Медицинские нанобиотехнологии и ионные каналы Е.Г. Чулков
advertisement
Медицинские нанобиотехнологии и ионные каналы Е.Г. Чулков Институт цитологии Российской академии наук Оглавление Введение .........................................................................................................................................1 Ионные каналы и лечение рака ....................................................................................................2 Ионные каналы – бактериальные токсины..................................................................................6 Заключение .....................................................................................................................................8 Список литературы .........................................................................................................................9 Введение С каждым днём в России и мире всё более и более расширяется сфера применения медицинских нанобиотехнологий. Прогресс в этой области привёл к значительному увеличению продолжительности жизни, многие болезни, ранее считавшиеся неизлечимыми, побеждены, а качество жизни значительно возросло. Именно уровень развития здравоохранения в современном мире является основным критерием для отнесения той или иной страны к числу развитых или развивающихся. Дальнейшее совершенствование медицинских нанобиотехнологий невозможно без чёткого понимания фундаментальных механизмов действия биологически активных веществ на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровнях. Наибольший прогресс был достигнут в области молекулярной биологии благодаря современным физико-химическим, информационным, статистическим методам, применённым к биологической проблематике. Всё живое на планете существует в виде клеток. Клетка — элементарная морфологическая и функциональная единица живого, обладающая собственным обменом веществ, способная к самостоятельному существованию, самовоспроизведению и развитию. Она состоит из органелл, выполняющих различные функции и окружённых 1 мембраной. Под мембраной происходит клеточная жизнь, а сама мембрана является границей отделяющей живую природу от неживой. Клеточная мембрана состоит из липидного каркаса, белков, глико- и липопротеинов, в итоге представляя собой надмолекулярный комплекс, согласованно выполняющий барьерную, защитную, транспортную, рецепторную, механическую, энергетическую функции. Важную роль в работе мембраны, поддержании водно-солевого баланса клетки играют ионные каналы – молекулы или надмолекулярные комплексы, встроенные в мембрану и обеспечивающие прохождение через неё ионов, воды, мелких молекул. Роль каналов велика, а нарушения в их работе приводят к серьёзным врождённым или приобретённым заболеваниям, называемым каналопатиями. Около 13.4 % известных наименований лекарственных средств непосредственно действуют на ионные каналы клеточных мембран организма человека и широко применяются при борьбе с эпилепсией, болезнями Альцгеймера и Паркинсона, стенокардией, аритмией, диабетом, депрессией, в качестве анальгетиков и при анестезии. Они являются вторым крупнейшим классом наименований препаратов после веществ, действующих на рецепторы сопряжённые с G-белком (Overington et al., 2006) с объёмом продаж около 12 млрд. дол. Ионные каналы и лечение рака Важную роль в поиске направлений путей синтеза новых лекарственных препаратов играет комплексный подход, основанный на глубоком знании фундаментальных причин и механизмов заболевания. Наступило время, когда при помощи инструментов молекулярной биологии появилась возможность синтезировать вещества с необходимыми свойствами и доставлять их в то место, где их эффект будет наиболее выражен. Среди заболеваний, при лечении которых целесообразно использовать подход адресной доставки лекарств, особое место занимают онкологические заболевания. Прогресс в области гигиены и медицины избавил человечество от многих инфекционных заболеваний, бывших в недавнем прошлом основной причиной смерти. Сейчас, когда средняя продолжительность жизни превысила 60 лет, проблема онкологических заболеваний встаёт особенно актуально, т.к. в предыдущие века подавляющее большинство людей с подобной проблемой столкнуться не успевало. Раковые клетки являются модифицированными клетками организма больного, вставшими на путь неконтролируемого деления. Они не подчиняются управляющим сигналам организма, но сохраняют значительное сходство на молекулярном уровне со 2 здоровыми клетками, поэтому и не распознаются иммунными клетками как чужеродные и подлежащие уничтожению, как это происходит с болезнетворными микробами, попавшими в организм. Мощным противораковым средством являются препараты, содержащие радиоактивные атомы, испускающие высокоэнергетические частицы (обычно α-частицы) с коротким пробегом в организме или фотосенсибилизаторы – продуценты активных форм кислорода. С середины XX века известно, что наиболее чувствительно к α-частицам клеточное ядро, хранящее и использующее генетический материал, т.к. в нём находятся молекулы ДНК – самые длинные молекулы в клетке, которые достаточно разорвать в нескольких местах, чтобы опухолевая клетка не имела возможности их в дальнейшем использовать. К активным радикалам также наиболее чувствительно ядро. Понятно, что, если появится возможность целенаправленно доставлять радионуклиды или фотосенсибилизаторы в ядро раковой клетки, то это позволит снизить количество препарата назначаемого больному, уменьшить вред, наносимый здоровым клеткам при такой терапии, и в конечном итоге увеличить шансы на выздоровление. Создание нанотранспортёров, выполняющих подобные функции, является приоритетным направлением развития медицинских нанобиотехнологий. Нанотранспортёр лекарственного средства на основе радиоактивных изотопов должен уметь выполнять следующие задачи: 1) опосредованно связаться с опухолевой клеткой и проникнуть в неё; 2) войти в её цитоплазму; 3) попасть в высокочувствительный компартмент – ядро. Выполнение этих задач возможно в случае создания нанотранспортёра по модульному принципу, при котором каждая часть структуры выполняет свою функцию. Проникновение в клетку через плазматическую мембрану может произвольно происходить только для мелких незаряженных молекул, непосредственно диффундирующих через бислой, или ионов, идущих через ионные каналы, для крупных молекул такие пути недоступны. Поэтому им необходимо либо содержать переносчик, который переносил бы их на другую сторону мембраны, подобно нуклеопротеиновым комплексам фагов, либо иметь способность специфически связываться с транспортными системами, уже имеющимися в клетке-мишени. Первый вариант менее предпочтителен, т.к. комплексы фагов малоспецифичны и неэффективно отличают здоровые клетки от больных. Вследствие высокой метаболической активности раковых клеток, обусловленной неограниченным ростом, на их поверхности находится большое количество рецепторов, опосредующих эндоцитоз. Форму питания клетки, при которой клетка захватывает 3 кусочек вещества извне, при помощи образования мембранного пузырька, вогнутого внутрь. В дальнейшем он со своим содержимым отшнуровывается от мембраны и перемещается вглубь клетки для последующего переваривания. Большое число разновидностей онкологических заболеваний приводит к необходимости против каждой использовать свой конкретный рецептор-узнающий комплекс, запускающий каскад эндоцитоза, так, например, для клеток меланомы – это αмеланоцитстимулирующий гормон, для эпидермальной карциномы, рака пищевода и мочевого пузыря – эпидермальный фактор роста, для миелоидного лейкоза – интерлейкин-3, для нейробластомы – соматостатин. Таким образом, можно, например, пришивая к белковой молекуле-носителю соматостатин, целенаправленно доставлять такой надмолекулярный комплекс в клетки нейробластомы. Следующий за эндоцитозом этап протекает в транспортных везикулах – эндосомах. Их содержимое подвергается обработке различными ферментами и постепенно закисляется. Подвергнутые такому достаточно жёсткому воздействию нанотранспортёры будут уже не в состоянии выполнить свою задачу – доставить лекарственный препарат в клеточное ядро. Возникает задача выхода комплекса из везикулы в цитоплазму. Осуществить этот процесс помогает эндосомолитический модуль, созданный на базе транслокационного домена дифтерейного токсина, который способен создавать повреждения в мембране эндосомы. Способность токсина делать поры была показана на липосомах – искусственных липидных пузырьках. По выходу красителя из липосом можно судить о наличии пор в мембране. Выход наблюдался в диапазоне pH 5.5–6.5, что примерно соответствует pH внутри эндосомы. Наблюдаемые на липосомах эффекты нарушения целостности мембраны были проверены при помощи изучения проводимости плоского липидного бислоя – искусственной системы, мембраноактивными моделирующей веществами. В in vitro плоских взаимодействие липидных мембраны мембранах с выявлено возникновение ионных каналов проводимостью 2–5 нСм в присутствие нанотранспортёра с эндосомолитическим модулём при pH 5.5. Причём при нейтральных значениях pH порядка 7.0 каналообразующей активности не проявлялось. С помощью атомно-силовой микроскопии в закисленном липидном бислое выявляются кольцевые структуры диаметром 30-50 нм. При нейтральных значениях pH они не обнаруживаются. Таким образом, нанокомплекс адресно связавшись с клеткоймишенью и попав в неё в виде эндосомы, покидает её через им самим же сделанные поры, не успев подвергнуться деградации в агрессивной эндосомальной среде. 4 Дальнейший путь свободного цитоплазматического нанотранспортёра лежит в клеточное ядро, куда он может попасть после того, как белки-импортины распознают его аминокислотную последовательность ядерной локализации и доставляют внутрь ядра через ядерные поры. Таким образом, препарат минимальное количество времени находится в пути по сравнению со свободной диффузией и практически сразу попадает в наиболее чувствительный компартмент. Благодаря адресной доставке именно в ядро всего нанотранспортёра, в нём создаётся летальная для клетки концентрация поражающих факторов, что позволяет снизить концентрации и уменьшить вред, наносимый здоровым клеткам. Рис.1 схематически показывает молекулярный механизм работы противоопухолевых препаратов, созданных по технологии адресной доставки лекарств. Рис. 1. Схема строения модульного нанотранспортера (МНТ) и этапов его проникновения в клетку-мишень. Первый модуль МНТ – лигандный – осуществляет двойную функцию: специфическое «узнавание» раковой клетки-мишени и проникновение в эту клетку путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Второй, эндосомолитический модуль позволяет МНТ «сойти» с эндоцитозного пути до попадания в лизосомы, чтобы дать возможность нанотранспортеру провзаимодействовать с импортинами. Для этой цели в качестве второго модуля используется полипептидный фрагмент, способный делать дефекты в мембранах при рН эндосом. Доставка в клеточное ядро обеспечивается третьим модулем, содержащим аминокислотную последовательность ядерной локализации, «узнаваемую» импортинами, находящимися в бесструктурной части цитоплазмы. Четвертый модуль МНТ – модуль-носитель служит для присоединения транспортируемого лекарства. По (Соболев, 2009). 5 Применение нанотранспортёра фотосенсибилизаторов в культурах опухолевых клеток показало его высокую эффективность. Препарат убивал все раковые клетки в такой концентрации, при которой на здоровые не оказывалось существенного вредоносного эффекта. Разработанные в лаборатории А.С. Соболева (Соболев, 2009) препараты на принципах наноконструктора, придают специфичность и повышают эффективность ряда известных противораковых препаратов. Сборка структуры, в которой объединены модули различной природы, каждый из которых выполняет свою определённую функцию, приводит к «узнаванию» нужной клетки-мишени и последующему направленному транспорту активного лекарственного начала в клеточное ядро. Узнавание опухолевых клеток обеспечивается лигандным модулем, связывающимся с рецепторами опухолевых клеток. После связывания комплекс образует эндосому, которая попадает внутрь клетки, где должна перевариться. Но ещё до разрушения в эндосоме нанотранспортёр самостоятельно сделав канал с помощью транслокационного домена дифтерийного токсина в мембране выходит из этого мембранного пузырька в свободную цитоплазму. В цитоплазме уже он связывается с белками раковой клетки, обеспечивающей всему комплексу транспорт в ядро. В ядре начинает работать препарат, который нёс этот комплекс, что приводит к гибели раковой клетки. Если бы нанотранспортёра не было, то понадобились бы большие концентрации препарата для достижения аналогичного цитотоксического эффекта. Подобные препараты можно рассматривать как новые фармакологические агенты, обладающие большой гибкостью, обеспеченной возможностью замены деталей этого конструктора на более эффективные или специфичные, или направленные на другой компартмент в данной конкретной ситуации. Ионные каналы – бактериальные токсины Проблема инфекционных заболеваний хоть и не стоит так остро как в прошлые века, но продолжает сохранять актуальность. Многие бактерии – возбудители инфекционных заболеваний продуцируют токсины, способные взаимодействовать с мембраной с образованием функционирующих ионных каналов, неподдающихся регулированию со стороны организма человека и приводящих к утечке из клетки жизненно важных ионов и метаболитов, нарушению водно-солевого баланса и последующей гибели клетки. В таблице 1 приведены сведения о некоторых порообразующих агентах, микроорганизмах их продуцирующих и заболеваниях ими вызываемых. 6 Табл. 1. Характеристика бактериальных порообразующих токсинов. По (Супотницкий, 2011) с изменениями. Микроорганизм Болезнь Токсин Мишень Aeromonas hydrophila Диарея Аэролизин Гликопротеины в плазматической мембране Clostridium perfringens Газовая гангрена Перфринголизин Холестерин в плазматической мембране Escherichia coli Инфекция уринарного тракта Гемолизин Плазматическая мембрана Listeria monocytogenes Системные пищевые инфекции, менингиты Листериолизин Холестерин в плазматической мембране Staphylococcus aureus Staphylococcus pneumoniae Абсцессы Альфа-токсин Плазматическая мембрана Пневмония Пневмолизин Холестерин в плазматической мембране Стрептококовая ангина, скарлатина Стрептолизин Холестерин в плазматической мембране Streptococcus pyogenes Механизм действия порообразующих бактериальных токсинов хорошо прослеживается на примере альфа-токсина S. aureus, рассматриваемого как прототип олигомеризующегося пороформирующего цитотоксина. Альфа-токсин синтезируется как прекурсорная молекула из 319 аминокислот, содержащая N-концевую последовательность из 26 аминокислот. Секретируемый бактерией «зрелый» токсин (протомер), является гидрофильной молекулой с массой 33 кДа, утратившей цистеиновые остатки. Протомер «узнает» клетку-мишень по высокоаффинным рецепторам или неспецифически сорбируется в участках плазматической мембраны, содержащих фосфатидилхолин или холестерин. На мембране семь протомерных токсинов собираются в пору, формируя грибоподобный гептамер (232 кДа), включающий три различных домена. Шляпка и ободочная область гептамера альфа-токсина располагаются на поверхности плазматической мембраны, в то время как ножка служит трансмембранным каналом. Образовавшаяся пора позволяет маленьким молекулам и ионам двухстороннее движение, что, в конечном итоге, приводит клетку к вздутию и гибели от осмотического шока. Альфа-токсин действует цитолитически в отношении различных типов клеток. Зная механизм действия альфа-гемолизинового канала, можно подобрать вещества избирательно с ним связывающиеся и модифицирующие его таким образом, чтобы он представлял меньшую опасность. Подобные исследования удобно проводить на бислойных липидных мембранах, в которые можно встраивать интересующие нас 7 мембраноактивные вещества с целью изучения их свойств и модификации, направленной на поиск путей снижения их вредоносности. Получая записи токов, протекающих через канал в присутствии и отсутствие различных модификаторов, таких как, например, растительные антиоксиданты – флавоноиды, можно делать выводы о целесообразности их использования в медицинских целях. Рис. 2. Стадии формирования α-гемолизинового канала. α1-мономер токсина в водном растворе, α1*-мономер токсина на поверхности мембраны, α7*-комплекс из 7 мономеров токсина на поверхности бислоя, α7-токсиновый канал в бислойной липидной мембране. По (Kawate and Gouaux, 2003). Понятно, что, если в присутствии некоторого агента через канал начнёт протекать меньший ток, или снизится число открытых каналов при данной концентрации порообразователя, или вероятность найти канал в проводящем состоянии уменьшиться, то через такую мембрану за единицу времени пройдёт меньшее количество ионов, что позволит клетке с большей вероятностью выжить после заражения подобным токсином. Один из растительных флавоноидов, – флоретин, по данным Остроумовой с соавторами (Ostroumova et al., 2011) увеличивает вероятность для альфа-гемолизинового канала находиться в состоянии с низкой проводимостью, что можно в дальнейшем связать со снижением токсичности альфа-гемолизина в присутствие флоретина. Заключение Несмотря на важную роль, которую каналы и вещества, влияющие на их активность, играют в медицине, понимание молекулярных механизмов их действия, качественных и количественных характеристик процессов, протекающих в норме и при патологии, крайне недостаточно. Большинство препаратов, нашедших практическое применение, было открыто в результате фармакологического скрининга на лабораторных животных сотен и тысяч различных веществ на предмет их биологической активности, что делало и продолжает делать конечный продукт для потребителя дороже, т.к. в цену 8 включены все расходы на проверку веществ, не проявивших активности или имевших серьёзные побочные эффекты. Список литературы 1. Kawate T., Gouaux E. 2003. Arresting and releasing Staphylococcal alpha-hemolysin at intermediate stages of pore formation by engineered disulfide bonds. Protein Sci., 12: 997-1006. 2. Ostroumova O.S., Efimova S.S., Schagina L.V. 2011. 5- and 4’-hydroxylated flavonoids affect voltage gating of single alpha-hemolysin pore. Biochim. Biophys. Acta. 1808: 2051-2058. 3. Overington J.P., Al-Lazikani B., Hopkins A.L. 2006. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5: 993-996. 4. Соболев А.С. 2009. Модульные нанотранспортеры противораковых лекарств, придающие им клеточную специфичность и бóльшую эффективность. Успехи биол. химии. 49: 389-404. 9
