005415 -1- Область техники Изобретение относится к

005415
Область техники
Изобретение относится к фармацевтическому препарату, предназначенному, главным образом, для
лечения опухолей, и к способу выделения фракции плазмы, не содержащей липидов.
Предшествующий уровень техники
Публикация международной заявки WO 00/40256 относится к ингибирующему воздействию на
опухоли плазмы крови, полученной от больных, страдающих острым лейкозом. В заявке описаны многочисленные эксперименты, в которых использованный препарат вызывал при определенных типах опухолей 20%-ное улучшение по сравнению с контрольной группой. Это улучшение близко к нижней границе
диапазона улучшений, считающихся достоверными.
Применимость фармацевтических препаратов, изготовленных из крови больных острым лейкозом,
ограничена, во-первых, из-за малого числа людей, которых можно использовать в качестве доноров, а
также из-за наличия жестких этических и законодательных ограничений, связанных с использованием
человеческой крови. Исключительное значение лечения опухолей и объем исследований, проводимых во
всем мире в этой области, обосновывают необходимость тщательного анализа любого нового способа,
представляющегося перспективным либо для терапии, либо для диагностики.
Вышеуказанная международная заявка показала вероятность того, что кровь людей, страдающих
острым лейкозом, содержит точно не определенный компонент, который оказывает общий противоопухолевый эффект.
Сущность изобретения
Задача изобретения состоит в том, чтобы обеспечить новый фармацевтический препарат, который
может быть использован для лечения опухолей, включая задачу эффективного отделения компонента
плазмы крови, играющего роль в борьбе с опухолями. Еще одна задача состоит в том, чтобы найти подходящие группы доноров такой крови.
Для решения этих задач на первом этапе был разработан более эффективный процесс очистки, при
этом предполагалось, что эффективные компоненты находятся в не содержащей липидов фракции плазмы. Было обнаружено, что отделение не содержащих липидов компонентов плазмы можно выполнить
предпочтительным способом, если фракцию плазмы обработать первым органическим растворителем,
затем добавить поверхностно-активное вещество, состоящее из очень мелких гранул, и после интенсивного перемешивания отделить не содержащую липидов фракцию, присоединившуюся к гранулам, от
жидкого компонента посредством центрифугирования, а затем эту отделенную фракцию снова перевести
в раствор.
Очистка будет более эффективной, если стадии растворения и отделения повторить с использованием второго органического растворителя и с последующим повторным центрифугированием.
Количество поверхностно-активного агента составляет примерно 0,5% от массы плазмы, а размер
его гранул лежит в диапазоне примерно от 200 до 400 нм. Предпочтительными материалами являются,
например, белая глина, активированный уголь или метоцель.
Центрифугирование предпочтительно можно выполнить с ускорением 15000 g. Растворение ускоряется, если после добавления органического растворителя раствор выдерживают в течение длительного
периода времени при повышенной температуре при периодическом перемешивании.
Отделение гранул поверхностно-активного вещества от не содержащего липидов компонента не является обязательным условием, и после второго отделения гранулы совместно со связанным с ними не
содержащим липидов компонентом плазмы можно поместить, например, в физиологический раствор.
Согласно второму способу очистки не содержащий липидов компонент плазмы переносят в раствор, содержащий слабый детергент, и посредством дополнительного центрифугирования можно отделить твердый компонент.
Так как было доказано, что не содержащий липидов продукт, выделенный таким образом и полученный от доноров, больных острым лейкозом, является значительно более эффективным, чем продукт,
описанный в вышеуказанной международной заявке, был проанализирован основной аспект поставленной задачи, а именно - можно ли обнаружить этот противоопухолевый компонент только в крови больных лейкозом, или он содержится также в крови людей, излеченных от опухолей.
Хотя число доноров, излеченных от опухолей, гораздо больше, чем число людей, больных острым
лейкозом, и количество крови, которое можно от них получить, менее ограничено, невозможно ожидать
их широкомасштабного использования в медицине из-за моральных и законодательных ограничений,
указанных выше.
Следующий подход к решению этой основной задачи привел к следующему открытию, являющемуся предметом изобретения. Путь к этому открытию был обнаружен при изучении спонтанного излечения животных от опухолей. Для парнокопытных животных весьма специфичным является опухолевое
заболевание, вызванное ретровирусом. У некоторых видов заболевание проявляется в виде опухоли, и
инфицированные животные погибают, тогда как у других видов, прежде всего у коров (крупного рогатого скота), болезнь не проявляется в виде опухоли или какого-либо ухудшения общего состояния здоровья
животных. Инфекцию можно обнаружить по присутствию в крови антитела GP 51.
-1-
005415
Современная единая точка зрения в ветеринарной медицине состоит в том, что поголовье скота
должно быть освобождено от особей, больных лейкозом. Эту точку зрения поддерживает заключение,
опубликованное в 1992 г. в 4-м выпуске Журнала венгерских ветеринаров и озаглавленное "Положение с
зараженностью лейкозом крупного рогатого скота в стране и возможности освобождения поголовья скота от лейкоза", и это заключение было представлено Ветеринарным комитетом Венгерской Академии
наук. Было обнаружено, что уровень инфицированности лейкозом близок к 50%. Выпуск № 9 от 1997 г.
того же журнала содержит статью д-ра Lajos Telkes "Освобождение крупного рогатого скота от лейкоза в
Венгрии", в которой подчеркивается важность освобождения поголовья скота от лейкоза. Было обнаружено, что уровень инфицированности выше на крупных фермах, и на момент появления второй статьи
уровень инфицированности был равен примерно 17%.
Сущность открытия состоит в обнаружении того, что кровь животных, успешно и бессимптомно
выздоровевших от лейкоза, более конкретно - не содержащая липидов фракция плазмы их крови, должна
содержать компоненты, эффективность которых доказана в экспериментах, выполненных с кровью доноров-людей. За этим открытием последовало большое количество экспериментов, которые подтвердили
эту гипотезу с нескольких сторон и обеспечили доказательства существования эффекта ингибирования
опухолей, причем настолько эффективного, какого не удавалось добиться с момента начала борьбы с
опухолями.
Существование эффекта подтверждается и тем фактом, что сходные компоненты крови, полученные от животных, не болеющих лейкозом, не оказывали такого эффекта.
Электрофоретический анализ не содержащей липидов плазмы крови, полученной от людей и животных-доноров, подтвердил существование сходных фракций в двух диапазонах молекулярного веса, и
эти фракции отсутствовали в плазме, полученной от здоровых доноров. Первая фракция с молекулярным
весом около 40000, в дальнейшем обозначенная как "bovine 40", и вторая фракция с молекулярным весом, попадающим в диапазон от 300000 до 350000, в дальнейшем обозначенная как "bovine 300", могут
быть ответственными за эффект ингибирования опухолей.
С учетом решения проблемы согласно настоящему изобретению представляется разумным пересмотреть необходимость освобождения поголовья скота от особей, больных лейкозом.
Фракции bovine 40 и bovine 300, идентифицированные согласно настоящему изобретению, оказывают превосходный противоопухолевый эффект, и одновременно обнаружение их присутствия помогает
при постановке диагноза опухоли.
Краткое описание графических материалов
Далее изобретение будет описано в связи с примерами осуществления изобретения, причем будут
производиться ссылки на сопроводительные чертежи и эксперименты. На чертежах
фиг. 1 является графиком выживаемости при лечении веществом Bbo-f;
фиг. 2 является графиком выживаемости после 10 сеансов лечения веществом Bbo-f;
фиг. 3 является графиком выживаемости после 6 сеансов лечения веществом Bbo-b;
фиг. 4 является графиком выживаемости после 8 сеансов лечения веществом Bbo-b;
фиг. 5 является графиком выживаемости после 10 сеансов лечения веществом Bbo-b;
фиг. 6 является графиком выживаемости после лечения 0,1 мл вещества Bbo-b;
фиг. 7 является графиком выживаемости после лечения 0,15 мл вещества Bbo-b;
фиг. 8 отображает вес тела животных вплоть до 19-го дня;
фиг. 9 является серией столбчатых диаграмм, суммирующих результаты исследования ферментов;
фиг. 10 отображает данные по выживаемости для лечения после имплантации колоректальной опухоли С26;
фиг. 11 отображает относительные массы опухолей при лечении по фиг. 10;
фиг. 12 отображает уровни 5'-нуклеотидазы в случае лечения по фиг. 10;
фиг. 13 отображает график выживаемости, полученный при лечении карциномы молочной железы
МХТ;
фиг. 14 иллюстрирует относительные массы опухолей при лечении по фиг. 13;
фиг. 15 является вариантом фиг. 14 при других типах лечения;
фиг. 16 отображает график выживаемости, полученный при лечении лимфолейкоза L1210;
фиг. 17 отображает значения абсолютной массы опухолей, полученные при лечении по фиг. 16; и
фиг. 18 отображает уровни 5'-нуклеотидазы при лечении по фиг. 16.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Различные подробности решения проблемы согласно настоящему изобретению можно узнать по
ходу различных этапов выполненных экспериментов. Независимо от уровня значимости, прежде всего
необходимо описание способа получения вещества, использованного для экспериментов.
Разделение и получение не содержащего липидов компонента плазмы
Из крови, использованной в качестве исходного материала, не содержащие липидов компоненты
плазмы крови были получены с помощью способа многостадийного разделения. Предпочтительными
стадиями разделения являются следующие:
-2-
005415
Сразу же после забора исходной крови ее обрабатывают антикоагулянтом, предпочтительно - гепарином.
Отделение форменных элементов (кровяных телец) производят посредством центрифугирования,
предпочтительно при температуре 4°С и при ускорении 5000 g (g означает ускорение свободного падения). В случае, если центрифугирование не производят сразу же после забора крови, кровь, обработанную антикоагулянтом, можно хранить при пониженной температуре, предпочтительно - при температуре
центрифугирования, в течение не более чем 48 ч. Продолжительность центрифугирования составляет не
менее 10 мин. Для дальнейшей обработки используют супернатант. Полученную таким способом плазму
можно охладить до температуры -20°С, и ее можно смешать с плазмами, полученными сходным образом
от различных доноров. Дальнейшую обработку, при необходимости, можно производить с использованием большего количества плазмы. В примерах, приведенных в данном описании, плазму, полученную
от определенного донора, не смешивали с плазмой, полученной от других доноров, и о любых отступлениях от такого порядка сообщается отдельно.
В качестве первой стадии удаления липидных компонентов плазму разводили равным количеством
первого органического растворителя, например спиртом с 96%-ной чистотой, и полученный таким способом раствор перемешивали.
На второй стадии к раствору добавляли поверхностно-активный материал (агент) в количестве 0,5
мас.%. Назначение этого поверхностно-активного материала состояло в связывании не содержащих липидов компонентов плазмы на его поверхности. Поверхностно-активным материалом может быть белая
глина, активированный уголь или метоцель, а средний размер его гранул предпочтительно находится в
диапазоне от 200 до 400 нм. В описанных примерах поверхностно-активным материалом была белая
глина.
Эту смесь с плазмой поддерживали в устойчивом суспендированном состоянии с помощью физического воздействия (перемешивания) при комнатной температуре в течение 6 ч, затем ее инкубировали
при температуре 5°С в течение 10-12 ч. Во время инкубации жидкость перемешивали в течение относительно коротких периодов времени через каждые полчаса.
После инкубации смесь повторно суспендировали посредством перемешивания, и суспензию центрифугировали при той же температуре, равной 4-5°С, с ускорением 15000 g в течение 10 мин.
Из центрифугата для дальнейшей обработки отделяли более плотные компоненты, связанные с частицами поверхностно-активного вещества, а жидкую фазу удаляли. К отделенной фазе добавляли второй
органический растворитель в количестве, равном массе первого органического растворителя, которым в
типичном случае была смесь, содержавшая 50 мас.% спирта и 50 мас.% толуола. Обработка полученной
при этом смеси была идентична обработке после первого растворителя. В ходе этого процесса смесь с
плазмой посредством физического воздействия (перемешивания) поддерживали в устойчивом суспендированном состоянии в течение 6 ч при комнатной температуре, затем ее инкубировали при 5°С в течение
5-12 ч. В период инкубации смесь перемешивали через каждые полчаса в течение относительно коротких
периодов времени.
После инкубации смесь повторно суспендировали посредством перемешивания, и при той же температуре, равной 5°С, суспензию центрифугировали в течение 10 мин с ускорением 15000 g.
Из центрифугата для дальнейшей обработки отделяли более плотные компоненты, связанные с частицами поверхностно-активного материала, а жидкую фазу удаляли.
Плотный компонент распределяли с получением тонкого слоя, затем весь оставшийся органический
растворитель удаляли в сушилке, помещенной под вакуум на два часа.
Затем к выделенному осадку добавляли физиологический солевой раствор с массой, равной массе
исходной плазмы, и материал повторно суспендировали посредством перемешивания. Полученные таким способом препараты плазмы в последующей части описания будут обозначены буквой "b", которая
является первой буквой названия поверхностно-активного материала, которым была белая глина (bolus
alba).
При получении второго, относительно более чистого альтернативного препарата плазмы поверхностно-активный материал удаляли таким способом, что к смеси "b" добавляли не повреждающий ткани
детергент, способный растворить препарат плазмы. В типичном случае этим детергентом был лаурилсульфат натрия в концентрации 0,01 мас.%. Для получения соответствующей суспензии материал совместно с добавленным к нему детергентом инкубировали при комнатной температуре в течение 6 ч при
постоянном перемешивании, а затем хранили его в холодильнике в течение 8-12 ч. Материал, который
образовал осадок во время инкубации, повторно суспендировали, после чего его центрифугировали в
охлажденном состоянии с ускорением 15000 g и осадок удаляли. Супернатант, который содержал полезное вещество, в последующей части описания будет обозначен буквой "f", чтобы его можно было отличить от вещества "b", и которая обозначает, что это вещество чище ("finer").
Для облегчения экспериментов, выполнявшихся на мышах, оба типа продуктов распределяли на дозы, равные 1 мл, затем их маркировали и хранили в замороженном состоянии.
Продукты и условия их приготовления были стерильными, поэтому вещество было асептическим и
пригодным для парентерального введения.
-3-
005415
I. Эксперименты с имплантацией саркомы S180
Все эти эксперименты были выполнены на идентичных самках мышей линии BDF1 со средним весом 25 г. Исследуемым мышам и мышам, использованным для положительного контроля, подкожно
трансплантировали саркому S180. Условия эксперимента, связанные с типом животных, типом имплантируемой саркомы и способом имплантации, были идентичны условиям, описанным в международный
заявке, указанной выше. Каждая экспериментальная группа состояла не менее чем из пяти мышей, и
приведенные данные относятся к средним значениям для мышей соответствующей группы. Мышей различали по соответствующим группам номеров, и они имели индивидуальные номера.
Эксперимент 1.
Из крови больного, страдающего острым лейкозом, был приготовлен препарат плазмы типа "b", и в
экспериментальной группе все мыши получали ежедневно подкожно по 0,1 мл этого препарата, в общей
сложности восемь раз.
В группе, использованной для положительного контроля, средний срок жизни составил 19,6 дней, а
в экспериментальной группе он был равен 23,5 дням. Это 20%-ное увеличение, которое можно признать
достоверным улучшением. В вышеуказанной международной заявке в отношении того же типа опухоли
самый лучший препарат смог обеспечить 5% увеличение срока жизни, которое было ниже порога достоверности. Поэтому правильное выделение не содержащего липидов компонента плазмы является очень
важным.
Эксперимент 2.
Этот эксперимент включает результаты шести независимых экспериментов, и он основан на предположении, что вещество, оказывающее эффективное противоопухолевое воздействие, которое предположительно содержится в не содержащем липидов компоненте плазмы, присутствует также в крови людей, излеченных от опухоли. В качестве доноров были выбраны люди, которые прожили не менее 10 лет
и не более 27 лет после того, как у них была выявлена опухоль, поэтому их можно было считать излеченными. Диагностированными у доноров типами опухолей были последовательно опухоли гортани,
толстой кишки, молочной железы, лимфолейкоз, опухоли яичка, предстательной железы, а также опухоли легких.
Препарат плазмы типа "b" получали в данном случае от каждого из шести доноров, и им обрабатывали соответствующие группы мышей. Среднее время жизни контрольной группы снова было равно 19,6
дней, однако среднее значение для групп, получавших препарат, колебалось от 25,5 до 27,3 дней, то есть
между группами, получавшими препарат, существовали лишь небольшие различия. Такой срок жизни
означал улучшение на 30-40% по сравнению с контрольной группой, которое является в высокой степени
достоверным.
В следующем эксперименте продукт плазмы типа "b" был приготовлен из смеси в равных количествах плазмы, полученной от всех шести доноров после удаления кровяных телец. Этот продукт обеспечил
увеличение срока жизни на 38% по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, эти эксперименты подтвердили гипотезу, согласно которой не содержащий липидов компонент плазмы крови людей, излеченных от опухоли, содержит эффективное ингибирующее
опухоли вещество. Кроме того, было также доказано, что наличие такого вещества не зависит (по меньшей мере, в случае исследованных опухолей) от фактического типа опухоли, поэтому смесь была столь
же эффективной.
Эксперимент 3.
В качестве доноров был выбран такой крупный рогатый скот (коровы), у которых анализ крови
подтвердил наличие коровьего лейкоза. Из крови таких доноров были получены продукты плазмы типа
"b" и "f". Аналогично оба типа продуктов были приготовлены из крови коров, в крови которых не было
обнаружено признаков лейкоза.
Исследования были проведены в нескольких вариантах, причем первым переменным параметром
было число воздействий, осуществлявшихся ежедневно, вторым параметром была величина дозы, которая колебалась между 0,1 и 0,15 мл, и третьим параметром была чистота продукта, то есть "b" или "f"
тип. Предпочтительные диапазоны исследования этих параметров были определены в предварительных
экспериментах, предшествующих истинным экспериментам, поэтому для дозы и числа воздействий были
определены относительные оптимумы.
Продукт, полученный из крови коров, имеющих лейкоз, удовлетворяет условиям крупномасштабного применения, так как нет ограничений, связанных с доступностью доноров или с этическими или
моральными соображениями. Данные по выживаемости значительно превышали благоприятные данные
для препаратов, полученных из человеческой крови. Это является причиной подробного описания результатов этих экспериментов.
В ходе экспериментов определяли средний вес животных, среднее время жизни, кроме того, на заранее определенных фазах эксперимента от соответствующих мышей каждой группы брали пробы крови
объемом 1 мл, и в этих пробах оценивали присутствие нескольких опухолевых маркеров. Мышей, у которых были взяты пробы крови, исключали из последующих исследований, так как они не могли выжить
после того, как от них было получено такое количество крови.
-4-
005415
Данные, относящиеся к сроку жизни
Результаты, относящиеся к сроку жизни, можно разделить на две большие группы, а именно - в зависимости от того, проводилось ли лечение продуктом "b" типа или "f" типа. Происхождение от быков,
больных лейкозом, обозначалось аббревиатурой "Вbо", поэтому лечение первой основной группы проводилось веществом Bbo-b, а лечение второй основной группы производилось веществом Bbo-f.
Отсчет дней вели от имплантации опухоли. Каждая кривая, приведенная на фиг. 1-7, относится к
средним значениям для группы, включавшей не менее пяти мышей.
На фиг. 1 и 2 приведены графики выживаемости для групп мышей, получавших лечение веществом
Bbo-f. Мыши в группе для позитивного контроля не получали после имплантации никакого лечения,
кроме нормального кормления, мыши в экспериментальной группе через день получали вещество Bbo-f в
определенном количестве. При каждом сеансе лечения в группах, изображенных на фиг. 1, доза была
равна 0,15 мл. Две экспериментальные группы отличаются друг от друга по количеству сеансов лечения.
В первой группе было выполнено 8 сеансов лечения, тогда как во второй группе число сеансов лечения
было равно 10, после чего мыши не получали никакого дополнительного лечения. В случае группы, получившей 10 сеансов лечения, можно видеть, что после завершения лечения, то есть после 20-го дня,
смертность резко увеличилась. Это внезапное увеличение можно видеть и в группе, получившей 8 сеансов лечения, но интересно, что это увеличение происходит позже и менее резко. Среднее время жизни,
по сравнению с контрольной группой с 19,6 днями, в группе, получившей 8 сеансов лечения, равно 24,8
дней, тогда как в группе, получившей 10 сеансов лечения, оно составляет 23,2 дня.
В каждой из групп, показанной на фиг. 2, лечение производили 10 раз через день. Различие состояло в дозе. Мыши первой группы получали при каждом сеансе лечения дозу, равную 0,15 мл, тогда как
мышей второй группы лечили дозой, равной 0,1 мл. Различие является очень заметным при снижении
дозы. Срок жизни увеличивался до 30 дней, что составляет 153%-ное улучшение по сравнению с группой, использованной для положительного контроля.
Результаты экспериментов с веществом Bbo-b показаны на двух группах фигур. В случае фиг. 3-5
переменным параметром является доза. В случае, изображенном на фиг. 3, лечение было произведено 6
раз, и можно видеть, что срок жизни почти не зависит от использованной дозы, причем меньшая доза
оказывает несколько лучший эффект. Срок жизни, тем не менее, значительно больше по сравнению с
веществом Bbo-f, так как средний срок жизни был равен 37 дням, что соответствует примерно 189%ному улучшению по сравнению с положительным контролем. Зависимость срока жизни от дозы будет
более очевидной при анализе фиг. 4. Здесь число сеансов лечения было равно 8. Под влиянием дозы,
равной 0,15 мл, срок жизни уменьшился по сравнению со значением, полученным при 6 сеансах лечения,
и это может быть только следствием передозировки. В противоположность этому, доза, равная 0,1 мл,
по-видимому, является оптимальной при 8 сеансах лечения, так как средний срок жизни значительно
увеличивался, и к 59-му дню график еще не достиг 50%-ного значения. При этом срок жизни превышал
300%, что является исключительно благоприятным значением.
Фиг. 5 показывает средний срок жизни у мышей, получивших 10 сеансов лечения. Неожиданной
здесь оказалась особенность дозы, равной 0,15 мл, поскольку в этой группе срок жизни внезапно снижался, но среднее значение было лучше, чем в предыдущей группе, получавшей сходное лечение. Из-за
малого числа мышей различия могли возникнуть из-за более или менее благоприятного поведения одной
или двух мышей. Внезапная смертность возрастает в случае дозы, равной 0,1 мл, после 33-го дня, что
также может быть следствием передозировки.
На фиг. 6 и 7 переменным параметром является число сеансов лечения. Сравнение двух фигур и в
этом случае демонстрирует, что использование 8 сеансов лечения при дозе, равной 0,1 мл, является оптимальным. Из фиг. 7 можно сделать вывод, что в случае более высокой дозы улучшение возрастает с
уменьшением числа сеансов лечения, что также свидетельствует о том, что доза была слишком большой.
Излечение опухолей и средний вес животных
Улучшение, произошедшее в состоянии животных из групп, получавших лечение, можно обнаружить не только на основании среднего срока жизни. У животных с начальным весом 25 г образовывались
такие крупные опухоли, что они весили 6-8 г, то есть составляли почти треть от общего веса животного.
У животных, получивших лечение веществом Bbo-b восемь раз, по окончании цикла лечения обнаруживались явные изменения состояния опухоли, саркома вскрывалась, и из нее выделялось вязкое вещество.
Это вещество содержало мертвые опухолевые клетки. У мышей исчезал "горб", и они начинали прибавлять в весе.
На фиг. 8 показан средний вес тела животных в течение первых 19 дней в группах Bbo-b и Bbo-f,
каждая из которых получила по 8 сеансов лечения, и в группе, использованной для положительного контроля. График хорошо совпадает с вышеописанным заключением о состоянии, особенно в случае лечения веществом Bbo-b. Недостаток графика состоит в том, что на нем не показано отдельно изменение
массы опухоли. Поскольку точное значение веса опухоли измерить невозможно, то общий вес тела
включает также вес опухоли. В группе, получавшей лечение, типичным является начальное снижение
веса с последующим регенеративным увеличением, в случае группы, использованной для положительного контроля, вес возрастал нерегулярным образом, что главным образом было связано с ростом опухоли.
-5-
005415
Эксперименты, оказавшиеся лучшими из вышеописанных, были повторены с веществом, полученным от здоровых коров, не имевших лейкоза. Результаты достоверно не отличались от результатов, полученных в группе, использованной для положительного контроля, и это служит подтверждением того,
что только вещество, полученное из крови коров, больных лейкозом, является эффективным.
Результаты анализов на ферментные опухолевые маркеры
Для исследования метаболических изменений, сопровождающих злокачественные процессы, используется несколько ферментных опухолевых маркеров, которые широко применяют в клинической
практике, и из этих способов было выбрано несколько типов, которые можно использовать для обычных
исследований. При выборе методов учитывалось, что злокачественные процессы сопровождаются и часто поддерживаются сложными биохимическими нарушениями. Поэтому из этих соображений представляется необходимым выполнять анализы метаболизма нуклеиновых кислот (активности сывороточной
щелочной (основной) и кислой дезоксирибонуклеазы, активности 5'-нуклеотидазы); метаболизма полиаминов (активности аргиназы); функции митохондрий печени (активности орнитинкарбамоилтрансферазы); глюконеогенеза (активности фосфогексозоизомеразы); и идентифицировать процессы, связанные с
костями (активность специфичной для костей щелочной фосфатазы). Изменения активности перечисленных ферментов являются следствием метаболических нарушений, сопровождающих и поддерживающих
злокачественные процессы, и результатом использованных видов лечения.
В экспериментах у мышей брали пробы крови на 8-ой, 15-ый и 19-ый день после имплантации опухоли. Данные суммированы в табл. 1. Данные относятся к средним значениям для пяти соответствующих
мышей, каждая из которых была исследована отдельно.
Обозначения в отдельных столбцах таблицы:
β-Glyc: неспецифическая фосфатаза, β-глицерофосфатаза; это значение следует вычитать из значений для других фосфатаз, чтобы их можно было интерпретировать как опухолевые маркеры;
5'-АМР: семейство ферментов 5'-нуклеотидаз, более конкретно: 5'-аденозин-5-монофосфатаз;
Alk. F: щелочная фосфатаза;
5'-ТМР: 5'-тимидин-5-монофосфатаза;
PDE: фосфодиэстераза;
SDNaz: кислая дезоксирибонуклеаза (кислая ДНКаза);
Σ5'-ND: суммарный уровень всех 5'-нуклеотидаз.
Таблица 1. Действие препаратов сыворотки плазмы Bbo-b и Bbo-f на мышей с саркомой S180
В таблице можно увидеть три различные группы. Последняя группа относится к контролю с мышами, которым не были имплантированы опухоли, и мыши 51-55 в этой группе были исследованы на 8-ой
день, мыши 56-60 были исследованы на 15-ый день, а мыши 106-110 были исследованы на 19-ый день.
Средняя группа относится к положительному контролю, причем мыши 151-155 были исследованы
на 8-ой день, мыши 101-105 - на 15-ый день, а мыши 41-50 -на 19-ый день.
Первую группу можно разделить на две подгруппы, одна группа, номера которой начинаются с
цифры 2, получала лечение веществом Bbo-b, а вторая группа, номера которой начинаются с цифры 3,
получала лечение веществом Bbo-f. В подгруппе Bbo-b исследование мышей 281-290 было выполнено на
8-ой день, мышей 276-280 - на 15-ый день, мышей 271-275 - на 19-ый день, и наконец, исследование мышей 246-250 было выполнено, в соответствии с реальным сроком жизни, гораздо позже - на 45-ый день.
Во второй подгруппе, где мышей лечили веществом Bbo-f, распределение по дням исследования
было следующим: 396-400: 8-ой день; 391-395: 15-ый день; 385-390: 19-ый день.
-6-
005415
Результаты суммированы в форме столбчатой диаграммы на фиг. 9, на которой группы мышей, указанные на горизонтальной оси, соответствуют данным на вертикальной оси, расположенным друг над
другом, причем высота столбцов отображает сумму данных. На горизонтальной оси группы мышей показаны раздельно, а в пределах каждой группы направление слева направо соответствует увеличению
срока отбора проб.
Три левых столбца связаны с контрольной группой, три средних столбца связаны с группой положительного контроля, первые три столбца из семи правых столбцов относятся к подгруппе Bbo-f, а последние четыре столбца относятся к подгруппе Bbo-b.
В контрольной группе результаты, естественно, не изменяются с течением времени, их флуктуации
находятся в пределах естественного диапазона колебаний. В случае группы, использованной для положительного контроля, все компоненты имеют исключительно высокие значения, и к моменту смерти
(последний столбец) они продолжают повышаться.
В противоположность этому, в обеих подгруппах, получавших лечение, начальные значения всегда
меньше данных в группе, использованной для положительного контроля, и они продолжают снижаться с
течением времени. Вещество Bbo-b, в соответствии с благоприятными результатами по сроку жизни,
дало значительно лучшие результаты, чем лечение веществом Bbo-f. Снижение продолжалось после 19го дня, и к концу эксперимента результаты были близки к нормальным значениям в контрольной группе.
Эксперимент 4.
На основании благоприятных результатов, полученных в ходе предыдущих экспериментов, было
исследовано, какие компоненты не содержащей липидов плазмы ответственны за эффект. Так как у авторов настоящего изобретения была кровь здоровых людей, кровь от больных с острым лейкозом, кровь от
больных, излеченных от опухолей, а также кровь, полученная от быков с лейкозом и без лейкоза, препарат типа "b" был приготовлен из всех перечисленных типов крови, и они были подвергнуты соответствующим электрофоретическим исследованиям. Для исследований исходное вещество наносили на поверхность полиакриламидного геля, и под действием электрофоретической обработки компоненты вещества разделялись в соответствии с их молекулярными весами.
Фракции, полученные из крови, признанной неэффективной с точки зрения лечения опухолей, то
есть из крови нормальных людей и крови, взятой от коров без лейкоза, сравнивали с фракциями, полученными из типов крови, бывших эффективными с точки зрения лечения опухолей. Наиболее явное отличие было получено для фракций крови, полученных от быков, имевших лейкоз, и оно состояло в присутствии фракции с молекулярным весом порядка 40000 и еще одной фракции с молекулярным весом
между 300000 и 350000. Эти две фракции совместно оставляли от 8 до 12% массы пробы. Фракции препаратов крови, взятой от доноров с излеченными опухолями, содержали оба этих компонента, тем не
менее, присутствие фракции с молекулярным весом около 40000 было более выраженным, а общее количество фракций было гораздо меньшим - примерно 2-3%. Среди фракций препарата, полученного из крови больных острым лейкозом, компонент с молекулярным весом 40000 присутствовал только в следовых
количествах, вторая фракция не обнаруживалась.
С целью идентификации двух вышеуказанных фракций фракция с молекулярным весом около
40000 будет далее обозначаться как "bovin 40", а вторая фракция с молекулярным весом в диапазоне от
300000 до 350000 будет обозначаться как "bovin 300". Метод, описанный здесь, достаточен для безошибочной идентификации этих двух фракций. В настоящее время производится структурная идентификация этих фракций. С учетом представленных результатов можно вполне обоснованно сделать вывод о
том, что присутствие веществ "bovin 40" и "bovin 300" ответственно за продемонстрированные эффекты.
II. Эксперимент с имплантацией колоректальной опухоли С26
Эксперименты были выполнены на первом поколении инбредных мышей-самцов линии Balb/c. Местом происхождения мышей был Институт TNO, Рейсвейк, Нидерланды, местом их разведения был Национальный институт онкологии (Венфия), Отдел экспериментальной фармакологии.
Условия содержания животных были следующими: клетка из материала макролон, температура 2022°С, относительная влажность воздуха 45-55%, темновое и световое содержание чередовались через
каждые 12 ч. Кормление осуществляли кормом для мышей стандартного качества, который стерилизовали в автоклаве (тип: Altromin, Германия), подстилка была изготовлена из древесных стружек. Гигиенический уровень содержания соответствовал предписанным SPF-условиям (отсутствия специфических патогенных микроорганизмов). Уход за животными и их содержание осуществлялись в соответствии с Хельсинкской декларацией "Руководящие принципы ухода за животными и их использования".
Аденокарцинома толстой кишки Colon-26 была получена из SRI, Бирмингем, Алабама, США. Способ трансплантации: от сохраняемой опухоли кусочек весом 20 мг имплантировали подкожно в межкапсулярную область.
В ходе экспериментов животных разделили на группы по десять мышей в каждой, животные в
группе, использованной для положительного контроля, после имплантации не получали никакого лечения. В группах, получавших лечение, лечение производили вышеописанным веществом Bbo-b. Это вещество при документировании экспериментов также обозначали как АВВ-7. Был учтен опыт, полученный в экспериментах серии I, и препарат применяли один раз в день в одно и то же время в период меж-7-
005415
ду 1-м и 9-м днем, в общей сложности восемь раз. Различия между соответствующими группами состояли в способе лечения и в количестве использованного экспериментального вещества.
Данные по выживаемости суммированы на фиг. 10. В случае группы, использованной для положительного контроля, срок 100%-ного выживания был равен 19 дням. В первой группе препарат вводили
внутрибрюшинно (ip1) в дозе 0,1 мл, во второй группе способ введения был таким же, но доза была равна 0,15 мл, и также было испробовано введение вещества через рот (per os). В этом случае для подачи
вещества непосредственно в желудок животного был использован подходящий дозатор. В первой группе
с пероральным введением (ро1) доза вещества была равна 0,2 мл, а во второй группе с пероральным введением (ро2) доза была равна 0,3 мл. Также получала лечение еще одна группа (sc), в которой вещество
вводили подкожно (под кожу) в дозе 0,1 мл. Данные по выживаемости представляют собой средние значения для групп из десяти мышей. Из фиг. 10 можно видеть, что во всех группах, получавших лечение,
имело место значительное улучшение, двумя наиболее эффективными способами лечения были внутрибрюшинное введение в дозе 0,1 мл и пероральное введение 0,2 мл вещества.
Эксперименты были повторены на других группах, содержавших по десять мышей в каждой, и для
определения массы опухолей опухоли удаляли, когда животные достигали предсмертного состояния (то
есть состояния, непосредственно предшествовавшего смерти), и определяли массы опухолей.
На фиг. 11 показаны результаты этих экспериментов. Над столбцами показаны значения соответствующих уровней доверительной вероятности, которые во всех случаях были меньше 0,05, то есть результаты были в высокой степени достоверными.
В следующих группах, содержавших по десять мышей, получавших сходное лечение, была определена активность 5'-нуклеотидазы в пробах, взятых на 8-ой, 16-ый дни после имплантации опухолей, а
также в предсмертном состоянии, как в случае эксперимента серии I. Эти результаты показаны на фиг.
12. Активность повышалась от начального низкого уровня до очень высокого на 16-ый день, затем по
достижении предсмертного состояния активность значительно снижалась, по сравнению со значениями,
полученными в группе для положительного контроля.
III. Эксперименты с имплантацией опухоли молочной железы МХТ
При условиях содержания, описанных в эксперименте II, самок мышей линии BDF1 вышеописанного происхождения использовали для исследования эффектов лечения веществом Bbo-b на опухоль молочной железы МХТ. Местом происхождения опухолевых клеток для трансплантации является научноисследовательский институт MASON (США). Маленький кусочек объемом 1 мм3, взятый от сохраняемой
опухоли, имплантировали подкожно в межкапсулярную область.
Из животных были сформированы группы по десять мышей, как в случае эксперимента II, и внутри
каждой группы отдельных животных лечили одинаково. Лечение веществом Bbo-b производили так же,
как в случае эксперимента II, то есть один раз в одно и то же время ежедневно в течение 8 дней. В случае
позитивного контроля средний срок жизни был равен 24 дням. На фиг. 13 показаны сроки жизни для различных групп, получавших лечение. Можно видеть, что несколько различных групп получали одинаковое лечение, например группы ip1 и ip2, получавшие дозу 0,15 мл, получали одинаковое лечение внутрибрюшинно, а группы ро2 и ро3 получали лечение в дозе 0,3 мл перорально. При этом типе опухоли увеличение срока жизни было равно примерно 40%, причем оно было наибольшим в случае перорального
введения.
Исследования массы опухолей были выполнены на животных в предсмертном состоянии, как описано в эксперименте II, и их результаты суммированы на фиг. 14 и 15. Номера, указанные на горизонтальной оси, относятся к порядковым номерам мышей в определенной группе, они не имеют особого
значения. Вертикальные отрезки, показанные на столбчатых диаграммах, относятся к отклонениям в
пределах соответствующей группы. Снижение опухолевой массы здесь также было наиболее значительным при пероральном введении препаратов.
Анализ на 5'-нуклеотидазу, выполненный на экспериментальных животных, продемонстрировал
значительное снижение ее в группах, получавших лечение; анализ всех экспериментальных данных, полученных в этих исследованиях, к настоящему времени еще не завершен, поэтому их невозможно суммировать в форме таблицы.
IV. Эксперименты с имплантированным острым лимфолейкозом L1210
Действие вещества Bbo-b было исследовано в случае острого лимфолейкоза L1210. Из самцов мышей
BDF1 были сформированы группы по десять мышей, содержавшиеся так, как описано в связи с экспериментами II и III. Из асцитной жидкости мышей DBA/2, в которых сохраняли острый лимфолейкоз L1210, и
физиологического раствора готовили жидкость, 0,1 мл которой содержал 106 клеток. 0,1 мл этой жидкости инъецировали внутрибрюшинно каждой экспериментальной мыши, и в группах, получавших лечение, сеансы лечения производили один раз в день в течение 8 дней, как в случае экспериментов II и III.
На фиг. 16 изображены данные по выживаемости. Средний срок жизни в группе, использованной
для положительного контроля, был равен 9,9 дням. На фиг. 16 можно видеть, что существует очень значительное различие в сроках жизни, в зависимости от того, как вводили вещество. В ответ на внутрибрюшинные и подкожные введения срок жизни составлял 170%, и в противоположность этому пероральное введение дозы, равной 0,2 мл, привело к 320%-ному сроку жизни, но в этой группе, получавшей
-8-
005415
лечение, были большие различия между отдельными животными, и некоторые из них излечивались полностью. При этом типе опухоли невозможно было определить относительную массу опухоли, и асцитная
жидкость, собранная из полости брюшины, вместе с опухолями, присутствовавшими в брыжейке, составляли абсолютную массу опухоли. На фиг. 17 показан измеренный вес такой абсолютной опухолевой
массы у групп животных в предсмертном состоянии. Животные, которые доживали до 30-го дня, также
относились к этим группам. Из фиг. 17 можно видеть, что в трех группах, получавших лечение, не было
обнаружено измеримой опухолевой массы.
На фиг. 18 показано изменение активности 5'-нуклеотидазы в 5-ый и 8-ой дни, а также в предсмертном состоянии. Из диаграмм можно видеть, что во всех группах, получавших лечение, имело место значительное улучшение, а в некоторых группах, получавших лечение, были получены нормальные значения.
В других группах мышей, участвовавших в экспериментах I-IV, в различные сроки были проведены
гистологические исследования. Исследования включали гистологический анализ 17 различных органов.
На основании этих гистологических исследований можно заключить, что метастазы не образовались ни
при одном из исследованных типов опухолей. В случае групп, использованных для положительного контроля, тем не менее, была обнаружена довольно значительная активность метастазов. Они были обнаружены в случае отдельных типов опухолей в следующих органах: в случае саркомы S180 - в лимфатических железах и печени; в случае С26 - в печени и в брыжеечных лимфатических железах; в случае опухоли МХТ - в печени; а в случае L1210 - в костном мозге.
Вышеописанные результаты экспериментов позволяют предположить, что установленные значительные улучшения будут иметь место и при таких типах опухолей, которые не были исследованы в данной работе. Исследования, охватывающее все типы опухолей, обязательно необходимо провести из-за их
исключительного значения. Тем не менее, описанные выше эксперименты были достаточно широкими
для того, чтобы подтвердить существование основного эффекта.
Раствор по настоящему изобретению можно успешно использовать не только для первоначального
лечения опухолей, но и для послебольничного лечения и для профилактики образования метастазов.
Вследствие того факта, что существует две раздельные фракции, ответственные за эффект, но, по
меньшей мере, фракция "bovin 40" присутствует в крови людей, имеющих опухоли, исследование этих
фракций можно использовать для диагностики опухолей.
Результаты, полученные с препаратом по настоящему изобретению, и его диагностический потенциал создают надежду на эффективное лечение и диагностику опухолей. Поголовье скота, больное лейкозом, достаточно во всем мире, что создает возможность крупномасштабного производства. Кроме того,
существует возможность найти способ синтеза для производства веществ "bovin 40" и "bovin 300", поскольку тщательное исследование этих веществ может в будущем привести к необходимости такого
производства.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фармацевтический препарат для лечения, профилактики и/или диагностики опухолей, характеризующийся тем, что он содержит компоненты не содержащей липиды фракции плазмы крови парнокопытных животных, не находящихся под угрозой летального исхода и перенесших лейкоз, причем указанные компоненты имеют молекулярный вес около 40000 и/или от 300000 до 350000.
2. Фармацевтический препарат по п.1, отличающийся тем, что парнокопытные животные являются
крупным рогатым скотом.
3. Способ получения не содержащей липиды фракции плазмы крови, входящей в состав препарата
по любому из пп.1-2, включающий обработку фракции плазмы первым органическим растворителем,
добавление к ней поверхностно-активного агента, состоящего из мелких гранул, перемешивание полученной смеси, последующее отделение не содержащей липиды фракции, связанной с указанными гранулами, от жидкого компонента смеси посредством центрифугирования и переведение указанной отделенной фракции в раствор.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что плазму крови получают из крови путем обработки исходной крови антикоагулянтом и отделения форменных элементов крови от плазмы.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что к не содержащей липиды фракции, связанной с гранулами
поверхностно-активного агента, добавляют второй органический растворитель, перемешивают полученную смесь, отделяют указанную фракцию посредством центрифугирования и повторно переводят отделенную фракцию в раствор.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что повторное переведение отделенной фракции в раствор
осуществляют при использовании физиологического раствора.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что повторное переведение отделенной фракции в раствор
осуществляют при использовании жидкости, являющейся растворителем для указанной не содержащей
липиды фракции, с последующим удалением указанных гранул поверхностно-активного агента из жидкой фракции посредством повторного центрифугирования.
-9-
005415
8. Способ по любому из пп.3-4, отличающийся тем, что гранулы поверхностно-активного агента
имеют размер в диапазоне от 200 до 400 нм.
9. Способ по любому из пп.3-4, отличающийся тем, что количество указанного поверхностноактивного агента составляет 0,5% от массы указанной фракции плазмы.
10. Способ по любому из пп.3-4, отличающийся тем, что указанным поверхностно-активным агентом является белая глина.
11. Способ по любому из пп.3-4, отличающийся тем, что количество указанного органического растворителя примерно равно количеству указанной фракции плазмы.
12. Способ по п.5, отличающийся тем, что количество второго органического растворителя примерно равно количеству первого органического растворителя.
13. Способ по п.5, отличающийся тем, что первый органический растворитель является спиртом, а
второй органический растворитель является смесью спирта и толуола в равных частях.
14. Применение фармацевтического препарата по п.1 для лечения опухолей у первичных больных и
у больных, уже подвергавшихся терапии.
15. Применение фармацевтического препарата по п.1 для предотвращения образования вторичных
опухолей.
16. Применение по п.14 для лечения саркомы S180, опухоли толстого кишечника С26, опухоли молочной железы МХТ и острого лимфолейкоза.
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
-10-
005415
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 7
-11-
005415
Фиг. 8
Фиг. 9
Фиг. 10
-12-
005415
Фиг. 11
Фиг. 12
Фиг. 13
-13-
005415
Фиг. 14
Фиг. 15
-14-
005415
Фиг. 16
Фиг. 17
Фиг. 18
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
-15-