Разделение цветных пигментов зеленых листьев растений

Министерство образования и науки Российской Федерации
НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра «Нанотехнологии и биотехнологии»
РАЗДЕЛЕНИЕ ЦВЕТНЫХ ПИГМЕНТОВ
ЗЕЛЕНЫХ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЙ
МЕТОДОМ АДСОРБЦИОННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Методические указания к лабораторной работе
по дисциплинам «Физическая химия поверхностных явлений» и
«Коллоидная химия» для студентов,
обучающихся по направлению «Биотехнология» и
«Химическая технология» всех форм обучения
Нижний Новгород 2014
Составители: Т.Н. Соколова, Е.В. Скоробогатова, В.Р. Карташов
УДК 541.18, 541.1
Разделение цветных пигментов зеленых листьев растений методом
адсорбционной хроматографии: Метод. указания к лаб. работе по дисциплинам «Физическая химия поверхностных явлений» и «Коллоидная химия»
для студентов, обучающихся по направлению «Биотехнология» и «Химическая технология» всех форм обучения / НГТУ; Сост.: Т.Н. Соколова и др.
Н. Новгород, 2004. – 10 с.
Методические указания предназначены для проведения лабораторных занятий по курсам «Физическая химия поверхностных явлений» и
«Коллоидная химия». Изложены краткие теоретические сведения по адсорбционной хроматографии, рассмотрены химические компоненты цветного пигмента, известного как хлорофилл, представлены основные этапы
экспериментального выполнения работы.
Методические указания предназначены для самостоятельной и аудиторной работы студентов.
Редактор Э.Б. Абросимова
Подп. к печ.
. Формат 60801/16. Бумага газетная. Печать
офсетная. Печ. л.
. Уч.-изд. л.
. Тираж 300 экз. Заказ
.
Нижегородский государственный технический университет
Типография НГТУ. 603600, Н. Новгород, ул. Минина, 24.
 Нижегородский государственный
технический университет, 2014
2
Цель работы. Изучение адсорбции на границе водный раствор поверхностно активного вещества (ПАВ) – воздух:
1. Определение поверхностного натяжения водных растворов ПАВ –
двух членов одного гомологического ряда (по заданию преподавателя) – в
зависимости от концентрации, построение графической зависимости в координатах  = f(С) для каждого ПАВ;
2. Определение, основываясь на уравнении Гиббса методом графического дифференцирования, адсорбции ПАВ в зависимости от концентрации,
построение изотермы адсорбции в координатах Г = f(С); определение поверхностной активности и сравнение ПАВ по их поверхностно активным
свойствам;
3. Расчет предельной адсорбции Г из линейной зависимости в координатах
С
 f (C ) , сравнение ПАВ гомологического ряда по значению пре
дельной адсорбции; определение эмпирической константы А уравнения изотермы адсорбции;
4. Построение линейной зависимости в координатах  = f (ln C), определение предельной адсорбции ПАВ гомологического ряда и эмпирической
константы А уравнения Шишковского;
5. Определение геометрических характеристик мономолекулярного адсорбционно насыщенного поверхностного слоя ПАВ – толщины монослоя,
или длины молекулы ПАВ, а также площади поперечного сечения молекулы,
сравнение этих параметров для двух членов гомологического ряда.
1. Краткие сведения из теории
Любая межфазная поверхность характеризуется избыточной поверхностной энергией. Ее возникновение является следствием нескомпенсированности сил межмолекулярных взаимодействий на границе раздела фаз. Рассмотрим систему, состоящую из жидкости и газа. Силы межмолекулярного
3
взаимодействия* в жидкости F1-1 больше сил взаимодействий между молекулами газа F2-2 , так что последними часто можно пренебречь. Молекула А
внутри жидкости равновероятно окружена со всех сторон другими родственными молекулами. В силу симметричности силового поля силы взаимодействия при этом взаимно уравновешиваются. На молекулу В, находящуюся на
межфазной поверхности, с одной стороны действуют молекулы жидкости, а
с другой – молекулы газа. Поскольку F1-1 > F2-2 , возникает результирующая
сила Р, направленная вглубь жидкой фазы. Эту силу часто называют внутренним давлением: F1-1 - F2-2 = Р. Чем сильнее различаются межмолекулярные взаимодействия в граничащих фазах, тем больше внутреннее давление.
Например, для воды Р = 14800 атм. В частности, большие значения внутреннего давления объясняют, почему жидкости обладают малой сжимаемостью при обычных давлениях.
воздух
B
жидкость
P=0
A
Fравн = 0
Рис. 1. Схема энергетического состояния молекулы в поверхностном
слое и объемной фазе
То обстоятельство, что все молекулы поверхностного слоя «втягиваются» внутрь жидкости, равносильно тому, что для образования межфазной
поверхности необходимо совершить работу, связанную с преодолением сил,
*
Это могут быть водородные связи, все типы вандерваальсовых
взаимодействий – ион-ионные, ион-дипольные, диполь-дипольные, дисперсионные.
4
обусловливающих внутреннее давление, рис 1. Чем сильнее межмолекулярные взаимодействия в объемной фазе, тем больше требуется энергии для
того, чтобы разорвать эти взаимодействия и перевести часть молекул из
объема жидкости в поверхностный слой. Эта энергия сосредотачивается в
поверхностных молекулах и называется поверхностной энергией.
Количественной мерой поверхностной энергии является обратимая изотермическая работа, совершаемая по образованию поверхности площадью
dS:
 W =  dS ,
где  -
(1.1)
коэффициент пропорциональности, называемый поверхностным
натяжением.
Из уравнения (1.1) следует, что поверхностное натяжение можно рассматривать как термодинамически обратимую изотермическую работу, которую надо совершить, чтобы увеличить площадь межфазной поверхности
на единицу. Следует подчеркнуть, что полезная работа, совершаемая над
системой по образованию поверхности, является величиной отрицательной.
Обычно работу совершают при условии Т=const, P=const. Из термодинамики известно, что обратимая изобарно-изотермическая полезная работа
является мерой убыли функции Гиббса:
dGS = - W.
С учетом знака ( W < 0) и уравнения (1.1) имеем соотношение:
dGS =  dS .
(1.2)
Из уравнения (1.2) следует, что поверхностное натяжение показывает,
как изменяется энергетическое состояние поверхности, выражаемое через
функцию Гиббса, при изменении ее площади при Т=const, P=const:
(
G S
)Т ,Р   .
S
(1.3)
5
Как следует из уравнения (1.3), для чистых жидкостей поверхностное
натяжение является удельной свободной поверхностной энергией:
gS = .
Энергетическое состояние может быть выражено через внутреннюю
энергию поверхностного слоя или любую другую характеристическую
функцию (энтальпию, функцию Гельмгольца) при соответствующих постоянных параметрах:
(
U S
H S
A S
) S ,V  (
) S ,P  (
) T ,V  
S
S
S
Из физического смысла поверхностного натяжения вытекает, что его величина характеризует различия в межмолекулярных взаимодействиях граничащих фаз. Чем существеннее эти различия, тем больше . Для изучаемой
границы «жидкость – газ» можно пренебречь межмолекулярными взаимодействиями газовой фазы, и, следовательно, поверхностное натяжение количественно отражает силу межмолекулярных взаимодействий в жидкости,
т.е. полярность жидкости. Чем более полярной является жидкая фаза, тем
сильнее в ней межмолекулярные взаимодействия, тем выше значения , например при 20 0С  ртути, воды, этанола и гексана соответственно равны
485,0; 72,75; 22,03; 18,42 мДж/м2 .
Совершаемая работа по образованию поверхности ведет к увеличению
поверхностной энергии, уравнения (1.1), (1.2).
Избыток поверхностной энергии является энергетически невыгодным.
Стремление системы к самопроизвольному снижению величины dGS выражается либо в уменьшении площади поверхности, либо в уменьшении поверхностного натяжения. Для индивидуальных веществ величина  постоянна. В этом случае снижение свободной поверхностной энергии возможно за
6
счет уменьшения площади межфазной поверхности. К таким поверхностным
явлениям можно отнести:
- стремление капель жидкости или пузырьков газа принять сферическую
форму при отсутствии внешнего поля;
- слияние капель жидкости в эмульсиях или пузырьков газа в пенах (явление называется коалесценцией);
- слипание твердых частиц дисперсной фазы (явление называется коагуляцией);
рост кристаллов.
Если площадь межфазной поверхности остается постоянной, или увеличивается, например, при диспергировании, то снижение dGS может осуществляться только за счет уменьшения поверхностного натяжения, которое
можно осуществить в поверхностном явлении, которое называется адсорбцией.
В широком смысле под адсорбцией понимают изменение концентрации
вещества в поверхностном слое по сравнению с объемной фазой. В этом понимании даже для чистого вещества характерно явление адсорбции. За счет
действия внутреннего давления, вызванного нескомпенсированностью сил
межмолекулярных взаимодействий на межфазной границе, количество вещества в единице объема поверхностного слоя иное, чем в единице объема
внутри фазы. Так, плотность воды в поверхностном слое ниже плотности
воды на 15%. В ряде случаев при формировании поверхностного слоя может
происходить его уплотнение. Другими словами, для индивидуального вещества перераспределение вещества между поверхностным слоем и объемной
фазой сопровождается изменением структуры поверхностного слоя. Это явление принято называть автоадсорбцией.
Термин же адсорбция используется для характеристики поверхностных
явлений в многокомпонентных системах. Причем с точки зрения термодина7
мики интерес представляют те системы, в которых происходит перераспределение i-го вещества между поверхностным слоем и объемной фазой таким
образом, что вследствие этого уменьшается  и избыток поверхностной энергии.
Вещества, которые склонны переходить из объемной фазы в поверхностный слой и концентрироваться в поверхностном слое, называются поверхностно-активными, или ПАВ. Адсорбция таких веществ положительная.
Способностью концентрироваться в поверхностном слое обладают, как
правило, вещества, состоящие из функциональных частей разной природы –
гидрофильных и липофильных. В качестве неполярных фрагментов обычно выступают углеводородные радикалы R, полярными являются группы
СООН, СОО-, ОН, NН3+ и др., причем дебаланс в сторону полярной или неполярной частей ПАВ должен быть очень незначительным.
У одних ПАВ, к числу которых относят высокомолекулярные белки,
полисахариды, фосфолипиды и др., полярные и неполярные фрагменты могут чередоваться вдоль полимерной цепи. Другие – низкомолекулярные ПАВ
обладают ярко выраженной биполярностью, или дифильностью. Чтобы
подчеркнуть эту структурную особенность низкомолекулярные ПАВ (органические кислоты, соли органических кислот, спирты, алкилсулфонаты металлов и др.) принято обозначать следующим образом:
(неполярный фрагмент, "хвост" ПАВ)
(полярный фрагмент, "голова" ПАВ)
При адсорбции ПАВ в поверхностном слое ориентируются таким образом, что полярный фрагмент обращен к полярной фазе, а неполярный - к
неполярной. В качестве примера на рис. 2 представлен адсорбционный слой
ПАВ на границе «водный раствор ПАВ – воздух». В результате поверхность
воды, «покрытая» углеводородными фрагментами ПАВ становится менее
8
полярной по сравнению с исходным состоянием поверхности воды. Происходит выравнивание полярностей граничащих фаз «водный раствор ПАВ воздух», следствием чего является снижение поверхностного натяжения.
воздух

H2O
S0
а
б
в
Рис. 2. Ориентация молекул ПАВ на границе «водный раствор – воздух»:
а – при малых концентрациях ПАВ; б – при умеренных концентрациях;
в – при концентрации адсорбционного насыщения
У таких веществ, как сильные электролиты, за счет значительных взаимодействий между ионами диссоциированного электролита и водой, концентрация в объемной фазе выше, чем в поверхностном слое. Такие вещества
повышают  и называются поверхностно-инактивными, ПИАВ.
Адсорб-
ция для них отрицательная. На рис. 3 представлены зависимости =f (c )
соответственно для ПАВ и ПИАВ.

H

ПИАВ
Рис. 3. Изотермы поверхностного натяжения на
границе с воздухом для
водных растворов ПАВ и
ПИАВ
2O
 ПАВ
% H 2O
9
Следует подчеркнуть, что поверхностная активность относится не к
индивидуальному веществу, а к веществу в определенной системе. В принципе одно и то же вещество в различных условиях может проявлять свойства
и ПАВ, и ПИАВ. Теоретически для любого вещества можно подобрать систему, где оно способно проявить свои поверхностно-активные свойства.
В настоящей работе исследуется только положительная адсорбция на
границе водный раствор ПАВ - воздух.
Количественно адсорбция определяется избытком i-го вещества (в
данном случае ПАВ), определенным по методу Гиббса, в поверхностном
слое отнесенным к единице площади поверхности:
i 
niS
,
S
где Гi (гамма) – гиббсовская адсорбция, моль/м2; niS - избыток ПАВ в поверхностном слое, определенный по методу Гиббса (рассмотрение метода
выходит за рамки настоящей работы), моль; S – площадь межфазной поверхности, м2.
Между поверхностным натяжением, гиббсовской адсорбцией и концентрацией ПАВ существует связь, определяемая фундаментальным уравнением Гиббса:
i  
С i d
,
RT dCi
(1.4)
где Гi – гиббсовская адсорбция i-го компонента; Сi – молярная концентрация ПАВ, моль/м3.
В такой форме уравнение Гиббса применяется для разбавленных
растворов. Для концентрированных растворов:
i  
10
а i d
,
RT dаi
где аi – активность водного раствора ПАВ.
Для того, чтобы рассчитать Гi по уравнению (1.4), надо знать величину
d
, т.е. производную поверхностного натяжения от концентрации i-го
dСi
компонента. Из математики известно, что производная – это тангенс угла
наклона касательной, проведенной к данной точке. Следовательно, имея экспериментальную зависимость  от концентрации ПАВ в воде, можно определить значение адсорбции. Например, находим адсорбцию в точке 1 при концентрации С1 следующим образом, рис. 4.

0
.
Z
1
0
C1
C
Рис. 4. Определение адсорбции методом графического
дифференцирования изотермы поверхностного натяжения

d
Z
  tg   tg(180 - )  tg 
,
dC
C1
1  
C1
CZ
Z
(-tg)  1 
RT
RTC1 RT
.
Зависимость адсорбции от концентрации ПАВ имеет характерный вид
монотонно возрастающей кривой, переходящей в плато, рис. 5.
11

область 3
область 2
область 1
0
C
Рис. 5. Изотерма адсорбции
Эта зависимость вполне объяснима, если более подробно остановиться
на схеме образования адсорбционного слоя ПАВ в зависимости от его концентрации. При малых концентрациях ПАВ углеводородные фрагменты,
«вытолкнутые» в неполярную фазу – воздух, в силу гибкости свободно «плавают» по поверхности воды, тогда как полярная часть погружена в воду,
рис. 2 а. С ростом концентрации число молекул ПАВ в поверхностном слое
увеличивается, цепи поднимаются, некоторые из них могут принять и вертикальную ориентацию, рис. 2 б. При достижении определенной концентрации
ПАВ вся поверхность водного раствора оказывается сплошь покрытой «частоколом» из вертикально ориентированных молекул ПАВ, формируется адсорбционно насыщенный мономолекулярный слой, которому соответствует
так называемая предельная адсорбция Г рис. 2 в. Поскольку адсорбция мономолекулярна, дальнейшее увеличение концентрации ПАВ в растворе не
приводит ни к изменению адсорбции, ни к дальнейшему уменьшению , рис.
5.
Из-за вертикальной ориентации молекул ПАВ в поверхностном слое
предельная адсорбция не зависит от длины углеводородного фрагмента, а
определяется только размерами полярной части ПАВ, которая у всех членов
гомологического ряда одинаковая (например у кислот – это СООН, солей –
12
СОО-, спиртов – ОН и т.д) . Однако концентрация ПАВ, при которой достигается адсорбционное насыщение в гомологическом ряду может существенно отличаться. Достижение адсорбционного насыщения зависит от поверхностной активности. Поверхностной активностью g называют отрицательную производную поверхностного натяжения по концентрации вещества в
области, когда С  0:
 d 
g  
.

 dC  C 0
Поверхностную активность можно определить графически по значению
тангенса угла наклона касательной к кривой  = f(C) в точке ее пересечения с
осью ординат, т.е. когда С = 0, рис. 6:
 d 
tg   
  g1
 dC 
В гомологическом ряду прослеживаются четкие закономерности в изменении поверхностной активности. В водных растворах ПАВ она возрастает
по мере увеличения длины углеводородного фрагмента R , рис.6, 7 .

0


4
3
2
1
1
2
4
0
3
C
Рис. 6. Изотермы поверхностного
натяжения органических кислот:
1 – масляной; 2 – валериановой;
3 – капроновой; 4 – каприловой
0
C
Рис. 7. Изотермы адсорбции органических кислот: 1- масляной;
2 – валериановой; 3 – капроновой;
4 – каприловой
Как следует из рис. 6, 7 , g4 > g3 > g2 > g1, а Г,4 = Г,3 = Г,2 = Г,1.
13
Экспериментально установлено, что кривые характерного вида, представленные на рис. 5, 7, описываются уравнением изотермы адсорбции:
АС
,
(1.5)
1  АС
где Г – адсорбция при концентрации С, моль/м2; Г - предельная адсорбция,
Г  Г
моль/м2; С – концентрация ПАВ, моль/м3; А – эмпирическая константа.
Анализируя уравнение (1.5) можно убедиться, что действительно, оно
удовлетворительно описывает экспериментальные кривые, рис 5, 7.
В области малых концентраций 1 >> АС, (1 + АС)  1,тогда уравнение
(1.5) переходит в вид:
Г = ГАС,
что соответствует прямой, выходящей из начала координат, (участок 1,
рис.5).
При высоких концентрациях АС >> 1, (1 + АС)  АС, а уравнение (1.5),
приобретает вид:
Г = Г,
которое соответствует участку 3 кривой на рис. 5.
Криволинейный участок 2 изотермы адсорбции соединяет участки 1 и 3
и описывается полным уравнением (1.5).
Линеаризованная форма уравнения изотермы адсорбции (1.5) используется для определения предельной адсорбции. Чтобы привести соотношение
(1.5) к линейному виду единицу делят на обе части уравнения, т.е. уравнение
надо «перевернуть»:
1
1
1


.
Г Г  АС Г 
(1.6)
Обе части уравнения (1.6) умножаются на С:
С
С
1


.
Г Г Г А
14
(1.7)
Как следует из выражения (1.7), в координатах
С
 f (C ) выполняется
Г
уравнение прямой линии, угловой коэффициент которой позволяет определить предельную адсорбцию, рис. 8.
C


1
 А
0
C
Рис. 8. Определение предельной адсорбции на основе
линеаризованного уравнения изотермы адсорбции (1.7)
1
tg 
, или ctg   Г  .
Г
Предельная адсорбция с удовлетворительной точностью может быть
определена также с использованием эмпирического уравнения Шишковского:
 = 0 – Вln(1 +АC),
(1.8)
где  - поверхностное натяжение раствора ПАВ при температуре Т, Дж/м2;
0 – поверхностное натяжение чистого растворителя при температуре Т,
Дж/м2; А и В – эмпирические константы.
Физический смысл константы В определяется, исходя из анализа уравнений Шишковского (1.8) и Гиббса (1.4) в области адсорбционного насыщения, когда АС >>1 . Тогда уравнение (1.8) принимает вид:
 = 0 – ВlnАC , или
 = 0 – ВlnА – ВlnС
(1.9)
15
Дифференцируя уравнение (1.9) по концентрации и учитывая, что
d 0
dlnA
 0,
 0 , получаем соотношение:
dC
dC
d
В
 ,
dC
С
В  С
откуда
d
.
dC
(1.10)
Уравнение Гиббса (1.4) для состояния адсорбционного насыщения
можно записать следующим образом:
  
или
С
d
,
RT dC
 RT  С
d
.
dC
(1.11)
Сравнивая соотношения (1.10) и (1.11) , имеем выражение, из которого
очевидно, что эмпирическая константа В определяется величиной предельной адсорбции:
В = ГRT
Таким образом,
(1.12)
для нахождения предельной адсорбции в области
средних концентраций ПАВ (0,05 М и выше) можно использовать уравнение
Шишковского (1.9), представленное в виде:
0 –  = ВlnС + ВlnА, или
 = ВlnС + ВlnА .
(1.13)
Выражение (1.13) есть уравнение прямой линии в координатах
 = f(lnC). Из линейного участка зависимости (1.13) определяется предельная адсорбция, рис. 9:
tg  В, Г  
16
В
.
RT


Вln A
0
lnC
Рис. 9. Определение предельной адсорбции на основе уравнения
Шишковского (1.13)
Проанализируем уравнение Шишковского в области низких значений
концентраций ПАВ. Когда С0, при представлении ln(1 +АC) в виде ряда
Тейлора можно ограничиться только первым слагаемым ряда:
ln(1 +АC) = АС -
АС 2 АС 3 АС 4


 ....  АС.
2
3
4
Тогда
 = 0 – ВАC.
(1.14)
Дифференцируя уравнение (1.14) по концентрации, когда С 0, имеем:
 d 

 ВА .

 dC  C 0
(1.15)
Левая часть соотношения (1.15) есть не что иное, как поверхностная
активность g ПАВ. Таким образом, величина эмпирической константы А
уравнения Шишковского, определяемая из графической зависимости (рис.
9), позволяет косвенно оценить поверхностную активность ПАВ.
17
Экспериментально найденная величина Г дает возможность рассчитать площадь, занимаемую полярной частью молекулы ПАВ (S0), рис. 2 в.
Поскольку Г выражает число молей, адсорбированных на единице площади
межфазной поверхности при адсорбционном насыщении, то произведение
Г NА показывает число молекул, адсорбированных на поверхности в 1 м2.
Тогда площадь, занимаемую одной молекулой S0, можно вычислить по уравнению:
S0 
1
,
 N A
где NА – число Авогадро (6,023 1023).
Толщину поверхностного монослоя  можно определить, исходя из
количества вещества, адсорбированного на 1 м2 поверхности. С одной стороны, это количество можно выразить как произведение числа молей ПАВ,
адсорбированных на единице площади поверхности, выражаемое через значение Г, на массу одного моля М, а с другой стороны – как произведение
объема слоя площадью 1 м2 и высотой  на плотность ПАВ . Тогда
 = ГМ.
Откуда

 М
.

Многочисленные экспериментальные данные показали, что поперечный размер S0 молекул жирных кислот равен в среднем 2010-20 м2, а предельных спиртов – 2510-20 м2. Толщина монослоя, как правило, совпадает с
длиной адсорбированной молекулы, имеет порядок 10-10 м и зависит от числа
фрагментов –СН2– в углеводородном радикале R.
18
2. Экспериментальная часть
2.1. Порядок выполнения работы
1. В соответствии с заданием приготовить исходный водный раствор
ПАВ концентрацией С0, моль/л, в мерной колбе объемом 50 мл.
В 1000 мл содержится
С0 молей ПАВ
в 50 мл
х молей ПАВ,
х
50С 0
, молей.
1000
Объем ПАВ, необходимый для приготовления раствора нужной концентрации рассчитывается по формуле:
V 
xM 50C 0 M

,

1000
где V – объем ПАВ, мл; М – молярная масса ПАВ;  - плотность ПАВ, г/см3.
С помощью мерной пипетки рассчитанный объем ПАВ помещается в
мерную колбу и доводится дистиллированной водой до метки, колба, закрывается пробкой, раствор тщательно перемешивается.
2. Из исходного раствора концентрацией С0 путем последовательного
разбавления вдвое приготовить 6 растворов: С0; С0/2; С0/4; С0/8; С0/16; С0/32.
Для этого с помощью мерной колбы, объемом 25 мл отбирается 25 мл
исходного раствора концентрацией С0. К остатку исходного раствора ПАВ в
мерной колбе на 50 мл добавляется до метки вода. После тщательного перемешивания получается 50 мл водного раствора ПАВ концентрацией С0/2. С
полученным раствором проделывается выше описанная процедура, рис. 1.
3. Для каждого из полученных растворов определить поверхностное
натяжение методом максимального давления в пузырьке. Этот метод относится
к полустатическим, когда определение поверхностного натяжения
основано не на достижении системой равновесного состояния, а , наоборот,
19
определение поверхностного натяжения основано на изучении условий, при
которых система теряет свое равновесие.
50 мл раствора ПАВ ( C0)
25 мл (C0)
25 мл (C0) + 25 мл H2O
50 мл раствора ПАВ (C0/ 2 )
25 мл (C0/ 2 )
25 мл (C0/ 2 ) + 25 мл H2O
50 мл раствора ПАВ (C0/4 )
25 мл (C0/ 4 )
25 мл (C0/ 4 ) + 25 мл H2O
50 мл раствора ПАВ (C0/ 8)
и т.д.
Рис. 10. Схема получения водных растворов ПАВ
Но так как приближение к границе устойчивости можно производить
очень медленно, то полустатические методы позволяют получать значения
поверхностного натяжения, близкие к рравновесным.
В методе наибольшего давления под действием приложенного извне
избыточного давления Р через капилляр в объем жидкости продавливается
пузырек газа. По мере роста пузырька радиус кривизны его поверхности r
уменьшается и достигает минимального значения, равного радиусу капилляра r0, когда поверхность пузырька приобретает форму полусферы, рис. 11.
20
При дальнейшем увеличении объема пузырька радиус кривизны его поверхности возрастает (r > r0). Следовательно, капиллярное давление, определяемое по формуле
Р
2
,
r
при r = r0 достигает своего максимального значения. Соответственно при
Р< 2/r0 система устойчива; при Р > 2/r0 капиллярное давление не может
уравновесить приложенного внешнего давления. Пузырек теряет свою устойчивость и, быстро увеличиваясь, отрывается от поверхности. При этом
обычно происходит заметный спад разности давлений в капилляре и внешней жидкости, что позволяет четко фиксировать максимальное значение перепада давления, отвечающего условию:
Рmax 
2
.
r0
Это значение используется для определения величины .
Рассматриваемый метод позволяет использовать относительные измерения
Цель работы: выделить методом экстракции цветные пигменты из
растительного материала; получить и зарисовать хроматограмму пигментов
21
зеленых растений; основываясь на химическом строении главных компонентов экстракта пигментов и адсорбента, проанализировать адсорбционные
способности пигментов на данном адсорбенте и обозначить на хроматограмме зоны адсорбции для отдельных компонентов.
1. Краткие сведения из теории
Хроматографический метод анализа был открыт в 1903 г. русским ботаником Цветом М.С., который обнаружил, что при пропускании через слой
адсорбента смеси веществ, обладающих различной адсорбционной способностью, они располагаются в нем слоями. Если вещества окрашены, то в адсорбенте видны слои адсорбированных веществ:
растворитель
адсорбент со слоями адсорбированных веществ
Отсюда этот метод разделения смесей веществ был назван хроматографическим (от греч. сhromos – цвет). Это же название было сохранено и
для аналогичного разделения бесцветных веществ. Хроматографический метод настолько надежен, что вещество можно считать индивидуальным, если
не удается разделить его этим методом. В частности, этим методом Цвет
смог разделить сложный растительный пигмент хлорофилл на составные
части. И настоящая работа, по существу, является воспроизведением классического эксперимента Цвета.
В современной химической науке под хроматографией понимают совокупность методов анализа и разделения смеси веществ, основанных на
22
различном распределении компонентов смеси между двумя фазами, одна из
которых неподвижная с большой поверхностью контакта, а другая представляет подвижный поток, перемещающийся относительно неподвижной
фазы.
Поскольку компоненты анализируемой смеси распределяются между
подвижной фазой и неподвижной с большой поверхностью, то наличие
двухфазной системы является обязательным условием хроматографического
разделения.
Твердое вещество, на котором происходит адсорбция, называют адсорбентом, вещество, которое адсорбируется – адсорбатом.
В методе адсорбционного хроматографирования разделение возникает вследствие хотя бы ничтожной разницы в адсорбируемости или в кинетике адсорбции и десорбции компонентов смеси.
Вещество, обладающее более высокой адсорбционной способностью, дольше удерживается на поверхности адсорбента, т.е. скорость десорбции существенно меньше, чем скорость адсорбции.
При движении разделяемой смеси через слой адсорбента процессы
адсорбции и десорбции многократно повторяются. Многократное повторение этих процессов при течении раствора через слой адсорбента является
характерной особенностью хроматографического метода, поскольку оно
создает условия для разделения сложных смесей.
В результате адсорбции - десорбции сильно адсорбирующиеся вещества «отстают» от веществ со слабой адсорбционной способностью и
высокой скоростью десорбции, что позволяет их отделить друг от друга.
Адсорбционную хроматографию можно проводить в хроматографических колонках – вертикально закрепленных стеклянных трубках, которые заполняются высокодисперсным адсорбентом, причем для успешного
23
разделения смеси большое значение имеет равномерное заполнение хроматографической колонки адсорбентом.
Раствор, подлежащий разделению, под действием силы тяжести
стекает по колонке вниз, причем отдельные компоненты раствора в зависимости от их адсорбционной способности на данном адсорбенте в идеальном случае занимают определенную узкую зону.
Таким образом, в верхней части адсорбционной колонки будет сосредоточен наиболее адсорбируемый компонент, в нижней части колонки–
наименее адсорбируемый.
Адсорбционная способность зависит от химической природы разделяемых веществ,
от химического и физического состава адсорбента, а
также от полярных свойств растворителя-экстрагента.
Сродство полярного адсорбента к соответствующему адсорбируемому веществу возрастает с ростом полярности последнего и, наоборот.
Основные требования, предъявляемые к адсорбенту:
- однородность;
- отсутствие химического взаимодействия между ним и анализируемыми веществами;
- отсутствие каталитического воздействия на растворитель и
разделяемые вещества;
- избирательность.
Растворители должны хорошо растворять все компоненты анализируемой смеси, химически не взаимодействовать ни с адсорбентом, ни с
исследуемыми веществами, минимально адсорбироваться на выбранном
адсорбенте.
Объект исследования – экстракт цветных пигментов зеленых листьев растений – представляет собой смесь двух хлорофиллов а и b, которые
являются главными компонентами фотосинтезирующих систем растений,
24
и вспомогательных пигментов, объединенных в химическую группу каротиноидов.
Хлорофиллы поглощают в основном красный и сине-фиолетовый
свет. Зеленый свет (область солнечного света с длиной волны около 480
нм) поглощается очень слабо и отражается хлорофиллами, что и придает
растениям специфическую зеленую окраску. Хлорофиллы являются координационными соединениями Mg(II) и замещенного порфина:
H2C
HC
R
H
CH3
C
CH2
H3C
N
N
H
C
N
H3C
H
C
Mg
N
CH3
H
C
H
CH2
CH2
CH
C
O
COOCH3
COOR1
хлорофилл а, R = CH3, R1 = C20H39; хлорофилл b, R = CHO, R1 = C20H39;
этилхлорофиллид а, R = CH3, R1 = C2H5;
этилхлорофиллид b, R = CHO, R1 = C2H5.
В хлоропластах хлорофилл связан с белком – пластином, с которым
он образует хромопротеин – хлоропластин, причем хлорофилл очень легко
отделяется от пластина. На этом основаны методы его выделения, например, экстрагированием спиртом. При экстрагировании этанолом или метанолом под действием фермента хлорофиллазы происходит переэтерификация: остаток спирта фитола С20Н39ОН, придающий хлорофиллу аморфный
25
характер воска, замещается на этил- или метильную группу с образованием этилхлорофиллидов или метилхлорофиллидов а и b в виде кристаллов.
Цветовая окраска каротиноидов обусловлена системой большого
числа сопряженных двойных связей.
Каротиноиды бывают двух типов: каротины и ксантофиллы.
К настоящему времени выделено примерно 70 каротиноидов и определено строение большинства из них. В качестве примера приведена формула -каротина, который исключительно широко распространен в природе. Он содержится во всех зеленых частях растений:
H3C
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
-каротин (С40Н56)
Поскольку все каротиноиды – соединения, родственные -каротину,
ниже представлено схематичное изображение некоторых из них:
- каротин (С40Н56)
каротин (С 40Н56)
26
-каротин (С40Н56)
ликопин (С40Н56)
Кислородсодержащие каротиноиды – ксантофиллы – имеют, как
правило, в своем составе полярный фрагмент. После -каротина наиболее
распространенным в природе является лютеин, или ксантофилл:
H3C
HO
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
OH
H3C
CH3
ксантофилл (С40Н56О2)
В качестве адсорбента в настоящей работе используется крахмал,
полярные свойства которого определяют гидроксильные группы -Dглюкозных фрагментов:
CH2OH
O H
H
H
OH H
O
H
OH
O
CH2OH
O H
H
H
OH H
H
H
O
OH
n
CH2OH
O H
H
OH H
O
H
OH
фрагмент крахмала
2. Экспериментальная часть
Все цветные пигменты находятся в мембранной системе специальной клеточной структуры – хлоропласте, поэтому первая стадия заключается в механическом разрушении клеточных стенок и биомембран, для
чего свежий зеленый листок растения измельчается и тщательно растирается пестиком в фарфоровой ступке в присутствии небольшого количества
мела до образования однородной массы.
Вторая стадия – экстрагирование пигментов. Хорошим экстрагентом
для цветных пигментов является этиловый спирт, но этанол проявляет полярные свойства и высокую склонность к адсорбции на крахмале. Поэто27
му в настоящей работе применяется комплексное экстрагирование. Сначала для обеспечения наибольшей полноты извлечения пигментов из растительного материала в ступку добавляется 2 мл этилового спирта, и после
растирания со спиртом – 8 мл бензина. Все содержимое тщательно растирается. Бензиново-этанольный экстракт пигментов имеет насыщенно темно-зеленую окраску.
Третья стадия – отделение экстракта пигментов и его отмывка.
Бензиново-этанольный раствор декантируют (сливают) из фарфоровой ступки в делительную воронку так, чтобы остатки растительного материала не попали в воронку. Поскольку этанол способен к конкурентной
адсорбции на полярном крахмале, его следует отмыть водой. Для чего в
делительную воронку с раствором пигментов добавляется дистиллированная вода примерно в таком же количестве, что и экстракт. Воронка закрывается пробкой, и смесь несколько раз встряхивается. Этанол, растворяющийся и в бензине и в воде, распределяется между водной и бензиновой
фазами в соответствии со своим коэффициентом распределения.
По окончании операции делительная воронка закрепляется на штативе и в течение 5-7 минут происходит расслаивание двух несмешивающихся фаз. После образования четкой границы раздела фаз нижний слой
(водный) сливается, а к органической фазе снова добавляется дистиллированная вода и операция повторяется с целью наиболее полного извлечения
этанола из бензинового экстракта. Отмытый бензиновый слой сливается в
пробирку, куда добавляется небольшое количество свежепрокаленного
хлорида кальция для удаления следов воды (вода как полярный растворитель так же, как и этанол, будет «мешать» адсорбционному разделению
пигментов). Время сушки органической фазы не менее 15- 20 минут.
Пока сушится экстракт, хроматографическая колонка заполняется
адсорбентом. В качестве хроматографической колонки используется стек28
лянная трубка длиной около 15 см и диаметром  1 см. В нижнюю часть
трубки помещается неплотный ватный тампон, затем небольшой слой
(0,5 см) свежепрокаленной окиси алюминия. Окись алюминия как менее
полярный адсорбент в сравнении с крахмалом служит для адсорбции неполярных компонентов, которые на крахмале практически не адсорбируются. После чего колонка равномерно, без пустот, при уплотнении стеклянной палочкой заполняется сухим крахмалом. Общая высота адсорбента
 10 см. Хроматографическая колонка с помощью штатива закрепляется в
вертикальном положении.
Бензиновый экстракт в количестве 2 мл вносится одновременно через воронку по центру хроматографической колонки. При движении раствора вдоль колонки происходит разделение компонентов на хлорофилл а,
хлорофилл b, каротины и ксантофиллы, что выражается в появлении четырех адсорбционных зон разной окраски – зеленой, сине-зеленой, желтой и
оранжево-красной. Хроматограмму следует зарисовать в тот момент, как
только появится оранжево-красный слой в нижней части колонки.
На качество хроматограммы могут влиять разные факторы, в том
числе субъективные, такие, как мастерство набивания колонки адсорбентом, полнота отмывки этанола, способ внесения и количество раствора
разделяемых пигментов и др.
Список литературы
1. Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина Е.А. Коллоидная химия. – М.:
Высш. шк., 1992. – 414 с.
2. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. – М.: Химия, 1982. – 400 с.
3. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. – Л.: Химия, 1984. –
368 с.
4. Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии. – М.: Химия, 1964. –
574 с.
29
30