Материалы номера - Раздел сайта, посвящённый печатным

№ 3 (47)
Июль–Сентябрь 2013
Л.А. Тарасевич
профилактика•диагностика•Лечение
Свидетельство о регистрации средств массовой информации
ПИ № ФС77-53128 от 14.03.2013 г.
Учредитель журнала «БИОпрепараты»:
ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
Журнал напечатан в типографии:
«ПОЛИГРАФ-ПЛЮС»
Члены редколлегии:
Аллилуев А.П.
Балаболкин И.И.
Борисевич И.В.
Бунятян Н.Д.
Воробьева М.С.
Горбунов М.А.
Гущин И.С.
Игнатьев Г.М.
Медуницын Н.В.
Мовсесянц А.А.
Мосягин В.Д.
Озерецковский Н.А.
Сакаева И.В.
Саяпина Л.В.
Таточенко В.К.
Ткаченко Е.А.
Ярилин А.А.
Редакционный совет:
Амвросьева Т.В. (Беларусь)
Брико Н.И. (Москва)
Волчков В.Е. (Франция)
Гинцбург А.Л. (Москва)
Дятлов И.А. (Оболенск)
Зверев В.В. (Москва)
Кутырев В.В. (Саратов)
Львов Д.К. (Москва)
Михайлов М.И. (Москва)
Покровский В.И.(Москва)
Савченко В.Г. (Москва)
Учайкин В.Ф. (Москва)
Хаитов P.M. (Москва)
Чернушенко Е.Ф. (Украина)
Чумаков К.М. (США)
Дизайн и верстка:
ООО «ПОЛИГРАФ-ПЛЮС»
Подписано в печать: 13.09.2013
Адрес редакции: ФГБУ « НЦЭСМП»
Минздрава России,
119002, Москва, пер. Сивцев Вражек,41.
БИОпрепараты ПРОФИЛАКТИКА•ДИАГНОСТИКА•ЛЕЧЕНИЕ
Рецензируемый научно-практический журнал Федерального
государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы
средств медицинского применения» Министерства здравоохранения
Российской Федерации
BIOpreparation PREVENTION•DIAGNOSIS•TREATMENT
Scientific and practical journal of the Federal State Budgetary Institution
«Scientific Center for Expertise of Medical Application Products» of the
Ministry of Health of the Russian Federation
Главный редактор
Доктор медицинских наук, профессор Миронов А.Н.
Editor-in-Chief
MD Professor Mironov A.N.
Заместители главного редактора
Доктор медицинских наук, профессор Меркулов В.А.
Доктор медицинских наук, профессор Бондарев В.П.
Deputy Editor-in-Chief
MD Professor Merkulov V.A.
MD Professor Bondarev V.P.
Ответственный секретарь редакции
Кандидат биологических наук Супотницкий М.В.
Executive secretary of the editorial board
PhD Supotnitskiy M.V.
Научный редактор
Кандидат биологических наук Лебединская Е.В.
Science Editor
PhD Lebedinskaya E.V.
Контакты редакции
Тел.: 8(495)214-62-29
8(495)214-62-32
e-mail: biopreparaty@expmed.ru
Contact information
Tel.: 8(495)214-62-29
8(495)214-62-32
e-mail: biopreparaty@expmed.ru
Тираж 500 экз.
ISSN 2221-996X
on-line версия журнала www.biopreparaty-magazine.ru
Содержание
Обзоры
Reviews
Препараты рекомбинантных эритропоэтинов и их характеристика
Меркулов В.А., Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Гайдерова Л.А., Яковлев А.К., Медуницын Н.В.
5
Recombinant erythropoietin preparations and their characteristics
Merkulov V.A., Soldatov A.A., Avdeeva J.I., Alpatova N.A., Gayderova L.A., Yakovlev A.K., Medunitsyn N.V.
Феномен антитело-зависимого усиления инфекции у вакцинированных и переболевших
Миронов А.Н., Супотницкий М.В., Лебединская Е.В.
12
The phenomenon of antibody-dependent enhancement of infection in vaccinated and convalescents
Mironov A.N., Supotnitskiy M.V., Lebedinskaya E.V.
Оригинальные статьи
Original Articles
Выявление специфических иммуноглобулинов класса G в препарате Иммуноглобулин человека против
клещевого энцефалита методом ИФА
Ладыженская И.П., Воробьёва М.С., Саркисян К.А., Кузнецова Д.Д., Афонина О.С., Фадейкина О.В.
26
Detection of specific immunoglobulin G in human immunoglobulin preparations against tick-borne encephalitis virus
by ELISA
Ladyzhenskaya I.P., Vorobieva M.S., Sarkisyan K.A., Kuznetsova D.D., Afonina O.S., Fadeikina O.V.
Сравнительное изучение штаммов вируса гриппа для приготовления вакцин и диагностических препаратов
эпидемического сезона 2012–2013 гг.
Миронов А.Н., Лонская Н.И., Шевцов В.А., Саркисян К.А., Мефед К.М., Хамитова М.Ф.
36
Comparative study of influenza virus strains for the preparation of vaccines and diagnostic products
for epidemic season 2012-2013
Mironov A.N., Lonskaya N.I., Shevtsov V.A., Sarkisyan K.A., Mefed K.M., Khamitova M.F.
Доклинические исследования новой пятикомпонентной Вакцины АКДС-ГЕП В+ХИБ
Николаева А.М., Петровских В.П., Соснина О.Ю., Белякова О.В., Вязникова Т.В., Афанасьева Т.М.
Preclinical research of the new pentavalent DTP-HBV+HIB (Haemophilus influenzae type b) vaccine
Nikolaeva A.M., Petrovskikh V.P., Sosnina O.Yu., Belyakova O.V., Vyaznikova T.V., Afanasyeva T.M.
2
41
Хроника
Current News
Арташес Авакович Мовсесянц (к 70-летию со дня рождения)
Artashes Avakovich Movsesyants (on the 70th birth anniversary)
45
Лидия Васильевна Саяпина (к 60-летию со дня рождения)
Lidia Vasilievna Syapina (on the 60th birth anniversary)
46
Владимир Александрович Шевцов (к 55-летию со дня рождения)
Vladimir Alexandrovich Shevtsov (on the 55th birth anniversary)
47
Некролог
Obituary
Памяти Александра Александровича Ярилина
Memory of Aleksandr Aleksandrovich Yarilin
48
3
Препараты рекомбинантных эритропоэтинов
и их характеристика
Меркулов В.А., Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Гайдерова Л.А., Яковлев А.К., Медуницын Н.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
Recombinant erythropoietin preparations
and their characteristics
Merkulov V.A., Soldatov A.A., Avdeeva J.I., Alpatova N.A., Gayderova L.A., Yakovlev A.K., Medunitsyn N.V.
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expertise of Medical Application Products»
of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
Представлен обзор по лекарственным препаратам эритропоэтинов, получаемых на основе технологии рекомбинантной ДНК. В настоящее время наиболее эффективным методом лечения анемий, вызванных снижением
синтеза эритропоэтинов, является применение препаратов рекомбинатных эритропоэтинов (rHuEPOs). Эритропоэтин является гетерогенным гликопротеином, состоит из нескольких различных изоформ, образующихся преимущественно путем гликозилирования, биологическая активность разных изоформ эпоэтина различна. Физико-химические характеристики определяют такие свойства препарата, как стабильность, активность,
фармакокинетические и фармакодинамические параметры, иммуногенность, которые, в конечном итоге, влияют на профиль безопасности и эффективности его применения. Использование технологии рекомбинантной
ДНК для изготовления лекарственных препаратов rHuEPOs не позволяет получить полную копию оригинального стандартного препарата. Поэтому препараты rHuEPOs, выпускаемые разными фирмами, имеют отличия
по показателям качества (подлинности, рН, осмолярности, содержанию белка, биологической активности),
которые могут влиять на безопасность и эффективность их применения. Представлены сведения о зарегистрированных лекарственных препаратах эритропоэтинов, показаниях для их клинического применения. Обосновывается необходимость разработки единых требований, регламентирующих показатели качества лекарственных препаратов рекомбинантных эритропоэтинов, что не только позволит унифицировать требования к
данным препаратам как отечественного, так и зарубежного производства, но и повысит качество, безопасность и эффективность их клинического применения. Требования при оценке показателей качества препаратов рекомбинантных эритропоэтинов должны быть гармонизированы с международными нормативными документами и должны соответствовать современным научным достижениям.
Ключевые слова: лекарственные препараты эритропоэтинов, рекомбинантные белки эритропоэтинов, физико-химические свойства, биологическая активность, оценка качества, показания к применению.
Библиографическое описание: Меркулов В.А., Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Гайдерова Л.А., Яковлев А.К.,
Медуницын Н.В. Препараты рекомбинантных эритропоэтинов и их характеристика // Биопрепараты. 2013. № 3. С. 4–11.
The present review describes erythropoietin preparations on the basis of recombinant DNA technology. At present
the most effective method of treating anemia caused by decreased synthesis of erythropoietin, is using recombinant
erythropoietin preparations (rHuEPOs). Erythropoietin is a heterogeneous glycoprotein consisting of several
various isoforms built primarily by glycosylation. Biological activity of various epoetin isoforms differs. Physicochemical properties of a preparation induce the following characteristics: stability, activity, pharmacokinetic and
pharmacodynamic parameters, immunogenicity, which ultimately affect it’s safety and efficacy profile. The use of
recombinant DNA technology for the manufacture of rHuEPOs preparations does not allow to obtain an exact copy of the
original reference drug. Therefore, rHuEPOs preparations manufactured by variuos companies, differ in terms of quality
(identity, pH, osmolarity, protein content, biological activity), which may affect their safety and efficacy. The review
provides information on authorized erythropoietin medicines and their proposed clinical use. It justifies the necessity to
develop unified standards, regulating recombinant erythropoietin drug quality indicators, which allows not only to unify
the requirements for this type of medicines, both domestic and foreign manufacture, but also to improve their quality,
safety and efficacy of their clinical use. The quality requirements for the evaluation of recombinant erythropoietin
products must be harmonized with international regulations and must conform to modern scientific achievements.
Key words: recombinant erythropoietin preparations, recombinant erythropoietin proteins, physico-chemical properties,
biological activity, quality evaluation, proposed clinical use.
Bibliographic description: Merkulov V.A., Soldatov A.A., Avdeeva J.I., Alpatova N.A., Gayderova L.A., Yakovlev A.K.,
Medunitsyn N.V. Recombinant erythropoietin preparations and their characteristics // Biopreparation (Biopharmaceuticals).
2013. № 3. P. 4–11.
4
Обзор Review
Для корреспонденции:
Солдатов А.А. – главный эксперт Управления экспертизы аллергенов, цитокинов и других иммуномодуляторов
Центра экспертизы и контроля МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41,
e-mail: Soldatov@regmed.ru
Статья поступила 25.10.12 г., принята к печати 22.08.2013 г.
Многие заболевания и патологические состояния
сопровождаются снижением количества эритроцитов
и, соответственно, гемоглобина, что приводит к снижению “кислородной ёмкости крови” и развитию симптоматической анемии. Одной из причин данного вида
анемии является снижение или полное прекращение
синтеза эритропоэтина. Снижение синтеза эритропоэтина развивается на фоне таких тяжелых состояний,
как опухолевый процесс, почечная недостаточность,
СПИД и др. Лечение анемии у больных с данной патологией возможно с использованием только двух методов – гемотрансфузия (переливание крови) или введение в организм аналога эритропоэтина. В организме
эритропоэтин синтезируется в мизерных количествах,
поэтому единственным методом получения эндогенного аналога эритропоэтина является генно-инженерная
технология с использованием рекомбинантной ДНК.
Развитие биотехнологии, в первую очередь методов
генной инженерии и высокой степени очистки биопрепаратов, позволило значительно увеличить количество
и номенклатуру рекомбинантных эпоэтинов. Однако,
нормативные требования для оценки качества, проведения доклинических и клинических исследований препаратов рекомбинантных эритропоэтинов отсутствуют.
В данной работе представлен обзор основных показателей качества, которые необходимо учитывать при
разработке унифицированных требований при оценке
качества, безопасности и эффективности на этапах
разработки, проведения доклинических и клинических
исследований и регистрации препаратов рекомбинантных эпоэтинов.
дисульфидных связей между цистеинами. Молекула
эритропоэтина представляет связанные между собой
четыре α-спирали, которые свернуты в компактную
шаровидную структуру (рис. 1). Углеводы составляют
40–50% массы молекулы гликопротеина, при этом около 17% приходится на сиаловую кислоту. Молекулярная масса гликопротеина 32–36 кДа, расчетная масса
белковой части – 18,4 кДа. Изоэлектрическая точка
эритропоэтина низкая pI 3,5–4,0, что обусловлено наличием сиаловых кислот в терминальных отделах углеводных цепочек [3, 4].
А
Химическое строение, механизм синтеза
и основные функции эритропоэтина
Эритропоэтин является гликопротеином и относится к группе цитокинов I класса (семейство факторов
гемопоэтических клеток), поддерживающих жизнеспособность и пролиферацию кроветворных клеток.
Являясь основным регулятором эритропоэза, эритропоэтин стимулирует образование эритроцитов из
поздних клеток-предшественников и повышает выход
ретикулоцитов из костного мозга [1]. Впервые эритропоэтин был выделен и очищен из мочи больного
апластической анемией в 1977 году, молекула природного эритропоэтина состоит из 165 аминокислотных остатков. Эритропоэтин является гетерогенным
гликопротеином, состоящим из нескольких различных
изоформ, образующихся преимущественно путем гликозилирования [2]. Сахара присоединяются к протеину
в участках гликозилирования путем образования одной
О-связи (серин) и трех N-связей (аспарагин). Трехмерная структура эритропоэтина формируется за счет двух
Б
Рис. 1. Структура молекулы эритропоэтина. А – двумерная модель молекулы эритропоэтина: “=” – дисульфидная связь, М – манноза, G – галактоза, • – аминокислоты,
N – ацетилглюкозамин, N – ацетилгалактозамин.
Б – пространственная модель молекулы эритропоэтина.
5
Молекулы эритропоэтинов имеют сходное строение
у различных видов животных, гомология составляет
80 %.
У взрослого человека основное количество эритропоэтина синтезируется почками и до 10–15% синтезируется гепатоцитами и эпителиальными клетками, окружающими центральные вены. Сигналом к выработке
эритропоэтина в организме является снижение парциального давления кислорода в циркулирующей крови.
В норме содержание эритропоэтина в крови колеблется
в пределах 10–15 мМЕ/мл, что позволяет поддерживать
эритропоэз на уровне 1,8×109 ретикулоцитов в минуту.
Серьезное кровотечение может вызвать увеличение
продукции эритроцитов в 10–12 раз, за счет повышения
в плазме уровня эритропоэтинов до 10000 мМЕ/мл. Период полувыведения эритропоэтина составляет от 6 до
10 часов. В норме эритропоэтин выводится почками, попадая в мочу из крови, а не из клеток почек.
Нарушение синтеза эритропоэтина почками сопровождается снижением синтеза эритроцитов и
развитием анемии. Подавление активности эритропоэза развивается при патологии почек, при опухолевом процессе (в результате синтеза большого
количества провоспалительных цитокинов и химиотерапии), при действии факторов, подавляющих деление клеток (радиационное излучение и т.п.) и др.
Разработка технологии получения рекомбинантных
эритропоэтинов (rHuEPOs) открыла новую эру лечения анемий, обусловленных сниженным синтезом
эритропоэтина [6, 7].
Основные виды рекомбинантных эритропоэтинов
Эритропоэтин является первым цитокином, который был клонирован и получен в виде рекомбинантного белка. Эритропоэтин, полученный с использованием клеток насекомых (с вектором на основе
бакуловируса), имел молекулярную массу 23 кДа и
сниженное количество углеводных цепочек. В системе
in vitro биологическая активность данного эритропоэтина соответствовала нативному, однако в исследованиях in vivo была установлена его более низкая биологическая активность. Бактериальная система синтеза
рекомбинантного эритропоэтина не позволила получить гликопротеин, в котором гликозилирование соответствует (или подобно) нативному эритропоэтину
[8]. Известно, что бактериальная клетка имеет систему гликозилирования, принципиально отличающуюся
от эукариотической. Препарат, синтезированный в
системе клеток Escherichia coli, распознавался антителами против эритропоэтина и имел молекулярную массу, соответствующую дегликозилированному
эритропоэтину.
Наиболее удачными явились исследования Lin F.K.
с соавт. [9], которые первыми получили эритропоэтин в культуре клеток линии СНО (эпителиоподобные клетки из яичника китайского хомячка). Для этого
была использована плазмида, которая содержала ген
э­ритропоэтина человека под контролем промотора
поздних генов вируса SV40.
Для получения следующего рекомбинантного эритропоэтина использована линия клеток из почки хомячка (ВНК), в которые встраивали две плазмиды, одна
6
из которых содержала ген эритропоэтина человека,
другая – ген дегидрофолатредуктазы.
Разработка технологии получения rHuEPOs на основе клеток линии СНО позволила начать промышленный
выпуск лекарственных препаратов на основе рекомбинантных эритропоэтинов. Вопрос о том, какие критерии
должны быть положены в основу при определении МНН
рекомбинантным эритропопэтинам, рассматривались в 1989, 2009 и 2010 международной группой ВОЗ
(Consultation on International Nonproprietary Names),
которая ежегодно рассматривает вопросы, связанные
с присвоением МНН лекарственным средствам. При
появлении первых рекомбинантных эритропоэтинов
было мало информации об их физико-химических и
биологических свойствах. В дальнейшем, с появлением новых препаратов, стало понятно, что препараты
рекомбинантных эритропоэтинов различаются между
собой по степени гликозилирования. Практически невозможно в разных производственных условиях получить абсолютно идентичные препараты, даже при сходстве аминокислотной цепочки они будут отличаться по
качественным и количественным характеристикам полисахаридных цепочек. Поэтому было принято решение о том, что для определения МНН рекомбинантных
препаратов эритропоэтинов будет использоваться
корень – poetin, а приставка (префикс) будет определяться в зависимости от того, имеется или нет изменение аминокислотной цепочки. При неизмененной
аминокислотной последовательности добавляется “э”
(“е” в английском варианте) – эпоэтин. Для препаратов,
к­оторые имеют модифицированную последовательность аминокислот присоединяется другой префикс
(например, дарбэпоэтин). В настоящее время известны девять видов эпоэтинов (альфа, бета, гамма, дельта, эпсилон, каппа, омега, тета и дзета). К основному
наименованию добавляется буква греческого алфавита, которая характеризует особенности гликозилирования, фактически это отражает разработку нового
производственного процесса получения рекомбинантного эпоэтина.
Препараты рекомбинантных эритропоэтинов, зарегистрированные органами контроля стран ЕС (ЕМА),
США (FDA) и Российской Федерации, включенные в
государственный реестр лекарственных средств РФ,
представлены в таблице 1.
Американская компания «Amgen», разработав биотехнологию получения эпоэтина альфа в системе клеток
СНО, получила патент на препарат Epogen, после продажи патента компании «Johnson & Johnson», последняя
начала выпускать препарат с наименованием Procrit для
США и наименованием Eprex для других стран.
Эпоэтин бета, синтезируемый клетками СНО, был
разработан двумя фирмами «Roche» и «Chugai» и поступил на рынки под торговыми наименованиями NeoRecormon (Ф. «Roche») и Epogin (Ф. «Chugai»).
Следующим rHuEPO является препарат эпоэтин
омега, для синтеза которого были использованы клетки почки хомячка. Права на препарат Epomax приобрела фирма «Baxter», которая не стала дальше развивать
препарат.
Европейские фирмы «Transkaryotic» и «Aventis» разработали технологию получения препарата Dynepo
(эпоэтин дельта), который синтезируется опухолевыми
Обзор Review
Таблица 1. Зарегистрированные лекарственные препараты рекомбинантных эритропоэтинов
в Российской Федерации, странах ЕС, США
Торговое наименование
МНН
РФ
Страны ЕС (ЕМА)
США (FDA)
Epoetin alfa
Эпрекс
Эпокомб
Бинокрит
Эпокрин
Аэприн
Abseamed
Binocrit
Epoetin
Epogen
Epoetin beta
Рекормон
Эпостим
Эритростим
Эритропоэтин
Веро-Эпоэтин
NeoRecormon
Epoetin theta
Biopoin
Eporatio
Epoetin zeta
Retacrit
Silapo
Darbepoetin alfa
Аранесп
Aranesp
Aranesp
Methoxipoly-ethyleneglycol
epoetin beta
Мирцера
Mircera
Mircera
клетками фибросаркомы человека (НТ-1080). Среди
всех рекомбинантных препаратов, эпоэтин дельта имеет наибольшее сходство с нативным эритропоэтином,
в нем также не содержится N-гликолилнейраминовая
кислота. Препарат выпускался около года и затем по
коммерческим причинам его выпуск был прекращен.
В настоящее время фирма «Sanofi-Aventis» готовится к
выпуску препарата DynEpo (эритропоэтин сигма), также синтезируемого клетками фибросаркомы человека
(НТ-1080).
К воспроизведенным препаратам эпоэтина альфа
относится разработанный «Japan Chemical Research
Pharmaceuticals Co.» и одобренный Японским национальным органом контроля как препарат эпоэтин каппа. В странах ЕС разработаны и зарегистрированы
воспроизведенные препараты эпоэтина альфа: Binocrit («Sandoz»), Epoetin alfa Hexal («Hexal Biotech»), Abseamed («Medice Arzneimittel») и препараты эпоэтина
зета: Silapo («Stada») и Retacrit («Hospira») [10].
В Российской Федерации, по данным реестра лекарственных средств Министерства здравоохранения,
разработаны и выпускаются препараты эпоэтина альфа (ГосНИИ ОЧБ) и эпоэтина бета («Фармапарк», «Микроген», «Биннофарм», «Лэнс-Фарм» и ЗАО МТХ).
Рядом зарубежных фирм разработаны новые лекарственные препараты эритропоэтинов, характеризующиеся более высокой эффективностью. Одним из
путей повышения эффективности rHuEPOs является
увеличение времени циркуляции в крови препарата за
счет образования непрочной связи активного центра
эпоэтина с соответствующим рецептором на клетках,
что позволяет ему многократно активировать рецептор
к эритропоэтину. Этого можно достичь путем использования одного из двух подходов – за счет увеличения
молекулярной массы самого rHuEPO или в результате
его полимеризации. Фирма «Amgen» разработала препарат Дарбэпоэтин (эпоэтин альфа), в котором к аминокислотной цепочке присоединены 2 дополнительные
углеводные N-цепочки в положении Asn30 и Asn88. В
результате этого, количество сиаловых остатков увеличилось до 22, доля углеводного компонента повысилась до 52% молекулярной массы, которая составила
37,1 кДа.
Компания «Ф.Хоффманн-Ля Рош Лтд.» разработала
препарат Mircera, в котором молекула эпоэтина бета
присоединена к метоксиполиэтиленгликолю. Данная
комбинация позволила повысить молекулярную массу
до 60 кДа, при этом полимеризация rHuEPO вызвала
снижение сродства активного центра эритропоэтина к
соответствующему рецептору на клетках [6].
Физико-химические и биологические свойства
препаратов рекомбинантных эпоэтинов
Физико-химические характеристики определяют такие свойства препарата, как стабильность, активность,
фармакокинетические и фармакодинамические параметры, иммуногенность и др., которые в конечном итоге влияют на профиль безопасности и эффективности
применения лекарственных препаратов рекомбинантных эритропоэтинов.
Аминокислотная цепочка молекулы эритропоэтина
является стабильной структурой, а углеводная часть
молекулы может меняться. Например, олигосахариды
N-участков глизилирования могут содержать 2, 3 или 4
ответвления. В каждом из ответвлений в терминальном
отделе прикреплены отрицательно заряженные сиаловые кислоты, которые сообщают кислотные свойства
гликопротеину. Углеводы О-участка либо не содержат,
7
Рис. 2. Варианты гликозилирования: первый ряд – гликозилирование эпоэтина альфа, бета и т.п.; второй ряд – гликозилирование дарбэпоэтинов; третий ряд – углеводородные цепочки пегилированного эпоэтина (W. Jelkmann, 2007).
либо содержат до 2 сиаловых кислот (рис. 2).
Количество сиаловых остатков в молекуле HuEPOs
может достигать 14, что составляет около 17% от всех
углеводных компонентов в составе гликопротеина. Изучение рекомбинантного эпоэтина альфа показало его
неоднородность, которая включает присутствие изоформ с содержанием от 9 до 14 сиаловых кислот. По
данным международных исследований биологическая
активность разных изоформ эпоэтина различна [2, 4].
Количественный и качественный состав углеводной
части молекулы HuEPOs определяет стабильность и
специфическую, биологическую активность эритропоэтина [11–13]. При отщеплении всей углеводной части
молекулы rHuEPO с помощью гликозидаз наблюдается
потеря до 80% активности, оцениваемой в тестах in vitro. При ферментативной обработке гликозилированного эритропоэтина с удалением всех остатков сиаловой
кислоты происходит потеря активности эритропоэтина
in vivo, при сохранении активности in vitro. Более активное снижение активности in vivo связано с тем, что
при отсутствии в терминальном отделе углеводной
цепочки сиаловой кислоты, происходит связывание
гликопротеиновой цепочки эритропоэтина с азилалогликопротеином. Образующийся азило-эритропоэтин
активно выводится из организма с мочой. Поэтому, чем
больше сиаловых остатков в боковой цепи, тем больше
времени циркулирует rHuEPO в крови. В то же время,
чем меньше содержание сиаловых остатков в боковой
цепи, тем активнее rHuEPO взаимодействует с рецептором к эритропоэтину на клетках. Все эти данные указывают на существенную роль структуры углеводного
компонента для биологической активности эритропоэтина in vivo. По-видимому, более высокая активность
in vitro тех форм эритропоэтина, которые содержат неполный углеводный компонент, связана с облегчением
взаимодействий эритропоэтина с рецепторами. В то
же время, по-видимому, именно углеводный компонент
обеспечивает стабильность эритропоэтина в организме и соответственно высокий уровень биологической
активности в тестах in vivo. Следует отметить, что в
организме человека в печени происходит деградация
rHuEPOs, при которой происходит постепенное отщепление сиаловых кислот [5, 10].
Клинические испытания рекомбинантных эритропоэтинов показали, что особенности химического строения rHuEPOs определяют, прежде всего, фармакокинетические свойства препаратов. Например, эпоэтин
бета содержит большее количество основных изоформ, которые вызывают более активное связывание
с лектинами (Erythrina cristagalli, Lycopersicon esculen-
Таблица 2. Показатели фармакокинетических свойств рекомбинантных эритропоэтинов
при введении больным с анемией на фоне хронической почечной недостаточности
8
Эпоэтин альфа
Эпоэтин
бета
Дарбэпоэтин
(эпоэтин альфа)
Метокси-полиэтиленгликоль эпоэтин бета
Молекулярная масса (кДа)
29,9
29,9
37,1
60
Содержание углеводов (%) в молекуле
40
40
52
не определ.
Период полувыведения при в/в (ч)
4–6
4 – 12
21
134
Период полувыведения при п/к (ч)
24
13 – 28
73
139 – 142
Время достижения максимальной концентрации при п/к введении (ч)
12‑18
12 – 28
54
72 – 95
Биодоступность после п/к введения (%)
до 20
23 – 42
37
54 – 62
Количество введений при лечении анемии
в неделю
2
1–3
0,5 – 1
0,25 – 0,5
Обзор Review
tum, Phaseolis vulgaris и Agaricus bisporus), в сравнении
с эпоэтином альфа. В результате этого, биологическая
активность in vitro эпоэтина бета выше, чем эпоэтина альфа. При внутривенном введении здоровым добровольцам распределение препарата эпоэтина бета
выше (16,9%) в сравнении с эпоэтином альфа (7,7%),
а период полувыведения на 20% больше, в сравнении
с эпоэтином альфа. При подкожном введении эпоэтина
бета уровень ретикулоцитоза выше, чем при введении
эпоэтина альфа. Кроме того, при подкожном введении
болевые реакции на эпоэтин бета (0,08±0,06 ед) менее
выражены, чем на введение эпоэтина альфа (1,75±0,19
ед). Эффективность лечения в этом исследовании, составила для препарата эпоэтина альфа 48%, для эпоэтина бета ‑ 83% [11, 13].
Дарбэпоэтин отличается от двух предыдущих препаратов наличием двух дополнительных углеводных
цепочек в N области гликозилирования (рис. 2). Увеличение структуры и молекулярной массы в препарате
дарбэпоэтин позволило значительно повысить период
полувыведения rHuEPO до 21 ч при внутривенном введении и до 73 ч при подкожном введении, относительно
эпоэтинов альфа и бета (4–6 и 4–12 ч при внутривен-
ном введении и 24 и 13–28 ч при подкожном введении
соответственно) (табл. 2).
Полимеризация rHuEPO в препарате Мирцера, вне
зависимости от пути введения, привела к повышению
периода его полувыведения до 134‑142 ч. При этом
биодоступность препарата повышается с 20%, которая определяется у препаратов эпоэтина альфа, до
54–62% у пегилированных эпоэтинов. Данные особенности фармакокинетики позволяют при лечении пегилированным препаратом вводить препарат подкожно 1
раз в 2 недели, в то время как препарат эпоэтин альфа
– 2 раза в неделю. Кроме того, низкое сродство полимеризованного rHuEPO к рецептору эритропоэтина на
клетках, позволяет ему многократно активировать рецептор в течение длительного времени.
Оценка качества рекомбинантных эритропоэтинов
Использование технологии рекомбинантной ДНК
для изготовления лекарственных препаратов rHuEPOs
не позволяет получить полную копию оригинального
стандартного препарата. Поэтому препараты rHuEPOs,
выпускаемые разными фирмами, имеют отличия по по-
Таблица 3. Основные показатели качества лекарственных рекомбинантных эритропоэтинов,
включенные в спецификацию нормативной документации
Требования по показателям качества
Показатель
Эпоэтин
альфа
Эпоэтин
бета
Эпоэтин
зета
Эпоэтин
тета
Европейская
Фармакопея
Подлинность
ВЭКЭ
Изоформа 1
Изоформа 2
Изоформа 3
Изоформа 4
Изоформа 5
Изоформа 6
Изоформа 7
Изоформа 8
1–5%
4–22%
23–35%
27–41%
11–30%
0–5%
0–4%
5–29%
17–36%
21–27%
8–23%
2–17%
0–9%
0–4%
0–1%
0–2%
8–16%
19–34%
26–32%
15–30%
5 –12%
0 –2%
0–2%
0–2%
4–10%
11–20%
22–29%
27–35%
5–12%
0–2%
0–15%
0–15%
1–20%
10–35%
15–40%
10–35%
5–25%
0–15%
рН
6,7–7,3
7,0–7,4
7,0–7,4
6,3–6,7
Осмоляльность
225–275 мОсм/кг
260–300 мОсм/кг
272 – 286 мОсм/кг
Бактериальные
эндотоксины
Не более 10 ЕЭ/мл
Не более
10 ЕЭ/мл
Не более
2 ЕЭ/
10000 МЕ
Не более
20 ЕЭ/
100000 МЕ
90–110%
90–110%
95–105%
80–120%
Не менее 10,4 моль
/1 моль
Не менее 10 моль
/1 моль
Не менее 10 моль
/1 моль
Не менее 10 моль
/1 моль
70–140%
80–125%
80–125%
80–125%
Белок
Содержание сиаловых
кислот
(в пересчете на
ацетилнейраминовую
кислоту)
на 1 моль эритропоэтина
Биологическая
активность
Не менее 10 моль /
1 моль
9
казателям качества, безопасности и эффективности их
применения.
Наиболее подробно современные требования к
оценке качества рекомбинатных эритропоэтинов изложены в общей фармакопейной статье Эритропоэтин,
концентрированный раствор (Erytropoietin concentrated
solution), которая была включена в Европейскую Фармакопею в 2008 г. [14]. До этого момента каждый производитель представлял собственные требования для
оценки качества лекарственных препаратов рекомбинантных эпоэтинов. Поэтому в нормативных документах от разных производителей можно встретить существенные отличия по многим показателям качества
(табл. 3).
Одним из основных показателей качества rHuEPOs
является оценка специфической активности препарата, которая согласно Европейской фармакопеи (ЕФ),
определяется по активности ретикулоцитоза у нормоцитемических мышей при введении им испытуемого
препарата в сравнении со стандартным образцом. Отсутствие до 2008 г. единых требований к качеству препаратов rHuEPOs отразилось на включении в нормативные требования к эпоэтину альфа более широкого
предела допустимых значений по показателю специфической активности (70–140%) по сравнению с требованиями, введенными ЕФ (80–125%).
К характеристике подлинности, кроме определения специфической активности препарата, относится
оценка качественных и количественных показателей
молекулы эритропоэтина методом капиллярного зонного электрофореза. Согласно требований ЕФ, пики
изоформ 1– 8 на электрофореграмме исследуемого
rHuEPO сравнивают с электрофореграммой стандартного образца и рассчитывают площади соответствующих пиков. Нормативные требования по показателю подлинность, оцениваемому указанным методом,
для рекомбинантных эритропоэтинов, разработанных
разными производителями, существенно различаются. Например, изоформы 1 и 2 отсутствуют в эпоэтине
альфа, в эпоэтине бета количество изоформ 1 может
достигать 4%, а изоформ 2–29%, тогда как по требованиям ЕФ количество изоформ 1 и 2 может быть не выше
15% (табл. 3).
Следующими показателями для качественной и количественной характеристики подлинности молекулы
эритропоэтина являются электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг. При детектировании
результатов электрофореза должна выявляться одна
полоса, соответствующая по положению и интенсивности полосе стандартного образца. Аналогичные значения установлены и для результатов иммуноблоттинга.
Данные методы являются достаточно чувствительными
для количественной и качественной оценки молекулы
rHuEPOs.
В работе А. Шнайдер [15] приведены результаты
сравнительного изучения физико-химических свойств
препарата Эральфон (Россия) с препаратом Eprex
(США), который является признанным эталоном рекомбинантных эритропоэтинов. После удаления альбумина и концентрации исследуемых образцов при
одномерном вестерн-блот анализе в препарате Eprex
определялись слабые полосы в диапазоне значений
между 32 и 44 кДа, в препарате Эральфон, кроме по-
10
лос в этом диапазоне, установлено наличие дополнительных полос в области 50 и 60 кДа. Данные иммуноблоттинга свидетельствуют, что молекулярная масса
эритропоэтина в препарате Eprex находится в узком
диапазоне от 40 до 45 кДа, тогда как молекулярная
масса эритропоэтина в препарате Эральфон – в диапазоне от 32 до 45 кДа. Полученные автором результаты исследований свидетельствуют о более высокой
степени гликозилирования эритропоэтина в препарате
Eprex по сравнению с препаратом Эральфон. Установленные различия могут оказывать влияние на фармакокинетические характеристики препаратов.
Кроме указанных методов, для полной характеристики подлинности препаратов rHuEPOs должны быть
включены метод пептидного картирования и анализ
N-концевой последовательности. Среди зарегистрированных лекарственных препаратов рекомбинантных
эритропоэтинов различия по данным критериям отсутствуют.
Количественная характеристика рекомбинантных
эритропоэтинов включает определение содержания
белка и сиаловых кислот. Согласно спецификации,
диапазон допустимых пределов содержания белка в
препаратах rHuEPOs различных производителей соответствует 90–110%, т.е. указанные требования более высокие по сравнению с требованиями ЕФ – 80–
120%. Количественное содержание сиаловых кислот
(в пересчете на ацетилнейраминовую кислоту) на
1 моль эритропоэтина, регламентируемое нормативной документацией всех анализируемых препаратов 10–10,4 моль/1 моль, требования ЕФ – не менее
10 моль/1 моль.
Кроме различий между требованиями по показателям качества rHuEPOs, включенными в спецификацию
нормативных документов на препараты разных производителей и которые включены в ЕФ, имеются различия между показателями, которые не регламентированы ЕФ. Например, при более высоком значении рН
7,0–7,4 в препарате эпоэтина зета, значения осмоляльности выше и находятся в пределах 260–300 мОсм/кг,
относительно препарата эпоэтина альфа (6,7–7,3 и
225–275 мОсм/кг) и эпоэтина тета (6,3–6,7 и 272–286
мОсм/кг).
Кроме указанных в ЕФ показателей качества
rHuEPOs, необходимо учитывать, что все белковые рекомбинантные препараты очень чувствительны к составу вспомогательных веществ, от которых зависит стабильность многомерной структуры белковой молекулы
препарата.
Для поддержания стабильности молекул rHuEPO
в готовом препарате используется несколько подходов. Первые зарубежные препараты выпускались с
использованием набора аминокислот и альбумина в
качестве стабилизатора, затем альбумин был заменен
на полисорбат с глицином. Известны два основных состава вспомогательных веществ для рекомбинанатных
эритропоэтинов. В одном случае используется набор
аминокислот, мочевины, кальция хлорида и небольшие количества полисорбата-20 в нейтральном растворе фосфатного буфера. Второй состав базируется
на большом количестве полисорбата-80 и глицина в
нейтральном растворе фосфатного буфера. В обоих
случаях изотоничность раствора достигается за счет
Обзор Review
добавления натрия хлорида. В отечественных препаратах в качестве стабилизатора используется альбумин
человека.
О важности требований к составу вспомогательных
веществ, качеству первичной упаковки и условиям хранения биотехнологических препаратов свидетельствуют сообщения о серьезных нежелательных явлениях в
случае их нарушения или недостаточного обоснования
для использования. Так, в препарате Eprex (компании
Johnson& Johnson) в качестве стабилизатора изначально был использован альбумин сыворотки крови человека. Для снижения риска передачи с альбумином возбудителей вирусных инфекций, а также возбудителей
прионовых энцефалопатий человека, включая болезнь
Крейцфельдта–Якоба, в 1998 г. альбумин был заменен
на полисорбат-80 и глицин. При этом среди больных,
получавших препарат Eprex, участились случаи развития парциальной красноклеточной аплазии (ПККА) –
около 250 случаев за 3 года. Расследование причин
ПККА показало, что развитие аплазии связано с одной
серией препарата Eprex, в котором альбумин был заменен на полисорбат-80, препарат был расфасован
в шприцы с резиновыми поршнями, которые были не
покрыты защитным составом. Предполагается, что
контакт полисорбата-80 с латексом вызывал выщелачивание последнего, появление латекса в растворе
препарата инициировало более интенсивное проявление иммуногенности препарата и как следствие развитие ПККА [5].
Таким образом, гарантия качества лекарственных препаратов рекомбинатных эритропоэтинов, как
и других биотехнологических препаратов, должна
о­беспечиваться валидацией основных этапов производственного процесса, контролем качества промежуточных продуктов в процессе производства, контролем готовой лекарственной формы препарата, а
также адекватностью используемых аналитических
методов контроля, их валидацией, указанным набором оцениваемых показателей качества, включенных
в спецификацию.
Литература
1. Krantz S.B. Eerythropoietin // Blood. 1991. V. 77(3).
P. 419–434.
2. Storring P.L., Gaines Das R.E. The International
Standard for recombinant DNA-derived erythropoietins
and two higly purified human urinary erythropoietins //
J. Endocrinology. 1992. V. 134(3). P. 459–484.
3. Imai N., Kawamura A., Higuchi M. et al. Physicochemical
and biological comparison of recombinant human
erythropoietin with human urinary erythropoietin //
J. Biochem. 1990. V. 107(3). P. 352–359.
4. Sasaki H., Bothner B., Dell A., Fukuda M. Carbohydrate
structure of erythropoietin expressed in Chinese
hamster ovary cells by a human erythropoietin c DNA
// J. Biol. Chem. 1987. V. 262(25). P. 12059–12076.
5. Locatelli F., Pozzoni P., Del Vecchio L. Recombinant
human epoetin beta in the treatment of renal anemia
// Therapeutics and Clinical Risk Management. 2007.
V. 3 (3). P. 433–439.
6. Macdougall I.C. Novel erythropoiesis-stimulating
agents: a new era in anemia management // Clin.
J. Am. Soc. Nephrol. 2008. V. 3. P. 200–207.
7. Бабичева Л.Г., Поддубная И.В. Лечение анемии в
онкологии: роль нового стимулятора эритропоэза
Аранесп (дарбэпоэтин альфа) // Современная онкология. 2007. № 3. Т. 9. С. 69–74.
8. Dordal M.S. Wang F.F. Goldwasser E. The role of
carbohydrate in erythropoietin action // Endocrinology.
1985. V. 116. P. 2293–2299.
9. Lin F.-K., Suggs S., Lin C.-H. et al. Cloning and
expression of the human erythropoietin gene // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 7580–7584.
10. Goldsmith D. 2009: A Requiem for rHuEPOs—but
should we nail down the coffin in 2010? // Clin. J. Am.
Soc. Nephrol. 2010. V. 5. P. 929–935.
11. Storring P.L., Tiplady R.J., Gaines Das R.E. et al.
Lectin-binding assays for the isoforms of human
erythropoietin: comparison of urinary and four
recombinant erythropoietins // J. Endocrinol. 1996.
V. 150. P. 401–412.
12. Takeuchi M., Kobata A. Structures and functional
roles of the sugar chains of human erythropoietins //
Glycobiology. 1991. V. 1(4). P. 337–346.
13. Yuen C.T., Storring P.L., Tiplady R.J. et al. Relationships
between the N-glycan structures and biological
activities of recombinant human erythropoietins
producedusing different culture conditions and
purification procedures // Br. J. Haematol. 2003.
V. 121. P. 511–526.
14. European
Parmacopoeia
7.0
«Erythropoietin
Concentrated Solution». 2008. P. 1946–1950.
15. Шнайдер А. Сопоставление распределения изоформ фармацевтических препаратов эритропоэтина с использованием двумерного гельэлектрофореза // Клиническая нефрология. 2010.
Т. 2. С. 50–53.
11
Феномен антитело-зависимого усиления инфекции
у вакцинированных и переболевших
Миронов А.Н., Супотницкий М.В., Лебединская Е.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
The phenomenon of antibody-dependent enhancement
of infection in vaccinated and convalescents
Mironov A.N., Supotnitskiy M.V., Lebedinskaya E.V.
Federal State Budgetary Institution
«Scientific Centre for Expertise of Medical Application Products»
of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
Суть феномена антитело-зависимого усиления инфекции (antibody-dependent enhancement, ADE) состоит в усиление инфекционного процесса в присутствии антител, специфических к возбудителю инфекционной болезни.
ADE развивается в две стадии: внешнее ADE (extrinsic ADE, eADE) – вирусспецифическое антитело, образовавшее
комплекс с вирусом, посредством взаимодействия его Fc-фрагмента с рецептором Fc (FcR) и/или с рецепторами
комплемента на поверхности фагоцитирующих клеток, усиливают распространение вируса по фагоцитирующим
клеткам; и внутреннее ADE (intrinsic ADE, iADE) – комплексы «вирус-специфическое антитело», взаимодействующие с фагоцитирующей клеткой через Fc-рецепторы и рецепторы комплемента, запускают сигнальные механизмы, блокирующие ее антивирусную защиту и тем самым способствуют внутриклеточному размножению вируса.
Феномен ADE развивается при инфекционных процессах, и в ответ на вакцинацию и введение иммуноглобулинов. У ранее вакцинированного человека он может быть связан с: 1) неполноценной иммунизацией; 2) особенностями взаимодействия возбудителя инфекционной болезни с иммунной системой человека. Наиболее вероятно
развитие ADE у лиц, ранее вакцинированных в отношении вирусов, возбудителей инфекционных болезней, представителей семейств Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Parvoviridae,
Filoviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Picornaviridae, а также возбудителей туберкулеза. Предложен алгоритм доклинических исследований, имеющих целью обнаружение ADE и установление его природы.
Ключевые слова: антитело-зависимое усиление инфекции, вирус Марбург, вирус Эбола, флавивирусная инфекция, вирус
Денге, иммуноглобулин, ВИЧ, арбовирусы, энтеровирус 71, иммунный комплекс, геморрагическая лихорадка, вирус бешенства, ретроэлементы, вирус кори, вакцины.
Библиографическое описание: Миронов А.А., Супотницкий М.В., Лебединская Е. В. Феномен антитело-зависимого
усиления инфекции у вакцинированных и переболевших // Биопрепараты. 2013. № 3. С. 12–25.
The essence of the antibody-dependent enhancement (ADE) of infection phenomenon is that the infectious process
increases in the presence of antibodies, specific to the infectious agents. ADE has two stages of development: external ADE
(extrinsic ADE, eADE) – a virus-specific antibody forms an antibody-virus complex, by it’s Fc-fragment interaction with Fcreceptor-Fc (FcR) and/or with complement’s receptors on the surface of phagocytic cells, it increases viral shedding by
phagocytic cells, and inner ADE (intrinsic ADE, iADE) – «virus-specific antibody» complexes which interact with phagocytic
cells via Fc-receptors and complement’s receptors, triggering signaling mechanisms which block it’s antivirus protection
and thereby promote the intracellular virus replication. The phenomenon of ADE develops under the condition of infectious
processes and as a response to vaccination and immunoglobulin administration. In previously vaccinated person it may
be related to: 1) inadequate immunization, 2) features of interaction between the infectious agent and human immune
system. The data provided in the article shows that the immunity is not always resistance. Not all the immune reactions to
vaccination or an infectious process are defensive. Therefore it is necessary to develop methods of research allowing to
detect the possibility of ADE to vaccination or administration of specific immunoglobulins during the pre-clinical studies.
Key words: antibody-dependent enhancement, Marburg virus, flavivirus infection, dengue virus, immunoglobulin, HIV, arboviruses,
enterovirus 71, immune complexes, haemorrhagic fever, rabies virus, retroelements, measles virus, vaccines.
Bibliographical description: Mironov A.N., Supotnitskiy М.V., Lebedinskaya E.V. The phenomenon of antibody-dependent
enhancement of infection in vaccinated and convalescents // Biopreparats (Biopharmaceuticals). 2013. No. 3. P. 12–25.
12
Обзор Review
Для корреспонденции:
Супотницкий М.В. – заместитель директора Центра планирования и координации НИР
ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.
Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
123060, Москва, 1-й Волоколамский проезд, строение 10, корпус 4
e-mail: mikhail.supotnitzky@yandex.ru
Статья поступила 21.07.13 г., принята к печати 22.08.13 г.
В последнее десятилетие в научных журналах появилось большое количество публикаций об участии иммунной системы человека в патогенезе инфекционных
болезней [30, 31, 56, 68, 77, 79]. Провалом закончились
масштабные клинические испытания ВИЧ-вакцины,
разрабатываемой фармацевтическим гигантом Merck
KGaA в полном соответствии с общепринятыми представлениями о роли Т- и В-систем иммунитета в блокировании инфекционных процессов [60, 63]. Эти и
другие данные свидетельствуют о наличии обширных
пробелов в знаниях о тонких механизмах функционирования иммунной системы человека, что не может не
сказываться на эффективности иммунобиологических
лекарственных препаратов (ИЛП) и результативности
их экспертизы. Цель работы – обобщить имеющиеся
в научной литературе данные по феномену антителозависимого усиления инфекции у вакцинированных и
переболевших.
Формирование типовых представлений об иммунитете. Теория опсонинов, разработанная А.Е. Райтом и С. Дугласом в 1903 г. [8], примирила враждующие
между собой фагоцитарную (И.И. Мечников) и гуморальную (Р. Кох, П. Эрлих) теории иммунитета, и дала толчок
к ее дальнейшему развитию на основе представлений о
кооперации клеточно-гуморальных иммунологических
реакций. В последующие годы были описаны и апробированы иммунологические реакции и тесты с фагоцитирующими клетками и специфическими антителами,
уточнялся механизм их взаимодействия с антигенами.
В 1948 г. А. Фагреус доказала, что антитела синтезируются плазмоцитами. Иммунологическая роль Т- и
В-лимфоцитов была установлена в 1960-х гг., когда было
показано, что под влиянием антигенов В-клетки превращаются в плазмоциты, а из недифференцированных
Т-клеток возникает несколько субпопуляций, синтезирующих специфические к антигену антитела. В 1966 г. были
открыты цитокины Т-лимфоцитов, обуславливающие
кооперацию (взаимодействие) иммункомпетентных клеток. Сформулированная в 1964 г. Н. Йерне и Ф. Бернетом клонально-селекционная теория иммунитета дала
ученым понимание того, каким образом специфические
антитела могут накапливаться в достаточно высокой концентрации, чтобы эффективно блокировать инфекционный процесс. Подобный же механизм установлен и при
формировании клоноспецифических Т-клеток [7].
Сложившаяся в результате этих исследований типовая схема иммунного ответа выглядит следующим образом. Макрофаг поглощает (фагоцитирует) патогенный
микроорганизм (бактерия, вирус), инактивирует его и
презентируют его Т- и В-лимфоцитам. Ввиду различий
рецепторного аппарата В-клетки реагируют с одними
детерминантами, Т-клетки – с другими. Получив информацию об антигене от антигенпрезентирующих клеток
(макрофаги, несущие на внешней мембране антигены),
Т-хэлперы с помощью иммуноцитокинов передают сиг-
нал, усиливающий пролиферацию Т- и В-лимфоцитов
определенных клонов�1. В-лимфоциты дифференцируются до плазмоцитов, а Т-хелперы превращаются в
Т-киллеры (Т-эффекторы). Плазмоциты синтезируют
специфические антитела, участвующие в иммунном
ответе в трех формах: нейтрализации, опсонизации
и активации системы комплемента (гуморальный иммунный ответ); Т-киллеры разрушают клетки-мишени
при непосредственном контакте (цитотоксический или
клеточный иммунный ответ). После первичного контакта с антигеном остаются клоны Т- и В-клеток памяти,
сохраняющие информацию о нем много лет. При вторичном попадании этого антигена в организм человека
происходит стимуляция клонов, и они начинают быстро
размножаться. В-клетки переходят в плазмоциты, продуцирующие антитела нужной специфичности. Т-клетки
обеспечивают клеточную форму защиты (субпопуляции
цитотоксических Т-клеток и Т-клеток воспаления) и участвуют в формировании гуморального иммунитета –
хелперные Т-клетки [1, 2, 7].
В соответствие с этой схемой иммунитет – это невосприимчивость. Все гуморальные и клеточные реакции, развивающиеся в ответ на введение вакцины или
развитие инфекционного процесса, имеют защитный
характер.
Феномен антителозависимого усиления инфекции (antibody-dependent enhancement, ADE). Феномен ADE впервые описан R. A. Hawkes в 1964 г. [34],
обнаружившим повышение продукции различных флавивирусов (японского энцефалита, энцефалита долины
Мюррей и др.) в клетках куриного эмбриона, впервые
экспонированных к вирусам, находящимся в среде с
низким содержанием специфических антител. В последствие он привел доказательства, что увеличение
«выхода» вируса в подобных экспериментах вызвано
образованием комплекса «вирус–антитело» [35]. Эти
данные настолько расходились с общепринятыми представлениями о защитной роли антител в инфекционном
процессе, что их посчитали артефактами. Однако в конце 1960-х и начале 1970-х гг. уже другими исследователями обнаружена роль ADE в патогенезе тяжелых форм
геморрагической лихорадки, вызванной вирусом Денге
(dengue virus, DENV). Было установлено, что наличие
антител в сыворотке крови реконвалесцента, оставшихся после легко перенесенных случаев лихорадки Денге,
приводит к тяжелому течению болезни, если произошло
повторное заражение DENV другого серотипа [30, 31].
Систематически феномен ADE изучается с конца
1980-х гг. [72]. Суть феномена ADE состоит в усиление
инфекционного процесса в присутствии антител, специфических к возбудителю инфекционной болезни.
Т-хелперы 1 (Th1) – преимущественно способствуют развитию клеточного иммунного ответа, активируя Т-киллеры;
Т-хелперы 2 (Th2) – активируют В-лимфоциты, способствуя
развитию гуморального иммунного ответа.
1
13
ADE развивается в две стадии:
внешнее ADE (extrinsic ADE, eADE) – вирусспецифическое антитело, образовавшее комплекс с вирусом,
посредством взаимодействия его Fc-фрагмента2 с рецептором Fc (FcR) 3и/или с рецепторами комплемента
на поверхности фагоцитирующих клеток, усиливает
распространение вируса по фагоцитирующим клеткам;
внутреннее ADE (intrinsic ADE, iADE) – комплексы «вирус–специфическое антитело»4, взаимодействующие с
фагоцитирующей клеткой через Fc-рецепторы и рецепторы комплемента, запускают сигнальные механизмы,
блокирующие ее антивирусную защиту и тем самым
способствуют внутриклеточному размножению вируса.
В основном феномен ADE проявляется в ответ на
образование антител изотипа IgG1 [37]. У людей имеются три типа рецепторов Fc, которые связывают IgG:
это сиалогликопротеины FcγRI, FcγRII и FcγRIII (CD16).
FcγRI наиболее представлен на моноцитах/макрофагах человека, и он связывает IgG с наибольшей авидностью. Поэтому ему принадлежит «лидерство» среди
других рецепторов макрофагов в реализации феномена ADE. ADE, показанный в условиях in vitro, не обязательно воспроизводится в условиях in vivo [45].
Феномен ADE характерен для инфекционных процессов, вызываемых вирусами, имеющими следующие
особенности: а) обычно они реплицируются в макрофагах; б) индуцируют продукцию большого количества
антител с низкой способностью к нейтрализации гомологичных вирусов; в) способны к персистентной инфекции, характеризующейся продолжительной виремией
[73]. Феномен ADE также обнаружен при инфекционных
процессах, вызываемых бактериальными патогенами,
но изучен фрагментарно. Например, порообразующий
токсин золотистого стафилококка – лейкоцидин, усиливает свое токсическое действие, если в крови человека
содержатся специфические к нему антитела [85]. Такой
же эффект вызывают моноклональные антитела к токсиFc-фрагмент Ig (кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина, fragment crystallizable region, Fc region) – концевая
часть молекулы иммуноглобулина, которая взаимодействует с
Fc-рецептором на поверхности клетки и с некоторыми белками системы комплемента. Другая часть антитела называется
Fab (от англ. Fragment antigen binding), и состоит из двух вариабельных участков, определяющих специфичность мишени,
которую связывает антитело. Fc-фрагменты антител одного
класса консервативны.
3
Fc-рецепторы (Fc receptors) – представляют собой семейство
молекул, каждый член которого распознает иммуноглобулин
одного или нескольких родственных изотипов. Рецепторы этого
типа входят в состав суперсемейства иммуноглобулинов. Fcрецепторы для иммуноглобулинов присутствуют на поверхности
мононуклеарных лейкоцитов, нейтрофилов, нормальных клетоккиллеров, эозинофилов, базофилов и тучных клеток. Взаимодействуя с Fc-областью иммуноглобулинов разных изотипов, эти
рецепторы стимулируют, например, фагоцитоз, противоопухолевую цитотоксическую активность и дегрануляцию тучных клеток.
4
Этот процесс отличается от образования иммунных комплексов, приводящих к развитию так называемых иммунокомплексных болезней (ревматоидный артрит, сывороточная
болезнь, системная красная волчанка и др.) тем, что комплексы «вирус–специфическое антитело» не вызывают прямого
повреждения тканей и органов. Их патологическое действие
проявляется через усиление инфекционного процесса. Более
подробно с патогенезом иммунокомплексных болезней можно ознакомиться по монографии Н.А. Константиновой [4].
ну А патогенных клостридий [36]. Имеются косвенные
доказательства причастности феномена ADE к прогрессированию туберкулезной инфекции и Ку-лихорадки.
При аэрозольном инфицировании M. tuberculosis мышей 57BL/6, дефицитных по рецептору FcγIIB, патологические изменения у них развиваются через 30 сут, у
интактных мышей через 20 сут [49]. В условиях in vitro
показано, что антитела к C. burnetii I фазы стимулируют
ее размножение в макрофагах более эффективно, чем
антитела к этому же микроорганизму II фазы [61, 65].
Возможно, что первое описание ADE оставил Д.К.
Заболотный, наблюдавший в 1899 г. в Вэнчане (Монголия) появление пустулезной формы чумы у больного с бубонной чумой на пятые сутки после введения
противочумной сыворотки. Он объяснил это явление
примерно так, как сегодня объясняют ADE – антитела
к возбудителю чумы распространили его по фагоцитирующим клеткам и усилили инфекционный процесс
[3]. Можно предположить, что из-за низкого качества
противочумной сыворотки, примененной Д.К. Заболотным, и ненадлежащих условий ее хранения во время
экспедиции к очагам чумы в Монголии, антитела к возбудителю чумы утратили нейтрализующее действие,
но сохранили способность взаимодействовать с FcR.
eADE. Феномен наблюдается в двух вариантах:
а) комплемент-опосредованное
антителозависимое усиление инфекции (complement-mediated ADE;
C-ADE); и б) независящее от комплемента и связанное с Fc-рецептором усиление инфекции (Fc-receptormediated ADE; FcR-ADE) [68, 73] (рисунок 1).
В таблице 1 обобщены сведения по вирусным и бактериальным инфекциям, сопровождающимся феноменом еADE.
2
14
Рис. 1. Общая схема развития феномена eADE при вирусных инфекциях. А. Взаимодействие между антителом и
FcR на поверхности макрофага. Б. Фрагмент С3 комплемента (компонент комплемента, после присоединения которого весь этот комплекс приобретает способность прилипать
к различным частицам и клеткам) и рецептор комплемента
(complement receptor; CR) способствуют присоединению вируса к клетке. В. Белки комплемента С1q и С1qR способствуют присоединению вируса к клетке (в составе молекулы C1q
имеется рецептор для связывания с Fc-фрагментом молекулы
антитела). Г. Антитела взаимодействуют с рецептор-связывающим сайтом вирусного белка и индуцируют его конформационные изменения, облегчающие слияние вируса с мембраной.
Д. Вирусы, получившие возможность реплицироваться в данной клетке посредством eADE, супрессируют антивирусные
ответы со стороны антивирусных генов клетки. По[68]
Обзор Review
Таблица 1. Инфекционные болезни, сопровождающиеся феноменом еADE*
Инфекционная
болезнь
Возбудитель болезни
(семейство)
Тип ADE
Примечание
Источник
Вирусные инфекции
ВИЧ/СПИД
Human immunodeficiency virus, FcR-ADE, На ранней стадии инфекции феномен реализуется через V3-петлю gp120 [38, 62,
HIV, ВИЧ (Retroviridae)
C-ADE, (по типу FcR-ADE). По типу C-ADE феномен начинает проявляться перед
72]
клиническим прогрессированием ВИЧ-инфекции
Инфекционная
анемия лошадей
Equine infectious anemia virus,
EIAV (Retroviridae)
FcR-ADE Показано обострение болезни у вакцинированных лошадей и пони, как [42, 81]
следствие присутствия антител, индуцированных введением инактивированной цельновирионной вакцины или рекомбинантной вакцины, полученной на основе поверхностного гликопротеина EIAV
Иммунодефицит
кошек
Feline immunodeficiency virus,
FIV (Retroviridae)
FcR-ADE Вакцинирование оболочечным рекомбинантным белком вируса усилива- [39, 59,
ет виремию. Усиление клинических признаков болезни у кошек при росте
70]
титров антител к коровому белку (core protein) FIV
Инфекционный
перитонит кошек
Feline infectious peritonitis
virus, FIPV, (Coronaviridae)
FcR-ADE Феномен ADE проявляется при инфицировании вирусом того же серотипа,
в отношении которого был иммунный ответ
[39]
Лихорадка Эбола
Вирус Эбола (Filoviridae)
FcR-ADE, Сыворотка, взятая от мышей, иммунизированных ДНК вакциной с геном
C-ADE поверхностного гликопротеина вируса Zaire, вызывает ADE
[69]
Лихорадка
Марбург
Вирус Марбург
(Filoviridae)
Гепатит С
Вирус гепатита С (Flaviviridae)
Желтая лихорадка
Viscerophilus tropicus
(Flaviviridae)
Корь
Measles virus (Paramyxoviridae)
Энцефалит Западного Нила
West Nile virus, WNV
(Flaviviridae)
C-ADE
ADE вызывают субклассы IgG, с высокой афинностью к фактору комплемента C1q
[53]
Энцефалит долины Мюррей
Murray Valley encephalitis virus,
MVEV (Flaviviridae)
Нет
данных
Антитела к вирусу японского энцефалита в субнейтрализующих концентрациях увеличивают вирусемию и смертность среди мышей, зараженных
MVEV. Авторы выражают опасение, что программы по вакцинации населения к вирусу японского энцефалита в тех районах, где одновременно с
ним циркулирует и MVEV, могут способствовать развитию эпидемии энцефалита долины Мюррей
[80]
Лихорадка Денге
Dengue virus, DENV, DV
(Togaviridae)
FcR-ADE Геморрагическая лихорадка развивается при перекрестном инфицировании любым из серотипов вируса
[12]
Энтероинфекции
и патология ЦНС
Human enterovirus 71, EV71
(Picornaviridae)
FcR-ADE Корреляция между ADE и тяжелым течением болезни
[33]
Бешенство
Вирус бешенства
(Rhabdoviridae)
Нет
данных
Антитела к вирусу усиливают инфицирование макрофагов в условиях in [15, 44,
vitro через образование иммунных комплексов. Предполагается связь этого
58]
феномена с «ранней смертью» от бешенства у вакцинированных животных
Алеутская болезнь норок
Aleutian disease virus, ADV
(Parvoviridae)
FcR-ADE
Комплекс «ADV–антитело» осаждается на ренальных гломерулярных мембранах
или стенках капиллярных сосудов почек, вызывая летальный гломерулонефрит
C-ADE
ADE наиболее выражен при инфекции, вызванной вирулентный изолятом
Angola
[56]
FcR-ADE ADE рассматривается как основная причина, мешающая созданию эффективных вакцин
[58]
FcR-ADE ADE рассматривается как основная причина нейровирулентности вируса [14, 29]
и тяжелого течения болезни. Показана связь ADE с антителами к гликопротеину Е вируса
FcR-ADE ADE вызывают антитела к гемагглютинину Н. Авторы связывают с ADE
случаи так называемой атипичной кори, когда она развивается у ранее
вакцинированных людей и протекает в тяжелой форме
[41]
[57]
Бактериальные инфекции
Стафилококковая Лейкоцидин Пантон-Валентина
инфекция
(Panton-Valentine leukocidin,
PVL) – пороформирующий
цитотоксин золотистого стафилококка (Micrococcaceae)
Клостридиоз
Токсин A, toxin TcdA Clostridium
difficile (Clostridiaceae)
Туберкулез
M. tuberculosis
(Mycobacterium tuberculosis
complex)
Нет
данных
Антитела к PVL, присутствующие в крови большинства людей, усиливают
действие PVL, повышая патогенность PVL-продуцирующих S. aureus
[85]
FcR-ADE Моноклональные антитела к токсину А усиливают его поражающее действие
[36]
FcR-ADE
[49]
(предположительно)
У мышей 57BL/6, дефицитных по рецептору FcγIIB, при аэрозольном
инфицировании M. tuberculosis патологические изменения развиваются
медленнее, чем у интактных мышей
Coxiella burnetii
Нет
Антитела к C. burnetii I фазы стимулируют ее размножение в макрофагах
(Rickettsiella)
данных
* За основу взята таблица, опубликованная нами ранее [10].
Лихорадка Ку
[61]
15
Безоболочечным вирусам (non-enveloped viruses),
образовавшим комплекс с антителом, способным взаимодействовать с Fc-рецептором, специфические рецепторы на поверхности клетки-мишени не требуются
[68].
Компонент комплемента С15, связывая Fc-фрагмент
антитела, инициирует классический путь активации
комплемента, в результате чего активируется компонент комплемента С3, ковалентно (!) связывающийся
или с антителом или с поверхностью вирусной частицы. Образовавшийся комплекс способен взаимодействовать с рецепторами комплемента на поверхности
клетки посредством С3, усиливая взаимодействие вируса с клеткой. Альтернативно C1q-субъединица непосредственно может перекрестно связывать вирусный
белок и C1q-рецепторы (C1qR) на поверхности фагоцитирующих клеток. Все перечисленные эффекты находятся в зависимости от концентрации антител.
iADE. Толчком к исследованиям блокирующего действия ADE на антивирусную защиту клетки послужили
данные, полученные при изучении причин развития
хронических артритов у реконвалесцентов, перенесших острую форму болезни, вызванную вирусом Росс
Ривер (Ross River virus, RRV). Такие артриты могут
длиться до года, делая пациента на весь этот период
неработоспособным. В синовиальной жидкости пациентов с хроническими артритами обнаружены антигены RRV и γ-интерферон (IFN-γ), что свидетельствует о
хронической RRV-инфекции. При попытке ее воспроизвести на линиях мышиных макрофагов и первичных
человеческих моноцитов/макрофагов6 (primary human
monocytes/macrophages) установлено, что инкубирование RRV с разбавленной специфической сывороткой
приводит: 1) к супрессии синтазы оксида азота 2 (nitric
oxide synthase 2, NOS2) и, соответственно, к снижению
продукции активных радикалов азота (reactive nitrogen
radical); 2) прекращению экспрессии генов интерферон-регулирующего фактора 1 (interferon regulatory factor 1, IRF-1) и фактора ядра каппа-би (nuclear factor-κВ)
и, соответственно, к подавлению синтеза фактора некроза опухолей альфа (tumor necrosis factor alpha, TNFalpha) и IFN-γ; 3) заметному увеличению синтеза интерлейкина-10 (interleukin-10, IL-10). Лигирование FcγR с
комплексом антитело-зимозан в присутствии RRV не
вызывало вышеописанного эффекта [47, 48]. Следовательно, увеличение продукции вируса клетками при
ADE вызвано не только увеличением возможностей для
взаимодействия вируса с поверхностью макрофагов,
но и подавлением их собственной системы защиты от
вирусов (innate cellular immunity) [76].
Классификация феномена ADE. Приведенные
данные позволяют нам предложить классификацию
феноменов ADE по двум принципам: по типу рецептора, с которым вирус взаимодействует на поверхности
моноцитов/макрофагов (С-ADE и FcR-ADE), и по механизмам развития ADE (рисунок 2).
5
С1 – компонент комплемента. Его субъединица C1q имеет
рецептор для связывания с Fc-фрагментом молекулы антитела.
6
Моноциты образуются в костном мозге из гемопоэтических стволовых клеток-предшественников. Они циркулируют
в кровяном русле 1–3 сут, затем созревают в резидентные макрофаги и дендритные клетки. Моноциты – наиболее активные
фагоцитирующие клетки периферической крови.
16
Рис. 2. Классификация ADE
Первая классификация удобна для изучения феномена ADE в условиях in vitro, например, для установления границ феномена среди близкородственных видов
вирусов на клетках культур тканей, содержащих, либо
наоборот, не содержащих Fc- и CIq-рецепторы; либо
при их блокировании специфическими мАТ (см. таблицу 1). Границы феномена ADE устанавливаются с
помощью специфических сывороток к вирусам близкородственных видов. Вторая классификация – для
воспроизведения ADE в условиях in vivo при разработке
ИЛП и их доклинических и клинических исследованиях.
Феномен ADE, развивающийся на фоне «сенсибилизации», вызванной предшествующим инфекционным процессом. Наиболее изучен среди других
проявлений феномена ADE, поэтому мы рассмотрим
его более подробно, чем остальные. Опережающим
объектом исследований при изучении феномена данного типа является геморрагическая лихорадка Денге – острая трансмиссивная инфекция, распространенная в странах Южной и Юго-Восточной Азии, Африки,
Океании и Карибского бассейна.
Возбудитель лихорадки Денге – оболочечный (+)
ssРНК-вирус7, четыре серотипа которого (DENV1–
DENV4) относятся к арбовирусам семейства Togaviridae
рода Flavivirus (арбовирусы антигенной группы В). Передача возбудителя инфекции среди людей осуществляется комарами Aedes aegypti, среди обезьян – A. albopictus.
Клинически болезнь характеризуется развитием геморрагического диатеза и тенденцией к развитию шокового состояния (шоковый синдром Денге), который может
привести к смерти. Отдельные вспышки болезни могут
охватывать сотни тысяч человек. Ежегодно в мире не менее 50 млн человек заболевают лихорадкой Денге [25].
Схема жизненного цикла DENV в отсутствие специфических антител представлена на рисунке 3.
После проникновения DENV в эндосомы, клетка запускает механизмы антивирусной защиты [74], в частности, экспрессию интерферонов (IFN). Оба типа интерферонов – тип I (α, β) и тип II (γ) способны блокировать
репликацию DENV, если происходит его распознавание
эндосомальными рецепторами: toll-подобный рецептор
3 (toll-like receptor, TLR-3)8 – распознает двухцепочечную
РНК (dsRNA) вируса; TLR8 – распознает G-богатые олигонуклеотиды; и TLR7 – распознает ssРНК.
7
(+)ssРНК означает, что вирус содержит одноцепочечную
(single-stranded, ss) плюс-цепь РНК, которая используется им
в качестве мРНК и генома.
8
Toll-подобный рецептор – рецептор системы иммунитета, подобный рецепторному белку Toll плодовой мушки
(Drosophila).
Обзор Review
Рис. 3. Жизненный цикл DENV в отсутствие специфических антител. Вирус проникает в клетку по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза. Клеточная мембрана впячивается внутрь клетки, формируя окаймленные ямки.
Внутриклеточная сторона окаймленной ямки в основном включает белок клатрин (clathrin). В зависимости от серотипа
вируса или типа клетки, вирус при рН 6,0 сливается со стенкой ранней эндосомы и покидает ее, либо это происходит
при рН 5,0–6,0 уже в поздней эндосоме. В эндоплазматическом ретикулуме (endoplasmic reticulum, ER) (+)РНК транслируется на рибосомах с образованием отдельного полипротеина, который в последующем процессируется с помощью
аутопротеаз и клеточных протеаз на 7 неструктурных белков (NS1, 2A, 2B, 3, 4A, 4B и 5) и три структурных белка: C (капсид), prM (прекурсорный мембранный белок, precursor membrane protein) и E-белок. Неструктурные белки инициируют
репликацию РНК вируса, prM и E-белки формируют гетеродипмеры, которые ориентированы в просвет эндоплазматического ретикулума, где происходит частичная сборка вирионов. РНК вируса ассоциируется с С-белком и формирует
нуклеокапсид, который «одевается» липидной мембраной, содержащей гетеродимеры prM- и Е-белков. Из цитоплазмы
клетки вирионы выводятся через сеть Гольджи, где происходит их созревание – prM расщепляется сериновой протеазой фурином с образованием растворимого pr-белка и М-белка. pr-белок остается ассоциированным с Е-белком во
время экзоцитоза, предотвращая преждевременное слияние вирионов с участками сети Гольджи, имеющими кислые
значения рН. Попав в нейтральную среду межклеточного пространства pr-белок диссоциирует, и вирусная частица становится способной вызывать инфекционный процесс, т.е. созревшей. По [25]
В цитоплазме вирусную РНК «узнают» цитоплазматические РНК-геликазы (cytoplasmic RNA helicases)9,
RIGI (retinoic-acid inducible gene 1) и MDA5 (melanoma
differentiation-associated gene 5). Активация TLR индуцирует экспрессию провоспалительных цитокинов:
IL8, IL12, IFN-α и IFN-γ. Положительная регуляция экспрессии IL8, осуществляется через ядерный фактор
каппа-би (NF-κB). Экспрессия IFN активирует STAT1 и
усиливает экспрессию IRF1 (IFN regulatory factor 1), что
приводит к усиленной продукции активных радикалов
азота (NO). Комбинированное действие интерферонов и NO вызывает антивирусное состояние у сосед9
Геликазы – ферменты, расплетающие двухцепочечные
ДНК или РНК у вирусов, бактерий и эукариот.
них клеток (antiviral state) и ограничивает размножение
DENV в инфицированных клетках соответственно [75].
При первичном инфицировании человека DENV
иммунные ответы на вирус мало отличаются от тех,
что описаны в классической схеме иммунного ответа,
приведенной выше. Специфичные в отношении DENV
B- и T-клетки формируются приблизительно через 6
сут после инфицирования и полностью контролируют
развитие инфекции. Вирион DENV распознается антителами, специфичными к белкам E и prM. Структурная
организация этих белков у «созревшего» и «несозревшего» вируса различается. Следовательно, различаются и их специфические эпитопы. Доминирующую роль
в нейтрализации вируса играют антитела к белку prM
17
«с­озревшего» вируса. Нейтрализующая активность
специфических к DENV антител проявляется на двух
уровнях: 1) блокирование взаимодействия вируса с
клеточным рецептором; 2) блокирование слияния вируса с клеточной мембраной вследствие связывания
антителами петли слияния белка Е. Антитела к prM «несозревшего» вируса обладают перекрестной активностью к DENV всех серотипов, но их нейтрализующая
активность незначительна [22, 50].
Репликация DENV, как и любого другого РНК-вируса,
сопровождается большим количеством ошибок. Вызвано это тем, что все молекулы вирусной РНК реплицируют через ассиметричную транскрипцию с одной
цепи, исключающую большинство корректирующих
механизмов, характерных для репликации ДНК. Поэтому первичный инфекционный процесс при лихорадке
Денге сопровождается полиморфизацией DENV и образованием квазиспецифичных производных в пределах его серотипа. Иммунная система реагирует на них
выработкой специфических антител [46].
При вторичном инфицировании человека DENV гетерологичного серотипа стимулируются клоны В-клеток
памяти, сохраняющие информацию о DENV, инфицировавшем человека первично. Они дифференцируются в плазмоциты, продуцирующие антитела к вирусу
(его квазипроизводным), который они запомнили, а не
к тому, который вызвал инфекцию. Этот иммунологический феномен называется феноменом первичного
антигенного греха или антигенным импринтингом10.
Усиление инфекционного процесса происходит еще
до того, как концентрация антител достигнет порога,
необходимого для нейтрализации вируса. Продуцируемые плазмоцитами антитела «узнают» DENV, вызвавший инфекционный процесс, но не нейтрализуют
его. Они формируют с вирусом комплекс и связывают
его с Fc-рецептором на поверхности макрофагов (феномен FcR-ADE), тем самым усиливая инфекционный
процесс. Одновременно происходит гомогенизация
популяции DENV, так как на этапе eADE преимущества
в инфицировании макрофагов/моноцитов получают
лишь те квазипроизводные DENV, в отношении которых
плазмоцитами вырабатываются антитела, способные
связать их с Fc-рецепторами [25, 46]11 (рисунок 4).
Изменения в клетке, связанные с iADE, начинаются
раньше, чем DENV покинет эндосому. Точный механизм
развития iADE не установлен. Имеющиеся знания позволили [25] описать его следующим образом.
Комплекс «DENV–специфическое антитело» через
рецептор Fc запускает негативные регуляторы экспрессии TLR3, TLR4, TLR7 и TLR-сигнальных молекул. В результате слабой экспрессии этих рецепторов вирус,
проникший в эндосому, не узнается клеткой, эффективной экспрессии генов, кодирующих и­нтерфероны
10
Более подробно феномен первичного антигенного греха
при инфекционных процессах будет рассмотрен в следующем
сообщении.
11
Однако в слюнных железах переносчиков DENV – комаров, гетерогенизация вируса возобновляется [46]. Мы объясняем это тем, что у членистоногих хорошо развита «питательная среда» для вируса – фагоцитарная система, однако
для гуморальных факторов их иммунной системы характерно
отсутствие высокой специфичности, присущей антителам позвоночных (см. в работе [5]).
18
Рис. 4. Механизм eADE при геморрагической лихорадке Денге. А. Вторичное инфицирование пациента DENV.
На различных стадиях инфекции происходит дивергенция
DENV. Уже существующие специфические антитела могут
блокировать инфекционный процесс, если они встретились
с тем его серотипом, который вызвал первичную инфекцию,
или, наоборот, усиливать его через механизм ADE, если возбудитель болезни представлен вирусом другого серотипа.
Б. Гипотетический механизм гомогенизации популяции
DENV на этапе eADE. По [46]
и синтез противовоспалительных цитокинов IL8, IL12,
не происходит. Одновременно блокируется экспрессия IRF1, что тормозит продукцию активных радикалов
азота12. Подавление системы противовирусной защиты клетки приводит к длительному размножению в них
DENV, и к увеличению выхода зрелых вирусных частиц
[46]. Однако только персистированием DENV в макрофагах iADE при лихорадке Денге не ограничивается.
По сигнальным путям, инициируемым через рецептор Fc, запускается экспрессия гена IL-10, макрофаг начинает продуцировать большие количества IL-10, ингибирующего синтез противовоспалительных цитокинов
(IFN-γ, IL 2, 3, 12 и др.) и усиливающего синтез фактора
некроза опухолей (TNF) и IL 6, вызывающих повышенную
проницаемость сосудов [86]. IL-10 также нарушает дифференциацию Т-хелперов на субпопуляции Th1 и Th2,
что ведет к нарушению взаимодействия между клеточными и гуморальными звеньями иммунной системы при
блокировании размножения DENV [19]. Лихорадка Денге развивается в тяжелой клинической форме.
Исследования, проведенные с целью выяснить, какие аминокислотные замены структурных и неструктурных белков различных серотипов DENV (мутации в их
генах) ассоциируются с тяжелым течением болезни, не
дали результатов. Повышенная виремия и высокие количества IL-10 в сыворотке крови всегда сопровождают тяжелое состояние больного. Других объяснений
тяжелых осложнений при геморрагической лихорадке
Денге, кроме как вовлечения в патогенез болезни ADE,
пока не предложено [46, 76].
Феномен ADE, развивающийся без предварительной «сенсибилизации» иммунной системы. A.
Takada et al. [67–69] показали, что ADE при инфекционном процессе, вызванном вирусом Эбола (субтип
Zaire), развивается в результате взаимодействия образующихся вирусспецифических антител с вирусом
и Fc1-рецептором или компонентом комплемента
C1q и его рецептором (C1ADE) у макрофагов. Используя м­оноклональные антитела, исследователи локализовали такие эпитопы у GP вируса субтипа Zaire, и
12
Подробное описание iADE при лихорадке Денге можно
найти в работах [25, 76].
Обзор Review
сконструировали химерные эпитопы, индуцирующие
продукцию антител у мышей со сниженной способностью вызывать ADE, но обладающих нейтрализующей
активностью в отношении вируса субтипа Zaire. Феномен ADE был менее выражен для не опасного для человека субтипа Reston, чем для вирусов субтипов Zaire и
Sudan. Авторы данных работ предположили, что феномен ADE играет важную роль в патогенезе лихорадки
Эбола (рисунок 5).
Рис. 5. Модель C-ADE (C1q-ADE) при лихорадке Эбола.
A. Схематическое изображение белков комплемента C1 и C1q.
Молекула C1q включает глобулярный и лигандсвязывающий
домены. Глобулярный домен состоит из шести глобулярных
набалдашников (globular heads), которые связываются с Fc1участком антитела. Лигандсвязывающий домен C1q взаимодействует с лигандом на поверхности фагоцитирующей клетки. Аффинитет C1q к лиганду снижается при ассоциации с C1r
и C1s (сериновые протеазы). Б. Механизм ADE при лихорадке
Эбола. Вирус Эбола инициирует инфекционный процесс путем связывания со специфическими рецепторами на поверхности фагоцитирующей клетки (1). C1q связывает комплекс
«вирус–антитело» с C1q1-лигандами, расположенными на поверхности клеток, вызывая взаимодействие между вирусом и
рецептором (2). Диссоциация C1r и C1s от C1q увеличивает
связывающий аффинитет молекулы C1q с лигандами на поверхности фагоцитирующей клетки (3). По [68]
Для лихорадки Марбург феномен ADE был описан в
2011 г. Так же как для субтипов вируса Эбола, показана связь между ADE и вирулентностью изолятов вируса
Марбург. Авторами делается вывод, что феномен ADE
лежит в основе патогенеза не только лихорадок Марбург и Эбола, но и других филовирусных геморрагичес­
ких лихорадок [56].
Феномен ADE, развивающийся в ходе персистирующего инфекционного процесса. Феномен
ADE лежит в основе патогенеза болезни многих персистирующих инфекционных процессов. Например,
клинически выраженный кошачий инфекционный перитонит, вызываемый FIPV (семейство Coronaviridae),
развивается у кошек, уже имевших антитела после ранее перенесенной бессимптомно инфекции, либо на
фоне персистирующей инфекции в случае мутации вируса, приведшей к появлению его н­ового а­нтигенного
варианта. Отличить же вирулентные штаммы FIPV от
н­евирулентных в прямых опытах на животных, не удается [78, 79].
Алеутская болезнь норок вызывается парвовирусом
(Aleutian disease virus, ADV) из семейства Parvoviridae.
ADV патогенен для норок всех цветных вариантов. Основной источник вируса – переболевшие норки-вирусоносители, выделяющие вирус с мочой, калом и слюной.
Репликация ADV в макрофагах сопровождается секрецией плазматическими клетками большого количества
антител, не обладающих способностью нейтрализовать
вирус. Эти антитела образуют иммунные комплексы с
ADV, увеличивающие инфицированность макрофагов и
вызывающие образование не нейтрализующих антител.
«Порочный круг» замыкается осаждением комплекса
«ADV–антитело» на ренальных гломерулярных мембранах или стенках капиллярных сосудов почек, что приводит к летальному гломерулонефриту [57].
Но наиболее неожиданную роль феномен ADE играет при ВИЧ-инфекции. Для ВИЧ он показан в конце
1980-х гг. [38, 62], но до сих пор игнорируется разработчиками ВИЧ-вакцин.
У ВИЧ-инфицированных людей соблюдается определенная очередность проявления вариантов развития
eADE. На ранней стадии инфекции феномен реализуется
через V3-петлю gp120 (по типу FcR-ADE); по типу C-ADE
феномен начинает проявляться перед клиническим прогрессированием ВИЧ-инфекции [72]. Клиническое значение феномена ADE для ВИЧ – это прогрессирование
инфекции и облегчение переноса вируса от матери к
плоду [28]. Вне контекста представлений о роли ретровирусов в эволюции клеточных форм жизни и роли ADE
в эволюции ВИЧ, процесс накопления разных вариантов
ВИЧ в популяциях людей выглядит случайным, как проявление некой способности ВИЧ «постоянно меняться».
Но случайностей в этом процессе нет.
По данным А. Takeda et al. [71], в условиях in vitro
добавление к клеткам моноцитов сыворотки ВИЧинфицированных людей в субнейтрализующих концентрациях значительно усиливает репликацию вируса,
т.е. на ранних этапах выработки антител к новому серотипу вируса основную роль в усилении инфекционного
процесса играет феномен ADE. Высокие концентрации
такой сыворотки в условиях in vitro показывают вируснейтрализующую активность. Следовательно, ВИЧ не
удается «увильнуть» от специфических антител, однако блокирования инфекционного процесса специфическими антителами в условиях in vivo не происходит.
Высокая скорость мутаций при обратной транскрипции
и высокая скорость репликации ВИЧ генерируют большое количество серовариантов ВИЧ. Особенно этот
процесс дает о себе знать после появления антител к
вирусу и перехода болезни в асимптоматическую стадию.
Как только уровень антител, нейтрализующих данный серотип ВИЧ, достигает определенного порога,
селекционируется вариант вируса, способный избегать их нейтрализующего действия [17]. Выработка
антител к нему начинается заново. И вновь путем вовлечения в инфекционный процесс феномена ADE новому серотипу вируса обеспечивается распространение по клеткам, содержащим на своей поверхности
Fc-рецептор (ранняя стадия инфекции) и рецептор
комплемента (перед клиническим п­рогрессированием
19
ВИЧ-инфекции). С каждым новым серовариантом
вируса цикл повторяется. Скорость появления как
ВИЧ-нейтрализующих антител, так и избегающих их
вирусов, варьируют у разных лиц, однако сам цикл
многократно повторяется на протяжении жизни ВИЧинфицированного человека и больного СПИДом [26],
приводя к росту генетического разнообразия ВИЧ.
Только по мере истощения иммунной системы и, соответственно, работы маховика ADE, гетерогенизация
ВИЧ прекращается. Эту закономерность хорошо иллюстрируют данные R. Shankarappa et al. [64].
У ВИЧ-инфицированных пациентов, так называемых умеренных прогрессоров (moderate progressors),
в пределах асимптоматической стадии ВИЧ-инфекции
R. Shankarappa et al. [64] выделяют три фазы дивергенции и три фазы роста разнообразия ВИЧ. Под дивергенцией (divergence) эти авторы понимают различия
между нуклеотидной последовательностью исходного
вируса и последовательностью вируса, полученного от
ВИЧ-инфицированного человека через какое-то время
после инфицирования. Под разнообразием (diversity) –
различия в нуклеотидных последовательностях ВИЧ в
данной временной точке (рисунок 6).
Приведенные R. Shankarappa et al. [64] данные показывают, что в раннюю фазу инфекции развиваются
оба процесса; промежуточная фаза характеризуется
непрерывным увеличением дивергенции ВИЧ, но стабилизацией или даже снижением его разнообразия;
поздняя фаза проявляется снижением темпа или даже
стабилизацией процессов дивергенции и формирования разнообразия вируса. Результатом работы такого
механизма являются: 1) массивное распространение
ВИЧ по фагоцитирующим клеткам; 2) повышение его
вирулентности за счет отбора вариантов, тропных к рецептору CXCR4.
По данным Zhang H. et al. [87] увеличение генетического разнообразия вируса субтипа С у детей зависит
от антител с широким нейтрализующим действием.
Чем выше титр таких антител, тем больше на данный
момент времени вирусы различаются между собой.
То, что ВИЧ меняется не сам, а его в ходе инфекционного процесса меняет иммунная система с помощью
феномена ADE и специфических антител, выглядит
странно только в контексте медицинского подхода к
пониманию ВИЧ/СПИД-пандемии. ВИЧ относится к семейству Retroviridae. Вирусы этого семейства интегрируют свою ДНК-копию (провирус) с геномом хозяина
в единую молекулу ДНК. Если ретровирус становится
частью генома вида, то вид считается прошедшим через эндогенизацию. Эндогенные ретровирусы активны
в геноме вида и его видов-потомков до 6 млн лет. Они
передаются вертикально, инициируя наращивание его
генетического материала образованием своих новых
копий; усложняя геном образованием новых экзонов
из интронов и/или увеличивая количества генов, подвергающихся альтернативному сплайсингу [9, 10, 13,
20, 21].
Феномен ADE, развивающийся на фоне «сенсибилизации», вызванной вакцинацией. Осложнения
после вакцинации, возникающие как следствие феномена ADE, до настоящего времени не стали объектом
системных исследований, поэтому сведения о них носят разрозненный характер (таблица 2).
20
Рис. 6. Схематическое изображение развития ВИЧинфекции у умеренных прогрессоров. Диаметры кругов
приблизительно соответствуют разнообразию (diversity)
вирусной популяции от сероконверсии (первый круг). Вертикальное смещение кругов показывает степень дивергенции вирусной популяции (divergence) от предкового
штамма (founder strain). Затенения соответствуют пропорции вирусной популяции, представленной X4-генотипом.
Вертикальные линии (начиная с левой стороны схемы)
соответствуют: окончанию стадии острой инфекции; пику
вирусного разнообразия; стабилизации дивергенции от
предкового штамма; развитию СПИДа. В начале поздней
фазы дивергенции (роста разнообразия) количество X4вариантов ВИЧ начинает снижаться. Эта фаза проявляется нарушением гомеостаза Т-клеток. Количество CD4+
T-клеток снижается до уровня <200 клеток/мм3, появляются симптомы выраженного поражения клеточной системы
иммунитета, болезнь переходит в стадию СПИДа. Теперь
разнообразие вариантов вируса идет на убыль, так как иммунная система истощена и уже не способна раскручивать
маховик его эволюции. По [64]
Феномен ADE у ранее вакцинированного человека
может быть связан с: 1) неполноценной иммунизацией; 2) особенностями взаимодействия возбудителя инфекционной болезни с иммунной системой человека.
Неполноценная иммунизация. Причинно-следственная связь ADE с неполноценной иммунизацией подробно изучена на примерах инактивированной коревой
вакцины и инактивированной вакцины против респираторного синтициального вируса (respiratory syncytial
virus, RSV) [27, 43]. Обе вакцины получают путем инактивации вирусов формальдегидом. C начала 1960-х гг.,
т.е. после начала массовых иммунизаций населения
против кори вакцинами, инактивированными формалином13, среди вакцинированных людей отмечаются
случаи так называемой атипичной кори (кори, протека13
В России такая вакцина не используется.
Обзор Review
Таблица 2. Феномен ADE, развивающийся как ответ на вакцинацию*
Вирус (семейство)
Доказан в условиях in vitro
Доказан в условиях in vivo
Источник
РНК-вирусы
Вирус гриппа А (Orthomyxoviridae)
+
+
[86]
Респираторный синтициальный вирус (Paramyxoviridae)
+
+
[10]
Вирус кори (Paramyxoviridae)
+
+
[29]
Вирус бешенства (Rhabdoviridae)
+
+
[48, 62]
Вирус кошачьего инфекционного перитонита (Coronaviridae)
+
+
[87]
Вирус свиного репродуктивного и респираторного синдрома
(Coronaviridae)
+
+
[88]
Вирус обезьяньей геморрагической лихорадки (Coronaviridae)
+
+
[77]
ВИЧ (Retroviridae)
+
?
[16]
Вирус лошадиной инфекционной анемии (Retroviridae)
+
+
[56]
Вирус артрита коз (Retroviridae)
+
+
[55]
+
[61]
ДНК-вирусы
Вирус алеутской болезни норок (Parvoviridae)
+
*По [30].
ющей в тяжелой форме). I. D. Iankov et al. [41] показали, что в основе ее развития лежит феномен FcR-ADE,
вызываемый антителами к гемагглютинину вируса (поверхностный белок Н).
Установлено, что антитела, полученные в отношении
антигенных белков вирусов кори и RSV, инактивированных формальдегидом, обладают сниженной протективной способностью по сравнению с антителами,
полученными в отношении этих же антигенов живых
вакцин. Это вызвано тем, что подвергнутые обработке
формалином антигенные белки имеют увеличенное количество активных карбонильных групп, что ведет к нарушению третичной структуры эпитопов [23, 55].
ADE как феномен, характерный для взаимодействия возбудителя инфекционной болезни с иммунной
системой человека. Если ADE развивается в ходе инфекционного процесса, то есть основание считать, что
феномен будет иметь место у вакцинированных людей
и животных, если они будут заражены вирусом, против
которого их вакцинировали (см. таблицы 1 и 2).
Показательны результаты экспериментов с вакцинами, разрабатываемыми для специфической профилактики ретровирусных инфекций у животных – инфекционной анемии лошадей и имунодефицита кошек. Также
они имели цель моделирование стратегий вакцинации
против ВИЧ. Хотя эти эксперименты выполнены еще в
1990-х гг., они до сих пор не вызвали интереса у разработчиков ВИЧ-вакцин.
Инфекционная анемия лошадей вызывается вирусом инфекционной анемии лошадей (Equine infectious
anemia virus, EIAV). Болезнь носит нециклический характер, проявляется синдромами лихорадки, анорексии, анемии, выздоровления не наступает. Показано
серьезное обострение болезни при заражении EIAV
вакцинированных лошадей и пони, если в их сыворотке
присутствовали антитела, индуцированные введением вакцины. C. Issel at al. [42] использовали виремию
как критерий тяжести болезни и продемонстрировали,
что вакцинация инактивированной цельновирионной
вакциной не может предотвратить развитие виремии и
клинических симптомов болезни у животного, которому введен вирулентный штамм вируса. В экспериментах по заражению гетерологичным штаммом вируса
животных, вакцинированных высокоочищенным оболочечным гликопротеином вируса, также не удавалось
ни предотвратить виремию, ни развитие клинических
симптомов болезни. В последующем S. Wang et al. [81]
провели масштабные эксперименты на пони и лошадях
по оценке защитной эффективности рекомбинантной
вакцины, полученной на основе поверхностного гликопротеина EIAV. Результаты экспериментов показали
усиление инфекции у всех предварительно вакцинированных животных.
Ретровирус, возбудитель иммунодефицита кошек
(Feline immunodeficiency virus, FIV), после инфицирования кошек, вакцинированных оболочечным рекомбинантным белком этого вируса, обнаруживался в их
крови даже раньше, чем у не вакцинированных животных [59]. В сходных исследованиях с различными рекомбинантными FIV-вакцинами было установлено, что
в крови животных в ответ на вакцинацию обнаруживаются антитела к оболочечному белку (env) FIV, плохо
нейтрализующие вирус в условиях in vitro. У вакцинированных животных вирусная нагрузка была значительно
большей, чем у не вакцинированных. При росте титров
антител к коровому белку (core protein) FIV у кошек имело место усиление клинических признаков болезни [11,
39, 40].
Сходные результаты были получены в экспериментах на людях по изучению протективного эффекта ВИЧвакцины, проведенных в Африке фирмой Merck. Из
741 вакцинированного добровольца 24 впоследствии
заразились ВИЧ. В другой группе добровольцев, получивших плацебо, 21 из 762 участников также были инфицированы. Эксперимент был досрочно прекращен
[77].
Приведенные выше данные показывают, что не все
реакции со стороны иммунной системы, развивающиеся в ответ на введение вакцины или инфекционный
процесс, имеют защитный характер. ADE – распространенное явление при инфекционных болезнях и иммунных ответах на введение вакцин и лечение иммуноглобулинами. Осложнения на вакцинацию, связанные
с ADE, могут проявляться через десятилетия после ее
проведения. Постулат вакцинологии «чем выше титр
антител, тем сильнее иммунитет», не может рассма-
21
триваться как критерий профилактической эффективности вакцины в тех случаях, когда возможно развитие
ADE. Также этот феномен требует по новому взглянуть
на подходы к оценке иммунологической безопасности
ИЛП. Граждане, которые привлекаются к клиническим
исследованиям вакцин, в соответствии с п. 1. ст. 5 Федерального закона № 157-ФЗ от 17.09.1998 г. «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней», должны
быть информированы о возможности развития у них
ADE при заражении возбудителем инфекционной болезни, в отношении которого они были вакцинированы
ранее. Поэтому необходима разработка методов исследований, позволяющих еще на этапе доклинического исследования ИЛП устанавливать возможность
развития ADE как следствие вакцинации или введения
специфических иммуноглобулинов. Ранее нами был
предложен алгоритм доклинических исследований,
имеющих целью обнаружение ADE при изучении иммунологической безопасности ИЛП (рисунок 7).
Общими требованиями при доклиническом изучении риска развития ADE у ранее вакцинированных
людей, должно быть проведение экспериментов, в которых необходимо установить: 1) границы феномена,
т.е. очертить «круг» близкородственных видов вирусов
(их серотипов или изолятов), при инфицировании которыми вакцинированных людей возможно усиление
инфекционного процесса; 2) тип ADE; 3) эпитопы антигенов, ответственные за феномен ADE, и эпитопы, ответственные за протективный эффект.
Литература
1. Воробьев А.А., Быков А.С., Пашков Е.П. с соавт.
Микробиология. М. 1992.
2. Галактионов В.Г. Эволюционная иммунология. М.
2005.
3. Заболотный Д.К. Пустулезная форма чумы // Русский архив патологии. 1899. Т. VIII. С. 239–242.
4. Константинова Н.А. Иммунные комплексы и повреждение тканей. М. 1996.
5. Купер Э. Сравнительная иммунология. М. 1980.
6. Медуницын Н.В. Вакцинология. М., 2010.
7. Павлович С.А. Основы иммунологии. М. 1997.
8. Райт А.Е. Основы вакцинотерапии (теория опсонинов). Спб. 1908.
9. Супотницкий М.В. Эволюционная патология. М.
2009.
10. Супотницкий М.В. Феномен антителозависимого
усиления инфекции при доклиническом изучении
иммунобиологических лекарственных препаратов
// Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая / Под ред. А. Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012. C.
177–185.
11. Baldinotti F. D., Matteucci P., Mazzetti P. et al. Serum
neutralization of feline immunodeficiency virus is
markedly dependent on passage history of the virus
and host system // J. Virol. 1994. V. 74. P. 10834–
10837.
12. Balsitis S.J., Williams K.L., Lachica R. et al. Lethal
antibody enhancement of dengue disease in mice is
prevented by Fc modification // PLoS Pathog. 2010.
6:e1000790.
13. Bannert N., Kurth R. Retroelements and the human
genome: New perspectives on an old relation // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101, Suppl. 2. P.
14572–14579.
Рис. 7. Блок-схема исследования феномена ADE в доклиническом изучении иммунологической безопасности ИЛП [10]
Наиболее вероятно развитие ADE у лиц, ранее вакцинированных в отношении вирусов, возбудителей
инфекционных болезней, представителей семейств
Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Parvoviridae, Filoviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Picornaviridae, а также возбудителей
туберкулеза.
22
14. Barrett A. D. T., Gould A. Antibody-mediated early
death in vivo after infection with Yellow fever virus // J.
Gen. Virol. 1986. V. 67. P. 2539–2542.
15. Blancou J., Andrai B., Andrai L. A model in mice for the
study of the early death phenomenon after vaccination
and challenge with rabies virus // J. Gen. Virol. 1980. V.
50. P. 433–435.
16. Burke D.S. Human HIV vaccine trials: does antibodydependent enhancement pose a genuine risk? // Perspect. Biol. Med. 1992. V. 35. P. 511–530.
Обзор Review
17. Burton D.R., Stanfield R.L., Wilson I.A. Antibody vs. HIV
in a clash of evolutionary titans // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2005. V. 102, № 42 P. 14943–1494.
18. Chanock R.M., Parrott R.H., Kapakian A.Z. Possible
role of immunological factors in pathogenesis of RS
virus in lower respiratory tract disease // Perspec. Virol. 1968. V. 6. P. 125–135.
19. Chaturvedi U.C., Raghupathy R., Pasca A.S. et al.
Shift from a Th1-type response to Th1-type in dengue haemorrhagic fever // Curr. Sci. 1999. V. 76. P.
63–69.
20. Coffin J. M. Evolution of retroviruses: fossils in our DNA
// Proceed. Amer. Philosoph. Soc. 2004. V. 148, № 3.
P. 264–280.
21. Costas J., Naverira H. Evolutionary history of the human endogenous retrovirus family ERV9 // Mol. Biol.
Evol. 2000. V. 17, № 2. P. 320–330.
22. Dejnirattisai W., Jumnainsong A., Onsirisakul N. Crossreacting antibodies enhance dengue virus infection in
humans // Science. 2010. V. 328. P. 745–748.
23. Delgado M.F., Coviello S., Monsalvo A. C. et al. Lack
of antibody affinity maturation due to poor Toll-like receptor stimulation leads to enhanced respiratory syncytial virus disease // Nat. Med. 2009. V. 15. P. 34–41.
24. Dworak L.J., Wolfinbarger J.B., Bloom M.E. Aleutian
mink disease parvovirus infection of K562 cells is antibody-dependent and is mediated via an Fc(gamma)RII
receptor // Arch. Virol. 1997. V. 142, № 2. P. 363–373.
25. Flipse J., Wilschut J., Smit J.M. Molecular mechanisms
involved in antibody-dependent enhancement of Dengue virus infection in humans // Traffic. 2013. V. 14. P.
25–35.
26. Frost S., Wrin T., Smith D.M. et al . Neutralizing antibody responses drive the evolution of human immunodeficiency virus type 1 envelope during recent HIV
infection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102,
№ 51. P. 18514–18519.
27. Fulginiti F.A., Eller J.J., Downie A.W., Kempe C.H. Altered reactivity to measles virus. Atypical measles in
children previously immunized with inactivated measles virus vaccines //JAMA. 1967. V. 202. P. 1075–
1080.
28. Fust G. Enhancing antibodies in HIV infection // Parasitology. 1997. V. 115, Suppl: S 127–140.
29. Goulld E.A., Buckley A. Antibody-dependent enhancement of Yellow Fever and Japanese encephalitis virus neurovirulence // J. Gen. Virol. 1989. V. 70. P.
1605–1608.
30. Halstead S.B., Mahalingam P.S., Marovich M.A. et al.
Intrinsic antibody-dependent enhancement of microbial infection in macrophages: disease regulation by
immune complexes // Lancet Infect. Dis. 2010. V. 10,
№ 10. P. 712–722.
31. Halstead S.B., Chow J., Marchette N.J. Immunologic
enhancement of Dengue virus replication // Nat. New
Biol. 1973. V. 243. P. 24–26.
32. Halstead S.B., Nimmannitya S., Yamarat C., Russell
P.K. Hemorrhagic fever in Thailand; recent knowledge
regarding etiology // Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1967. V. 20
(Suppl.). P. 96–103.
33. Han J.-F., Cao R., Deng Y. et al. Antibody dependent
enhancement infection of Enterovirus 71 in vitro and in
vivo // Virol. J. 2011. V. 8 (http://www.virologyj.com/
content/8/1/106).
34. Hawkes R.A. Enhancement of the infectivity of arboviruses by specific antisera produced in domestic fowls
// Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1964. V. 43. P. 465–482.
35. Hawkes R.A., Lafferty K.J. The enhancement of virus infectivity by antibody // Virology. 1967. V. 33. P. 250–261.
36. He X., Sun X., Wang J. et al. Antibody-enhanced, Fc
gamma receptor-mediated endocytosis of Clostridium
difficile toxin A // Inf. Immunol. 2009. V.77, № 6. P.
2294–2303.
37. Henchal E.A., McCown J.M., Burke D.S. et al. Epitopic
analysis of antigenic determinants on the surface of
Dengue-2 virions using monoclonal antibodies // Am.
J. Trop. Med. Hyg. 1985. V. 34. P. 164–169.
38. Homsy J., Meyer M., Tateno M. et al. The Fc and not
CD4 receptor mediates antibody enhancement of HIV
infection in human cells // Science. 1989. V. 16, №
244. P. 1357–1360.
39. Hosie M.J., Osborne R., Reid G. et al. Enhancement
after feline immunodeficiency virus vaccination // Vet.
Immunol. Immunopathol. 1992. V. 35. P. 191–197.
40. Huisman W., Karlas K.H., Siebelink K.H. et al. Feline
immunodeficiency virus subunit vaccines that induce
virus neutralizing antibodies but no protection against
challenge infection // Vaccine. 1998. V. 16. P. 181–
187.
41. Iankov I. D., Pandey M., Harvey M. et al. Immunoglobulin G antibody-mediated enhancement of measles
virus infection can bypass the protective antiviral immune response // J. Virol. 2006. V. 80, № 17. P. 8530–
8540.
42. Issel C.J., Horohov D.W., Lea D.F. et al. Efficacy of inactivated whole-virus and subunit vaccines in preventing infection and disease caused by equine infectious
anemia virus // J. Virol. 1992. V. 66. P. 3398–3408.
43. Kim H.W., Canchola J.G., Brandt C.D. et al. Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine // Am. J.
Epidemiol. 1969. V. 89. P. 422–434.
44. King A.A., Sands J.J., Porterfield J.S. Antibody-mediated enhancement of rabies virus infection in a mouse
macrophage cell line (P388D1) // J. Gen. Virol. 1984.
V. 65. P. 1091–1093.
45. Kreil T.R., Eibl M.M. Pre- and postexposure protection
by passive immunoglobulin but no enhancement of
infection with a flavivirus in a mouse model // J. Virol.
1997. V. 71, № 4. P. 2921–2927.
46. Kurosu T. Quasispecies of dengue virus // Trop. Med.
and Health. 2011. V. 39, № 4. P. 29–36.
47. Lidbury B.A., Mahalingam S. Specific ablation of antiviral gene expression in macrophages by antibodydependent enhancement of Ross River virus infection
// J. Virol. 2000. V. 74. P. 8376–8381.
48. Linn M.L., Aaskov G., Suhrbier A. Antibody-dependent
enhancement and persistence in macrophages of
23
an arbovirus associated with arthritis // J. Gen. Virol.
1996. V. 77. P. 407–411.
1 infection // J. Virol. 1999. V. 73, № 12. P. 10489–
10502.
49. Maglione P.J., Xu J., Casadevall A., Chan J. Fc gamma
receptors regulate immune activation and susceptibility during Mycobacterium tuberculosis infection // J.
Immunol. 2008. V. 180. P. 3329–3338.
65. Shannon J., Heinzen R. Adaptive immunity to the obligate Intracellular pathogen Coxiella burnetii // Immunol. Res. 2009. V. 43, № 1–3. P. 138–148.
50. Mathew A., West K., Kalayanarooj S. et al. B-cell responses during primary and secondary dengue virus
infections in humans // J. Infect. Dis. 2011. V. 204. P.
1514–1522.
51. Mdurvwa E.G., Ogunbiyi P.O., Gakou H.S., Reddy P.G.
Pathogenic mechanisms of caprine arthritisencephalitis virus // Vet. Res. Commun. 1994. V. 18. P. 483–490.
52. Mealey R.H., Leib S.R., Littke M.H. et al. Viral load and
clinical disease enhancement associated with a lentivirus cytotoxic T lymphocyte vaccine regimen // Vaccine. 2009. V. 27. P. 2453–2468.
53. Mehlhop E., Ansarah-Sobrinho C., Johnson S. et al.
C1q Inhibits antibody-dependent enhancement of Flavivirus infection in vitro and in vivo in an IgG subclass
specific manner // Cell Host Microbe. 2007 V. 2, № 6.
Р. 417–426.
54. Meyer K., Ait-Goughoulte M., Keck Zhen-Yong et al.
Antibody-dependent enhancement of hepatitis C virus
infection // J. Virol. 2008. V. 82, № 5. P. 2140–2149.
55. Moghaddam A., Olszewska W., Wang B. et al. A potential molecular mechanism for hypersensitivity caused
by formalin-inactivated vaccines // Nat. Med. 2006. V.
12. P. 905–907.
56. Nakayama E., Tomabechi D, Matsuno K. et al. Antibody-dependent enhancement of Marburg virus infection // J. Infect. Dis. 2011. V. 204. P. 978–985.
57. Porter A.D., Larsen A.E., Porter H.G. The pathogenesis
of Aleutian disease of mink. II. Enhancement of tissue
lesions following the administration of a killed virus
vaccine or passive antibody // J. Immunol. 1972. V.
109. P. 1–7.
58. Prabhakar B.S., Nathanson N. Acute rabies deaths
mediated by antibody // Nature. 1981. V. 290. P. 590–
5991.
59. Radkowski M. T., Laskus T., Goch A. et al. Affinity of
anti-GP41 antibody in patients infected with human immunodeficiency virus type I // Eur. J. Clin. Invest. 1993.
V. 23. P. 455–458.
60. Reed H. Intelligent discussion on HIV vaccine serves
as a small consolation for slow progress // Yale J. Biol.
2011. V. 84. P. 153–154.
61. Reimer L.G. Q Fever // Clin. Microbiol. Rev. 1993. V. 6,
№ 3. P. 193–198.
62. Robinson W.E., Montefiori D.C., Mitchell W.M. Antibody-dependent enhancement of human immunodeficiency virus type 1 infection // Lancet. 1988. V. 9, №
1. P. 790–794.
63. Sekaly R.-P. The failed HIV Merck vaccine study: a step
back or a launching point for future vaccine development? // J. Exp. Med. 2008. V. 21. V. 205, № 1. P. 7–12.
64. Shankarappa R., Margolick J.B., Gange S.J. et al.
Consistent viral evolutionary changes associated with
the progression of human immunodeficiency virus type
24
66. Suhrbier A., La Linn M. Suppression of antiviral responses by antibody-dependent enhancement of
macrophage infection // Trends Immunol. 2003. V.
24. P. 165–168.
67. Takada A., Ebihara H., Feldmann H. et al. Epitopes required for antibody-dependent enhancement of Ebola
virus infection // J. Infec. Dis. 2007. V. 196. P. 347–
356.
68. Takada A., Feldmann H., Ksiazek T.G. et al. Antibodydependent enhancement of Ebola virus infection //J.
Virol. 2003. V. 77, № 13. P. 7539–7544.
69. Takada A., Watanabe S., Okazak K. et al. Infectivity
enhancing antibodies to Ebola virus glycoprotein // J.
Virol. 2001. V. 75, № 5. P. 2324–2330.
70. Takano T., Kawakami S., Yamada S. et al. Antibody-dependent enhancement occurs upon re-infection with
the identical serotype virus in feline infectious peritonitis virus infection // J. Vet. Med. Sci. 2008. V. 70, №
12. P. 1315–1321.
71. Takeda A., Tuazon C.U., Ennis F.A. Antibody-enhanced
infection by HIV-1 via Fc receptor-mediated entry //
Science. 1988. V. 242. № 4878. P. 580–5833.
72. Thomas H.I., Wilson S., O’Tolle C.M. et al. Differential
maturation of avidity of IgG antibodies to gp41, p24
and p17 following infection with HIV-1 // Clin. Exp. Immunol. 1996. V. 103. P. 185–191.
73. Tirado S.M., Yoon K.J. Antibody-dependent enhancement of virus infection and disease // Viral Immunol.
2003. V. 16. P. 69–86.
74. Tsai Y.T., Chang S.Y., Lee C.N., Kao C.L. Human TLR3
recognizes dengue virus and modulates viral replication in vitro // Cell. Microbiol. 2009. V. 11. P.
604–
615.
75. Ubol S., Chareonsirisuthigul T., Kasisith J., Klungthong C. Clinical isolates of Dengue virus with distinctive
susceptibility to nitric oxide radical induce differential
gene responses in THP-1 cells // Virology. 2008. V.
376. P. 290–296.
76. Ubol S., Halstead S.B. How innate immune mechanisms contribute to antibody-enhanced viral infections
// Clin. Vac. Immunol. 2010. V. 17, № 12. P. 1829–
1835.
77. Vaccination and Enrollment Are Discontinued in Phase
II Trials of Merck’s Investigational HIV Vaccine Candidate // News Release (http://www.hvtn.org/pdf/FINAL_HIV_Vaccine_Press_Release.pdf).
78. Vennema H., De Groot R., Harbour D. et al. Early death
after feline infectious peritonitis virus challenge due
to recombinant vaccinia virus immunization // J. Virol.
1990. V. 64. P. 1407–1409.
79. Vennema H., Poland A., Foley J., Pedersen N.C. Feline
infectious peritonitis viruses arise by mutation from endemic feline enteric coronaviruses // Virology. 1998. V.
243, № 1. P. 150–157.
Обзор Review
80. Wallace M.J., Smith D.W., Broom A.K. et al. Antibodydependent enhancement of Murray Valley encephalitis
virus virulence in mice // J. Gen. Virol. 2003. V. 84, №
7. P. 1723–1728.
81. Wang S.Z., Rushlow K.E., Issel C.J. et al. Enhancement
of EIAV replication and disease by immunization with a
baculovirus-expressed recombinant envelope surface
glycoprotein // Virol. 1994. V. 199. P. 247–251.
84. Yoon K.J., Wu L.L., Zimmerman J.J., Hill H.T., Platt
K.B. Antibody-dependent enhancement (ADE) of
porcine reproductive and respiratory syndrome virus
(PRRSV) infection in pigs // Viral. Immunol. 1996. V. 9.
P. 51–63.
85. Yoong P. Enhancement of bacterial virulence by antibody neutralization of immune-activating toxins //
Virulence. 2010. V. 1, № 5. P. 409–413.
82. Webster R.G., Askonas B.A. Cross-protection and
cross reactive cytotoxic T cells induced by influenza virus vaccines in mice // Eur. J. Immunol. 1980. V.10. P.
396–401.
86. Zellweger R.M., Prestwood T.R., Shresta S. Enhanced
infection of liver sinusoidal endothelial cells in a mouse
model of antibody-induced severe dengue disease //
Cell. Host. Microbe. 2010. Vol. 7. P. 128–139.
83. Weiss R.C., Scott F.W. Antibody-mediated enhancement of disease in feline infectious peritonitis: comparisons with dengue hemorrhagic fever // Comp. Immune. Microbiol. Infect. Dis. 1981. V. 4. P. 175–188.
87. Zhang H., Hoffmann F., He J. et al. Evolution of subtype
C HIV-1 Env in a slowly progressing Zambian infant //
Retrovirology. 2005 (http://www.retrovirology.com/
content/2/1/6).
25
Оригинальные статьи
Июль – Сентябрь 2013
Выявление специфических
иммуноглобулинов класса G в препарате
Иммуноглобулин человека против
клещевого энцефалита методом ИФА
Ладыженская И.П., Воробьёва М.С., Саркисян К.А., Кузнецова Д.Д., Афонина О.С., Фадейкина О.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств
медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ, Москва
Detection of specific immunoglobulin G in
human immunoglobulin preparations against
tick-borne encephalitis virus by ELISA
Ladyzhenskaya I.P., Vorobieva M.S., Sarkisyan K.A., Kuznetsova D.D., Afonina O.S., Fadeikina O.V.
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expertise of Medical Application Products»
of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
Препарат Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, раствор для внутримышечного введения, в течение многих лет применяется в РФ для экстренной серопрофилактики и лечения клещевого энцефалита. Шесть предприятий ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России более 50 лет осуществляют промышленный выпуск этого препарата. Основу
препарата составляют специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, которые
обладают защитной активностью при парентеральном введении и нейтрализуют вирус клещевого энцефалита, циркулирующий в крови инфицированного или заболевшего клещевым
энцефалитом человека. Для определения активности препарата по содержанию антител к
вирусу клещевого энцефалита применяется регламентированный метод – реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Метод иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет выявлять в сыворотке или плазме крови человека иммуноглобулины класса G к вирусу клещевого
энцефалита при использовании наборов реагентов, предназначенных для этой цели. ЦЕЛЬ
данного исследования – изучить и дать дополнительную характеристику специфической активности препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита по титру иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита при использовании метода иммуноферментного анализа.
Ключевые слова: клещевой энцефалит, иммуноглобулины класса G к вирусу клещевого энцефалита, иммуноферментный анализ (ИФА), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), титр антител.
Библиографическое описание: Ладыженская И.П., Воробьёва М.С., Саркисян К.А., Кузнецова Д.Д., Афонина О.С., Фадейкина О.В. Выявление специфических иммуноглобулинов класса G в
препарате Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита методом ИФА // Биопрепараты. 2013. № 3. С. 26–35.
Human immunoglobulin preparation against tick-borne encephalitis, solution for intramuscular
injection, has been used in the Russian Federation for many years for the emergency seroprophylaxis
and treatment of tick-borne encephalitis. Six units of the Federal State Unitary Enterprise Science
and Production Association «Microgen» of the Ministry of Health of the Russian Federation have
been commercially manufacturing the mentioned medicine for more than 50 years. The active part
of the preparation consists of tick-borne encephalitis virus-specific antibodies, which demonstrate
protective activity when administered parenterally and neutralize tick-borne encephalitis virus,
circulating in the blood of an infected or sick person. Hemagglutination-inhibition reaction (HIR) is
a specified method for evaluating the activity of the drug based on the amount of antibodies to tickborne encephalitis. The method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) allows to detect
immunoglobulins G against tick-borne encephalitis virus in human blood serum or blood plasma by
26
using a reagent kit elaborated for this purpose. The purpose of the present research is to study and
provide additional characterization to the specific activity of human immunoglobulin preparations
against tick-borne encephalitis virus according to the titer of immunoglobulins G against tick-borne
encephalitis virus by enzyme immunoassay.
Key words: tick-borne encephalitis, immunoglobulins G against tick-borne encephalitis virus, enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), hemagglutination- inhibition reaction (HIR), antibody titer.
Bibliographic description: Ladyzhenskaya I.P., Vorobieva M.S., Sarkisyan K.A., Kuznetsova D.D., Afonina
O.S., Fadeikina O.V. Detection of specific immunoglobulin G in human immunoglobulin preparations against
tick-borne encephalitis virus by ELISA // Biopreparation (Biopharmaceuticals). 2013. № 3. P. 26–35.
Для корреспонденции:
Воробьёва М.С. – главный эксперт Управления экспертизы противовирусных МИБП
Центра экспертизы и контроля МИБП
ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России,
119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41
e-mail: Vorobiova@expmed.ru
Статья поступила 17.12.12 г., принята к печати 22.08.2013 г.
В течение многих лет в России для экстренной серопрофилактики и лечения клещевого энцефалита (КЭ)
применяется препарат Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита. В 60–80-е годы прошлого
столетия были проведены многочисленные исследования по доказательству профилактических и лечебных
свойств этого препарата [1–4].
На первых этапах получения препарата использовали отобранную по титру антител к вирусу КЭ плазму
крови доноров, проживающих в эндемичных по клещевому энцефалиту регионах и имеющих в крови, благодаря естественному «проэпидемичиванию», антитела к
вирусу клещевого энцефалита. Позднее, плазму крови
человека для производства этого препарата стали получать от доноров, вакцинированных против клещевого
энцефалита.
В Инструкциях по медицинскому применению отечественных вакцин против КЭ представлены специальные
схемы вакцинации для доноров, обеспечивающие получение в короткие сроки регламентированного уровня
специфических антител в плазме крови доноров [5–7].
Отечественный препарат Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита представляет собой
концентрированный раствор очищенной фракции иммуноглобулинов, выделенных методом фракционирования этиловым спиртом при температуре ниже 0ºС из
плазмы крови здоровых доноров, содержащей антитела к вирусу КЭ.
Иммунологические свойства: действующим началом
препарата являются иммуноглобулины класса G, обладающие активностью антител, нейтрализующих вирус
клещевого энцефалита. Препарат также повышает неспецифическую резистентность организма [8, 9].
В готовом препарате фракция иммуноглобулинов
должна составлять не менее 97% от общего белка. Содержание белка в иммуноглобулине – от 10 до 16%.
Титр антител к вирусу КЭ в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) – не менее 1:80 [8, 10, 11].
Согласно нормативной документации на Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита [10]
методом определения показателя «Специфическая
активность» препарата является, как было указано
выше, РТГА. Однако на современном уровне развития
аналитических методов в биологии представлялось
целесообразным дополнить характеристику показателя «Специфическая активность» препарата показателем активности препарата по титру иммуноглобулинов
класса G к вирусу КЭ в иммуноферментном анализе
(ИФА) [2, 12, 13].
Цель работы – изучить возможность применения иммуноферментного анализа для выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ и дать дополнительную
характеристику специфической активности препарата
Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита в ИФА по титру специфических иммуноглобулинов
класса G.
Для выполнения этой цели были проведены следующие исследования:
I. Титрование образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита производства различных предприятий ФГУП «НПО «Микроген» для определения титра антител к вирусу КЭ по
регламентированному методу (РТГА).
II. Подбор условий проведения иммуноферментного
анализа для выявления иммуноглобулинов класса G к
вирусу КЭ в препарате Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита при использовании отечественных наборов реагентов для иммуноферментного
выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ,
предназначенных для исследования сывороток (плазмы) крови человека.
Подтверждение пригодности отработанной методики постановки ИФА для иммуноглобулинов класса
G при параллельном исследовании серий препарата
с использованием наборов реагентов для ИФА отечественного и зарубежного производства.
27
Июль – Сентябрь 2013
III. Титрование образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита
методом ИФА для определения содержания иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ для дополнительной
характеристики специфической активности препарата.
Материалы и методы
Материалы:
1. Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, раствор для внутримышечного введения,
производитель ФГУП «НПО «Микроген», Минздрава
России – образцы 58 серий выпуска 2009–2012 гг. в производственных филиалах ФГУП «НПО «Микроген», расположенных в следующих городах России – г. Томск – 28
серий, г. Пермь – 12 серий, г. Уфа – 6 серий, г. Хабаровск –
5 серий, г. Екатеринбург – 4 серии, г. Омск – 3 серии.
2. Иммуновенин – иммуноглобулин человека нормальный, лиофилизат для приготовления раствора для
внутривенного введения, производитель ФГУП «НПО
«Микроген» Минздрава России, филиал г. Уфа – образцы 2 серий.
3. Пентаглобин – иммуноглобулин человека нормальный (IgG+IgM+IgA), раствор для инфузий, производитель: фирма «Biotest», Германия – образцы 1 серии.
4. Плазма для фракционирования, субстанция, производитель ГБУЗ «СПК Калининградской области»,
Россия – образцы 2 серий.
5. Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита «Векто ВКЭ – IgG», производитель ЗАО
«Вектор-Бест», Россия.
6. Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого
энцефалита «NovaLisa TBE/FSME–IgG –ELISA», производитель «Nova Tec Immunodiagnostica GmbH», Германия.
7. Набор реагентов «Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ», производитель
ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России, филиал г.
Томск.
8. Эритроциты гусей для постановки РТГА.
Примечание: Образцы серий вышеуказанных различных иммуноглобулинов, плазмы для фракционирования были предоставлены для выполнения этого
исследования из Лаборатории иммуноглобулинов и
препаратов крови Испытательного Центра МИБП ФГБУ
«НЦЭСМП» Минздрава России.
Методы:
1. Титрование образцов препарата Иммуноглобулин
человека против клещевого энцефалита – регламентированным методом РТГА (Инструкция по применению
набора реагентов Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ) [11].
В состав набора реагентов для РТГА в качестве основного компонента входит инактивированный бетапропиолактоном антиген вируса клещевого энцефалита, полученный методом боратно-солевой экстракции
из мозга белых мышей, инфицированных вирусом КЭ,
штамм № 139, обладающий способностью вызывать
28
агглютинацию эритроцитов гуся [11, 14]. Гемагглютинирующая активность и выбор рабочей дозы антигена
для РТГА проводится в реакции гемагглютинации (РГА)
с взвесью гусиных эритроцитов по учёту феномена агглютинации эритроцитов. При использовании образцов сывороток (плазмы) крови, содержащих антитела
к вирусу КЭ, агглютинация тормозится (подавляется),
благодаря блокировке ответственного за этот феномен
антигена – гемагглютинина (ГА), обычно располагающегося на поверхности вириона [11]. В РТГА используется рабочая доза антигена вируса КЭ – 8 ГАЕ.
До постановки в РТГА образцы исследуемых препаратов иммуноглобулинов: Иммуноглобулина человека
против клещевого энцефалита, Иммуновенина, Пентаглобина, Плазмы для фракционирования, субстанция
предварительно обрабатывали для удаления неспецифических гемагглютининов и ингибиторов гемагглютинации
25% взвесью каолина и 0,4% взвесью гусиных эритроцитов. В результате проведенной обработки было получено
исходное разведение каждого образца – 1:10, из которого
далее готовили на боратном буферном растворе разведения от 1:20 до 1:1280. За титр антител в каждом исследуемом образце иммуноглобулина принимали максимальное
разведение препарата, при котором наблюдали визуально полную задержку гемагглютинации (-) с рабочей дозой
антигена, при контрольном титровании которой наблюдается гемагглютинация не менее чем на 3+.
2. Подготовка и предварительное определение оптимального разведения образцов препаратов иммуноглобулинов: Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, Иммуновенин, Пентаглобин, Плазма
для фракционирования, субстанция – для исследования методом ИФА в наборах реагентов отечественного
производства «Векто ВКЭ – IgG». Постановку ИФА проводили согласно Инструкции по применению данного
набора реагентов [12].
Набор реагентов «Векто ВКЭ – IgG» предназначен
для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в сыворотках или плазме
крови человека, при этом исследуемые образцы сыворотки или плазмы предварительно разводят 1:100 для
предотвращения неспецифических реакций.
Для проведения ИФА с образцами препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита и
других препаратов иммуноглобулинов готовили разведения каждого исследуемого препарата от 1:400 до
1:25600 на растворе для разведения сывороток из комплекта набора.
При использовании набора реагентов «Векто ВКЭ –
IgG» учет результатов реакции проводили по измерению величины оптической плотности (ОП) растворов в
лунках планшета-иммуносорбента на спектрофотометре вертикального сканирования в двухволновом режиме 450/620 нм. Учитывая показатели ОП в лунках с отрицательным контрольным образцом (К–), вычисляли
критическое значение оптической плотности (ОПкрит.).
За титр иммуноглобулина класса G (результат анализа
положительный) принимали максимальное разведение
исследуемого образца, при котором величина оптической плотности (ОПобр.) была равна или более ОПкрит.
Таблица 1. Состав диагностических наборов реагентов для РТГА и ИФА, предназначенных для выявления антител
(иммуноглобулинов) к вирусу клещевого энцефалита
Биологические реагенты,
входящие в состав диагностических наборов
Набор реагентов для РТГА
Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита
«Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА,РСК,РРГ»
(ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ)
«ВектоВКЭ-IgG»
(ЗАО «Вектор-Бест» Россия)
«NovaLisa TBE/FSME –IgGElisа» (Фирма «NovaTec
Immundiagnostica GmbH»,
Германия)
Антиген вируса клещевого энцефалита,
полученный методом боратно-солевой
экстракции из мозга белых мышей инфицированных вирусом КЭ, очищенный
протаминсульфатом, инактивированный
Планшет разборный с иммобилизованным антигеном вируса КЭ
Планшет разборный с иммобилизованным антигеном вируса КЭ
2. К+ (положительный кон- К+ (РТГА) – асцитная жидкость крыс,
трольный образец)
иммунизированных живым вирусом
КЭ, обработанная хлороформом, каолином и гусиными эритроцитами
К+ (положительный контрольный
образец, инактивированный)
Не входит в состав набор
3. К– (отрицательный контрольный образец)
К– (РТГА) – асцитная жидкость неиммунизированных крыс, обработанная
хлороформом, каолином и гусиными
эритроцитами
К– (отрицательный контрольный
образец, инактивированный)
Не входит в состав набора
4. Калибровочные растворы, содержащие иммуноглобулины класса G к вирусу КЭ
Не входят в состав набора
Калибровочные растворы, содержащие IgG к вирусу КЭ в концентрациях
от 10 до 160 ЕД/ мл*
Стандарты IgG к вирусу КЭ от 0 до
300 NTU/ml** (TBE/FSME IgG)
5. Растворы для разведения
образцов
Смесь солей (таблетка) для приготовления боратного буферного раствора
(ББР) рН 9,0 ± 0,05;
Смесь солей (таблетка) для приготовления фосфатного буферного раствора (ФБР) рН 6,2 ± 0,05
6. Конъюгат
Отсутствует; для визуального выявления результатов взаимодействия комплекса «антиген–антитело» (феномен
задержки гемагглютинации) используют 0,4% взвесь эритроцитов гуся
Конъюгат антител к
иммуноглобулинам человека,
меченых пероксидазой хрена
TBE/FSME anti-IgG конъюгатсвязанные с пероксидазой антитела
к IgG человека
7. Субстрат
Отсутствует
Раствор тетраметилбензидина (раствор ТМБ)
ТМБ субстрат (раствор TMB) 3,3,5,5тетраметилбензидин
8. Промывочные растворы
Отсутствуют
Концентрат фосфатно-солевого
буферного раствора с твином
(ФСБ-Т×25)
20-кратный концентрат буферного
раствора рН 7,2 ± 0,2
9. Стоп-реагент
Отсутствует
Стоп-реагент
Стоп-раствор – 0,2 М раствор серной
кислоты
Результаты ИФА регистрируют, измеряя величину оптической плотности
растворов в лунках на спектрофотометре вертикального сканирования
в двухволновом режиме 450/620 нм
Результаты ИФА регистрируют, измеряя величину оптической плотности
растворов в лунках на спектрофотометре вертикального сканирования
в двухволновом режиме 450/620 нм
СОСТАВ
1. Иммуносорбент
10. Результьы анализа
Визуальное выявление:
(–) полное оседание эритроцитов
(от 3+ до 4+) гемагглютинация
эритроцитов
Растворы для разведения сывороток Растворы для разведения сывороток
(РПРС – для предварительного раз- (IgG pH 7,2 ± 0,2)
ведения и РРС – раствор для разведения)
* Калибраторы используются только при количественном варианте ИФА.
**NTU/мл = Nova Tec Units, при интерпретации результатов ИФА (значение величин применяется при регистрации положительного или отрицательного результата анализа).
29
Июль – Сентябрь 2013
Для сравнения и оценки специфичности положительных результатов ИФА для препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита в опыте
ИФА в разведении 1:400 и более параллельно исследовали образцы препаратов иммуноглобулинов человека
нормальных (Пентаглобин, 1 серия, Иммуновенин, 2
серии, образцы Плазма для фракционирования, субстанция, 2 серии), которые по данным РТГА не содержали антитела к вирусу КЭ (титр менее 1:10).
Воспроизводимость полученных результатов ИФА
оценивали при параллельном титровании образцов в
разведениях 1:400–1:25600 трёх серий (в трех повторах)
препарата Иммуноглобулин человека против клещевого
энцефалита на двух наборах реагентов для ИФА: «Векто
ВКЭ – IgG» и «NovaLisa TBE/FSME IgG ELISA».
Для зарубежного набора,согласно Инструкции по
применению [13], расчет активности (титр) специфического иммуноглобулина класса G проводили при сравнении значений ОП разведений исследуемых образцов
препарата со значениями ОП калибровочных стандартов, входящих в комплект этого набора реагентов.
Состав диагностических наборов реагентов для РТГА
и ИФА представлен в таблице 1.
3. Определение содержания иммуноглобулинов
класса G к вирусу КЭ в образцах 58 серий препарата
Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита при титровании методом ИФА в наборах реагентов отечественного производства «Векто ВКЭ – IgG».
4. Методы статистической обработки и анализа полученных результатов. Определяли значение среднеарифметической величины титров и ошибку средней
ОП [17–19].
Для статистической характеристики результатов экспериментов выбрана медиана – показатель, позволяющий статистически охарактеризовать ряд анализируемых значений и который можно применять для любого
типа распределений данных [18]. Применение медианы
рекомендовано в тех случаях, когда значения подвержены варьированию (от 1:6400 до 1:25600). Вычисление медианы проводили в соответствии с методикой,
изложенной в [19]. Медиана – это значение исследуемого признака, справа и слева от которого находится
одинаковое число упорядоченных элементов выборки.
Наглядное применение метода статистики «Медиана»
для распределения титров антител в РТГА и титров иммуноглобулинов класса G в ИФА для образцов 58 серий
препарата Иммуноглобулин человека против клещевого
энцефалита представлено на рисунках 1 и 2.
Результаты и обсуждение
I. Диагностический набор реагентов «Диагностикум
клещевого энцефалита, сухой, для РТГА, РСК, РРГ»
предназначен для исследования сывороток (плазмы)
крови человека и иммуноглобулина человека против КЭ
на наличие антител к вирусу КЭ.
Для подтверждения наличия антител к вирусу КЭ в
РТГА при использовании «Диагностикума клещевого
энцефалита сухого для РТГА, РСК, РРГ» были исследованы образцы 58 серий препарата Иммуноглобулин
человека против клещевого энцефалита различных
филиалов предприятия «НПО «Микроген», а также образцы препаратов Иммуновенин, Пентаглобин, Плазма
для фракционирования.
Результаты представлены в таблице 2 и на рис. 1.
Как видно из представленных данных, все образцы
58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита содержали специфические
антитела к вирусу клещевого энцефалита и соответствовали по показателю «Специфическая активность»
требованиям НД.
Большинство образцов серий имели титры антител –
1:160, 1:320, единичные образцы имели титр – 1:640,
что соответствовало паспортным данным.
Таблица 2. Определение антител к вирусу клещевого энцефалита в РТГА в образцах серий препарата
Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, производитель ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России
Производство (филиалы
НПО «Микроген»)
Количество исследованных
серий
Титр антител к вирусу КЭ в РТГА (показатель активности по НД – не менее
1:80)*
1:160
1:320
1:640
г. Томск
28
14
12
2
г. Пермь
12
6
3
3
г. Уфа
6
5
1
-
г. Хабаровск
5
5
-
-
г. Екатеринбург
4
4
-
-
г. Омск
3
3
-
-
Всего
58 ***
37 /64,3%**
16 /27,5%
5/8,9%
*За титр исследуемого образца иммуноглобулина принимают максимальное разведение, дающее полную (-) задержку гемагглютинации с 8 ГАЕ антигена вируса КЭ. Определяется визуально.
**37/64,3% – числитель: количество образцов препарата с данным показателем титра, знаменатель: показатель в %.
***При исследовании образцов препаратов: Иммуновенин (2 серии); Пентаглобин (1 серия); Плазма для фракционирования, субстанция (2 серии) – антитела к вирусу КЭ не выявлены.
30
Рис. 1. Определение уровня антител к вирусу КЭ в образцах иммуноглобулина человека против КЭ в реакции
РТГА.
В образцах исследованных серий препаратов Иммуновенин, Пентаглобин, Плазма для фракционирования
антитела к вирусу клещевого энцефалита отсутствовали.
II. Подбор условий проведения ИФА для выявления
иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в препарате Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита.
Для выполнения этой задачи использовали коммерческий набор реагентов для ИФА отечественного производства «Векто ВКЭ – IgG», предназначенный для
выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в
сыворотках или плазме крови человека.
Первоначально исследовали образцы одной серии
препарата Иммуноглобулин человека против клещевого
энцефалита, образцы двух серий препарата Иммуновенин, образец одной серии препарата Пентаглобин и двух
серий Плазмы для фракционирования, субстанция.
Вышеуказанные препараты разводили раствором
для разведения сывороток, входящим в состав набора
реагентов для ИФА. Для постановки ИФА был использован ряд разведений образцов препаратов от 1:400
до 1:25600, так как в предварительных исследованиях было показано, что для более низких разведений
Таблица 3. Результаты сравнительного изучения в наборе реагентов «ВектоВКЭ – IgG» показателей оптической
плотности (ОП 450/620 нм) при титровании в ИФА образцов препаратов, содержащих и не содержащих
(по данным РТГА) антител к вирусу КЭ
Показатели ОП растворов в лунках соответствующих разведений образцов препаратов:
№
п/п
Наименование препарата
1.
разведения
1:400
1:800
1:1600
1:3200
1:6400
1:12800
1:25600
Иммуноглобулин человека против
КЭ
серия № Т28
>3.5*
3.045
1.877
1.025
0.512
0.253
0.124
2.
Иммуновенин (иммуноглобулин
человека нормальный)
cерия № У-75
0.201
0.108
0.067
0.041
0.031
0.032
0.019
3.
Иммуновенин (иммуноглобулин
человека нормальный)
cерия № У-76
0.172
0.091
0.058
0.035
0.033
0.028
0.018
4
Пентаглобин (иммуноглобулин
человека нормальный)
серия № 146222
0.056
0.054
0.038
0.036
0.035
0.036
0.030
5.
Плазма для фракционирования
серия № 6
0.007
0.021
0.023
0.021
0.024
0.024
0.015
Плазма для фракционирования
0.013
0.026
0.032
0.022
0.023
0.022
0.016
серия № 7
Примечания. Критерии оценки результатов ИФА (Инструкция по применению набора реагентов)
Показатели оптической плотности ОП 450/620 нм:
Контрольные образцы:
К+ (положительный контрольный образец) – не менее 0,8;
К– (отрицательный контрольный образец) – не более 0,2;
Учет результатов анализа:
ОПкрит. = ОПср.К– + 0,1;
ОПобр. ≥ ОПкрит. (результат анализа положительный);
ОПобр. < ОПкрит. (результат анализа отрицательный).
*ОПобр. – оптическая плотность в лунках с исследуемым образцом; Контрольные образцы, комплектующие набор (характеристики, полученные при тестировании, средняя из трех определений):
- ОПК+ = 2,980;
- ОПК – =0,020;
ОПкрит. = 0,120. Положительный результат анализа: ≥0.120;
Отрицательный результат анализа: <0.120.
6.
31
Июль – Сентябрь 2013
препарата иммуноглобулина против КЭ значения ОП
«зашкаливали» при измерении на спектрофотометре
(1:100, 1:200 – ОП = более 3,5).
После внесения проб исследуемых препаратов
в соответствующих разведениях в лунки планшета-­
иммуносорбента (в лунках сорбирован антиген вируса
клещевого энцефалита) дальнейшую постановку ИФА
проводили в соответствии с Инструкцией по применению на отечественный набор для ИФА.
Результаты представлены в таблице 3.
Иммуноглобулин человека против КЭ в разведении
1:400 имел показатель ОП более 3,5, при этом в разведении 1:400 в образцах двух серий препарата Иммуновенин выявлены следовые низкие значения ОП: 0,201
и 0,172 при ОПкрит. = 0,120. Для последующих разведений образцов препарата Иммуновенин, а также Пентаглобин и Плазмы для фракционирования в ИФА выявлены отрицательные значения ОП. В данном опыте
положительный результат анализа – специфический
титр иммуноглобулина класса G к вирусу КЭ для препарата Иммуноглобулин человека против клещевого
энцефалита соответствовал разведению 1:12800.
Таким образом, для получения объективных и специфичных результатов титрования иммуноглобулина
класса G к вирусу КЭ целесообразно проводить разведения образцов препарата, начиная с 1:800, при котором для препаратов иммуноглобулинов человека нормальных и для плазмы крови человека положительные
значения ОП отсутствуют.
Для подтверждения полученных результатов по подбору оптимального разведения для ИФА, оценки воспроизводимости этих результатов было проведено
параллельное титрование образцов трех серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого
энцефалита в наборах реагентов для ИФА отечественного и зарубежного производства. Иммуноглобулины
титровали в тех же разведениях, что и в предыдущем
опыте. В каждом испытании для оценки воспроизводимости результатов постановки ИФА повторяли для
каждой серии препарата трехкратно. Результаты представлены в таблицах 4 и 5.
В данной серии опытов на наборе реагентов «Векто
ВКЭ – IgG» (табл. 4) была подтверждена правильность
установленных значений разведений иммуноглобулина
против КЭ (1:800–1:25600), в ИФА получены сходные
показатели среднеарифметических значений ОП в образцах препарата каждой из трех серий в соответствующем разведении.
Были определены максимальные разведения образцов иммуноглобулина против КЭ, в пробах с которыми выявлялся положительный результат анализа
(ОПобр.≥ ОПкрит.), при ОПкрит. = 0,121. Эти значения
максимального разведения образцов с положительной
реакцией в ИФА, равные 1:12800, были определены как
титры иммуноглобулина класса G против КЭ в ИФА в
наборе реагентов «Векто ВКЭ – IgG».
В таблице 5 представлены результаты титрования
образцов тех же трех серий препарата иммуноглобу-
Таблица 4. Показатели оптической плотности (ОП) при титровании методом ИФА образцов трех серий препарата
Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита (данные тестирования в наборе реагентов «ВектоВКЭ-IgG»)
Серия Иммуноглобулина человека против
клещевого
энцефалита
Количество
исследованных
образцов
1
Т32
2
3
№
п/п
Показатели ОП растворов в лунках соответствующих разведений образцов
разведения
1:400
1:800
1:1600
1:3200
1:6400
1:12800
1:25600
3
3,35*±0,018
2,53±0,008
1,61±0,026
0,84±0,015
0,4±0,008
0,21±0,008
0,11±0,006
П569
3
3,35±0,021
2,62±0,072
1,68±0,053
0,93±0,056
0,45±0,047
0,23±0,045
0,12±0,017
П567
3
3,39 ± 0,028
2,65 ± 0,068
1,77±0,075
0,97±0,059
0,46 ± 0,015
0,24 ± 0,003
0,13 ± 0,007
Примечания. Критерии оценки результатов ИФА (Инструкция по применению набора реагентов)
Показатели оптической плотности ОП 450/620 нм:
1. Контрольные образцы:
К+ (положительный контрольный образец) – не менее 0,8;
К– (отрицательный контрольный образец) – не более 0,2;
Учет результатов анализа:
ОПкрит. = ОПср.К– + 0,1;
ОПобр. ≥ ОПкрит. (результат анализа положит.);
ОПобр. < ОПкрит. (результат анализа отриц.).
*ОПобр. – оптическая плотность в лунках с исследуемым образцом
n = 3; (X+m), где X – средняя арифметическяя, m – ошибка средней.
Контрольные образцы, комплектующие набор реагентов (характеристики полученные при тестировании):
- ОПК + = 3.001;
- ОПК– = 0.021;
ОПкрит. = 0.121; Положительный результат анализа: ≥ 0,121;
Отрицательный результат анализа: < 0,121.
32
Таблица 5. Показатели оптической плотности (ОП) при титровании методом ИФА образцов трех серий препарата
Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита (данные тестирования в наборе реагентов «NovaLisa TBE /
FSME IgG – ELISA»
№
п/п
1
Серия Иммуноглобулина человека
против клещевого
энцефалита
Количество
исследованных
образцов
Т32
3
Показатели ОП растворов в лунках соответствующих разведений образцов
разведения
1:400
1:800
1:1600
1,82*±0,023
1,43±0,004
0,96±0,007
1:3200
1:6400
1:12800
1:25600
0,67±0,014 0,38±0,004
0,21±0,008
0,13±0,001
2
П569
3
1,73±0,015
1,38±0,030
0,92±0,035
0,62±0,028 0,35±0,029
0,19±0,010
0,12±0,007
3
П567
3
1,80 ± 0,032
1,37 ± 0,042
0,91±0,004
0,60±0,030 0,33 ± 0,007 0,18 ± 0,012
0,12 ± 0,004
Примечания. Критерии оценки результатов ИФА (Инструкция по применению набора реагентов):
*ОПобр. – оптическая плотность в лунках с исследуемым образПоказатели оптической плотности (ОП 450/620 нм):
цом n=3; (X+m), где Х – средняя арифметическяя, m – ошибка
Контрольные реагенты:
средней;
-стандарты (NTU/мл) * *
Контрольные реагенты, комплектующие набор «Nova Lisa ТВЕ
0 NTU/мл<0,200
/FSME IgG – ELISA» (значения ОП стандартов, полученные при
50 NTU/мл>0,200
тестировании):
130 NTU/мл>0,400
0 NTU /мл – 0,018
200 NTU/мл>0,800
50 NTU/ мл – 0,223
300 NTU/мл>1,200
130 NTU /мл – 0,635
Учет результатов анализа:
200 NTU /мл – 1,241
Положительный результат ˃110 NTU/мл
300 NTU/мл – 2,044
Отрицательный результат <55 NTU/мл
**NTU/мл – единицы активности Nova Tec Units.
Серая зона (неопределенный результат) 55–110 NTU/мл
лина против КЭ в зарубежном наборе реагентов для
иммуноферментного выявления иммуноглобулинов
класса G к вирусу КЭ (NovaLisa TBE/FSME-IgG-ELISA).
Использованы те же разведения образцов иммуноглобулина против КЭ от 1:400 до 1:25600. Выявлено, что
значения ОП по разведениям для образцов трех серий
препарата имеют близкие показатели и воспроизводимы по среднеарифметическим величинам ОП.
Метод учета результатов ИФА (положительный и отрицательный результат анализа) в данном наборе реагентов предусматривает, согласно Инструкции по применению, обязательное использование калибровочных
стандартных образцов с определенными показателями
единицы активности (NTU/мл). Для положительного показателя анализа установлено значение >110 NTU/мл,
для отрицательного – значение <55 NTU/мл, серая зона
(неопределенный результат) – 55–110 NTU/мл.
В проведенном нами тестировании значения NTU/
мл в калибровочных стандартных образцах набора соответствовали следующим показателям ОП (что укладывалось в требования Инструкции по применению):
0 NTU/мл
0.018
50 NTU/мл
0.223
130 NTU/мл
0.635
200 NTU/мл
1.241
300 NTU/мл
2.044
Сопоставляя эти показатели ОП калибровочных
стандартов с активностью в единицах NTU/мл, согласно Инструкции по применению на использованный
набор, были установлены положительные результаты
ИФА при значении ОП = 0,635, что соответствовало
130 NTU/мл (т.е. >110 NTU/мл) и отрицательные значения в реакции ИФА при значении ОП = 0,223,что
соответствовало 50 NTU/мл (т.е. менее 55 NTU/мл).
Сравнивая эти значения ОП калибровочных стандартов с данными ОП при тестировании образцов трех
серий препарата Иммуноглобулин человека против
клещевого энцефалита, определяли положительный
или отрицательный результат ИФА в соответствующем разведении исследуемого образца иммуноглобулина. Так ИФА реакция была положительной (ОП =
0,600; 0,620; 0,670) для разведения препарата 1:3200;
в разведении 1:6400 (ОП = 0,330; 0,350; 0,380) реакция определялась как серая зона, т.е. неопределенный результат.
Таким образом, значения максимального разведения образцов с положительной реакцией, равные
1:3200 (1:6400) были определены как титры иммуноглобулина класса G против КЭ в ИФА в наборе реагентов «NovaLisa TBE/FSME-IgG-ELISA». Более низкие
значения титра иммуноглобулина класса G при тестировании образцов серий препарата в данном наборе
реагентов по сравнению с титрами, полученными на
отечественном наборе реагентов, можно объяснить
особенностями конструкции набора, методом учета
результатов с применением калибровочных стандартов в единицах активности производителя (NTU/мл)
и, возможно, использованием антигена вируса КЭ
европейского генотипа для приготовления планшета-­
иммуносорбента.
Для определения в ИФА концентрации иммуноглобулина класса G к вирусу КЭ в образцах серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого
энцефалита в перспективе необходима разработка
стандартного образца (СО) иммуноглобулина против
клещевого энцефалита, калиброванного по содержанию специфического иммуноглобулина класса G в единицах активности.
33
Июль – Сентябрь 2013
Таблица 6. Определение иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита в ИФА (набор реагентов
«ВектоВКЭ- IgG») в образцах 58 серий препарата «Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита»,
производитель ФГБУ «НПО «Микроген»
Производство
(филиалы НПО «Микроген)
Количество исследованных серий
Титр антител (иммуноглобулинов класса G) к вирусу
КЭ в ИФА*
1:6400
1:12800
1:25600
г. Томск
28
6
20
2
г. Пермь
12
-
8
4
г. Уфа
6
-
3
3
г. Хабаровск
5
-
2
3
г. Екатеринбург
4
1
-
3
г. Омск
3
-
3
-
Всего
58
7 /12,1%**
36 /62,0%
15 /25,9%
*За титр иммуноглобулина класса G в исследуемом образце препарата принимали максимальное разведение, при котором в
ИФА значение оптической плотности в лунках было равно или более ОП критической (ОПкрит.); вычисление значения ОПкрит.
проводилось по формуле в соответствии с Инструкцией по применению набора.
**7 /12,1% – числитель: количество образцов препарата с данным показателем титра; знаменатель: % от общего числа исследованных образцов.
III. Определение содержания специфических иммуноглобулинов класса G в образцах 58 серий препарата
Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита методом ИФА с применением отечественного коммерческого набора реагентов для ИФА – «Векто ВКЭ –
IgG». После получения удовлетворительных результатов
по воспроизводимости данных по содержанию иммуноглобулина G к ВКЭ в наборах реагентов отечественного
и зарубежного производства в дальнейшем для тестирования образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин
человека против клещевого энцефалита нами был выбран отечественный набор для ИФА – «Векто ВКЭ – IgG».
Набор реагентов для ИФА «Векто ВКЭ – IgG», производства ЗАО «Вектор-Бест» разработан более 10 лет
тому назад, зарегистрирован в РФ и с успехом применяется для диагностики КЭ, мониторинга этой инфекции, для изучения иммунного статуса привитых против
КЭ многими российскими специалистами [15, 16].
Нами было проведено тестирование образцов 58
серий препарата Иммуноглобулин человека против
клещевого энцефалита в вышеуказанном наборе реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулина класса G. Использовали подобранное нами
исходное разведение (1:400–1:800) исследуемых образцов этого препарата.
Результаты представлены в таблице 6 и на рисунке 2.
На представительном количестве образцов серий
препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита показана возможность выявления
специфических иммуноглобулинов класса G по титру –
соответствующему максимальному разведению препарата с положительным результатом анализа.
Согласно данным таблицы 6 и рисунка 2, наибольшее
количество образцов серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита содержало иммуноглобулины класса G к вирусу КЭ в титре
1:12800 и 1:25600, образцы 7 серий – в титре 1:6400.
34
Рис. 2. Определение уровня иммуноглобулинов класса
G к вирусу КЭ в образцах иммуноглобулина человека
против КЭ, методом ИФА.
Таким образом, при исследовании образцов 58 серий препарата Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита показано, что титры иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в ИФА превышают в 10–40
раз титры антител, определяемых в РТГА.
Выводы:
1. Показана возможность дополнительной характеристики препарата Иммуноглобулин человека против
клещевого энцефалита по содержанию иммуноглобулинов класса G при титровании образцов 58 серий этого препарата методом ИФА в наборе реагентов отечественного производства «Векто ВКЭ – IgG».
2. Подобраны условия проведения ИФА для выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ в препарате Иммуноглобулин человека против клещевого
энцефалита. Подтверждена специфичность выявления
иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ параллельными исследованиями препаратов иммуноглобулинов
человека нормальных (Иммуновенин, Пентаглобин,
Плазма для фракционирования, субстанция), не содержащих антитела к вирусу КЭ по данным РТГА.
3. Воспроизводимость метода ИФА в применении
к титрованию препарата Иммуноглобулина человека
против клещевого энцефалита подтверждена при параллельном титровании образцов трех серий препарата в трехкратном повторении в двух наборах реагентов
для ИФА отечественного и зарубежного производства.
8. Инструкция по применения лекарственного препарата для медицинского применения Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита.
Литература:
11. Инструкция по применению набора реагентов Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА,
РСК, РРГ.
1. Воронкова Г.М., Николаева С.П., Захарычева Т.А.,
Воробьева М.С., Шарыгин С.Л. Лечебный эффект
донорских специфических иммуноглобулинов при
клещевом энцефалите // Биопрепараты. 2005. № 2
(18). С. 15.
2. Козлова И.В., Злобин В.И., Воробьева М.С., Верхозина М.М. Иммуноглобулины и тест-системы для
профилактики и диагностики клещевого энцефалита // Экспресс-диагностика и экстренная профилактика иксодовых клещевых инфекций. М. 2009.
З. Пеньевская Н.А. Оценка эффективности этиотропной профилактики инфекций, передающихся клещами: проблемы теории и практики. Омск. 2010.
229 с.
4. Субботина Л.С. Результаты использования метода
ELISA при изучении клещевого энцефалита и бешенства // Журн. микробиологии, эпидемиологии
и иммунобиологии. 1985. № 1. С. 73–77.
5. Билалова Г.П. Вакцина клещевого энцефалита
«ЭнцеВир»: иммунобиологические и клинические
испытания: Автореф. дис. … канд. мед. наук. Уфа.
2003.
6. Инструкция по применению: «ЭнцеВир», вакцина
клещевого энцефалита культуральная очищенная
концентрированная инактивированная сорбированная, производства ФГУП «НПО «Микроген»,
PN000763/01 – 180309/.
7. Инструкция по применению: «Вакцина клещевого
энцефалита культуральная, очищенная, концентрированная, инактивированная, сухая», производства ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов ИПВЭ им. М.П.
Чумакова РАМН», РN003793/01.
9. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 2010.
гл. 6. раздел 6.4.
10. Фармакопейная статья предприятия ЛС-001279010811: Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, раствор для внутримышечного
введения.
12. Инструкция по применению набора реагентов для
иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита «Векто ВКЭ – IgG».
13. Инструкция по применению набора реагентов для
иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к вирусу клещевого энцефалита
«NovaLisa TBE /FSME IgG-ELISA».
14. Островская Л.А., Верета Л.А., Мжельская Т.В. и др.
Штамм вируса клещевого энцефалита № 139 для
приготовления гемагглютинирующего инактивированного диагностикума (Авт. Свидетельство на
изобретение № 107 / 1634 от 8.10.83).
15. Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Бархалева
О.А. и др. Иммунный ответ при экспресс-иммунизации против клещевого энцефалита вакцинами
«ЭнцеВир» (Россия) и «ФСМЕ – Иммун» (Австрия)
// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2009.
№ 5 (48). С. 61.
16. Николаева С.П., Воронкова Г.М., Мжельская Т.В. и
др. Специфическая диагностика клещевого энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов в Хабаровском крае // Биопрепараты. 2005. № 2 (18).
С. 11.
17. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.:
Изд-во медицинской литературы, 1962. С. 16.
18. Гланц С. Медико-биологическая статистика, М.
1999. С . 32–36.
19. ГОСТ Р ИСО 16269-2004: Статистическое представление данных. Медиана.
35
Оригинальные статьи
Июль – Сентябрь 2013
Сравнительное изучение штаммов
вируса гриппа для приготовления вакцин
и диагностических препаратов
эпидемического сезона 2012–2013 гг.
Миронов А.Н., Лонская Н.И., Шевцов В.А., Саркисян К.А., Мефед К.М., Хамитова М.Ф.
Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
Comparative study of influenza virus strains
for the preparation of vaccines and diagnostic
products for epidemic season 2012–2013
Mironov A.N., Lonskaya N.I., Shevtsov V.A., Sarkisyan K.A., Mefed K.M., Khamitova M.F.
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expertise of Medical Application Products»
of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
Для эпидемического сезона 2012–2013 гг. Всемирной организацией здравоохранения
(ВОЗ) были рекомендованы для производства гриппозных вакцин и диагностических препаратов два новых антигенно актуальных штамма вируса гриппа: типа А, подтипа А/Н3N2/,
подобных А/Виктория/361/2011, и типа В, подобных В/Висконсин/1/10. В соответствии с
рекомендациями ВОЗ были подготовлены варианты штаммов для приготовления вакцин
и диагностических препаратов. В данной статье представлены данные сравнительного
изучения антигенной структуры и ряда биологических свойств новых штаммов для инактивированных гриппозных вакцин, живых гриппозных вакцин и диагностических препаратов,
полученных из ВОЗ, ФГБУ НИИ гриппа Минздрава России, ФГБУ НИИЭМ РАМН и ФГУП НПО
«Микроген» Минздрава России.
Ключевые слова: штаммы вируса гриппа, гемагглютинин, антигенная структура, биологические
свойства штаммов, гриппозные вакцины, диагностические гриппозные препараты.
Библиографическое описание: Миронов А.Н., Лонская Н.И., Шевцов В.А., Саркисян К.А., Мефед
К.М., Хамитова М.Ф. Сравнительное изучение штаммов вируса гриппа для приготовления вакцин и диагностических препаратов эпидемического сезона 2012–2013 гг. // Биопрепараты. 2013. № 3. С. 36–40.
For the epidemic season of 2012-2013 the World Health Organization (WHO) has been
recommended two new antigenically relevant strains of influenza virus type A, subtype A/H3N2 /
similar to A/Viktoria/361/2011, and type B, similar to B / Wisconsin / 1/10 for the production
of influenza vaccines and diagnostic products. According to the WHO recommendations several
variants of strains for vaccine and diagnostic products has been prepared. The present article
provides the comparative study of the antigenic structure and certain biological characteristics
of new strains for inactivated influenza vaccines, live influenza vaccines and diagnostic products
collected from the WHO, Federal State Budgetary Institution Research Institute of Influenza
of the Ministry of Health of the Russian Federation, Federal State Budgetary Institution Institute
of Experimental Medicine of the Russian Academy of Medical Sciences and Federal State Unitary
Enterprise Science and Production Association «Microgen» of the Ministry of Health and Social
Development of the Russian Federation.
Key words: strains of influenza virus, hemagglutinin, antigenic structure and biological properties
of the strains, influenza vaccines, influenza diagnostic products.
Bibliographic description: Mironov A.N., Lonskaya N.I., Shevtsov V.A., Sarkisyan K.A., Mefed K.M.,
Khamitova M.F. Comparative study of influenza virus strains for the preparation of vaccines and diagnostic
products for epidemic season 2012-2013 // Biopreparation (Biopharmaceuticals). 2013. № 3. P. 36–40.
36
Для корреспонденции:
Лонская Н.И. – главный эксперт Управления экспертизы противовирусных МИБП
ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, 119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41
e-mail: Lonskaya@expmed.ru
Статья поступила 13.05.2013 г., принята к печати 20.08.2013 г.
Штаммы вируса гриппа для производства гриппозных вакцин и диагностических препаратов требуют ежегодного обновления в связи с изменчивостью вируса
гриппа [6, 16, 17]. Этот процесс ограничен во времени,
так как антигенная структура актуальных для следующего эпидемического сезона вирусов гриппа, может быть
определена только после окончания текущего эпидемического сезона и проведения соответствующего анализа
этиологии заболеваемости прошедшей эпидемии [6–8].
При этом необходимо подготовить штаммы как можно
быстрее для передачи на производства для приготовления вакцин предстоящего эпидемического сезона.
С другой стороны, штаммы для производства живых и
инактивированных гриппозных вакцин должны быть подготовлены с учетом типа вакцины. Для живых гриппозных
вакцин штаммы должны быть аттенуированы и не вызывать заболеваний у человека, для инактивированных
гриппозных вакцин важна высокая репродуктивность
вируса [10–12, 14]. Вирус должен быть достаточно иммуногенным и нейтрализовать значительное количество
антигенных вариантов предстоящего эпидемического
сезона. Штаммы должны соответствовать требованию
генетической совместимости с вирусами-донорами внутренних генов, ответственных за аттенуацию или высокую репродуктивность [15, 19]. Штаммы для диагностических препаратов должны выявлять широкий спектр
антигенных вариантов при изучении антител заболевших
или индуцировать выработку антител широкого спектра
активности для диагностических сывороток [13].
В Российской Федерации для производства диагностикумов готовят ингибиторорезистентные штаммы
вируса гриппа, что позволяет при проведении ряда исследований не проводить обработку сывороток рецептор-разрушающим энзимом (RDE).
Штаммы, входящие в состав вакцин, должны соответствовать по антигенной структуре вирусам, которые будут
циркулировать в предстоящем эпидемическом сезоне,
учитывая антигенный дрейф гемагглютинина (ГА) и нейраминидазы (НА). Определяющим являются антигенные изменения в ГА, так как известно, что антигемагглютинирующие антитела обладают нейтрализующей активностью и
изменения молекулы ГА позволяют вирусу гриппа выживать и распространяться в человеческой популяции [3–5].
Первостепенное значение отводится тестированию
штаммов вируса гриппа при определении его взаимодействия с другими штаммами в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), несмотря на важность сведений,
получаемых современными молекулярно-биологическими методами (полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование) [16].
В эпидемическом сезоне 2012–2013гг. проведена
замена двух из трех, входящих в состав сезонных грип-
позных вакцин, штаммов [9, 20]. Подготовлены новые
штаммы – антигенные аналоги, рекомендованных ВОЗ
для приготовления вакцин и диагностических препаратов, изучение которых необходимо при их внедрении, с
целью оценки показателей их качества и соответствия
требованиям, предъявляемым к штаммам, рекомендуемым для противогриппозных препаратов.
Материалы и методы
Штаммы вируса гриппа типа А: А/Висконсин/15/09/
Н3N2/ИР (ФГБУ НИИ гриппа Минздрава России)*; А/
Виктория/361/2011/Н3N2 (ФГБУ НИИ гриппа Минздрава России); А/17/Виктория/2011/89/Н3N2 (ФГБУ
НИИЭМ РАМН); А/Виктория/361/2011/Н3N2/(Nib-79)
(Посевной вирус ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава
России); А/Виктория/361/2011/Н3N2/(RА-32) (ФГБУ
НИИ гриппа Минздрава России).
Штаммы вируса гриппа типа В: В/Висконсин/1/10
(ФГБУ НИИ гриппа Минздрава России); В/Висконсин/1/10, ВХ-41 (Посевной вирус ФГУП НПО «Микроген» Минздрава России); В/60/Висконсин/2010/125
(ФГБУ НИИЭМ РАМН); В/Санкт-Петербург/40/09 (ФГБУ
НИИ гриппа Минздрава России).
Для накопления вирусного материала вирусы культивировали в аллантоисной полости 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов (КЭ).
Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) проводили по общепринятой методике с использованием
0,5% взвеси куриных эритроцитов.
Определяли инфекционную активность штаммов при
размножении при разных температурах (32–34, 25–26,
38–40оС), стабильность инфекционной активности при
нагревании, термостабильность гемагглютинирующей
активности, чувствительность к ингибиторам нормальных сывороток животных, стабильность изученных
свойств после 5 пассажей на развивающихся КЭ.
Штаммы адаптированы к куриным эмбрионам и активно размножаются при температуре 32–34оС, обладают специфичностью, по антигенной структуре
соответствуют господствующей антигенной разновидности. Штаммы для живых гриппозных вакцин температурочувствительны и адаптированы к пониженной температуре культивирования (ts-фенотип и ca-фенотип).
Результаты и обсуждение
Сравнительное изучение антигенной структуры штаммов вируса гриппа, предназначенных для приготовления
вакцинных и диагностических препаратов для использования в течение эпидемического сезона 2012–2013 гг., в
РТГА показало, что все они идентичны эталонному штам-
37
Июль – Сентябрь 2013
Таблица 1. Антигенная характеристика вирусов А/Н3N2/ для эпидемических сезонов 2011–2012 гг. и 2012–2013 гг.
Иммунные сыворотки к вирусам гриппа А/Н3N2/
Диагностическая сыворотка
А/Висконсин
/15/09
Сыворотка к
ГА штамма А/
Перт/16/09
Сыворотка
к ГА
А/Висконсин
/15/09
Иммунная
сыворотка к
штамму
А/Виктория/361/2011
Иммунная
сыворотка
к штамму
А17/Виктория/2011/89
Иммунная
сыворотка к
штамму RА-32
А/Висконсин/15/09 ИР
(сезон 2011–2012 гг.)
160*
2560
1280
640
320
320
2
А/Виктория/361/2011
40
320
640
640
320
640
3
А/17/Виктория/2011/89
20
320
320
320
320
640
4
А/Виктория/361/2011
(Nib-79)
40
320
320
640
160
320
5
А/Виктория/361/2011 (RА-32)
20
640
160
320
320
640
№
п/п
Вирусы гриппа А/Н3N2/
1
Примечание. 1 и 2 – штаммы для диагностикумов.
3 – вакцинный (атенуированный) штамм для живой гриппозной вакцины.
4 и 5 – штаммы для инактивированных гриппозных вакцин.
*Величина, обратная разведению в РТГА.
му А/Виктория/361/2011 /Н3N2/ и реагировали с гомологичными сыворотками до титра или 1/2 титра. В то время,
как штаммы предыдущего сезона, подобные А/Висконсин/15/2009/Н3N2/, отличались на 1/4–1/8 титра (табл. 1).
Штаммы вируса гриппа типа В соответствовали по
антигенной характеристике эталонному штамму В/Висконсин/1/10 (табл. 2) и отличались от штаммов предыдущих лет на 1/2–1/8 титров антител.
При определении ингибиторочувствительности
было выявлено различие штаммов по данному признаку. Все штаммы подтипа А/Н3N2/ были резистентны к
ингибиторам нормальной сыворотки лошади, тогда
как ингибиторорезистентность вирусов гриппа типа
В была отмечена только у штаммов, предназначенных
для производства диагностических препаратов. Ингибиторорезистентность нормальных сывороток морских
свинок также была несколько ниже для диагностических штаммов, остальные сыворотки (кроликов, мышей) практически не различались по этому показателю
(табл. 3). Штаммы для производства диагностических
препаратов резистентны к ингибиторам нормальной
лошадиной сыворотки. Различия свойств изученных
штаммов сохранялись после 5-ти пассажей на КЭ, что
позволяет судить об их генетической стабильности.
Гемагглютинины штаммов вируса гриппа подтипа А/
Н3N2/ первого и пятого пассажей были термостабильными при нагревании в течение 1 ч при температуре 56 и
60°С, в то время как гемагглютинины вируса гриппа типа
Таблица 2. Антигенная структура вирусов гриппа типа В для эпидемических сезонов 2011–2012 гг. и 2012–2013 гг.
Иммунные сыворотки к вирусам гриппа типа В
Диагностическая
Диагностическая Диагностическая
Диагностическая
сыворотка В/
сыворотка
сыворотка
В/Висконсин/­
сыворотка
В/Висконсин/10
Санкт-Петербург/
В/Иоханнесбург
В/Бейджинг
1/10
В/Брисбен
40/09
/05/99
/184/93
№
п/п
Вирусы гриппа
типа В
1
В/Висконсин/1/10
320*
320
40
20
160
80
2
В/Висконсин/1/10 ВХ-41
160
160
40
20
80
80
3
В/60/Висконсин/20/10/125
160
320
40
20
80
160
4
В/Санкт-Петербург/40/09
(сезон 2011-2012 гг.)
20
10
160
160
40
20
Примечания. 1 – штамм для диагностикума.
2 – штамм для инактивированных гриппозных вакцин.
3 – вакцинный (атенуированный) штамм для живой гриппозной вакцины.
4 – штамм для диагностикума.
*Величина, обратная разведению в РТГА.
38
Таблица 3. Чувствительность к ингибиторам нормальных сывороток животных
№
п/п
Вирусы гриппа А/Н3N2/
1
Сыворотки животных
лошадь
морская свинка
кролик
мышь
А/Висконсин/15/09 ИР
<10*
20
80
80
2
А/Виктория/361/2011
<10
20
80
40
3
А/17/Виктория/2011/89
<10
80
80
80
4
А/Виктория/361/2011
(Nib-79)
<10
40
160
80
5
А/Виктория/361/2011 (RА-32)
<10
80
160
80
Вирусы гриппа
типа В
6
В/Висконсин/1/10
<10
<10
40
20
7
В/Висконсин/1/10
ВХ-41
20
40
20
160
8
В/60/Висконсин/2010/125
40
80
20
160
9
В/Санкт-Петербург/40/09
<10
20
20
10
Примечание. 1 и 2 – штаммы для диагностикумов.
3 и 8 – вакцинные (атенуированные) штаммы для живой гриппозной вакцины.
4 и 5 – штаммы для инактивированных гриппозных вакцин.
6 и 9– штаммы для диагностикумов.
7 – штамм для инактивированных гриппозных вакцин.
*Величина, обратная разведению в РТГА.
Таблица 4. Биологические свойства штаммов
Термостабильность
инфекционной
активности
lg ЭИД50/0,1 мл
32–34 °С
Термостабильность ГА
№
п/п
Штаммы вирусов гриппа
Размножение при
разных температурах
lg ЭИД50/0,1 мл
Исходн.
30 мин
56°С
1ч
56°С
30 мин
60°С
1ч
60°С
Не прогреты
Прогреты
15мин
56°С
26°С
39°С
1
А/Виктория/361/2011
640*
320
320
160
160
7,0
5,66
5,1
6,0
2
А/17/Виктория/2011/89
320
320
320
320
320
8,33
6,03
7,33
3,33
3
А/Виктория/361/2011
(Nib-79)
320
160
160
160
160
7,66
5,0
5,33
6,33
4
RA-32
640
640
320
320
320
7,2
5,66
5,0
6,0
5
В/Висконсин/1/10
160
160
160
160
< 10
8,33
6,0
6,0
5,33
6
В/Висконсин/1/10(ВХ-41)
320
160
160
160
< 10
6,33
5,66
6,5
4,33
7
В/Висконсин/2010/125
320
160
160
80
< 10
8,5
6,0
7,0
2,66
Примечания. 1 – штамм для диагностикума.
2 и 7 – вакцинные (атенуированные) штаммы для живой гриппозной вакцины.
3 и 4 – штаммы для инактивированных гриппозных вакцин.
5 – штамм для диагностикума.
6 – штамм для инактивированной гриппозной вакцины.
*Величина, обратная разведению в РТГА.
39
Июль – Сентябрь 2013
В были термостабильны при 56°С, но инактивировались
после прогревания в течение 1 ч при температуре 60°С.
Инфекционная активность снижалась после нагревания при 56°С на 1,5–2.0 lg у всех изученных штаммов. Изучение влияния температуры культивирования
подтвердило характеристику штаммов нового сезона,
предназначенных для живых гриппозных вакцин, значительное снижение титра при температуре 39°С и способность к размножению при пониженной температуре
в более высоких титрах по сравнению с остальными не
атенуированными штаммами (табл. 4).
Выводы:
Сравнительное изучение биологических свойств
штаммов вируса гриппа предназначенных для
различных типов гриппозных вакцин и диагностических
препаратов позволило оценить пригодность данных
штаммов для введения их в практику здравоохранения: идентичность антигенной характеристики
и соответствие антигенной структуре актуальных
штаммов, рекомендованных ВОЗ для эпидемического
сезона 2012–2013 гг., наличие у штаммов для живых
гриппозных вакцин температурочувствительности и их
адаптация к репродукции при пониженной температуре
культивирования (ts фенотип и ca фенотип).
Инфекционная активность данных штаммов при
культивировании при температуре 39°С не превышала
3,3 lgЭИД50/0,1 мл для штамма А/17/Виктория/2011/89
и 2,66 lgЭИД50/0,1 штамма В/Висконсин/2010/125.
Штаммы для диагностических препаратов резистентны к ингибиторам нормальной лошадиной сыворотки. Биологические свойства изученных штаммов
сохранялись после 5 пассажей на куриных эмбрионах,
что позволяет судить об их генетической стабильности.
Литература
1. Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и
куриных эмбрионах и их идентификация: Метод. рекомендации. СПб. 2006.
2. Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высокопатогенными
штаммами вируса гриппа А(Н1N1) у людей: Метод.
рекомендации. М. 2009.
3. Rota P.A., Hemphill M.L., Whistler T. et al. Antigenic and
genetic characterization of the hemagglutinins of recent
cocirculation strains of influenza B virus // J. Gen. Virol.
1992. V. 73. P. 2737–2742.
4. Бурцева Е.И., Щелканов М.Ю., Колобухина Л.В. и
др. Анализ результатов надзора, лабораторной диагностики и выделения штаммов вирусов гриппа в базовых лабораториях ЦЭЭГ в период 2009-2011 гг. //
Грипп: эпидемиология, профилактика и лечение:
Сборник НИИ гриппа. СПб. 2011. С. 12–16.
5. Еропкин М.Ю., Даниленко Д.М., Коновалова
Н.И. и др. Выделение и антигенная характеристика вирусов гриппа, циркулировавших в России в эпидемические сезоны 2009-2011 гг. //
Грипп: эпидемиология, профилактика и лечение:
40
Сборник НИИ гриппа. СПб. 2011. С. 37–41.
6. Карпова Л.С., Бурцева Е.И., Поповцева Н.М., Столярова Т.П. Сравнение эпидемий гриппа в России 2009
и 2011 годов, вызванных пандемическим вирусом
гриппа А(Н1N1) // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011. Т. 60 (5). С. 6–15.
7. Hay A.J., Daniels R., Lin Y.P., Zheng X., Hou T., Gregory V.
et al. WHO influenza centre report. Sept. 2009. London.
2009. P. 1–31.
8. Lin Y.P., Gregory V., Bennett M., Hay A. Recent changes
among human influenza viruses // Virus Res. 2004.
V. 03. P. 47–52.
9. Summary of NIMR Results. Final Report for WHO
meeting: 20–22 February 2012 [электронный ресурс]:
http://www. Nimr.mrc. as.uk/documents/about/interimreport-feb-2012.pdf.
10. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб. 1994.
11. Александрова Г.И. Применение метода генетической
реассортации для получения вакцинных штаммов
вируса гриппа // Вопросы вирусологии. 1997. № 4.
С. 387–395.
12. Гендон Ю.З. Живая холодоадаптированная гриппозная вакцина: современное состояние // Вопросы вирусологии. 2011. № 1. С. 4–17.
13. Методические указания МУ 3.3.2.1758-03. Методы
определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики
гриппа. М. 2003.
14. Kendal A.P., Maasab H.F., Alexandrova G.I., Gherudon
Y.Z. Development of cold-adapted recombinant live
attenuated influenza A vaccines in the USA and USSR //
Antiviral Res. 1981. V. 1. P. 339–365.
15. Цыбалова Л.М., Киселев О.И. Универсальные вакцины против гриппа. Разработки, перспективы использования // Вопр. вирусол. 2012. Т. 1. С. 9–13.
16. Грудинин М.П., Комиссаров А.Б., Писарева М.М.,
Стукова М.А., Бузицкая Ж.В., Паянкова А.А., Елпаева
Е.А., Задонская А.В., Иванов Я.В., Киселев О.И. Генетическое разнообразие и молекулярная эволюция
вирусов гриппа А в России в 2006-2012 гг. // Грипп:
эпидемиология, профилактика и лечение. Сб. НИИ
гриппа. СПб. 2011. Т. 6. С. 37–42.
17. Лобова Т.Г., Прокопец А.В., Комиссаров А.Б., Даниленко Д.М., Паянкова А.А., Суховецкая В.Ф., Гудкова
Т.М., Григорьева В.А., Грудинин М.П., Еропкин М.П.
Эволюционная изменчивость вирусов гриппа В, циркулировавших в Российской Федерации с 2005 по
2012 г. // Грипп: эпидемиология, профилактика и лечение. Сб. НИИ гриппа. СПб. 2012. Т. 6. С. 22–26.
18. Еженедельный бюллетень Euro Flu. [электронный ресурс]: http://www.euroflu.org бюллетень.
19. Киселев О.И. Геном пандемического вируса гриппа
А/Н1N1-2009. М.: «Димитрейд График Групп», 2011.
20. Report prepared for the WHO annual consultation on
the composition of influenza vaccine for the Northern
Hemisphere, 20–22 February 2012 / WHO influenza
Centre, London. 2012. P. 1–73.
Оригинальные статьи
Доклинические исследования новой
пятикомпонентной
Вакцины АКДС-ГЕП В+ХИБ
Николаева А.М., Петровских В.П., Соснина О.Ю., Белякова О.В., Вязникова Т.В., Афанасьева Т.М.
Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед», г. Пермь
Preclinical research of the new pentavalent
DPwP-HBV+HIB (Haemophilus influenzae
type b) vaccine
Nikolaeva A.M., Petrovskikh V.P., Sosnina O.Yu., Belyakova O.V., Vyaznikova T.V., Afanasyeva T.M.
«Biomed» – Perm Branch of the Federal State Unitary Company “Microgen”, of the Ministry of Health of the
Russian Federation, Perm
Проведены доклинические исследования новой пятикомпонентной вакцины против коклюша,
дифтерии, столбняка, гепатита В, гемофильной инфекции тип b (вакцины АКДС-Геп В+ХИБ)
производства ФГУП НПО «Микроген». Установлено, что вакцина не обладает токсическими
свойствами и формирует напряженный иммунитет в отношении всех компонентов, входящих
в ее состав.
Ключевые слова: вакцина, доклинические исследования, острая и хроническая токсичность, специфическая активность.
Библиографическое описание: Николаева А.М., Петровских В.П., Соснина О.Ю., Белякова О.В.,
Вязникова Т.В., Афанасьева Т.М. Доклинические исследования новой пятикомпонентной Вакцины
АКДС-ГЕП В+ХИБ // Биопрепараты. 2013. № 3. С. 41–44.
Preclinical research of the new pentavalent vaccine against pertussis, diphtheria, tetanus, hepatitis
B, haemophilus influenzae type b (DPwP-HBV+HIB) developed at FSUC «Microgen» has been carried
out. It has been demonstrated that the vaccine doesn’t possess toxicity properties and provides a
strong immune response to each antigen comprising the vaccine.
Key words: vaccine, preclinical research, acute and chronic toxicity, specific activity.
Bibliographical entry: Nikolaeva A.M., Petrovskikh V.P., Sosnina O.Yu., Belyakova O.V., Vyaznikova T.V.,
Afanasyeva T.M. Preclinical research of the new pentavalent DТP-HBV+HIB (Haemophilus influenzae type b)
vaccine // Biopreparations. 2013. № 3. P. 41–44.
Для корреспонденции:
Николаева А.М. – заместитель директора по науке и инновационному развитию
филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России
«Пермское НПО «Биомед».
Адрес: 614089, г. Пермь, ул. Братская, 177
e-mail: a.m.nikolaeva@perm.microgen.ru
Статья поступила 05.04.2013 г., принята к печати 22.08.2013 г.
Разработка комбинированных вакцин является приоритетным направлением современной вакционологии.
Комбинированные вакцины, включающие цельноклеточный антиген Bordetella pertussis, дифтерийный и столбнячный анатоксины занимают центральное место в Расширенной программе иммунизации ВОЗ. Включение
новых антигенов в существующие комбинированные вакцины позволяет не только уменьшить стрессовую нагрузку на прививаемых, но и более успешно реализовать про-
ведение вакцинации в сроки, определенные календарем
прививок, снизить загруженность медицинских работников и соответственно уменьшить стоимость программ
иммунизации. Тем не менее, важно иметь доказательства,
что комбинированное введение нескольких вакцинных антигенов не снижает безопасность и эффективность иммунизации по сравнению с их введением по отдельности [3].
Цель работы: разработка и проведение лабораторно-экспериментального (доклинического) иссле-
41
Июль – Сентябрь 2013
дования иммунобиологических свойств новой пятикомпонентной вакцины против коклюша, дифтерии,
столбняка, гепатита В и гемофильной инфекции тип b
(вакцины АКДС-Геп В+ХИБ).
Материалы и методы
При конструировании комбинированных вакцин
были использованы следующие препараты: анатоксин
дифтерийный очищенный концентрированный (ФСП
№002161-060612), анатоксин столбнячный очищенный
концентрированный (ФСП Р№001040/01-060712), нативная коклюшная суспензия (ФСП №42-8909-07) производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава
России Пермское НПО «Биомед»; поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) и синтетический полирибозилрибитолфосфат, конъюгированный со столбнячным анатоксином, производства Эбер Биотек, Куба.
В качестве препаратов сравнения использовали вакцины: АКДС и АКДС-Геп В (Пермское НПО «Биомед»);
моновакцины против ХИБ инфекции – АКТ-ХИБ (Санофи Пастер, Франция) и Кими-ХИБ (Эбер Биотек, Куба).
Экспериментальные исследования выполнены на 72
белых беспородных крысах массой 160–220 г, 312 морских свинках массой 250–350 г, 40 кроликах шиншилла
массой 2,0–2,5 кг, 390 мышах белых беспородных массой 16–18 г, 340 мышах гибридах F1 (C57BL/6J×CBA)
массой 10–12 г, 365 мышах линии balb/c массой 12–14 г.
Опыты по исследованию токсичности препарата
проводили согласно действующим методическим документам [1, 4–6]. Общетоксическое действие пентавакцины исследовали на крысах и морских свинках.
Препарат вводили в дозе, эквивалентной предлагаемой для человека в пересчете на 1 кг массы животного.
Исходя из дозы для ребенка 0,5 мл на 7 кг: 1 доза для
крысы составила 40,9 мкл/190 г кр., 1 доза для морской
свинки – 63,6 мкл/300 г м.св.
Для изучения острой токсичности крысам вводили
испытуемый препарат внутримышечно однократно в
объеме 5 мл (120 доз), морским свинкам – однократно
в объеме 5 мл (80 доз). Животным контрольной группы
водили внутримышечно аналогичное количество 0,9%
раствора натрия хлорида
В опыте хронической токсичности – внутримышечно
по одной дозе в течение 10 сут. Контрольным животным
вводили в том же количестве физиологический раствор. Наблюдение за животными при изучении острой
токсичности вели в течение 14 суток, при хронической –
в течение 31 суток. Ежедневно регистрировали следующие показатели: гибель животных, их вес, наличие
или отсутствие клинических симптомов интоксикации.
Через 24 часа, 7 суток и 14 суток (21 сутки для хронической токсичности) после последнего введения препарата у 6 крыс (3 самцов и 3 самок) и 12 морских свинок
(6 самцов и 6 самок) из опытных и контрольных групп
отбирали кровь для определения биохимических и гематологических показателей, затем животных подвергали эвтаназии. Патоморфологическое исследование
включало в себя макроскопическое и гистологическое
исследование внутренних органов. Для проведения ги-
42
стологических исследований фиксировали следующие
органы: головной мозг, сердце, печень, селезенку, почки, надпочечники, тимус, лимфатические узлы (паховый, брыжеечный).
Определение иммуногенности компонентов вакцин
(дифтерийного, столбнячного, коклюшного и гепатитного), контроль безвредности комбинированных вакцин на белых мышах и морских свинках, определение
полноты сорбции компонентов комбинированных вакцин проводили в соответствии с действующими фармакопейными статьями на АКДС и АКДС-Геп В вакцины.
Иммуногенную активность ХИБ-компонента оценивали в опытах на кроликах. Иммунизацию проводили
двукратно в дозе 0,5 мл внутримышечно с интервалом
14 суток. Отбор сывороток осуществляли до иммунизации, перед второй иммунизацией и на 7 сутки после
второй иммунизации. Определение антител к полисахариду H. influenzae тип b проводили с помощью тестсистемы «Rabbit Anti-Haemophilus influenzae type b IgG
ELISA Assay» («XpressBio», США), в которой в качестве
положительного контроля использовали кроличью сыворотку, откалиброванную нами относительно международного стандарта Anti-ХИБ Human Reference Serum
(NIBSC, 96/536). Кроме того, в сыворотках иммунизированных кроликов титр специфических антител
определяли для каждого антигена, входящего в состав
вакцин, методом иммуноферментного анализа (ИФА):
к коклюшным антигенам Bordetella pertussis, дифтерийному и столбнячному анатоксинам с помощью тестсистем (НПО «Биомед», г. Пермь) с использованием
коммерческого конъюгата анти-IgG кролика (SDT, Германия); анти-HBs с помощью тест-системы «Микрат
Анти-HBs» («Имбио», Н-Новгород).
Статистическую обработку результатов проводили
с использованием методов описательной статистики.
Достоверность различий между группами оценивали с
помощью t-критерия Стьюдента. В работе использовали пакеты статистических программ MS Excel, «DIASTA»
(МГУ, Россия), программу статистической обработки
результатов ИФА методом параллельных линий, программу «Биостат».
Результаты и обсуждение
Комбинированные вакцины представляют собой
препараты, состоящие из двух или более различных иммуногенов, скомбинированных в одной лекарственной
форме. Трудности создания сложной вакцины связаны,
прежде всего, с решением проблем совместимости ее
компонентов, стабильности и сохранения достаточной
иммуногенности препарата. Иммуногенная активность
компонентов сложных вакцин может зависеть от многих факторов: методов изготовления компонентов, качественных характеристик адъювантов, консервантов,
стабилизаторов. Кроме того, химическое или физическое взаимодействие между компонентами вакцины
может привести к нарушению иммунного ответа на них.
Представлялось целесообразным изучить совместимость синтетического ХИБ-компонента с составляющими вакцины АКДС-Геп В. Конструирование
Таблица 1. Иммунный ответ на компоненты экспериментальных серий комбинированных вакцин в опытах на кроликах
(средняя геометрическая титра)
Компоненты вакцин
Наименование препарата
Дифтерийный, МЕ/мл Столбнячный, МЕ/мл
Коклюшный,
ИЕ/мл**
Гепатитный,
мМЕ/мл
Гемофильный,
мкг/мл
АКДС-Геп В+ ХИБ
3,5
2,4-5,1
3,6
2,5-5,3
608,2
350,2-1056,4
1442,5
590,7-3522,4
58,1
29,3-115,2
АКДС+ ХИБ
2,5
1,4-4,4
2,7
1,8-4,1
694,3
295,0-1633,6
-
72,4
49,7-105,3
АКДС*
2,7
1,6-4,5
2,4
1,5-3,8
761,2
382,4-1515,1
-
-
АКДС-Геп В*
2,5
1,8-3,6
2,9
1,8-4,7
855,9
615,5-1190,3
867,1
235,7-3190,1
-
Кими-ХИБ, лиофилизированная форма
-
-
-
-
12,4
4,8-32,2
АКТ-ХИБ*
-
-
-
-
18,2
1,0-97,5
Кими-ХИБ*
-
-
-
-
15,3
7,3-32,0
*Препараты сравнения.
**Условные иммуноферментные единицы.
п­ятивалентной вакцины АКДС-Геп В+ХИБ проводили,
исходя из мирового опыта, т.е. предварительно была
разработана технология получения лиофилизированной ХИБ-вакцины, для которой в качестве растворителя использовали вакцину АКДС-Геп В, безопасность и
эффективность которой была подтверждена нами ранее [2].
Одна доза вакцины после приготовления содержала
15 Lf11 дифтерийного анатоксина, 5 Lf столбнячного анатоксина, 10 млрд. коклюшных бактерий�2, 5 мкг HBsAg, 10
мкг полирибозилрибитола фосфата, конъюгированного
со столбнячным анатоксином, а так же вспомогательные вещества: алюминия гидроксид, формальдегид,
тиомерсал, сахарозу, натрия хлорид, однозамещенный
натрия фосфат, двузамещенный натрия фосфат.
Результаты
изучения
совместимости
ХИБ1
Здесь и далее мутность микробной взвеси определяют по откалиброванному в международных единицах референс-препарату
мутности. 1 МЕ условно принята за 1 млрд. коклюшных бактерий.
компонента с компонентами АКДС-Геп В вакцины представлены в таблице 1.
Из представленных данных видно, что введение в
состав комбинированных вакцин ХИБ-компонента ни в
одном из изученных вариантов не приводило к снижению гуморального иммунного ответа на дифтерийный,
столбнячный, коклюшный и гепатитный компоненты. В
случае использования комбинированных вакцин, содержащих ХИБ-компонент, наблюдался более высокий
уровень антител к полисахариду H. influenzae тип b по
сравнению с моновакцинами против ХИБ-инфекции.
Таким образом, была продемонстрирована полная
иммунологическая совместимость компонентов дифтерийного, столбнячного, коклюшного, гепатитного и
ХИБ компонентов в составе предлагаемых комбинированных вакцин АКДС+ХИБ и АКДС-ГепВ+ХИБ.
Одним из важнейших этапов доклинической оценки новых вакцинных препаратов является изучение их
безопасности. В связи с этим целью следующего этапа
работы явилось изучение острой и хронической ток-
Таблица 2. Динамика изменения веса лабораторных животных при изучении острой и хронической токсичности
вакцины АКДС-Геп В+ХИБ
Время наблюдения
Крысы
Опыт
Морские свинки
Контроль
Опыт
Контроль
Острая токсичность
24 ч
183,8±10,2
183,6±11,3
286,25±24,75
289,16±19,55
7 сут
194,2±20,1
225,0±20,7
325,85±17,9
320,85±18,05
14 сут
206,3±46,4
231,7±19,9
334,5±30,4
352,1±29,25
327,05±33,1
Хроническая токсичность
24 ч
224,2±28,7
226,7±25,0
326,5±27,4
7 сут
234,2±34,6
229,2±38,3
372,9±21,5
357,5±32,7
21 сут
274,2±48,8
276,7±47,5
404,15±28,05
424,55±25,0
Примечание. Достоверных отличий между опытом и контролем не было (р>0,05).
43
Июль – Сентябрь 2013
Таблица 3. Результаты изучения иммуногенных свойств экспериментальных серий комбинированных вакцин в опытах
на животных
Наименование
препарата
Компоненты
Дифтерийный, МЕ/мл
(≥ 60 МЕ/мл)*
Столбнячный, МЕ/мл
(≥ 120 МЕ/мл)*
Коклюшный, МЕ/мл
(≥ 8 МЕ/мл)*
Гепатитный, относительная потенция
(≥ 0,5)*
Гемофильный,
% сероконверсии
(≥ 50)*
АКДС
132,0
245,5
13,6
-
-
АКДС+ ХИБ
100,0
283,9
11,4
-
100
АКДС-Геп В + ХИБ
93,3
206,2
13,0
1,7
100
АКДС-Геп В
123,13
228,2
10,89
1,09
-
*Требования ВОЗ.
сичности вакцины АКДС-Геп В+ХИБ.
При изучении пятикомпонентной вакцины АКДС-Геп
В+ХИБ в тестах острой и хронической токсичности не
наблюдалось снижения массы тела (табл. 2), гибели
животных, изменения поведенческой и двигательной
активности.
Патологических изменений внутренних органов и
значимых изменений биохимических и гематологических показателей крови не выявлено, что свидетельствует об отсутствии токсического действия препарата.
Проведенные исследования, доказавшие безопасность и эффективность вакцины АКДС-Геп В+ХИБ в отношении формирования гуморального иммунитета,
послужили основанием для разработки технологии ее
изготовления и оформления проектов нормативно-технической документации (регламент производства, ФСП).
В производственных условиях по разработанной технологии приготовлено 3 серии вакцины АКДС-Геп В+ХИБ.
Изучение физико-химических свойств, стерильности,
специфической безвредности, подлинности и специфической безопасности, иммуногенности (табл. 3) показало, что пятикомпонентная вакцина АКДС-Геп В+ХИБ для
профилактики дифтерии, столбняка, коклюша, гепатита
В и гемофильной инфекции тип b, полученная в производственных условиях, полностью соответствует требованиям, предъявляемым к препаратам такого класса отечественными нормативными документами и ВОЗ [7–9].
Таким образом, проведенные доклинические исследования показали, что пентавакцина АКДС-Геп В+ХИБ
безопасна, обладает выраженными иммуногенными
свойствами и может быть рекомендована для клинического изучения.
44
Литература:
1. Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических препаратов». М. 2010.
2. Николаева А.М. Конструирование комбинированных вакцин и иммуноферментных тест-систем для
профилактики и диагностики управляемых инфекций (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В): автореф. дис. … докт. биол. наук. Ч. 2003. 43 с.
3. Плоткин С. Вакцина АбКДС-ИПВ//PRP~T: обзор
16-летнего опыта клинического применения //Вопросы современной педиатрии. 2012. № 1. С. 18–
36.
4. РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых
медицинских иммунобиологических препаратов.
Основные положения». М. 1989.
5. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ Минздрава РФ / Под общей редакцией чл.корр. РАМН, проф. Хабриева Р.У. М. 2005.
6. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая.
М.: Гриф и К, 2012. 536 с.
7. Diphtheria, tetanus and pertussis (adsorbed) //
European Pharmacopeia, 6th Edition, 2008 P. 768–
769;
8. Haemophilus influenzae type b conjugate // European
Pharmacopeia, 6th Edition. 2008. P. 792–794;
9. Hepatitis B vaccine (rDNA) // European Pharmacopeia,
6th Edition, 2008. P. 800–801.
Хроника
9 августа 2013 года исполнилось 70 лет со дня рождения доктора медицинских наук, профессора Арташеса Аваковича Мовсесянца.
А.А. Мовсесянц родился в 1943 г. в г. Орджоникидзе. После окончания средней школы в 1962 г. поступил
и в 1968 г. закончил Северо-Осетинский Государственный медицинский институт по специальности «врачлечебник». С 1968 г. работал в Центральной районной
больнице г. Петушки Владимирской области в должности сельского участкового терапевта до 1970 г. С 1970 по
1971 г. – участковый терапевт в Москве.
В 1971–2011 гг. А.А. Мовсесянц работал в ГИСК им.
Л.А. Тарасевича, пройдя путь от младшего научного сотрудника до заместителя директора института по научной работе. В 1974 г. защитил диссертацию на соискание
ученой степени кандидата медицинских наук, посвященную изучению механизмов вакцинального процесса,
вызванного вирусом осповакцины, и развития поствакцинальных осложнений при оспопрививании у детей.
В 1994 г. под руководством одного из крупнейших ученых страны профессора Анатолия Тимофеевича Кравченко защитил докторскую диссертацию «Современные
проблемы лечения гидрофобии антирабическими препаратами».
Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации в 2003 году на базе лаборатории бешенства и оспы ГИСКа им. Л.А. Тарасевича был создан
Центр по борьбе с бешенством, руководителем которого назначен А.А. Мовсесянц. Центр и в настоящее время оказывает консультативную и практическую помощь
Арташес Авакович
Мовсесянц
(к 70-летию
со дня рождения)
Artashes Avakovich
Movsesyants
(on the 70th
birth anniversary)
учреждениям системы здравоохранения в их р­аботе по
оказанию медицинской помощи л­ицам, п­одвергшимся
риску заражения вирусом бешенства, и организации
профилактических мероприятий.
Являясь профессором кафедры эпидемиологии медико-профилактического факультета послевузовского
профессионального образования Первого московского государственного медицинского университета им.
И.М. Сеченова, А.А. Мовсесянц много внимания уделяет подготовке специалистов-эпидемиологов и хирургов-травматологов по оказанию антирабической помощи населению и иммунопрофилактике других опасных
инфекций.
Арташес Авакович является одним из ведущих специалистов страны по проблемам иммунопрофилактики
особо опасных и зоонозных инфекций. Неоднократно
представлял страну на международных конференциях.
С апреля 2011 г. по настоящее время Арташес Авакович – начальник Испытательного центра экспертизы качества медицинских иммунобиологических препаратов
ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.
Под руководством А.А. Мовсесянца защищены 3
кандидатские диссертации и одна докторская. Лично
и в соавторстве им опубликовано более 150 научных
работ.
А.А. Мовсесянц является членом редколлегий журналов «Биопрепараты», «Ведомости НЦЭСМП».
Награжден медалью ордена «За заслуги перед Отечеством» II степени, медалью «В память 850-летия
Москвы», знаком «Отличнику здравоохранения».
45
Хроника
Июль – Сентябрь 2013
30 августа 2013 г. исполнилось 60 лет со дня рождения доктора медицинских наук Лидии Васильевны Саяпиной.
Лидия Васильевна Саяпина родилась в 1953 г. в Саратове. После окончания школы поступила в Саратовский государственный медицинский институт, который
успешно закончила в 1976 г. по специальности «Педиатрия». После прохождения интернатуры Л.В. Саяпина
работала врачом-терапевтом в учреждениях здравоохранения.
В 1980 г. Лидия Васильевна поступила на работу в
Саратовский ВНИИ «Микроб», посвятив всю свою последующую жизнь изучению особо опасных инфекций,
их лечению и профилактике.
В 1981 г. Л.В. Саяпина переведена в ГИСК им. Л.А.
Тарасевича на должность младшего научного сотрудника лаборатории препаратов против чумы и других
особо опасных инфекций, которую, в последствии, возглавила. В 1995 году Лидии Васильевне присвоено ученое звание «Старший научный сотрудник» .
Основным направлением научной деятельности
Саяпиной Л.В. является разработка и оценка иммунобиологических препаратов, применяемых для вакцинации против возбудителей чумы, холеры, псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза, сапа, мелиоидоза,
легионеллеза, бруцеллеза, сибирской язвы и листериоза.
46
Лидия Васильевна
Саяпина
(к 60-летию
со дня рождения)
Lidia Vasilievna
Syapina
(on the 60th
irth anniversary)
В 1999 г. Лидия Васильевна защитила докторскую
диссертацию на тему «Совершенствование стандартизации и оценка качества средств диагностики особо
опасных инфекций».
С 2011 г. и по настоящее время Л.В. Саяпина – главный эксперт Управления экспертизы противобактериальных МИБП Центра экспертизы и контроля МИБП
ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.
Л.В. Саяпина является высококвалифицированным
специалистом с богатым научным опытом в области
разработки и внедрения лечебных и диагностических
препаратов против особо опасных инфекционных
заболеваний. При ее личном участии и непосредственном руководстве были усовершенствованы и
внедрены в практику многочисленные лечебные и
диагностические препараты, применяемые для диагностики, профилактики и лечения особо опасных
заболеваний.
Лидия Васильевна - член Диссертационного совета
старейшего научно-исследовательского противочумного учреждения нашей страны РосНИПЧИ «Микроб»
Роспотребнадзора, член редакционных коллегий журналов «Биопрепараты» и «Проблемы особо опасных
инфекций». Лично и в соавторстве опубликовала более
150 научных работ.
В 2000 г. Л.В. Саяпина награждена нагрудным знаком «Отличнику здравоохранения».
Хроника
31 августа 2013 г. исполнилось 55 лет со дня рождения кандидата медицинских наук, заслуженного врача
Российской Федерации Владимира Александровича
Шевцова.
В.А. Шевцов родился в 1958 г. в Минске. В 1975 г.
поступил в Калининский государственный медицинский
институт. После окончания в 1981 г. Военно-медицинского факультета – врач-специалист противочумного
отряда в Монгольской народной республике. С 1987 по
1998 гг. работал в санитарно-эпидемиологическом отряде Московского военного округа на должностях начальника отделения и отдела особо опасных инфекций
Московского военного округа.
В 2000 г. В.А. Шевцов защитил диссертацию на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
на тему «Эпидемиологические особенности коревой
инфекции в воинских коллективах в период массовой
вакцинопрофилактики».
С 1998 по 2010 гг. работал в Главном центре государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства обороны Российской Федерации на
Владимир Александрович
Шевцов
(к 55-летию
со дня рождения)
Vladimir Alexandrovich
Shevtsov
(on the 55th
birth anniversary)
должностях начальника отдела, начальника лаборатории особо опасных инфекций. Закончил службу в
звании полковника медицинской службы.
С августа 2010 г. – заведующий лабораторией кишечных вирусных инфекций ГИСК им Л.А. Тарасевича.
С апреля 2011 г. по настоящее время – начальник
управления экспертизы противовирусных медицинских
иммунобиологических препаратов Центра экспертизы
и контроля МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.
Владимир Александрович в 1995, 2008 гг. участвовал
в контртеррористической операции на Северном Кавказе, организуя проведение противоэпидемических мероприятий в местах дислокации воинских контингентов.
В.А. Шевцов лично и в соавторстве опубликовал
57 печатных работ. Награжден орденом «За военные
заслуги», нагрудным знаком «Отличнику здравоохранения», почетной грамотой Великого государственного Хурала Монголии. Указом Президента
Российской Федерации в 2010 г. В.А. Шевцову присвоено почетное звание Заслуженный врач Российской
Федерации.
47
Хроника
Июль – Сентябрь 2013
27 августа 2013 г. ушел из жизни Александр Александрович Ярилин – доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией дифференцировки
лимфоцитов Института иммунологии, профессор кафедры иммунологии биологического факультета МГУ
им. М.В. Ломоносова.
С основания Института иммунологии (1980 г.) А.А.
Ярилин возглавлял в нем лабораторию дифференцировки лимфоцитов, а с 1999 г. – отдел клеточной иммунологии. С 2002 г. он являлся профессором МГУ им.
М.В. Ломоносова, читал на биологическом факультете
курсы молекулярной иммунологии и иммуноморфологии. Его научные интересы были сосредоточены на
фундаментальных закономерностях развития и функционирования иммунной системы.
Профессор А.А. Ярилин опубликовал более 400
научных работ, в том числе 13 монографий, подготовил
32 кандидата и 8 докторов наук. Его учебник «Основы
иммунологии» (1999 г.), ставший классическим, открыл
для студентов и научных работников двери в этот увлекательный раздел биологии. Незадолго до болезни
48
Памяти
Александра
Александровича
Ярилина
(1941–2013)
Memory of Aleksandr
Aleksandrovich Yarilin
(1941–2013)
Александр Александрович успел завершить титанический труд по созданию нового большого учебника «Иммунология» (2010 г.).
А.А. Ярилин многие годы был членом редколлегий
журналов «Иммунология», «Цитокины и воспаление»,
«Медицинская иммунология», «Радиационная биология. Радиоэкология», «Успехи физиологических наук»,
«Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение»;
членом бюро Российского общества иммунологов и Научного совета по радиобиологии РАН.
Результаты научной и педагогической работы А.А.
Ярилина отмечены множеством премий и наград. Он
награжден медалью «В память 850-летия Москвы»,
знаком «Ветеран атомной энергетики и промышленности», памятными медалями им. Н.В. Тимофеева-Ресовского (1992 г.) и В.И. Вернадского (2002 г.), памятным
знаком им. В.Н. Иоффе «За достижения в области фундаментальной иммунологии» (2003 г.).
Светлая память о А.А. Ярилине, выдающемся ученом, прекрасном человеке навсегда сохранится в сердцах коллег, друзей, учеников.