системы», г.Н-.Новгород), и три ИФТС этих же производителей с раздельным определением 4 видов антител: анти-Core, анти- NS3, анти-NS, анти-NS5 ВГС. Раскапывание проб и внесение реагентов производилось вручную с помощью автоматических пипеток и диспенсеров фирмы «Biohit» (Финляндия), а также с помощью системы для автоматического пипетирования проб биологического происхождения «Freedom Evo Clinical». Промывка лунок планшета производилась с помощью автоматического промывателя фирмы «BioRad» PW40 (Франция). Оптическую плотность (ОП) образцов определяли с помощью ридера PR2100 «BioRad» (Франция). Расчеты по определению критической оптической плотности (ОП кр.) в системе для автоматического пипетирования проб биологического происхождения «Freedom Evo Clinical» производились в автоматическом режиме. Автоматическое проведение ИФА осуществлялось с помощью автоматического иммуноферментного анализатора «Freedom Evolyzer». Положительные в первичном скрининге пробы на наличие анти-ВГС, с общим определением антител к структурным и неструктурным антигенам ВГС, затем исследованы в соответствии с Приказом МЗ РФ №322 от 21.10.2002 года [О применении в практике здравоохранения…: приказ МЗ РФ №322 от 21.10.2002 г.] в диагностических системах для ИФА с раздельным определением антител к Core-антигену и к комплексу NS-антигенов для подтверждения в них наличия анти-ВГС. Значение коэффициента позитивности (КП) вычислялось как отношение величины ОП образца к величине ОП кр. Иммуноблоты. Референсные подтверждающие исследования проведены с использованием тест-систем для линейного иммуноферментного анализа (ЛИА) «INNO-LIA HCV Ab III update» («Innogenetics», Бельгия), «ЛИА ВГС» («Ниармедик плюс», г. Москва) и иммуноблота «RecomBlot HCV IgG 2.0» («Mikrogen», Германия). Для проведения исследований использовался «Profiblot 48» («Tecan»). процессор для автоматизации метода иммунного блота Учет результатов иммуноблота проводили с помощью компьютерной программы «LiRAS for Infectious Diseases v. 200» (Innogenetics N.V.,2003), которая позволяет автоматизировать процесс интерпретации результатов как позитивных и негативных, так и неопределенных. Хемилюминесцентный иммунный анализ на микрочастицах (ХИАМ) проведен с помощью диагностической системы «Architect Anti-HCV» на приборе «Architect i System» (Abbott Diagnostics, гематологического США) центра МЗ совместно РФ с сотрудником Овчинниковой Е.Н. ФГБУ Государственного Получаемая в результате 79 хемилюминесцентная реакция измеряется в относительных световых единицах (RLU). Между количеством анти-ВГС и RLU, измеряемых оптической системой Architect I System, существует прямая зависимость. Присутствие или отсутствие анти-ВГС в пробе определялось по соотношению хемилюминесцентного сигнала реакции в пробе («S» от англ. sample) к величине сигнала критического уровня (Cut off , Со), определяемой при калибровке теста (соотношение S/Со). ПЦР с детекцией продуктов реакции в геле и в режиме реального времени для определения наличия РНК ВГС в 132 образцах с противоречивыми и неопределенными результатами исследования анти-ВГС и в 40 пробах, содержащих анти-ВГС, проводилось совместно с сотрудниками ООО «Диасан» к.м.н. Ж.В. Евсегнеевой и Н.Ю. Сафроновой. При проведении качественной ПЦР для обратной транскрипции РНК ВГС и ПЦР-амплификации кДНК использованы тест-системы «Реверта» и «АмплиСенс-100-R для амплификации участка кДНК 240 п.н. вируса гепатита С» (пр-во ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) с заявленной чувствительностью 400 копий/мл. Детекцию продукта ПЦР проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, под УФсветом с длиной волны 310 нм, регистрацию результата проводили визуально после сканирования видеосистемой; данные сохраняли в виде файла на компьютере. ПЦР в режиме реального времени проводили с помощью прибора «АНК» (пр-во Института аналитического приборостроения РАН; МГТУ им.Н.Э.Баумана; ЗАО «Синтол» г. Москва). Пробоподготовка к ПЦР проведена с использованием пробоподготовки «GenePakTM Quantitative» комплекта реактивов для универсальной (НПФ «ГЕНТЕХ», Москва). Для проведения ПЦР на приборе «АНК» использован «Комплект реагентов для проведения обратной транскрипции РНК и ПЦР-амплификации кДНК вирусных гепатитов (HCV)» (пр-во НПФ «ДНК-технология», Москва). Кроме того, совместно с гематологический центр МЗ РФ) к.м.н. Т.А. Туполевой (ФГБУ Государственный проведено определение РНК ВГС в клиническом материале с использованием наборов реагентов «АмплиСенс HCV-FL», формат FRT, и «АмплиСенс HCV-Монитор-FRT» (гибридизационно-флуоресцентная детекция результатов в режиме реального времени, производство ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) на приборе Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия). В Real-Time PCR используются положительные, отрицательные и внутренние контрольные образцы (соответственно ПКО, ОКО и ВКО). При проведении исследования серии образцов ПКО и ОКО анализируются как отдельные пробы. Аликвота ВКО вносится в каждую анализируемую пробу и проходит все стадии анализа, включая пробоподготовку, что позволяет в каждой пробе оценивать потери выявляемой РНК 80 на стадии пробоподготовки, а также определить снижение эффективности за счет ингибиторов обратной транскрипции или ПЦР. При экстракции РНК из 200 мкл образца с помощью комплекта реагентов «Магно-сорб» аналитическая чувствительность составляла 50 МЕ/мл. Количественное определение концентрации иммуноглобулинов классов G, M, A проводили в пробах сыворотки крови людей старше 60 лет с отрицательными (11 проб), ложно-положительными (8 проб) и положительными (6 проб) результатами тестирования анти-ВГС. В 21 пробе сыворотки крови с γ-глобулинопатиями, выявленными методом электрофореза, определяли антитела к ВГС. Использовали метод радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле агарозы. Антисыворотку («Моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов человека» фирмы «ИмБио», Н.-Новгород, Россия) разводили до половины рабочего титра, установленного в предшествующих опытах, 0,12М раствором веронал-мединалового буфера, pH=8,56, и нагревали на водяной бане до +560С. Затем 2%ную агарозу тщательно смешивали с равным объемом подготовленной антисыворотки. Полученную смесь заливали на стеклянные пластины. На застывшем геле пробивали лунки, в которые вносили по 2 мкл исследуемых образцов. Пластины инкубировали во влажной камере при комнатной температуре в течение 18 часов. с применением моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов человека. После окончания инкубации гель отжимали под прессом, отмывали от несвязавшегося белка гипертоническим раствором хлорида натрия и окрашивали 0,1% раствором амидо-черного с последующей отмывкой фона 7% раствором уксусной кислоты. Для построения калибровочной кривой использовали стандартную сыворотку крови человека фирмы «ИнБио» (Россия) с известной концентрацией иммуноглобулинов. Определение концентрации белка в различных фракциях сыворотки крови (альбумина, α1-, α2-, β- и γ-глобулинов) проводили в 11 пробах с отрицательным, в 8 пробах с ложноположительным и в 6 пробах с положительным результатом тестирования анти-ВГС методом электрофореза в геле агарозы на системе «Beckman-Paragon», с использованием наборов «Gel Protein 100» фирмы «Cormay» (Польша), согласно инструкции фирмизготовителей. Электрофорез проводили по общему принципу. Образцы по трафарету наносили на платинку по 4,5 мкл и после их всасывания в гель (через 5 минут) пластинки помещали в камеру для электрофореза. Электрофорез проводили при напряжении 100V в течение 17 минут. После окончания электрофореза пластинки помещали в фиксирующий раствор на 15 минут, после чего их высушивали под струей горячего воздуха. Образцы сыворотки окрашивали в растворе красителя амидо-черного. Обесцвечивание фона проводили в растворе 5% уксусной кислоты. Оценку концентрации белка в различных 81 фракциях осуществляли методом денситометрии на аппарате «Appraise Densitometer System” (Beckman). Выявление циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в 11 пробах с отрицательным, в 8 пробах с ложно-положительным и в 6 пробах с положительным результатом тестирования анти-ВГС проводили осаждением в в 4.16% растворе полиэтиленгликоля [Rina I. et al., 1979] и последующим фотометрированием на автоматическом микропланшетном фотометре (ридере) «SUNRISE» (Tecan). Оптическую плотность (ОП) растворов измеряли в кюветах спектрофотометра при длине волны 340 нм. Уровень ЦИК выражали в условных единицах Е, где Е = ("ОП исследуемых проб" − "ОП контрольных проб") х 1000. Норма содержания ЦИК в крови человека при определении данным методом – до 55 МЕ/мл. Определение ревматоидного фактора проводилось двумя методами: с помощью диагностического набора для ИФА «ВектоРевматоидный фактор суммарный - стрип» (ЗАО «ВекторБест», Новосибирская обл., Россия) и с помощью теста для латексной агглютинации «Humatex RF» («Human», Германия) в полученных от пожилых пациентов пробах сыворотки крови с положительным (33), отрицательным (77) и ложно-положительным (30) результатом исследования анти-ВГС. Выявление С-реактивного белка в полученных от пожилых пациентов пробах сыворотки крови с положительными (6), отрицательными (12) и ложноположительными (11) результатами исследования анти-ВГС проводилось методом ИФА при использовании набора реагентов "СРБ—ИФА—Бест" (ЗАО «Вектор-Бест»). Сывороточную концентрацию α-фетопротеина (АФП) определяли методом твердофазного ИФА с помощью наборов реактивов «ИФА-АФП-Бест-400-стрип» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) в пробах сыворотки крови, полученных от мужчин моложе 60 лет (средний возраст 33,6 ± 1,7 года, 58 проб), женщин в первом триместре беременности (56 проб) и пожилых лиц (от 60 до 93 лет, средний возраст 74,0 ± 0,7 года, 82 пробы) с положительным, отрицательным и неопределенным результатом тестирования анти-ВГС. Определение авидности антител к ВГС (100 проб) проводилось с использованием набора реактивов «ДС-ИФА-АНТИ-HCV-Авидность» (НПО «Диагностические системы», Россия). Исследование наличия анти-ВГС проведено в экспериментальной серии иммуночипов – диагностических наборов, изготовленных в ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, − совместно с сотрудниками ФБУН ЦНИИЭ к.б.н. Т.А. Чекановой, к.б.н. М.Л. Маркеловым, м.н.с. Е.А. Пудовой, к.м.н. Г.А. Шипулиным. Исследована 71 проба, в которых в ИФА планшетного формата обнаруживались антитела, 82 направленные к одному или нескольким антигену ВГС. Положительную контрольную группу составляли 9 проб с высоким КП в первичном скрининге и в подтверждающих ИФТС. Отрицательную контрольную группу составляли 60 образцов с отрицательным результатом тестирования анти-ВГС в ИФА. Иммуночипы включали иммуносорбент (микроскопные слайды с иммобилизованными антигенами ВГС), раствор для разведения образцов, концентрат конъюгата, раствор для промывки иммуносорбента, положительный и отрицательные контрольные образцы. В пределах каждого эррея – ограниченной зоны на слайде для постановки одного клинического или контрольного образца, – были иммобилизованы антигены ВГС, относящиеся к генотипам 1b и 3a: Сore-3а; Сore-1b, NS3-3a, NS3-1b, m-p-100 (участок NS4), m-51-3a, m-51-1b, NS5-3a; NS5-1b. Каждому антигену соответствовал индивидуальный спот (пятно) в двух повторах. На одном микроскопном слайде формировали 12 индивидуальных эрреев. Дизайн иммуночипа представлен на рис. 2.2. Рис. 2.2. Схема иммуносорбента иммуночипа и пример его флуоресцентного изображения на канале Сy5 (Red), где 1 – споты, содержащие соответственно антиген NS3-3a, 2 – NS3-1b, 3 – c100p, 4 – m-51-3а, 5 – m-51-1b, 6 – NS3-3а, 7 – NS5-1b, 8 – Core-3a, 9 – Core-1b, 10 – сорбционный буфер, не содержащий антигены ВГС. Границы эррея – споты, содержащие бычий сывороточный альбумин, меченый флуорофорами Cy5 и Cy3. 83 Для исследования в иммуночипе 30 мкл сыворотки крови, разведенной в два раза раствором для разведения образцов, инкубировали в течение 1 часа в эрреях иммуносорбента с помощью термошейкера при температуре 37°С с режимом вращения платформы 500 об/мин. После инкубации слайды дважды промывали раствором для отмывки иммуносорбентов, вносили конъюгат в рабочем разведении и инкубировали в течение 30 мин. в термошейкере при температуре 37°С с режимом вращения платформы 500 об/мин. Конъюгат тест-системы представлял собой смесь двух конъюгатов: антител к IgG человека, меченых флуорофором Cy5, и антител к IgM человека, меченых флуорофором Сy3. После инкубации с конъюгатом слайды промывали дважды раствором для промывки иммуносорбента и однократно – дистиллированной водой, затем высушивали. Обработку результатов серологического анализа на иммуночипе проводили с помощью флуоресцентного сканера MarS (Ditabis, Германия) и вспомогательного программного обеспечения (ЦНИИЭ Роспотребнадзора); оценивали интенсивность сигнала флуоресценции соответствующих спотов (в местах локализации антигенов и внутренних контролей) и суммарного фона эррея. На канале Сy5/Red детектировали специфические иммуноглобулины класса G, на канале Cy3/Green − специфические иммуноглобулины класса M. Для каждого спота рассчитывали коэффициенты К как отношение абсолютного значения флуоресценции конкретного спота (за вычетом суммарного фона вокруг эррея) к фону. Значение критического уровня (cut off) для каждого из антигенов и контролей устанавливали путем умножения среднего значения К в эррее с внесенным контрольным отрицательным образцом тест-системы (К-) на два. Положительным результатом на наличие антител к определенному антигену в исследуемом образце считали те показатели, при которых средние значения К были выше соответствующего уровня cut off. В состав иммуносорбента иммуночипа входили 9 иммуногенных антигенов, которые относились к четырем группам антигенов ВГС: Core, NS3, NS4, NS5. Образец считали содержащим анти-ВГС (положительный результат), если средние значения коэффициентов К, соответствующие двум и более группам антигенов ВГС, превышали или были равны уровню cut off. Результат исследования образца считали неопределенным при выявлении положительного сигнала К только для одной группы антигенов. Образец считали не содержащим анти-ВГС (отрицательный результат), если значения иммобилизованных антигенов были меньше значения критического уровня. К для всех 84 Порядок проведения внешнего и внутрилабораторного контроля качества исследований. Внешний контроль исследований на наличие анти-ВГС включал решение контрольных задач с помощью контрольных панелей Федеральной системы внешней оценки качества ФСВОК, контрольных панелей международной системы VQC-anti-HCV «Acrometrix», контрольных панелей ЗАО «Вектор-Бест». ВЛКК исследований на наличие антител к ВГС включал ежедневное определение воспроизводимости и ежеквартальное определение сходимости результатов исследования, а также с 2007 года ежедневное ведение контрольных карт. Ежеквартально проводили решение контрольных задач с помощью контрольных панелей промышленного производства. При необходимости использовали метод повторных исследований в размере одного планшета (96 исследований). Для первичного определения антител к ВГС использованы тест-системы (ТС) «ИФАanti-HCV» (НПО «Диагностические системы», Н.-Новгород) и «РекомбиБест анти–ВГС тест» (ЗАО Вектор-Бест, Новосибирская обл., пос. Кольцово). Вычисляли среднее значение КП (КП ср.), среднеквадратическое отклонение (σ) и ошибку определения среднего (m). Сходимость результатов исследования определяли ежеквартально. На том же планшете, на котором проводилось исследование проб пациентов, в 20 лунок раскапывалась низкоположительная сыворотка, полученная при разведении положительной сыворотки, присланной в лабораторию на исследование. Воспроизводимость результатов исследования определяли, ежедневно внося материал ВЛКК на каждый планшет при каждой первичной скрининговой постановке. Воспроизводимость и сходимость результатов исследований выражали в виде коэффициента вариации (CV, %) результатов повторных измерений одной и той же пробы (сходимость) или одной серии контрольного материала (воспроизводимость). Оперативный контроль исследований проводили ежедневно с помощью контрольной карты. При массовом объеме исследовании на анти-ВГС использован метод ведения карты по «средним значениям». Серией считалось количество планшетов, в которые последовательно вносился исследуемый и контрольный материал вручную, с помощью автоматических пипеток, или с помощью системы для автоматического пипетирования проб «Freedom Evo Clinical» с последующим проведением исследований. По мере увеличения количества исследований (рис. 2.1) количество планшетов в серии изменялось от 9 до 12. Для учета результатов ВЛКК исследований на наличие анти-ВГС была разработана форма регистрации, в которой фиксировали: дату проведения анализа, тип применяемого контрольного материала; наименование и серию использованной ТС, смену операторов, проводившую исследование; ОП контроля; ОП кр.; коэффициент позитивности КП. 85 Внесение контрольного материала проводилось во все планшеты, затем вычислялось среднее значение КП, которое наносилось на карту. ВЛКК включал метод повторных исследований: ежеквартально повторно другим оператором проводилось исследование проб в объеме 1 планшета (88 проб плюс 8 контролей). Для разработки критериев отбора проб в дополнительное исследование нами использован подход достижения диагностического консенсуса, где в качестве критической точки для перепроверки результатов используется КП сыворотки в первичном скрининге [Suslov A.P. et al., 2002] с некоторыми изменениями. Пробы с КП в первичном скрининге менее 6 тестировали в нескольких ИФТС. Интегрально- отрицательным считали результат в тех случаях, когда: в одной скрининговой ИФТС результат был положительным, во второй (как правило, «Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2») − отрицательным; в одной из подтверждающих ИФТС результат был отрицательным, в другой (с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4 NS5) обнаруживалась реактивность только к одному антигену. Интегрально- положительным считали результат в тех случаях, когда результат был положительным в любых трех ИФТС, один или два скрининговых теста были положительными (КП => 1), один из подтверждающих тестов был положительным, в другой (с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4 NS5) обнаруживалась реактивность только к одному антигену. По результатам достижения диагностического консенсуса в общей группе (117 проб) выделены группы интегрально-отрицательных (инт-, 78 проб) и интегрально- положительных проб (инт+, 39 проб). Для проверки гипотезы о законе распределения инт+ и инт- групп использовали критерий согласия χ2. Поиск различий между группами проводили по двум статистическим критериям. Для сравнения дисперсий двух вариационных рядов использовали F-критерий Фишера. С целью проверки гипотезы о различии между средними двух генеральных совокупностей (интегрально-отрицательных и интегрально-положительных проб) использовали двухвыборочный z-тест для средних с известными дисперсиями. 2.5. Статистическая обработка материала проведена с помощью компьютерных программ MS Excel, «BioStatistica», «Statistica 6» и «Clinic» [Бенсман В.М., 2002]. Автоматическая обработка данных внутрилабораторного контроля качества проводилась с помощью программы «Altey Laboratory Quality Control», v.4.1 и v.4.2 (ЗАО «Алтэй»). 86 В работе использовались параметрические и непараметрические критерии. Сравнение выборочных средних осуществляли с помощью t-критерия. Сравнение дисперсий вариационных рядов проведено с помощью F-критерия Фишера. Для оценки различий между двумя независимыми выборками использовался U-критерий Манна-Уитни. Для проверки гипотезы о различии между средними двух генеральных совокупностей использовали двухвыборочный z-тест для средних с известными дисперсиями. Проверка гипотезы о законе распределения проводилась по критерию согласия χ2. Средние значения определяемых показателей приведены с величиной среднеквадратичного отклонения (M±σ) или со стандартной ошибкой средней величины (M±m). Для точечной оценки и определения уровня ее точности использовали среднюю величину и 95% доверительный интервал (диапазон значений в пределах ± 2m) [Ланг Т., 2005]. Для проверки различия концентрации АФП между группами использовали величину MOM (от англ. multiply of median), принятую в практике обследования беременных женщин, которая вычисляется как частное от деления величины медианы концентрации АФП в исследуемых группах на величину медианы в контрольной группе образцов [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003]. 87 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ГЛАВА 3. ЧАСТОТА И ДИНАМИКА РАСПРОСТРАНЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВГС СРЕДИ РАЗЛИЧНЫХ ГРУПП ПАЦИЕНТОВ ЛПУ Г. МОСКВЫ ПРИ МАССОВОМ СКРИНИНГЕ В 2000-2012 ГГ. Распространение в 2011 г. анти-ВГС в контингентах с разным риском инфицирования ВГС представлено на рис. 3.1. 27,31 25 20 4,44 9- все обследованные 3,96 8-пациенты МНПЦДК 7-пациенты наркоучреждений 4,04 6-пациенты с болезнями печени 4,22 3,91 * 5-пациенты с высоким риском заражения 4-медработники 0 1,31 5 2-беременные женщины 10 3,93 15 1-пациенты без факторов риска % положительных лиц в группе 30 группы Рис. 3.1. Распространение анти-ВГС в контингентах с разным риском инфицирования в 2011г. Показатели всех групп отличаются от показателя группы 2 (беременные женщины) при p<0,001. На рис. 3.1 не представлены результаты группы 3 − детей первого года жизни, матери которых были ВГС-инфицированными; в 2011 г. у обнаруживались анти-ВГС. 86,15% детей этой группы 88 Результаты исследования анти-ВГС в группах сравнивались с результатами в группе беременных женщин. Среди населения, обратившегося в ЛПУ общего профиля г.Москвы, в основном в поликлиники (группа 1 – лица с невыявленными факторами риска), которые составляли более половины всех обследованных лиц, частота обнаружения антител (4,44%) по сравнению с группой беременных женщин была повышена в 3,4 раза (p<0,001). Среди медицинского персонала ЛПУ г. Москвы в 2011 г. распространение анти-ВГС (обнаруживались у 3,91% лиц) превышало показатель группы беременных женщин в 2,9 раза (p<0,001). В контингенте больных с хроническими заболеваниями печени частота обнаружения антител к ВГС (4,04%) в 2011 г. в 3,1 превышала распространенность антиВГС в контрольной группе беременных женщин (p<0,001). В контингенте пациентов МНПЦДК (ранее − кожно-венерологических диспансеров) распространение анти-ВГС в 2011 г. (3,96%) было в 3 раза выше, чем в группе беременных женщин. Распространение маркеров ВГС среди пациентов наркологических учреждений г. Москвы (27,31%) превышало показатель в группе беременных женщин более чем в 20 раз (p<0,001). 27,31 28,44 30 25 20 5,7 3,96 4,44 9- все обследованные 5,25 8-пациенты МНПЦДК 7-пациенты наркоучреждений 3,73 4,04 4,22 2,72 3,91 4,95 5-пациенты с высоким риском заражения 6-пациенты с болезнями печени 0 4-медработники 1,66 1,31 5 2-беременные женщины 10 5,11 3,93 15 1-пациенты без факторов риска % положительных лиц в группе Результаты, полученные в 2011 г., были сопоставлены с данными 2006 г. (рис. 3.2). группы Рис. 3.2. Распространение анти-ВГС среди различных групп пациентов ЛПУ г.Москвы в 2006 г. (светлые столбики) и в 2011 г. (темные столбики). Отличие показателей в группах 5 и 7 при p<0,05, в остальных − при p<0,001. 89 Частота обнаружения антител среди населения, обратившегося в ЛПУ общего профиля г.Москвы, в основном в поликлиники (группа 1 – лица с невыявленными факторами риска), была выше в 2006 г. по сравнению с 2011 г.г. (p<0,001). Среди беременных женщин распространение анти-ВГС снизилось с 1,66% до 1,31% (p<0,001). Среди детей первого года жизни (в группу входили дети с высоким риском заражения и так называемые отказные дети) распространение анти-ВГС, напротив, повысилось с 66,86% в 2006 г. до 86,15% в 2011 г. (p<0,001). При изучении распространения анти-ВГС среди медицинского персонала было обнаружено, что средний показатель в данном контингенте в 2006 г. был ниже на 1,2% (p<0,001). Этот показатель в 2006 г. был выше, чем среди беременных женщин, в 1,6 раза, а не в 3 раза, как в 2011. Существенно, что в 2004 г. распространение анти-ВГС среди медперсонала (1,50%) тех же ЛПУ не превышало распространения анти-ВГС среди контрольной группы беременных женщин (1,53%). В контингенте пациентов отделений с высоким риском парентерального заражения распространение анти-ВГС в 2011 г. снизилось по сравнению с 2006 г. (p<0,05). В контингенте больных с хроническими заболеваниями печени частота обнаружения антител к ВГС в 2011 году была выше, чем в 2006 г. (p<0,001). В контингенте пациентов МНПЦДК распространение анти-ВГС в 2011 г. было ниже, чем в 2006 (p<0,001), но соотношение к показателю группы беременных женщин было таким же (выше в 3 раза), как в 2006 г. Распространение анти-ВГС среди пациентов наркологических учреждений г. Москвы снизилось в 2011 по сравнению с 2006 г. (p<0,05). Таким образом, обнаружено, что с 2006 по 2011 г. распространение анти-ВГС уменьшилось среди следующих контингентов: беременных женщин (p<0,001); пациентов ЛПУ без установленных факторов риска заражения ВГС-инфекцией (p<0,001), пациентов отделений с высоким риском парентерального заражения (p<0,05), потребителей внутривенных наркотиков (p<0,05), пациентов МНПЦДК(p<0,001) и в целом среди группы (№ 9 на рис. 3-2), в которую объединены все обследованные лица (p<0,001). Однако в двух контингентах за период с 2006 по 2011 год, а именно среди медицинского персонала отделений с высоким риском инфицирования ВГС и лабораторий (p<0,001), а также среди больных с хроническими заболеваниями печени (p<0,05) распространение анти-ВГС увеличилось. Указанные изменения явились отчасти продолжением тех тенденций, которые наблюдались с 2000 по 2006 г. Результаты мониторинга частоты анти-ВГС во всех 90 обследованных группах пациентов ЛПУ г. Москвы с 2000 по 2011 гг., проведенного в скрининговой лаборатории, представлены на рис. 3.3. % анти-ВГС+ лиц в группе Все пациенты ЛПУ г.Москвы 8 7,34 6,58 7 5,86 5,61 5,89 5,57 6 5,7 5,33 5 4,83 4,58 4,66 4,44 4 3 2 1 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 год Лица с неустановленными факторами риска % анти-ВГС+ лиц в группе 7 6 6,19 6,03 5,83 5,49 5,45 5,63 5,11 5 4 4,82 4,47 4,3 4,31 3,93 3 2 1 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 год Рис. 3.3. Динамика распространения анти-ВГС среди контингентов г.Москвы с разным риском инфицирования. 91 Продолжение рис. 3.3. % анти-ВГС+ лиц в группе Пациенты МНПЦДК 12 10 9,63 10,09 8,18 8 7,5 7,21 6,15 6 5,25 5,22 4,77 4 3,99 3,74 3,96 2 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 год % анти-ВГС+ лиц в группе Беременные женщины 3 2,5 2 1,5 2,78 2,27 1,87 1,7 1,9 1,53 1,66 1,53 1,35 1,12 1,38 1,31 1 0,5 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 год 92 Продолжение рис. 3.3. % анти-ВГС+ лиц в группе Пациенты с высоким риском заражения 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 8,19 7,68 7,79 6,4 5,58 5,94 4,98 4,95 4,51 5,06 4,68 4,22 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 год % анти-ВГС+ лиц в группе Пациенты с хроническими заболеваниями печени 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 9,13 7,18 4,29 3,45 3,3 4,04 3,51 3,73 2,61 1,72 1,88 2,39 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 год 93 Продолжение рис. 3.3. % анти-ВГС+ лиц в группе Медработники 6 5 4 4,78 3,69 2,72 2,55 3 2 3,92 3,51 1,64 1,33 1,46 1,55 2,02 2,23 1 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 год % анти-ВГС+ лиц в группе Наркоманы 50 45,18 44,48 45 39,48 40 35 28,44 27,26 26,84 27,31 30 25,69 25,35 23,97 23,37 25 21,51 20 15 10 5 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 год 94 Среди пациентов ЛПУ с неустановленными факторами риска инфицирования с 2000 г. по 2006 г. происходило последовательное снижение распространения анти-ВГС с 6,19% до 5,11%, которое становилось статистически значимым (p<0,001) через каждые 2 года и продолжилось до 2011 г. Среди беременных женщин с 2000 по 2004 гг. происходило последовательное снижение частоты анти-ВГС с 2,785 до 1,53% (p<0,001), затем наступила некоторая стабилизация. С 2006 г. до 2011 г. произошло снижение доли анти-ВГС- позитивных лиц среди беременных женщин. Группа 3 − дети первого года жизни − отсутствует на рис.1; в 2000, 2006, 2011 гг. распространение анти-ВГС в ней составляло соответственно 4,14%, 66,86% и 86,15%. Разница в показателях 2000 г. и 2006 г. была вызвана изменением в 2002 году подхода к обследованию детей: на анти-ВГС стали обследовать только детей с высоким риском перинатального инфицирования и так называемых отказных детей. В этой группе в 2011 г. по сравнению с 2006 г. распространение анти-ВГС повысилось (p<0,001). Среди медицинских работников г.Москвы в 2000 − 2002 гг. наблюдалось снижение количества анти-ВГС-позитивных лиц с 4,78 до 1,33% (p<0,001) с последующей стабилизацией до 2004 г. С 2005 года, после увеличения количества инфицированных лиц (3,51%) наблюдался спад до 2008 г. (1,64%, p<0,001). Последующее увеличение количества анти-ВГС-инфицированных лиц среди медработников г.Москвы происходило с 2008 г. по 2011 г. (до 3,92%, p<0,001). Среди пациентов с повышенным риском заражения ВГС-инфекцией (отделения гемодиализа, пересадки почки, сердечно-сосудистой и легочной хирургии и гематологии) в 2006 г. только 4,95% имели анти-ВГС, по сравнению с 8,19% в 2000 г. (p<0,001). Снижение продолжилось до 2011г. Постоянное увеличение количества анти-ВГС-позитивных лиц наблюдался с 2004 г. по 2006 г. в группе пациентов с хроническими заболеваниями печени (p<0,001). Это увеличение продолжилось до 2011 г. В группе пациентов наркологических учреждений г. Москвы после снижения с 44,48 до 21,51% за период с 2000 до 2004 г., в последующем наблюдалось увеличение количества анти-ВГС позитивных лиц до 28,44% (p<0,001) в 2006 г., а в последующем – снижение до 27, 31% в 2011 г. (p<0,005). Среди пациентов кожно-венерологических диспансеров за период с 2000 по 2006 гг. количество анти-ВГС-позитивных лиц снизилось с 9,63% до 5,25% (p<0,001) и продолжило снижаться в следующие 5 лет. Полученные нами результаты соответствуют современной эпидемиологической характеристике гепатита С в Российской Федерации [Шахгильдян И.В. и др., 2007., Шулакова Н.И. и др., 2007]: в г. Москве наблюдается общее снижение лиц с анти-ВГС, но увеличивается количество анти-ВГС-позитивных лиц в группе пациентов с хроническими 95 заболеваниями печени и среди медперсонала ЛПУ с высоким риском гемоконтактного заражения. Выбор беременных женщин для сравнения распространения анти-ВГС в различных контингентах обусловлен тем, что степень ВГС-инфицированности в данной группе соответствует уровню заболеваемости на обследуемой территории [Даниленко Е. Д. и др., 2007]. Аналогичный вывод сделан и в отношении ВИЧ-инфекции: по уровню распространенности ВИЧ-инфекции среди основного населения территории можно судить по показателю пораженности среди беременных женщин [Анализ эпидемиологческой ситуации … , 2007]. В нашем исследовании в 2011 году в группе беременных анти-ВГС были обнаружены у 1,31%, то есть ВГС-инфекция уже значительно распространилась среди основного населения г.Москвы, но, в отличие от ВИЧ-инфекции, эффективность ее распространения при сексуальных контактах значительно ниже. Большое количество анти-ВГС-позитивных сывороток среди образцов крови обследованных нами детей первого года жизни (в 2011 г. − 86,15%) связано с особенностями данного контингента: во-первых, это дети с высоким риском заражения, как правило, рожденные матерями, инфицированными ВГС. Минимальный риск передачи самого вируса (а не антител к нему) детям от инфицированных ВГС матерей составляет в среднем 5% [Баранов А.А. и др., 2003], а антитела передаются в 100% случаев. При отсутствии заражения вирусом анти-ВГС материнского происхождения исчезают из кровотока детей в возрасте от 3-5 месяцев до 18 месяцев [Ершова О.Н., 2009]. Во-вторых, в эту группу входили так называемые отказные дети, обследуемые при оформлении в Дома ребенка. Риск вертикальной передачи ВГС в данной группе детей в 2 раза превышает среднестатистический показатель и составляет 9,54% [Сеченова Н.В. и др., 2007]. В связи с распространением вируса гепатита С среди лиц репродуктивного возраста, в том числе среди беременных женщин, вопросы перинатального контакта плода с больными вирусным ГС женщинами приобретают все большую актуальность, и в последние годы, по мнению Рейзис А. Р. и соавт., хронический гепатит С все более становится проблемой педиатрической [Рейзис А.Р. и др., 2007]. Гепатит С у детей первого года жизни в ряде случаев становится проблемой лабораторной информация о ранее выявленных антителах диагностики при инфекции, направлении поскольку на скрининговое исследование (и/или о наличии инфекции у матери), как правило, отсутствует. При оценке ситуации в иных контингентах можно отметить довольно высокое, несмотря на снижение, распространение маркеров гепатита С среди лиц с неустановленными факторами риска заражения (так называемый спорадический гепатит С, 3,93% в 2011 г.). По-видимому, имеется необходимость идентифицировать эти факторы, 96 возможно, путем предварительного обсуждения направляющих пробы на исследование идентификация факторов риска и документирования в скрининговую заражения ВГС с лабораторию. последующим в ЛПУ, Подобная обследованием предлагается для оптимизации системы ранней диагностики гепатита С в поликлиниках (клиниках первичного наблюдения) США [Shehab T.M. et al., 2003]. К подобному выводу приводит и сравнение частоты выявления анти-ВГС в двух группах: лиц с неустановленными факторами риска (3,93%) и пациентов МНПЦ дерматовенерологии и косметологии (3,96%). В нашей работе среди пациентов с высоким риском половой передачи инфекций (пациенты МНПЦДК ДЗ г. Москвы) анти-ВГС выявлялись практически с той же частотой, что и в США (3,4%), однако в Москве эта величина соответствует распространению анти-ВГС среди пациентов ЛПУ общего профиля с неустановленными факторами риска инфицирования ВГС, а в США частота анти-ВГС среди основного населения в 2 раза ниже, чем среди пациентов клиник инфекций, передающихся половым путем [Gunn R.A. et al., 2001]. По нашим данным, среди медработников г.Москвы, которые по роду своей деятельности имеют контакты с кровью, частота выявления анти-ВГС после снижения с 2000 по 2002 г. постоянно увеличивается. Это привело к увеличению соотношения относительного количества анти-ВГС среди медработников к показателю в группе беременных женщин примерно в 2 раза − с 1,64 в 2006 г. до 3 в 2011 г. По данным официальной статистики, увеличение происходит среди медперсонала отделений гемодиализа [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010], по нашим данным – среди более широкого круга медицинских работников отделений гемодиализа, сердечно-сосудистой и легочной хирургии, гематологии; клинико-диагностических лабораторий, хирургических и прочих отделений городских больниц. В настоящее время скрининг сыворотки крови лиц, употребляющих наркотики внутривенно, проводится во многих странах [Roy K. et al., 2004]. Несмотря на существование региональных отличий, в ряде стран, например, в США, так же, как у нас, отмечено снижение распространения ВГС-инфекции среди внутривенных наркоманов [Daniels D. et al., 2009; Amon J. et al., 2008]. Причины этого процесса до настоящего времени не очень понятны, но, возможно, они отражают некоторую коррекцию рискованного поведения в среде наркоманов. В снижении заболеваемости острым С при отсутствии вакцин ведущую роль играет совершенствование профилактики ГС: уменьшение источников инфекции путем проведения современного лечения больных хроническими формами ГС, реализация широких программ предупреждения внутрибольничного заражения ВГС, все более 97 активная борьба с наркоманиями, улучшение санитарного просвещения населения, в первую очередь молодежи. Вероятно, в настоящее время специфической профилактикой ГС можно считать раннее, на доклиническом этапе, выявление инфицированных лиц, которое происходит при массовом скрининге крови на маркеры ВГС-инфекции, при котором зачастую впервые выявляются больные не только острым, но и хроническим ГС [Шахгильдян И.В. и др., 2007]. Определение значимости верифицирования результатов исследования маркеров гепатита С в сложных случаях, с нашей точки зрения, связано также с проблемой выделения группы вирусных гепатитов неустановленной этиологии (ВГНЭ). «Анализ этого показателя свидетельствует о последовательном его увеличении с 1-2,2% в 1993-1997 гг. до 4,1-4,2% в 2004-2005 гг. и 5,6%-7,1% в 2006-2009 гг. В современный период, отличающийся интенсивной миграцией населения с риском завоза «новых» гепатотропных контингентов вирусов, больных возможностью вирусными неполного гепатитами и лабораторного использования обследования некачественных диагностических тест-систем и лабораторных методов в определенные периоды, не исключено увеличение количества больных с этиологически нерасшифрованным вирусным гепатитом» [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. Возможно, проблема ВГНЭ, которая требует более полного и пристального изучения в ближайшие годы, может быть отчасти разрешена на пути совершенствования алгоритма инфекции. лабораторной диагностики ВГС- 98 ГЛАВА 4. ПОКАЗАТЕЛИ И CПОСОБЫ ОПТИМИЗАЦИИ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ МАССОВОМ СКРИНИНГЕ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С 1) В работе исследована возможность использования для ВЛКК контрольных материалов, приготовленных самостоятельно из проб, присланных в лабораторию на исследование, и контрольных материалов промышленного производства. Сопоставлена воспроизводимость результатов измерения оптической плотности следующих материалов: отрицательного контроля, который входит в состав диагностических тест-систем (в качестве группы сравнения − высокостабильного контрольного материала, n=50); контрольного материала собственного изготовления, так называемого домашнего контроля, иначе сливной сыворотки (n=100 в течение 2-х месяцев); материала промышленного производства, предназначенного для внутрилабораторого контроля качества исследований «Внутрилабораторного контроля анти-ВГС». При использовании разного контрольного материала получены результаты, представленные на рис. 4.1. 25 CV,% 20 23,0 15 10 10,61 5 5,42 0 1 2 3 вид контрольного материала Рис. 4.1. Воспроизводимость результатов исследования различных видов контрольного материала: 1) отрицательного лиофилизированной и контроля восстановленной диагностической сыворотки для ТС ВЛКК (CV ОП); 2) промышленного производства (CV КП); 3) самостоятельно приготовленного контрольного материала (CV КП). 99 Согласно полученным результатам, при определении воспроизводимости оптической плотности отрицательного контроля, который входит в состав тест-системы «РекомбиБест-анти-ВГС», CV был равен 5,42%. CV не превышал пределов: CV средний ± 1σ (от 4,14% до 6,7%). При использовании материала так называемого домашнего контроля для оценки воспроизводимости результатов в первичном скрининге в ИФТС «ИФА-antiHCV» CV КП был равен 23% (рис.1), а в «РекомбиБест- анти–ВГС» − 34%, что было связано с нестабильностью самостоятельно изготовленного контрольного материала при соблюдении всех условий проведения ИФА. При оценке воспроизводимости результатов измерения «Внутрилабораторного контроля анти-ВГС», CV КП был равен 10,61% (рис. 4.1). В дальнейшем (с 2006 г.) для оценки воспроизводимости результатов определения анти-ВГС использован только материал промышленного производства, предназначенный для ВЛКК. Была определена сходимость результатов измерения оптической плотности контрольного материала собственного изготовления. В 2005 г. средний CV КП «сливной» сыворотки (n=640) был равен 3,3% (от 2,27 до 4,28%), в 2006 г. (n=680) – 3,17% (от 1,9 до 4,16%). Полученные удовлетворительные результаты обусловили использование в дальнейшем для оценки сходимости результатов самостоятельно приготовленную так называемую сливную сыворотку. Для сравнения, в 2012 г. сходимость результатов определения оптической плотность материала промышленного производства «Virotrol» не превышала 7%, самостоятельно приготовленного контрольного материала − не превышала 10%. 2) Были сопоставлены результаты оперативного контроля качества исследований анти-ВГС методом ведения контрольных карт а) при проведении ИФА вручную − при внесении исследуемых проб и контрольного материала автоматическими пипетками (рис.4.2), б) при использовании для внесения контрольного материала и исследуемых образцов системы для автоматического пипетирования проб биологического происхождения «Freedom Evo Clinical» (рис. 4-3; карты были построены и велись по средним значениям КП в серии), в) при полностью автоматизированном проведении ИФА с помощью автоматического иммуноферментного анализатора «Freedom Evolyzer», карты были построены и велись при использовании КП контрольного материала на каждом планшете (не в серии). При проведении ИФА вручную были получены результаты, представленные в таблице 4.1. 100 Таблица 4.1 Параметры контрольных карт при внесении исследуемых проб и контрольного материала автоматическими пипетками № Вид контрольного Период Параметры карты п/п материала времени КП σ CV ср. 1 ЛС 1 квартал 2006 г. 3,21 0,47 14,5% 2 ЛС 2 квартал 2006 г. 3,3 0,3 9,7% 3 ЛС 3 квартал 2006 г. 4,17 0,54 13% Примечание: ВЛК «Внутрилабораторный контроль анти-ВГС» («Вектор-Бест»); ЛС − лиофилизированная и восстановленная сыворотка для ВЛКК промышленного производства. КП − коэффициент позитивности контрольного материала, CV − коэффициент вариации. При внесении исследуемого и контрольного материала с помощью системы для автоматического пипетирования проб «Freedom Evo Clinical» полученные результаты близки к результатам при проведении ИФА вручную (рис. 4.2 и 4.3). При автоматическом проведении ИФА с помощью «Freedom Evolyzer» CV был выше, но не превышал 19%. На контрольных картах имелись единичные предупредительные критерии, в основном превышение 2σ. Как правило, количество результатов, выходящих за границы 2σ, было не более 4,5%, т.е. составляло статистически ожидаемую величину. 101 Рис. 4.2. Контрольная карта исследований на наличие анти-ВГС при ручном проведении ИФА в КИЛ по диагностике ВИЧ-инфекции МНПЦДК ДЗ г. Москвы. 102 Рис. 4.3. Контрольная карта исследований на наличие анти-ВГС при ведении «по средним значениям КП в серии» и внесении сыворотки крови с помощью системы для автоматического пипетирования проб биологического происхождения «Freedom Evo Clinical» в КИЛ по диагностике ВИЧ-инфекции МНПЦДК Департамента здравоохранения г. Москвы. 103 Таким образом, в картах, полученных при усреднении КП контрольного материала в серии (при проведении ИФА вручную либо при автоматическом раскапывании материала) CV КП результатов, использованных при построении карты (8,7%), так и КП результатов при ее ведении (9,5%) был ниже, чем при использовании неусредненных величин и был сопоставим с CV сходимости результатов в серии (средний CV=7%). В картах, полученных при использовании неусредненных показателей, CV был выше в среднем в 2 раза, но не превышал 19%. 3) Проведение повторных исследований выполнялось в объеме одного планшета (88 нативных проб плюс 8 контролей) в день первичного исследования. Результаты ратификации в 2000 году: из 704 образцов, использованных для ратификации антител к ВГС, в первичном исследовании в тест-системе «ИФА-anti-HCV» (Н.Новгород) одна проба была определена как первично-положительная одним лаборантом и как первичноотрицательная другим лаборантом (ошибка составила 0,14%). В подтверждающих исследованиях проба была признана не содержащей анти-ВГС. Обсуждая результаты ВЛКК, следует отметить, что ИФА является основным методом массового скрининга сыворотки крови на наличие анти-ВГС в России, вследствие чего возрастает роль контроля качества данного вида исследований. В представленной работе сопоставлены результаты использования для ВКК контрольных материалов, приготовленных самостоятельно из сывороток, присланных в лабораторию на исследование, и контрольных материалов промышленного производства. Согласно полученным результатам, использование самостоятельно приготовленного контрольного материала (слабоположительной сыворотки), не подвергавшегося хранению, замораживанию и оттаиванию, приводит к стабильным и удовлетворительным для ИФА показателям для контроля сходимости результатов исследования (средний CV 4,3%). При использовании самостоятельно приготовленного материала для контроля воспроизводимости результатов получены неудовлетворительные для ИФА показатели CV (23-34%), что объясняется нестабильностью т. н. домашнего контроля даже при хранении при -240С и однократном замораживании-оттаивании. В то же время, использование лиофилизированных удовлетворительной сывороток для ИФА промышленного воспроизводимости производства результатов привело к [Медицинские лабораторные технологии, 1998; Нетесова И.Г., Бобкова М.Р., 2011]: CV КП данного контрольного материала как при «ручном», так и при автоматическом проведении ИФА не превышал 19%. Построение контрольных карт, которое является одним из наиболее эффективных способов ежедневного оперативного контроля качества исследований в ИФА [Ястребова 104 О.Н., 2003; Suslov A.P. et al., 2002], при массовом скрининге маркеров вирусных гепатитов целесообразно вести «по средним значениям в серии» [Качество клинических лабораторных исследований…: сб. ст. и док., 2002], что приводит к удовлетворительным результатам как при «ручном», так и при автоматическом проведении исследований. Результаты, полученные нами при повторном исследовании (ошибка не более чем 0,15%) были учтены при разработке алгоритма исследований проб в скрининге. Следует отметить, что все далее представленные результаты получены при систематическом и регулярном проведении не только внутреннего, но и внешнего контроля качества исследований анти-ВГС: участия в федеральной системе внешней оценки качества (ФСВОК) и в международной системе «VQC Acrometrix». Некоторые противоречивые результаты тестирования материалов внешнего контроля качества представлены в следующих разделах работы. 105 ГЛАВА 5. ЛАБОРАТОРНЫЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ АЛГОРИТМ МАССОВОГО СКРИНИНГА АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С 5.1. Подтверждение наличия антител к вирусу гепатита С при массовом скрининге крови: противоречивость результатов в подтверждающих иммуноферментных диагностических системах планшетного формата Руководствуясь приказом о проведении исследований на наличие антител к ВГС [О применении в практике здравоохранения…: приказ МЗ РФ РФ №384 от 30.10.2000 г.], после первичного исследования 144 позитивные в скрининге (ИФТС «РекомбиБест анти-ВГС») пробы тестировали в подтверждающей диагностических наборах с раздельным вывлением антител к ядерному белку и к комплексу неструктурных белков ВГС «РекомбиБест анти– ВГС-подтверждающий тест»). Для того, чтобы сравнить результаты подтверждения наличия анти-ВГС в двух подтверждающих диагностических системах с раздельным выявлением антител к Core-антигену и к комплексу NS-антигенов разных производителей, были проведены дополнительные исследования. Пробы с позитивными результатами исследования в ИФТС (РекомбиБест анти–ВГС-подтверждающий тест» вследствие выявления реактивности только к комплексу NS-белков (КП 2,35±2,45, результат позитивный) были дополнительно исследованы в подтверждающей ИФТС «ДС-ИФААНТИ-HCV-СПЕКТР-GM». При исследовании 32 проб (22,22%) были получены противоречивые результаты в ИФТС разных производителей, в том числе в 8 пробах во второй подтверждающей ИФТС («ДС-ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР-GM») были обнаружены антитела к Core-белку (КП 2,16±1,29). Эти 32 пробы с противоречивыми результатами в двух подтверждающих ИФТС затем были протестированы с помощью иммуноблота «INNO-LIA HCV Ab III update», результаты представлены в таблице 5.1. 106 Таблица 5.1 Референсная оценка в иммуноблоте противоречивых результатов исследования анти-ВГС в подтверждающих тест-системах планшетного формата для ИФА № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 № и дата ана-лиза Возраст (лет) Пол ЛИА ИФТС Скр. РБ ДС Core КП - NS КП 5,6 Рез-т Ответ в ЛИА Core КП - NS КП - Рез-т Отриц. Не обнар. отриц - - Отриц. NS4 (3+) неопр - 2,4 Пол. Не обнар. отриц Варианты несовпадения результатов в ИФТС и ИБ ЛИА+/- ЛИА+ РБ+ ДС- РБ+ ДС- 1368 14 02 1097 7 02 31 15 02 30 15 02 38 21 02 55 *ж КП 1,56 26 ж 4,4 - 7,6 24 ж 4,4 - - Полож . Полож . Отриц. 18 м 1,4 - - Отриц. - 2,43 Пол. C2 (2+) неопр 27 ж 2 - - Отриц. - 3,8 Пол. полож 110 26 02 1257 15 03 2377 19 03 26 м 14 - 14 - - Отриц. 73 ж 10,8 - 14 - - Отриц. 25 ж 7,2 - 6,4 Полож . Полож . Полож . C1 (1+) C2 (1+) E2 (1+) NS4 (+/-) NS5 (+/-) C1 (+/ -) NS4 (3+) Не обнар. - - Отриц. NS4 (3+) неопр ♦ 14 21 03 82 м 5,6 - 8,4 Полож . - - Отриц. NS4 (3+) неопр ♦ неопр РБДС+ ЛИАРБДС+ РБ+ ДС- РБДС+ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ отриц ♦ 107 Продолжение таблицы 5.1 10 1258 21 ж 20 03 11 1080 16 м 22 03 12 82 41 **м 23 03 13 1826 ж 06.04 14 43 м 05.04 15 14 - 4,4 3,48 - 3,28 1,45 - - 8,8 - 4,5 0,84 - - Полож . Полож . Отриц. - - Отриц. NS4 (2+) неопр ♦ - - Отриц. NS4 (2+) неопр ♦ - 5,55 Полож. NS3 (2+) неопр Полож . Отриц. - - полож 1 - - - NS3 (2+) NS3 (+/-) Полож. C1 (2+) C2 (+/-) E2(+/-) NS3 (1+) NS4 (+/-) Отриц. C1 (+/-) - - Отриц. полож - - Отриц. C2 (1+) NS4 (3+) NS4 (2+) - - Отриц. NS4 (2+) - - Отриц. Не обнар. - - Отриц. NS4 (1+) 2,44 - Полож. C1 (1+) NS3 (1+) NS4 (+/-) 2,22 Полож. C1 (+/-) C2 (1+) NS4 (2+) Полож. C1 (+/-) 848 13 04 1981 13 04 1101 12 04 294 18 04 230 19 04 1886 18 04 47 23 04 65 м 5,2 - 5,0 32 ***ж 14 - 8 82 ж 7,6 - 4,8 18 ж 8 - 7,6 80 ж 8,8 - 9,6 73 *ж 1,68 - 2,7 37 м 1 - - Полож . Полож . Полож . Полож . Полож . Полож . Отриц. 22 857 27 04 78 *ж 4,8 - - Отриц. 1,66 23 2074 26 04 67 ж 1,4 - - Отриц. 1,66 16 17 18 19 20 21 Отриц. ♦ ♦ полож ♦ отриц ♦ ♦ Неопр . Неопр . отриц ♦ Неопр . полож ♦ полож отриц ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ 108 Продолжение таблицы 5.1 24 2077 21 м 26 04 25 1482 68 м 28 04 26 1438 74 м 28 04 27 1077 20 м 28 04 28 797 55 м 3 05 29 68 21 ж 8 05 30 1404 19 ж 25 05 1,4 - - Отриц. 1,66 - Полож. Не обнар. отриц ♦ 1,44 - - Отриц. - 1,66 Полож. Не обнар. отриц ♦ 1,6 - - Отриц. - 1,61 Полож. Не обнар. отриц ♦ 2,36 - 1,2 - - отрц 2,8 - - Полож . Отриц. - 1,66 Полож. Не обнар. отриц ♦ 1 - - Отриц. - 1 Полож. Не обнар. отриц ♦ 1,04 - - Отриц. 5 - Полож. C1 (1+) C2 (+/-) E2(2+) NS3 (2+) NS4 (2+) Полож. C1 (3+) NS3 (+/-) NS4 (2+) Полож. C1 (+/-) C2 (+/-) NS3 (2+) полож ♦ полож ♦ полож ♦ 31 1003 5 06 33 ****ж 2,36 - - Отриц. 2,77 - 32 71 5 06 37 ж 1 - - Отриц. 1,1 - Отриц. Не обнар. ♦ Примечания. Использованы следующие диагностические системы: при скрининге (скр.) «РекомбиБест анти-ВГС»; при подтверждениии «РекомбиБест анти–ВГС-подтверждающий тест» (РБ) и «ДС-ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР-GM» (ДС); иммуноблот «INNO-LIA HCV Ab III update» (ЛИА). ♦ Отмечены результаты, полученные в трех подтверждающих диагностических системах. * Носитель HCV, ** потребитель внутривенных наркотиков,*** беременная женщина, **** медработник. 109 Из 32 образцов неопределенные результаты в ЛИА были характерны для 11 образцов (34,4%), анти-ВГС в ЛИА были обнаружены в 9 образцах (28,1%) и не обнаружены в 12 образцах (37,5%). Сравнение результатов исследования в «INNO-LIA HCV Ab III update» с результатами в подтверждающих ИФТС разных производителей получены результаты, представленные в таблице 5.2. Таблица 5.2 Сравнение данных, полученных при исследовании образцов сыворотки с противоречивыми результатами в подтверждающих ИФТС разных производителей («РекомбиБест анти–ВГС тест», ВБ, и «ИФА-анти-HCV-спектр-GM», ДС) в «INNOLIA HCV Ab III update» Результат Неопределенный исследования 11 Отрицательн Положительны ый, в ЛИА, й, 12 9 количество проб Результат ВБ+ ВБ- ВБ+ ВБ- ВБ+ ВБ- исследования ДС - ДС+ ДС - ДС+ ДС - ДС+ в ИФТС Количество 9 2 5 7 2 7 образцов Разницы в специфичности ВБ и ДС (при сравнении частоты отрицательных результатов в ЛИА) не обнаружено. Из представленных данных следует, что позитивные результаты исследования «проблемных» проб в ДС в 3,5 раза чаще совпадали с позитивными результатами в ЛИА, чем позитивные результаты в ВБ (p<0,05). В то же время количество проб, которые в РБ были определены как позитивные, а в ЛИА имели неопределенный результат исследования, превышало в 4,5 раза количество проб, определенных как позитивные в ДС (p<0,05). Учитывая количество неотрицательных (позитивных и неопределенных) результатов в ЛИА, можно сделать вывод о том, что обе подтверждающие ИФТС продемонстрировали 110 сходную чувствительность, что позволяет использовать каждую из них для дополнительного подтверждающего исследования в ТС другого производителя. 5.2. Сравнение результатов исследования в ИФА планшетного формата «Спектр» (с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4 и NS5-антигенам ВГС) с результатами исследования в двух иммуноблотах: «INNO-LIA HCV Ab III update» и «RecomBlot HCV IgG 2.0» Кроме ИФТС с раздельным выявлением антител к Core и к комплексу NS-антигенов ВГС, в России производятся (и используются в основном практике специализированных стационаров) ИФТС с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4 и NS5-антигенам ВГС. Учитывая проблемы лабораторной диагностики ВГС-инфекции на этапе массового первичного скрининга, следовало выяснить, насколько данные ИФТС могут решать референсные задачи и заменить иммуноблот. Пробы (74) с низкой позитивной оптической плотностью в скрининге (КП 3,14±1,78) и в подтверждающей ИФТС с раздельным выявлением антител к Core (КП 1,68±1,12) и к комплексу NS-антигенов (КП 2,35±2,45) были исследованы в ИФТС с раздельным выявлением антител к Core-, NS3-, NS4- и NS5-антигенам ВГС и в иммуноблоте «INNOLIA HCV Ab III update» (Приложение 1). В ИФТС «спектр» было получено 16 положительных (21,6%), 43 неопределенных (58,1%), 15 отрицательных результатов (20,3%). В ИБ «INNO-LIA HCV Ab III update» в данной выборке было 23 положительных результата (31%), 41 неопределенный (55,4%), 10 отрицательных результатов (13,5%). Статистически значимых различий по количеству положительных, отрицательных и неопределенных результатов между ИФТС и ИБ не было. Менее чем в половине случаев (в 35 пробах − в 47%) исследования низкопозитивных в скрининге образцов наблюдалось полное совпадение выявленных антител в ИФТС и в ЛИА. Совпадение отрицательных результатов исследования проб в ИФТС и в ЛИА наблюдалось в трех пробах (4%). Итого, полное совпадение результатов исследования составляло примерно 50 %. Результаты, полученные при исследовании прочих 36 проб, распределились следующим образом: 6 проб (8,1%), отрицательных в ИФТС «спектр», но с неопределенным результатом исследования в ИБ; 111 6 проб (8,1%) с отрицательным результатом в ИФТС «спектр», но с положительным результатом в ИБ; в 11 пробах (14,9%) в ИБ спектр выявленных антител был расширен по сравнению с ИФТС; в четырех пробах (5,4%) результат исследования в ИФТС был неопределенным, в ИБ − отрицательным; в трех пробах (4%) результат исследования в ИФТС был положительным, в ИБ – в отрицательным; в пяти пробах (6,8%) результат исследования в ИФТС и в ЛИА был неопределенным, но вследствие обнаружения антител к разным антигенам; в одной пробе (1,4%) результат исследования в ИФТС был положительным (обнаружены антитела к антител к Core, NS3 и NS4 антигенам ВГС), а в ИБ неопределенным (обнаружена реактивность только к NS4). Кроме ИБ «INNO-LIA HCV Ab III update», для оценки верификации результатов исследования в ИФА был использован и другой ИБ − «RecomBlot HCV IgG 2.0» (Приложение 2). По результатам исследования в «RecomBlot HCV IgG 2.0» были выделены те же группы, что и при использовании ИБ «INNO-LIA HCV Ab III update» (таблица 5.3). 112 Таблица 5.3 Сравнение результатов исследования проб сыворотки крови пациентов ЛПУ в ИФТС планшетного формата и в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» № группы Результат в ИФТС/ в РБ Кол-во проб (133) В ИФТС: реактивность антигенам ВГС 1 Полное совпадение : А) в ИФТС неопр/ РБ неопределенный Б) в ИФТС положительный/ в РБ положительный В ИФТС отрицательный / в РБ неопределенный В ИФТС отрицательный / в РБ отрицательный ИФТС отриц./ РБ полож. Расширение спектра анти-ВГС в РБ по сравнению с ИФТС 18 (15,53%) А) 14 проб – к NS3 А) 14 проб - к NS3 и геликазе, Ответ неопределенный 6 баллов, ответ неопределенный Б) 4 пробы – к Core, NS3, NS4- Б) 4 пробы – к Core, NS3, геликазе, Ответ положительный NS4 (18 баллов, положительный) 3 (2,26%) Не обнаружена 7(5,26%) Не обнаружена 0 0 0 13 (9,77%) В ИФТС неопределенный/ в РБ отрицательный 76 (57,14%) + к Core и NS3 К NS4 неопр. К NS3 5 проб – к NS3 Core, NS3, Hel, NS4 Core, NS3 полож. Core, NS3, Hel, NS4, NS5 1 проба - NS3 (3 балла, отр.) 1 проба - Hel (3 балла, отр.) 4 пробы -NS4 (4 балла - ответ отр.) 1 NS5 (2 балла, ответ отрицат.) 2 3 4 5 6 70 проб - анти-NS4 1 проба - анти-NS5 к В РБ: реактивность к антигенам ВГС 2 пробы – к Core (8 баллов, неопред.) 1 проба – к NS3 и геликазе (6 баллов, неопределенный) 1 проба – Core (5 баллов, отриц.) 6 проб - анти-ВГС не обнаружены 113 Продолжение таблицы 5.3 7 8 9 В ИФТС положит./ В РБ отрицат. 5(3,76%) А) В ИФТС неопред./ в РБ неопред., или Б) В ИФТС полож./ в РБ полож, но с разными АТ 5 (3,76%) В ИФТС положит./ В РБ неопредел. 6 (4,51%) Core Core, NS5 Core, NS4 Не обнаружена Не обнаружена NS4 (4 балла - ответ отри цат.) Core, NS3, NS4, NS5 Core, NS4, NS5 Не обнаружена Не обнаружена А)NS4 NS4 NS3, Hel (6 баллов, неопр.) Core (8 баллов, неопр.) Б) NS3, NS4 Core, NS3, Hel (14 баллов, полож.) Core, NS3, NS4, NS5 Core Core (8 баллов, неопределенный) Core (8 баллов, неопределенный) 114 Полное совпадение результатов определения наличия анти-ВГС в ИФТС (с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4 и NS5 антигенам ВГС) и в «RecomBlot HCV IgG 2.0» составило 15,5% (группа 1). Из данных таблицы следует, что результат определения наличия анти-ВГС в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» вследствие установленного производителем способа интерпретации был отрицательным при обнаружении реактивности к тем же антигенам, что и в ИФТС. Так, при обнаружении реактивности антител исследованного образца к только к NS3 (или только к геликазе), к NS4 или к Core антигенам ВГС результат следовало расценивать как отрицательный, при том, что в ИФТС планшетного формата с раздельно детектируемыми антителами результат расценивался как неопределенный (группа 6 − 57% всех проб) или даже положительный (группа 7 − 4% всех проб). 5.3. Противоречия между результатами исследования проб сыворотки крови в иммуноблотах разных производителей и некоторые ограничения использования иммуноблотов При противоречивых результатах исследования некоторых проб в ИФТС разных производителей или при низкой позитивной оптической проб результат референсного исследования в ИБ может быть не интерпретируемым вследствие появления неспецифической реакции пробы к стрептавидину или иных компонентов ИБ. Примеры подобных исследований приведены в таблице 5.4. 115 Таблица 5.4 Неспецифическая реакция на стрептавидин в иммуноблоте «INNO-LIA HCV Ab III update» проб с позитивными результатами исследования анти-ВГС в подтверждающих тест-системах планшетного формата для ИФА № п/п № перв. пост. Дата первичного исследования Пол 1 730 17 04 07 м 2 489 14 05 07 м 3 4 2764 11 05 07 1145 03 05 07 м м 5 6 660 25 06 07 1071 04 12 07 *ж м Возраст, лет Реактивность к стрептавидину 43 Есть Есть 17 Есть 21 16 Есть Есть 27 30 Есть Результат Неинтерпретируемый Неинтерпретируемый Неинтерпретируемый Неинтерпретируемый Неинтерпретируемый Неинтерпретируемый РБ: реактивность к антигенам Core, NS, КП КП + 3,2 +2,8 +2,16 - +1,2 + 1,2 + 1,16 +1,08 1,6 2,4 ДС: реактивность к антигенам Core, NS, КП КП "-" NS5 2,22 NS3 1,61 +2,22 NS5 1,88 2,83 Примечания: На последовательных этапах исследования использованы следующие иммуноферментные тест-системы (ИФТС): при скрининге: «РекомбиБест анти-ВГС»; в подтверждениии 1: «РекомбиБест анти–ВГС-подтверждающий тест» (РБ); в подтверждении 2: «ДС-ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТРGM» (ДС); при референсном тестировании использован иммуноблот «INNO-LIA HCV Ab III update» (ЛИА). *-Беременная женщина. 116 Среди проб с неспецифической реакцией на стрептавидин проба № 1071 принадлежала пациенту М-ву, состоящему на учете по наличию ХГС. При повторном исследовании сыворотки крови М. в ИФТС «РекомбиБест анти–ВГС подтверждающий тест-спектр» были обнаружены анти-Core (КП 1,64), NS3 (КП 1,56), NS4 (КП 1,84), NS5 (КП 1,76). Дальнейшее исследование пробы пациента М-ва в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» представлено в приложении 4 (результат отрицательный), а исследование в иммуночипах − в главе 8 (результат положительный). При исследовании 19 проб с низкой позитивной ОП в скрининге и в подтверждающих ИФТС в двух ИБ разных производителей были получены следующие результаты (Приложение 3). В ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» было получено 2 положительных (10,5%), 5 неопределенных (26%), 10 отрицательных результатов (53%); результаты исследования двух проб (10,5%) были не интерпретируемыми вследствие неспецифической реакции к протеинам молока. В ИБ «INNO-LIA HCV Ab III update» было 4 положительных результата (21,1%), 7 неопределенных (36,8%), 7 отрицательных (36,8%) и 1 (5,3%) неспецифическая реакция на стрептавидин. Статистических различий между результатами, полученными в использованных ИБ, не было. В то же время, при рассмотрении результатов тестирования отдельных проб выявлены определенные противоречия. Положительные результаты в двух ИБ совпали по двум пробам (10%); неопределенные результаты − по трем пробам (16%), отрицательные − по четырем пробам (21%). Таким образом, общее совпадение результатов в двух ИБ наблюдалось менее чем в 50%. Результаты исследования семи проб (36,8%) в двух ИБ были противоречивыми, что в ряде случаев было вызвано слабой реактивностью к тем же антигенам в одном из ИБ с соответствующей оценкой общего результата в данном ИБ как отрицательного (проба п/п №3). В трех пробах (15,8%) наблюдалась неспецифическая реакция в ИБ (в двух пробах− в «RecomBlot HCV IgG 2.0», в одной – в «INNO-LIA HCV Ab III update»). При сравнении результатов тестирования проб в двух ИФТС и в двух ИБ привлекают внимание ситуации, в которых результаты тестирования анти-ВГС в ИФТС были положительными, а в двух ИБ − отрицательными; так, результаты исследования пробы п/п №1 в двух ИФТС были позитивными (выявлены анти-Core или антитела к NS3 и к NS5), а в двух ИБ − отрицательными (при этом в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» обнаружена низкая реактивность также к Core-антигену); в пробе п/п №2 в двух ИФТС результаты были позитивными (выявлены анти-Core), в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» неопределенными вследствие выявления реактивности к Core-антигену, а в «INNO-LIA HCV Ab III update» − отрицательными. 117 Противоречия между результатами, полученными в двух иммуноблотах, обнаруживались не только при исследовании проб сыворотки крови людей, но и при решении задач внешней оценки качества исследований. Так, в 2007 г. при исследовании образцов панели ФСВОК (цикл 2) результат исследования пробы №3 в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» был неопределенным вследствие обнаружения реактивности только к Core антигену, а в «INNO-LIA HCV Ab III update» − позитивным вследствие обнаружения реактивности к Core, NS3 и NS4 антигенам, что более соответствовало результатам, полученным в ИФТС, и результатам, сообщенным из ФСВОК (табл. 5.5). Таким образом, противоречия при массовом скрининге антител к ВГС наблюдаются среди результатов, полученных а) в ИФТС разных производителей, б) среди результатов, полученных в ИФТС и ИБ, в) среди результатов, полученных в разных ИБ. Одной из возможных причин противоречивости результатов может быть состав и качество рекомбинантных и синтетических антигенов, которые используются в разных тестсистемах, информация относительно которых, как правило, отсутствует. 118 Результаты исследования панели контрольных образцов ФСВОК, цикл 2 − 2007 № 1 2 3 4 Реком 2АГ скрининг ( КП ) Сore NS 4 АГ Сore NS3 NS4 NS5 Ответ 0,082 0,3 0,102 0,4 2,127 8,2 Реком Новг. Реком Новг. Реком Новг. 0,157 0,046 0,071 0,042 0,547 0,422 0,146 0,33 0,083 0,269 0,579 1,318 Реком Новг. Реком Новг. Реком Новг. 0,079 0,043 0,07 0,042 0,42 0,423 0,06 0,291 0,061 0,267 0,081 0,249 0,062 0,154 0,056 0,087 0,771 1,003 0,07 0,32 0,054 0,218 0,068 0,214 Отриц. Полож. Отриц. Неопр. Полож. Полож. 2,549 9,8 Реком 1,404 Новг. 0,834 1,19 1,697 Реком Новг. 1,702 1,04 0,119 0,746 0,902 1,291 1,152 1,17 Полож. Полож. . 5 3,112 12 Реком 2,808 Новг. 2,411 0,168 0,487 Реком Новг. 2,79 2,35 0,16 0,519 0,083 0,115 0,056 0,329 Полож. Полож. 6 0,069 0,3 0,085 0,3 Реком Новг. Реком Новг. 0,123 0,208 0,077 0,353 Реком Новг. Реком Новг. 0,068 0,043 0,055 0,053 0,072 0,276 0,059 0,447 0,063 0,125 0,072 0,297 0,064 0,315 0,056 0,441 Отриц. Полож. Отриц. Полож. 2,217 Реком 1,247 0,24 Реком 1,358 0,227 0,289 0,083 Полож. 8,5 Новг. 0,762 Новг. 1,356 0,807 0,176 0,248 Полож. 7 8 0,131 0,043 0,074 0,044 1,182 Таблица 5.5 RecomBlot: результат, количество баллов (б.), реактивность антител к антигенам 0 б. отриц. 0 б. отриц. Core(1+) 8б. неопр. пол.14б core (2+) NS4(+) NS5-12(+) Core (3+) 8 б. неопр. 0 б. отриц. 0б. отриц. пол. 11 б. core2+, NS3+, NS4+/Helic +/- LIA: результат, интенсивность реактивности антител к антигенам отриц. отриц. С1(+), С2 (+/-) NS3(2+) NS4(2+) полож. С1(1+), NS4(2+) NS3 (+/-), NS5 (+/-) полож. С1 (2+), С2 (1+) NS3(+/-), полож. отриц. отриц. С1 (1+), С2 (+/-) NS3 1+ полож. 119 5.4. Критерии отбора проб для дополнительного подтверждения наличия в них анти-ВГС при массовых исследованиях Для разработки критериев подтверждающее наличие анти-ВГС, отбора проб в дополнительное исследование, пробы с КП в первичном скрининге менее 6 тестировали в нескольких ИФТС. Интегрально- положительным считали результат в тех случаях, когда: результат был положительным в любых трех ИФТС, один или два скрининговых теста были положительными (КП => 1), один из подтверждающих тестов был положительным, в другой (с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4 NS5) обнаруживалась реактивность только к одному антигену; Интегрально- отрицательным считали результат в тех случаях, когда: в одной скрининговой ИФТС результат был положительным, во второй скрининговой ИФТС (как правило, «Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2»), был отрицательным; в одной из подтверждающих ИФТС результат был отрицательным, в другой ИФТС (с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4 NS5) обнаруживалась реактивность антител только к одному антигену. По результатам достижения диагностического консенсуса в общей группе из 117 проб были выделены группы интегрально-отрицательных (инт-, 78 проб) и интегрально- положительных проб (инт+, 39 проб). Из общей группы 117 «проблемных» проб сыворотки крови (с КП в первичном скрининге менее 6) получили 2 выборки: интегральноотрицательных и интегрально-положительных проб. Некоторые статистические параметры соответствующих распределений были рассчитаны и представлены в таблице 5.6. 120 Таблица 5.6 Результаты определения наличия анти-ВГС в низкопозитивных в скрининге проб (КП менее 6) и некоторые статистические параметры распределения интегральноотрицательных и интегрально-положительных групп Интегральноположительные результаты Показатели Группы образцов по результатам диагностического консенсуса Интегральноотрицательные результаты № п/п Все проблемные сыворотки Положительные по наличию АТ к следующим АГ ВГС n=78 n=39 (33,33%) n=14 n=13 core + NS+ n=12 1,787 0,964 0,2-5,33 1,593 1,779 0,2-4,76 2,224 1,171 0,9-5,33 2,244 0,922 1,636 1,181 2,77 1,27 1,817 1,064 0,28-6,6 1,705 0,603 0,8-2,65 2,37 1,27 0,99-6,6 2,051 0,853 Abs. 4,19 1,57 среднее 2,73 станд. 2,656 отклон. min-max 0,3-14,0 КП по ТС «Монолиза С» 2,243 1,985 4,201 3,366 Abs. 4,22 2,54 4,82 4,01 0,7-12,82 1,2-14,0 Количество n=27 полож-х (n) Количество n=90 отрицат-х Среднее КП 0,854 в ТС «Монолиза» станд. отклон. 1,135 min-max 0,05-9,07 n=5 n=27 n=8 n=13 n=6 n=73 n=12 n=6 0 n=6 0,372 1,787 0,316 0,05-1,32 1,535 0,2-9,07 1 Количество проб(n) 2 КП в скрининге 3 Среднее станд. отклон. min-max КП АТ-Core 4 среднее станд. отклон. min-max КП АТ-NS 5 n=117 core + NS+ 121 Следующим шагом было определение различий между группами интегральноотрицательных и интегрально-положительных проб по двум статистическим критериям. А именно, для сравнения дисперсий двух вариационных рядов использовали F-критерий Фишера, а для проверки гипотезы о различии между средними двух генеральных совокупностей (интегрально-отрицательных и интегрально-положительных проб) использовали двухвыборочный z-тест для средних с известными дисперсиями. Поиск различия групп с интегрально-отрицательными и интегральноположительными ответами провели по результатам тестирования: 1) в первичном скрининге, 2) в дополнительной скрининговой тест-системе «Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2», 3) в тест-системах, утвержденных по приказу МЗ РФ для подтверждения наличия анти-ВГС с раздельным выявлением анти-Core и антител к комплексу NS. Определялось различие групп инт+ и инт- образцов: а) в первичных скрининговых ИФТС и б) в подтверждающих ИФТС при наличии анти-Core ВГС и при наличии анти-NS ВГС. Результаты проведенного статистического анализа различия групп представлены в таблице 5.7. 122 Таблица 5.7 Различие групп интегрально-отрицательных и интегрально-положительных проб в первичном скрининге (А), в дополнительной ИФТС с общим определением анти-ВГС «Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2» (Б), в подтверждающих ИФТС с выявлением реактивности к Core АГ (В), в подтверждающих ИФТС с выявлением реактивности к комплексу NS АГ (Г) А. Статистические показатели и различие выборок при первичном скрининге Группа проб Статистический 1. Все 2. Интегрально- 3. Интегрально- показатель проблемные отрицательные положительные пробы пробы пробы (117) (78) (39) в 1,787 1,593 2,224 Стандартная ошибка 0,089 0,087 1,187 Стандартное отклонение 0,964 0,776 1,154 Дисперсия выборки 0,931 0,602 1,332 Среднее КП первичном крининге Статистическая значимость между различий 1. По двухвыборочному F-критерию нет и различия между дисперсиями выборок в положительных отрицательными положительными первичном скрининге сыворотками и отрицательных сывороток 2. По двухвыборочному z-тесту средние значения выборок отрицательных и положительных сывороток различаются (p<0,05), но не более чем на 0,2 123 Б. Статистические показатели выборок в дополнительном исследовании проб в ТС «Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2» Статистический показатель Среднее КП Группы проб 1. Все проблем-ные 2. Интегрально- 3. Интегрально- пробы отрицательные положительные (117) пробы пробы (78) (39) 0,854 1,787 0,372 Стандартная 0,245839 ошибка 0,1049 0,037 Стандартное 1,135 0,316 1,535262 1,28747 0,1 2,357029 отклонение Дисперсия выборки Статистическая значимость различий 1. По двухвыборочному F-критерию есть между интегрально-отрицательными и различие между дисперсиями выборок интегрально-положительными пробами положительных в ИФТС «Monolisa anti-HCV PLUS. сывороток (p<0,05) и отрицательных Version 2» 2. По двухвыборочному z-тесту с различными дисперсиями разница между средними не более чем на 0,9 (p<0,05) 124 В. Статистические показатели и различие выборок в подтверждающей тест-системе при выявлении реактивности к Core АГ Статистический 1. Все 2. Интегрально- 3. Интегрально- показатель проблемные отрицательные положительные сыворотки сыворотки из (117) сомнительных сывороток сомнительных группы сыворотки из группы (78) сывороток (39) 2.1. Среднее КП 1,817 1,661(29) 2,284 (26) 0,136 0,101 0,245 1,064 0,542 1,251 1,133 0,294 1,564 АТ к Core-ВГС Стандартная ошибка Стандартное отклонение Дисперсия выборки Статистическая значимость 1. По двухвыборочному выборок z-тесту различий между отрицательными и значения положительными сыворотками в положительных подтверждающей ТС по КП анти- (p<0,05), но не более чем на 0,15 средние отрицательных и сывороток различаются Core-ВГС 2. По двухвыборочному различие между F-критерию дисперсиями есть выборок положительных и отрицательных сывороток (p<0,01) 125 Г. Статистические показатели и различие выборок в подтверждающей тест-системе при выявлении реактивности к комплексу NS АГ Статистический 1. Все 2. Интегрально- 3. Интегрально- показатель проблемные отрицательные положительные сыворотки из сыворотки сыворотки (117) группы сывороток сомнительных (39) из группы сомнительных сывороток (78) 2,73 (85) 2,259 (56) 4,166 (25) 0,288 0,267 0,693 2,656 1,998 3,465 7,056 3,994 12,0 Среднее КП АТ к NS-ВГС Стандартная ошибка Стандартное отклонение Дисперсия выборки Статистическая значимость 1. По двухвыборочному F-критерию есть различий между отрицательными и различие между дисперсиями выборок положительными положительных сыворотками в подтверждающей ТС по КП анти- и отрицательных сывороток (p<0,01) NS-ВГС 2. По двухвыборочному z-тесту с различными дисперсиями разница между средними не более чем на 0,7 (p<0,05) 126 В первичной скрининговой ИФТС между группами интегрально-положительных и интегрально-отрицательных образцов не было различий по величине дисперсий выборок, а величина выборочных средних КП различалась не более чем на 0,2 (p<0,05). В первичной скрининговой ИФТС между группами интегрально-положительных и интегрально- отрицательных образцов не было различий по величине дисперсий выборок, а величина выборочных средних КП различалась не более чем на 0,2 (p<0,05). В ИФТС «Monolisa antiHCV PLUS. Version 2» с общим определением антител к ВГС и Core антигена было различие между дисперсиями выборок положительных и отрицательных проб (p<0,05) и между средними не более чем на 0,9 (p<0,05). При определении различия статистических параметров выборок интегральноположительных и интегрально-отрицательных образцов в первой подтверждающей ИФТС с раздельной сорбцией структурных и неструктурных АГ («ВГС-ДСМ-подтверждающий тест») обнаружено, что группы различались по средним величинам КП анти-Core (соответственно 1,66 и 2,28, при p<0,05) и по дисперсиям соответствующих выборок (p<0,05), а также по средним величинам КП анти-NS (соответственно 2,26 и 4,16, p<0,05) и по дисперсиям соответствующих выборок (p<0,01). Таким образом, при использовании статистических критериев было показано различие групп интегрально-положительных и интегрально-отрицательных образцов сыворотки крови по показателям в подтверждающей ИФТС. Критерии для выборки проб в дополнительное подтверждающее исследование были рассчитаны с учетом данных о распределении в интегрально-отрицательной выборке значений КП скрининга, КП анти-Core и КП анти-NS. Как минимум 95% значений КП в первичном скрининге проб из интегральноотрицательной выборки попадает в интервал (0; 2,1), а 99% − в интервал (0; 2,48). Полученное нами значение КП скрининга ≤2, которое может быть принято для проведения дополнительного расширенного исследования проб в планшетных ИФТС, в 2 раза ниже значений КП, при которых в США рекомендовано проводить расширенные исследования на наличие анти-ВГС в иммуноблоте (S/CO ≤ 3,8)[Alter M. J. et al., 2003]. Гипотеза о логнормальности распределения КП проб «инт −» в подтверждающей тест-системе при выявлении реактивности только к антителам к Core-антигену, а также к антителам к комплексу NS АГ принимается с уровнем значимости менее 2% (p< 0,02). В подтверждающей тест-системе при выявлении реактивности антител к Core АГ 95% значений КП анти-Core проб из интегрально-отрицательной выборки попадают в интервал (0; 1,87), а 99% − в интервал (0; 2,02). 127 Как минимум 95% значений КП анти-NS проб из интегрально-отрицательной выборки попадают в интервал (0; 3,2), а 99% − в интервал (0; 4,16). Соответствующие величины КП (при < 0,05): в скрининге КП анти-ВГС ниже 2,1 (округленно 2); при подтверждении КП анти-Core ниже 2,13 (округленно 2); КП анти-NS ниже 3,2 (округленно 3) − могут быть обоснованно приняты за пограничные значения для проведения дополнительного подтверждающего исследования образцов сыворотки, которые в первой подтверждающей тест-системе были низкопозитивными, поскольку в интервалах от 0 до данных значений КП с вероятностью 95% находятся пробы с интегрально-отрицательным результатом. По результатам проведенного анализа была предложен алгоритм исследования наличия анти-ВГС в пробах при массовом скрининге, в котором: была обоснована необходимость использования тест-систем разных производителей; были разработаны критерии отбора проб в дополнительное подтверждающее исследование для предотвращения сообщения ложно-позитивного результата; была обоснована необходимость использования ИФТС планшетного формата с раздельным определением антител, направленных к четырем антигенам ВГС, для дополнительных исследований низкопозитивных проб; использование этих тест-систем уменьшает риск сообщения ложнопозитивного результата за счет возможности сообщения неопределенного результата исследований; необходимость использования иммуноблота как референсного метода в случае противоречивых результатов в ИФА планшетного формата для предотвращения сообщения ложноотрицательного результата. На рис. 5.1 представлен разработанный нами полный алгоритм исследования проб сыворотки крови на наличие антител к ВГС, включающий первичный скрининг и подтверждение наличия анти-ВГС в пробах, позитивных на этапе первичного скрининга (А), а также дополнительное расширенное исследование проб с низким коэффициентом позитивности в подтверждающем исследовании (Б). 128 А Сыворотка крови, направленная на исследование в скрининговую лабораторию 1 этап исследования (по приказу МЗ РФ №384 от 30.10.2000 г.) -скрининговые ИФТС: в одной общей лунке тестирование АТ к Core- и к NS- белкам Не обнаружены анти-ВГС Обнаружены анти-ВГС 2 этап (по приказу МЗ РФ №384 от 30.10.2000 г.) – подтверждающие ИФТС с раздельным тестированием АТ к Core- и NS- белкам Не обнаружены анти -ВГС Обнаружены анти- ВГС (анти-Core и анти-NS) ____________________________________________________________________ Обнаружены анти- ВГС (анти-Core и анти-NS) в подтверждающем тесте (по приказу МЗ РФ №384 от 30.10.2000 г.) Б 1.Обнаружены только Ат-Core ВГС КП>2 Обнаружены анти-ВГС* КП<2 Дополнительное подтверждение: ИФТС другого производителя Обнаружены Ат-Core ВГС: Обнаружены анти-ВГС* Не обнаружены Ат-Core ВГС: требуется исследование в ЛИА или ИБ или ИФТС «спектр»* 2.Обнаружены только Ат-NS ВГС КП<3 Дополнительное подтверждение: ИФТС другого производителя Обнаружены АТ-NS ВГС или АТ к NS3/NS4/NS5 АГ Результат неопределенный или позитивный * 3.Обнаружены Ат-Core ВГС, КП<2, Ат-NS ВГС, КП<3 КП анти-NS >3, Обнаружены анти-ВГС* Не обнаружены Ат-NS ВГС: требуется исследование в ЛИА или ИБ или ИФТС «спектр»* 4.Обнаружены анти-Core, КП >2 и анти-NS, КП >3 Результат: Обнаружены анти-ВГС Дополнительное подтверждение: ИФТС другого производителя Обнаружены Ат-Core ВГС и/или Ат-NS ВГС Ответ неопределенный или позитивный * Не обнаружены Ат-NS ВГС: требуется исследование в ЛИА или ИБ или ИФТС «спектр»* Рис. 5.1. Усовершенствованный алгоритм исследования сыворотки крови на наличие антител к вирусу гепатита С. А − алгоритм исследования проб на наличие анти-ВГС по приказу МЗ РФ №384 от 30.10.2000 Б − алгоритм дополнительного исследования проб с низким КП анти-Core и/или анти-NS в подтверждающем тесте * − ответ в соответствии с инструкцией к тест-системе с указанием КП обнаруженных антител 129 Второй (упрощенный) вариант алгоритма, в котором использовано минимальное количество тест-систем (в том числе, возможно, только одного производителя), обеспечивающий объективность информации о результатах исследования, включает 1) скрининговую ИФТС с общим определением анти-ВГС, 2) подтверждающую тест-систему с определением анти-Core и анти-NS, 3) тест-систему с раздельным определением анти-Core, анти-NS3, анти-NS4, анти-NS5 (Практические рекомендации, №1). Простой расчет интервалов КП анти-Core приказу подтверждения, в которых и анти-NS ВГС из обязательного по содержатся позитивные результаты, не подтверждающиеся при исследовании в тест-системах с определением спектра антител, проведен с использованием тест-систем одного производителя: скрининг – в ИФТС «Бестанти-ВГС», подтверждение – в ИФТС «Анти-ВГС-подтверждающий тест», дополнительное подтверждение в ИФТС «Бест-анти-ВГС-спектр» по данным ноября 2012 г. и сентября 2014 года. Результаты представлены в таблице 5.8 (А и Б). Таблица 5.8 Результаты подтверждения наличия анти-ВГС в образцах сыворотки крови, низкопозитивных в подтверждающей ИФТС с определением анти-Core и анти-NS (ИФТС1 − Бест-анти-ВГС, комплект 4) и в ИФТС «спектр» (ИФТС2 − Бест-анти-ВГСспектр) в 2012 году (А) и в 2014 году (Б). Группы проб Интервал ОП маркера в подтверждающей ИФТС1 Количество проб в интервале ИФТС1 Количество отрицательных проб в ИФТС «спектр» % отрицательных проб в ИФТС «спектр» Результат в ИФТС «спектр» А) 1 1<КП анти-Core<2 47 27 57,4% 2 2<КП анти-Core<3 42 14 33,3% 3 3<КП анти-Core<6 32 3 9,4% 4 1<КП анти- NS <3 225 132 58,7% 5 3<КП анти- NS <6 100 16 16% 6 6<КП анти- NS <9 121 6 5% 93,2% всех проб с отрицательным результатом в ИФТС «спектр» (41 из 44) находится в интервале 1<КП анти-Core<3 96,1% всех проб с отрицательным результатом в ИФТС «спектр» находится в интервале 1<КП анти- NS <6 130 Группы проб Интервал ОП маркера в подтверждающей ИФТС1 Количество проб в интервале ИФТС1 Количество отрицательных проб в ИФТС «спектр» % отрицательных проб в ИФТС «спектр» Результат в ИФТС «спектр» Б) 1 1<КП анти-Core<2 24 6 25%* 2 2<КП анти-Core<3 17 0 0%** 3 3<КП анти-Core<6 4 0 0% 4 1<КП анти- NS <3 104 2 2%** 5 3<КП анти- NS <6 36 0 0%** 6 6<КП анти- NS <9 11 0 0%* 100% всех проб с отрицательным результатом в ИФТС «спектр» находится в интервале 1<КП анти-Core<2 100% всех проб с отрицательным результатом в ИФТС «спектр» находится в интервале 1<КП анти- NS <3 Примечание: * − отличие от показателей соответствующего интервала КП в 2012 г. при p<0,05; ** − отличие от показателей соответствующего интервала КП в 2012 г. при p<0,001. В ноябре 2012 г. для определения наличия анти-ВГС в первичном скрининге, первом и дополнительном подтверждении были использованы тест-системы одного и того же производителя. Из общего количества 66333 пробы при первичном скрининге положительными были 4050 пробы (6,11%). Из них в тест-системе с определением анти-Core и комплексом анти-NS ВГС анти-ВГС были обнаружены в 3188 пробе (4,81% от общего количества исследованных проб). Результат исследования 220 проб был неопределенным в тест-системе «спектр»; по одному виду антител выявлялось в следующем соотношении: в 55 пробах (25%) – антитела к NS3-белку, в 154 пробах (70%) – антитела к NS4-белку, в 11 пробах (5%) – антитела к NS5-белку. Для разработки критериев отбора в дополнительное исследование при использовании тест-систем только одного производителя из 3188 проб были отобраны 567 проб с КП антиCore менее 6, КП анти-NS менее 9. Было проведено дополнительное исследование этих проб в тест-системе планшетного формата с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенам ВГС. Результаты исследования низкопозитивных проб представлены в таблице 5.8 (А). По результатам исследований был проведен расчет интервалов оптической 131 плотности проб в тест-системах с раздельным выявлением Core-антигена и комплекса NSантигенов ВГС, в которых большая часть проб имеет окончательный отрицательный результат исследования в тест-системах с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенам ВГС. Было подсчитано количество проб с отрицательными результатами в тест-системах «спектр», взятых из разных интервалов ОП в тест-системах с раздельным выявлением Coreантигена и комплекса NS-антигенов ВГС. Согласно расчету, представленному в таблице 5.8 (А) при отборе в дополнительное исследование в ИФТС «спектр» проб с КП анти-Core более 1, но менее 2, наличие анти-Core в пробах не подтвердилось в 57,4% проб. В интервале 2<КП анти-Core<3 наличие анти-Core в ИФТС «спектр» не подтвердилось в 33,3%, а в интервале 3<КП анти-Core<6 – в 9,4% проб. В интервале 1<КП анти-Core<3 находилось 93,2% всех проб, наличие в которых анти-Core не подтвердилось в дополнительных исследованиях в ИФТС «спектр». При выборке в дополнительное исследование в ИФТС «спектр» проб с КП анти-NS более 1, но менее 3, наличие анти-NS не подтвердилось в 58,7% (в 132 из 225 проб); с КП более 3, но менее 6 – в 16% (в 16 из 100 проб); с КП более 6, но менее 9 – в 5% (в 6 из 121 проб). В интервале 1<КП анти-NS <6 находилось 96,1% проб, наличие в которых анти-NS не подтвердилось в дополнительных исследованиях. Итого, используя критерии дополнительного исследования проб с КП анти-Core менее 3, либо с КП анти-NS менее 6, в дополнительное исследование следовало отобрать 414 проб (0,62% от общего количества проб, исследованных в ноябре 2012 г.). При использовании тест-систем того же производителя в сентябре 2014 г. (то есть примерно через 2 года) были получены следующие результаты (таблица 5.8, Б). Всего на наличие анти-ВГС было исследовано 60763 проб сыворотки крови, полученных от пациентов ЛПУ г.Москвы. Из них положительными в первичном скрининге были 3206 пробы (5,28%); при исследовании первично-положительных проб в тест-системах с определением анти-Core и антител к комплексу NS-антигенов наличие анти-ВГС обнаружено в 2724 пробах (4,48%). Из общего количества исследованных в сентябре 2014 г. 60763 проб были отобраны 216 проб (0,36%) с КП анти-Core<6 или с КП анти-NS <9. Из этого количества 196 проб были исследованы в тест-системе «спектр». Было обнаружено, что все пробы с отрицательными результатами в ТС «спектр» были выбраны из интервала КП анти-Core <2. При дополнительном исследовании проб с низкими значениями КП анти-NS было обнаружено следующее. Из интервала 1< КП анти-NS <3 неопределенный результат исследования был в 91 пробе, из них в 24 пробах – вследствие обнаружения анти-NS3 (26,37%), в 62 пробах – вследствие обнаружения анти-NS4 (68,13%), в 5 пробах – по анти- 132 NS5 (5,49%). В этом же интервале как положительные были идентифицированы 11 проб (по совместному наличию антител к NS3 и другим неструктурным антигенам ВГС). В интервале 3<КП анти-NS<6 результат исследования 31 пробы был неопределенным, из них в 11 пробах были обнаружены только анти-NS3 (35,48%), в 19 пробах – только антиNS4 (61,29%), в 1 пробе – только анти-NS5 (3,22%). В этом же интервале как положительные были идентифицированы 5 проб (по наличию антител к NS3 и другим антигенам ВГС). В интервале 6<КП анти-NS<9 результат исследования 7 проб был неопределенным, из них в 3 пробах были обнаружены анти-NS3 (42,86%), в 4 пробах – анти-NS4 (57,14%). В этом же интервале как положительные были идентифицированы 4 пробы (по наличию антител к NS4 и другим антигенам ВГС). Таким образом, все отрицательные результаты в тест-системе «спектр» получены в пробах, выбранных из подтверждающей тест-системы с КП анти-Core <2 и КП анти-NS <3. В целом, результаты исследования 129 проб из 151 пробы неопределенными. Соотношение количества проб с обнаруженными (85%) были антителами, направленными к NS3, NS4, NS5 антигенам было соответственно равно 29,5% : 65,9% : 4,6%. Кроме 24 проб с КП анти-Core более 1, но менее 3, исследованных дополнительно в тест-системе «спектр», еще 20 проб с КП в том же интервале были протестированы в той же тест-системе, в которой проводили первое подтверждение наличия анти-ВГС, то есть с определением анти-Core и анти-NS. Из 20 проб при повторном исследовании в одной пробе не были обнаружены анти-ВГС, а 19 проб были идентифицированы как содержащие антиCore. Полученные нами сведения о количестве проб, которые являются низкопозитивными в скрининге и в первом подтверждающем исследовании (что обуславливает необходимость проведения дополнительного тестирования в планшетных диагностических системах с раздельным выявлением антител к 4 антигенам ВГС), были учтены при разработке алгоритма исследования. Алгоритм, представленный в практических рекомендациях №1, обеспечивает получение объективного, в том числе неопределенного, результата исследования с указанием направленности антител к определенному антигену ВГС. 5.5. Количество дополнительных исследований и увеличение стоимости массового скрининга анти-ВГС Результаты различных вариантов расширенного подтверждения наличия анти-ВГС представлены ниже. В IV квартале 2004 г. при проведении первичного скрининга в ТС 133 «ИФА-anti-HCV» из 102570 сывороток 6789 (6,62%) образцов были признаны первичноположительными, из них у 436 (6,42%) проб в первичном скрининге КП был менее 3. От общего количества исследованных проб (102570) эти 436 пробы с низкой позитивной ОП составляли 0,43%. Для верификации положительного результата эти пробы были протестированы в нескольких ИФТС: «Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2» и в конфирматорных ИФТС разных производителей: «РекомбиБест анти-ВГС подтверждающий тест» и «ВГС-ДСМ подтверждающий тест». Из 436 низкопозитивных сывороток были признаны положительными 282 сыворотки (64,67% низкопозитивных проб); 137 (31,42%) проб при дальнейшем анализе были признаны отрицательными. Относительно 17 проб (3,9%) однозначный вывод сделать не удалось, было рекомендовано повторить забор крови. При использовании диагностических систем планшетного формата для ИФА, в которых есть критерии неопределенного ответа, были получены следующие результаты. В мае 2006 г. при использовании в качестве скрининговой ТС «РекомбиБест анти-ВГС» из 39105 исследованных проб первично-положительными были признаны 2748 (7,03%) проб, из них 283 были низкопозитивными с КП в скрининге менее 3 (10,3% от первично- или условно-положительных сывороток). От общего количества исследованных проб (39105) 283 пробы с низкой положительной ОП составляли 0,73%. Из 283 низкопозитивных проб результаты исследования 133 (47%) проб были положительными, 69 (24,38%) проб – отрицательными, а результат тестирования 81 (28,6%) пробы был неопределенным в соответствии с инструкциями к использованным ТС планшетного формата с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенам ВГС. В 81 пробе с неопределенным результатом выявлялось по 1 виду антител в следующем соотношении: в 1 (1,23%) сыворотке – антитела к Core-белку (неопределенный ответ выдан по результатам ЛИА), в 23 (28,4%) пробах – антитела к NS3-белку, в 54 (66,67%) пробах – антитела к NS4-белку, в 3 (3,7%) пробах – антитела к NS5-белку. Таким образом, в 2006 г. при использовании ТС, в инструкции к которым есть критерии неопределенного результата, по сравнению с 2004 годом доля позитивных ответов при исследовании первично (условно)-низкопозитивных сывороток снизилась с 64,7 до 47 % (p<0,001). В меньшей степени снизилась доля негативных ответов – с 31,42 до 24,38% (p<0,05). При использовании ЛИА как референсного способа оценки противоречивых данных в первом полугодии 2007 года получены следующие результаты. Всего было исследовано 264587 образцов сыворотки, с помощью ЛИА проанализирован 181 образец (0,07%), поскольку в подтверждающих ИФТС различных производителей: «РекомбиБест анти–ВГС тест» и «ИФА-анти-HCV-спектр-GM» были получены противоречивые результаты. По 134 данным 2007 г., от 20 до 30% образцов, низкопозитивных в скрининговой и в подтверждающей ИФТС «РекомбиБест анти–ВГС-подтверждающий тест», в двух дополнительных подтверждающих ИФТС «ВГС-ДСМ- подтверждающий тест», (НПО «Медико-биологический союз», г.Новосибирск) и «ИФА-анти-HCV-спектр-GM» (НПО «Диагностические системы», Н.-Новгород) оцениваются как не содержащие анти-ВГС. В ЛИА из проб с противоречивыми результатами 28% были признаны анти-ВГС-позитивными, 32% анти-ВГС-негативными, а результаты исследования 40% проб признаны неопределенными. Как следует из сравнения распределения положительных, отрицательных и неопределенных ответов, количество подтвержденных положительных результатов при разных способах дополнительного исследования (рис. 5.2) различается. 100,0% 3,9% % различных результатов в подтверждении 90,0% 80,0% 28,6% 31,4% 40% 70,0% 24,4% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 32% * 64,7% * 47,0% 20,0% * 28% ЛИА ИФТС "спектр" 0,0% ИФТС нескольких производителей 10,0% неопределенные отрицательные положительные Дополнительное подтверждение Рис. 5.2. Распределение положительных, отрицательных и неопределенных ответов и различие долей положительных ответов (*p<0,001) при разных вариантах дополнительного подтверждения. 135 Полученные нами данные о количестве проб, которые являются низкопозитивными в скрининге и исследование которых следует продолжить в ИФТС «спектр» для получения объективного результата исследований, представлены в разделе «Практические рекомендации, №1». Расчеты показывают, что стоимость массового скрининга анти-ВГС (включающего первичный скрининг и обязательное подтверждение положительных в нем проб в ИФТС с определением анти-Core и анти-NS) при использовании для выборочного исследования проб с низким КП (составляющих не более 10% проб, положительных при конфирмации) ИФТС «спектр» возрастает не более чем на 3−4%, исходя из цен на диагностические системы 2013 г. (Была использована стоимость диагностических систем производства ЗАО «Вектор-Бест»). Так, для исследования проб, полученных от 100000 физических лиц, на скрининг и обязательное подтверждение (примерно 7% − 7000 проб) в ИФТС требуется примерно 1935000 руб. (с учетом необходимых контролей). Для исследования низкопозитивных проб (примерно 500) требуется дополнительно 60000 − 80 000 руб. При дополнительном исследовании в ИБ примерно 2% низкопозитивных проб с противоречивыми результатами стоимость массового скрининга увеличивается еще на 5,5%. Общая стоимость скрининга с использованием ИФТС «Анти-ВГС-спектр» и ЛИА ВГС не превысит 10%. Для сравнения, при принятом в США порядке исследования (для исследования всех низкопозитивных образцов в скрининге рекомендуется ИБ) увеличение общей стоимости массового скрининга составило бы примерно 30%. Обсуждая полученные в этой главе результаты, следует отметить, что многочисленные данные, представленные российскими и зарубежными исследователями, свидетельствуют о сложности интерпретации результатов исследования анти-ВГС как с помощью различных видов хемилюминесцентного), так анализа (ИФА, линейного иммуноферментного и и в тест-системах, относящихся к одному и тому же виду анализа, например, ИФА [Tobler L. H. et al., 2000]. Наиболее актуальными являются результаты, полученные при использовании диагностических систем, разрешенных для лабораторной диагностики в определенной стране [Alter M.J. et al., 2003; Ren F.R. et al., 2005]. В нашей работе были сопоставлены результаты исследования проб в наиболее часто используемых в России скрининговых и подтверждающих ИФТС планшетного формата (как российских, так и зарубежных производителей). При низкопозитивных результатах в скрининговой и в подтверждающей ИФТС, как свидетельствуют полученные нами [Потапова А.А., Ковальчук Л.В., 2006] и литературные данные [Кузина Л.Е. и др., 2004], 136 оправдано критическое отношение к результатам исследования, поскольку в ИФТС другого производителя в 20-30% анти-ВГС, по нашим данным, не обнаруживаются. Отрицательные результаты определения анти-ВГС в ИФТС планшетного формата могут сочетаться с неопределенными результатами определения данных маркеров в ИБ; в работе Schroter M. с соавт. доля таких образцов составляла 13%; отсутствие клинических и биохимических признаков заболевания через 3 месяца привели исследователей к выводу о неспецифической реактивности проб в ИБ [Schroter M. et al., 1999]. В то же время положительный результат исследования анти-ВГС может маскироваться неспецифической реакцией сыворотки крови в ИБ, например, в ЛИА на стрептавидин, который используется для фиксации на твердой фазе антигенов ВГС. В нашей работе примером подобной ложной интерпретации реактивности пробы как неспецифической является результат исследования образца № 1071 в таблице 5.4, поскольку при исследовании в иммуночипах в пробе были обнаружены антитела, направленные к нескольким антигенам ВГС. В работе интерпретации других исследователей результатов в ИБ рассматривался вопрос неопределенных при как о правомерности их неоднократном воспроизведении (при положительном результате в ИФА) в течение нескольких лет [Piro L. et al., 2008]. Противоречивые в нескольких диагностических системах результаты определения анти-ВГС, по-видимому, могут иметь отношение к проблеме диагностики скрытого гепатита С, которая более подробно рассматривается в главе «Иммуночипы». Статистических различий между результатами, полученными в использованных нами ИБ, не было. В то же время, при рассмотрении результатов тестирования отдельных проб выявлены определенные противоречия, в ряде случаев обусловленные разным способом интерпретации результатов. Данные литературы также свидетельствуют о том, что использование для подтверждения скрининговых результатов иммуноблотов различных фирм приводит к получению противоречивых результатов [Ястребова О.Н., 2003, 2003а]. В целом, у исследователей возникают сомнения в правомерности референсного использования ИБ вследствие более низкой чувствительности. Одним из способов определения окончательного результата исследования так называемых проблемных образцов является достижение «диагностического консенсуса», согласно которому заключение о наличии анти-ВГС делается по совокупности результатов, полученных в нескольких ИФТС [Suslov A. P. et al., 2002], однако при массовом скрининге крови (более 2000 образцов в день) этот способ чрезвычайно трудоемок. При массовом скрининге количество так называемых проблемных образцов достаточно велико: к низкопозитивным образцам, которые необходимо исследовать дополнительно для определения достоверного результата, относится до 10% образцов, положительных в 137 первичном скрининге [Feucht H.H. et al., 1999; Потапова А.А. и др., 2004]. Мы использовали этот подход для определения параметров группы, пробы из которой необходимо исследовать дополнительно для достижения объективного результата, возможно, без включения в исследование иммуноблотов в качестве референсных тест-систем. Об актуальности нашего подхода свидетельствовало более позднее предложение Британского Агентства по Защите здоровья, выдвинутое в 2008 г.: в качестве альтернативы ИБ для подтверждения наличия анти-ВГС у пациентов с ослабленным иммунитетом может использоваться не ИБ, а вторая ИФТС. Авторами исследования было сделано заключение, что ИФТС планшетного формата Monolisa может использоваться в качестве альтернативы ИБ для подтверждения наличия анти-ВГС в пробах, положительных в первичном скрининге (в ИФТС «AxSYM»). Чувствительность и специфичность подтверждения результатов с Monolisa Plus составляли 98.15 % и 98.33. При исключении из исследования проб сыворотки крови пациентов с ослабленным иммунитетом с ложноотрицательными результатами определения антител к ВГС чувствительность составляла 99.58%. [Vermeersch P. et al., 2008]. В нашем исследовании «Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2” была одной из скрининговых ИФТС в комплексном исследовании низкопозитивных проб. Полученные нами результаты приводят к выводу о том, что в лабораторной практике для исследования так называемых проблемных проб полезно использовать ИФТС планшетного формата с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенам ВГС, в инструкции которых введены критерии неопределенного результата. Варианты разработанного нами алгоритма пригодны для массовых исследований, причем при сравнении результатов 2012 и 2014 гг. была продемонстрирована целесообразность периодического пересчета границ интервалов, из которых необходимо производить выборку проб для расширенного исследования в тест-системах «спектр». Определение антител различной направленности, в том числе только к одному антигену, позволяет сообщать ответ, адекватный полученным результатам, в том числе в отношении сывороток, которые с помощью современных ИФТС не могут быть определены однозначно как содержащие или не содержащие анти-ВГС. Введение формулировки «неопределенный результат исследований на наличие анти-ВГС» при массовом скрининге повышает достоверность сообщаемого результата исследований, но несколько снижает диагностическую значимость теста определения анти-ВГС в сложных случаях. В целом, это отражает место данного вида лабораторных исследований как части комплекса мероприятий при диагностике вирусного гепатита С. 138 ГЛАВА 6. ПРОБЛЕМЫ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ МАССОВОГО СКРИНИНГА КРОВИ НА АНТИТЕЛА К ВГС У ПАЦИЕНТОВ ЛПУ Г. МОСКВЫ 6.1. Контингенты пациентов с противоречивыми результатами исследования антител к ВГС Анализ распределения и подтверждаемости наличия анти-ВГС в «проблемных» пробах (с низкой позитивной ОП, с противоречивыми результатами в разных тест-системах) в обследуемых контингентах проведен за период с января по август 2002 года (таблица 6.1). Таблица 6.1 Распределение «проблемных» сывороток по группам пациентов и процент подтверждения положительных результатов в каждой группе № Количество Количество Из «проблемных» % подтвержденных групп- положительных «проблемных» проб выдано пы результатов в проб в группе положитель-ными сывороток от группе положительных количества «проблемных» в группе 1 2 3 6875 797 61 933 102 15 317 44 2 4 5 6 77 495 419 25 58 50 7 20 25 7 1512 38 24 8 Всего . 1822 12058 112 1333 32 471 33,98% 43,13% 13,13%, p<0,05 28% 34,48% 50%, p<0,05 63,16% p<0,01 28,57% 35,33% Примечание. Группы пациентов ЛПУ г. Москвы: 1 − обследование по общим показаниям; 2 − беременные женщины; 3 − дети первого года жизни с высоким риском инфицирования; 4 − мед. персонал отделений гемодиализа и прочих мед. учреждений; 5 − пациенты отделений с высоким риском заражения гепатитом С; 6 − больные с хроническими заболеваниями печени; 7 − пациенты наркологических больниц и диспансеров; 8 − пациенты кожно-венерологических диспансеров. 139 В дополнительное исследование брали сыворотки с КП в первичной скрининговой постановке от 1,0 до 3,0, в среднем 1,674+0,067, у которых в первой подтверждающей тестсистеме обнаруживались а) антитела только к Core-АГ, КП не более 3, б) антитела только к NS, КП не более 6. В 2002 году в среднем за месяц отбирались в постановку на 3-х тестсистемах 161,63+15,5 проб, за 8 месяцев 2002 года это количество составило 1333 проб (11% из общего количества обследованных сывороток, равного 120580). Результаты, полученные при подтверждающих исследованиях в группах с различным риском инфицирования ВГС, сравнивались с результатами в группе 1 – лиц с неустановленными факторами риска, где подтверждалось как положительные 33,98% результатов. Наибольшее количество «сомнительных» результатов подтвердилось при расширенных исследованиях среди проб пациентов наркологических ЛПУ − 63,16%, что примерно вдвое больше, чем среди лиц с неустановленными факторами риска инфицирования ВГС (p<0,01). Как правило, не подтверждающиеся результаты принадлежали пациентам с хроническим алкоголизмом, а не потребителям внутривенных наркотиков. В группе пациентов с заболеваниями печени (гр. 6) процент подтвержденных положительных результатов был больше (p<0,05), чем в группе 1. Количество «проблемных» проб сыворотки крови беременных, в которых было подтверждено наличие анти-ВГС в расширенных исследованиях (43,13%), не отличалось от результатов исследования сыворотки крови лиц, обследованных по общим показаниям (33,98%), при использовании ИФТС «ИФА- anti-HCV», в подтверждении − в ИФТС «ВГСДСМ−подтверждающий тест». При использовании в качестве первичной скрининговой ТС «ВекторБест-анти-ВГС», а в качестве подтверждающей – ТС «ВекторБест-анти-ВГСподтверждающий тест» были получены результаты, отличающиеся от описанных выше. А именно, в 2005 г. среди всех исследованных сывороток подтверждалось 67,62% первично(условно)-положительных результатов, а в группе беременных женщин − только 57,14% (p<0,05). Таким образом, уровень ложно-позитивных результатов при тестировании крови беременных женщин во многом зависел от используемых тест-систем. Кроме свойств используемого диагностикума, по-видимому, имеет значение характер развития гестационного процесса. Примером является динамика развития беременности у пациентки К., в двух пробах сыворотки крови которой при использовании одних и тех же ИФТС планшетного формата в 10 недель беременности анти-ВГС не были обнаружены, а в 26 недель беременности при развитии антифосфолипидного синдрома были обнаружены антиNS4 ВГС (результат исследования неопределенный). Результаты исследования, представленные в таблице 6.1, свидетельствуют о том, что в группе детей первого года жизни (гр. 3) процент подтвержденных положительных результатов был меньше по сравнению с 140 группой, обследованной по общим показаниям (гр. 1, p<0,05). Во всех пробах сыворотки крови детей отсутствовала РНК ВГС. При анализе группы, обследуемой по общим показаниям (№ 1), обнаружено, что при выделении в ней подгруппы лиц старше 60 лет и моложе 60 лет процент подтверждения в подгруппах отличался. В группе, обследуемой по общим показаниям, с «проблемными» пробами сыворотки крови было 933 человека, из них 333 человека были старше 60 лет. Из 333 «проблемных» проб сыворотки крови лиц старше 60 лет были подтверждены в 3-х системах как анти-ВГС-содержащие 84 пробы (25,22%), что статистически достоверно ниже, чем в подгруппе лиц моложе 60 лиц (600 человек, подтверждено 38,83%, p<0,001) и в общей группе 1 (933 человека, 33,98%, p<0,005). 6.2. Проблемы диагностики ВГС-инфекции у лиц пожилого возраста При анализе распространения антител к ВГС среди пожилых людей в г. Москве нами получены результаты, представленные в таблице 6.2. Таблица 6.2 Распространение анти-ВГС среди людей старше и моложе 60 лет Количество проб на различных этапах Группа пациентов Все исследования в ИФА Моложе Старше 60 лет 60 лет Количество проб в первичном 5167 4211 956 скрининге (% от всех) (100%) (81,49%) (18,51%) Количество проб, 344 309 35 положительных в первичном (6,66%) (7,34%) (3,66%) Количество подтвержденных 322 296 26 положительных сывороток (6,23%) (7,03%) (2,72%)*, скрининге (% в группе) (% в группе) % подтверждения в группе (p<0,001) 93,6% 95,79% 74,29%*(p<0,005) Примечание. Исследования проведены в мае 2003 г.; при первичном скрининге использована тест-система «ИФА-anti-HCV -ДСМ- подтверждающий тест». * - Отличие от результатов в группе лиц моложе 60 лет Пробы сыворотки крови пациентов старше 60 лет составляют примерно 18,5% всех образцов, направляемых на исследование в скрининговую лабораторию (таблица 6.2). В 141 данной возрастной группе распространение антител к ВГС было в 2,58 раза ниже, чем в группе лиц моложе 60 лет (соответственно 2,72% и 7,03%, p<0,001). Кроме того, в старшей возрастной группе наличие анти-ВГС подтверждается в меньшем количестве проб, положительных при первичном скрининге, чем среди людей моложе 60 лет. При определении количества низкопозитивных проб в группах людей моложе и старше 60 лет были проанализированы результаты исследований, проведенных в 3 квартале 2003 г. Анти-ВГС-позитивных проб было 1441, из них 1282 пробы принадлежали людям моложе 60 лет, и из них низкопозитивными были 111 проб (8,66%); 138 проб принадлежали людям старше 60 лет, из них низкопозитивными была 21 проба (15,21%,). Таким образом, в группе лиц старше 60 лет количество образцов сыворотки крови с низкой ОП больше, чем в группе пациентов моложе 60 лет (p<0,05). Для проверки количества проб, которые подтверждаются как анти-ВГС-позитивные в расширенном исследовании, из общей группы низкопозитивных проб были отбраны 111 проб: 94 пробы, полученные от молодых и 17 проб, полученные от пожилых пациентов. Несмотря на то, что по величине ОП между группами низкопозитивных проб пожилых и более молодых людей не было различий, при анализе этих сывороток с помощью дополнительных тест-систем получены отличающиеся результаты (табл. 6.3). Таблица 6.3 Результаты трех этапов исследования: скрининга (I), подтверждения (II) и исследования в дополнительных ТС «Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2” и «Murex anti-HCV», (III) низкопозитивных сывороток пожилых (старше 60 лет) и более молодых людей Группы с низкопозитивными положительными результатами, Этап исследования I. Скрининг, ОП II. Подтверждение, ОП Анти-сore Анти-NS III. В дополнительном подтверждении: количество положительных проб в группе (%) количество в группе (n) Общая группа, n=111 Люди моложе 60 лет, n=94 Люди старше 60 лет, n=17 0,563+0,031* 0,568+0,047 0,537+0,051 0,419+0,014 0,524+0,027 0,417+0,016 0,524+0,029 0,436+0,047 0,527+0,073 51 (45,9%) 47 (50%) 4 (23,5%)* Примечание. * − M±m, ** − Отличие от результатов в группе лиц моложе 60 лет (p<0,05) 142 Из низкопозитивных проб в дополнительных подтверждающих ТС «Monolisa antiHCV PLUS. Version 2” («BIO-RAD», Франция) и «Мюрекс anti-HCV» («Abbott», США) в группе людей старше 60 как анти-ВГС-позитивные подтверждалось только 23,5% − меньше, чем в группе людей моложе 60 лет (50%, p<0,05). 6.3. Определение РНК ВГС в образцах с неопределенными результатами исследования анти-ВГС. Результаты и интерпретация Исследование РНК ВГС в образцах сыворотки крови проводилось в двух контрольных группах: во-первых, в 10 пробах с позитивными результатами исследования анти-ВГС вследствие выявления антител к Core, NS3, NS4, NS5 с высокой ОП (контрольная группа); РНК была обнаружена во всех пробах. Во-вторых, РНК тестировали в 20 пробах пациентов с низкой позитивной ОП анти-ВГС, при этом из 20 проб сыворотки крови РНК ВГС была обнаружена в одной пробе (результат был воспроизведен дважды). Исследование РНК ВГС в образцах сыворотки крови проводилось также в пробах с неопределенными результатами тестирования в ИФТС, в которых неопределенный результат в соответствии с инструкциями относится только к случаям выявления антител к одному из неструктурных антигенов ВГС (таблица 6.4). Среди образцов, результаты исследования которых в ИФТС «спектр» и/или в ИБ были интерпретированы как неопределенные, было 8 проб с КП в скрининге < 3 (в среднем 1,8±0,21) и 12 сывороток с КП в скрининге > 3 (в среднем 6,0 ± 0,86),. Среди представленных в таблице 6.4 двадцати образцов сыворотки крови с неопределенными результатами исследования соотношение обнаруженных анти-ВГС выглядело следующим образом: 6 (30%) с анти-NS3: 13 (65%)с анти-NS4: 1 (5%)с анти-NS5 ВГС. В ИФТС средняя величина (m±σ) КП анти-NS4 была равна 3,84± 3,65; КП анти-NS3 − 1,51 ± 0,42. 143 Таблица 6.4 Неопределенные результаты исследования на наличие анти-ВГС образцов сыворотки № п/п № в постановке Дата первичного исследова-ния Пол Возраст, лет КП в скрининге крови пациентов ЛПУ без определенных факторов риска инфицирования 18 19 20 683 59 377 30.08.2006 14.09.2006 15.09.2006 М Ж Ж 77 81 78 1,75 2,13 1,2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 6 7 1601 42 105 2377 400 804 221 928 894 1268 1878 809 2099 14 135 13.03.2007 13.03.2007 07.03.2007 07.03.2007 15.03.2007 19.03.07 15.09.2006 19.03.2007 19.03.2007 12.09.2006 12.09.2006 12.09.2006 13.10.2006 16.10.2006 16.10.2006 21.03.2007 06.04.2007 М Ж Ж М Ж Ж Ж М Ж Ж Ж Ж М М М Ж Ж 40 28 35 31 23 25 71 76 10 64 79 70 63 79 68 82 45 Результаты определения анти-ВГС в подтверждающих ИФТС* ИФ АТ КП*** ТС к АГ 3,47 5,13 3,70 1,71 1,6 7,17 2,8 3,18 1,50 7,61 2,64 1,31 2,55 1,17 12,2 5,7 1,19 ДС ДС ДС ДС ДС ДС РБ РБ РБ РБ РБ РБ РБ РБ РБ РБ ДС РБ РБ РБ NS§ NS NS NS NS –¶ NS4 NS NS NS3 NS3 NS4 NS4 NS4 NS4 NS NS3 NS4 NS5 NS4 NS3 NS5 1,66 1,13 1,06 1,44 2,09 – 2,79 1,28 1,76 1,9 2,0 5,58 2,64 1,56 12,66 8,44 1,89 1,21 1,56 2,28 1,11 3,82 Результаты определения анти-ВГС в ИБ** ИБ АТ к АГ СП*** ЛИА ЛИА ЛИА ЛИА ЛИА ЛИА – ЛИА ЛИА ЛИА ЛИА ЛИА – ДЦ ДЦ ЛИА ЛИА NS4 NS4 NS3 NS4 NS4 NS4 – NS3 NS3 NS3 NS3 NS4 – NS4 NS4 NS4 NS4 2+ 2+ +/2+ 3+ 3+ – 1+ 1+ 1+ 1+ 3+ – 0,5+ 0,5+ 3+ 2+ – – – – – – – – – Примечание. *ИФТС − иммуноферментная тест-система «ДС-ИФА-анти-HCV-спектр-GM» (ДС) или «РекомбиБест анти-ВГС-подтверждающий тест спектр» (РБ), **ИБ − иммуноблот «ЛИА ВГС» (ЛИА) и «Deciscan HCV PLUS» (ДЦ), ***КП – коэффициент позитивности, СП − степень позитивности в соответствие с инструкциями к соответствующим ТС, § ¶ NS – определение антител к комплексу антигенов ВГС, – антитела не обнаружены. 144 Образцы сыворотки крови с неопределенными результатами тестирования анти-ВГС были исследованы на присутствие сывороточной РНК ВГС с помощью ПЦР с разделением продуктов реакции в геле и ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. При проведении ПЦР с электрофоретическим разделением продуктов реакции было обнаружено, что из 20 сывороток, представленные в табл. 1, только в 2-х сыворотках – с порядковым № 11 (№ исследования 894 от 12.09. 2006, женщина 79 лет) и с порядковым № 19 (№ исследования 59 от 14.09.2006, женщина 81 года) в агарозном геле визуально обнаруживались слабые полосы, соответствующие фрагментам кДНК ВГС. Отрицательный контрольный образец свидетельствовал об отсутствии контаминации и позволял учитывать результаты реакции (рисунок 6.1). (+) (-) 1 2 3 4 5 6 Рис. 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 6.1. Результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР 20 сывороток: фрагменты кДНК (240 н.п.), комплементарные к РНК ВГС, обнаружены в сыворотках № 11 и №19. Использован электрофорез в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, с детекцией под ультрафиолетом с длиной волны 310 нм. При исследовании тех же 20 образцов сыворотки крови с помощью ПЦР в режиме реального времени ни в одном из образцов не было обнаружено РНК ВГС. На рисунке 6.2 (А, Б) представлены компьютерные изображения сглаженных графиков выявления РНК ВГС. А) позитивный контроль, негативный контроль и результаты ПЦР в первых 14 пробах; Б) результаты ПЦР в пробах с №17 по №20 и дубль отрицательного контроля. Из результатов, представленных на рис. 6.2 (А, Б) следует, что ни в одном образце в ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени не было обнаружено присутствия РНК ВГС. Таким образом, в двух из 20 образцов отмечено расхождение результатов при исследовании РНК ВГС с регистрацией результатов ПЦР в геле (результат низкопозитивный и сомнительный) и с регистрацией результатов ПЦР в режиме реального времени (результат отрицательный). В каждом из этих образцов: в образце № 11 и в образце № 19 в ИФА были обнаружены только анти-NS3 ВГС с низким КП (менее 2). 145 А Б Рисунок 6.2. Регистрация результатов определения РНК ВГС в образцах с неопределенными результатами методом ПЦР в режиме реального времени. Сигмовидная кривая соответствует позитивному контролю. Представлен сглаженный вариант графиков. А) Позитивный контроль, негативный контроль и результаты ПЦР в первых 14 пробах Б) Результаты ПЦР в пробах с №17 по №20 и дубль отрицательного контроля. Кроме того, было проведено исследование наличия РНК ВГС в пробах с неопределенным результатом исследования антител к ВГС в ИФА вследствие обнаружения АТ только к одному из неструктурных белков ВГС с КП более 3, а также с позитивным 146 результатом определения антител к ВГС вследствие обнаружения только анти-Core ВГС. Образцы были протестированы также в ХИАМ. Результаты представлены в таблице 6.5. Таблица 6.5 Результаты определения РНК ВГС в пробах сыворотки крови, протестированных на наличие анти-ВГС методами ИФА и ХИАМ (дата первичного анализа в ИФА − 17. 10. 2014) № № пробы пробы п/п ФИО Г.р. пол 1 1262 С.Г.Н. 1986 ж 2 1370 Д.Л.Х. 1970 ж 3 28 Т.М.В. 1982 ж 4 2567 1941 Ш.О.В. ж 5 769 С.О.В. 1959 м 6 2902 К.В.Н. 1961 ж 7 588 Ф.С.А. 1978 м 8 483 Ч.Н.В. 1949 ж 9 1305 С.А.А. 2004 м 10 1058 С.Т.Ф. 1966 ж ИФТС Скрининг Подтверждение Спектр КП КП КП Антитела Антитела Результат Результат 1,32 1,5 3,13 Анти-NS Анти- NS4 Положит. Неопред. 4,8 7,91 10,53 Анти-NS Анти- NS3 Положит. Неопред. 6,0 1,38 3,87 Анти-NS Анти- NS3 Полож. Неопред. 3,72 2,91 2,4 Анти-Core Анти-Core 1,54 Положит. Анти-NS Положит. 2,71 1,04 1,17 Анти-NS Анти-Core Положит. Положит. 3,48 4,58 10,16 Анти-NS Анти- NS4 Положит. Неопред. 3,94 2,0 3,53 Анти-NS Анти- NS3 Положит. Неопред. 1,6 1,17 8,17 Анти-NS Анти- NS4 Положит. Неопред. 3,24 4,17 2,95 Анти-NS Анти- NS3 Положит. 5,57 Анти- NS4 Положит. 1,25 1,83 3,7 Анти-NS Анти- NS4 Положит. Неопред. ХИАМ ПЦР S/Co Результат Результат 0,05 Отриц. Отриц. 12,46 Полож. 14,92 Полож. 9,96 Полож. 24,74 Полож. 0,03 Отрицат. Отриц. 0,04 Отриц. Отриц. 0,15 Отриц. Отриц. 6,61 Положит. Отрицат. 0,07 Отриц. Отриц. 10,22 Положит. 17,96 Положит. 0,08 Отриц. Отриц. 147 Результаты качественного определения РНК ВГС в таблице 6.5 представлены с указанием цикла амплификации, на котором происходит пересечение кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговым уровнем. Установлено, что РНК ВГС обнаруживается в пробах с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в ИФА, обусловленными выявлением с высокой оптической плотностью только антител к анти-NS3 (КП анти- NS3>3), в которых в ХИАМ также наблюдается высокопозитивная реактивность антител к антигенам ВГС (S/Co более 6, образцы № 2, 3). Для образца №7 была характерна высокая позитивность по наличию анти-NS3 в ИФТС и в ХИАМ, но РНК ВГС не выявлялась. При неопределенном результате исследования в ИФА, обусловленном наличием только анти-NS4 с КП>3, результат определения антител к ВГС в ХИАМ был отрицательным. В данных пробах при предельной чувствительности использованного метода 50 МЕ/мл РНК ВГС не обнаруживалась (образцы №1, 6, 8, 10). При позитивном результате в ИФТС «спектр» вследствие обнаружения антител к NS3 и к NS4, результат определения анти-ВГС в ХИАМ также был положительным, а в пробе обнаруживалась РНК ВГС (проба №9). При положительном результате в ИФТС вследствие обнаружения анти-Core результат в ХИАМ был отрицательным, РНК в пробах также не обнаруживалась (пробы №4, 5). 6.4. Белки сыворотки крови у пожилых пациентов с позитивными, негативными и неопределенными результатами исследования анти-ВГС. Исследование анти-ВГС в пробах крови пациентов с диспротеинемией Было проведено сравнение проб сыворотки крови с отрицательными, положительными и ложноположительными результатами исследования анти-ВГС по содержанию некоторых компонентов, способных, по данным литературы, влиять на результаты ИФА. Во-вторых, мы проверили, выявляется ли в образцах с высоким содержанием этих компонентов неспецифическая реакция в ИФА при тестировании антиВГС. В пробах сыворотки крови, полученных от пожилых пациентов − наиболее массовой группе с проблемами интерпретации результатов тестирования анти-ВГС, − была определена концентрация иммуноглобулинов разных классов, содержание белковых фракций крови, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), С-реактивного белка и ревматоидного фактора. А) Определение концентрации Ig классов G, M, A проводилось в пробах с отрицательными, положительными и ложноположительными результатами исследования анти-ВГС, полученными от пожилых людей. В последних двух группах проводилось 148 выявление РНК ВГС. В группе с предположительно ложнопозитивными результатами исследования анти-ВГС РНК ВГС отсутствовала, в группе проб с анти-ВГС РНК вируса была обнаружена в 6 пробах из 8. Результаты определения концентрации Ig представлены в таблице 6.6. Достоверных различий между группами по концентрации Ig нет, однако можно отметить, что в группе проб без анти-ВГС концентрация IgA превышает границы нормы. Таблица 6.6 Концентрации Ig (M±m) классов G, M, A в пробах сыворотки крови, полученных от пожилых людей, с отрицательными, положительными и ложноположительными результатами исследования анти-ВГС № п/п Результаты исследования Концентрация (МЕ/мл) анти-ВГС, (n) IgG IgM IgA 1 Отрицательные (11) 138,4±12,3 109±14,5 287,6±37,8* 2 Ложноположительные (8) 137,5±16,8 169,9±43,1 217,3±49,2 3 Положительные(6) 154±15,3 165±25,6 220,7±34,1 4 Границы нормы 95−235 60 − 405 55 − 250 Примечание. *−Концентрация IgA превышает границы нормы. Б) При определении фракций белка крови в пробах пожилых людей с отрицательными, положительными и ложноположительными результатами исследования анти-ВГС (в которых было определено также содержание Ig разных классов) получены результаты, представленные в таблице 6.7. 149 Таблица 6.7 Содержание фракций белков (M ± m) в сыворотке крови пациентов старше 60 лет в пробах с отрицательными, положительными и ложно-положительными результатами исследования анти-ВГС № Фракция белка, Результаты исследования анти-ВГС в группе, Интервал п/п % (n) нормы Отрицат. Ложнопо- Положит. (11) ложит. (8) (6) 1 Альбумин 58,1±1,1 56,7±1,7 56,3±1,3 52,4− 69,4 2 α 1-глобулины 4,1±1,8 4,6±0,3* 3,8±0,1 1,3 − 3,9 3 α 2-глобулины 10,4±0,6 9,6±0,7 9,2±0,6 5,4 − 11,6 4 β-глобулины 12,8±0,5 11,6±0,6 12,1±0,5 9,0 − 17,4 5 γ-глобулины 14,5±0,7 17,4±1,1 18,5±0,9 9,3 − 20,3 Примечание. * −Отличие от группы сывороток, содержащих анти-ВГС, p=0,019; − повышение по сравнению с нормой Из результатов, представленных в таблице 6.7, следует, что не было обнаружено различий между анти-ВГС-отрицательными, анти-ВГС-положительными пробами и пробами с ложной позитивностью по содержанию альбумина, α2-, β- и γ-глобулинов. В группе с противоречивыми результатами, которые были признаны ложнопозитивными, по сравнению с группой положительных на анти-ВГС проб (3,8±0,1%, p=0,019) было увеличено содержание α1-фракции (4,6±0,3%), превышающее границы нормы (1,3 − 3,9%). В группе проб, не содержащих анти-ВГС, содержание α1-фракции также превышало границы нормы, установленной для людей среднего возраста, но не отличалось от результатов, полученных в группе анти-ВГС-содержащих проб. На рис. 6.3 представлена электрофореграмма пробы сыворотки крови пациента с ложнопозитивным результатом исследования анти-ВГС и повышенным содержанием фракций α-1- , α-2- и γ-глобулинов при сниженном содержании альбумина. 150 Рис. 6.3. Электрофореграмма пациента с ложнопозитивным результатом исследования анти-ВГС. На электрофореграмме пациента с ложноположительным результатом определения анти-ВГС видно увеличение содержания в сыворотке крови фракций α1- , α2- и γ-глобулинов. Дополнительные исследования были проведены для того, чтобы выяснить, вызывает ли гипер-γ-глобулинемия ложноположительные результаты ИФА (таблица 6.8) 151 Таблица 6.8 Парапротеинемии и γ-глобулинопатии у пациентов с отрицательными, положительными и ложноположительными результатами исследования анти-ВГС № группы Номер пробы в постановке Содержание α-глобулинов Содержание γ-глобулинов 1. Пробы без № п/п пробы в группе 1 5824 норма Gκ (10,1 г/л) анти-ВГС 2 5832 норма Мκ (6,7 г/л), Gλ (5,7 г/л) 2. Пробы с анти-ВГС 3. Пробы с ложноположительным результатом 3 5833 норма Gκ (23,7 г/л) 4 5841 норма Аκ (26,0 г/л) 5 5843 норма Gκ (41,0 г/л) 6 5856 норма Аκ (74,0 г/л) 7 5863 норма Мκ (12,5 г/л) 8 5874 норма Gλ (15,3 г/л) 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 5875 5893 5911 5924 5916 5918 5942 *5845 5777 5780 ↑ α1, α2 норма ↑ α1 ↑ α1, α2 норма норма ↑ α1 норма ↑ α1 норма Мκ Gλ (17,3 г/л) Gλ (22,5 г/л) ↑IgA Гипер-γ-глобулинемия Гипер-γ-глобулинемия Гипер-γ-глобулинемия Гипо-γ-глобулинемия Гипер-γ-глобулинемия Гипер-γ-глобулинемия: ↑ IgG, IgA 1 5908 ↑ α1, α2 гипо-γ-глобулинемия 2 3 5914 5776 ↑ α1, α2 норма норма Аκ (16,0 г/л) Примечание. * − Пациент ВИЧ-инфицирован Полученные результаты (15 из 45 представлены в таблице 6.8) свидетельствуют о том, что при исследовании проб больных гаммаглобулинопатиями не обнаруживалось ложноположительных реакций как в первичных скрининговых, так и в подтверждающих диагностических системах. В группе проб с ложнопозитивными результатами исследования 152 анти-ВГС могла обнаруживаться как гипо-, так и гипер-γ-глобулинемия и нормальное содержание γ-глобулинов при повышенном содержании α1- и α2-глобулинов. В) При определении циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в пробах сыворотки крови пожилых людей с отрицательными (11), положительными (6) и противоречивыми (8) результатами исследования, признанными не содержащими анти-ВГС, было установлено, что в пробах без анти-ВГС и в пробах с противоречивыми результатами исследования содержание ЦИК («M±m» соответственно 44,09±3,72 ед./мл и 48,38±5,23 ед./мл) не превышало границ нормы (55 ед./мл). В группе положительных на анти-ВГС пробах количество ЦИК было повышено по сравнению с анти-ВГС-отрицательными пробами и пробами с противоречивыми результатами исследования анти-ВГС (80,83+ 15,85 ед./мл, p<0,05). Г) Результаты выявления ревматоидного фактора в пробах сыворотки крови, полученных от пожилых пациентов, с положительными (33), отрицательными (77) и ложноположительными (30) результатами исследования анти-ВГС представлены в таблице 6.9. Таблица 6.9 Результаты выявления ревматоидного фактора в полученных от пожилых пациентов пробах сыворотки крови с положительными, отрицательными и ложноположительными результатами исследования анти-ВГС № Результаты Всего Из них % проб группы исследования исследовано содержат РФ, с РФ анти-ВГС проб интервал концентрации* 1 Отрицательные 77 4 (12-96 МЕ/мл) 5,19% 2 Положительные 33 6 (24-96 МЕ/мл) 18,18% 3 Ложноположительные 30 2 (12-24 МЕ/мл) 6,67% Примечание. * − В норме концентрация РФ в сыворотке крови не превышает 10 МЕ/мл. Различий по частоте выявления проб с РФ между группами проб сыворотки крови, полученных от пожилых пациентов с положительными, ложноположительными результатами исследования отрицательными и анти-ВГС, не было, однако можно отметить тенденцию к увеличению этой частоты примерно втрое в группе анти-ВГС- позитивных образцов по сравнению с анти-ВГС-отрицательными и ложноположительными 153 результатами определения анти-ВГС. Ни в одной пробе с ложноположительными результатами исследования анти-ВГС не было обнаружено РНК ВГС. РФ в высокой концентрации (96 МЕ/мл) в группе проб с отрицательными результатами исследования антиВГС не вызывал неспецифическую реакцию в ИФА. Д) Результаты выявления С-реактивного белка в полученных от пожилых пациентов пробах сыворотки крови с положительными (6), отрицательными (12) и ложноположительными (11) результатами исследования анти-ВГС представлены в таблице 6.10; в норме концентрация СРБ не должна превышать 5 мг/мл [Кишкун А.А., 2006]. Таблица 6. 10 С-реактивный белок в полученных от пожилых пациентов пробах сыворотки крови с положительными, отрицательными и ложноположительными результатами исследования анти-ВГС № Результаты Исследовано Из них % проб группы исследования проб содержат СРБ, с СРБ анти-ВГС интервал концентрации 1 Отрицательные 12 5 (6 -192 мг/л*) 41,7% 2 Положительные 6 5 (6 – 12 мг/л) 83,3% 3 Ложно- 11 5 (6 мг/мл) 45,5% положительные Примечание. * −В норме концентрация СРБ не превышает 5 мг/мл. Различий по частоте выявления СРБ в группах проб сыворотки крови, полученных от пожилых пациентов с положительными, отрицательными и ложноположительными результатами исследования анти-ВГС не было. Однако можно отметить тенденцию к увеличению этой частоты в группе проб, содержащих анти-ВГС, по сравнению с пробами, не содержащими анти-ВГС, и пробами с ложноположительной реакцией. При анализе проблемы интерпретации результатов массового скрининга анти-ВГС в нашей работе наибольшее количество «сомнительных» результатов, подтвердившихся при расширенных исследованиях как позитивные, наблюдалось в группе пациентов наркодиспансеров, в соответствии с результатами, представленными Altеr M.J., о прямой 154 положительной связи количества подтверждаемых в ИБ результатов с низкой оптической плотностью с величиной распространения ВГС-инфекции в контингенте [Alter M. J. et al., 2003]. Количество подтверждающихся позитивных результатов было также увеличенным в группе больных с заболеваниями печени, что свидетельствует о наличии в данной группе лиц с истинным содержанием небольшого количества анти-ВГС в сыворотке крови. Наибольшее количество «сомнительных», противоречивых подтверждающихся как позитивные при расширенном результатов, не тестировании, наблюдалось в группах лиц пожилого возраста, детей первого года жизни и (в некоторых диагностических системах) беременных женщин. По-видимому, общим свойством этих групп является физиологическая дисфункция иммунной системы. Изучение клинико-эпидемиологических особенностей гепатита С в старшей возрастной групп населения в настоящее время является одним из приоритетных направлений исследований в мире У пациентов пожилого возраста в г. Москве инфицирование вирусом гепатита С является наиболее частой причиной хронического гепатита (у 69,3% больных). При инфицировании ВГС в возрасте старше 50 лет цирроз печени формируется вдвое быстрее, чем у лиц, инфицированных до 50 лет. Осложнения ВГС-инфекции выявляются у пожилых в основном в далеко зашедших формах вследствие того, что длительная бессимптомная персистенция вируса и стертые клинические проявления заболевания приводят к позднему обращению больных к врачу [Дьякова И.П., 2005]. Сравнение данных о распространении антител к ВГС среди пожилых и более молодых людей в разных странах привело к неоднозначным выводам [Sinor A.E. et al., 1992; Sirchia G. et al., 1990; Watanabe J. et al., 1990]. По результатам нашей работы, в Москве, также как среди городского населения США, распространение анти-ВГС среди лиц пожилого возраста ниже, чем среди лиц моложе 60 лет. В то же время даже при наличии факторов риска инфицирования [Подымова С.Д., Азов Ф.Г., 2001; Briggs M.E. et al., 2001] лабораторная диагностика ВГС-инфекции у пожилых людей представляется в ряде случаев затруднительной вследствие особенностей иммунной системы при старении. Возрастные иммунологические изменения приводят к дисфункции иммунной системы, основными проявлениями которой являются иммунодефицитные состояния и аутоиммунные процессы. Старение сопровождается количественными и качественными изменениями первичного и вторичного гуморального иммунного ответа [Семенков В.Ф. и др., 2005], а также уменьшением специфичности и аффинности антител [Weksler M. E., 2000.]. Эти и другие изменения гуморального звена приводят, с одной стороны, к снижению специфической антителопродукции в ответ на инфекцию, которая может дополнительно усугубляться 155 сопутствующими заболеваниями; так, онкологические заболевания (особенно опухоли лимфоидной ткани) сами обладают мощным иммунодепрессивным действием [Ильченко Л.Ю. и др., 2010]. Снижение специфичности антител может привести к появлению перекрестно-реагирующих антител (в том числе к аутоантигенам). Следствием всех этих причин, по-видимому, могут быть неспецифические, не подтверждающиеся при расширенных исследованиях, реакции при проведении серодиагностики у пожилых пациентов, в том числе в нашей работе. Большое количество не подтверждающихся в группе детей первого года жизни результатов тестирования анти-ВГС в нашей работе может быть следствием транзиторного физиологического иммунодефицита новорожденных, усугубленного сопутствующими патологиями. Транзиторный физиологический иммунодефицит новорожденных проявляется, в частности, в динамике изменения количества и происхождения анти-ВГС у неинфицированных и инфицированных вирусом детей. В исследовании, проведенном Сенягиной Н.Е. с соавт., было установлено, что у неинфицированных ВГС детей в возрасте 3-х месяцев в 100% случаев определяются высокоавидные анти-ВГС IgG (материнского происхождения). У неинфицированных детей антитела к Core, NS3, NS4, NS5 антигенам ВГС, относящиеся к IgG, элиминируются к 18 месяцам жизни, при этом у большинства детей (89,7%) элиминация происходит к 9-12 месяцам. Динамика у инфицированных детей включает незначительное снижение КП антител к ВГС (материнского происхождения), с последующим нарастанием к 8-9 месяцу. Наиболее выраженным было снижение и последующий подъем анти-NS4 и анти-NS5; как правило, выявлялась комбинация анти-Core с антителами к одному из неструктурных белков ВГС [Сенягина Н.Е. и др., 2007]. В нашей работе у детей до полугода отсутствовала типичная картина сочетания антител к ВГС разной направленности при инфицировании или при получении материнских антител без передачи самого вируса. Показано, что при наличии высокого риска естественного (в родах или в семье) или искусственного (при множественных медицинских манипуляциях) инфицирования неопределенный результат вследствие выявления антител только к одному антигену ВГС (только анти-NS3 или анти-NS4) может быть обусловлен серореверсией при транзиторном выявлении РНК ВГС у детей от двух до 18 лет. Была прослежена динамика гуморального иммунного ответа ребенка, рожденного ВГС-инфицированной матерью: при рождении у ребенка определялась РНК ВГС, в течение четырех лет определялись анти-Core в сочетании с анти-NS3 и анти-NS4 без РНК ВГС, в 6 лет анти-ВГС не определялись, через год появились изолированные анти-NS4. Наличие единственного серологического маркера у 60% детей сочеталось с признаками поражения печени, выявляемыми при ультразвуковом сканировании [Евплова И.А. и др., 2007]. При вертикальной передаче вируса от матери 156 новорожденному ребенку, несмотря на постоянную виремию, ВГС-инфекция у ребенка может длительно протекать как серонегативная [Larouche A. et al., 2012]. В то же время в группе детей с изолированными серологическими маркерами (только анти-NS3 или антиNS4) по данным литературы более половины составляют часто болеющие дети с рецидивирующими инфекциями верхних дыхательных путей, с аллергическими заболеваниями, с патологиями желудочно-кишечного тракта, развившихся на фоне иммунного дисбаланса [Евплова И.А. и др., 2009а]. Многие формы врожденных пороков развития у детей также сопровождаются частыми инфекционно-воспалительными заболеваниями. При этом выявляется дисфункциональное состояние системы иммунитета в виде дисбаланса Т-, В- и О-лимфоцитов, нарушений в содержании иммунорегуляторных субпопуляций, в изменении спектра сывороточных иммуноглобулинов [Минков И.П., 1992]. По-видимому, часть противоречивых результатов тестирования анти-ВГС в пробах сыворотки крови детей первого года жизни, не подтвержденных в расширенных исследованиях в нашей работе, могло быть следствием врожденных пороков соматического развития и/или инфекционных заболеваний. Наши результаты говорят о необходимости дополнительных исследований и осторожной оценке результатов при обнаружении у детей первого года жизни антител к ВГС с низкими значениями ОП, особенно при отсутствии факторов риска вертикальной передачи вируса. Данные литературы об изменении количества и функциональной активности Влимфоцитов при обратимой гестационной иммуносупрессии довольно противоречивы. Проведенная оценка количества В-лимфоцитов на протяжении беременности выявила следующую закономерность: относительное содержание Ig-позитивных клеток уменьшалось и достигало во II триместре наиболее низкого уровня, затем вновь восстанавливалось к концу беременности. Эта же динамика была характерна для абсолютного количества Влимфоцитов В эксперименте in vivo на животных было показано, что во время развития гестационного процесса отмечается блокирование ранних этапов развития Т- и Влимфоцитов, при этом не страдает созревание зрелых элементов. Определение в сыворотке крови концентраций IgM, IgА и IgG показало, что концентрация первых двух Ig снижалась незначительно, а IgG примерно на 25% во II-III что было связано с трансплацентарным переносом антител [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003]. Кроме значительной перестройки иммунной системы, в организме беременной женщины, в частности, в сыворотке крови, происходят другие изменения: синтезируются новые белки и гормоны, меняется микроэлементный состав, концентрация цитокинов и многое другое. В работе Л.А. Вединой с соавт. [Ведина Л.А. и др., 2009] приводится широко распространенное мнение о том, что образцы сыворотки (плазмы) крови беременных в лабораториях традиционно считают 157 "сложными", при исследовании которых вероятность получения ложноположительных результатов возрастает, основанное, в частности, на сведениях о том, что положительные результаты выявления анти-ВГС у беременных женщин иногда не подтверждаются после родов. В данной работе количество сывороток, дающих противоречивые результаты после использования соответствующих подтверждающих тестов, составило 0,6% от общего числа обследованных. Анализ спектров антител к различным антигенам ВГС в противоречивых образцах показал, что все они содержали антитела только к одному из неструктурных антигенов (три образца − к NS3, два − к NS4). Дополнительные исследования этих образцов были проведены с использованием рекомбинантного иммуноблота "CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA" ("Chiron Corporation") − одного из основных подтверждающих тестов в лабораторной диагностике ГС. Для всех пяти противоречивых в ИФА проб результат иммуноблота был отрицательным, и авторы отнесли эти пробы к ложноположительным. При послеродовом обследовании двух женщин с противоречивыми результатами ИФА было показано, что в сыворотке крови по-прежнему определялись антитела только к одному неструктурному антигену ВГС, коэффициенты не претерпели существенных изменений, РНК вируса не выявлялась. Эти данные подтвердили, по мнению авторов работы, что результаты ИФА, полученные ранее у беременных женщин, были "ложноположительными", обусловленными неспецифическими реакциями антител с антигенами, используемыми в диагностических наборах, а также лабораторными ошибками, возникающими при постановке ИФА [Ведина Л.А. и др., 2009]. В нашем исследовании гипотеза о связи гестации с ложноположительными результатами определения серологических маркеров ВГС не получила подтверждения, и количество результатов в первичном скрининге, не подтверждающихся при расширенных исследованиях, в целом зависело от конструктивных особенностей диагностических наборов. Проведение повторных исследований с использованием тех же проб и наборов с точным соблюдением всех требований к проведению ИФА и получением аналогичных результатов исключило вывод о лабораторных ошибках. Рассматривая ситуацию с появлением анти-NS4 у пациентки К. при беременности, можно оценить ее как проявление скрытого, «оккультного» гепатита С в ходе патологической беременности. Одним из ведущих признаков антифосфолипидного синдрома, который развился у К., является невынашивание беременности, обусловленное тромбозом сосудов плаценты. Показано, что пациентки с АФС в целом имеют повышенный риск развития акушерской и перинатальной патологии. Женщин с первичным АФС, проявляющимся акушерской патологией, выделяют в отдельную группу, что связано как со значимостью проблемы, так и с особенностями тактики ведения беременных [Крысова Л.А. и др., 1999]. Известно, что этиологическим 158 фактором фосфолипидного синдрома (который развился у К.) может быть широкий спектр бактериальных инфекций (у К. обнаружены Lactobacillus sp., Staphylococcus aureus и Enterobacter sp.) и вирусные инфекции, в том числе вызванная вирусом гепатита С. По данным Насонова Е.Л., антифосфолипидные антитела обнаруживаются у 20% больных, инфицированных ВГС [Насонов Е.Л., 2000]. У пациентки К. имелся фактор высокого риска инфицирования ВГС-инфекцией, а именно перенесенная в детстве гемотрансфузия. Рассмотренные выше сведения о наличии скрытого гепатита С у детей, проявлявшегося транзиторным выявлением антител к одному из белков ВГС и транзиторным выявлением РНК [Евплова И.А. и др., 2009] с нашими результатами выявления аналогичного скрытого гепатита С у взрослых (глава «Иммуночипы»), позволяет предположить возможность детекции истинных маркеров ВГС в период перестройки иммунной системы при гестации. Это выявление может свидетельствовать, однако, не о текущей инфекции, а об остаточных следах ее наличия в прошлом, закончившейся элиминацией вируса. Проблемы серодиагностики инфекционных заболеваний по наличию антител к возбудителю, по-видимому, частично объясняются проявлениями вторичной иммунной недостаточности, в том числе и в гуморальном звене иммунного ответа, в группах пожилых лиц, детей первого года жизни и беременных женщин. В представленной работе в группе из 20 проб с неопределенными результатами исследования анти-ВГС вследствие обнаружения с низкими КП антител только к одному антигену с низкими КП РНК ВГС не обнаруживалась. Из 20 образцов 12 были получены от людей старше 60 лет. Как было показано ранее, серологическое определение анти-ВГС в группе пожилых людей имеет некоторые особенности: количество результатов, позитивных в скрининге, но не подтверждающихся при дальнейших исследованиях, увеличивается с возрастом обследуемых людей (доноров крови и пациентов ЛПУ без определенных факторов риска инфицирования) [Потапова А.А., 2005]. В 2-х из 12 проб, полученных от пожилых людей без высокого риска инфицирования ВГС, с КП в скрининге 2,64 и 2,13, и с неопределенными результатами исследования в ИБ и подтверждающих ИФТС (выявлены только анти-NS3), наблюдались противоречия результатов ПЦР (с детекцией результатов а)в агарозном геле проявилась реакция, б) в режиме реального времени реакция отсутствовала). При неопределенном результате исследования анти-ВГС вследствие выявления антител с высоким КП к одному антигену ВГС получены иные результаты. При выявлении только анти-NS3 с высокими КП (данные пробы были также анти-ВГС–позитивными в ХИАМ) в части проб обнаружавалась РНК ВГС. В пробах с анти-NS4 с высокими КП (все данные пробы были анти-ВГС–негативными в ХИАМ) РНК ВГС (при чувствительности метода более 50 МЕ/мл) не обнаруживалась. 159 Полученные нами данные в целом совпадают с результатами ретроспективного исследования Sayan M. с соавт., направленного на определение частоты наличия РНК в образцах с низким отношением S/Co анти-ВГС: ни в одном образце с отношением S/Co ниже, чем 3.8, РНК ВГС не была обнаружена. Авторы работы сделали вывод о том, что для подтверждения ВГС-инфицирования в образцах с низким S/Co и/или с неопределенными результатами исследования анти-ВГС, находящимися в «серой зоне», до тестирования образцов на РНК ВГС более обоснованным и экономически доступным является исследование тех же образцов в иммуноблоте, или повторное тестирование образцов в других тест-системах для ИФА планшетного формата, или исследование новой пробы [Sayan M. et al., 2006]. Исходя из полученных в нашей работе результатов, можно сделать вывод, что использование метода ПЦР с чувствительностью 50 МЕ/мл для подтверждения инфицированности пациента вирусом ГС эффективно при выявлении анти-NS3 с высокими КП, что сочетается с позитивностью по анти-ВГС в ХИАМ. Отсутствие анти-ВГС-позитивности в ХИАМ у проб с анти-NS4 в ИФА в нашей работе (и отсутствие РНК ВГС в данных пробах), по-видимому, поддерживает мнение исследователей о том, что диагностическая значимость выявления только анти-NS4 вызывает определенные сомнения и рассматривается не как свидетельство перенесенной инфекции, а как неспецифическая реакция [Piro L. et al., 2008]. Переходя к обсуждению результатов исследования факторов, которые, по данным литературы, могут быть ассоциированы с ХГС или вызывать неспецифическую реакцию в ИФА, следует подчеркнуть, что нами были исследованы пробы сыворотки крови пожилых пациентов. Возможно, именно возрастными особенностями объясняются некоторые отличия от представленных в литературе (в том числе и справочной) сведений о «нормальном» содержании некоторых компонентов и их изменении при ГС. У пожилых людей снижается уровень продукции специфических антител в крови, особенно IgG, а вырабатываемые антитела являются главным образом низкоавидными антителами IgM. В нашей работе в пробах контрольной группы пожилых людей наблюдалось повышение содержания IgA. Это наблюдение соответствует данным литературы о том, у 30% людей старше 65 лет выявляется высокая концентрация сывороточного IgA [Парахонский А.П., 2008], и тенденции, отмеченной для долгожителей г.Москвы − сдвига нижней границы интервала концентраций IgA, определяемых у долгожителей г.Москвы, в сторону больших значений [Сотникова В.Н. и др., 2005]. В пробах пожилых людей с положительными и ложно-положительными результатами определения анти-ВГС отсутствовала возрастная динамика повышения среднего уровня IgA, при этом в отдельных пробах (проба 5780 в таблице 9) IgA мог быть повышен. 160 Ранее было показано, что у больных ХГС по сравнению с контрольной группой и с больными с алкогольным поражением печени без цирротических изменений установлено повышение в крови содержания IgG. Уровень сывороточного IgА у больных ХГС и в контрольной группе не отличался от нормы, а в группе больных алкоголизмом был повышен. Указанные изменения наблюдались при минимальном проявлении патологи: соответственно при ХГС с индексом по Knodell менее 3 и при алкогольном стеатозе печени [GonzàlezQuintela A. et al., 2003]. В нашей работе не было обнаружено различий между уровнем сывороточного IgG и IgM в пробах сыворотки крови пожилых людей с положительными, отрицательными и ложноположительными результатами исследования анти-ВГС. При исследовании РФ в крови пожилых людей, инфицированных и не инфицированных ВГС, нами были получены результаты, отличающиеся от данных литературы по молодым людям. Как известно из литературных данных, РФ может иногда обнаруживаться в крови клинически здоровых людей. Так, при тестировании группы 6000 человек он был выявлен в 3,3% случаях. Процент обнаружения РФ среди населения возрастает с увеличением возраста, и, по данным некоторых исследований, достигает 40 % в возрасте свыше 75-ти лет [Rose N.R., 1992]. При анализе более 440 проб сыворотки крови больных и здоровых людей г.Новосибирска у доноров суммарный РФ был выявлен в 8% случаев, у больных гепатитами различной этиологии − в 5,2%. У пожилых людей без ревматоидного артрита с возрастной иммунной недостаточностью частота выявления РФ составляла 14% [Смердова М.А., Косова Е.Ю., 2000]. В нашей работе у лиц с анти-ВГС частота выявления РФ составляла 18,18%, но достоверных различий между группами проб с анти-ВГС, без анти-ВГС и с ложноположительной реакцией не было. Возможно, это объясняется тем, что в пробах пожилых людей последних двух групп РФ выявлялся в 2 раза чаще, чем в более молодой возрастной группе: у 5,19% лиц без анти-ВГС и у 6,67% лиц с ложно-положительной реакцией при исследовании анти-ВГС. По некоторым данным, повышенный уровень РФ способствует появлению ложноположительных результатов [Stevenson D.L. et al., 1996]. В наших исследованиях наличие РФ в концентрации до 96 МЕ/мл включительно не влияло на качество тестирования проб при выявлении суммарных антител (IgG и IgM) как в использованных скрининговых, так и в подтверждающих ТС, что совпадает с выводом Pawlotsky J.M. о том, что ревматоидный фактор не влияет на качество выявления анти-ВГС [Pawlotsky J.M. et al., 1995]. Кроме РФ, к Ig-содержащим продуктам, которые образуются и участвуют в патогенезе хронических вирусных гепатитов, относятся ЦИК. Показано, что при ХГС выявление ЦИК происходит более чем в 70% случаев [Tsai J.F. et al., 1995], причем в их составе обнаруживаются антитела к различным антигенам ВГС в зависимости от 161 длительности заболевания и наличия сопутствующих заболеваний [Хаертынова И.М. и др., 2012]. Повышение содержания ЦИК может сопровождать, кроме ХГС, многочисленные патологии, связанные с избыточной продукцией антител (в том числе и аутоантител), что, по-видимому, является причиной высокого уровня циркулирующих иммунных комплексов у 73% пожилых людей. [Парахонский А.П., 2008]. В нашей работе количество ЦИК было повышено в группе анти-ВГС- положительных пробах сыворотки крови пожилых людей по сравнению с анти-ВГС-отрицательными пробами и пробами с противоречивыми результатами исследования анти-ВГС (80,83+ 15,85 ед., p<0,05). По данным литературы, в случае повышенной концентрации ЦИК могут включать в свой состав и маскировать наличие анти-ВГС [Troisi C.L., Hollinger F.B., 1997]. По-видимому, в нашей работе противоречивость результатов исследования анти-ВГС (которые были интерпретированы как ложно-положительные) не была связана с маскировкой анти-ВГС в составе ЦИК, так как в данной группе количество ЦИК не отличалось от нормы (соответственно 48,38±5,23 ед. и 44,09±3,72 ед.). При определении влияния патологических иммуноглобулинов на результат тестирования анти-ВГС были исследованы на анти-ВГС пробы пациентов, в которых с помощью электрофореза было определено наличие моноклональных гаммапатий и миеломной болезни (множественной миеломы). Парапротеины в сыворотке крови присутствовали в высокой концентрации ( в пробе 5843 − Gκ 41,0 г/л; в пробе 5856 − Аκ 74,0 г/л), но не влияли на отрицательный результат определения анти-ВГС. Гипер-γглобулинемия (в пробах 5916, 5918; 5942) также не вызывала ложноположительных реакций. В анти-ВГС-позитивных пробах наблюдалась как гипер-, так и гипо-γ-глобулинемия и селективное повышение концентрации IgG и IgА. В пробах с ложноположительной реакцией на анти-ВГС содержание γ-глобулинов было разнообразным: пониженным, в норме или обнаруживался парапротеин. С нашей точки зрения, представленные данные свидетельствуют об отсутствии у парапротеинов в указанных концентрациях способности вызывать неспецифическую реакцию в ИФА при тестировании наличия анти-ВГС. В целом, электрофоретическое исследование в нашей работе фракций белка крови в пробах пожилых людей с положительными, отрицательными и ложноположительными результатами тестирования анти-ВГС привело к выводу об отсутствии различий между этими группами по содержанию альбумина, α2-, β- и γ-глобулинов. В группе с противоречивыми результатами, которые были признаны ложно-позитивными, по сравнению с группой положительных на анти-ВГС проб (3,8+0,1%, p=0,019) было увеличено содержание α1-фракции (4,6+0,3%), превышающее границы нормы (1,3 − 3,9%). Таким образом, содержание α1-фракции в анти-ВГС-отрицательных и ложноположительных 162 пробах не отличалось между собой, но превышало границы нормы, установленной для людей среднего возраста. В группе с ложноположительными результатами тестирования анти-ВГС содержание α1-фракции было выше, чем в группе проб, содержащих анти-ВГС. Данные относительно содержания α1-фракции при гепатитах в литературе противоречивы. Генетическое снижение продукции α1-антитрипсина − основного компонента α1-фракции в норме, снижение содержания которого обязательно отражается на электрофореграмме, − является первичной причиной гепатоцеллюлярной карциномы, а наличие в анамнезе гепатита В или C рассматривается как фактор, влияние которого на развитие заболевания печени синергично дефициту α1-антитрипсина [Elzouki A.N., Eriksson S., 1996; Banner B.F. et al., 1998]. При отсутствии генетического дефекта дефицита α1-антитрипсина содержание этого белка в плазме крови у больных с гепатитами, циррозом и другими заболеваниями печени было нормальным или повышенным [Deam D. et al., 1989]. В исследовании 2012 года, посвященного исследованию биомаркеров воспаления при ХГС, показано, что у этих пациентов уровень α1-антитрипсина зависит от стадии фиброза: первоначально повышенный уровень α1-антитрипсина при прогрессирующем фиброзе понижался [Atta M. et al., 2012]. Аналогичные данные о нарушении обмена белков при ХГС были получены Cheung K.J. с соавт. при определении протеинового профиля в сыворотке крови больных на разных стадиях фиброза (METAVIR F0-F4) с помощью электрофореза в геле [Cheung K.J. et al., 2009]. В нашей работе у пожилых пациентов с анти-ВГС содержание α1-глобулинов было в норме. Известно, что повышенное содержание α1-глобулинов характерно для многих хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваний (ревматоидного артрита, системной красной волчанки, болезни Крона) и метастазах опухолей [Долгов В.В., Шевченко О.П., 2002], при которых наблюдаются ложноположительные реакции на наличие антител к ВГС, возможно, вследствие образования перекрестно-реагирующих антител. В литературе имеются лишь единичные данные о роли СРБ − гепатоспецифического острофазового белка − в защитных реакциях организма при вирусных заболеваниях, в частности, при вирусных гепатитах. При остром вирусном гепатите уровень СРБ повышается в 10-15 раз по сравнению с группой здоровых лиц [Каримов И.З. и др., 2004]. В работе S. Khan с соавт. наблюдался повышенный уровень СРБ у больных ХГС и ХГВ по сравнению с контрольной группой, но корреляций с вирусной нагрузкой не было [Khan S. et al., 2011]. Однако при гепатите, сопровождающемся некрозом клеток печени, уровень СРБ понижается [Atta M. et al., 2012]. В основном референтными величинами (нормой) концентрации СРБ в сыворотке признается концентрация менее 5 мг/л [Долгов В.В., Шевченко О.П., 2002]. При исследовании возрастных изменений содержания СРБ установлено, что у лиц 50–65 лет по сравнению с более молодыми практически здоровыми людьми концентрации СРБ повышена 163 (соответствующие интервалы 6,2±1,77 и 3,24±0,7 мг/мл, p<0,05) [Короленко Т.А. и др., 2007]. В нашей работе различий по частоте выявления СРБ в группах проб сыворотки крови, полученных от пожилых пациентов, с положительными, ложноположительными результатами исследования отрицательными и анти-ВГС не было. Однако можно отметить тенденцию к увеличению этой частоты в группе проб, содержащих анти-ВГС, по сравнению с пробами, не содержащими анти-ВГС и пробами с ложноположительной реакцией. Концентрация СРБ в пробах, содержащих анти-ВГС, находилась в интервале от 6 до 12 мг/мл, в пробах с отрицательным результатом тестирования анти-ВГС − от 6 до 192 мг/мл; в пробах с ложноположительным результатом исследования − не превышала возрастной нормы (6 мг/мл). Между образцами сыворотки крови пожилых людей с положительными и ложноположительными результатами тестирования анти-ВГС в наших исследованиях были впервые выявлены следующие различия: во-первых, в пробах с анти-ВГС (но не с ложноположительным результатом исследования) повышено содержание ЦИК. Во-вторых, в пробах с ложноположительными результатами повышено содержание α1-глобулинов. Между тремя группами проб сыворотки крови, полученных от пожилых людей, не выявлено различий по содержанию (повышенному в данной возрастной группе) РФ и СРБ, по уровню α2, β и γ-глобулинов. Повышенное количество РФ, ЦИК, γ-глобулинов не влияло на качество тестирования анти-ВГС в современных ТС на основе твердофазного ИФА. 164 ГЛАВА 7. КОНЦЕНТРАЦИЯ α-ФЕТОПРОТЕИНА КАК МАРКЕР БИОХИМИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА ПРИ НЕОПРЕДЕЛЕННОМ РЕЗУЛЬТАТЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИТЕЛ К ВГС 7.1. Концентрация α-фетопротеина в сыворотке крови молодых мужчин с различными результатами исследования антител к ВГС В группе из 19 образцов, не содержащих анти-ВГС в первичном скрининге (АнтиВГС-, отрицательный контроль), средняя величина концентрации АФП составляла 4,37 МЕ/мл (при 95% ДИ от 3,13 до 5,61 МЕ/мл), или 5,46 нг/мл (при 95% ДИ от 3,91 до 7,01 нг/мл). Группа положительного контроля (Анти-ВГС+) состояла из 20 образцов, в каждом из которых обнаруживались анти-ВГС с высокой ОП и, соответственно, с высоким КП. В первичном скрининге КП образцов в данной группе в среднем (M±m) составлял 12,72±1,37 (min 5,5; max 18). В подтверждении из 20 образцов 18 содержали анти-Core и анти-NS ВГС (КП>10), два образца – только анти-Core (КП более 4). В группе анти-ВГС+ образцов средняя величина концентрации АФП составляла 12,57 МЕ/мл (при 95% ДИ от 2,94 до 22,2 МЕ/мл), или 15,72 нг/мл (при 95% ДИ от 3,68 до 27,75 нг/мл). Образцы с низким КП в первичных скрининговых ИФТС, а также в подтверждающих ИФТС с раздельным определением анти-Core и анти-NS ВГС согласно ранее разработанному алгоритму были отобраны в дополнительное исследование в плИФТС с раздельным определением анти-Core, анти-NS3, анти-NS4 и анти-NS5 ВГС. В 26 образцах согласно критериям в инструкциях к данным ИФТС результат исследования был признан неопределенным. В данной группе средняя концентрация АФП была равна 6,28 МЕ/мл (95% ДИ от 5,04 до 7,52 МЕ/мл ) или 7,85 нг/мл, что превышало концентрацию АФП в группе образцов, не содержащих анти-ВГС (p=0,026). Образцы с неопределенным результатом в ИФТС были исследованы в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0». В ИБ в 19 образцах (из 26) анти-ВГС не были обнаружены (группа АнтиВГС:ИБ-, таблица 7.1). Из 19 образцов, признанных в ИБ отрицательными, в 17 образцах в ИФТС выявлены только анти-NS4; в одном образце выявлены только анти-NS5 (проба 973); в образце (1563) ОП анти-NS4 и анти-NS5 соответствовала так называемой серой зоне. При определении авидности антител в группе Анти-ВГС:ИБ- только в образце 663 обнаружены низкоавидные анти-ВГС. Результаты определения авидности антител в других образцах не могут быть 165 достоверно интерпретированы. Средняя концентрация АФП в группе Анти-ВГС:ИБсоставляла 5,87 МЕ/мл ( 95% ДИ от 4,37 до 8,81 МЕ/мл, рис. 7.1), или 7,33 нг/мл. Образцы с подтвержденным в ИБ наличием анти-ВГС (4) и с неопределенным результатом в ИБ (3) были объединены в одну группу неотрицательных в ИБ образцов (7 из 26 исследованных). В таблице 7.2 представлены результаты определения анти-ВГС, полученные в ИФТС и в ИБ, а также определения авидности анти-ВГС и концентрации АФП в группе Анти-ВГС:ИБ неопр/+. Из семи образцов сыворотки с неотрицательными (положительными или неопределенными) результатами исследования анти-ВГС в ИБ в трех образцах в плИФТС обнаруживались анти-Core ВГС, в трех других – анти-NS3, в одном – анти-NS4. Обнаруженные антитела имели как высокую, так и низкую авидность, в одном образце авидность антител в использованной плИФТС не определялась (табл. 7.2). Средняя концентрация АФП в группе Анти-ВГС:ИБ неопр/+ составляла 7,41 МЕ/мл ( 95% ДИ от 5,81 до 9,01 МЕ/мл, рис. 7.1), или 9,26 нг/мл. 166 Таблица 7.1 Концентрация АФП в образцах сыворотки крови мужчин моложе 60 лет с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в планшетных иммуноферментных тест-системах и отрицательным результатом в иммуноблоте 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1921 1109 1146 185 1904 1061 663 1443 1241 20 339 973 1377 71 11 1,07 4,02 1,25 2,03 4,83 1,37 2,4 1,11 1,49 1,64 1,15 2 2,37 4,4 8,2 17 18 19 M σ Min-max 2,6 1,74 1,07-8,2 2,88 5,072 3,55 0,88 (и анти-NS5 с КП 0,87) 1,67 4,51 3,3 6,33 8,82 2,88 1,91 1,25 2,7 1,97 2,19 1,86 (анти-NS5) 4,19 8,27 5,3 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 Отр. Отр. Отр. Отр. 4,41 5,19 3,11 2,95 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 16 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр 7,01 11,75 4,09 5,35 5,19 3,61 13,68 11,61 5,19 3,61 0,72 8,61 7,03 4,25 4,09 3,61 2,25 0,87- 8, 82 Ответ 3 0 0 0 сумма баллов NS4 Core 1,5 3,36 3,51 1,79 NS 5-12 74 80 1961 1563 КП анти-NS4*** ИБ (оценочные баллы антигенов)** NS3 1 2 3 4 ТС «спектр»* АФП, МЕ/мл геликаза № п/п Скрининг, КП № в первичной постановке «RecomBlot HCV IgG 2.0» 5,87 3,28 0,7213,68 Примечание. *ТС «спектр» – ИФТС с раздельным определением анти-Core, анти-NS3, анти-NS4 и анти-NS5 ВГС; **ИБ – «RecomBlot HCV IgG 2.0»; ***КП – коэффициент позитивности анти-NS4 (кроме проб 1563 и 973). 166 167 Таблица 7.2 Анти-ВГС и концентрация АФП в образцах сыворотки крови мужчин моложе 60 лет с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в планшетных иммуноферментных тест-системах и неотрицательным (положительным и 0 2 0 0 4 4 8 0 8 8 12 12 неопр. полож. полож. 3,54 1,53 5,91 2,4 3,4 1,97 0,6-6,38 анти-NS3 анти-Core* анти-NS3 анти-NS4 3,54 1,25 2,73 1,68 3 0 3 3 3 0 0 3 2 0 2 0 4 4 4 0 0 5 5 0 12 9 14 полож. неопр. полож. 6 неопр. 4 1457 904 5 1456 6 61 7 M σ Min-max АФП, МЕ/мл 0 3 0 Авидность 0 3 0 Ответ 3,33 7,40 1,81 Сумма баллов анти-Core* анти-NS3 анти-Core* анти-Core анти-NS 5-12 6,38 3,13 2,68 КП анти-NS4 Геликаза 339 410 376 Обнаружены антитела анти-NS3 ИФТС Скрининг, КП 1 2 3 ИБ (оценочные баллы антигенов) № исследования . № п/п неопределенным) результатом исследования в иммуноблоте «RecomBlot HCV IgG 2.0» Не интерп. **ВА ВА 5,96 7,45 10,27 ***НА ВА НА ВА 6,72 10,81 5,96 4,73 7,41 2,12 4,73-10,81 Примечание: КП – коэффициент позитивности; ИБ –«RecomBlot HCV IgG 2.0». * – в ИФТС «ДС-ИФА-анти-HCV–GM» (комплект 2, с.7) в № 339 анти-ВГС не были обнаружены, в №376 и № 904 ОП анти-Core соответствовала так называемой серой зоне.** – высокоавидные анти-ВГС ; *** – низкоавидные анти-ВГС. 167 168 Для определения достоверности различий концентрации АФП в группах использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (рис.7.1). 14 * 12,57 12 АФП, МЕ/мл 10 ** 8 7,41 5,87 6 4,37 4 2 0 Анти-ВГС- Анти-ВГС :ИБ- Анти-ВГС :ИБ неопр/+ Анти-ВГС+ группы Рис. 7.1. Концентрация АФП в группах образцов сыворотки крови мужчин моложе 60 лет с различными результатами исследования анти-ВГС: Анти-ВГС- – не содержат анти-ВГС; Анти-ВГС:ИБ- – с неопределенным результатом исследования в плИФТС и отрицательным в ИБ; Анти-ВГС:ИБнеопр/+ – с неопределенным результатом исследования в плИФТС и неотрицательным (положительными или неопределенным) результатом исследования в ИБ; Анти-ВГС+ – содержат анти-ВГС с высоким КП при скрининге (КП более 5,5) и при подтверждении позитивного результата. По оси ординат: концентрация АФП. * − различие от концентрации АФП в группе АнтиВГС- (p=0,045) ** − различие от концентрации АФП в группе АнтиВГС- (p=0,008) Было обнаружено, что по концентрации АФП различаются следующие группы. Вопервых, в образцах, содержащих анти-ВГС (группа анти-ВГС+ на рис. 7.1) концентрация АФП выше, чем в образцах, не содержащих анти-ВГС (группа анти-ВГС- на рис. 7.1, 169 p=0,045). Во-вторых, в образцах с неопределенным результатом исследования в плИФТС и неотрицательным (положительным и неопределенным) результатом исследования в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» (на рис. 7.1 группа анти-ВГС:ИБнеопр/+) концентрация АФП была также выше, чем в образцах без анти-ВГС в плИФТС (группа анти-ВГС-, P=0,008). Между остальными группами образцов различий по концентрации АФП не обнаружено. 7.2. Концентрация сывороточного α-фетопротеина у женщин на ранних стадиях беременности с неопределенными результатами исследования антител к вирусу гепатита С Образцы сыворотки крови женщин в первом триместре беременности были исследованы на наличие анти-ВГС. В группе, состоящей из 23 образцов сыворотки крови женщин в первом триместре беременности на сроке беременности 8-10 недель, которые в первичном скрининге были признаны не содержащими анти-ВГС (отрицательный контроль), получены следующие результаты: средняя концентрация АФП в группе анти-ВГС- была равна 10 МЕ/мл (ДИ 95% от 8,88 до 11,12 МЕ/мл) или 12,5 нг/мл, а медиана (М) – 8,83 МЕ/мл или 11,04 нг/мл. Вторая группа включала 14 образцов, которые в первичном скрининге и в двух подтверждающих ТС были определены как содержащие анти-ВГС (положительный контроль). Из 14 образцов 13 содержали АТ и к Core, и к NS АГ ВГС, один образец − только АТ к Core АГ (КП=3,92) и другой образец – только АТ к NS АГ ВГС (ОП=3,0, КП=11,76). В группе Анти-ВГС+ медиана концентрации АФП была равна 25,64 МЕ/мл (32,05 нг/мл). Из 14 образцов в 7 (50%) концентрация АФП превышала 40 МЕ/мл, которая рассматривается как граница нормы для первого триместра беременности. В третьей группе образцов результаты исследования анти-ВГС были признаны неопределенными после дополнительного тестирования образцов в ТС планшетного формата для ИФА с критериями соответствующего результата. В дополнительное исследование в ТС планшетного формата для ИФА с раздельным определением анти-Core, анти-NS3, анти-NS4 и анти-NS5 были отобраны образцы с низким КП в первичном скрининге (<3) и в подтверждающей ТС с раздельным определением антител к Core и к NS антигенам ВГС (соответственно КП <2 и <6). Результаты исследования образцов группы анти-ВГСнеопр. в плИФТС с раздельным определением анти-Core, анти-NS3, анти-NS4 и анти-NS5 представлены в таблице 7.3. 170 Таблица 7.3 Антитела к ВГС и концентрация АФП в образцах сыворотки женщин в первом триместре беременности с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в тест-системах планшетного формата для ИФА с раздельным определением анти-Core, анти-NS3, анти-NS4 и анти-NS5 ВГС № п/п Результаты подтверждающих исследований на наличие антиВГС в тест-системах: «ВГС-ДСМ - подтверждающий «РекомбиБест анти–ВГС тест», комплект 2 подтверждающий тест» КП анти-NS3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Х σ Медиана КП анти-NS4 Анти-ВГС не обнаружены Анти-ВГС не обнаружены – 1,94 – 1,48 – 1,40 1,43 – – 2,16 – 2,09 1,24 – Анти-ВГС не обнаружены Анти-ВГС не обнаружены – 1,97 Анти-ВГС не обнаружены – 3,60 – 2,25 Анти-ВГС не обнаружены – 1,82 – 1,53 Анти-ВГС не обнаружены 1,33 2,04 – 0,63 – 1,95 КП анти-NS3 – – – – – – – 1,75 – – – 1 – – – – – – 1,37 – – АФП, МЕ/мл КП анти-NS4 5,11 3,05 4,60 5,64 8,52 8,89 4,81 3,58 – 4,37 9,76 1,68 – 4,77 7,68 3,43 6,86 7,42 4,09 5,54 2,28 4,81 9,48 30,325 15,71 8,18 27,71 9,1 89,84 39,82 60,65 17,96 8,49 56,03 32,61 9,3 21,6 10,21 11,89 19,53 21,57 26,32 21,85 19,53 171 При исследовании 7 образцов из 19 (36,8%) в двух дополнительных подтверждающих ТС разных производителей с раздельным определением антител к четырем антигенам ВГС (Core, NS3, NS4, NS5) были получены противоречивые результаты. А именно, в образцах с порядковыми номерами 1, 2, 10, 11, 13, 16, 19 в плИФТС «РекомбиБест анти–ВГС подтверждающий тест» были обнаружены антитела к неструктурным антигенам ВГС (в шести образцах к NS4, в одном образце – к NS3), а в плИФТС «ВГС-ДСМ подтверждающий тест» в данных образцах не было обнаружено антител ни к одному из антигенов ВГС. Из 19 образцов в 4 (21,1%) выявлены анти- NS3, в остальных – анти-NS4 ВГС; анти-NS5 не были обнаружены ни в одном из образцов. Согласно инструкциям к использованным подтверждающим плИФТС образцы в группе анти-ВГСнеопр. удовлетворяли критериям неопределенного результата исследования анти-ВГС. Средний КП сыворотки при выявлении антител только к NS4 в «ВГС-ДСМ-подтверждающий тест» был равен 2,04±0,14, а в «РекомбиБест анти–ВГС подтверждающий тест» – 5,54±0,52. Согласно результатам, представленным в таблице 7.3, среднее значение концентрации АФП в группе анти-ВГСнеопр. было равно 26,32 (95% ДИ от 16,32 до 36,32 МЕ/мл), а медиана − 19,53 МЕ/мл. Сравнение концентрации АФП в группах проводили, во-первых, так, как принято в практике обследования беременных женщин с использованием величины медианы и вычислением величины MOM (от англ. multiply of median). Из представленных на рис. 7.2 данных следует, что в первом триместре беременности медиана концентрации АФП в анти-ВГС+ образцах сыворотки крови превышала медиану концентрации АФП в анти-ВГС- группе в 2,56 раза. Медиана концентрации АФП в группе анти-ВГС+/- образцов превышала медиану в контрольной группе в 1,95 раза. *MOM 172 3 2,56 2,5 1,95 2 1,5 1 1 0,5 0 Анти-ВГС- Анти-ВГС неопр. Анти-ВГС+ группа Рис. 7.2. Относительное увеличение медианы концентрации АФП в группе антиВГС-содержащих образцов и в группе образцов с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в первом триместре беременности. По оси абсцисс: группы образцов: без анти-ВГС (Анти-ВГС-); с неопределенными результатами исследования (Анти-ВГСнеопр.); образцов, содержащих анти-ВГС (Анти-ВГС+). По оси ординат: величина MOM (Multiply of Median) – кратность медианы концентрации АФП в исследуемой группе медиане в контрольной группе (Анти-ВГС-). Во-вторых, для проверки различия концентрации АФП в первом триместре беременности между группами анти-ВГС+, анти-ВГС- и анти-ВГС+/- образцов был использован критерий Манна-Уитни. Было обнаружено, что уровень сывороточного АФП у женщин в первом триместре беременности, инфицированных ВГС, превышает уровень сывороточного АФП у женщин без данной инфекции (p=0,003). 173 Уровень АФП в образцах сыворотки крови беременных женщин с неопределенным результатом исследования анти-ВГС превышает уровень АФП в образцах сыворотки крови беременных без анти-ВГС (p=0,001). Различий между анти-ВГС-позитивными образцами и образцами с неопределенным результатом исследования по уровню сывороточного АФП не обнаружено. 7.3. Сывороточная концентрация α-фетопротеина у пожилых пациентов с позитивными, негативными и неопределенными результатами исследования антител к вирусу гепатита С В результате исследования анти-ВГС в образцах сыворотки крови людей старше 60 лет (от 60 до 93 лет) были выделены четыре группы, из них две контрольные: 1) группа Анти-ВГС- − в скрининговой тест-системе 16 образцов были признаны не содержащими анти-ВГС (отрицательный контроль); 2) группа Анти-ВГС+ − в первичной скрининговой и в подтверждающей тест-системе в 30 пробах выявлялись анти-ВГС с высокой оптической плотностью: ОП не менее 2,0; КП не менее 8 (положительный контроль). Следующие две группы были выделены при дальнейшем исследовании группы из 42 позитивных образцов с низкой ОП в ИФТС при первичном скрининге (КП менее 3), а именно: 3) при выявлении анти-ВГС с низкой ОП и соответственно с низким КП в двух подтверждающих ИФТС разных производителей и определения низкой или высокой авидности анти-ВГС образцы признавались анти-ВГС-низкоположительными (группа АнтиВГС низк+); 4) при выявлении анти-ВГС только в одной из двух подтверждающих ТС, либо при выявлении анти-ВГС в двух подтверждающих ТС разных производителей, но при отсутствии положительного результата в ЛИА и при определении авидности анти-ВГС, результат исследования анти-ВГС рассматривался как неопределенный в ИФТС, но отрицательный в ЛИА (группа Анти-ВГС но/–). Группу Анти-ВГС– составили 16 образцов сыворотки крови пациентов (средний возраст 74,5; 95% ДИ от 70,5 до 77,5), у которых отсутствовали указания на факторы высокого риска инфицирования ВГС. В группе анти-ВГС средняя величина концентрации АФП составляла 8,25 МЕ/мл (ДИ 95% от 5,12 до 11, 38 МЕ/мл). В группе Анти-ВГС+ было 30 образцов сыворотки крови пациентов, средний возраст которых составлял 73,6 года (ДИ 95% от 72,6 до 75,6). Один образец был получен от пациента с заболеванием печени, один – от пациента с алкоголизмом. В 28 из 30 образцов в 174 подтверждающей ТС были обнаружены анти-Core и анти-NS ВГС с ОП в первичной и подтверждающей ИФТС не менее 2, КП не менее 8. Во всех образцах данной группы анти-ВГС были высокоавидными. Средняя концентрация АФП в группе Анти-ВГС+ составляла 14,7 25 МЕ/мл (интервал от 3,804 до 111,815 МЕ/мл, σ = 22,02 МЕ/мл). В группу Анти-ВГСнеопр. были включены 42 образца сыворотки крови, полученных от пожилых пациентов (средний возраст 74±7лет). Результаты исследования образцов в ИФТС планшетного формата разных проихзводителей были противоречивыми (табл. 7.4). При исследовании в ИФТС с определением спектра антител в в 19 из 42 образцов обнаружены антитела, направленные более чем к одному антигену. Образцы с порядковыми номерами 1-35 (таблица 7-10) были исследованы в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0», результаты были признаны отрицательными; среди данных образцов были образцы как с высоко-, так и с низкоавидными антителами в ИФТС. В целом, из 42 в 11 образцах антитела были низкоавидными, в 14 − высокоавидными, в 17 образцах результаты определения авидности были не интерпретируемыми. Среднее значение концентрации АФП в группе антиВГСнеопр. было равно 9,69 МЕ/мл (от 2,941 до 83,16 МЕ/мл). 175 Таблица 7.4 Концентрация α-фетопротеина в образцах сыворотки крови пожилых людей с неопределенными и противоречивыми результатами исследования анти-ВГС в ИФТС № Пол Возраст, п/п полных лет 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 ж ж м ж ж м м ж ж ж м ж ж ж м ж ж ж ж ж м ж м 67 60 82 69 71 69 75 69 82 67 72 85 84 79 70 75 74 70 82 93 67 71 79 ИФТС1 антиCore – – – – – – 1,33 – – – – – – – 1,34 – – – – – – – – антиNS 3,83 8,49 4,97 5,43 3,1 2,39 1,8 1,16 5,18 3,11 – – – – 8,47 – – – – 2,36 – – 1,67 ИФТС2 антиCore 1,92 – – – – – – – – – – 2,45 – – – – – – – – – – – ИФТС3 антиNS 4,95 1,64 2,93 3,03 1,16 1,72 2,27 3,09 3,05 1,15 1,54 3,08 3,07 1,40 4,44 2,89 1,00 1,19 2,22 2,52 1,81 1,48 1,35 АФП (МЕ/мл) антитела Авидность антиВГС анти-NS3,4,5 анти- NS4 анти- NS4 анти-NS3, анти-NS5 анти-NS4 анти-NS4 анти-Core, анти-NS4 анти-NS4 анти-NS4 анти-NS4 Анти-NS3,4,5 Анти-Core, анти-NS3,4,5 Анти-NS3,4,5 Анти-NS3,4,5 Анти-NS3,4,5 Анти-NS4,5 Анти-NS4,5 Анти-NS3,4 Анти-NS3,4,5 Анти-NS3,4,5 Анти-NS4 Анти-NS3,4,5 Анти-NS3,4,5 ВА ВА ВА НА ВА НА ВА ВА ВА НА НА НА ВА НО НО НА НО НО НА НО НО НО НО 4,062 4,525 4,259 5,139 6,58 4,458 7,802 4,458 6,805 24,062 3,933 21,211 4,127 4,659 4,127 6,58 5,139 2,941 5,992 83,16 6,358 7,184 4,727 176 Продолжение таблицы 7.4 Анти-NS5 5 24 ж 73 – 1,39 – 1,60 НО 3,997 Анти-NS5 25 м 81 – – – 3,70 НО 5,07 Анти-Core, анти-NS3, 4, 5 26 ж 74 – – 1,78 2,93 НА 23,42 Анти-NS3,4,5 27 ж 68 – 1,61 – – НО 4,795 Анти-NS3,4,5 28 ж 77 – – – 3,33 ВА 7,031 Анти-NS3,5 29 ж 69 – – – 7,04 НА 4,062 Анти-NS4 30 м 79 – – 1,49 3,05 НО 5,419 Анти-NS4 31 м 84 – 3,76 – 1,66 НО 11,357 Анти-NS4 32 ж 69 – 2,68 6,00 2,23 НО 6,137 Анти-NS4 33 ж 71 – 8,91 – 3,13 НО 4,795 Анти-NS4 34 ж 62 – 7,00 – 1,45 НО 33,305 Анти-NS4 35 ж 77 – – 4,96 1,84 НО 10,159 анти- NS4 36 ж 60 – 8,49 – 1,64 ВА 4,525 анти- NS4 37 м 82 – 4,97 – 2,93 ВА 4,259 анти-NS4 38 ж 71 – 3,1 – 1,16 ВА 6,58 анти-NS4 39 м 69 – 2,39 – 1,72 НА 4,458 анти-NS4 40 ж 69 – 1,16 – 3,09 ВА 4,458 анти-NS4 41 ж 82 – 5,18 – 3,05 ВА 6,805 анти-NS4 42 ж 67 – 3,11 – 1,15 НА 24,062 Среднее 74 1,34 4,065 3,1 2,43 9,69 σ 7 0,01 2,464 1, 9 1,21 13,462 Мин 60 1,33 1,16 1,49 1 2,941 Макс 93 1,34 8,91 6 7,04 83,16 Медиана 72 1,34 3,11 2,19 2,23 5,139 Примечание. Использованы следующие тест-системы для ИФА планшетного формата: ИФТС1 − "РекомбиБест анти-ВГСподтверждающий тест» и ИФТС2 − "ДС-ИФА-Анти-HCV- спектр GM", комплект 4 – подтверждающие тест-системы с раздельным определением анти-Core и анти-NS ВГС; ИФТС3 − "ДС- ИФА-Анти-HCV- спектр GM", комплект 2 – подтверждающая тест-система с раздельным определением анти-Core, анти-NS3, анти-NS4, анти-NS5 ВГС. * − Антитела не обнаружены, **Авидность: ВА – высокая, НА – низкая, НО – не определяется 177 Между группами проб сыворотки крови, полученной от пациентов старше 60 лет, с отрицательными, положительными и неопределенными результатами исследования в ИФТС планшетного формата, различий по сывороточной концентрации АФП (по критерию МаннаУитни) не обнаружено. Обсуждая результаты определения сывороточной концентрации АФП у молодых мужчин, пожилых людей и беременных женщин с разным результатом исследования антиВГС, следует отметить, что выбор АФП в качестве дополнительного серологического маркера в представленной работе обусловлен тем, что концентрация этого белка коррелирует с патофизиологическими процессами в печени при вирусном гепатите С и его осложнениях. Критическим значением для диагноза ГЦК является концентрация АФП 50 нг/мл [Cedrone A. et al., 2000]. Результаты, полученные нами при определении концентрации АФП в анти-ВГСнегативных и анти-ВГС-позитивных образцах сыворотки крови мужчин моложе 60 лет, соответствуют данным литературы. В крови здоровых людей (кроме беременных женщин) концентрация АФП не превышает 10 мкг/мл [Молдогазиева Н.Т., Терентьев А.А., 2006; Hu K.Q. et al., 2004] и в среднем составляет менее 5 нг/мл [El-Bassiouny A.E. et al., 2007; Резников Ю.П., 2007; Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003]. El-Bassiouny с соавт. представили следующие сведения относительно концентрации АФП: в контрольной группе здоровых людей она равна 3.39±2.9 МЕ/мл, в группе больных хроническим гепатитом С без цирроза была увеличена до 9.36±13.6 МЕ/мл, в группе больных хроническим гепатитом С с циррозом − до 10.41±15.6 МЕ/мл, в группах больных ГЦК и ХГС − до 25.04±27.9 МЕ/мл [El-Bassiouny A.E. et al., 2007]. В исследовании .Chen T.M. и соавт. средняя концентрация АФП у больных ХГС без ГЦК была равна 18.5 ± 63.0 нг/мл, а интервал концентрации составлял 1.3 – 676.0 нг/мл [Chen T.M. et al., 2007]. В нашем исследовании уровень АФП в сыворотке крови без анти-ВГС составлял 4,37±2,71 МЕ/мл. Уровень сывороточного АФП (12,47± 21,58 МЕ/мл) у мужчин в группе Анти-ВГС+, в которую вошли образцы с высоким КП анти-ВГС в скрининге и в подтверждении, был повышен по сравнению с нормой, при этом из 21 образца с анти-ВГС только один образец (4,8%) содержал АФП в концентрации выше 50 МЕ/мл (96,05 МЕ/мл). Для диагноза ГЦК критическим значением является концентрация АФП 50 нг/мл [Cedrone A. et al., 2000]. В последнее время было показано, что у пациентов с гепатитом С АФП не только в высокой (более 20 нг/мл), но также в средней сывороточной концентрации (от 6 до 20 нг/мл) указывает на существенный риск развития ГЦК, вне зависимости от стадии фиброза [Tateyama M. et al., 2011]. По данным других авторов, повышение уровня АФП свыше 10 нг/мл наблюдается у 23% пациентов с ХГС, при этом 178 концентрация АФП свыше 15 нг/мл ассоциирована с III/IV стадией фиброза печени при отсутствии ГЦК [Hu K.Q. et al., 2004]. В нашей работе в 8 из 21 образцов группы Анти-ВГС+ (38,1%) концентрация АФП была менее 4,8 МЕ/мл (6 нг/мл ), что соответствует низкому риску развития ГЦК. В 10 образцах данной группы (47,6%) она составляла от 4,8 до 16 МЕ/мл (от 6 до 20 нг/мл), в трех образцах (14,3%) превышала 16 МЕ/мл (20 нг/мл), что указывает на высокую и среднюю степень риска развития ГЦК. Примечательно, что соотношение образцов с низкой, средней и высокой концентрацией АФП соответствовало таковой в работе Tateyama M. С соавт. (49,5%, 35,9% и 14,6%) [Tateyama M.et al., 2011]. Группа образцов сыворотки крови мужчин моложе 60 лет с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в ИФТС включала 26 образцов. Концентрация АФП в этой группе (6,28 МЕ/мл или 7,85 нг/мл) превышала концентрацию АФП в контрольной группе без анти-ВГС (p=0,026). Результаты исследования в ИБ трех образцов из данной группы были признаны неопределенными, четырех образцов − позитивными. Ранее Rios M. с соавт. при использовании ИБ RIBA-3 сделали вывод об эпидемиологическом сходстве пациентов с позитивными и неопределенными результатами исследования, который был основан на изучении динамики появления РНК ВГС, подъема уровня трансаминаз и развития фиброза печени [Rios M. et al., 2006]. Руководствуясь выводом Rios M., мы сочли возможным объединение образцов с неотрицательным (положительным и неопределенным) результатом исследования анти-ВГС в одну группу Анти-ВГС:ИБнеопр./+. В трех образцах из группы Анти-ВГС:ИБнеопр./+ в плИФТС и в ИБ выявились анти-Core, в трех других – анти-NS3, в одном образце в плИФТС выявились антитела к NS4 ВГС, а в ИБ − антитела к геликазе и к NS3. В отношении анти-Core и анти-NS3 мнение многих исследователей сходится: низкий КП (или низкий титр) этих антител характерен как для раннего периода острой фазы заболевания ГС, поскольку эти антитела появляются первыми, так и для периода выздоровления, поскольку они исчезают последними [Николаева Л.И., 2006]. При первичной (недавней) ВГС-инфекции обнаруживаются антитела с низкой авидностью, при хронической инфекции и после перенесенного гепатита С авидность антител существенно возрастает [Kanno A., Kazuyama Y., 2002]. Среди исследованных нами низкопозитивных образцов были как «ранние» анти-Core и анти-NS3 с низкой авидностью, так и «поздние» анти-Core и антиNS3 с высокой авидностью. В данных пробах концентрация АФП (7,41±2,12 МЕ/мл) была выше, чем в образцах, не содержащих анти-ВГС (p=0,08) и в каждом образце превышала уровень 6 нг/мл, соответствующий среднему риску развития ГЦК [Tateyama M. et al., 2011] Таким образом, при обнаружение в ИБ таких маркеров ВГС-инфекции, как анти-Core или анти-NS3, в сыворотке крови выявлялся биохимический сдвиг − увеличенное содержание 179 АФП в сыворотке крови, − который свидетельствует о патофизиологических процессах в печени. Из 26 низкоположительных образцов сыворотки крови мужчин моложе 60 лет в 19 образцах в ИФТС обнаруживались анти-NS4 ВГС, в одном − анти-NS5. Нами было показано, что более чем в половине случаев неопределенный результат в плИФТС связан с выявлением только анти-NS4 ВГС [Потапова А.А. и др., 2008]. В ИБ Анти-NS4-содержащие образцы были в основном идентифицированы как анти-ВГС-отрицательные (19 образцов из 20). Авидность анти-NS4 в одном образце с анти-NS4 была низкой, в 19 других – не идентифицируемой в использованной плИФТС. Группа образцов сыворотки крови мужчин моложе 60 лет с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в плИФТС и с отрицательными результатами в ИБ (группа Анти-ВГС:ИБ-) по концентрации АФП не отличалась ни от одной из исследованных групп, что, по-видимому, является следствием ее гетерогенности. Переходя к обсуждению результатов, полученных при определении концентрации АФП в образцах сыворотки крови беременных женщин с различным результатом тестирования анти-ВГС, можно отметить следующее. Так же, как и у других пациентов ЛПУ, у беременных в ряде случаев ВГС-инфекция впервые выявляется при скрининге крови на наличие анти-ВГС. Обследование беременных женщин на ВГС-инфекцию согласно карте эпидемиологического обследования должно проводиться в г. Москве с 2008 г. дважды: в I и III триместре беременности [О мерах по совершенствованию эпиднадзора …, 2008 г.]. Согласно приказу МЗ РФ №457 от 28.12.2000 г. «О совершенствовании пренатальной диагностики в профилактике наследственных и врожденных заболеваний у детей», всем беременным на сроке 16–20 недель рекомендуется проведение исследования крови на содержание АФП. В качестве точки отсчета в АФП-скрининге используется медиана, для определения границ выборки вычисляется показатель MOM. Крайние значения нормы чаще всего определяются как 2,0 MOM и 0,5 MOM. Выход за пределы этого интервала считается зоной риска и требует наблюдения и повторных обследований, поскольку часто свидетельствует о наличии патологии у плода или у матери [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003]. В нашем исследовании концентрация АФП в конце первого триметра беременности (12,5 нг/мл) соответствовала данным литературы (12,9 мкг/л) [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003]. Величина MOM концентрации АФП в образцах сыворотки крови беременных женщин в первом триместре беременности с неопределенным результатом исследования анти-ВГС (1,95), согласно нашим данным, находилось на границе нормы (до 2,0), а величина MOM концентрации АФП в образцах с анти-ВГС (2,56) превышала уровень нормы. Использование непараметрической статистики подтвердило повышение концентрации АФП при наличии ВГС-инфекции, что согласуется с данными литературы, в частности, 180 представленными в исследовании Chen T.M. и соавт.: средняя концентрация АФП у больных хроническим гепатитом С без гепатоцеллюлярной карциномы равна 18.5 ± 63.0 нг/мл, а интервал концентрации составляет 1.3 – 676.0 нг/мл [Chen T.M. et al., 2007]. Согласно нашим результатам, у беременных женщин в первом триместре беременности с неопределенным результатом исследования анти-ВГС сывороточная концентрация АФП была выше, чем в образцах без анти-ВГС, полученных от женщин на том же сроке беременности. Поскольку в норме в первом триместре беременности существенного увеличения концентрации АФП в сыворотке матери за счет АФП плодного происхождения еще нет, выявленный прирост может быть обусловлен АФП материнского происхождения как продукта секреции клеток, поврежденных ВГС-инфекцией и вступивших в репаративную регенерацию [Park J.K., Feuerman M.H., 2005]. Наши данные об отсутствии различий по уровню АФП между группами образцов сыворотки крови беременных женщин с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в ИФТС и образцов, содержащих анти-ВГС, согласуются с нашими результатами, полученными при исследовании сыворотки крови мужчин моложе 60 лет. Кроме того, эти результаты согласуются и с выводом Rios M. и соавт. об эпидемиологическом сходстве групп с анти-ВГС-позитивными и анти-ВГСнеопределенными результатами в иммуноблоте RIBA-3, который был основан на изучении динамики появления РНК ВГС, подъема уровня трансаминаз и развития фиброза печени [Ríos M. et al., 2006]. Сравнивая результаты исследования проб, полученных от пожилых людей, с результатами исследования проб, полученных от молодых мужчин, можно отметить следующее. В пробах, полученных от пожилых людей, не подтверждалось наличие анти-ВГС в ИБ при выявлении в ИФТС анти-NS3, анти-NS4 и анти-NS5 раздельно и в различных сочетаниях. В пробах, полученных от молодых мужчин, в ИБ не подтверждалось наличие анти-ВГС только при выявлении в ИФТС анти-NS4 ВГС. Во-вторых, различие между группами выявилось по авидности антител: анти-NS4 у пожилых пациентов могли быть как высоко-, так и низкоавидными, а при обнаружении в пробе пациента моложе 60 лет только анти-NS4 авидность антител, как правило, не определялась. В-третьих, согласно нашим данным, изменение концентрации АФП в зависимости от результата тестирования анти-ВГС (позитивного, негативного и неопределенного) в группах проб молодых и пожилых пациентов было различным. В отличие от этого, группа образцов сыворотки крови пожилых людей с отрицательными результатами тестирования анти-ВГС была крайне гетерогенной по концентрации АФП, по-видимому, вследствие разнообразных приобретенных заболеваний и наличия иных, кроме ВГС, гепатотоксических факторов, и не отличалась ни от одной из исследованных групп по концентрации АФП. В отличие от молодых мужчин, в группе 181 пожилых людей повышенная концентрация АФП не может служить дополнительным критерием, позволяющим рассматривать группу с неопределенными в ИФТС результатами как группу, эпидемиологически близкую к группе с анти-ВГС-позитивными результатами. Таким образом, в лабораторной диагностике гепатита С необходима комплексная оценка серологических и биохимических маркеров ВГС-инфекции с учетом возрастной категории пациента. Вопрос о том, что является причиной реактивности в образцах сыворотки крови с положительными в ИФТС, но отрицательными в ИБ результатами: ложная позитивность или действительно присутствие малых количеств анти-ВГС, − сложно решить при использовании данных видов диагностических систем с разной чувствительностью (которая выше у ИФТС) и специфичностью (выше у ИБ). Сложность интерпретации результатов при исследовании позитивных образцов с низкой ОП в ряде случаев может быть преодолена при исследованиях проб в новом классе диагностических препаратов − в иммуночипах. 182 ГЛАВА 8. ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИММУНОЧИПОВ ДЛЯ ВЕРИФИКАЦИИ НАЛИЧИЯ АНТИ-ВГС В ОБРАЗЦАХ СЫВОРОТКИ КРОВИ С НИЗКИМ СОДЕРЖАНИЕМ АНТИТЕЛ В иммуночипах на наличие антител к ВГС класса G и класса М был исследован 71 образец сыворотки крови пациентов, в которых с низкой ОП в ИФА обнаруживались антитела, направленные к одному из антигенов ВГС. Из всех образцов 58 принадлежали людям, не имеющих идентифицированных факторов риска заражения, 7 образцов − беременным женщинам, 1 образец − мед. работнику, 2 образца − людям с проведенными ранее гемотрансфузиями, образца − потребителям внутривенных наркотиков, 1 образец − пациенту с ИППП. Контрольными образцами являлись 60 проб сыворотки крови пациентов. На рис. 8.1 представлены эрреи с флуоресцентной меткой антител к ВГС в некоторых пробах. 183 22 14 22 60 14 21 22 27 28 22 НСV + 56 30 21 К - 60 27 26 К- 28 37 32 39 33 40 34 35 36 К- К- Рисунок 8.1. Иммуночипы: слайды и отдельно представленные эрреи с флуоресцентной меткой антител к ВГС в исследуемых пробах (обозначен порядковый номер пробы). 184 8.1. Изучение верификационных возможностей иммуночипов при серодиагностике гепатита С в случаях низкой позитивной оптической плотности антител к Core-антигену ВГС в ИФА Пробы с низким КП анти-Core в ИФТС (16) были исследованы в ИБ/ЛИА; результат был положительным, неопределенным или отрицательным в соответствии с правилами интерпретации соответствующего теста (таблица 8.1). Таблица 8.1 Результаты исследования образцов сыворотки крови с низким коэффициентом позитивности анти-Core в иммуноферментных тест-системах планшетного формата с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенам ВГС (производства «Вектор Бест анти-ВГС»), в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» («Mikrogen», Германия) и в «INNO-LIA HCV Ab III update» («Innogenetics», Бельгия) № п/п Шифр Пол пациента Возраст, лет Группа* 1 642 ж 27 11 2 1486 ж 45 11 3 2047 ж 33 2 4 2181 ж 36 8 5 588 ж 17 11 6 2259 ж 22 2 7 615 ж 25 4 8 1460 ж 78 11 9 1795 м 17 11 10 1189 м 47 11 **11 372 ж 37 11 12 692 ж 78 11 13 603 ж 49 6 КП анти-Core Реактивность в ИФТС, к антигенам результат ВГС в ИБ** позитивный 1,77 Core, 5 баллов 1,00 Core, 5 баллов 3,42 Core, 5 баллов 1,31 Core, 5 баллов 3,61 Core, 5 баллов 1,66 Core, 8 баллов 2,40 Core, 8 баллов 1,08 Core, 8 баллов 1,28 Core, 8 баллов 1,48 Core, 8 баллов 1,60 С1(+/-), С2(+/-) 1,6 Core, NS3, NS4, геликаза, 14 баллов 2,2 Core, 8 баллов Результат в ИБ Отриц. Отриц. Отриц. Отриц. Отриц. неопред. неопред. неопред. неопред. неопред. Положит. Положит. неопред. 185 Продолжение таблицы 8.1 14 637 ж 34 11 1,28 15 1735 м 52 11 1,92 16 1035 м 32 11 3,55 Core, 8 баллов Core, 8 баллов Core, 8 баллов неопред. неопред. неопред. Примечания: * Группы описаны в разделе «Материалы и методы». ** Образец №11 исследован в «INNO-LIA HCV Ab III update», прочие образцы − в «RecomBlot HCV IgG 2.0». В первичной ИФТС КП анти-ВГС в группе составлял 2,62 ±0,20; в ИФТС с раздельным выявлением антител к 4-м антигенам ВГС КП анти-Core был равен 1,95±0,22 (M±m). Образец №13 принадлежал повторно обследуемой пациентке. В первом исследовании, проведенном двумя месяцами ранее, в ИФТС у пациентки также были обнаружены анти-Core (КП=1,92). Выявление анти-Core в соответствии с инструкциями практически ко всем ИФТС является основанием для интерпретации результата исследования анти-ВГС как позитивного. При дополнительном исследовании образцов в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» при наличии низкой реактивности сыворотки крови только к Coreпротеину результат исследования интерпретировался как отрицательный (образцы п/п №1, 2, 3, 4, 5), либо, при наличии большей реактивности, как неопределенный (образцы п/п №6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16). Два образца с низким КП анти-Core после проведения дополнительных исследований в ИБ и ЛИА были признаны анти-ВГС-позитивными. А именно, результат исследования образца №11 в ЛИА «INNO-LIA HCV Ab III update» был признан позитивным вследствие выявления реактивности к нескольким B-эпитопам Coreпротеина ВГС. В образце №12 в ИБ обнаружена реактивность к антигенам Core, NS3, NS4 и геликазе (следует отметить, что и в плИФТС с расширенным спектром определяемых антител в данной пробе были обнаружены анти-Core, КП=1,6; анти-NS3, КП=1,12 и антиNS4, КП=1,4). В целом, из 16 проб, в которых в ИФТС были обнаружены анти-Core, в ИБ результат исследования двух проб был позитивным, девяти − неопределенным и пяти − негативным. Эти образцы были исследованы в иммуночипах производства ЦНИИ эпидемиологии c раздельно иммобилизованными антигенами (Core-1b, Core-3a, NS3-1b, NS3-3а, c100p, m-51-1b, m-51-3а, NS5-1b, NS5-3а) и раздельным выявлением антител классов M и G. Результаты тестирования в иммуночипах 16 образцов, ранее исследованных в ИФА (таблица 8.1), представлены в таблице 8.2. 186 Таблица 8.2 Результат исследования в иммуночипах с раздельным выявлением IgG и IgM образцов сыворотки крови с низким коэффициентом позитивности анти-Core ВГС в иммуноферментных тест-системах планшетного формата № п/п № пробы в постановке Результат определения анти-ВГС класса IgM Антигены ВГС, к которым обнаружена Реактивность IgG (КП) 2 642 Антигены ВГС, к которым обнаружена реактивность IgM (КП) 3 не обнаружена 1 1 4 отрицат. 2 1486 не обнаружена отрицат. 3 4 2047 2181 NS5-1b (1,7) не обнаружена неопред. отрицат. 5 6 588 2259 не обнаружена не обнаружена отрицат. отрицат. 7 615 NS5-3a (6,8) неопред. 8 1460 *Core-3a (1,2), *Core-1b (1,1) неопред. 9 1795 *Core-3a (1,2), *Core-1b (1,3) неопред. 5 6 Core-3a (15,9), положит. Core-1b (11,2), NS3-1b (1,1), m5-1-1 1b (3,5) NS3-3a (3,2), положит. NS5-3a (2,1), NS5-1b (7,4) NS3-3a (2,5) неопред. Core-3a (14,9), положит. Core-1b (3,8), NS3-3a (6,3), NS3-1b(13,8), m5-1-1 3a (13,2), m5-1-1 1b (37,9), NS5-1b (1,5) m5-1-1 1b (15,5) неопред. Core-3a (32,5), неопред. Core-1b (18,7) Core-3a (9,2), Core-1b (3,9), c-100 (4,9), m5-1-1 1b (4,4) Core-3a (11,8), положит. Core-1b (2,4), NS3-1b (9,4), m5-1-1 1b (3,7) Core-3a (1,9), положит. NS3-1b (1,5) 10 1189 NS3-1b (1,2) Неопред. NS3-3a (4,1), NS3-1b (9,6), m5-1-1 3a (2,2), m5-1-1 1b (1,3) Результат определения анти-ВГС класса IgG положит. 187 Продолжение таблицы 8.2 11 372 не обнаружена отрицат. 12 692 *Core-3a (1,2), *Core-1b (1,1) неопред. 13 603 не обнаружена отрицат. 14 637 NS3-1b (4), m5-1-1b(1,2) положит. 15 1735 не обнаружена отрицат. 16 1035 m5-1-1 3a (4,5) неопред. Core-3a (22), Core-1b (6,4), NS3-3a (3,7), NS3-1b (7,2), m5-1-1 3a (1,1) Core-3a (2,2), Core-1b (1,1), NS3-1b (17,1), c-100 (69,6), m5-1-1 1b (2,7), NS5-1b (1,2) Core-3a (47,6), Core-3b (12,1), NS3-3a (11,7), NS3-1b (31,2), m5-1-1 3a (6,6), m5-1-1 1b (14,5), NS5-1a (1,2), NS5-1b (3,9) Core-3a (8,2), Core-3b (4,4), NS3-1b (11,4), c-100 (12,1), m5-1-1 3a (2), m5-1-1 1b(2,3) Core-3a (24,7), Core-1b (4,4), NS3-1b (7,1), c-100 (5,1), m5-1-1 1b(8,2) Core-3a (2), NS3-3a (1,4), NS3-1b (7,1), m5-1-1 1b (15,6) положит. положит. положит. положит. положит. положит. Из результатов, представленных в таблицах 8.1 и 8.2 следует, что из 16 образцов, позитивных в ИФТС по наличию анти-Core, в иммуночипах анти-Core были обнаружены в 12 образцах (75%). Кроме того, в 11 образцах дополнительно были обнаружены анти-NS3, в девяти − анти-NS4, в трех − анти-NS5. При тестировании в иммуночипах анти-ВГС класса IgG в четырех образцах (№2, 3, 5, 10) в иммуночипах детектировались антитела не к Core, а к неструктурным протеинам ВГС; при этом вследствие выявления антител к антигенам нескольких неструктурных протеинов ВГС результат исследования двух проб был положительным (№ п/п 2 и 10), а двух других − неопределенным. В целом, при тестировании анти-ВГC класса IgG в иммуночипах в 13 образцах из 16 результат был интерпретирован как положительный, а в трех − как 188 неопределенный, поскольку были обнаружены антитела только к одному из структурных (п/п №6) или неструктурных (п/п №3 и №5) антигенов ВГС. При тестировании в иммуночипах 16 образцов на наличие анти-ВГС класса IgM (таблица 8-2) результат исследования 10 образцов был отрицательным. В пяти образцах (31,25%) результат исследования IgM был неопределенным. В пробе №14 (6,25%) результат исследования IgM анти-ВГС был положительным вследствие обнаружения антител класса M к антигенам двух неструктурных протеинов ВГС − анти-NS3 +анти-NS4. Результаты исследования образцов с низкой позитивной ОП антител к Core протеину ВГС в ИФА, иммуноблотах и иммуночипах представлены в таблице 8.3. Таблица 8.3 Сводная таблица исследований образцов с низкой позитивной оптической плотностью антител к Core протеину ВГС в ИФА, иммуноблотах и иммуночипах («+» позитивный результат, «–» негативный результат, «+/–» неопределенный результат исследования) №п/п Шифр пациента Результат Результат Результат Результат В ИФТС В ИБ в ИЧ: в ИЧ: IgG IgM 1 642 + – + – 2 1486 + – *+ – 3 2047 + – *+/– – 4 2181 + – + – 5 588 + – *+/– – 6 2259 + +/– +/– – 7 615 + +/– + +/– 8 1460 + +/– + +/– 9 1795 + +/– + +/– 10 1189 + +/– + – 11 372 + + + – 12 692 + + + +/– 13 603 + +/– + – 14 637 + +/– + + 15 1735 + +/– + – 16 1035 + +/– + +/– Примечание. * − Анти-Core не обнаружены, выявлены антитела к неструктурным антигенам ВГС 189 8.2. Изучение верификационных возможностей иммуночипов при серодиагностике гепатита С в случаях низкой позитивной оптической плотности антител к NS3-антигену ВГС в ИФА По результатам первичного скрининга и подтверждающего исследования было выбрано 22 пробы, в которых в ИФТС обнаруживались только анти-NS3 ВГС с низким КП; из них 13 образцов были дополнительно исследованы также в ИБ (таблица 8.4). В первичной ИФТС КП анти-ВГС в группе составлял 2,42 ±0,14; в ИФТС с раздельным выявлением антител к 4-м антигенам ВГС КП анти- NS3 был равен 4,79±0,86 (M±m). Выявление анти-NS3 в соответствии с инструкциями к использованным тестсистемам являлось основанием для интерпретации результата исследования анти-ВГС как неопределенного. При дополнительном исследовании 13 образцов в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» и «INNO-LIA HCV Ab III update» результаты исследования интерпретировались как отрицательные для 5 образцов (38,5%), как неопределенный – для 6, причем в одном из них (№ п/п 18) в ЛИА были обнаружены антитела к Е2, но не к NS3 антигену ВГС. 190 Таблица 8.4 Результаты исследования образцов сыворотки крови с низким коэффициентом позитивности анти-NS3 в ИФА («Бест-антиВГС-спектр», в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» и в «INNO-LIA HCV Ab III update» № п/п Шифр пациента Пол Возраст, лет КП анти-NS3 в ИФТС; Результат Реактивность образца к антигенам ВГС в ИБ: РБ и в ЛИА (интенсивность реакции). Результат 1 887 ж 60 РБ: не обнаружена (0 баллов). Отрицательный 2 206 м 50 11,00 Неопределенный. 14,23. Неопределенный. 3 193 ж 79 2,76. Неопределенный. РБ: не обнаружена (0 баллов). Отрицательный. 4 771 м 60 5 547 м 59 6 1708 ж 57 12,85 Неопределенный. 4,30 Неопределенный. 1,04. Неопределенный. РБ: к NS3 (3 балла), к геликазе (3 балла); всего 6 баллов. Неопределенный. РБ: к NS3 (3 балла), к геликазе (3 балла), всего 6 баллов. Неопределенный. РБ: к геликазе (3 балла). Отрицательный. 7 246 ж 73 4,33. Неопределенный. Образец не исследован в ИБ. 8 702 ж 32 5,48. Неопределенный. Образец не исследован в ИБ. 9 2069 м 25 1,20. Неопределенный. РБ: к NS3; 3 балла. Отрицательный. 10 253 ж 54 1,20 Неопределенный. РБ: к NS3 (3 балла), к геликазе (3 балла), к NS4 (4 балла); всего 10 баллов. Положительный. РБ: не обнаружена (0 баллов). Отрицательный. 191 Продолжение таблицы 8.4 11 479 м 28 4,40. Неопределенный. ЛИА: к NS3 (1+). Неопределенный. 12 1638 ж 77 2,16. Неопределенный. Образец не исследован в ИБ 13 1661 ж 23 2,52. Неопределенный. Образец не исследован в ИБ 14 1731 ж 66 3,03. Неопределенный. Образец не исследован в ИБ 15* 2987 м 58 1,50. Неопределенный. Образец не исследован в ИБ 16 106 м 43 1,00.Неопределенный. Образец не исследован в ИБ 17** 1025 ж 29 1,80. Неопределенный. 18 1356 ж 77 5,42.Неопределенный. РБ: к NS3 (3 балла), к геликазе (3 балла), всего 6 баллов.Неопределенный. ЛИА: к Е2, (2+). Неопределенный. 19 2006 м 61 10,00.Неопределенный. ЛИА: к NS3 (1+). Неопределенный. 20 1425 ж 23 1,70.Неопределенный. 21 509 ж 82 4,20. Неопределенный. ЛИА: к С1(1+), к С2(+/-), к NS3 (1+). Положительный. Образец не исследован в ИБ 22 872 м 77 9,34. Неопределенный. Образец не исследован в ИБ Примечания: * − сыворотка крови потребителя внутривенных наркотиков (№15) ; ** − сыворотка крови беременной женщины (№17). 192 Результаты исследования двух образцов были признаны позитивными (15,4%) вследствие обнаружения антител не только к NS3, но и к NS4 антигену (№ п/п 10), а также к С1 и С2 антигенам ВГС (№ п/п 20). Исследованные в ИФА 22 образца были протестированы в иммуночипах (таблица 8.5). Таблица 8.5 Результат исследования в иммуночипах образцов сыворотки крови с низким коэффициентом позитивности анти-NS3 ВГС в иммуноферментных тест-системах планшетного формата № п/п 1 Шифр пациента 887 2 206 Антигены ВГС, к которым обнаружена реактивность IgM (КП) Результат определения анти-ВГС класса IgM Не обнаружена Отрицат. Не обнаружена Отрицат. Core-3a (1,4), Core-1b (1,5), NS3-1b (7,3) NS5-3a (2,3), NS5-1b (3,4) Положит. 3 193 4 771 5 547 Не обнаружена Отрицат. 6 1708 NS3-3a (3,8), NS3-1b (6,5), m5-1-1b (3,5), NS5-3a (1,9), NS5-1b (6,2) Положит. Неопред. Антигены ВГС, к которым обнаружена реактивность IgG (К) Core-3a (1,4), Core-1b (1,4) NS3-3a (2), NS5-3a (29,1), m5-1-1b (58,6) m5-1-3a (2,3) Результат определения анти-ВГС класса IgG NS3-3a (17,9), NS3-1b (46), m5-1-3a (8,9), m5-1-1b (6,7), NS5-3a (1,9), NS5-1b (3,3) Core-3a (10,8) NS3-3a (15,3), NS3-1b (90,5), m5-1-3a (3,8), m5-1-1b (8,6), NS5-3a (1,5), NS5-1b (2,7) Core-3a (6,5) NS3-3a (9,5), NS3-1b (47), m5-1-3a (5,3), m5-1-1b (2), NS5-3a (1,2), NS5-1b (1,7) Core-3a (4) Положит. Неопред. Положит. Неопред. Положит. Положит. 9 10 193 Продолжение таблицы 8.5 7 246 Не обнаружена Отрицат. 8 Отрицат. 702 2069 NS5-1b (1,3) 253 NS5-3a (1,3) Положит. Положит. NS3-3a (1,6), NS3-1b (2), m5-1-1a (1,8), m5-1-1b (1,5), NS5-3a (1,7), Положит. NS3-1b (14) Неопред. NS5-3a (1), NS5-1b (3) Неопред. NS3-1b (22,5), c100 (15,5), m5-1-1b (20,3), Core-3a (2,2), Core-1b (1,9) NS3-1b (64,9), m5-1- 1b (1,2), Core-3a (1,2) NS3-1b (2,5), NS5-1b (2,1), Core-3a (2,5), Core-1b (2,3) Положит. NS3-3a (1,2), NS3-1b (5,8), m5-1-3a (1,5), Core-3a (1,3) NS3-3a (11,3), NS3-1b (22,5), m5-1- 3а (6,8), m5-1- 1b (33,3), NS3-3a (10,9), NS3-1b (38,8), Core-3a (1,8) NS3-3a (35,7), NS3-1b (37,9), c-100 (1,9), m5-1- 3а (31,1), m5-1- 1b(101,3), NS3-3a (55,9), NS3-1b (135,3), Core-3a (43,4), Core-1b (5,2) NS3-1b (4,1), m5-1-1 1b(4,1) NS3-1b (11,6) Положит. 11 479 NS5-3a (1,2), NS5-1b (1,1) Неопред. 12 1638 NS3-3a (1,9), NS3-1b (3,3), m5-1-1b (1,1), Положит. NS5-1b 1,1) NS3-3a (2,7), NS3-1b (28,9), m5-1-3a (12,4), m5-1-1b (1,3) NS3-3a (1,3), NS3-1b (161,1), m5-1-1b (14,8) 13 1661 Не обнаружена Отрицат. 14 1731 NS3-1b (4,4) Неопред. 15 2987 NS3-3a (4,4), NS3-1b (3), m5-1-1a (3), m5-1-1b (4,7), NS5-3a (1,3), NS5-1b (6,3), Core-3a (1,4), Core-1b (1,2) Положит. 16 106 Отрицат. 17 1025 Не обнаружена Не Обнаружена Отрицат. Положит. Положит. Положит. Положит. Положит. Неопред. 18 194 Продолжение таблицы 8.5 1356 Не обнаружена Отрицат. 19 2006 Не обнаружена Отрицат. 20 1425 Не обнаружена Отрицат. 21 509 NS3-1b (2,5) Неопред. 22 872 Не обнаружена Отрицат. NS3-3a (10,3), NS3-1b (15,3), m5-1- 3а (1,7), m5-1- 1b (3), NS3-3a (1,1), NS3-1b (3,1) NS3-3a (17,9), NS3-1b (30,9), m5-1- 3а (4,4), m5-1- 1b (2,4), Core-3a (2), Core-1b (1,3) NS3-1b (1,2), m5-1- 1b (16,4), Core-3a (1,7), Core-1b (1,4) NS3-3a (31,9), NS3-1b (36,3), c-100 (3,5), m5-1- 3а (20,1), m5-1- 1b (64,6), NS3-3a (23,1), NS3-1b (57,4), Core-3a (3,1), Core-1b (1,2) NS3-1b (5,6), Core-3a (1,2) Положит. Положит. Положит. Положит. Положит. Из результатов, представленных в таблице 8.5, следует, что из 22 образцов в иммуночипах анти-NS3, относящиеся к IgG, не были обнаружены в 2 образцах (9%); а именно, в пробах пациентов под шифром 887 и 193 (№ п/п 1 и 2), в них соответственно выявлялись только анти-Core или анти-NS4. В двух пробах (№ п/п 9 и 17) были обнаружены только анти-NS3. Результат исследования данных четырех образцов в иммуночипах так же, как в ИФТС, был признан неопределенным вследствие выявления антител только к одному протеину ВГС. Дополнительно к анти-NS3 в 16 (80%) из 20 образцов были обнаружены анти-NS4, в семи (35%) − анти-NS5, в 14 (70%) − анти-Core ВГС. Антитела к двум белкам ВГС были обнаружены в 4 пробах из 22 (18,18%); антитела к трем белкам (36,4%); в восьми пробах ). Всего в иммуночипах из 22 образцов 18 (81,8%) образцов были признаны анти-ВГС позитивными, поскольку в них обнаруживались антитела более чем к двум протеинам ВГС. При тестировании в иммуночипах 22 образцов на наличие анти-ВГС класса IgM (таблица 8.5) результат исследования 12 образцов (54,5%) был отрицательным, пяти образцов (22,7%) – неопределенным. Среди образцов с неопределенным результатом 195 исследования в двух пробах с низкой позитивностью детектировались анти-NS3, в трех пробах − анти-NS5. Пять образцов были признаны содержащими IgM к протеинам ВГС (22,7%), причем в одной пробе (пациент 193) обнаруживались IgM к двум белкам ВГС (NS3 и к Core), в трех пробах (пациенты 1708, 2069, 1638) − к трем белкам ВГС (NS3, NS4 и Core), в одной пробе (пациент 2987) – к четырем протеинам ВГС. Таким образом, из 22 проб, в которых в ИФТС обнаруживались только анти-NS3 и в соответствии с правилами интерпретации результат исследования был неопределенным, в иммуночипах 18 проб (81,8%) были признаны анти-ВГС позитивными по наличию IgG, а пять (22,7%) – позитивными на наличие IgM (табл. 8.6). Из 13 образцов, исследованных в ИБ, в 5 образцах (38,5%) результат исследования был неопределенным (в основном вследствие обнаружения анти-NS3 и антител к геликазе), в двух (15,4%) – позитивным, в остальных шести – отрицательным (вследствие отсутствия реактивности пробы к антигенным полосам в ИБ, либо вследствие обнаружения антител к одному антигену, в основном только к NS или только к геликазе). При тестировании этих 12 проб в иммуночипах результат исследования IgG в пяти пробах (38,5%) был признан неопределенным, а в восьми (61,5%) – позитивным (табл. 8.6). Таким образом, среди проб с неопределенным результатом исследования в ИФА (вследствие выявления только анти-NS3) в иммуночипах анти-ВГС-позитивных проб было в 4 раза больше, чем в ИБ (p<0,05). 196 Таблица 8.6 Сводная таблица исследований образцов с низкой позитивной оптической плотностью антител к NS3 протеину ВГС в ИФА, иммуноблотах и иммуночипах («+» – позитивный результат, «–» – негативный результат, «+/–»– неопределенный результат исследования, «ни» – образец в ИБ не исследован) №п/п 1 Шифр пациента Результат Результат Результат в Результат в в ИФТС в ИБ ИЧ: IgG ИЧ: IgM 887 +/– – +/– – +/– – + – 206 2 3 193 +/– – +/– + 4 771 +/– +/– + +/– 5 547 +/– +/– + – 6 1708 +/– – + + 7 246 +/– ни + – 8 702 +/– ни + – 9 2069 +/– – +/– + 10 253 +/– + + +/– 11 479 +/– +/– + +/– 12 1638 +/– ни + + 13 1661 +/– ни + – 14 1731 +/– ни + +/– 15 2987 +/– ни + + 16 106 +/– ни + – 17 1025 +/– +/– +/– – 18 1356 +/– +/– + – 19 2006 +/– +/– + – 20 1425 +/– + + – 21 509 +/– ни + – 22 872 +/– ни + – Из пяти проб, в которых в иммуночипах были обнаружены IgM к ВГС, три пробы были ранее признаны в ИБ не содержащими анти-ВГС (пациенты 193, 1708, 2069). 197 8.3. Изучение верификационных возможностей иммуночипов при обнаружении антител к NS4-антигену ВГС в ИФА с низкой позитивной оптической плотностью По результатам первичного скрининга и исследования в ИФТС с раздельным определением антител к белкам ВГС был выбран 31 образец , в которых обнаруживались только анти-NS4 ВГС; 16 из них были дополнительно исследованы в ИБ. Результаты представлены в таблице 8.7. Таблица 8.7 Результаты исследования образцов сыворотки крови с анти-NS4 в иммуноферментных тест-системах планшетного формата с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенам ВГС («Бест-анти-ВГС-спектр»), в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0», и в «INNO-LIA HCV Ab III update» № п/п Шифр пациента Пол Возраст, лет КП анти-NS4 в ИФТС. Результат 1 885 м 1941 3,23. Неопределенный. 2 1839 ж 1939 3 6 ж 1984 4 1430 м 1943 5 1584 ж 4,6 Неопределенный. 2,5 Неопределенный. 3,0 Неопределенный. Отрицательный. 6 1891 м Отрицательный. 7 670 ж 1928 8 778 ж 1935 9* 836 ж 1976 10 29 ж 1981 11 2751 ж 1940 12 1657 м 1950 13 2025 ж 1964 2,6 Неопределенный. 1,48 Неопределенный. 1,56 Неопределенный. 3,2 Неопределенный. 8,8 Неопределенный. 4,92 Неопределенный. 1,33 Неопределенный. Реактивность образца к антигенам ВГС в ИБ: РБ и в ЛИА (интенсивность реакции). Результат РБ: не обнаружена (0 баллов). Отрицательный РБ: NS-5-12 (2 балла). Отрицательный. РБ: NS-5-12 (2 балла). Отрицательный. РБ: NS-5-12 (2 балла). Отрицательный. ЛИА: NS4 (1+) Неопределенный. ЛИА: NS4 (1+) Неопределенный. ЛИА: NS4 (2+) Неопределенный. ЛИА: NS4 9 (2+) Неопределенный. НИ*** НИ НИ НИ НИ 198 Продолжение таблицы 8.7 14 2007 ж 1977 2 Неопределенный. 3,2 Неопределенный. 1,8 Неопределенный. 1,38 Неопределенный. 2,74 Неопределенный. 1,82 Неопределенный. 1,82 Неопределенный. 1,24 Неопределенный. 1,22 Неопределенный. 2,63 Неопределенный. 2,83 Неопределенный. 3,79 Неопределенный. 5,83 Неопределенный. 2,92 Неопределенный 2,79 Неопределенный. 3,8 Неопределенный 15 1091 м 1937 16 *691 ж 1979 17 1502 м 1941 18 172 м 1948 19 1335 м 1934 20 1831 ж 1965 21 1774 ж 1983 22 *1089 ж 1984 23 2030 ж 1987 24 2246 ж 1967 25 576 м 1924 26 *599 ж 1975 27 1788 ж 1926 28 **2283 ж 1992 29 ***875 м 1934 30 1320 м 1962 1,7 Неопределенный 31 73 м 1938 5,7 Неопределенный НИ НИ НИ НИ НИ НИ НИ НИ ЛИА: NS4 (2+) Неопределенный. ЛИА: NS4 (2+) Неопределенный. ЛИА: NS4 (3+) Неопределенный. ЛИА: NS4 (2+) Неопределенный. ЛИА: NS4 (1+) Неопределенный ЛИА: NS4 (3+) Неопределенный. ЛИА: NS4 (3+) Неопределенный. РБ: NS3 (3 балла), геликаза (3 балла), всего 6 баллов Неопределенный РБ: NS3 (3 балла), NS4 (4 балла), всего 7 баллов. Неопределенный РБ: NS3 (3 балла), геликаза (3 балла), всего 6 баллов. Неопределенный Примечания: * − беременная женщина; ** − потребитель внутривенных наркотиков; *** − пациент с алкогольным поражением печени; ***− НИ − проба в иммуноблоте не исследована 199 В первичной ИФТС КП анти-ВГС в группе составлял 3,04 ±0,34; в ИФТС с раздельным выявлением антител к 4-м антигенам ВГС КП анти- NS4 был равен 2,98±0,31 (M±m). Выявление анти-NS4 в соответствии с инструкциями к использованным тестсистемам являлось основанием для интерпретации результата исследования анти-ВГС как неопределенного. Результат исследования двух проб (пациенты 1584 и 1891) был позитивным в ИФТС для первичного скрининга и отрицательным в ИФТС с раздельным выявлением антител, направленных к разным антигенам ВГС. При дополнительном исследовании 18 образцов в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» или «INNO-LIA HCV Ab III update» результат исследования интерпретировался как отрицательный для 4 образцов (22,2%), как неопределенный – для 14 образцов, причем в двух из них (№п/п 29 и 30) в ИБ были обнаружены антитела к участкам протеина NS3, но не к NS4 антигену ВГС. Результат исследования проб, полученных от двух пациентов двух пациентов (1584 и 18910 в ЛИА был признан неопределенным вследствие выявления только анти-NS4. Результат исследования в ИБ ни одного образца не был признан позитивным. Образцы, ранее исследованные в ИФА, были протестированы в иммуночипах (таблица 8.8). Таблица 8.8 Результат исследования в иммуночипах с раздельным выявлением IgG и IgM образцов сыворотки крови с выявлением в иммуноферментных тест-системах планшетного формата только анти- NS4 ВГС № п/п Пациент Антигены Результат ВГС, определе к которым ния обнаружена анти-ВГС реактивность класса IgM (КП) IgM 1 885 Не обнаружена 2 1839 c-100 (2,8) Антигены ВГС, к которым обнаружена реактивность IgG (К) Результат определения анти-ВГС класса IgG Отрицат. NS3-1b (2,7), с-100 (66) m5-1-1b (1,2) Core-3a (1,8), Core-1b (1,5) Полож. Неопреде л. NS3-3a (1,4), NS3-3b (1,9), с-100 (74) Core-3a (1,5), Core-1b (1,7) Положит. 200 Продолжение таблицы 8.8 3 6 Не обнаружена Отрицат. 4 1430 Core-3a (1,7) Неопред. 5 1584 Не обнаружена Отрицат. 6 1891 Не обнаружена Отрицат. 7 670 Не обнаружена Отрицат. 8 778 Не обнаружена Отрицат. 9 836 Не обнаружена Отрицат. 10 29 Не обнаружена Отрицат. 11 2751 Не обнаружена Отрицат. 12 1657 Не обнаружена Отрицат. 13 2025 Не обнаружена Отрицат. 14 2007 Не обнаружена Отрицат. 15 1091 Не обнаружена Отрицат. NS3-3a (1,7), NS3-3b (2,4), с-100 (20,2) m5-1-3a (1,3) Core-3a (1,1), Core-1b (1,3) NS3-3a (19,2), NS3-1b (42,7), m5-1-1a (9,2), m5-1-1b (82,9), NS5-3a (13,4), NS5-1b (48,3) Core-3a (1,3) Core-1b(1,1) с-100 (35,6) Core-3a (2,6), Core-1b (2,1) с-100 (45,8) m5-1-1b (2,8), Core-3a (1,1) NS3-3a (3), NS3-1b (23,8), c-100 (33,4), m5-1-1 3a (2,8) Core-3a (1,9) Положит. NS3-3a (1,6), NS3-1b (12,4), c-100 (50,3), m5-1-1 3a (1,6) NS3-1b (1,5), c-100 (21,9) NS3-1b (10,4), c-100 (60,8), m5-1-1 3a (1,1) NS3-1b (2,8), c-100 (92,1) NS3-1b (25), c-100 (35,3) NS3-3a (3,6), NS3-1b (34,3), c-100 (51,7) m5-1-1 3a (1,6) NS3-3a (3,6), NS3-1b (34,3), c-100 (51,7) m5-1-1 3a (1,6) NS3-1b (2,5), c-100 (60,6) c-100 (60,6) Положит. Положит. Положит. Положит. Положит. Положит. Положит. Положит. Положит. Положит. Положит. Положит. 201 Продолжение таблицы 8.8 16 *691 Не обнаружена Отрицат. NS3-3a (6,2), NS3-1b (4,7), c-100 (61), m5-1-3a (4,8), m5-1-1b (3,5), NS5-3a (4,5), NS5-1b (3,5) Core-3a (3,5) Положит. 17 1502 Не обнаружена Отрицат. NS3-1b (1,1), c-100 (26,6) Положит. 18 172 Не обнаружена Отрицат. c-100 (63,3), m5-1-3a (1,4) Неопред. 19 1335 Не обнаружена Отрицат. c-100 (84,5), Core-3a (1,1) Положит. 20 1831 Не обнаружена Отрицат. NS3-1b (2,6), c-100 (30,3) Положит. 21 1774 Не обнаружена Отрицат. c-100 (43,7) Неопред. 22 *1089 Не обнаружена Отрицат. NS3-1b (3,2), c-100 (74,1), NS5-3a (1,1) Положит. 23 2030 m5-1-1 3a (6,6) Отриц. c-100 (34,5) Неопред. 24 2246 Не обнаружена Отрицат. NS3-1b (1,9), c-100 (49,9), Core-3a (1,2) Положит. 25 576 Не обнаружена Отрицат. c-100 (50,9), m5-1-1b (1,4), NS5-3a (1,6), NS5-1b (3) Core-3a (3,7), Core-1b(3,8) Положит. 26 *599 Не обнаружена Отрицат. c-100 (65,1), m5-1-3a (4,1), Core-3a (1,2) Положит. 27 1788 Не обнаружена Отрицат. Положит. 28 **2283 Не обнаружена Отрицат. NS3-3a (2,4), NS3-1b (19,6), c-100 (26,4), Core-3a (4) c-100 (35,5) Неопред. 202 Продолжение таблицы 8.8 29 ***875 30 31 Не обнаружена Отрицат. c-100 (10,6) Неопред. 1320 NS3-3a (5,2), Положит. NS3-1b (19,5), c-100 (2,2), m5-1-1 3a (1,6), m5-1-1 1b (3,2), NS5-1a (4,2), NS5-1b (4,1) NS3-1b (45,1), c-100 (36,4), m5-1-1b (51,2), Core-3a (1,4), Core-1b(1,3) Положит. 73 NS3-3a (2,5), Положит. NS3-1b (17,7), m5-1-1 3a (1,2), NS5-1a (1,1), NS5-1b (5,2) NS3-1b (18,6), c-100 (117,2), Core-3a (2,9) Положит. Результат исследования пяти образцов на наличие анти-ВГС класса G в иммуночипах был неопределенным вследствие обнаружения реактивности только к антигенам белка NS4, а 26 образцов − позитивным вследствие обнаружения антител к антигенам нескольких белков ВГС. Из 31 образца реактивность к антигенам белка NS4 c-100 и m5-1-1 была обнаружена соответственно в 30 (96,8%) и в 13 образцах (41,9%). Кроме того, дополнительно к анти-NS4 в 19 образцах были обнаружены анти-NS3 (61,3%), в четырех (пациенты 1430, 691, 1774, 576) − анти-NS5 (12,9%), в десяти − анти-Core (32,3%), относящиеся к IgG. Антитела к двум протеинам ВГС в иммуночипах обнаруживались в 14 образцах, из них в четырех − анти- NS4 и анти-Core, в десяти − антиNS4 анти- NS3. Антитела к трем протеинам ВГС обнаруживались в 8 образцах (25,8%), к четырем − в двух образцах (6,45%). Ни один из образцов с неопределенным результатом исследования в ИФА по наличию только анти-NS4 в иммуночипах не был определен как не содержащий анти-ВГС (таблица 8.9). 203 Таблица 8.9 Сводная таблица исследований образцов с низкой позитивной оптической плотностью антител к NS4 протеину ВГС в ИФА, иммуноблотах и иммуночипах («+» – позитивный результат, «–» – негативный результат, «+/–»– неопределенный результат исследования, «НИ» – образец в ИБ не исследован) №п/п 1 2 Шифр пациента 885 1839 Результат Результат Результат Результат В ИФТС В ИБ в ИЧ: ИЧ: IgG IgM +/– − + − +/– − + +/− 3 6 +/– − + − 4 1430 +/– − + +/− 5 1584 +/– +/− + − 6 1891 +/– +/− + − 7 670 +/– +/− + − 8 778 +/– +/− + − 9 836 +/– НИ + − 10 29 +/– НИ + − 11 2751 +/– НИ + − 12 1657 +/– НИ + − 13 2025 +/– НИ + − 14 2007 +/– НИ + − 15 1091 +/– НИ + − 16 *691 +/– НИ + − 17 1502 +/– НИ + − 18 172 +/– НИ +/− − 19 1335 +/– НИ + − 20 1831 +/– НИ + − 21 1774 +/– НИ +/− − 22 *1089 +/– +/− + − 23 2030 +/– +/− +/− − 24 2246 +/– +/− + − 25 576 +/– +/− + − в 204 Продолжение таблицы 8.9 *599 +/– 26 +/− + − 27 1788 +/– +/− + − 28 **2283 +/– +/− +/− − 29 ***875 +/– +/− +/− − 30 1320 +/– +/− + + 31 73 +/– +/− + + Примечания: * − беременная женщина; ** − потребитель внутривенных наркотиков; *** − пациент с хронической болезнью печени При тестировании в иммуночипах 31 образца на наличие анти-ВГС класса M результат исследования 2 образцов (6,45%) был позитивным, двух (6,45%) – неопределенным (таблица 8-11), остальных 27 образцов − отрицательным. Таким образом, из 31 пробы, в которых в ИФТС обнаруживались только анти-NS4 и в соответствии с правилами интерпретации результат исследования был неопределенным, в иммуночипах 26 проб (83,9%) были признаны анти-ВГС позитивными по наличию IgG, и две из них содержали также IgM (табл. 8.9). При сравнении результатов исследования 18 образцов, полученных в ИБ и иммуночипах, обнаружено, что 4 пробы, идентифицированные в ИБ как не содержащие анти-ВГС, в иммуночипах определены как содержащие анти-ВГС класса G (пациенты 885, 1839, 6, 1430). Результат исследования трех образцов был неопределенным как в ИБ, так и в иммуночипах (пациенты 2030, 2283, 875). Прочие 11 образцов, результат исследования которых в ИБ был неопределенным, в иммуночипах были идентифицированы как содержащие анти-ВГС класса G. Таким образом, распределение негативных, неопределенных и позитивных результатов в ИБ (соответственно 4:14:0 образцов) и иммуночипах (соответственно 0:3:15 образцов) различалось (p<0,001). Распределение частоты результатов в ИБ и иммуночипах в группе с NS4 в ИФА представлено на рис. 8.2. 205 90% 83% 78% 80% частота реультата 70% 60% 50% 40% 30% иммуноблот иммуночип 22% 17% 20% 10% 0% 0% 0% негативный результат неопределенный результат позитивный результат результат исследования Рис. 8.2. Распределение частоты отрицательного, неопределенного и позитивного результата при исследовании в иммуноблотах и в иммуночипах пробах с анти- NS4 ВГС в ИФА (в иммуноблоте при исследовании данных проб нет позитивных результатов, в иммуноблоте − нет негативных результатов). 8.4. Результаты исследования в иммуночипах образцов, положительных в ИФА планшетного формата на наличие анти-NS5 ВГС, Пробы с антителами только к NS5 белку ВГС в ИФТС российского производства встречаются редко. В нашей работе представлены результаты исследования двух проб (таблица 8.10 ). 206 Таблица 8.10 Результат исследования в иммуноблоте и в иммуночипах с раздельным выявлением IgG и IgM образцов сыворотки крови с выявлением в иммуноферментных тест-системах планшетного формата только анти- NS5 ВГС № п/п Шифр Пол пациента 1 1009 Возраст, Результат лет ж 74 ИФА ИЧ: ИЧ: IgG IgM Отриц. Отриц. Отриц. Неопр. Отриц. Полож. Отриц. КП=1,88 (НС5-12, NS5-1b, 2 балла) Core-3a, Неопр. ИБ КП=3,74 2 220 ж 81 Core-1b Данные, представленные в таблице 8.10, свидетельствуют о том, что результаты исследования одной из двух проб (пациента 1009) были отрицательными в ИБ и в иммуночипах; результат исследования второй пробы в ИБ был неопределенным, в иммуночипах − положительным на наличие анти- ВГС класса G и отрицательным − на наличие анти- ВГС класса M. 8.5. Сравнение результатов исследования антител к ВГС, полученных различными методами: ИФА в планшетном формате, иммуноблот, иммуночип При сравнении результатов исследования проб в ИФА и в иммуночипах (таблица 8.11), в иммуночипах количество позитивных проб было учтено как сумма проб с антителами класса G и проб с антителами класса M (при этом, возможно, с неопределенным результатом исследования антител класса определяются антитела классов G и M. G), поскольку в ИФТС одновременно 207 Таблица 8.11 Изменение относительного результатов в иммуночипах количества неопределенных и позитивных по сравнению с результатом исследовании образцов с антителами только к одному антигену ВГС в ИФА Анти-Core (16) 100% позитив. 19% Анти-NS3 (22) 100% неопр. Анти-NS4 (31) 100% неопр. Количество позитивных результатов тестирования анти-ВГС класса M в иммуночипе Изменение количества позитивных Результатов определения анти-ВГС по сравнению с ИФА (IgG + IgМ) Изменение количества неопределенных рез Ультатов В ИЧ по сравнению с ИФА (IgG + IgМ) позитив-ные Результаты определения анти-ВГС (классов G и M) в иммуночипе неопределенные Результаты в ИФА, антитела классов GиM* Антитела к ВГС с низким КП (кол-во проб) * позитив. − позитивный результат; ** неопр. − неопределенный результат 81% 9% Статистических различий нет 91% P<0,001 P<0,001 6,25% 16% 84% P<0,001 22,7% 6,45% P<0,001 208 Относительное количество позитивных результатов при исследовании в иммуночипах проб с антителами к одному из антигенов ВГС в ИФА представлено в таблице 8-14. А именно, при исследовании в иммуночипах следующих проб: с анти-Core в ИФА количество позитивных в иммуночипах проб было равно 13 из 16 (81%), то есть отмечена тенденция к снижению количества анти-ВГС -позитивных проб по сравнению с ИФА; с анти-NS3 в ИФА − количество позитивных в иммуночипах проб было равно 20 (из них 18 проб были позитивны по анти-ВГС класса G, 2 пробы − только по анти-ВГС класса М), итого 20 из 22 (91%); с анти-NS4 в ИФА − количество позитивных в иммуночипах проб было равно 26 (из них 26 позитивны по анти-ВГС класса G либо по антителам классов G и M), итого 84%. Различий по частоте обнаружения антител класса М между образцами, в которых в ИФА обнаруживались антитела только к структурному либо к одному из неструктурных протеинов ВГС: NS3 или NS4 не было. Результаты сравнения относительного количества позитивных проб и проб с неопределенными результатами исследования в иммуночипах и в ИФА представлены в таблице 8-11. По сравнению с ИФА количество неопределенных результатов снизилось в иммуночипах примерно в 10 раз при выявлении в ИФА только анти анти-NS3, и примерно в 6 раз − при выявлении в ИФА только анти-NS4 (P<0,001). Результаты сравнения относительного количества позитивных проб и проб с неопределенными результатами исследования в иммуноблотах и в иммуночипах, представлены в таблице 8.12. Таблица 8.12 Сравнение частоты позитивных результатов в иммуноблотах и в иммуночипах. Группа с антителами % % к ВГС с позитивных Позитивных Достоверность низким КП результатов результатов в различий в ИФА (n) в ИБ иммуночипах Анти-Core 12% 81% P<0,001 15% 70% P<0,005 0% 88% P<0,001 (16) Анти-NS3 (13) Анти-NS4 (17) 209 Таким образом, в каждой из групп (с анти-Core, анти-NS3 и анти- NS4 в ИФА) в иммуночипах как анти-ВГС-позитивные определялось статистически достоверно больше проб, чем в иммуноблотах. 8.6. Результаты исследования РНК в образцах сыворотки крови с антителами, относящимися к IgМ Образцы с неопределенным и позитивным результатом определения антител класса М в иммуночипах были исследованы методом ПЦР для выявления РНК ВГС с помощью «АмплиСенс HCV-Монитор-FL» (чувствительность 50 МЕ/мл). Процесс амплификации кДНК ВКО регистрировался в нашем исследовании на канале FAM/Sybr (рис. 8.3 − постановка 1, рисунок 8.4 − постановка 2). Из рисунка 8.3 следует, что потерь интенсивности флуоресцентного сигнала не было, что свидетельствовало о достоверности анализа. Для решения клинической задачи были исследованы образцы с позитивным и неопределенным ответом по наличию IgM с п/п № 7, 14, 16, 19, 20, 23, 24, 25, 29, 30, 31, 33, 34, 40, 45 и 48 (см. общую таблицу 8.1 исследования проб в иммуночипах). Накопление интенсивности флуоресцентного сигнала, соответствующее количеству РНК ВГС в исследуемых образцах, оценивалось по каналу JOE. На рисунке 8.3 исследуемые образцы помечены зеленым цветом, отрицательные контроли – синим, калибраторы ВКО – оранжевым, положительные контроли и калибраторы РНК ВГС – красным. По результатам двух постановок ПЦР все 16 исследованных образцов признаны не содержащими РНК ВГС при аналитической чувствительности метода 50 МЕ/мл (рис. 8.3 и 8.4). Однако три образца в первой постановке: №14(с неопределенным результатом выявления IgM к антигенам NS3-1b, К=4; и m5-1-1b, К=1,2); №20 (с неопределенным результатом выявления IgM к антигенам NS5-3a, К=2,3; и NS5-1b, К=3.4); №23 (с положительным результатом выявления IgM к антигенам NS3-3a, К=5,2; NS3-1b, К=19,5; c100, К=2,2; m5-1-1 3a, К=1,6; m5-1-1 1b, К=3,2; каналу JOE имели кривые накопления, NS5-3a, К=4,2; NS5-1b, К=4,1), − по характерные для продуктов реакции, но ниже порогового уровня, поэтому данные образцы также были оценены как не содержащие РНК ВГС. 210 Cycling A.FAM This report generated by Rotor-Gene Analysis Software (C)Corbett Research 2004 (R)All Rights Reserved 8.3.А. Кривые накопления флуоресцентного сигнала продукта амплификации кДНК ВКО в первой постановке. Cycling A.JOE Рис. 8.3. Б. Кривые накопления флуоресцентного сигнала продуктов амплификации фрагмента кДНК ВГС образцов в первой постановке. 211 Cycling A.FAM This report generated by Rotor-Gene Analysis Software Run Name : F:\HCV mon 2011-03-10.rex (C)Corbett Research 2004 (R)All Rights Reserved 8.4.А. Кривые накопления флуоресцентного сигнала продуктов амплификации кДНК ВКО во второй постановке. Рис. 8.4. Б. Кривые накопления флуоресцентного сигнала продуктов амплификации фрагмента кДНК ВГС образцов во второй постановке. 212 6.7. Выявление анти-ВГС с помощью иммуночипов в сыворотке крови пациентов с различным анамнезом (клинические примеры) 1) Пациент Ю. – женщина, 45 лет, лаборант клинической диагностической лаборатории, стаж работы 15 лет. Переливаний крови не было; двое родов. В течение последних 10 лет (с 2000 г. по 2010 г.) на ежегодных профосмотрах в ИФА выявляются антитела к NS4 антигену ВГС с КП менее 5. В иммуноблотах «RecomBlot HCV IgG 2.0», lot HC03091 (РБ, «Mikrogen», Германия) и в «INNO-LIA HCV Ab III update», с.009 (ЛИА, «Innogenetics», Бельгия) результат исследования анти-ВГС отрицательный. Трижды (в 2010, 2003 и 2009 гг.) были проведены исследования на наличие РНК ВГС в сыворотке крови; результаты отрицательные. Результаты биохимического исследования крови (таблица 8.13) постоянно были в норме. Таблица 8.13 Результаты биохимического исследования крови пациентки Ю-ной в 2010 г. № п/п Вид исследования Результат Значения показателя низкие высокие 1 Общий белок 80,4 г/л 65,0 88,0 2 АСТ 20,0 ед/л 4,0 37,0 3 АЛТ 20,3 ед/л 6,0 41,0 4 Амилаза 63,0 ед/л 30 100 5 Билирубин общий 9,0 мкмоль/л 1,7 20,5 6 Мочевина 5,0 ммоль/л 3,0 9,2 7 Холестерин 5,09 ммоль/л 1,7 5,6 8 Креатинин 55,8 мкмоль/л 44,0 97 9 Глюкоза 5,0 ммоль/л 3,5 6,4 10 Триглицериды 1,06 ммоль/л 0,4 1,71 11 Мочевая кислота 265,3 мкмоль/л 140,0 420,0 12 ЛПВП 2,30 ммоль/л 0,9 3,0 13 ЛПНП 2,9 ммоль/л 0 4,1 В 2010 г. сыворотка крови Ю. была исследована в иммуночипах, результат был положительным на наличие антител к ВГС класса G (табл. 8.17 А) и отрицательным – антител класса M (табл. 8.14). 2) Пациент Т-в (образец № 1335 в таблице 8.7). С 2007 г. состоит на учете как «носитель анти-ВГС». Биохимические показатели крови при исследовании крови в 2007 − 2010 годах 213 были в норме. В 2009 г. при исследовании на наличие анти-ВГС были получены следующие результаты: в скрининге КП был равен 1,17; в подтверждающей тест-системе КП к комплексу NS антигенов был равен 1,2; в подтверждающей тест-системе с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4 и NS5 антигенам КП анти-NS4 был равен 1,4. Результаты определения РНК методом ПЦР отрицательные. Результаты, полученные при исследовании образца сыворотки крови от 2009 г. пациента Т. в иммуночипах (таблица 8.14), свидетельствовали о наличии анти-ВГС вследствие выявленной реактивности пробы к антигенам белков NS4 и Core (c-100 и Core3a). Таблица 8.14 Результаты исследования проб сыворотки крови пациентов в иммуночипах А) IgG c-100 m5-1-1 -3a m5-1-1 -1b NS5-3a NS5-1b Core-3a Core-1b Результат Ю. Т. К Г. М. NS3-1b 1 2 3 4 5 NS3-3a Реактивность к пептидам, аналогичным белкам ВГС Пацтиент № п/п 0,9 0.5 2,8 0,6 23.1 3,5 0.5 7,2 0,8 9 41,3 84.5 5,1 80,5 62.8 0,2 0.6 0,2 0,2 6.7 0,2 0 10,4 0,2 176 1,5 0.3 2,1 0,6 51 2,7 0.2 2,4 0,3 9 0,5 1.1 0,9 0,8 7.2 0,2 0.7 2,9 0,2 12.3 + + + +/− + Б) IgM 1 2 3 4 5 Ю. Т. К. Г. М. 0,2 0 0,2 0,1 0.4 0,5 0 0,2 0,3 0.4 0,8 0.1 0,6 0,7 0.1 0,4 0.1 0,3 0,3 0.1 0,3 0.1 0,4 0,3 0.1 0,1 0 0,3 0,3 0 0,4 0.1 0,2 0,2 0.4 0,5 0 0,5 0,5 0.1 0,7 0 0,7 0,8 0 − − − − − 3) Пациент К., женщина, 1960 г.р. Лаборант КДЛ, стаж работы 30 лет. Переливания крови в анамнезе не было. Результаты исследования на наличие анти-ВГС в ИФТС при профилактических осмотрах 2006 г. - 2011 года представлены в таблице 8.15. Таблица 8.15 214 Результаты исследования в динамике наличия анти-ВГС в сыворотке крови пациентки К. в иммуноферментных тест-системах при профилактических осмотрах в 2006 г. - 2011 гг. Месяц и год исследования Анти-ВГС в ИФТС 07. 2006 Обнаружены анти-Core (КП 1,2) и анти-NS (КП 1,2) 11.2006 Не обнаружены 03.2007 Не обнаружены 06.2007 Обнаружены анти-Core (КП 1,5) 03.2011 Обнаружены анти-Core (КП 2,4) 04.2011 Обнаружены анти-Core (КП 2,8) и анти-NS (КП 1,35) Результаты исследования РНК ВГС в периферической крови в 2007 г. и в 2011 г. были отрицательными. В таблице 8.16 представлена динамика результатов биохимического исследования крови пациентки К. Таблица 8.16 Результаты биохимического исследования крови пациентки К. (* - превышение нормы). № Вид исследования Результат Значения п/п показателя 2006 2010 2011 низкие высокие 2 АСТ (ед/л) 16,16 21,0 158,29* 4,0 37,0 3 АЛТ (ед/л) 22,54 24,3 79,77* 6,0 41,0 4 Щелочная фосфатаза 162,0 96,0 238,6* 22,8* 25,49* 1,7 20,5 норма 5 Билирубин общий 20,6 (мкмоль/л) Две пробы сыворотки крови пациентки К. были исследована в ИФТС с раздельным определением антител к четырем антигенам ВГСМ, в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» («Mikrogen Diagnostik», Германия), в ЛИА «INNO-LIA HCV Ab III update», с.009 (ЛИА, «Innogenetics», Бельгия) и в иммуночипах; результаты представлены в таблице 8.17. Таблица 8.17 215 Результаты исследования в динамике сыворотки крови пациентки К. (2011 г.) на наличие антител к ВГС в ИФТС с раздельным определением антител к четырем антигенам ВГС («Эколаб С спектр»), в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0», в ЛИА «INNOLIA HCV Ab III update», с.009 и в иммуночипах № Вид Обнаружена реактивность к пептидам п/п исследования структурных Результат неструктурных антигенов ВГС антигенов ВГС ИФТС (общие антитела) Анти-Core отсутствуют (КП 2,4) (проба от 03.2011) 4 5 1 Иммуночипы, IgG (проба от 03.2011) Core-1b (2.9) Иммуночипы, IgM (проба от 03.2011) ИФТС Не обнаружена Не обнаружена – Core (КП=2,8) NS4 (КП=1,35) + Core отсутствует +/- Линейный С1 (+1), NS3 (+/-), + иммунный С2 (+/-) NS4 (+/-) NS3-3a (2,8), NS3-1b (7,2), + c100 (5,1), m5-1-1 -1b (10,4), NS5-3a (2,1), NS5-1b (2,4) (общие антитела) (проба от 04.2011) 2 Иммуноблот (IgG) (проба от 04.2011) 3 анализ (IgG) (проба от 04.2011) Таким образом, у пациентки К. после первого обнаружения в ИФТС анти-ВГС к Core-антигену и комплексу NS-антигенов ВГС в 2006 г. в течение года продолжался период серонегативности и нормальных биохимических показателей крови. Через год выявились только анти-Core с низким КП (1,5). В марте 2011 в ИФТС выявлялись антитела только к Core-антигену ВГС, а в той же замороженной пробе в иммуночипах выявлялись антитела к каждому из четырех пептидов ВГС. В апреле 2011 г. в ИФТС выявились анти-ВГС к Core- и 216 NS4- антигенам ВГС (при противоречивых результатах исследования в ИБ и ЛИА) и произошло повышение уровня ферментов, свидетельствующих о нарушении работы печени. Таким образом, в иммуночипах выявление антител, направленных к нескольким антигенам ВГС, наблюдалось, как минимум, на 1 месяц ранее, чем в остальных использованных тестсистемах. 4) Врач Г. в 2010 г. отделения гематологии укололся иглой шприца с кровью больного, содержащей анти-ВГС и не содержащей РНК вируса. Через 2 недели сыворотка крови Г. была исследована в ИФТС, и в ней были обнаружены анти-NS4 с КП 5,6. При повторном исследовании через 2 месяца сыворотка крови Г. была реактивна в ИФТС только к анти-NS4, а в иммуночипах – только к c-100 (таблица 8.14). Результат исследования был признан неопределенным как в ИФТС, так и в иммуночипах. Результат исследования в ИБ был отрицательным. Биохимические показатели крови в норме, РНК ВГС не обнаружена. Таким образом, в иммуночипах была обнаружена реактивность сыворотки крови Г. только к с-100 пептиду (участку NS4 протеина ВГС), то есть расширения спектра антител к ВГС по сравнению с ИФТС не было, ответ исследования материала на наличие анти-ВГС был также неопределенным, что позволяет более обоснованным сделать заключение о ложной позитивности (неспецифической реактивности) сыворотки крови Г. 5) Пациент М., мужчина, 20 лет, состоял на учете как больной ХГС (проба №1071 в таблице 5.4, таблице 8-14). При исследовании сыворотки крови М. в двух ИФТС с раздельным выявлением анти-Core и антител к комплексу неструктурных антигенов в ИФТС «РекомбиБест анти–ВГС подтверждающий тест» были обнаружены анти-Core с КП=1,6, а также анти-NS с КП=2,4; в «РекомбиБест анти–ВГС подтверждающий тест-спектр» были обнаружены анти-Core (КП=1,64), NS3 (КП=1,56), NS4 (КП=1,84), NS5 (КП=1,76). В ИФТС другого производителя «ИФА-анти-HCV-спектр-GM» были обнаружены только анти-NS3 (КП=2,83). При исследовании авидности антител было обнаружено, что антитела к ВГС пациента М. являются низкоавидными. При референсном тестировании в ЛИА «INNO-LIA HCV Ab III update» обнаружена неспецифическая реакция на стрептавидин, а в ИБ «RecomBlot HCV IgG 2.0» не было обнаружено реактивности пробы ни к одному антигену ВГС, результат в ИБ отрицательный. При исследовании в иммуночипах пробы, хранящейся при −24°С, были получены результаты, представленные в таблице 8.14, которые свидетельствуют о наличии реактивности сыворотки крови М. к спектру антигенов ВГС (Core, NS3, NS4, NS5). 217 В представленном исследовании иммуночипы были использованы для уточнения серодиагностики ВГС-инфекции в случаях выявления в ИФТС антител только к одному антигену ВГС. Белок Core является одним из наиболее иммуногенных антигенов ВГС [Л. И. Николаева, 2006], однако причиной низкой позитивной ОП по анти-Core в ИФТС может быть неспецифическая реактивность сыворотки [Leñn P. et al., 1998], обусловленная, в том числе, конструктивными особенностями тест-систем, молекулярной мимикрией между антигенными структурами вируса и эпитопами клеток хозяина, в частности теми, которые были вскрыты посредством аутоиммунного мепханизма [Zhang Z.X. et al., 1994; Quiroga J.A. et al., 1996; Quiroga J.A. et al., 2007] и проч. Противоречия при выявлении анти-Core в различных ТС для ИФА также возникают (как в ИФТС планшетного формата, так и в иммуноблотах) при небольших количествах действительно содержащихся в крови антител. Реактивность к единственному антигену Core, по-видимому, отражает предшествующий контакт организма человека с вирусом, но редко активную инфекцию, как острую, так и хроническую [Leñn P. et al., 1998]. В последнее время все большее внимание исследователи уделяют возможностям диагностики скрытой ВГС-инфекции (так называемой серологически молчащей: РНК- и анти-ВГС-негативной, иногда с повышенным уровнем трансаминаз, с выявлением РНК в гепатоцитах при биопсии печени) по реактивности к перекрестным антигенам и именно к к иммунодоминантным эпитопам Core-белка, которые обнаруживаются при проведении динамических исследований [Quiroga J.A. et al., 2009; Quiroga J.A. et al., 2007]. Из представленных выше данных литературы очевидно, что высокая значимость выявления анти-Core ВГС неизбежно требует повышения чувствительности диагностических тест-систем. При обсуждении результатов, полученных в нашей работе с использованием иммуночипов, следует отметить, что были изучены образцы сыворотки крови с факторами риска ложной позитивности: величина КП пробы в скрининге была низкой, а в подтверждающих ИФТС обнаруживалась невысокая реактивность только к Core-антигену. Ранее нами было показано, что пробы с КП по анти-Core менее 2-2,5 целесообразно исследовать дополнительно, поскольку в разных ИФТС и в ИБ результаты исследования могут быть противоречивыми [Потапова А.А. и др., 2008]. Реактивность к анти-Core ВГС была обнаружена во всех 16 образцах, но результат исследования зависел от концентрации данных антител (что отражалось на интенсивности окрашивания соответствующей антигенной полосы в ИБ), а также от наличия дополнительно выявленных маркеров ВГСинфекции (обнаружены в ИБ только в одном образце). Как следствие, в ИБ результаты 218 исследования следовало интерпретировать как позитивные в двух образцах (12,5%), как неопределенные в 9 образцах (56,25%), как отрицательные – в 5 образцах (31,25%). В иммуночипах в 12 из 16 образцов (76,9%) были выявлены анти-Core класса G. В четырех образцах в иммуночипе анти-Core не были обнаружены, причем в трех из них (№п/п 2, 3 и 5) в ИБ степень окрашивания полосы с Core-антигеном также соответствовала отрицательному результату тестирования. Однако вследствие выявления в иммуночипах в данных пробах антител к различным неструктурным антигенам ВГС результат исследования был неопределенным или положительным. Антитела к неструктурным антигенам ВГС при исследовании в иммуночипах были выявлены в 15 из 16 проб (93,8%), причем в 4 пробах (25%) были выявлены антитела, направленные к одному неструктурному антигену, в 8 пробах (50%) – антитела к двум неструктурным антигенам, в 4 (25%) – к трем неструктурным антигенам. Таким образом, в иммуночипах, в отличие от скрининговых и верификационных ИФА тест-систем и ИБ, наблюдался высокий процент определения антител к неструктурным антигенам, что позволило некоторые образцы сыворотки крови признать положительными по содержанию анти-ВГС. Таким образом, тест-системы в формате иммуночипа позволяют успешно проводить верификацию результатов тестирования на наличие анти-ВГС класса G образцов с низким содержанием антител, в частности к Соre. Обнаружение с помощью иммуночипа в 6 из 16 образцов (37,5%) антител, относящихся к IgM, требует проведения дополнительных исследований c целью подтверждения диагностических возможностей иммуночипов по выявлению среди пациентов с низкими значениями позитивности анти-Core больных с активной ВГС-инфекцией. Примером проявления скрытой ВГС-инфекции является клиническое наблюдение пациентки К. Транзиторная серопозитивность, отсутствие РНК в сыворотке крови и длительный период биохимического благополучия завершился выявлением анти-Core в ИФТС и в той же пробе в иммуночипах – спектра антител, направленных к нескольким антигенам ВГС. Выявление антител к структурному антигену и только к одному из неструктурных антигенов ВГС произошло только через месяц, при одновременном увеличении уровня ферментов АСТ и АЛТ, свидетельствующих о развитии патологическом процессе в печени. Учитывая вывод Quiroga J.A. с соавторами о том, что у пациентов со скрытой ВГСинфекцией, позитивных на наличие IgG анти-Core, чаще обнаруживалось некротическое воспаление печени и РНК ВГС- позитивные гепатоциты, чем у IgG анти-Core-негативных пациентов [Quiroga J.A. et al., 2009], а также наши данные о повышенной концентрации АФП и о выявлении в иммуночипах расширенного спектра антител к ВГС у пациентов, в 219 сыворотке которых в ИФА обнаруживались только анти-Core ВГС, можно сделать вывод о том, что тестирование в иммуночипах IgG и IgM анти-Core может быть полезным при диагностике скрытой ВГС-инфекции у пациентов, в сыворотке крови которых не содержится РНК ВГС и анти-ВГС, а также при наблюдении за пациентами с анти-ВГС негативной инфекцией. Кроме Core-протеина ВГС, одними из наиболее иммуногенных для Т- и Влимфоцитов являются антигены неструктурного протеина NS3 ВГС. Примерно в половине случаев при обследовании доноров крови с неопределенным в ИБ результатом тестирования анти-ВГС обнаруживались сенсибилизированные в основном антигеном NS3 Т-лимфоциты, что позволило авторам исследования сделать вывод о контакте иммунной системы данных доноров с вирусом в прошлом [Hitziger T. et al., 2009]. Динамика появления анти-NS3 после инфицирования (одновременно с антителами к Core антигену или ранее) [Николаева Л.И.б 2006] свидетельствует о том, что наличие анти-NS3 является надежным маркером начала инфекционного процесса. В нашей работе в части образцов с анти-NS3 (в том числе с отрицательным результатом исследования в ИБ) в иммуночипах был выявлен IgM – маркер острого инфекционного процесса или фазы реактивации хронического заболевания. Cреди образцов с неопределенным результатом исследования в ИФА (вследствие выявления только анти-NS3) в иммуночипах количество позитивных образцов было в 4 раза выше, чем в ИБ; ни одного образца в иммуночипах не было определено как не содержащего анти-ВГС. Полученные нами при использовании иммуночипов результаты об истинной позитивности образцов с анти-NS3 (даже при низком КП) согласуются с косвенным указанием на патофизиологический процесс при выявлении только данного маркера, а именно с увеличением сывороточной концентрации α-фетопротеина, что характерно для процессов, связанных с повреждением и регенерацией печени. С нашей точки зрения, обнаружение в ИФА низких концентраций анти-NS3, даже при признании проб в ИБ антиВГС-негативными, является основанием для расширенного обследования пациентов, включающего серологическое исследование с помощью иммуночипов. При обсуждении верификационных возможностей иммуночипов в случаях низкой позитивной оптической плотности антител к NS4-антигену ВГС важно отметить следующее. При длительном наблюдении за потенциальными донорами с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в ИБ RIBA с целью определения динамики изменений (в сторону отчетливо положительного или отрицательного результата) или ее отсутствия, в многочисленных случаях сочетание положительного результата в ИФА и неопределенного результата в RIBA сохранялось в течение нескольких лет, что вызвало у авторов исследования сомнения в правомерности интерпретации результатов RIBA как 220 неопределенных. Для решения проблемы интерпретации неопределенных результатов и определения статуса донора Piro L. с соавт., с одной стороны, предлагают использовать технологию амплификации нуклеиновой кислоты для прямой оценки инфекционности крови, с другой стороны, оценивать направленность антител, обнаруженных в ИФА [Piro L. et al., 2008]. Наиболее устойчивыми маркерами острой, хронической или завершившейся выздоровлением ВГС-инфекции, по мнению многих исследователей, являются антитела к Core или к NS3 белкам ВГС (соответственно к антигенным группам C22 и C33c в RIBA и в других тестах) [Николаева Л.И., 2006]. Реактивность сыворотки крови только к белку NS4 (антигену C100) считается менее достоверным маркером, чем реактивность к C33c и C22, и часто расценивается как неспецифическая [Lemaire J.M. et al., 2000]. В нашем исследовании из 31 пробы, в которых в ИФТС обнаруживались только анти-NS4 и в соответствии с правилами интерпретации результат исследования был неопределенным, в иммуночипах 26 проб (83,9%) были признаны анти-ВГС позитивными вследствие выявления антител класса G, направленных к нескольким антигенам ВГС. Отсутствие позитивного результата в иммуночипах в контрольной группе: пробах, анти-ВГС-отрицательных также и в ИФТС, − свидетельствует, с нашей точки зрения, об отсутствии ложной позитивности в отобранных нами пробах. По-видимому, отрицательные результаты, полученные в ИБ в группе опытных образцов с низким КП анти-NS4, в ряде случаев (например, при длительном сохранении у пациента такого сочетания результатов анализа) следует оценивать критически, поскольку в подобных случаях в иммуночипах в нашем исследовании было подтверждено наличие антител класса G, направленных не только к NS4, но и к другим антигенам ВГС. Более того, позитивность двух (из 31) опытных образцов по анти-ВГС класса M − маркерам активной инфекции, возможно, указывает на необходимость дополнительного референсного исследования образцов с неопределенным результатом исследования в ИФТС. Наши результаты, свидетельствующие о возможности наличия активного гепатита С при обнаружении в ИФТС только небольшого количества анти-NS4, совпадают с результатами, полученными при выявлении РНК вируса гепатита С у доноров крови, в крови которых обнаруживались только анти-NS4 [Малышев B.C. и др., 2000] . По нашим данным, при массовом скрининге населения на наличие антител к ВГС чрезвычайно редко встречаются пробы сыворотки крови, содержащие только антитела к белкам, кодированным зоной NS5. По мнению других исследователей, значимость выявления анти-NS5 как единственных антител к ВГС различается в группах пациентов с разным риском гемоконтактного инфицирования [Cavazza S., Lagging M., 2005]. В нашей работе из двух случаев изолированного выявления анти-NS5 у пожилых лиц в одном случае 221 в иммуночипах было подтверждено наличие антител к другим антигенам ВГС, во втором случае реакция в ИФА была признана неспецифической. При обсуждении результатов исследования образцов крови пациентов с отчасти известным анамнезом можно отметить следующее. Результаты исследования проб пациентов Ю. и Т. в иммуночипах (обнаружены анти-ВГС класса G и не обнаружены антитела класса M) характерны для (само)излеченной инфекции. В то же время при оценке результатов серологического исследования нельзя не учитывать появившиеся в последнее время данные о существовании «скрытого» или «оккультного» гепатита С с различными его вариантами; например, с выявлением РНК ВГС в ткани печени и периферических мононуклеарных клетках при отсутствии в крови анти-ВГС и РНК ВГС, или с наличием вирусспецифического клеточного ответа CD4+ и CD8+ T-клеток на 6 пептидов ВГС, относящихся к неструктурным протеинам NS3, NS4 и NS5, с продукцией медиаторов с антивирусной активностью и с выявлением РНК ВГС в виде «+» или «–» (репликативной) цепи в мононуклеарах крови [Roque-Cuellar M.C. et al., 2011]. В нашей работе у пациентки К. (лаборанта поликлинической лаборатории) с 2006 по 2010 г., по-видимому, длился период скрытого гепатита С, только в 2011 г. проявившегося устойчивой серопозитивностью и изменением уровня АЛТ и АСТ. В то же время в крови, взятой в 2010 г., в иммуночипах были обнаружены антитела к четырем антигенам ВГС-инфекции. По поводу неспецифической реакции пациента М. можно заметить, что чувствительность метода ИБ заметно страдает из-за эндогенного биотина. Замена в иммуночипов биотина на флюоресцеин, а стрептавидин-пероксидазного комплекса на антитела против флюоресцеина, меченные пероксидазой хрена, полностью ликвидирует неспецифическое окрашивание. Чувствительность метода при этом не страдает, но специфичность возрастает многократно. По-видимому, часть результатов с реактивностью сыворотки крови к единственному антигену ВГС в ИФА (в том числе не только с постоянной, но и с транзиторной реактивностью) обусловлена скрытой ВГС-инфекцией. Таким образом, полученные результаты подтверждают эффективность иммуночипов для верификации наличия анти-ВГС в сыворотке крови со слабой реактивностью к структурному и анти-NS4 в ИФТС и в ИБ, которая обусловлена расширением в иммуночипах спектра выявляемых в данном образце антител с возможностью одновременного выявления IgG и IgM. В целом, проявившиеся в нашем исследовании такие качества иммуночипов, как: совмещение иммуноблотов; высокой чувствительности планшетных ИФТС со специфичностью 222 потребность в небольшом количестве материала для исследжования (не более 30 мкл на весь анализ); расширение спектра выявляемых антител по сравнению с иммублотом и ИФА; возможность выявления не только паст-инфекции, но и активной ВГС-инфекции по наличию IgM; возможность за одну постановку судить о наличии спектра антител разных классов – IgM и IgG, благодаря раздельной флуоресцентной детекции результатов, – доказывают перспективность нового вида препаратов молекулярной диагностики – иммуночипов – для доказательства наличия антител в пробах с неопределенным результатом исследования в ИФА и в ИБ, а также для выявления людей со «скрытым» гепатитом С. 223 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Обобщая результаты представленной работы, можно сделать следующее заключение. Выявление антител к ВГС в качестве метода первичного скрининга на маркеры гепатита С в настоящее время связано с проблемами, обусловленными 1)особенностями морфологии и биологии вируса; 2)особенностями гуморального иммунного ответа на антигены вируса и иными (в частности, биохимическими) реакциями организма хозяина на заражение; 3)гетерогенностью обследуемых контингентов; 4)ограничениями диагностических возможностей используемых препаратов. Средний уровень распространения анти-ВГС среди всех пациентов ЛПУ г.Москвы в 2000-2011 гг. последовательно снижался с 7,34% до 4,44%. При снижении распространения маркеров гепатита С в контингенте лиц с неустановленными факторами риска заражения этот уровень оставался достаточно высоким (6,19% в 2000 г. и 3,93% в 2011 г.), что обуславливает необходимость выявлять эти факторы, возможно, путем предварительного обсуждения и документирования (анкетирования) в ЛПУ, направляющих пробы на исследование в скрининговую лабораторию. Особенно необходима информация в отношении детей, рожденных ВГС-инфицированными матерями, для представления динамики выявления антиВГС. Подобная идентификация факторов риска заражения ВГС будет способствовать оптимизации системы ранней диагностики гепатита С при массовом скрининге анти-ВГС. Среди медицинского персонала, который по роду своей деятельности имеет контакты с кровью, по нашим данным, частота распространения анти-ВГС в Москве меняется волнообразно; максимальный пик наблюдался в начальный период обследования (в 2000 г. – 4,78%), с минимальным уровнем в 2008 г. (1,64%), с увеличением к 2011 г. до 3,91%. Особое внимание к этому контингенту обследуемых лиц обусловлено наличием в нем лиц со скрытым ГС и периодическим обнаружением анти-ВГС при нормальных показателях активности печеночных ферментов. Рост инфицированности медработников Москвы «заставляет еще раз обратить внимание на качество и полноту проводимых в лечебных учреждениях профилактических мероприятий» [Шахгильдян И.В., 2000]. Результаты, полученные в нашей работе, свидетельствуют о том, что ложная положительность при тестировании анти-ВГС по-прежнему представляет проблему массового скрининга. Нами были разработаны критерии и алгоритм проведения дополнительных исследований с целью предотвращения сообщения ложноположительных результатов при массовом скрининге анти-ВГС. При оценке результатов и назначения дополнительных исследований необходимо учитывать принадлежность пациента к контингентам с возрастным дисбалансом иммунного ответа (преходящим у детей первого года жизни и постоянным у 224 пожилых лиц) и в силу этого сниженной специфичностью антител. В пробах сыворотки крови пожилых людей с ложной позитивностью не было отмечено увеличения концентрации иммуноглобулинов и патологических продуктов иммунной системы, которые способны маскировать наличие антител (РФ и ЦИК); ложная позитивность в использованных нами диагностических наборах российского производства не вызывалась повышенной концентрацией этих сывороточных компонентов и парапротеинов. По-видимому, в основе ложнопозитивных реакций взаимодействия антител сыворотки с сорбированными антигенами лежали как дефекты антител, так и дефекты сорбированных на планшетах антигенов. Так, наличие ассоциации ложнопозитивных реакций сыворотки пожилых людей с повышенной концентрацией α1-глобулинов – белков, характерных для хронических воспалительных процессов различной этиологии (не ХГС), сопровождающихся в том числе появлением антител, перекрестно-реагирующих с антигенами ВГС, повидимому, могло привести к их взаимодействию с антигенными структурами ВГС, сорбированными на планшетах некоторых диагностических наборов. С другой стороны, количество ложнопозитивных реакций проб сыворотки крови беременных женщин, избирательно повышенное в некоторых использованных нами диагностических тест-системах, свидетельствует о зависимости результатов тестирования диагностических систем. этого контингента По-видимому, от дальнейшее конструктивных особенностей совершенствование первичной лабораторной диагностики ВГС-инфекции по наличию антител к вирусу требует повышения специфичности диагностических систем, особенно при исследовании сыворотки крови пациентов отдельных контингентов. Обязательность подтверждения наличия анти-ВГС в пробах сыворотки крови пациентов, позитивных в первичном скрининге, в диагностических наборах для ИФА с раздельным выявлением антител к структурному (Core) антигену и комплексу неструктурных антигенов, безусловно, повысило качество выявления маркеров ГС – опасного социальнозначимого заболевания. Включение в скрининг для дополнительных исследований тест- систем для ИФА планшетного формата с расширенным спектром выявляемых антител, которые по сути являются недорогими аналогами иммуноблотов, как показали наши результаты, также способствует повышению качества исследований маркеров ГС. Чувствительность этих тест-систем выше, чем у иммуноблотов, что подтверждают результаты исследования «проблемных» проб в иммуночипах. По-видимому, неопределенный результат исследования наличия анти-ВГС в ИФТС планшетного формата, используемых в лабораториях, проводящих массовый скрининг, позволит ориентировать пациента и врача на проведение дальнейшего обследования и избежать как гипердиагностику, так и недооценку выявления низкого количества антител только к одному антигену ВГС. Разработанный для 225 условий скрининговой лаборатории алгоритм (в отсутствии референсных лабораторий, которые, например, в Москве оценивают результаты исследования в скрининге маркеров ВИЧинфекции) позволяет без существенного увеличения затрат минимизировать количество необходимых дополнительных исследований и обеспечить не только адекватность ответа полученным результатам, но и указать на границы диагностической значимости тестирования анти-ВГС. Использование метода ПЦР для верификации наличия ВГС-инфекции у людей с проблемами выявления антител, кроме отдельных контингентов пациентов с выраженным иммунодефицитным состоянием, эффективно только при некоторых условиях. А именно, РНК ВГС выявляется в части образцов сыворотки крови с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в ИФА, обусловленными выявлением антител только к NS3 антигену ВГС с КП более 3 (что сочетается с анти-ВГС-позитивностью пробы в ХИАМ). В пробах с неопределенными результатами исследования анти-ВГС вследствие определения в ИФА только анти-NS4 (и отрицательными результатами в ХИАМ) РНК ВГС (при чувствительности 50 МЕ/мл) не обнаруживается. При использовании ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени для исследования проб с неопределенными результатами тестирования анти-ВГС в ИФА и в ИБ, но позитивными в ИЧ по наличию специфических иммуноглобулинов класса М, в некоторых образцах наблюдалась типичная картина кривой накопления продуктов реакции в Real-time ПЦР, не выходящая, однако, на уровень cut off. Не исключено, что при использовании более чувствительных методов первичной экстракции РНК вируса (и значительно большем, чем 100 мкл, объема клинического материала) наличие генетического материала будет подтверждаться в большем количестве проб с неопределенными результатами исследования анти-ВГС в ИФА и в ИБ. Косвенным свидетельством заболевания при неопределенном результате исследования анти-ВГС является повышение концентрации АФП − биохимического маркера повреждения/репарации печени − у мужчин моложе 60 лет и у женщин в I триместре беременности. Существенно, что этот сдвиг, характерный для развития патологических процессов в печени, наблюдался только при выявлении антител к Core- или NS3-антигену ВГС. Выявлявшиеся антитела были как высоко-, так и низкоавидными, то есть относились к ранним и к более поздним стадиям гуморального иммунного ответа, а также, возможно, были остаточными при выздоровлении от инфекции. Таким образом, наличие воспаления/репарации печени, которое проявляется, среди прочих признаков, в увеличении концентрации АФП у пациентов с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в ИФА (и при этом с возможным отрицательным результатом в ИБ) может 226 свидетельствовать, повидимому, о наличии скрытой ВГС-инфекции. Полученные нами данные указывают на эпидемиологическую близость контингента молодых людей с неопределенными результатами исследования анти-ВГС к ВГС-инфицированным пациентам. Отклонения от границ нормы концентрации АФП в группе пожилых людей без маркеров ВГС-инфекции не позволили сравнить по этому показателю группы с позитивным, негативным и неопределенным результатом исследования анти-ВГС. Таким образом, повышение сывороточной концентрации АФП подтверждает наличие заболевания печени у людей с выявлением низкого количества антител к Core или NS3 антигенам ВГС и может служить дополнительным биохимическим маркером инфицирования с учетом возрастной категории пациента. При выявлении антител у людей моложе 60 лет только к антигену NS4 (при массовом скрининге анти-NS4 составля.т около 80% всех случаев выявления антител только к одному антигену ВГС) концентрация АФП находилась в пределах нормы, что вновь поставило вопрос о неспецифичности этого маркера при его изолированном выявлении. Для решения вопроса о верификации в спорных случаях наличия этих и других антител к ВГС мы использовали новый метод – иммуночипы. При исследовании в иммуночипах была, во-первых, показана их высокая специфичность. Во-вторых, в части образцов с неопределенными результатами в ИФ и в ИБ при исследовании в иммуночипах было подтверждено наличие антител класса G, направленных не только к NS4, но и к другим антигенам ВГС, а также антител класса M − маркеров активной инфекции. Аналогичные результаты были получены при исследовании в иммуночипах проб с антителами, направленными к другим антигенам ВГС. Способность иммуночипов выявлять скрытую ВГС-инфекцию, клинически проявшуюся через годы периодического появления и исчезновения анти-ВГС в ИФА при постоянном отсутствии РНК ВГС, была подтверждена при исследовании проб сыворотки, в которых не обнаруживались анти-ВГС в ИФА и ИБ. Таким образом, использование иммуночипов способствует улучшению выявления антиВГС и снижает возможность ложноотрицательных результатов. 227 ВЫВОДЫ 1. Установлено увеличение распространения антител к ВГС среди медработников г.Москвы (с 1,64% до 3,92%) и среди пациентов с хроническими заболеваниями печени (с 1,72% до 4,04%) за период с 2008 г. по 2011 г. Относительно устойчивое снижение количества показателя в период с 2000 по 2011 г.г. наблюдалось среди пациентов с высоким риском гемотрансмиссивного заражения (с 8,19% до 4,22%), беременных женщин (с 2,78% до 1,31%), пациентов МНПЦДК (с 9,63% до 3,69%), пациентов ЛПУ г.Москвы без выявленного риска заражения (с 6,19% до 3,93%). 2. Для оценки воспроизводимости результатов массового скрининга населения на наличие антител к ВГС методом ИФА при проведении внутрилабораторного контроля качества исследований следует использовать контрольный материал промышленного производства (CV менее19%), а для оценки сходимости может быть использован контрольный материал, самостоятельно приготовленный в лаборатории, не подвергшийся замораживанию и оттаиванию (CV менее 10%). Показатели внутрилабораторного контроля качества исследований сопоставимы при ручном, автоматическом и полуавтоматическом режимах проведения ИФА. 3. Разработанные критерии отбора проб ограничивают количество верифицирующих тестов, необходимых для исключения ложнопозитивных результатов. При использовании диагностических систем для ИФА разных производителей следует отбирать пробы с коэффициентом позитивности анти-Core менее 2, с коэффициентом позитивности анти-NS менее 3. При использовании диагностических систем для ИФА одного производителя показана необходимость периодического перерасчета критериев отбора. 4. Алгоритм дополнительного исследования проб сыворотки крови с неоднозначными результатами определения антител к ВГС разработан в двух вариантах: 1) полном − с использованием диагностических систем нескольких производителей и иммуноблота, и 2) упрощенном − с использованием российского производства, только планшетных иммуноферментных тест-систем которые являются недорогим аналогом иммуноблота. Упрощенный вариант алгоритма при экономической доступности обеспечивает необходимые врачу и пациенту достоверность и информативность результатов. 228 5. Высокая частота ложноположительных результатов при скрининге на антитела к ВГС наблюдается среди лиц с физиологическим иммунодефицитом (дети первого года жизни и лица старше 60 лет). Низкие значения позитивности по анти-ВГС пациентов с заболеваниями печени и пациентов наркодиспансеров соответствуют истинному наличию у них антител к ВГС. 6. В группе лиц старше 60 лет маркером истинной позитивности при исследовании антиВГС является повышенное содержание ЦИК в сыворотке крови, а маркером ложной позитивности − повышенное содержание α1-фракции сывороточных белков. 7. Концентрация α-фетопротеина увеличена у мужчин моложе 60 лет (в 2,9 раза) и женщин в первом триместре беременности (в 2,6 раза) с антителами к ВГС. При неопределенных результатах исследования анти-ВГС концентрация АФП в данных группах увеличена соответственно в 1,7 и 1,95 раза. Увеличение концентрации АФП характерно для проб с антителами к Core или к NS3, но не к NS4 антигенам ВГС. 8. РНК ВГС выявляется в пробах сыворотки крови пациентов с неопределенными результатами исследования анти-ВГС вследствие обнаружения только анти-NS3. В пробах сыворотки крови пациентов с реактивностью антител только к NS4 антигену ВГС при чувствительности метода ПЦР 50 МЕ/мл РНК ВГС не выявляется. 9. Метод иммуночипов позволяет верифицировать наличие антител к ВГС в 80% проб с неопределенными результатами исследования в ИФА, и в 50% проб, признанных в иммуноблотах не содержащими антитела к ВГС. В иммуночипах в данных пробах обнаруживаются антитела, направленные не к одному, а к нескольким антигенам ВГС, относящиеся и к IgM, и к IgG. Дополнение скрининга в ИФА исследованием в иммуночипе способствует выявлению так называемого скрытого гепатита С. 229 Практические рекомендации 1) Алгоритм массового скрининга анти-ВГС и количество исследуемых проб на каждом его этапе. 1. 100% проб – скрининг в ИФТС с общим определением анти-ВГС (первичное исследование) 2. 7% проб, положительных в первичном скрининге, исследуются в подтверждающей ИФТС с определением анти -Core и антител к комплексу антигенов NS (подтверждаются как анти-ВГС-положительные только 5% проб от общего количества проб в первичном скрининге) 3. 10% проб, положительных в подтверждающей ИФТС (0,5% из общего скрининга), которые являются низкопозитивными* (КП анти-Core<2, или КП анти-NS <4), исследуются в ИФТС с определением спектра антител к ВГС** 4. Пробы с противоречивыми результатами в подтверждающих ИФТС исследуются в ИБ (0,1% проб из общего скрининга)*** Примечания. * Границы выборки в дополнительное исследование периодически рассчитываются. ** Дополнительные исследования необходимы при исследовании лиц из контингентов массового скрининга с физиологическим иммунным дисбалансом (детей первого года жизни и лиц старше 60 лет) и беременных женщин. *** При неопределенном результате исследования в ИФТС «спектр» этот этап не требуется. 230 2) Расширенное направление на повторное исследование антител к вирусу гепатита С (ВГС) при неопределенном результате предыдущего исследования и/или при наличии факторов риска заражения ВГС у впервые обследуемого пациента ЛПУ, направившее на исследование……………………………………. ФИО……………………………………………………………………….. Пол ………………………..Дата рождения …………………………… Предполагаемый диагноз…………………………………………. парентеральные вирусные гепатиты в анамнезе: да, точная информация о принадлежности к группе с определенным риском нет, нет сведений, инфицирования: группа………………………………………, не относится сведения о гемотрансфузиях: да, нет, нет сведений, принадлежность к медицинскому персоналу (в т.ч. в прошлом): да, биохимические показатели крови: АЛТ ………………АСТ ……………………..АФП…………………….. потребление в прошлом наркотических препаратов: да, татуировки: да, нет, отказ* , пребывание в заключении: да, более чем 15 половых партнеров за жизнь: да, нет, нет, нет, отказ* отказ*, отказ* Для детей первого года жизни дополнительно: наличие ВГС-инфекции у матери: да, нет, При повторном исследовании дополнительно: № и дата исследования. предыдущие результаты определения анти-ВГС (КП антител к каждому антигену ВГС) *Примечание: Отказ отвечать на вопрос нет сведений нет 231 3) Некоторые методы и способы преодоления ложных результатов при массовом скрининге антител к ВГС. № 1 2 3 4 5 6 Методы и способы достижения достоверного результата Дополнительно исследовать пробы с низкими КП антител к Core (КП менее 2) и комплексу NS (КП менее3) антигенов ВГС* Использовать диагностические системы для ИФА нескольких производителей для проб с низкими КП Преимущества и недостатки использования Следующее действие Определение границы КП для дополнительного См. пункты 2, 3, 4, 5 тестирования проб минимизирует их количество и обеспечивает качество исследований Позволяют результата избежать ложнопозитивного При противоречивости исследований использовать иммуноблоты или ИФТС планшетного формата с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенами ВГС Позволяют избежать ложной позитивности и В массовом скрининге может быть ложной негативности при использовании окончательным; критериев неопределенного результата дополнительно могут использоваться иммуноблоты или иммуночипы Диагностические системы для ИФА планшетного формата с раздельным определением антител к Core, NS3, NS4, NS5 антигенам ВГС Иммуноблоты Вследствие относительно низкой чувствительности следует критически оценивать отрицательные результаты при наличии изолированной реактивности к Core или к NS3 антигенам ВГС Иммуночипы Верифицируют наличие анти-ВГС в пробах с неопределенным результатом в ИФА, поскольку в них выявляется более широкий спектр антител, относящихся как к IgG, так и к IgM ПЦР При чувствительности 50 МЕ/мл позволяет выявить РНК ВГС в образцах с анти-NS3, но не с анти-NS4 Иммуночипы ПЦР Возможно, использование метода ПЦР с большей аналитической чувствительностью 232 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ: антиген АЛТ: аланинаминотрансфераза Анти-Core: антитела к Core- антигену вируса гепатита С Анти-NS: антитела к комплексу NS - антигенов вируса гепатита С Анти-NS3: антитела к NS3 - антигену вируса гепатита С Анти-NS4: антитела к NS4 - антигену вируса гепатита С Анти-NS5: антитела к NS3 - антигену вируса гепатита С Анти-ВГС: антитела к вирусу гепатита С АСТ: аспартатаминотрансфераза АТ: антитело АФП: α-фетопротеин ВБ: иммуноферментные диагностикумы планшетного формата производства НПО «ВекторБест» (Новосибирск) ВГС: вирус гепатита С ВЛКК: внутрилабораторный контроль качества ГГТ: гаммаглютамилтрансфераза (транспептидаза) ГС: гепатит С ГЦК: гепатоцеллюлярная карцинома ГЭ/мл: геномные эквиваленты в мл (оценка результата ПЦР) ДИ: доверительный интервал ДС: иммуноферментные диагностикумы планшетного формата производства НПО «Диагностические системы» (Н.Новгород) ИБ: иммуноблот ИА: индекс авидности ИФА: иммуноферментный анализ ИФТС: иммуноферментная (-ые) тест-система (-ы) КИЛ: клинико-иммунологическая лаборатория КП: коэффициент позитивности ЛИА: линейный иммунный анализ МНПЦДК ДЗМ: Московский научно-практический косметологии Департамента здравоохранения г. Москвы ЛПУ: лечебно-профилактические учреждения Центр дерматовенерологии и 233 МЕ: международные единицы ОГС : острый гепатит С ОП: оптическая плотность ПЦР: полимеразная цепная реакция РНК: рибонуклеиновая кислота РФ: ревматоидный фактор СРБ: С-реактивный белок УЕ: условная единица ХВГНЭ: хронический вирусный гепатит неясной этиологии ХГС: хронический гепатит С ХИАМ: хемилюминесцентный иммунный анализ на микрочастицах ЦИК: циркулирующие иммунные комплексы ЭДТА: этилендиаминтетрауксусная кислота AMA: антимитохондриальные антитела ANA: антиядерные антитела CDC: (Centers for Disease Control and Prevention) Центр по контролю заболеваний (США) Core: белок ядра вируса гепатита С Ig: иммуноглобулины LKM: антитела к микросомам печени и почек M±m: среднее с ошибкой определения среднего NS: неструктурный белок вируса гепатита С S/CO: (Sample/ Cut off) отношение оптической плотности образца к критической оптической плотности SMA: антитела к гладкой мускулатуре 234 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Методические указания по осуществлению контроля качества гематологических исследований: приказ Минздрава СССР №545 от 23 апреля 1985 г. [Электронный ресурс]. − Режим доступа: http://www.webapteka.ru/phdocs/doc6373.html. (Дата обращения 26. 02. 2015). 2. О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека: приказ МЗ РФ №384 от 30.10.2000 г [Электронный ресурс]. − Режим доступа: http://www.referent.ru/1/72470?l0 (дата обращения 26. 02. 2015). 3. О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека: приказ МЗ РФ №322 от 21.10.2002 г [Электронный ресурс]. − Режим доступа: http://docs.cntd.ru/document/901832500 (дата обращения 10. 07. 2015). 4. О совершенствовании пренатальной диагностики в профилактике наследственных и врожденных заболеваний у детей: приказ МЗ РФ №457 от 28.12.2000 г. Режим доступа: gosuslugi.ru›Обычная версия›srfile/19157004 (Дата обращения 8.03. 2015). 5. Об утверждении отраслевого стандарта "Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов»: приказ Минздрава РФ №220 от 26.05.2003. [Электронный ресурс]. − Режим доступа: http://gepatit-c.ru/laws/pr_mzrfn322-21-10-2002.html. (Дата обращения 26. 02. 2015). 6. Об утверждении перечня социально-значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих: постановление Правительства Российской Федерации от 1 декабря 2004 г. №715 // Российская газета. – 7 декабря 2004 г. – Федеральный выпуск № 3648. 7. О мерах по совершенствованию эпиднадзора за вирусными гепатитами в городе Москве: приказ Управления Роспотребнадзора по г. Москве от 01 октября 2008 года №122 [Электронный ресурс]. − Режим доступа: http://www.bestpravo.ru/moskva/hj- praktika/t3k.htm. (Дата обращения 26. 02. 2015). 8. Об организации мероприятий по снижению заболеваемости вирусными гепатитами В и С: приказ Департамента Здравоохранения и Центра Госсанэпиднадзора г.Москвы от 235 29.05. 1996 г. №330/83 [Электронный ресурс]. − Режим доступа: http://www.lawmix.ru/medlaw/34156. (дата обращения 26. 02. 2015). 9. О совершенствовании медицинской помощи больным вирусными гепатитами: приказ Комитета здравоохранения гор.Москвы №283 от 06.07.2000 [Электронный ресурс]. − Режим доступа: http://www.lawmix.ru/search?searchSubmit. (Дата обращения 26. 02. 2015). 10. Анализ эпидемиологической заболеваниям (туберкулез, ситуации ИППП, по ВИЧ-инфекции гепатиты): и сопутствующим методические рекомендации Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации 20 сентября 2007 г. №6964-РХ. − Москва, 2007. − 84 с. 11. О взаимодействии территориальных органов и учреждений Роспотребнадзора с Референс-центром по мониторингу за вирусными гепатитами: письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 4 марта 2011 г. № 01/2390-1-32 [Электронный ресурс]. − Режим доступа: http://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/4092267/ (дата обращения 26. 02. 2015). 12. Предупреждение и борьба с социально- значимыми заболеваниями (2007 − 2012 годы): Федеральная программа 2007 г. [Электронный ресурс]. − Режим доступа: http://base.garant.ru/4184672/. (Дата обращения 26. 02. 2015). 13. ГОСТ Р 51352-99. Наборы реагентов для клинической лабораторной диагностики. Методы испытаний. − Москва: Госстандарт России, 1999. − 16 с. 14. ГОСТ Р 53133.3 – 2008. Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований. Часть 3. Описание материалов для контроля качества клинических лабораторных исследований. − Москва: Стандартинформ, 2009. − 23 с. 15. Абдулмеджидова, А.Г. Характеристика панели моноклональных антител к рекомбинантному белку NS3 вируса гепатита С / А.Г. Абдулмеджидова, О.В. Масалова, С.Н. Атанадзе и др. // Вопросы вирусологии. – 2002. – №1. – С.21-25. 16. Абелев, Г.И. 25 лет изучения a-фетопротеина / Г.И. Абелев // Онтогенез. – 1989. – Т.20 . – №6. – С.607-615. 17. Ариас, Ф. Беременность и роды высокого риска. Пер. с англ. / Ф.Ариас. – М.: Медицина, 1989. – 656 с. 18. Арсенин, С.Л. Лабораторная диагностика гепатита С / С.Л. Арсенин, В.Г. Минькова, Б.А.Никулин, А.А. Кишкун // Клин. лаб. диагност. – 2001. – №.2 . – С.34-36. 19. Байкова, И.Е. Хронические гепатиты: методические рекомендации / И.Е. Байкова, И.Г. Никитин, под ред. Сторожаков Г.И. – М., 2007. – 43 с. 236 20. Баранов, А.А. Диагностика и лечение хронических вирусных гепатитов B, C, D у детей: пособие для врачей / А.А Баранов, Б.С.Каганов, В.Ф. Учайкин и др. М., 2003. – 84 с. 21. Баранов, А.В. Взаимосвязь между уровнем РНК HCV и антител при хроническом гепатите С / А.В.Баранов, В.В. Малеев // Журнал микробиологии. – 2009. – №5. – С. 19-22. 22. Баширова, Д.К. Клинико-иммунологические особенности течения хронического вирусного гепатита C при HCV-моноинфекции и HCV+HIV-коинфекции / Д.К. Баширова, О.М. Романенко, И.М. Хаертынова, А.П. Цибулькин // Казанский медицинский журнал. – 2005. – Т. 86. – №2. – С. 142-149. 23. Бенсман, В.М. Облегченные способы статистического анализа в клинической медицине (с приложением компьютерной программы Романова А.Ю. на CD) / В.М. Бенсман. – Краснодар: изд-во КГМА, 2002. − 30 с. 24. Бобкова, М.Р. Применения контрольных образцов для внутрилабораторного контроля качества скринингового ИФА на наличие антител к ВИЧ: методические рекомендации / М.Р. Бобкова, Е.В. Буравцова, Т.В. Калашникова и др. – М., 2004. − 25 с. 25. Ведерников, В.Е. Два новых диагностических набора: «РеалБест РНК ВГС» и «РеалБест РНК ВГС-генотип» / В.Е. Ведерников, М.К. Иванов, А.В. Трухина и др. // «Вектор-Бест» . − 2009. − № 2 (52) . − C. 2-9. 26. Ведина, Л.А. Гепатит С и беременность: проблемы ложноположительных результатов исследования методом иммуноферментного анализа / Л.А Ведина, Э.В. Криницына, Н.Е. Казарина, О.Н. Ястребова // Мир вирусных гепатитов. − 2009. − №2. − С.18-19. 27. Гепатит С: консенсус 2002. Национальный институт здоровья США. 10-12 июня 2002 // Мир вирусных гепатитов. − 2002. − №7-8. − С. 2-15. 28. Даниленко, Е.Д. Маркеры парентеральных вирусных гепатитов среди беременных на территориях с разным уровнем заболеваемости / Е.Д. Даниленко, C.М. Казарян, О.А. Орлова и др. // Вирусные гепатиты − эпидемиология, лечение и профилактика: материалы VII Российской научно-практической конференции с международным участием. − М., 2007. − С. 99-100. 29. Дмитриев, Г.А. Сифилис. Дифференциальный клинико-лабораторный диагноз: пособие для специалистов / Г.А. Дмитриев, Н. В. Фриго − М.: Мед. кн., 2004. − 363 с. 30. Долгов, В.В. Лабораторная диагностика наружений обмена белка :учебное пособие / В.В. Долгов, О.П. Шевченко − М, 2002. − 68 с. 31. Дунаева, Н.В. Криоглобулинэмия и вирус гепатита С / Дунаева Н.В., Эсауленко Е.В. // Журнал инфектологии. − 2011. − Том 3, №2. − С. 15-20. 237 32. Дунаева, Н.В. Распространѐнность и факторы риска развития криоглобулинемии, ассоциированной с хроническим гепатитом / Н.В. Дунаева, Ю.А Неустроева, Т.А.Тихомирова и др. // Медицинская иммунология. − 2007. − Т. 9, №6. − С. 575-580. 33. Дьякова, И.П. Особенности клинической картины и лечения HCV-инфекции у пожилых: автореф.дис. … канд. мед.наук. / И.П. Дьякова. − М., 2005. − 26 с. 34. Евплова, И.А. Особенности серологической диагностики вирусного гепатита С при перинатальной передаче инфекции / И.А. Евплова, В.И. Ершов., Е.И. Ефимов, Н.Е. Сенягина // Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний. − Н.Новгород: НПО «Диагностические системы» − 2007. − №2-3. − С.7-8. 35. Евплова, И.А. Сравнительная клинико-эпидемиологическая характеристика детей с неопределенными результатами и больных хроническим гепатитом С / И.А. Евплова, Н.Е. Сенягина, В.И. Ершов // Медицинский альманах.− 2010.− №2 (11) .− С. 247-251. 36. Евплова, И.А. Характер и частота различной патологии у детей с «неопределенными результатами на антитела к вирусу гепатита С / И.А. Евплова, В.И. Ершов, Е.И. Ефимов и др. // Мир вирусных гепатитов. − 2009а.− №3.− С. 36-37. 37. Евплова, И.А. Эпидемиологическая и клинико-лабораторная характеристика детей с изолированными антителами к вирусу гепатита С/ И.А Евплова, В.И Ершов, Е.И Ефимов, Н.Е. Сенягина // Мир вирусных гепатитов.− 2009.− №3.− С. 35-36. 38. Ершова, О.Н. Характеристика современных эпидемиологических особенностей HCвирусной инфекции в Северном регионе России: автореф. дис….канд. мед. наук / О.Н. Ершова − М., 2009. − 29 стр. 39. Ильченко, Л.Ю. Вирус гепатита С и особенности течения ВГС-инфекции у онкогематологических больных / Л.Ю. Ильченко, Р.С. Осканова, Г.И. Сторожаков // Мир вирусных гепатитов.− 2010.− №2.− С.9-14. 40. Иноятова, Ф.И. Клинические особенности течения скрытого − «оккультного» гепатита у ВИЧ-инфицированных детей / Ф.И. Иноятова, Л.О. Нуритдинова // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии.− 2011.− Т.3.− №2.− С.78-83. 41. Исаева, О.В. Федеральная система внешнего контроля качества выявления HBsAg, анти-ВГС и РНК ВГС: 1996-2001 г. / Исаева О.В., Гущин А.Е., Малышев В.С. и др. // Гепатит В, С и D – проблемы диагностики, лечения и профилактики: тезисы ІΥ Российской научно-практической конференции. М., 2001.− С. 151-153. 42. Каира, А.Н. Контроль инфицированности вирусами гепатитов В и С доноров крови в Московской области / А.Н. Каира, Г.С. Фролова // Эпидемиология и инфекционные болезни. − 2002. − №3. − С. 31 −33. 238 43. Камышников, В.С. Карманный справочник врача по лабораторной диагностике: справочник / Камышников, В.С. − М.: Медпресс-информ., 2008.− 400 с. 44. Каримов, И.З. Изменение содержания С-реактивного белка и других белков острой фазы в крови больных вирусным гепатитом / И.З. Каримов, М.М Шавловский, П.Г. Назаров // Цитокины и воспаление.− 2004. − Т. 3.− № 4.− С. 42-46. 45. Качество клинических лабораторных исследований. Новые горизонты и ориентиры: сб. ст. и док. / под ред. В.И. Меньшикова − М., 2002. − 304 с. 46. Кишкун, А.А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике: практическое пособие / А.А. Кишкун. − М.: Медицинское информационное агентство, 2006.− 536 с. 47. Клиническое руководство по лабораторным тестам: пер. с англ. / под ред. Тиц Н.У. М.: Юнимед-пресс, 2003. 960 с. 48. Константинова, Н.А. Криоглобулины и патология / Н.А. Константинова. − М.: Медицина, 1999.− 176 с. 49. Короленко, Т.А. Возрастные изменения содержания цистатина С и С-реактивного белка у здоровых лиц / Т.А. Короленко, М.С. Черканова, Т.Г. Филатова, Ю.И. Бравве // Лабораторная диагностика. − СПб: Terra medica. − 2007.− № 1(13). − С.21-22. 50. Корыстов, Ю.Н. Физиология и репаративная регенерация тканей, основной фактор онтогенеза / Ю.Н. Корыстов // Успехи современной биологии. − 1994. − Т. 114. − Вып. 5. − С. 606-616. 51. Красавцев, Е.Л. Спектр антител к разным антигенам вируса у больных хроническим гепатитом С / Е.Л. Красавцев, С.В. Жаворонок, В.М. Мицура, А.П. Демчило // ЖМЭИ. − 2006.− №2. − С. 57-61. 52. Кругляк, С.П. Спектр антител к ВГС у лиц, употребляющих внутривенно психоактивные вещества [Электронный ресурс] / С.П. Кругляк, Ю.Н. Мартынченко // Новости Вектор-Бест.− 2005.− №1(35). URL: www.vector-best.ru/nvb/n35/st35_3.htm. (Дата обращения: 02.11.2013). 53. Кузина, Л.Е. Сравнительная оценка результатов определения антител к вирусу гепатита С при использовании различных иммуноферментных тест-систем и подтверждающих тестов / Л.Е. Кузина, О.Н. Ястребова, Н.В. Садикова и др. // Вопросы вирусологии.– 2004.–Т. 49. − №6. – С. 41-44. 54. Ланг, Т. Двадцать ошибок статистического анализа, которые вы сами можете обнаружить в биомедицинских статьях / Т. Ланг // Международный ж. мед. практ. − 2005. − №1.− С.21-31. 239 55. Мазус, И.А. Эпидемиологическая ситуация по ВИЧ-инфекции в городе Москве / И.А. Мазус, Г.Ю. Панкова, М.В. Лаврова // Здоровье столицы: тезисы докладов IX Московской ассамблеи . − Москва, 2010. − С. 136-137. 56. Майер, К.-П. Гепатит и последствия гепатита: практ. рук.: пер. с нем. / Майер, К.-П. − М.: Гэотар медицина, 1999. – 432 с. 57. Малышев, B.C. Выявление РНК вируса гепатита С у доноров крови / B.C. Малышев, А.Г. Тоневицкий, A.M. Ведяков и др. // Иммунопатология . − 2000.− № 2. − С. 75-79. 58. Масалова О.В. Вирусный гепатит С: новые подходы к изучению патогенеза и разработка средств диагностики и профилактики: дисс. …д-ра биол. наук / О.В. Масалова − М., 2011. − 336 с. 59. Маянский, А.Н. Вирусный гепатит С: информационные материалы НПО «Диагностические системы» / А.Н. Маянский, А.П. Обрядина, Т.И. Уланова и др. − Н.Новгород, 2003. − 47 с. 60. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы): справочник / под ред. А.И. Карпищенко. − СПб.: Интемедика, 2001 г. − 304 стр. 61. Медицинские лабораторные технологии. В 2 томах. Т.1: справочник / под ред. А.И. Карпищенко − СПб.: Интермедика, 1998.− 151 с. 62. Минков, И.П. Роль врожденных пороков развития в патологии детского возраста: автореф. дисс. … д-ра мед. наук / И.П. Минков − Киев, 1992 − 45 с. 63. Мицура, В.М. Выявление антител к NS5 белку вируса гепатита С (HCV) и антител к HCV класса IgM и их использование для прогноза эффективности и интерферонотерапии хронического гепатита С / В.М. Мицура, С.В Жаворонок, Е.Л. Красавцев, А.П. Демчило // Мир вирусных гепатитов. − 2009. − №3. − С. 16-17. 64. Молдогазиева, Н.Т. Альфа-фетопротеин и факторы роста. Структурно- функциональные взаимоотношения и аналогии / Молдогазиева Н.Т., Терентьев А.А. // Успехи биологической химии. − 2006. − Т.46. − С. 99-148. 65. Москалев, А.В. Латентные формы вирусных гепатитов В и С. Оптимизация диагностики / Москалев А.В., Астапенко П.В. // Новости «Вектор-Бест» − 2009. − №1 (51) − С. 7-12. 66. Мукомолова, А.Л. Значение измерения авидности антител класса IgG к отдельным белкам вируса гепатита С для диагностики различных форм инфекций: дисс. ……. канд. мед. наук / А.Л. Мукомолова. − СПб, 2004. − 149 с. 67. Нетесов, С.В. Проблемы создания вакцин против гепатитаС и ВИЧ-инфекции / С.В. Нетесов // Вестник Российской академии наук. − 2008. − Т. 78. − №10. − С.880-892. 240 68. Нетесова, И.Г. Проведение внутрилабораторного контроля качества неколичественных методов иммуноферментного анализа / И.Г. Нетесова, М.Р. Бобкова // Справочник заведующего КДЛ. − 2011. − №6. − С. 9-15. 69. Николаева, Л.И. Вирус гепатита С: антигены вируса и реакция на них иммунной системы макроорганизма: информационно-методическое пособие / Л.И. Николаева − Новосибирск: Вектор-Бест, 2009. − 78 с. 70. Николаева, Л.И. Исследование отличительных особенностей гуморального иммунитета при разных стадиях инфекции вирусом гепатита С / Л.И. Николаева, А.И. Арчаков, Н.П. Блохина и др. // Новости Вектор Бест. Вирусные гепатиты: дайджест. − Новосибирск: Вектор-Бест. − 2003a. − С. 42-47. 71. Николаева, Л.И. Расшифровка клинико-диагностической значимости серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита С / Николаева Л.И., Макашова В.В., Токмалаев А.К. // Мир вирусных гепатитов. − 2009. − №3. − С.20-21. 72. Николаева, Л.И. Специфический гуморальный иммунитет при вирусном гепатите С: дисс. ... д-ра биол. наук / Л.И. Николаева − М., 2006. − 260 с. 73. Николаева, Л.И. Титры вирус-специфических антител в разные фазы инфекции вирусом гепатита С / Л.И. Николаева // Новости Вектор Бест. Вирусные гепатиты: дайджест. − Новосибирск: Вектор-Бест. − 2003. − С.34-37. 74. Николаева, Л.И. Титры специфических антител в разные фазы гепатита C / Николаева, Л.И., Михайлов М.И., Блохина Н.П. и др.// Эпидемиология и инфекционные болезни. − 2004 – № 5. – С.37-42. 75. Окунев, Д.Ю. Справочник по клиническим лабораторным тестам / Д.Ю. Окунев. М.: Агат-Мед, 2001. — 192 с. 76. Ольшанский, А.Я. Лабораторное сопровождение высокоактивной антиретровирусной терапии ВИЧ-инфекции (ВААРТ) / Ольшанский А.Я., Дворкин С.А., Гейне М.Д., В.Н. Вдовина − Здоровье столицы: тезисы докладов IX Московской ассамблеи. − Москва, 2010. – С.139-141. 77. Онищенко, Г.Г. Вирусные гепатиты в Российской Федерации 2010: справочник / Г.Г. Онищенко, А.Б. Жебрун. – СПб.:НИИЭМ им. Пастера, 2010.– 204 с. 78. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР): методическое пособие. − Москва, 2012. − 80 стр. [Электронный ресурс] http://www.dna-technology.ru /files/images/metodichki/OsnoviPCR.pdf (дата обращения 9.03.2015) 79. Парахонский, А.П. Клинико-иммунологическая характеристика иммунной недостаточности у пожилых людей и ее коррекция / А.П. Парахонский // Современные наукоемкие технологии. – 2008. – № 7 – С. 89-90. 241 80. Подымова, С.Д. Вирусные гепатиты у пожилых пациентовю Особенности эпидемиологии, клинической картины, профилактики и лечения / С.Д. Подымова, А.Г. Азов // Вирусные гепатиты. – 2001. – №1 (11). – С. 3-12. 81. Попонин, Д.М. Зависимость титров IgG, специфичных к различным белкам вируса гепатита С, от особенностей течения хронической инфекции / Д.М. Попонин, Э.С. Горовиц, А.Л. Бондаренко // Журн. микробиол., эпидемиологии, иммунобиологии. – 2011. – №6. – С.57 - 61. 82. Потапова, А.А. Алгоритм исследования «проблемных» образцов при массовом скрининге сывороток крови на антитела к вирусу гепатита С / А.А. Потапова, Е.Б. Редченко, В.А. Науменко // Мир вирусных гепатитов. − 2008. −№4. − С. 8-12. 83. Потапова, А.А. Иммунодиагностика вирусного гепатита С при массовых исследованиях в скрининговой лаборатории: руководство для практических врачей / А.А. Потапова, Е.Б. Редченко, П.Г. Богуш, Л.В. Ковальчук. − Москва, 2008. − 108 с. 84. Потапова, А.А. Повышение достоверности результатов массового скрининга крови на наличие антител к вирусу гепатита С / А.А. Потапова, Л.В. Ковальчук // Вестник РГМУ. 2006. №5 (52). С. 63-68. 85. Потапова, А.А. Проблемы диагностики ВГС-инфекции у лиц пожилого возраста (некоторые характеристики сывороток крови, в которых зарегистрирован ложнопозитивный результат обнаружения анти-ВГС) / А.А. Потапова // Мир вирусных гепатитов. – №11. – 2005. – С. 2-5. 86. Потятынник, О.Н. Половой путь передачи гепатитов В, С и ТТV среди групп населения с рискованным сексуальным поведением: дисс. … канд. мед. наук / О.Н. Потятынник − Москва, 2005. − 114 с. 87. Ребриков, Д.В. ПЦР в «реальном времени» / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. − М.: Бином, 2009. − 215 с. 88. Резников, Ю.П. Иммунология в клиническом лабиринте / Ю.П. Резников. − М.: Триада, 2007. − 141 с. 89. Рейзис, А.Р. Особенности и сравнительная эффективность противовирусного лечения ХГС у детей и взрослых / А.Р. Рейзис, Т.С. Никитина, А.К. Дрондина и др. // Вирусные гепатиты – эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика: материалы ΥІІ Российской научно-практической конференции с международным участием. Москва, 2007 С. 224-226. 90. Решетников, С.С. Иммуноферментный анализ альфа-фетопротеина, использование в диагностике заболеваний человека / Решетников С.С. // Диагностическая значимость выявления маркеров фето-плацентарного комплекса в контроле развития 242 беременности и онкозаболеваний: научный сборник ЗАО «Вектор-Бест». Кольцово, 2005 С.9-31. 91. Руководство по клинической лабораторной диагностике /под ред. В.В. Меньшикова − М.: Медицина, 1982. − С. 158. 92. Рыжиков, Е.А. Разработка метода иммуноферментного анализа для диагностики вирусного гепатита С, основанного на выявлении вирусных антигенов core и Е2 в сыворотке крови / Е.А. Рыжиков // Мир вирусных гепатитов. 2009. №3 С.30. 93. Рябикова, Т.Ф. Заболеваемость парентеральными вирусными гепатитами В и С в приволжском Федеральном округе (1997-2006 гг.) / Т.Ф. Рябикова, Е.И. Ефимов, П.Н. Никитин // Вирусные гепатиты эпидемиология, лечение и профилактика: материалы VII Российской научно-практической конференции с международным участием. М., 2007 С. 135-137. 94. Селиванов, Е.А. Деятельность службы крови России в 2010 году / Е.А. Селиванов, А.В. Чечеткин, Т.Н. Данилова, М.Ш. Григорьян // Трансфузиология. 2011. Т. 12 №4 С. 5-14. 95. Семенков, В.Ф. Иммуногеронтология / В.Ф. Семенков, В.И. Карандашов, Л.В. Ковальчук. М.: Медицина, 2005 208 с. 96. Сенягина, Н.Е. Особенности серологической диагностики вирусного гепатита С при перинатальной передаче инфекции / Н.Е. Сенягина, С.Н. Фомина, М.Г. Никишина и др. // Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний. − Н.Новгород, НПО «Диагностические системы». − 2007. − №2-3. − С. 7-8. 97. Сеченова, Н.В. Распространенность HCV-инфекции у детей раннего возраста в закрытых учреждениях / Н.В. Сеченова, З.С. Матютина, Т.А. Ковалева, К.И. Чуйкова // Вирусные гепатиты – эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика: материалы ΥІІ Российской научно-практической конференции с международным участием. Москва, 2007. С. 148-149. 98. Смердова, М.А. Ревматоидный фактор в лабораторной диагностике / Смердова М.А., Косова Е.Ю. // Информационный бюллетень "Новости "Вектор-Бест". 2000. №3 (17). URL: http://www.vector-best.ru/nvb/cont17.htm (Дата обращения 02.10 2013). 99. Сомова, А.В. Частота выявления маркеров ВИЧ и вирусов гепатитов у доноров и в компонентах и препаратах плазмы (в ИФА и ПЦР) / А.В. Сомова, Т.А. Туполева, Л.О. Грумбкова и др. // Вестник Службы крови России 2005. № 2. С. 37-46. 243 100. Сотникова, В.Н. Характеристика иммунитета долгожителей Москвы / Сотникова В.Н., Кочергина Н.И., Мирошниченко И.В. // Геронтология и гериатрия: альманах. М., 2005. Вып. 4. С.166-169. 101. Тарасенко, О.А. Опыт использования метода ПЦР для выявдения РНК (ДНК) возбудителей вирусных гепатитов В и С у серонегативных доноров / О.А.Тарасенко, И.А. Гукасян, Л.В. Соболевская, Т.В. Черненко // Справочник заведующего КДЛ. 2011. №3. С. 3-8. 102. Творогова М.Г., Малахов В.Н. Качество выявления нуклеиновых кислот вирусов гепатита В и С методом ПЦР в Российской Федерации (по данным ФСВОК) // Мир вирусных гепатитов. 2009. №3. С. 44-45. 103. Туполева, Т.А. Использование ПЦР для детекции ВГВ и ВГС на станции переливания крови: [Электронный ресурс] / Т.А. Туполева, Е.В. Богословская, Л.О. Грумбкова и др. URL: http:// www.epidemiolog.ru/diagnost/pcr/3856.html (Дата обращения: 02.11.2013). 104. Флетчер, Р. Клиническая эпидемиология : основы доказательной медицины : пер. с англ. / Р. Флетчер, С. Флетчер, Э. Вагнер. – М. : Медиа сфера, 1998. – 352 с. 105. Хаертынова, И.М. Выраженность гуморального иммунного ответа при HCV моно- и HCV/HIV-коинфекции / И.М. Хаертынова, А.П. Цибулькин, О.М. Романенко и др. // Практическая медицина. Инфекционные болезни и антимикробная терапия. − 2012. − V.1. − №56 .− С.45-48. 106. Чеканова, Т.А. Разработка иммуночипа для раздельной детекции антител к вирусу гепатита С. / Т.А. Чеканова, М.Л. Маркелов, И.Н. Манзенюк и др. // Клиническая лабораторная диагностика. − 2008. − №6. − C. 25-30. 107. Шаркова, В.Е. Ошибки при проведении иммуноферментного анализа / Шаркова В.Е., Власов Г.С., Свежова Н.В. // Клин. лаб. диагн. − 2007.− №3. −С. 42- 45. 108. Шахгильдян И.В. Характеристика групп высокого риска инфицирования вирусом гепатита С // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы.− 2000.− №2.− С. 3-4. 109. Шахгильдян, И.В Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика) / И.В. Шахгильдян, М.И. Михайлов, Г.Г. Онищенко − М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. − 384 с. 110. Шахгильдян, И.В. Современная эпидемиологическая характеристика гепатита С в Российской Федерации и пути совершенствования профилактики этой инфекции / И.В. Шахгильдян, О.Н. Ершова, С.Н. Кузин и др. // Вирусные гепатиты – эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика: материалы ΥІІ Российской научно-практической конференции с международным участием . Москва, 2007 г. С. 168-171. 244 111. Шмагель, К.В. Иммунитет беременной женщины / К.В. Шмагель, В.А. Черешнев − М.: Медицинская книга.− 2003.− 226 с. 112. Шубина, Ю.Ф. Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови: автореф. дисс. …канд. мед. наук / Ю.Ф. Шубина. − М., 2009.− 25 с. 113. Шулакова, Н.И. Состояние заболеваемости хроническими вирусными гепатитами в Москве / Н.И. Шулакова, И.Н. Лыткина, Н.Н. Филатов и др. / Вирусные гепатиты – эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика: материалы ΥІІ Российской научно-практической конференции с международным участием. Москва, 2007 С. 174-175. 114. Элбакян, Р.М. Ложноположительные результаты при проведении исследований на наличие анти-ВГС / Элбакян Р.М., Романов М.Ю., Романова Е.Н., М.И. Михайлов // Гепатиты B, C и D – проблемы диагностики, лечения и профилактики: тезисы докладов V Российской научно-практической конференции. Москва, 2003. С. 356359. 115. Ястребова О.Н. Результаты внешней оценки качества лабораторных исследований по выявлению антител к вирусу гепатита С в десяти регионах России / О.Н. Ястребова, Э.В. Криницына, Е.И. Лебедева и др. // Новости Вектор-Бест. − 2006.− №2 (40). − С. 24. 116. Ястребова, О.Н. Гепатит С: Информационно-методическое пособие / Ястребова О.Н. − Новосибирская обл., пос. Кольцово.− 2003.− 36 с. 117. Ястребова, О.Н. Сложности лабораторной диагностики вирусного гепатита С / О.Н. Ястребова // Вирусные гепатиты. Новости Вектор-Бест: дайджест. − 2003а. − С. 38-41. 118. Afdhal, N.H. The natural history of hepatitis C / N.H. Afdhal // Semin Liver Dis. 2004. V. 24 (Suppl 2). P. 3-8. 119. Agha, S. Prevalence of Low Positive Anti-HCV Antibodies in Blood Donors: Schistosoma mansoni Co-Infection and Possible Role of Autoantibodies / Agha S., El-Mashad N., ElMalky M. et al. // Microbiol Immunol. 2006. V. 50 (6). P. 447-452. 120. Alter, M.J. Epidemiology of hepatitis C virus infection / M.J. Alter // World. J. Gastroenterol. − 2007, May 7. − 13(17) . − P. 2436-2441. 121. Alter, M.J. Guidelines for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. Centers for Disease Control and Prevention / M.J. Alter, W.L. Kuhnert, L. Finelli // MMWR Recomm Rep. − 2003. − 52(RR_3). − P. 1-13, 15. 122. Alvarez-Del Arco, D. HIV testing policies for migrants and ethnic minorities in EU/EFTA Member States / D. Alvarez-Del Arco, S. Monge, A. M. Caro-Murillo et al. // Eur. J. Public. Health. 2014 . V. 24 (1). P. 139-144. 245 123. Amon, J. Prevalence of hepatitis C virus infection among injection drug users in the United States, 1994-2004 / J. Amon, R. Garfein, L. Adieh-Grant et al. // Clin Inf Dis. 2008. V. 46. №12. P. 1852-1858. 124. Aoyagi, K. Performance of a conventional enzyme immunoassay for hepatitis C virus core antigen in the early phases of hepatitis C infection / K. Aoyagi, K. Iida, C. Ohue et al. // Clin Lab. 2001. V. 47. №3-4. P.119-127. 125. Appel, N. From Structure to Function: New Insights into Hepatitis C Virus RNA Replication / N. Appel, T. Schaller, F. Openin, R. Bartenschlager // J. Biol. Chem. 2006. V.281. P. 9833-9836. 126. Araujo, A.C. Distinguishing Acute from Chronic Hepatitis C Virus (HCV) Infection Based on Antibody Reactivities to Specific HCV Structural and Nonstructural Proteins / A.C. Araujo, I.V. Astrakhantseva, H.A. Fields, S. Kamil // Clin Microbiol. 2011. 49 (1). P. 54–57. 127. Armstrong, G.L. The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1999 through 2002 / G.L. Armstrong, A. Wasley, E.P. Simard et al. // Ann Intern Med. 2006, May 16. V. 144. №10. P.705-714. 128. Atta, M. Inflammation biomarkers in chronic hepatitis C: association with liver histopathology, HCV genotype and cryoglobulinemia / M. Atta, M. Cabral, G. Santos et al. // Inflamm. Res. 2012, Oct. 61(№10). P. 1101-1106. 129. Banner, B.F. Enhanced phenotypic expression of alpha-1-antitrypsin deficiency in an MZ heterozygote with chronic hepatitis C / B.F. Banner, N. Karamitsios, L. Smith, H.L. Bonkovsky // Am. J. Gastroenterol. 1998, Sep. V.93. №9. P. 1541-1545. 130. Beld, M. Quantitative antibody responses to structural (Core) and nonstructural (NS3, NS4, and NS5) hepatitis C virus proteins among seroconverting injecting drug users: impact of epitope variation and relationship to detection of HCV RNA in blood / M. Beld, M. Penning, M.van Putten et al. // Hepatology. 1999. №4. P. 1288-1298. 131. Bharti, A.R. Clinical Variables Identify Seronegative HCV Co-infection in HIV-Infected Individuals / A.R. Bharti, S.L. Letendre, T. Wolfson et al. // J Clin Virol. 2011. V.52. №4. P. 328–332. 132. Bondarenko, I.G. Lack of correlation between sensitivity characteristics of the tests for hepatitis C virus antibodies estimated with serially diluted and natural low-reactive control specimens / I.G. Bondarenko, P.E. Garrett, I.N. Savinova, Y.A. Sedunova // Scand J Clin Lab Invest. 1999. V.59. №2. P.153-158. 246 133. Bongiorno, M.R. Hepatitis B and hepatitis C virus infections in dermatological patients in west Sicily: a seroepidemiological study / M.R. Bongiorno, G. Pistone, G. Aricò // J Eur Acad Dermatol Venereol. 2002. V.16 . №1. P.43-46. 134. Branson, B.M. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Revised recommendations for HIV testing of adults, adolescents, and pregnant women in health-care settings / B.M. Branson, H.H. Handsfield, M.A. Lampe et al. // MMWR Recomm. Rep. 2006 . 55 (RR-14). P.1-17; quiz CE1-4. 135. Briggs, M.E. Prevalence and risk factor for hepatitis C virus infection at an urban veterans administration medical center / M.E. Briggs, C. Baker, R. Hall et al. // Hepatology. 2001. V.34. № 6. P.1200-1205. 136. Brillanti, S. Serum IgM antibodies to hepatitis C virus in acute and chronic hepatitis C / Brillanti S., Masci C., Miglioli M. et al. // Arch. Virol. Suppl. 1993. V. 8. P.213-218. 137. Bruce, M.G. Clinical significance o elevated alpha-fetoprotein in Alaskan Native patients with chronic hepatitis C / Bruce M.G., Bruden D., McMahon B.J. et al. // J. Viral. Hepat. 2008. V.15. №3. P.179-187. 138. Bruce, M.G. Hepatitis C infection in Alaska Natives with persistently normal, persistently elevated or fluctuating alanine aminotransferase levels / M.G. Bruce, D. Bruden, B.J. McMahon et al. // Liver Int. 2006. V.26. №6. P. 643-649. 139. Carreðo, V. New perspectives in occult hepatitis C virus infection / V. Carreðo, J. Bartolomé, I. Castillo, J.A. Quiroga // World. J. Gastroenterol. 2012. V.18. №23. P.2887-2894. 140. Caspari, G. Non-specific and specific anti-HCV results correlated to age, sex, transaminase, rhesus blood group and follow-up in blood donors / G. Caspari, W.H. Gerlich, J. Beyer, H. Schmitt // Arch. Virol. 1997. V.142(3) . P.473-478. 141. Castillo, I. High prevalence of occult hepatitis C virus infection in patients with chronic hepatitis B virus infection / I. Castillo, J. Bartolomé, J.A. Quiroga et al. // J. Med. Microbiol. 2013. V.62 (Pt 8). P.1235-1238. 142. Castro, F.G. Evaluation of hepatitis C vuris RNA RT/PCR qualitative and quantitative second generation assay / F.G. Castro, S. Sauleda, J.I. Esteban et al. // J. Virol. Methods. 2001.-V.91. №1. P.51-58. 143. Cavazza, S. Indeterminate third-generation hepatitis C recombinant immunoblot assay and HCV RNA analysis: isolated reactivity against NS5 associated with HCV viraemia in clinical patients but not blood donors / S. Cavazza, M. Lagging // Scand. J. Infect. Dis. 2005. V.37. P.488–489. 247 144. Cedrone, A. Utility of alpha-fetoprotein (AFP) in the screening of patients with virus-related chronic liver disease: does different viral etiology influence AFP levels in HCC? A study in 350 western patients / A. Cedrone, M. Covino, E. Caturelli et al. // Hepatogastroenterology. V.47. №36. P.1654-1658. 145. Chak, E. Hepatitis C virus infection in USA: an estimate of true prevalence / E. Chak, A.H. Talal, K.E. Sherman, E.R. Schiff et al. // Liver Int. 2011. V.31. №8. P.1090-1101. 146. Chapko, M.K. Cost effectiveness of testing strategies for chronic hepatitis C / M.K. Chapko, K.L. Sloan, J.W. Davison et al. // Am. J. Gastroenterol. 2005. V.100. 3. P. 607-615. 147. Chen, S. L. The Natural History of Hepatitis C Virus (HCV) Infection. Review / S. L. Chen, T.R. Morgan // Int. J. Med. Sci. 2006. V.3. №2. P.47-52. 148. Chen, T.M. Predictors of alpha-fetoprotein elevation in patients with chronic hepatitis C, but not hepatocellular carcinoma, and its normalization after pegylated interferon alfa 2aribavirin combination therapy / T.M. Chen, P.T. Huang, M.H. Tsai et al. // J. Gastroenterol. Hepatol. 2007. V.22. №5. P. 669-675. 149. Cheung, K.J. The HCV serum proteome: a search for fibrosis protein markers / K.J. Cheung, K. Tilleman, D. Deforce et al. // J. Viral. Hepat. 2009. V.16. №6. P. 418-429. 150. Colantoni, A. Polymerase-chain reaction for the detection of HCV-RNA-cryoglobulinemia as a cause of false-negative results / A. Colantoni, N. De Maria, R. Idilman, D.H. Van Thiel // Italian J. Gastroenterology and Hepatology. 1997. V.29. №3. P.273-274. 151. Coppola N. Anti-HCV IgG avidity index in acute hepatitis C / N. Coppola, R. Pisapia, C. Marrocco et al. // J. Clin. Virol. 2007. V. 40. №2. P.110-115. 152. Coppola, N. Improvement in the aetiological diagnosis of acute hepatitis C: a diagnostic protocol based on the anti-HCV-IgM titre and IgG Avidity Index / N. Coppola, R. Pisapia, G. Tonziello et al. // J. Clin. Virol. 2009. V.46. №3. P.222-229. 153. Damen, M. Reliability of the third-generation recombinant immunoblot assay for hepatitis C virus / M. Damen, H.L. Zaaijer, H.T. Cuypers et al. // Transfusion. 1995. V.35. №9. P.745-749. 154. Daniels, D. Surveillance for acute viral hepatitis - United States, 2007. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) / D. Daniels, S. Grytdal, A. Wasley // MMWR Surveill. Summ. 2009. V.3. P.1-27. 155. De Maddalena, C. HCV-RNA detection using different PCR methods in sera, cryoglobulins and peripheral blood mononuclear cells of patients with mixed cryoglobulinemia / C. De Maddalena, G. Zehender, A. Bianchi Bosisio et al. // Clin. Exp. Rheumatol. 1995. V.13, Suppl 13. S119-122. 248 156. Deam, D. Alpha-1-antitrypsin in liver disease / D. Deam, K. Byron, S. Ratnaike // Ann. Clin. Biochem. 1989. V.26 ( Pt 2) . P.122-124. 157. Degos, F. Hepatitis C virus related cirrhosis: time to occurrence of hepatocellular carcinoma and death / F. Degos, C. Christidis, N. Ganne-Carrie et al. // Gut. 2000. V. 47. №1. P.131-136. 158. Deuffic-Burban, S. Comparing the public helth burden of chronic hepatitis C and HIV infection in France / S. Deuffic-Burban, J.B. Wong, A.J. Valleron et al. // J. Hepatol. 2004. V.40. №2. P.319-326. 159. Di Bisceglie, A. Chronic hepatitis C viral infection in patients with normal serum alanine aminotransferases / A. Di Bisceglie // Am. J. Med. 1999. V.107 (6B). 53S-5S. 160. Egger, D. Expression of hepatitis C virus proteins induces distinct membrane alterations including a candidate viral replication complex / D. Egger, B. Wolk, R. Gosert et al. // J. Virol. 2002. V.76. P.5974-5984. 161. El-Bassiouny, A.E. Expression of cyclooxygenase-2 and transforming growth factor-beta1 in HCV-induced chronic liver disease and hepatocellular carcinoma / A.E. El-Bassiouny, M.M. Zoheiry, M.M. Nosseir at al. // MedGenMed. 2007. V.9. №3. V.45. 162. El-Shamy, A. Sequence variation in hepatitis C virus nonstructural protein 5A predicts clinical outcome of pegylated interferon/ribavirin combination therapy / A. El-Shamy, M. Nagano-Fujii, N. Sasase et al. // Hepatology. 2008. V.48. №1. P.38-47. 163. Elzouki, A.N. Risk of hepatobiliary disease in adults with severe alpha 1-antitrypsin deficiency (PiZZ): is chronic viral hepatitis B or C an additional risk factor for cirrhosis and hepatocellular carcinoma? / A.N. Elzouki, S. Eriksson // Eur J Gastroenterol Hepatol. 1996. V.8. №10. P.989-994. 164. Erdtmann, L. The hepatitis C virus NS2 protein is an inhibitor of CIDE-B-induced apoptosis / L. Erdtmann, N. Franck, H. Lerat, J. Le Seyec et al. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. №20. P.18256-18264. 165. Farci, P. A long-term study of hepatitis C virus replication in non-A, non-B hepatitis / P. Farci, H.J. Alter, D. Wong et al. // N. Engl. J. Med. 1991. V.325. №2. P. 98-104. 166. Farci, P. Hepatitis C virus-associated fulminant hepatic failure / P. Farci, H.J. Alter, A. Shimoda et al. // N. Engl. J. Med. 1996. V.335. P.631-634. 167. Fattovich, G. Morbidity and mortality in compensated cirrhosis type C: a retrospective follow-up study of 384 patients / G. Fattovich, G. Giustina, F. Degos et al. // Gastroenterology. 1997. V.112. №2. P.463-472 249 168. Feucht, H.H. Definition of false-positive reactions in screening for hepatitis C virus antibodies / H.H. Feucht, P. Schäfer, B. Zöllner et al. // J. Clin. Microbiol. – 1999, Jan. – V.37.- №l.- P. 233-234. 169. Fishman, S.L. The quasispecies nature and biological implications of the hepatitis C virus / S.L. Fishman, A.D. Branch // Infect. Genet. Evol. – 2009. – V.9. – P.1158–1167. 170. Galli, M. Viruses and cryoglobulinemia / M. Galli // Clin Exp Rheumatol. 1995. V.13, Suppl 13. S63-70. 171. Germi, R. Quantitative real-time RT-PCR to study hepatitis C virus binding onto mammalian cells / R. Germi, J.M. Crance, D. Garin et al. // Am. Clin. Lab. – 2001 . – V.20. – №7. – P.26-28. 172. Gonzàlez-Quintela, A. Serum immunoglobulins (IgG, IgA, IgM) in chronic hepatitis C. A comparison with non-cirrhotic alcoholic liver disease / A. Gonzàlez-Quintela, M.R. Alende, R. Gamallo et al. // Hepatogastroenterology. – 2003. – V.50. – №54. – P.2121-2126. 173. Gorodin S. New Tools in HCV Diagnosis, in Light of the Enhanced Awareness and the New Drugs for Treatment: SMARTube and Stimmunology / S. Gorodin, S. Unal, Y. Wang et al. // ScientificWorldJournal. – 2013;2013:389780. 174. Gosert, R. Identification of the hepatitis C virus RNA replication complex in Huh-7 cells harboring subgenomic replicons / R. Gosert, D. Egger, V. Lohmann et al. // J. Virol. – 2003. – V.77. – P.5487-5492. 175. Gunn, R.A. Screening for chronic hepatitis B and C virus infection in an urban sexually transmitted disease clinic: rationale for integrating services / R.A. Gunn, P.J. Murrey, M.L. Ackers et al. // Sex. Transm. Dis. – 2001. – V. 28. – №3. – P. 166-170. 176. He, J. Double-antigen sandwich ELISA for the detection of anti-hepatitis C virus antibodies / J. He, B. Xiu, G. Wang et al. // Virol. Methods. – 2011 . – V.171. – №1. – P.163-168. 177. Hitziger, T. Cellular immune response to hepatitis C virus (HCV) in nonviremic blood donors with indeterminate anti-HCV reactivity / T. Hitziger, M. Schmidt, V. Schottstedt et al. // Transfusion. 2009 . – V.49. – №7. – P.1306-1313. 178. Hu, K.Q. Clinical significance of elevated alpha-fetoprotein (AFP) in patients with chronic hepatitis C, but not hepatocellular carcinoma / K.Q Hu., N.L. Kyulo, N. Lim et al. // Am. J. Gastroenterol. – 2004. – V. 99. – №5. – P. 860-865. 179. Hu, K.Q.The long-term outcomes of patients with compensated hepatitis C virus-related cirrhosis and history of parenteral exposure in the United States / K.Q. Hu, M.J. Tong // Hepatology. – 1999. – V.29. –№4. – P.1311-1316. 180. Hu, Y.W. Immunoglobulin mimicry by Hepatitis C Virus envelope protein E2 / Y.W. Hu, L. Rocheleau, B. Larke et al. // Virology. – 2005 . – V.332. – №2. – P.538-549. 250 181. Husby, G. Epidemiological and genetic aspects of IgM rheumatoid factors / G. Husby, J.T. Gran, A. Johannessen // Scand. J. Rheumatol. – 1988. – V.75, Suppl. – 213-218. 182. Jusot, J.F.Cost-effectiveness analysis of strategies for hepatitis C screening in French blood recipients / J.F. Jusot, C. Colin // Eur. J. Public Health. – 2001. – V.11. – №4. – P.373-379. 183. Kamal, S.M. Acute hepatitis C: a systematic review / S.M. Kamal // Am. J. Gastroenterol. – 2008. – V.103. – №5. – 1283-1297; quiz 1298. 184. Kammer, A.R. Molecular mimicry of human cytochrome P450 by hepatitis C virus at the level of cytotoxic T cell recognition / A.R. Kammer, S.H. van der Burg, B. Grabscheid et al. // J. Exp. Med. – 1999. – V. 190. – P.169-176. 185. Kanno, A. Immunoglobulin G antibody avidity assay for serodiagnosis of hepatitis C virus infection / A. Kanno, Y. Kazuyama // J. Med. Virol. – 2002. – V.68. – P.229-223. 186. Kemmer, N.M. Hepatitis C-related arthropathy: Diagnostic and treatment considerations / N.M. Kemmer, K.E. Sherman // J. Musculoskelet. Med. – 2010 . – V.27. – №9 . – P.351354. 187. Khan, S. Circulating Biomarkers and their Possible Role in Pathogenesis of Chronic Hepatitis B and C Viral Infections / S. Khan, A. Bhargava, N. Pathak et al. // Indian. J. Clin. Biochem. – 2011. – V. 26. – №2. – P.161–168. 188. Kindmark, C-O. The concentration of C-reactive protein in sera from healthy individuals / C-O. Kindmark // Scand. J. Clin. Lab. Invest. – 1972. – V.29. – P.407-411. 189. Kleinman, S. The incidence/window period model and its use to assess the risk of transfusion-transmitted human immunodeficiency virus and hepatitis C virus infection / S. Kleinman, M.P. Busch, J.J. Korelitz, G.B. Schreiber // Transfusion Medicine Review. – 1997. – V.11. – №3. – P.155–172. 190. Klimashevskaya, S. Patients PCR status and hepatitis C avidity assay / S. Klimashevskaya, T. Ulanova, A. Burkov et al. // Clinical Microbiology and Infection. – V. 16, Suppl. . – №2. – P.S307. 191. Kobayashi, M. Amino acid substitutions in the nonstructural region 5A of hepatitis C virus genotypes 2a and 2b and its relation to viral load and response to interferon / M. Kobayashi, K. Watanabe, M. Ishigami et al. // Am. J. Gastroenterol. 2002 . – V.97. – №4. – P.988998. 192. Koziel, M.J. Hepatitis C virus-specific cytolytic T lymphocyte and T helper cell responses in seronegative persons / M.J. Koziel, D.K. Wong, D. Dudley et al. // J. Infect. Dis. – 1997 . – V.176. – №4. – P.859-866. 251 193. Kraus, T.G. Second -trimester maternal serum alpha-fetoprotein and risk of adverse pregnancy outcome / T.G. Kraus, P. Christens, J. Wohlfahrt et al. // Obstet. Gynecol. 2001. V.97. №2 Р.277-282. 194. Krawczynski, K. Hepatitis С virus antigen in hepatocytes: immunomorphologic detection and identification / K. Krawczynski, M.J. Beach, D.W. Bradley et al. // Gastroenterology. – 1992. – V.103. – №2. – P.622-629. 195. Krishnadas, D. K. In vitro activation and differentiation of naïve CD4+ and CD8+ T cells into HCV core- and NS3-specific armed effector cells: a new role for CD4+ T cells / D.K. Krishnadas, W. Li, R. Kumar et al. // Cell. Immunol. – 2009. – V.259. – №2. – P.141-149. 196. Kuiken, C. Hepatitis C Databases. Principles and Utility to Researchers / C. Kuiken, M. Mizokami, G. Deleage et al. // Hepatology. – 2006. – V. 143. – P.1157-1165. 197. Kuiken, C. The Los Alamos hepatitis C sequence database / C. Kuiken, K. Yusim, L. Boykin, R. Richardson // Bioinformatics . – 2005. – V.21. – P.379-384. 198. Laperche, S. Simultaneous detection of hepatitis C virus (HCV) core antigen and anti-HCV antibodies improves the early detection of HCV infection / S. Laperche, N. Le Marrec, A. Girault et al. // J. Clin. Microbiol. – 2005. – V.43. – P.3877–3883. 199. Larouche, A. Seronegative hepatitis C virus infection in a child infected via mother-to-child transmission / A. Larouche, G. Gaëtan, N. El-Bilali et al. // J. Clin. Microbiol. – 2012 . – V.50 . – №7. – P.2515-2519. 200. Lavillette D. Human serum facilitates hepatitis C virus infection, and neutralizing responses inversely correlate with viral replication kinetics at the acute phase of hepatitis C virus infection / D. Lavillette, Y. Morice, G. Germanidis et al. // Virol. – 2005. – V.79. – P. 6023-6034. 201. Le Page, A.K. Discordant hepatitis C serological testing in Australia and the implications for organ transplant programs / A.K. Le Page, P. Robertson, W.D. Rawlinson // J. Clin. Virol. – 2013. – V.57. – №1. – P.19-23. 202. Lemaire, J.M. HCV RNA in blood donors with isolated reactivities by third-generation RIBA / J.M. Lemaire, A.M. Courouce, C. Defer et al. // Transfusion. – 2000. – V.40. – P.867–70. 203. Leñn, P. Use of overlapping synthetic peptides to characterize samples from blood donors with indeterminate results to hepatitis C virus core antigen / P. Leñn, J.A. Lñpez, C. Elola et al. // Vox. Sang. – 1998. – V.75 . – №1. – P.32-36. 204. Li, K. Immune evasion by hepatitis C virus NS3/4A protease-mediated cleavage of the Tolllike receptor 3 adaptor protein TRIF / K. Li, E. Foy, J.C. Ferreon et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2005 . – V.102. – №8. – P.2992-2997. 252 205. Lopes, E.P. Determination of the cut-off value of serum alanine aminotransferase in patients undergoing hemodialysis, to identify biochemical activity in patients with hepatitis C viremia / E.P. Lopes, E.C. Gouveia, A.C. Albuquerque et al. // J. Clin. Virol. – 2006 . – V.35. – №3. – P.298-302. 206. Lorenz, I. C. Structure of the catalytic domain of the hepatitis C virus NS2-3 protease / I. C. Lorenz, J. Marcotrigiano, G. Dentzer, C.M. Rice // Nature. – 2006. – V.442. – P. 831-835. 207. Madalinski, K. Immunological mechanisms of hepatitis B and C chronicity / K. Madalinski, J. Rybczynska, J. Zawadzka-Skomial // Exp. Clin. Hepatology. – 2006. – V.2. – №1. – P.10-16. 208. Males, S. Serum alpha-foetoprotein level predicts treatment outcome in chronic hepatitis C / S. Males, R.R. Gad, G. Esmat et al. // Antivir. Ther. – 2007. – V.12. – №5. – P.797-803. 209. Management of hepatitis C 2002: National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement (June 10-12, 2002) // Gastroenterology. – 2002. – V.123 . – №6. – P.2082-2099. 210. Management of hepatitis C 2002: National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement (June 10-12, 2002) // Hepatology . – 2002 . – 36 (5 Suppl 1). – S 320. 211. Manual of clinical laboratory immunology: Amer. Soc. For Microbiol / Rose N.R. (Ed). – Washington (4 Edition) . – 1992. – 987 р. 212. Marceau, G. LKM1 autoantibodies in chronic hepatitis C infection: a case of molecular mimicry? G. Marceau, P. Lapierre, K. Béland et al. // Hepatology. – 2005. – V.42. – №3. – P.675-682. 213. Martinelli, A.L. Quantitative assessment of hepatitis C virus RNA and IgM antibodies to hepatitis C core in chronic hepatitis C / A.L. Martinelli, D. Brown, H.B. Braun et al. // J. Hepatol. – 1996 . – V.24. – №1. – P.21-26. 214. Martinot-Peignoux, M. Prospective studies of anti- hepatitis C virus –positive patients with persistently normal serum alanine transeaminase with or without detectable serum hepatitis C virus RNA / M. Martinot-Peignoux, N. Boyer, D. Cazals-Hatem et al. // Hepatology. – 2001. – V.34. – P.1000-1005. 215. Maylin, S. Sustained virological response is associated with clearance of hepatitis C virus RNA and a decrease in hepatitis C virus antibody / Maylin S., Martinot-Peignoux M., Ripault M.-P. et al. // Liver Int. – 2009 . – V.29. – №4. – P. 511–517. 216. McCaughan, G.W. Clinical assessment and incidence of hepatitis C RNA in 50 consecutive RIBA-positive volunteer blood donors / G.W. McCaughan, P.H. McGuinness, G.A. Bishop, et al. // Med. J. Aust. – 1992. – V.157. – №4. – P.231-233. 253 217. Mitsuhashi, N. Clinical significance of alpha-fetoprotein: involvement in proliferation, angiogenesis, and apoptosis of hepatocellular carcinoma / N. Mitsuhashi, S. Kobayashi, T. Doki et al. // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2008. – V.23. – e 189-197. 218. Mondelli, M. Immunobiology and pathogenesis of HCV infection / M. Mondelli, A. Cerino, V. Beiiotii et al. // Res. Virol. —1993. —Vol. 144. - P. 269-274. 219. Moriishi, K. Exploitation of Lipid Components by Viral and Host Proteins for Hepatitis C Virus Infection / K. Moriishi and Y. Matsuura // Front. Microbiol. – 2012. – V.3. – 54. 220. Moriishi, K. Proteasome Activator PA28γ-Dependent Nuclear Retention and Degradation of Hepatitis C Virus Core Protein / K. Moriishi, T. Okabayashi, Nakai et al. // J. Virol . – 2003 . – V.77. – №19. – P.10237–10249. 221. Murakami, J. Functional B-cell response in intrahepatic lymphoid follicles in chronic hepatitis C / J. Murakami, Y. Shimizu, Y. Kashi et al. // Hepatology . – 1999. – V.30. – P.143-150. 222. Nastouli, E. Diagnosing acute hepatitis C in HIV-infected patients: Nucleic acid testing compared with antibody and antigen-antibody detecting methods / E. Nastouli, E.C. Thomson, P. Karayiannis et al. // J. Clin. Virol. – 2009. – V.44 . – №1. – Р. 78-80. 223. Neddermann, P. The nonstructural proteins of the hepatitis С virus: structure and functions / P. Neddermann, L. Tomei, C. Steinkuhler et al.// J. Biol. Chem. – 1997. – V. 378. – P.469-476. 224. Newkirk, M.M. Rheumatoid Factors: What Do They Tell Us? / M.M. Newkirk // J. Rheumatol. – 2002. – V.19. – №10. – P. 2034-2040. 225. Orland, J.R. Acute hepatitis C / J.R. Orland, T.L. Wright and S. Cooper // Hepatology. – 2001. – Vol. 33. – № 2. – P.321-327. 226. Pardo, M. Comparative study between occult hepatitis C virus infection and chronic hepatitis C / M. Pardo, J.M. Lñpez-Alcorocho, E. Rodríguez-Iðigo et al. // J. Viral. Hepat. – 2007 . – V.14. – №1. – P.36-40. 227. Paredes , A.M. A Genetic Interaction between Hepatitis C Virus NS4B and NS3 Is Important for RNA Replication / A.M. Paredes and K.J. Blight // J. Virol. . – 2008 . – V.82. – №21. – 10671–10683. 228. Park, J.K. Afr2 regulation occurs cell-autonomously in vitro but is not conferred on episomal DNA in transient assays / J.K. Park, M.H. Feuerman // DNA Cell Biol. 2005 Mar. V. 24(3) . P. 189-198. 229. Pawlotsky, J.M. Immunological disorders in C virus chronic active hepatitis: a prospective case-control study / J.M. Pawlotsky, M. Ben Yahia, C. Andre et al. // Hepatology. – 1994. – V.19. – №4. – P. 841-848. 254 230. Pawlotsky, J.M. Is the detection of anti-hepatitis C virus core IgM influenced by the presence of serum rheumatoid factor? J.M. Pawlotsky, J. Remire, F. Darthuy et al. // J. Med. Virol. – 1995 . – V.45. – №1. – P. 68-70. 231. Peltola, H.O. C-reactive protein for rapid monitoring of infections of the central nervous system / H.O. Peltola // Lancet. – 1982. – V.1. – P. 980-982. 232. Perz, J.F. The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide / J.F. Perz, G.L. Armstrong, L.A. Farrington et al. // Hepatol. – 2006. – V.45. – P. 529–538. 233. Peterson, J. Detection of hepatitis C core antigen in the antibody negative 'window' phase of hepatitis C infection / J. Peterson, G. Green, K. lida et al. // Vox Sang. – 2000. – V.78. – №2. – P.80-85. 234. Pham, T.N. Hepatitis C virus persistence after spontaneous or treatment-induced resolution of hepatitis / T.N. Pham, S.A. MacParland, P.M. Mulrooney et al. // J. Virol. – 2004. – V.78. – №11. – P. 5867-5874. 235. Piro, L. Prospective study of the meaning of indeterminate results of the Recombinant Immunoblot Assay for hepatitis C virus in blood donors / L. Piro, S. Solinas, M. Luciani et al. // Blood Transfus. – 2008. – V.6. – №2. – P. 107–111. 236. Plunkett, B.A. Routine hepatitis C virus screening in pregnancy: a cost-effectiveness analysis / Plunkett B.A., Grobman W.A. // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2005. – V. 192. – №4. – P. 1153-1161. 237. Poynard, T. Viral hepatitis C / Poynard T., Yuen M.F., Ratziu V. et al. // Lancet. – 2003. – V.362. – №9401. – P.2095–2100. 238. Puoti, C. HCV carriers with persistently normal aminotransferase levels: normal das not always mean healthy / C. Puoti // J. Hepatol. – 2003. – V.38. – P.529-532. 239. Quinkert, D. Quantitative Analysis of the Hepatitis C Virus Replication Complex / D. Quinkert, R. Bartenschlager and V. Lohmann // J. Virol. – 2005. – V.79. – №21. – P.13594–13605. 240. Quiroga, J.A. Identification of serologically silent occult hepatitis C virus infection by detecting immunoglobulin G antibody to a dominant HCV core peptide epitope / J.A. Quiroga, I. Castillo, S. Llorente et al. // J. Hepatol. – 2009. – V. 50. – №2. – P.256-263. 241. Quiroga, J.A. Patterns of immune responses to the host-encoded GOR and hepatitis C virus core-derived epitopes with relation to hepatitis C viremia, genotypes, and liver disease severity / J.A. Quiroga, M. Pardo, S. Navas et al. // J. Infect. Dis. – 1996. – V.173. – №2. – P.300-305. 255 242. Quiroga, J.A. Serum immunoglobulin G antibodies to the GOR autoepitope are present in patients with occult hepatitis C virus (HCV) infection despite lack of HCV-specific antibodies / J.A. Quiroga, I. Castillo, J. Bartolomé, V. Carreðo // Clin. Vaccine Immunol. – 2007 . – V.14. – №10. – P. 1302-1306. 243. Ray, R.B. Suppression of apoptotic cell death by hepatitis C virus core protein / R.B. Ray, K. Meyer, R. Ray // Virology. – 1996. – V. 226. – P. 176–182. 244. Ren, F.R. Significance of the signal-to-cutoff ratios of anti-hepatitis C virus enzyme immunoassays in screening of Chinese blood donorse / F.R. Ren, Q.S. Lv, H. Zhuang et al. // Transfusion. – 2005. – V.45. – №11. – P. 1816-1822. 245. Rina, I. The use of polyethyleneglycol for immune complex detection in human sera / I. Rina, V. Haskova, J. Kaslik et al. // Mol. Immunol. – 1979. – V.16 . – №7 – P. 489- 493. 246. Rios, M. Epidemiological, biological and histological characterization of patients with indeterminate third-generation recombinant immunoblot assay antibody results for hepatitis C virus / M. Rios, M. Diago, P. Rivera et al. // J.Viral. Hepat. – 2006. – V. 13. – №3. – P. 177-181. 247. Rivière, Y. Hepatitis C virus-specific cellular immune responses in individuals with no evidence of infection / Y. Rivière, T. Montange, G. Janvier et al. // Virology Journal . – 2012. – V. 9. – P. 76. 248. Roberts, E.A. Maternal-infant transmission of hepatitis C virus infection / E.A. Roberts, L. Yeung // Hepatology. – 2002. – V. 36. – № 5, Suppl1. – Р. 106-113. 249. Roe, B. Cellular and molecular interactions in coinfection with hepatitis C virus and human immunodeficiency virus / B. Roe, W.W. Hall // Expert. Rev. mol. – 2008. – V. 20. – P. 1030. 250. Roque-Cuéllar, M.C. Cellular immune responses and occult infection in seronegative heterosexual partners of chronic hepatitis C patients / Roque-Cuéllar M.C., Sánchez B., García-Lozano J.R et al. // J. Viral. Hepat. – 2011 . – V. 18 – №10. – P. 541-549. 251. Roy, K. Methods of investigating the epidemiology of hepatitis C virus infection among injecting drug users in Scotland / K. Roy, S. Hutchinson, L. Shaw, D.J. Goldberg // Abst. Book of Consensus Conference on Hepatitis C. – Edinburgh, April. – 2004. – P. 20. 252. Sayan, M. Low positive anti-HCV microparticle enzyme immunoassay results: do they predict hepatitis C virus infection? / M. Sayan, M. Meriç, B. Mutlu et al. / Mikrobiyol. Bul. – 2006 . – V.40. – №1-2. – P.81-84. 253. Serfaty, L. Determinants of outcome of compensated hepatitis C virus-related cirrhosis / L. Serfaty, H. Aumaître, O. Chazouillères et al. // Hepatology. – 1998 . – V.27. – №5. – P. 1435-1440. 256 254. Shehab, T.M. Identification and management of hepatitis C patients in primary care clinics / T.M Shehab, M. Orrego, R. Chunduri, A.S. Lok // Am. J. Gastroenterol. – 2003 . – V. 98. – №3. – P. 639-644. 255. Shroter, M. Definition of false-positive reactions in screening for hepatitis C virus antibodies / M. Shroter, H.H. Feucht, P. Schafer et al. // J. Clin. Microbiol. – 1999. – V. 137. – №1.– P.233-234. 256. Silva, I.S. Role of gamma-glutamyl transferase activity in patients with chronic hepatitis C virus infection / I.S. Silva, M.L. Ferraz, R.M. Perez et al. // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2004. – V.19 .– №3. – P. 314-318. 257. Singer, M.E. Cost effectiveness of screening for hepatitis C virus in asymptomatic, averagerisk adults / M.E. Singer, Z.M. Younossi // Am. J. Med.– 2001.– V. 111.– №8.– P. 614-621. 258. Sinor, A.E. Prevalence of hepatitis B surface antigen, hepatitis C antibody, and HIV-1 fntibody among residents of a long-term- care facility / A.E. Sinor, R. Gordon, F.R. Bishai // J. Amer. Geriatr. Soc. – 1992. – V.40. – №3. – P. 218-220. 259. Sirchia, G. Prevalence of hepatitis C virus antibodies in Italian blood donors / G. Sirchia, D. Almini, A. Bellubuono et al. // Vox Sang. – 1990. – V.59. – №1. – P. 26-29. 260. Stevenson, D.L. The presence of rheumatoid factor in sera from anti-HCV positive blood donors interferes with the detection of HCV-specific IgM. Trent HCV Study Group / D.L. Stevenson, A.G. Harris, K.R. Neal, W.L. Irving // J. Hepatol.– 1996. – V. 25. – №5. – P. 621-626. 261. Sugimura, T. A major CYP2D6 autoepitope in autoimmune hepatitis type 2 and chronic hepatitis C is a three-dimensional structure homologous to other cytochrome P450 autoantigens / T. Sugimura, P. Obermayer-Straub, A. Kayser et al. // Autoimmunity. – 2002. – V. 35. – №8. – P.501-513. 262. Suslov, A. P. Limits of diagnostic accuracy of anti-hepatitis C virus antibodies detection by ELISA and immunoblot assay / A.P.Suslov, S.N. Kuzin, T.V. Golosova et al. // Russin Journal of Immunol.– 2002. – V.7. – №2. – P. 176-184. 263. Sutti, S. Breaking self-tolerance toward cytochrome P4502E1 (CYP2E1) in chronic hepatitis C: possible role for molecular mimicry / Sutti S., Vidali M., Mombello C., Sartori M. et al. // J. Hepatol. – 2010. – 53. – №3.– P.431-438. 264. Takaki, A. Cellular immune responses persist and humoral responses decrease two decades after recovery from a single-source outbreak of hepatitis C / A. Takaki, M. Wiese, G. Maertens et al. // Nature medicine. – 2000. – V.6. – P.578-582. 265. Tarr, A.W. The Role of Humoral Innate Immunity in Hepatitis C Virus Infection / A.W. Tarr, R.A. Urbanowicz, J.K. Ball // Viruses. – 2012. – V.4.– №1. – P.1–27. 257 266. Tateyama, M. Alpha-fetoprotein above normal levels as a risk factor for the development of hepatocellular carcinoma in patients infected with hepatitis C virus / M. Tateyama, H. Yatsuhashi, N. Taura et al. // J. Gastroenterol. – 2011. – V.46. – №1. – P. 92-110. 267. Taylor, D.R. Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein / D.R. Taylor, S.T. Shi, P.R. Romano et al. // Science. – 1999. – V.285. – P. 107–110. 268. Terrault, N.A. Sexual transmission of hepatitis C virus among monogamous heterosexual couples: the HCV partners study / N.A. Terrault, J.L. Dodge, E.L. Murphy et al. // Hepatology. – 2013 . – V. 57. – №3. – P. 881-889. 269. Thimme, R. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus infection / R. Thimme, D. Oldach, K.M. Chang et al. // J. Exp. Med.– 2001. – V.194.– №10.– P.1395-406. 270. Tobler, L. H. Lookback on donors who are repeatedly reactive on first-generation hepatitis C virus assays:justification and rational implementation / L. H. Tobler, G. Tegtmeier, S.L. Stramer et al. // Transfusion. – 2000. – V.40. – P.15-24. 271. Toubi, E. IgA rheumatoid factor in patients with chronic HCV infection: prevalence and clinical correlations / E. Toubi, E. Zuckerman, A. Kessel et al. // Clin. Exp. Rheumatol. 2003. - Vol. 21.– №4. – P. 524. 272. Toyoda, H. Changes in Hepatitis C Virus (HCV) Antibody Status in Patients with Chronic Hepatitis C after Eradication of HCV Infection by Interferon Therapy / H. Toyoda, T. Kumada, S. Kiriyama et al. // Clin. Infect. Dis. – 2005. – V.40. – №6. – e49-54. 273. Troisi, C.L. Detection of antibodies to hepatitis C virus in seronegative patients using an immune complex dissociation assay / C.L. Troisi, F.B. Hollinger // J. Viral. Hepat. – 1997.– V.4. – №6. – P. 383-386. 274. Trojan, J. Alpha-fetoprotein (AFP) in granulomatous inflammation of the mouse / J. Trojan, J. Naval, H. Jusforgues, J. Uriel // Br. J. Exp. Pathol.– 1989. – V.70. – №4. – P.469-478. 275. Tsai, J.F. Circulating immune complexes in chronic hepatitis C / J.F. Tsai, J.E. Jeng, W.Y Chang et al. // J. Med. Virol.– 1995. – V.46. – №1. – P. 12-17. 276. Uprichard, S.L.. Hepatitis C Virus Experimental Model Systems and Antiviral drug Research / S.L.. Uprichard // Virol. Sin.– 2010 .– V.25.– №4.– P. 227–245. 277. Van Schaardenburg, D. The relation between class-specific serum rheumatoid factors and age in the general population / D. Van Schaardenburg, A.M. Lagaay, H.G. Otten, E.C. Breedveld // Br. J. Rheumatol. – 1993.– V.32. – P.546-549. 278. Vasiljević N. Gene similarity between hepatitis C virus and human proteins – a blood transfusion problem / N. Vasiljević, L. Marković // Med. Pregl. – 2005. – V.58. – №1112. – P. 582-586. 258 279. Veerapu, N.S. Sporadic reappearance of minute amounts of hepatitis C virus RNA after successful therapy stimulates cellular immune responses / Veerapu N.S., Raghuraman S., Liang T.J. et al. // Gastroenterology. – 2011. – V. 140. – P. 676–685. 280. Vermeersch, P. Validation of a strategy for HCV antibody testing with two enzyme immunoassays in a routine clinical laboratory / P. Vermeersch, M. Van Ranst, K.Lagrou // J. Clin. Virol. – 2008. – 42.– №4. – P.394-398. 281. Vigani, A.G. The association of cryoglobulinaemia with sustained virological response in patients with chronic hepatitis C / A.G. Vigani // J. Viral. Hepat. – 2011. – V. 18. – №4. – Р. 91- 98. 282. Villegas, R. Lifestyle determinants of C-reactive protein in middle-aged, urban Chinese men / R. Villegas, Y.B. Xiang, H. Cai et al. // Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. – 2012. – V. 22. – №3. – P. 223-230. 283. Waller, D.K. The association between maternal serum alpha-fetoprotein and preterm birth, small for gestation age infants, preeclampsia, and placental complications / D.K. Waller, L.S. Lustig, G.C. Cunningham at al. // Obstet. Gynecol. – 1996. – V.88. – №5. – Р. 816-822. 284. Watanabe, J. Prevalence of anti-HCV antibody in blood donors in the Tokio area / J. Watanabe, K. Minegishi, T. Mitsumori et al. // Vox. Sang. – 1990. – V.59. – №2. – P. 8688. 285. Wedemeyer, H. Cross-reactivity between hepatitis C virus and Influenza A virus determinant-specific cytotoxic T cells / H. Wedemeyer, E. Mizukoshi, A.R. Davis et al. // J.Virol. – 2001. – V.75. – №23. – P. 11392-11400. 286. Weksler, M.E. Changes in the B-cell repertoire with age / M.E. Weksler // Vaccine .– 2000.– V.18. – P. 1624-1628. 287. Williams, I. Epidemiology of hepatitis C in the United States / I. Williams // Am. J. Med.– 1999. – V.107(6B). – 2S-9S. 288. Yagci, S. Comparison of Monolisa HCV Ag/Ab ULTRA with two anti-HCV assays for the detection of HCV infection in hospital setting / S.Yagci, E. Padalko // Curr. Microbiol.– 2012. – V.64. – №2. – P.148-151. 289. Yu, M.L. Treatment of chronic hepatitis C in Asia: when East meets West / M.L. Yu, W.L. Chuang //J. Gastroenterol. Hepatol. – 2009. – V.24. – №3. – P.336-345. 290. Zaghloul, H. Detection of occult hepatitis C and hepatitis B virus infections from peripheral blood mononuclear cells / H. Zaghloul, W. El-Sherbiny // Immunol. Invest. – 2010. – V.39. – P. 284–291. 291. Zer, Y. Evaluation of the patients with low levels of anti-HCV positivity / Y. Zer, I. Karaoğlan, H. Ciçek // Mikrobiyol. Bul. – 2009 . – V.43. – №1. – P.133-139. 259 292. Zeuzem, S. Лечение больных хроническим гепатитом С и «нормальной» активностью аминотрансфераз / S. Zeuzem, A. Alberti, W. Rosenberg et al. // Клиническая гепатология. – 2006. – V.2 . – №4. – P.24-34. 293. Zhang, W. Role of molecular mimicry of hepatitis C virus protein with platelet GPIIIa in hepatitis C-related immunologic thrombocytopenia / W. Zhang, M.A. Nardi, W. Borkowsky et al. // Blood. – 2009. – V. 113. – №17. – P.4086– 4093. 294. Zhang, Z.X. Molecular basis for antibody cross-reactivity between the hepatitis C virus core protein and the host-derived GOR protein / Z.X. Zhang, M. Chen, K. Wallhagen et al. // Clin. Exp. Immunol.– 1994.– V.96.– №3.– P.403–409. 295. Zhu, N. Hepatitis C virus core protein binds to the cytoplasmic domain of tumor necrosis factor (TNF) receptor 1 and enhances TNF-induced apoptosis / N. Zhu, A. Khoshnan, R. Schneider et al. // J. Virol. – 1998. – V.72. – P.3691–3697. 260 Приложения Приложение 1. Таблица 1 Сравнение результатов референсного исследования в ИФТС планшетного формата с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4 и NS5-антигенам ВГС и в иммуноблоте «INNO-LIA HCV Ab III update» Возраст Группа* 1 2 3 198 489 674 ж ж ж 53 34 47 11 2 11 3,80 3,65 6,24 АнтиCore, ОП 0,00 0,00 0,00 4 1373 м 59 11 1,27 1,00 5 794 ж 42 11 1,08 6 767 ж 70 4 7 646 ж 28 8 806 ж 9 1769 10 11 АнтиNS, ОП 0,85 0,78 0,48 Подтверждение в ИФТС ИФТС «спектр» Анти- Анти- Анти- Анти- результат Core NS3 NS4 NS5 ЛИА реактивность результат к антигенам *№ группы Пол Подтверждение Номер № п/п Скрининг КП Неопр. Неопр. полож 2 2 4 полож 1 полож 5 неопр 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 отр. отр. отр. 0 1,4 0 0 0 полож. 0,00 0 1,2 0 0 0 полож. 4,31 0,00 0,6 0 0 4,8 0 неопред. NS4 (3+) NS4 (3+) С2 (+), NS4 (3+) С1(+), С2(+) С1,2 (+), NS(3+) NS4 (3+) 2 2,68 0,00 0,318 0 1,6 1,6 0 полож. NS3 NS4 полож 1 51 5 2,18 0,00 0,4290 1,2 0 0 неопред. Е2 (3+) неопр 8 ж 29 11 1,10 0,00 0,325 0 0 1,2 0 неопред. отриц 6 670 ж 83 11 7,59 0,00 0,354 0 0 2,6 0 неопред. не обнаружена NS4 (3+) неопр 1 778 ж 74 11 2,75 0,00 0,434 0 0 1,48 0 неопред. NS4 (3+) неопр 1 261 При ложение 1. Продолжение таблицы 1 12 479 ж 28 11 3,28 0,00 0,223 0 4,4 0 0 неопред. NS4 (3+) неопр 8 13 490 ж 50 11 6,05 1,91 0 10 0 0 0 полож. С1+ NS3 + полож 5 14 372 ж 37 11 5,11 1,61 0 11,6 0 0 0 полож. С1 С2 полож 1 15 2193 м 29 8 5,49 0,00 1,86 0 9,2 1,2 0 полож. С1 NS3 NS4 полож 5 16 2246 м 42 11 3,14 0,00 0,52 0 0 2,72 0 неопред. NS4 (3+) неопр 1 17 1969 м 51 11 4,73 0,00 0,285 0 0 3,16 0 неопред. NS4 (3+) неопр 1 18 2006 м 61 11 1,40 0,00 0,5 0 10 0 0 неопред. NS3 неопр 1 19 2030 ж 22 11 3,94 0,00 0,3 0 0 2,52 0 неопред. NS4 (3+) неопр 1 20 1356 ж 32 11 1,60 0,00 0,251 0 5,2 0 0 неопред. Е2 неопр 8 21 1425 ж 23 11 3,60 1,90 0 1,64 0 0 0 полож. С1 С2 NS3 полож 5 22 1089 ж 25 2 4,88 0,00 0,26 0 0 1,16 0 неопред. NS4 (3+) неопр 1 23 1757 ж 67 11 2,54 0,00 0,3 0 0,992 0 0 неопред. NS3 неопр 1 24 2283 ж 17 8 4,34 0,00 0,3 0 0 2,68 0 неопред. NS4 (3+) неопр 1 25 1788 ж 81 11 10,74 0,00 0,22 0 0 2,8 0 неопред. NS4 (3+) неопр 1 26 1073 ж 77 11 7,18 0,00 0,25 0 0 3,32 0 неопред. NS4 (3+) неопр 1 27 576 м 85 11 5,04 0,00 0,4 0 0 3,64 0 неопред. NS4 (3+) неопр 1 262 Приложение 1. Продолжение таблицы 1 28 612 ж 46 11 5,34 0,00 1 0 3,52 0 0 неопред. 29 30 31 32 33 37 35 36 37 92 469 600 1614 2775 1666 99 197 922 ж ж ж ж м ж ж ж ж 25 45 49 36 51 35 25 76 50 11 11 11 11 6 2 11 11 11 1,41 2,56 2,77 1,36 2,94 3,20 3,06 2,23 1,07 0,00 0,00 0,00 1,36 0,00 0,00 0,00 0,00 1,69 0,25 0,25 0,6 0 0,62 0,8 0,38 0,63 0,51 0 0 0 1,12 0 0 0 0 1,28 0 1,2 0 0 0 1,2 1,4 0 1,08 1,6 0 2 0 0 0 0 4 1,24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 неопред. неопред. неопред. полож. отр. неопред. неопред. неопред. полож. 38 1038 ж 77 11 1,70 0,00 0,61 0 2,28 0 0 неопред. 39 40 41 2110 925 340 ж ж ж 24 28 64 4 2 11 4,47 2,56 3,25 0,00 1,41 0,00 1,1 0 0,27 0 1,24 1,72 0 0 1,32 4,8 0 0 0 0 0 неопред. полож. полож. 42 43 44 45 46 47 48 49 410 1932 1457 1838 1681 343 667 798 ж м ж м ж ж м ж 59 49 26 27 37 70 61 32 11 6 11 11 2 11 11 11 4,87 1,10 6,24 2,27 1,20 2,98 4,00 4,60 0,00 0,00 0,00 1,50 0,00 0,00 0,00 0,00 1,1 0,46 0,51 0 0,58 1,2 1 0,74 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6,8 1,04 0 0 5,2 5,2 0 0 0 0 2,4 4,4 0 0 0 0 0 1,52 0 0 0 0 отр. отр. неопред. полож. неопред. неопред. неопред. неопред. 50 2812 ж 27 11 1,56 0,00 0,24 0 1,48 0 0 неопред. 51 52 53 2827 1907 1537 ж ж ж 30 73 57 2 8 11 1,67 1,34 1,52 0,00 0,00 0,00 0,39 0,38 0,39 0 0 0 0 0 0 2,108 4 0 0 0 0 неопред. неопред. отр. не обнаружена NS4 (3+) NS3 NS4 (3+) С1 NS3 NS4 NS3 NS3 NS4 NS3 NS4 (3+) не обнаружена Е2 отриц 6 Неопр Неопр неопр полож неопр полож неопр неопр отриц 1 1 1 5 2 5 1 1 7 неопр 8 NS4 (3+) С2 NS3 С1 С2 NS3 NS4 NS3 NS4 С1 С2 NS3 NS3 С1 NS3 NS4 NS4 (3+) NS4 (3+) NS3 не обнаружена не обнаружена NS4 (3+) NS4 (3+) С1 NS3 неопр полож полож 1 5 5 полож полож неопр полож неопр неопр неопр отриц 4 4 1 5 1 1 1 6 отриц 6 неопр неопр полож 1 1 4 263 Приложение 1. Продолжение таблицы 1 54 1826 м 42 11 2,33 2,00 0 0 0 0 0 отр. 55 56 57 58 59 2063 3189 1026 1382 2468 м м ж ж ж 22 35 26 72 50 11 11 2 11 11 1,28 2,02 2,86 2,19 2,68 0,00 0,00 1,23 1,27 0,00 3,2 0,27 0,65 0,38 0,68 0 0 1,88 0 2,12 0 0 1,36 0 1,6 0 1,12 2,8 0 1,32 0 0 0 0 0 отр. неопред. полож. отр. полож. 60 1348 ж 36 11 3,96 0,00 1,6 0 0 0 0 отр. 61 1540 ж 34 2 3,70 0,00 1,8 0 0,8 0 0 неопред. 62 63 2271 2590 м ж 70 28 11 11 1,53 2,76 5,00 2,73 0,32 3,4 0 7,2 2 2 0 1,2 0 0 неопред. полож. 64 65 66 67 68 69 70 845 2986 1258 1752 1160 2032 1139 ж ж м м ж м ж 41 20 44 32 47 15 67 11 11 11 11 4 11 11 2,63 2,94 3,17 2,48 2,63 3,10 1,65 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,14 0,00 1,2 1 0,48 0,82 0,22 0 0,28 0 0 0 1,2 0 0 0 0 0 3,6 0 0 0 0 0 0 0 3,2 2,8 0 0 0 0 0 0,3 0 0 0 отр. отр. неопред. полож. неопред. отр. отр. 71 72 73 74 854 1627 1728 1893 м ж ж м 16 30 30 16 11 2 11 11 2,86 2,62 1,08 1,02 0,00 0,00 0,00 0,00 0,29 1,2 1,1 0,44 0 0 0 0 1,16 0 0 0 0 1,72 1,52 1,24 0 0 0 0 неопред. неопред. неопред. неопред. Примечание: *Описание групп см. в таблице 2.1 не обнаружена Е2 NS4 С1 NS3 NS4 С1NS3 NS4 С1 NS3 не обнаружена не обнаружена С1 С2 Е2 NS4 С1 NS3 не обнаружена NS4 (3+) NS4 (3+) NS3 NS4 (3+) NS4 (3+) С1 С2 не обнаружена NS3 NS3 NS4 (3+) NS4 (3+) отриц 3 полож полож полож полож отриц 4 5 1 4 7 отриц 3 полож 5 полож отриц 1 7 неопр неопр неопр неопр неопр полож отриц 2 2 1 9 1 2 3 неопр неопр неопр неопр 1 8 1 1 264 Приложение 2. Таблица 2 Сравнение результатов референсного исследования проб сыворотки крови (133) в ИФТС планшетного формата с раздельным выявлением антител к Core, NS3, NS4 и NS5-антигенам ВГС и в иммуноблоте «RecomBlot HCV IgG 2.0» (август, сентябрь, октябрь 2009 года) 81 Группа* ID 1 1243 Возраст, лет Скрининг № п/п ОП 11 0,544 Подтверждение 1 АнтиCore 0,34 АнтиNS 0,44 Подтверждение 2 АнтиCore ИБ АнтиАнти- АнтиNS3 NS4 NS5 0,24 0,38 0 Реактивность к антигенам, баллы Результат в РБ Группа* 0 NS3,Hel, NS4, Core 18 бал полож 5 2 49 73 11 0,598 0 0,26 0 0 0,7 0 0 бал отриц 6 3 84 71 11 0,93 0 0,45 0 0 0,9 0 0 бал отриц 6 4 196 85 11 0,303 0 0,7 0 0,35 0,72 полож 8 5 1871 28 2 0,722 0 0,37 0 0 0 0 NS3,Hel, Core 14 бал 0 Core 5 бал отриц 3 6 1985 69 4 0,843 0 0,24 0 0 0,31 0 0 бал отриц 6 7 1248 41 11 0,616 0 0,5 0 0 0,92 0 0 бал отриц 6 265 Приложение 2. Продолжение таблицы 2 8 1270 20 11 0,432 0 0,3 0 0 1 0 0 бал отриц 6 9 1642 77 11 0,352 0 0,26 0 0 0 0,9 0 бал отриц 6 10 1217 25 11 0,779 0 0,37 0 0 0,73 0 0 бал отриц 6 11 1685 66 11 0,336 0 0,31 0 0,29 0 0 NS4, 4 бал отриц 6 12 1777 72 11 0,485 0 0,35 0 0 0,35 0 0 бал отриц 6 13 1894 57 11 0,763 0 0,28 0 0 0,81 0 0 бал отриц 6 14 2005 30 11 0,295 0 0,24 0 0 0,47 0 0 бал отриц 6 15 438 71 11 0,4 0 0,49 0 0 2 0 0 бал отриц 6 16 173 45 11 1,149 0 0,53 0 0 2,3 0 0 бал отриц 6 17 963 29 11 0,637 0 0,36 0 0 0 0 0 бал отриц 3 18 1416 22 11 0,47 0 0,25 0 0,5 0 0 неопр 1 19 1638 31 11 0,649 0 0,65 0 0 1,2 20 1810 31 11 0,39 0,36 0,64 неопр полож 8 9 21 2435 74 6 0,267 0 0,25 0 0 0,8 0 0 бал отриц 6 22 2688 48 11 0,979 0 0,49 0 0 1,4 0 полож 5 23 2772 36 4 0,961 0 0,86 0 0 1 отриц 6 0,26 с з сз Ns3,Hel 6 бал 0 Ns3,Hel 6 бал 0,41 8 бал core NS3,Core 11 бал 0 0 бал 266 Приложение 2. Продолжение таблицы 2 24 1272 81 11 0,415 0,6 2,1 25 1542 42 11 0,374 26 1834 17 2 0,27 0 0,71 0 0 0,9 0 все полож 20 бал 0 NS3, Hel 6 бал 0 0 бал 27 1949 5 11 0,206 0 0,27 0 0,5 0 6 бал Ns3, 0 Hel неопр 1 28 2136 81 11 0,428 0 0,73 0 0,3 0 0 0 бал отриц 6 29 775 33 11 1,18 0 0,25 0 0 2,3 0 0 бал отриц 6 30 1104 70 11 2,845 0 1,2 0 0 0 0 0 бал отриц 3 31 701 52 11 0,233 0 0,358 0 0 0,5 0 0 бал отриц 6 32 2540 46 11 0,311 0 0,3 0 0 0,51 0 0 бал отриц 6 33 1761 43 11 1,264 0 0,71 0 0 1,4 0 0 бал отриц 6 34 1828 31 11 2,233 0 1,25 0 0 2,3 0 0 бал отриц 6 35 2202 54 4 0,352 0 0,37 0 0 0,6 0 0 бал отриц 6 36 2392 35 11 0,739 0 0,36 0 0,52 0 NS3, Hel, 0 Core 10 бал полож 5 37 2854 68 6 1,261 0 0,61 0 0 0 0 0 бал отриц 3 0 сз 0 1 0 0 0,4 0 полож 5 неопр 1 отриц 6 267 Приложение 2. Продолжение таблицы 2 38 1420 93 11 1,359 39 1925 70 11 0,29 0,3 1,9 0 1,6 0 0 0 0,33 0 0,3 0 Ns3 Hel NS4 Core 15 бал полож 5 6 бал Ns3 0 Hel неопр 1 6 бал Ns3 0 Hel неопр 8 40 2207 58 6 2,967 0 2,3 0 0 3,5 41 2747 27 11 0,577 0 0,4 0 0,8 0 0 0 бал отриц 6 42 2809 40 2 0,554 0,38 0 0,33 0 0 0 0 бал отриц 7 43 2816 30 11 1,306 0 0,9 0 0 0,9 0 0 бал отриц 6 44 207 83 11 0,792 0 0,37 0,27 0,39 0,4 0 NS3 Hel Ns4 core 18 бал полож 1 45 494 67 11 0,847 0 0,58 0 0 1 0 0 бал отриц 6 46 617 24 0,24 0,38 0 0 0 0 0 6 бал Ns3 0 Hel неопр 2 0 0 бал отриц 6 0 NS4 4 бал 0 NS5-12 2 бал отриц отриц 47 1066 29 11 3,136 0 1,3 0 0 2,7 48 1324 34 2 0,691 0 0,53 0 0,39 0 49 1381 27 11 0,617 0 0,36 0 0 0,89 6 6 268 Приложение 2. Продолжение таблицы 2 50 1697 27 11 1,201 0 0,62 0 0 0,86 0 Ns3 3 бал 0,9 отриц 6 0 отриц 7 0,28 NS4 4 бал 0 Ns3 Hel NS4 Core 18 бал отриц 7 полож 1 51 1703 52 11 1 463 0 0,9 0 0 52 638 57 11 0,871 0,3 0 0,29 0 0,3 53 450 53 11 0,68 0 0,47 0,28 0,67 0 54 1021 28 2 0,651 0 1,2 0 0 1,7 0 0 бал отриц 6 55 1143 74 4 1,661 0 0,38 0 0 0,78 0 0 бал отриц 6 56 1368 24 11 0,367 0 0,24 0,3 0,38 0,55 0,48 0 бал отриц 7 57 1676 79 11 0,435 0 0,26 0 0 0,33 полож 5 58 1077 57 11 0,456 0 0,33 0,2 1,1 0 18 бал Ns3 0 Hel NS4 Core полож 5 59 1708 32 8 0,387 0,36 0 0 0 0 60 2259 22 2 0,548 0,4 0 0 0 0 0 Hel 3 бал 0 Core 8 бал 61 21 11 0,958 0 0,36 0 1,85 0 Ns3 гелик 6 0 ,бал 615 0 Ns3 Hel NS4 Core 10 бал отриц 5 неопр 2 неопр 1 269 Приложение 2. Продолжение таблицы 2 62 73 71 11 2,2 0 0,64 0 0 1,45 Ns3 гелик 6 0 ,бал неопр 1 63 757 32 11 1,715 0 0,49 0 0 0,85 0 отриц 6 Ns3 0 Гелик, 6 бал неопр по N3 1 гел 3+ 64 547 59 11 1,476 0 0,35 0 1,7 0 65 875 75 6 1,056 0 0,6 0 0 0,94 Ns3, Hel, 0 6 бал неопр по N3 8 66 928 46 8 0,832 0 0,9 0 0 1,12 0 0 бал отриц 6 67 1320 47 11 2,423 0 0,9 0 0 0,42 неопр 5 68 1399 85 11 2 0 0,9 0 0 0,77 0 NS3 NS4 гелик 7 бал 0 0 бал отриц 6 69 1450 34 11 1,045 0 0,27 0 0 0,3 0 0 бал отриц 6 Ns3, Hel, NS4, Core 0 18 бал полож 1 70 342 38 11 0,463 0 сз 71 61 1 3 0,458 0 72 2145 22 11 1,251 73 52 11 0,79 297 0,3 0,5 0,3 0,37 0 0,27 0,37 NS3, гелик 0 6 бал неопр по N3 9 0,39 0,34 0 0 0 0 Core, 8 бал Неопр 2 0 0,7 0 1,75 0 Ns3, Hel, 0 Core, 14 бал полож 5 270 Приложение 2. Продолжение таблицы 2 74 304 85 11 0,661 0 0,34 0 0 0,72 0 0 бал отриц 6 75 1594 31 11 0,726 0 1,3 0 0 0,77 0 0 бал отриц 6 76 1482 20 2 0,946 0 0,56 0 0 0,39 0 0 бал отриц 6 77 20 11 2,8 0 1,4 0 0 1,76 0 0 бал отриц 6 неопр 1 514 78 543 49 8 1,645 0 2,1 0 3,45 0 Ns3, гелик 0 6 бал 79 595 58 11 1,426 0 1,1 0 0,7 0 Ns3, гелик 0 6 бал неопр 1 80 849 50 11 1,57 0 0,29 0 0 0,4 0 0 бал отриц 6 81 1555 56 11 0,863 0 сз 0 0 0,34 0 0 бал отриц 6 82 1147 24 11 2,507 0 0,33 0 0 0,7 0 0 бал отриц 1 83 1157 39 11 90 9 0 1,1 0 0 отриц 6 84 706 59 11 1,54 0 0,46 0 0 0,61 0 0 бал отриц 6 85 769 31 11 1,3 0,34 0 0,64 0 0 0 Core 8 неопр 9 неопр 1 полож 5 неоп 0,9 NS4, 4 бал 86 1528 61 11 2,175 0 0,48 0 0,846 0 Ns3, гелик 0 6 бал 87 1640 49 5 1,476 0 0,97 0 0,75 0 Ns3, гелик 0 NS4, 12 бал 271 Приложение 2. Продолжение таблицы 2 88 476 50 11 1,045 89 0 0,7 0 0 0,4 0 8 бал core неопр 8 NS3 Htl Ns4 0 5-12 полож 5 82 19 11 1,938 0 1 0 0,38 0 90 2061 31 11 0,348 0,52 0,76 0,3 0 0,36 0,26 0 бал отриц 7 91 1472 32 11 3,3 0 0,6 0 0 0,58 0 0 бал отриц 6 92 1598 39 11 1,249 0 0,65 0 0,3 0 NS3 Hel Ns4 0 10 бал полож 5 93 609 32 2 2,558 0 0,593 0 0 0 0 0 бал отриц 3 94 642 22 8 0,89 0 0,3 0 0 0,44 0 0 бал отриц 6 95 684 32 2 0,484 0 0,31 0 0,49 0 Ns3 гелик 6 0 ,бал неопр по N3 1 неопр по N3 1 96 807 74 11 1,132 0 0,5 0 0,88 0 Ns3 гелик 6 0 ,бал 97 835 46 11 2,15 0 0,77 0 1,3 0 Ns3 гелик 6 0 ,бал неопр по N3 1 98 1028 22 11 0,591 0 0,38 0 0 0,7 0 0 бал отриц 6 99 1059 61 11 0,817 0 0,45 0 0 0,3 0 0 бал отриц 6 25 4 1,3 0,48 0 0,6 0 0 0 положит 9 100 615 Core, 8 бал 272 Приложение 2. Продолжение таблицы 2 101 692 78 11 1 0 0,39 0,4 0,28 0,35 NS3 3+, Hel 0 3+, Core 8+ полож 1 102 50 39 11 0,99 0 0,8 0 0 0,67 0 0 бал отриц 6 103 408 33 11 1,27 0 0,5 0 0 0,49 0 0 бал отриц 6 104 810 55 11 0,361 0 0,4 0 0,6 0 0 NS4 4 бал отриц 9 105 1025 27 2 0,868 0 0,6 0 1,8 0 NS3, Hel. 0 6 бал неопр по N3 1 106 637 34 11 0,623 0,32 0 0,27 0 0 0 8 бал по кор неопр 9 107 650 25 11 0,791 0 0,26 0 0 0,34 0 0 бал отриц 6 108 177 28 11 2,263 0 0,54 0 0 0,83 0 0 бал отриц 6 109 242 21 11 0,983 0 0,22 0 0 0,31 0 0 бал отриц 6 110 1787 67 11 1,619 0 0,44 0 0 0,64 0 0 бал отриц 6 111 1347 23 11 1,048 0 0,52 0 0,5 0 0 0 бал отриц 6 112 603 49 11 0,961 0,3 0 0,55 0 0 0 8 бал кор неопр 9 113 1891 65 8 1,7 0 0,25 0 0 0,6 0 0 бал отриц 6 114 1968 22 11 0,5 0 сз 0 0 0,4 0 0 бал отриц 6 115 1644 30 11 1,69 0 0 1,6 0 отриц 6 0 1,28 0 бал 273 Приложение 2. Продолжение таблицы 2 116 1826 23 2 0,8 0 0,7 0 0 0,6 0 0 бал отриц 6 0 Сер. з. 0 0 0,4 0 0 бал отриц 6 117 1202 57 6 1,13 118 952 42 5 0,418 0 0,28 0 0 0,35 0 0 бал отриц 6 119 849 44 8 0,376 0 0,4 0 0 0,44 0 0 бал отриц 6 120 71 33 11 1,4 0 0,511 0 0 0,3 0 0 бал отриц 6 121 234 58 11 1,23 0 0,8 0 0 0,36 0 0 бал отриц 6 122 2298 39 6 0,744 0 0,53 0 0 0 0 0 бал отриц 3 123 1430 66 11 1,118 0 0,75 0,9 0 0 0 2 бал отриц 3 253 64 11 0,491 0 Сер. з. 0,3 0,3 0 Ns3, Hel, 0 Ns4,10 бал полож 8 125 531 23 11 0,677 0 0,83 0 0 2,7 0 0 бал отриц 6 126 173 60 11 1,767 0 0,9 0 0 1,2 0 0 бал отриц 6 127 1977 63 11 0,524 0 0,46 0 0 0,9 0 0 бал отриц 6 128 1754 23 11 0,384 0 0,44 0 0 0,3 0 0 бал отриц 6 129 147 79 11 0,933 0 0,5 0 0 0,5 0 0 бал отриц 6 130 418 22 11 0,555 0 0,25 0 0 0,3 0 0 бал отриц 6 124 274 Приложение 2. Продолжение таблицы 2 131 1525 20 11 0,609 132 0 0,4 0 0 0,8 0 0 бл отриц 6 384 16 11 0,598 0 0,25 0 0 0,5 0 0 бал отриц 6 133 1410 80 11 1 0 0,28 0 0 0,29 0 3 бал отриц 6 Примечание: *Описание групп см. в таблице 2.1 275 Приложение 3. Таблица 3. Результаты исследования проб с низкой позитивной оптической плотностью в скрининге в двух иммуноблотах: 1 2 3 скринин в ИФТС «Рекомби-Бест», ОП № п/п № и дата исследования «INNO-LIA HCV Ab III update» («Innogenetics», Бельгия) и «RecomBlot HCV IgG 2.0» (2007 г.) 1993 (28.9) 68 М , 11 (2.10) 1 1808 0,41 1,3 1826 (15.10) Подтверждение 2: (ОП) ИФТС Анти Анти-Core NS ИФТС core NS3 NS4 NS5 Реком Новг. Реком Реком Новг. Реком 1,3 0 0,37 0 0,42 0 0 0 0 Новг. 0,85 0 0 Новг. (15.10) 4 Подтверждение 1: (ОП) Реком 0,9 Не иссл. Не иссл. 0,28 0 0,38 Новг. 0,55 Реком 0,6 Новг. Не иссл. 0 Результат в ИФТС RecomBlot: результат, количество баллов (б.), реактивность к антигенам LIA: результат, интенсивно сть реактивнос ти к антигенам 0 0,4 0 Полож. Полож. Полож. отриц. 0 Полож. Отриц., 5 б. core +/неопред., 8 б. Core отриц., 5 б. Core +/Helic +/- Полож. Реком Новг. 0 Реком Не иссл. Не иссл. Новг. 0,7 0 0,29 Полож. Полож. полож., 11 б. Core + Helic + NS3 +/- отриц. С2+/NS3(2 +) NS4+/полож. С1 и С2+/NS3 (3 +) 276 Приложение 3. Продолжение таблицы 3 5 2243 0,79 Реком 0,4 0,4 18-10 Новг. 6 64пл 3,6 Реком 7 18-10 1656 0,4 Новг. Реком 8 9 26-10 1930/м 1877 ж 23/11 1 1,2 0,26 0,78 9,9 Полож. Неспециф. реакция 0 б. Отрицат. 0 3,8 0 Неопред. NS4 (3+) 1,32 0,55 0 0 Неопред. Неопр. отрицат., 0 б. Новг. Реком 0 0 0 0 Новг. 0,52 0 1 0 Полож. неопред., 8 б. Core + Реком 0 0 Реком Не иссл. Отриц. Неопредел., 8б. Новг. 1,1 0 Новг. Не иссл. 0,41 Полож. Core 3+ Отрицат., 0 б. Реком 1921/ж 11 13 30/11 1923/м 0 0 Реком Не иссл. Не иссл. 0 Новг. Новг. *1071 М, 6 4/12 10 797 3/12 Не иссл. Реком Реком 0,39 0,46 0,44 Полож. 0 0 0 Отриц. Полож. Новг. Реком 0 0,65 0,511 0 Новг. Реком 0 Не иссл. Новг. 0,33 0,56 Новг. Не иссл. Реком 0 0 Реком 0 0 0 Новг. 0 0,54 Новг. 0 0,47 0,34 Неопредел. Положит. С1 + NS4 (2+) Неопредел. , С1+/С2+/Неспецифи ч. реакция Положит., 12 б. Положит., Полож. Core 3+ NS4 + 0 Отриц. 0,66 Полож. Неопред., 8б. Core + С1+/С2 2+ NS3 +/NS4 + Неопред., С2 (1+) 277 Приложение 3. Продолжение таблицы 3 12 1541 0,47 Реком 0,49 с/з0,24 29/11 1937/м Новг. 0 0,35 13 1955 29/11 1968/ж 1 14 1650 29/11 1955/м 15 1673 29/11 1989/м 16 1785 13/12 1956/м/ 4к Реком 0 0 0,4 0,26 Полож. Новг. 0 0 0 0 Отриц. Отрицат., 0 б. Неопред., NS4 2+ отр. 0 б. Отрицат. отриц. Реком 0,6 0 Реком 1,6 0 0 0 Полож. Новг. 0 0,35 Новг. 0 0 0 0 Отриц. 1,9 Реком 0,5 0,6 Реком 0,6 0,5 0,3 0 Полож. 0 баллов. 1,8 Новг. Реком 0 1,1 0 0 Новг. Реком 0 1,2 0 0 0 0 0 0 Отриц. Полож.0 0,26 Новг. Реком 0 1,5 0 0 Новг. Реком с/з 0,22 0 0 0 0 0 0 0 Отриц. Отриц. отриц. Неопред., 8б. Core 3+ отр. 0 б. Новг. 0 0 Новг. 17 1180 1 10/12 1937/ж 18 333 1,48 18/12 1934/м Реком Новг. 0,7 0 1 0 Реком Новг. 1 Не иссл. Реком 0,9 0 Реком Новг. Новг. 0 0 19 1355 1,1 18/12 15лет/м Реком Не иссл. 0,42 Не иссл. 0 Реком 0 0 Новг. 0 0 Новг. Не иссл. 0,53 Отриц. 0,6 0,27 0 С1 3+ неопр. NS3 ( 2+) неопр. Полож. Отриц. Core +/отр. 5б. NS3 ( 2+) неопр. Полож. отр., 3 б. отриц. 0 Отриц. Helic + 0,3 0,3 Полож. 0 0 Отриц. Неспециф. реакция отриц.
