Исследование природы бета лактамазной активности
advertisement
Иммунопатология, аллергология, инфектология Immunopathology, allergology, infectology 2011, №3:1723 АБЗИМЫ Исследование природы беталактамазной активности сыворотки крови И.В. Жильцов, И.С. Веремей, В.М. Семенов, И.И. Генералов, С.К. Егоров Витебский государственный медицинский университет, Витебск, Республика Беларусь Study of the nature of betalactamase activity of blood serum I.V. Zhyltsou, I.S. Veremey, V.M. Semenov, I.I. Generalov, S.K. Egorov Vitebsk State Medical University, Vitebsk, Republic of Belarus Аннотация Summary В проведенном нами исследовании показано, что бета лактамазная активность – неотъемлемое свойство сыво ротки крови человека. Данная активность крови на 86 100% обусловлена ее альбуминовой фракцией. Очи щенные препараты ЧСА различного происхождения в концентрации, близкой к нормальной сывороточной, обладают беталактамазной активностью, сравнимой с таковой у нативной сыворотки крови. Помимо ЧСА, большинство белковых фракций крови обладает незна чительной беталактамазной активностью, составляю щей приблизительно 9,6% от общей сывороточной. Поликлональные IgG субклассов 1, 2 и 4 также облада ют беталактамазной активностью, но их вклад в общую сывороточную активность не превышает 1015%. Ак тивность 1 М ЧСА превышает таковую 1 М поликло нальных IgG в 3,8 раза. Оптимум рН беталактамазной активности ЧСА лежит в районе 9,0. При этом имеет место аномально быстрый рост уровня активности при повышении рН с 7,0 до 8,0. Беталактамазная актив ность человеческой крови существенно возрастает с по вышением температуры тела, и у больных с высокой лихорадкой она может оказаться значительно (до 44,6%) выше, чем у лиц с нормальной температурой тела. С повышением ионной силы раствора уровень беталак тамазной активности ЧСА снижается. Кинетика распа да нитроцефина под воздействием ЧСА соответствует реакции первого порядка с K m=0,115. Для проявления беталактамазной активности ЧСА критически важна сохранность его третичной структуры, что наводит на мысль о существовании в молекуле альбумина актив ного центра, как у бактериальных беталактамаз; тем не менее, данная активность явно не зависит от наличия кофакторов. In the presented study we have shown that betalactamase activity is intrinsic property of human blood serum. This activity is medicated by human serum albumin (HSA) fraction by 86100%. Purified HSA preparations of different origin with concentration corresponding to the normal serum one possess their proper betalactamase activity compatible with one of native blood serum. Besides HSA, the majority of protein blood fractions possess low level betalactamase activity what composes about 9,6% of the whole serum activity. Polyclonal IgG of 1, 2 and 4 subclasses also possess some betalactamase activity but their contribution to the total serum betalactamase activity doesn’t exceed 1015%. Activity of 1 M of HSA 3,8fold exceeds that of 1 M polyclonal IgG. Optimal pH for HSA betalactamase activity is about 9,0. Meanwhile, extraordinary high growth of activity level takes place in increase of pH from 7,0 to 8,0. Betalactamase activity of human blood increases substantially with the rise of body temperature, and in patients with high fever it may be significantly (by 44,6%) higher than in persons with normal body temperature. Increase of ionic strength of solution leads to decline in betalactamase activity of HSA. Kinetics of nitrocefin decay under the influence of HSA corresponds to the 1st degree reaction with Km =0,115. Intact tertiary structure of HSA is crucial for manifestation of its beta lactamase activity what suggests presence of active site in albumin molecule resembling that of true bacterial beta lactamases; nonetheless, this activity obviously doesn’t depend upon the presence of cofactors. Ключевые слова Key words Беталактамазная активность, человеческий сывороточ ный альбумин, нативная сыворотка крови, «биологичес кая» антибиотикоустойчивость Betalactamase activity, human serum albumin (HSA), native blood serum, “biological” resistance to antibiotics Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°3 17 И.В. Жильцов, И.С. Веремей, В.М. Семенов и др. Введение Устойчивость бактерий к беталактамным антибиотикам и ингибиторам беталактамаз – непрерывно растущая проблема [1]. Веро ятно, именно поэтому вплоть до настоящего времени антибиотикоустойчивость рассмат ривалась лишь как приспособительная реак ция микроорганизмов. При этом исследова тели и клиницисты традиционно не принима ют во внимание, что организм человека, со своей стороны, также небезразличен к введе нию антибиотиков. Антибиотики, и в том числе беталактамы, являются для макроор ганизма чужеродными веществами, от кото рых он стремится освободиться, используя для этого разнообразные механизмы. Так, общеизвестна система окислительной деградации чужеродных соединений под воз действием системы цитохромов Р450 [2]. Суще ствуют и другие пути распада антибиотиков в организме; в частности, показано, что у челове ка отсутствуют ферменты – аналоги беталак тамаз [3], но гемолизированная кровь может разрушать 3ацетоксиметилцефалоспорины (цефалотин, цефотаксим) посредством деаце тиляции 3ацетоксиметильной группы [4]. Дан ное наблюдение показывает, что антибиотики беталактамного ряда в принципе могут разру шаться компонентами цельной крови. Кроме того, давно известно, что карбапенемы (в ча стности, имипенем) разрушаются почечными дегидропептидазами; именно поэтому в со став коммерческого препарата имипенема был введен их ингибитор циластатин [5]. Также было показано, что аналоги карбапе немов (в частности, 2метилпенем3карбок силовая кислота) разрушаются альбуминами человеческой крови, причем глобулиновая фракция подобной активностью не обладает [6]. В 1972 г. группа исследователей компании Glaxo Research Ltd, изучая свойства нитроце фина, описала значимый распад беталак тамной связи указанного антибиотика под воздействием, в числе прочего, сыворотки че ловеческой крови, причем было показано, что данное ее свойство опосредуется в первую очередь альбуминовой фракцией [7]. Природа беталактамазной активности сы воротки крови никогда и никем подробно не изучалась: до сих пор неизвестны особенности данной активности, ее механизм, а также воз можное клиническое значение. Существует предположение, что беталактамазная актив ность сыворотки крови индуцибельна и в зна 18 чительной мере опосредуется поликлональ ными иммуноглобулинами, обладающими беталактамазной активностью, т.н. абзима ми [8]. Наши собственные исследования ранее впервые продемонстрировали феномен обра зования антител с пенициллиназной активно стью у людей in vivo при шигеллезах [9], при чем у некоторых препаратов иммуноглобули нов уровень данной активности оказался до статочно высоким [10]. Соответственно, целью настоящего иссле дования было уточнить природу беталакта мазной активности сыворотки крови и уста новить характеристики данной активности; мы полагаем, что данное исследование явля ется первой ступенью в исследовании клини ческой значимости и практической примени мости описываемого феномена. Материалы и методы Сыворотка практически здоровых военнос лужащих (n=82) была получена центрифугиро ванием цельной свежеполученной крови, выдер жанной в холодильной камере при +4°С в тече ние 46 часов для образования фибринного сгу стка; применялось центрифугирование в угло вой центрифуге при 3000 об/мин в течение 15 минут. Полученная сыворотка крови сохраня лась до момента проведения эксперимента в морозильной камере при 20°С. Кроме сыворотки крови, мы определяли беталактамазную активность двух препаратов ЧСА, очищенных спиртовой седиментацией по Кону [11] (полученного на Витебской област ной станции переливания крови, а также про изведенного Reanal, Венгрия), а также препара та ЧСА особо высокой очистки прва Sigma, ис ходно не содержащего глобулинов (Albumin from human serum lyophilized powder, essentially globulin free, ~99%, кат. № A8763). Помимо этого, нами был получен 51 пре парат поликлональных IgG субклассов 1, 2 и 4. Материалом для выделения послужила сыво ротка крови 23 больных рожей, 21 больного острым гнойным тонзиллитом и 7 больных пневмонией. Использовалась методика очис тки, ранее разработанная нами специально для изучения абзимной активности поликло нальных иммуноглобулинов [12] на основе комбинирования общепринятых методов [13]. Полученные нами препараты IgG отли чались высокой чистотой и гомогенностью и не содержали следовых примесей ферментов крови, что подтверждается данными аналити Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°3 Абзимы: Исследование природы бета'лактамазной активности сыворотки крови ческого электрофореза, выполненного в диссо циирующих условиях. Для определения и количественной оценки беталактамазной активности сыворотки кро ви и препаратов IgG мы использовали хрома тографическую методику, основанную на изме нении окраски антибиотика цефалоспориново го ряда нитроцефина при распаде его беталак тамной связи. При этом происходит батох ромный сдвиг в хромофорной системе моле кулы, и окраска реакционной смеси меняется с желтой на краснооранжевую. Максимум поглощения продукта реакции меняется с 390 нм на 486 нм, что и делает возможным спектрофотометрическую детекцию бета лактамазной активности. Показано, что нит роцефин разрушается всеми известными беталактамазами [7]. Для проведения экспе риментов мы использовали химически чис тый нитроцефин производства Calbiochem (кат. № 484400). Беталактамазная активность оценивалась в % распада стандартного количе ства нитроцефина, вносимого в пробу. Фракционирование сыворотки крови про изводилось при помощи препаративного диск электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле (ПААГ). В стеклянную силиконированную трубку, залитую ПААГ вышеуказанной концен трации, вносилась смесь, полученная путем пу лирования равных объемов 82 сывороток кро ви практически здоровых военнослужащих. В качестве маркера молекулярного веса исполь зовался коммерческий маркер Pierce 3Color Prestained Protein Molecular Weight Marker Mix (кат. № 26691). По завершении электрофореза столбики геля извлекались из стеклянных тру бок, часть их окрашивалась Кумасси R250, а ос тальные разрезались на фрагменты длиной 0,5 см. Данные фрагменты помещались в прону мерованные пробирки Эппендорфа, после чего в каждую из пробирок добавлялся рабочий ра створ нитроцефина, и производилось определе ние беталактамазной активности. Для оценки зависимости уровня беталакта мазной активности сыворотки крови от со хранности трехмерной структуры ЧСА и нали чия кофакторов (в частности, ионов Cu 2+ и Zn2+) исследуемая сыворотка крови обрабаты валась 2% раствором додецилсульфата натрия (ДДС), водными растворами мочевины с кон центрацией 1, 5 и 10 мг/мл, а также 0,3 М ра створом ЭДТА. Беталактамазная активность сыворотки крови, обработанной ДДС, ЭДТА и мочевиной, определялась при помощи нитро Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°3 цефиновой методики. Выраженность конфор мационных изменений белков сыворотки кро ви оценивалась при помощи вертикального электрофореза в плоском 7,5% ПААГ в недис социирующих условиях. Для изучения зависимости уровня беталак тамазной активности сыворотки крови от рН был приготовлен рабочий раствор нитроцефи на с использованием различных 0,2 М буфер ных растворов в интервале рН от 2,5 до 13,0 с шагом 0,5. Интервал рН от 2,5 до 3,5 был пере крыт глицинHCl буфером, 4,05,5 – ацетатным буфером, 6,07,5 – цитратнофосфатным буфе ром, 8,08,5 – трисHCl буфером, 9,010,5 – гли цинNaOH буфером, 11,011,5 – фосфат натрия (2зам.)NaOH буфером, и 12,013,0 – KCl NaOH буфером. Для выявления зависимости уровня бета лактамазной активности сыворотки крови от температуры использовалась базовая версия нитроцефиновой методики. При этом пробы сыворотки крови либо ЧСА раздельно инкуби ровались при 33°С, 36°С, 39°С и 42°С. Для оценки влияния ионной силы раствора на беталактамазную активность сыворотки крови и ЧСА был приготовлен ФБР с рН 7,4 следующей молярности: 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,00625; 0,003125 М (всего 8 значений). Данные значения молярности соответствуют ионной силе растворов 1,05; 0,52; 0,26; 0,13; 0,066; 0,033; 0,016; 0,0082 моль/л. Для оценки вклада беталактамазной актив ности ЧСА в общую сывороточную беталакта мазную активность образцы 5 сывороток крови, проявивших наиболее высокую актив ность, были обработаны суспензией гранул голубой сефарозы (Blue Sepharose CL6B пр ва Sigma, кат. № R9903), способной избира тельно связывать альбумин. После 15минут ного энергичного встряхивания с образцами сывороток крови гранулы голубой сефарозы отделялись 5минутным центрифугировани ем при 12.000 об/мин, прозрачный надосадок извлекался и использовался для определения беталактамазной активности. Результаты Средний уровень беталактамазной актив ности сыворотки крови, определенный в насто ящем исследовании, составил 61,2% распада внесенного в пробу нитроцефина (95% CI: 60,3 62,1), min=0, max=99,2%. Неоднократное раздельное определение беталактамазной активности различных бел 19 И.В. Жильцов, И.С. Веремей, В.М. Семенов и др. ковых фракций сыворотки крови всякий раз давало однозначный результат – основной со ставной частью человеческой крови, способ ной разрушать нитроцефин, является сыво роточный альбумин; все прочие белковые фракции крови либо обладают минимальной беталактамазной активностью, либо вовсе не обладают таковой. Оказалось, что гаммаглобулиновая фрак ция крови (в частности, поликлональные IgG) действительно может обладать беталак тамазной активностью; указанный феномен наблюдался у 39,2% (95% CI: 25,852,6) изу ченных образцов высокоочищенных IgG суб классов 1, 2 и 4. Тем не менее, данная актив ность составляет приблизительно 9,6% от об щей сывороточной. Вычисление беталактамаз ной активности в пересчете на 1 моль сравни ваемых веществ показало, что активность ЧСА превышает таковую поликлональных IgG в среднем в 3,8 раза, чего и следовало ожидать, с учетом того факта, что абзимной активностью, согласно теории Ерне, облада ют лишь некоторые пулы IgG из огромного их множества, и доля указанных антител в об щей массе гаммаглобулиновой фракции не может быть высокой по определению [8]. Не обходимо также принять во внимание невы сокую концентрацию IgG в плазме крови (в пределах 416 г/л) в сравнении с прочими бел ковыми фракциями [14]. Очевидно, что по ликлональные IgG с абзимными свойствами вносят свой вклад в общую сывороточную беталактамазную активность, но он невелик и в значительном большинстве случаев опре деленно не превышает 1015%. ЧСА в концентрации 100 мг/мл, полученный на станции переливания крови г. Витебска, за 30 минут инкубации при 37°С катализировал распад 51,3% внесенного в пробу нитроцефи на, тот же препарат в концентрации 10 мг/мл вызвал распад 30,7% нитроцефина, а ЧСА производства Reanal в концентрации 10 мг/ мл привел к гидролизу 22,2% нитроцефина. Препарат ЧСА особо высокой очистки про изводства Sigma в тех же условиях инкубации разрушил 65,5% внесенного в пробу стандарт ного количества нитроцефина. Обработка образцов нативной сыворотки крови взвесью гранул голубой сефарозы всякий раз приводила к резкому (в 11,323,2 раза) сни жению уровня беталактамазной активности в соответствующих пробах. При этом в абсолют ных цифрах активность снижалась с 34,958,4% 20 до 04,9%, т.е. имело место падение активности по сравнению с исходной на 86100%. Посколь ку голубая сефароза избирательно адсорбиру ет альбумин, почти не взаимодействуя с други ми белками сыворотки крови, ясно, что бета лактамазная активность человеческой крови на 86100% связана именно с ЧСА; оставшуюся часть активности обусловливают другие белки. Таким образом, очищенные препараты ЧСА различного происхождения в концентрации, близкой к сывороточной, обладают беталак тамазной активностью, сравнимой с таковой у цельной сыворотки крови; прочие белковые фракции вносят незначительный вклад в опи сываемый феномен. Оптимум рН для беталактамазной активно сти ЧСА лежит в районе 9,0. Указанная величи на не является для человеческого организма чемлибо уникальным – так, оптимум рН арги назы составляет 9,7, а «дикой» разновидности бактериальной пенициллиназы tem1 – лежит в районе 9,0 [15]. Обращает на себя внимание резкое изменение уровня беталактамазной ак тивности ЧСА в интервале рН 7,08,0: так, при рН 7,0 указанная активность составляет около 6,4% распада внесенного в пробу нитроцефина, при рН 7,4 – приблизительно 22,2%, а при рН 8,0 – уже 57,3%. Данный феномен говорит о том, что при различных патологических состо яниях беталактамазная активность человечес кой крови может быстро и скачкообразно из меняться – снижаться до минимальных цифр при ацидозе любого генеза (типичном для большинства тяжелых заболеваний и неотлож ных состояний) и резко нарастать при алкало зе (также встречающемся при некоторых тяже лых заболеваниях и неотложных состояниях). С повышением температуры каталитическая активность как ЧСА, так и сыворотки крови существенно возрастает (разница между уров нями беталактамазной активности при 36°С и 39°С составляет до 11,5%, а при 37° и 42°С – до 44,6%). Известно, что зависимость скорости ре акции, катализируемой ферментами, от темпе ратуры обычно имеет колоколообразный вид: с повышением температуры скорость реакции быстро возрастает, достигает максимума при температуре, соответствующей оптимальной для данного фермента (обычно в интервале 37 38°С), после чего так же быстро снижается при дальнейшем повышении температуры [16]. В нашем случае температурный оптимум реак ции распада нитроцефина под воздействием ЧСА, очевидно, лежит выше 42°С и недостижим Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°3 Абзимы: Исследование природы бета'лактамазной активности сыворотки крови в жизнеспособном человеческом организме; соответственно, можно утверждать, что бета лактамазная активность человеческой крови быстро возрастает с повышением температу ры тела, и у больных с высокой лихорадкой in vivo она может оказаться существенно выше, чем у здоровых. Уровень беталактамазной активности ЧСА нарастает по мере снижения ионной силы реакционного раствора. При ионной силе раствора, равной 0,066 моль/л, актив ность достигает своего максимума, и при дальнейшем снижении меняется уже незначи тельно. При значении ионной силы, равном среднему уровню таковой в человеческой крови (0,15 моль/л), беталактамазная актив ность ЧСА близка к максимально возможной (61,4% при максимальном достигнутом в дан ном эксперименте уровне, равном 67,4%). Уменьшение беталактамазной активности ЧСА при увеличении ионной силы раствора легко объяснить, поскольку при повышении концентрации ионов в растворителе белко вая молекула укладывается более плотно, ее площадь и занимаемый ею объем уменьша ются, а конформация соответствующим об разом изменяется. Кроме того, ионная сила раствора влияет на заряд боковых радикалов аминокислот и, соответственно, на формиро вание и стабильность электростатических вза имодействий, в частности, водородных связей внутри белковой молекулы [17]. Можно пред положить, что при увеличении ионной силы ра створа конформация молекулы ЧСА меняется таким образом, что это приводит к снижению эффективности катализа. По мере увеличения концентрации нитроце фина в реакционной смеси происходит насыще ние им молекул альбумина, и скорость катали тической реакции постепенно стабилизируется, выходя на плато. Данный вид кинетической кривой характерен для ферментативных реак ций 1 порядка. Константа МихаэлисаМентен (Km) для данной реакции равна 0,115, т.е. кон центрация нитроцефина, при которой ско рость его катализируемого распада в условиях эксперимента равна половине максимальной, составляет 0,115 мг/мл (95% CI: 0,090,139). Обработка нативной сыворотки крови 2% раствором ДДС в течение 1 часа приводит к па дению уровня ее беталактамазной активности практически до нуля (0,67%, при собственной активности испытуемой сыворотки 35,6%). В то же время, обработка сыворотки крови 0,3 М Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°3 раствором ЭДТА приводит к очень незначи тельному снижению ее беталактамазной актив ности (32,7%; разница с активностью нативной сыворотки в 2,9 процентных пункта (п.п.) очень невелика, хотя и статистически значима (Uтест МаннаУитни, р=0,014). Аналогично, эксперимент с последователь ным увеличением концентрации раствора ДДС 0 Þ 0,5 Þ 0,75 Þ 1 Þ 2 ммоль/л) показал, что с ростом концентрации данного реагента уро вень беталактамазной активности как ЧСА, так и нативной сыворотки крови прогрессивно снижается, вплоть до нулевых значений. При этом концентрация додецилсульфата натрия, достаточная для полной нейтрализации бета лактамазной активности сыворотки крови, со ставляет 1 ммоль/л, а ЧСА – 2 ммоль/л. Обработка нативной сыворотки крови ра створом мочевины в концентрации 1, 5 и 10 мг/мл также приводит к незначительному снижению уровня ее беталактамазной актив ности (на 0, 2,1 и 4,0 п.п., соответственно). Так, активность нативной сыворотки соста вила 35,9%, в то время как образца сыворот ки, обработанного раствором мочевины 1 мг/мл – 36,1%, раствором мочевины 5 мг/мл – 33,8%, и раствором мочевины 10 мг/мл – 31,9%. Разница уровней беталактамазной активности нативной сыворотки крови и сы воротки, обработанной раствором мочевины в концентрации 1, 5 и 10 мг/мл, оказалась ми нимальной, хотя и статистически значимой для концентраций 5 и 10 мг/мл (в обоих случа ях р=0,002 в Uтесте МаннаУитни). Как известно, ДДС является жестким детер гентом; воздействие ДДС вызывает распад всех нековалентных взаимодействий в белковой мо лекуле и денатурацию белка до вторичной или даже первичной его структуры. Мочевина яв ляется гораздо более мягким детергентом, разрывающим только слабые нековалентные связи, и ее воздействие не вызывает измене ний в пространственной структуре белка; об работка мочевиной приводит лишь к десорб ции возможных кофакторов с поверхности белковых молекул. ЭДТА не является детер гентом, но образует устойчивые комплексные соединения с катионами двухвалентных ме таллов, в частности, Zn (II) и Cu (II), причем он способен извлекать данные катионы из бо лее слабых соединений; обработка ЭДТА не может привести к изменению пространствен ной организации белковой молекулы, но вы зывает десорбцию с ее поверхности ионов 21 И.В. Жильцов, И.С. Веремей, В.М. Семенов и др. меди и цинка, которые могут быть ответствен ны за проявление либо усиление беталактамаз ной активности ЧСА (как это имеет место в цинкзависимых беталактамазах). Представленные данные убедительно дока зывают, что кофакторы, в частности, ионы Zn (II) и Cu (II), не могут опосредовать более 8,1% от уровня беталактамазной активности ЧСА; при этом для проявления указанной активности важна пространственная (т.е. третичная) струк тура альбумина – при ее денатурации под воздей ствием додецилсульфата натрия беталактамаз ная активность ЧСА падает практически до нуля, чего не наблюдается при его обработке более мягким детергентом (мочевиной). Выводы 1. Беталактамазная активность – неотъемле мое свойство сыворотки крови человека. Данная активность крови на 86100% обус ловлена ее альбуминовой фракцией. Очи щенные препараты ЧСА различного проис хождения в концентрации, близкой к нор мальной сывороточной, обладают беталак тамазной активностью, сравнимой с тако вой у нативной сыворотки крови. 2. Помимо ЧСА, большинство белковых фрак ций крови обладает незначительной бета лактамазной активностью. Данная актив ность составляет приблизительно 9,6% от общей сывороточной. 3. Поликлональные IgG субклассов 1, 2 и 4 также обладают беталактамазной активностью, но их вклад в общую сывороточную активность в общем случае не превышает 1015%. Актив ность 1 М ЧСА превышает таковую 1 М поли клональных IgG в среднем в 3,8 раза. 4. Оптимум беталактамазной активности ЧСА лежит в районе 9,0. При этом имеет место аномально быстрое нарастание уровня данной активности при повыше нии рН в интервале от 7,0 до 8,0, что созда ет предпосылки для резкого изменения уровня беталактамазной активности кро ви при патологических состояниях, сопро вождающихся выраженным ацидозом либо алкалозом. 5. Беталактамазная активность человеческой крови быстро возрастает с повышением температуры тела, и у больных с высокой ли хорадкой она может оказаться существенно (до 44,6%) выше, чем у лиц с нормальной температурой тела, что может приводить к снижению клинической эффективности ан тибиотиков беталактамного ряда. 6. С повышением ионной силы раствора уро вень беталактамазной активности ЧСА сни жается, причем значение ионной силы, рав ное среднему для человеческой крови, соот ветствует беталактамазной активности сы вороточного альбумина, близкой к макси мально возможной. 7. Кинетика распада нитроцефина под воздей ствием ЧСА соответствует реакции первого порядка с Km=0,115. 8. Ионы Zn (II) и Cu (II) не могут опосредовать более 8,1% от уровня суммарной беталакта мазной активности ЧСА. 9. Для проявления беталактамазной активно сти ЧСА критически важна сохранность его третичной структуры, что наводит на мысль о существовании в молекуле альбумина ак тивного центра, подобного таковому у бак териальных беталактамаз. Литература 1. Helfand M.S., Bonomo R.A. Betalactamases: a survey of protein diversity. Curr Drug Targets Infect Disord. 2003 Mar; 3 (1): 923. 5. Moellering R.C., Eliopoulos G.M., Sentochnik D.E. The carbapenems: new broad spectrum betalactam antibiotics. J Antimicrob Chemother. 1989 Sep; 24 Suppl A: 17. 2. Pea F, Furlanut M. Pharmacokinetic aspects of treating infections in the intensive care unit: focus on drug interactions. Clin Pharmacokinet. 2001; 40 (11): 83368. 6. Bruderlein H., Daniel R., Perras D., DiPaola A., Fideliб A., Belleau B. An investigation of the destruction of the betalactam ring of penems by the albumin drugbinding site. Can J Biochem. 1981 Oct; 59 (10): 85766. 3. Avalle B., Dйbat H., Friboulet A., Thomas D. Catalytic mechanism of an abzyme displaying a betalactamaselike activity. Appl Biochem Biotechnol. 2000 JanMar; 83 (13): 1639. 4. Wright W.E., Frogge J.A. Hydrolysis of 3acetoxymethyl cephalosporins by lysed whole blood. Antimicrob Agents Chemother. 1980 Jan; 17 (1): 99100. 22 7. O’Callaghan C.H., Morris A., Kirby S.M., Shingler A.H. Novel method for detection of betalactamases by using a chromogenic cephalosporin substrate. Antimicrob Agents Chemother. 1972 Apr; 1 (4): 2838. 8. Jerne N.K. Towards a network theory of the immune system. Ann Immunol (Paris). 1974 Jan; 125C (12): 37389. Immunopathology, Allergology, Infectology 2011 N°3 Абзимы: Исследование природы бета'лактамазной активности сыворотки крови 9. Жильцов И.В., Генералов И.И., Семенов В.М. Выявле ние абзимов с пенициллиназной активностью в сыворот ке крови больных шигеллезами. Иммунопатология, аллер гология, инфектология. 2004 (3): 903. 10. Жильцов И.В., Генералов И.И., Семенов В.М., Дмитраченко Т.И. Особенности «биологической» ан тибиотикоустойчивости при шигеллезах: выявление in vivo поликлональных IgG, обладающих пеницил линазной активностью. Медицинская панорама. 2006; 5 (62): 468. 11. Сивакова Н.П. и др. Способы получения иммуногло булинов для внутривенного введения и их клиническое применение. Трансфузиология. 2008; 1 (9): 412. 12. Конорев М.Р. и др. Выбор метода очистки катали тических иммуноглобулинов для исследования их роли при инфекционной патологии. Сборник науч ной конференции ВГМУ «Вопросы патогенеза и те рапии инфекционных и паразитарных заболеваний». 1993: 603. 13. Иммунологические методы. Под ред. Г. Фримеля.: пер. с нем. М.: «Мир». 1987: 346 с. 14. Stoop J.W., Zegers B.J., Sander P.C., Ballieux R.E. Serum immunoglobulin levels in healthy children and adults. Clin Exp Immunol. 1969 Jan; 4 (1): 10112. 15. GolemiKotra D., Meroueh S.O., Kim C., Vakulenko S.B., Bulychev A., Stemmler A.J., Stemmler T.L., Mobashery S. The importance of a critical protonation state and the fate of the catalytic steps in class A betalactamases and penicillinbinding proteins. J Biol Chem. 2004 Aug 13; 279 (33): 3466573. 16. КорнишБоуден Э. Основы ферментативной кинети ки. М.: «Мир». 1979: 282 с. 17. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: «Медицина». 1998: 704 с. Сведения об авторах: Автор, ответственный за переписку с редакционной коллегией: Жильцов Иван Викторович – к.м.н., доцент кафедры инфекционных болезней УО ВГМУ Адрес для корреспонденции: 210023, г. Витебск, пр'т Фрунзе, 73 Кафедра инфекционных болезней УО ВГМУ Тел./факс: +375 (212) 24'33'46 Моб. тел.: +375 (29) 710'43'68 E'mail: zhyltsou@tut.by Веремей Игорь Святославович – старший научный сотрудник ЦНИЛ УО ВГМУ Семенов Валерий Михайлович – д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней УО ВГМУ, декан лечебного факультета УО ВГМУ Генералов Игорь Иванович – д.м.н., профессор, заведующий кафедрой микробиологии УО ВГМУ Егоров Сергей Константинович – студент 6 курса лечебного факультета УО ВГМУ Поступила 4.08.2011 г. Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2011 N°3 23
